KR102600164B1 - 목질 액체배지와 led를 이용한 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법 - Google Patents
목질 액체배지와 led를 이용한 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 목질 액체배지와 LED를 이용한 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법에 관한 것으로, 눈꽃동충하초 균사를 목질원료가 투입된 액체 배지에 접종하는 단계; 및 접종된 배지를 광조건에서 배양하여 눈꽃동충하초 균사체를 얻는 배양단계; 를 포함하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법으로 이루어져 배지 및 광조건에 따라 눈꽃동충하초 균사체의 최대 생장량을 나타냄을 확인하였으며, 반응 표면 분석을 통하여 최적의 목질원료 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간 조건을 도출하고, 이를 배양조건으로 이용함으로써 눈꽃동충하초 균사체의 최대 생장량을 효율적으로 수득할 수 있다.
Description
본 발명은 목질 액체배지와 LED를 이용한 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법에 관한 것이다.
동충하초(冬蟲夏草)는 겨울에는 벌레, 여름에는 버섯으로 나온다는 뜻에서 이름이 붙여졌다. 대부분이 곤충병원성진균(entomopathogenic fungi)으로 약 800여종이 알려져 있으며, 기주 곤충에 감염되어 내부에서 균사 생장을 하여 자실체를 생성하는 것이 큰 특징이다. 이러한 동충하초는 아시아(중국, 한국, 일본 등)에서 예전부터 약초로 쓰여 왔다. 그 효능으로는 면역력 증강, 성인병 예방, 천식, 빈혈에 좋은 약재로 사용되어져 왔다.
또한, 동충하초는 작물들 중 단백질 함량이 가장 높은 (건조함량의 28%이상) 군에 속하고, 면역력을 강화시키는 물질이 다량 함유되어 있다. 특히, 동충하초의 면역활성물질 중에는 키닉산(quinic acid)의 이성체로 밝혀진 '코디세핀(Cordycepin :3'-deoxy-adenosine)' 이 포함되어 있다. 코디세핀은 핵산 물질로서 세포의 유전정보에 관여하면서 저하된 면역기능을 활성화하여 정상세포가 암세포로 전환되는 것을 방지하는 작용을 한다. 동충하초를 투입한 임상실험에서 암세포를 죽이는 면역세포인 NK세포(natural killer cell/자연살해세포)와 면역세포에서 분비되는 사이토카인의 함량이 18%~25% 증가되는 것으로 확인되어 혈액암치료용으로 활용되고, 건강기능식품으로서도 많은 관심을 받고 있다.
이러한 결과를 토대로 국내에서는 코디세핀이 함유된 동충하초가 건강기능식품으로 식약처 인증을 받았으며, 면역증강활성, 항암활성 외 항바이러스 효과와 항염증 효과 등 다양한 기능 등이 발표되고 있다.
상기와 같은 기능들로 인해 동충하초는 버섯류 중에서도 많은 소비가 이루어지고 있지만 천연에서 채집되는 양은 매우 적어서 수요를 충당할 수 없으므로 전 세계의 많은 농가들이 인공재배법으로 재배사를 만들어서 대량 재배하고 있다. 그러나 동충하초는 성장속도가 느리고, 외부환경에 민감하여 농약을 살포할 수 없는 식물이어서 재배가 매우 까다롭다. 또한, 대량재배에 성공하기는 하였지만 오랫동안 재배를 해온 농가에서도 동충하초 재배의 수확률은 저조한 것으로 알려져 있다. 즉, 10개를 배양하여 수확하면 1~2개 정도가 오염되거나 이상 균주가 성장하여 수확율이 낮아진다.
최근, 동충하초의 자실체 생산보다 균사체 생산에 대한 연구가 주목받고 있으며, 균사체의 경우 자실체보다 단기간 재배가 가능하고 저비용으로 소규모 장소에서 배양이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 뿐만 아니라, Feng et al. (2018)과 Tang et al. (2018)에 의하면 동충하초의 자실체와 균사체간의 성분에 대한 차이는 거의 없는 것으로 보고되었다. 따라서 자실체보다 단기간에 대량생산이 가능한 균사체를 배양하는 것이 경제적으로 유리하다고 판단된다. 하지만 현재까지 동충하초 균사체의 생산량 증대에 적합한 최적 조건에 관한 연구는 미비하다.
따라서 코디세핀이 함유된 눈꽃동충하초 균사체의 생장량 증대를 위한 최적 배양방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 눈꽃동충하초의 최대 생장량을 위한 최적의 눈꽃동충하초 균사체의 배양방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 배양방법에 따른 눈꽃동충하초 균사체 및 이를 포함하는 건강기능식품을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 눈꽃동충하초 균사체의 최대 생장량 예측방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 눈꽃동충하초 균사를 목질원료가 투입된 액체 배지에 접종하는 단계; 및 접종된 배지를 광조건에서 배양하여 눈꽃동충하초 균사체를 얻는 배양단계; 를 포함하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법에 따라 배양된 눈꽃동충하초 균사체 및 이를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 눈꽃동충하초 균사체의 건중량을 예측하는 방법에 있어서, (a) 박스 벤켄 계획법(Box-Behnken design)으로 목질원료의 분말도(X1), 배지의 목질원료의 함량(X2), 배양시간(X3)에 대하여, -1, 0 및 1로 코드화하여 실험범위를 설계하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 설계된 실험범위로, 상기 목질원료의 분말도, 배지의 목질원료의 투입량 및 배양시간에 대한 실험값을 얻는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 실험값을 이용하여 하기 수학식 1로 표시되는 이차 회귀식 모델을 도출하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 도출된 수학식 1로 표시되는 이차 회귀식 모델을 변량분석(ANOVA)하여 상기 눈꽃동충하초 균사체의 건중량을 예측하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 건중량 예측방법을 제공한다.
[수학식 1]
Y1=-1292.94187+17.78612X1+18.92425X2+2.11464X3
-0.019375X1X2-0.006276X1X3+0.008177X2X3-0.070169X1 2-0.292175X2 2-0.008818X3 2
(상기 수학식 1에서 Y1은 눈꽃동충하초 균사체의 건중량(mg/mL), X1은 목질원료의 분말도(코드단위), X2는 목질원료의 함량(코드단위) 및 X3는 배양시간(코드단위)을 의미함.)
본 발명에 따라 눈꽃동충하초 균사체는 SDB(Sabouraud dextrose broth) 액체배지에 1% NaOH로 전처리된 목분을 첨가하고, 적색, 청색 혼합 LED 광을 조사하여 배양한 경우 최대 생장량을 나타내었으며, 반응 표면 분석을 통하여 최적의 목질원료 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간 조건을 도출하고, 이를 배양조건으로 이용함으로써 눈꽃동충하초 균사체의 최대 생장량을 효율적으로 수득할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따른 배양방법에 따라 수득된 눈꽃동충하초 균사체는 면역증강활성, 항암활성, 항바이러스 및 항염증 효과가 뛰어난 코디세핀을 함유하고 있으므로 건강기능식품으로도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 눈꽃동충하초(Paecilomyces javanicus) 균사체를 나타낸 도면이다.
도 2는 액체배지에 사용된 목질원료를 나타낸 도면이다.
도 3은 액체배지에 투입된 목질원료의 수종에 따른 동충하초 균사체의 dry weight 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 4는 동충하초 균사체의 액체 배양에서 참나무 목분 투입량에 따른 dry weight 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 5는 목질원료의 분말도에 따른 참나무 목분을 나타낸 도면이다.
도 6은 액체배지에 투입된 참나무 목분의 분말도에 따른 동충하초 균사체의 dry weight 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 7은 다양한 용매로 전처리한 참나무 목분을 나타낸 도면이다.
도 8은 참나무 목분의 전처리 용매에 따른 동충하초 균사체의 dry weight 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 9는 전처리된 참나무를 이용한 목질 액체배지와 LED광의 복합 공정 적용에 따른 동충하초 P. javanicus 균사체의 dry weight 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 10은 P. javanicus 균사체의 균사체량 증대를 위한 1% NaOH 전처리된 참나무 목분의 최적 투입 조건을 나타낸 도면이다(A: 목질원료의 분말도; B: 목질원료의 함량; C: 배양시간).
도 11은 유도된 2차 다항방정식 회귀식 모델을 나타낸 도면이다.
도 12는 2차 회귀식 모델을 변량분석(ANOVA)하여 상기 눈꽃동충하초 균사체의 건중량 예측 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 액체배지에 사용된 목질원료를 나타낸 도면이다.
도 3은 액체배지에 투입된 목질원료의 수종에 따른 동충하초 균사체의 dry weight 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 4는 동충하초 균사체의 액체 배양에서 참나무 목분 투입량에 따른 dry weight 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 5는 목질원료의 분말도에 따른 참나무 목분을 나타낸 도면이다.
도 6은 액체배지에 투입된 참나무 목분의 분말도에 따른 동충하초 균사체의 dry weight 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 7은 다양한 용매로 전처리한 참나무 목분을 나타낸 도면이다.
도 8은 참나무 목분의 전처리 용매에 따른 동충하초 균사체의 dry weight 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 9는 전처리된 참나무를 이용한 목질 액체배지와 LED광의 복합 공정 적용에 따른 동충하초 P. javanicus 균사체의 dry weight 변화를 나타낸 도면이다(데이터는 3번의 실험 결과를 평균±표준편차로 나타냈다).
도 10은 P. javanicus 균사체의 균사체량 증대를 위한 1% NaOH 전처리된 참나무 목분의 최적 투입 조건을 나타낸 도면이다(A: 목질원료의 분말도; B: 목질원료의 함량; C: 배양시간).
도 11은 유도된 2차 다항방정식 회귀식 모델을 나타낸 도면이다.
도 12는 2차 회귀식 모델을 변량분석(ANOVA)하여 상기 눈꽃동충하초 균사체의 건중량 예측 결과를 나타낸 도면이다.
이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 SDB(Sabouraud dextrose broth) 액체배지에 1% NaOH로 전처리된 목분을 첨가하고, 적색, 청색 혼합 LED 광을 조사하여 배양한 경우, 눈꽃동충하초 균사체의 최대 생장량을 나타냄을 확인하였으며, 반응 표면 분석을 통하여 최적의 목질원료 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간 조건을 도출하고, 이를 배양조건으로 이용함으로써 눈꽃동충하초 균사체의 최대 생장량을 효율적으로 수득할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 눈꽃동충하초 균사를 목질원료가 투입된 액체 배지에 접종하는 단계; 및 접종된 배지를 광조건에서 배양하여 눈꽃동충하초 균사체를 얻는 배양단계; 를 포함하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법을 제공한다.
이때, 상기 배지는 SDB(Sabouraud dextrose broth) 액체배지일 수 있으며, 3일 내지 7일 동안 배양을 수행할 수 있다.
또한, 상기 목질원료는 참나무, 소나무, 삼나무 및 백합나무로 이루어진 군에서 선택되는 산림청 조림권장 수종인 것을 특징으로 하나, 바람직하게는 100 내지 140 mesh 분말도의 참나무 목분을 액체 배지 1L에 20 내지 40 g으로 첨가하여 배양하며, 상기 목분을 액체 배지에 첨가하기 전에 1 내지 5% 농도의 NaOH로 전처리하면 눈꽃동충하초 균사체의 생장량을 높일 수 있다.
또한, 상기 광조건은 620 nm 내지 780 nm의 파장을 갖는 적색광과 380 nm 내지 500 nm의 파장을 갖는 청색광을 혼합한 LED 혼합광을 접종된 배지에 조사하여 균사체를 배양하는 것을 특징으로 하며, 상기 LED 혼합광을 1일 5 내지 15시간 동안 접종된 배지에 조사하여 균사체를 배양하는 것을 특징으로 한다.
상기와 같이 액체배지에 첨가되는 목질원료 조건 및 광조건 하에서 배양하면 눈꽃동충하초 균사체는 최대 생장량(14.9355 mg/mL)을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이때, 상기와 같은 배양조건 및 광조건을 벗어나면 본 발명에 따른 눈꽃동충하초 균사체가 제대로 수득되지 않거나, 눈꽃동충하초 수득 수율이 현저히 낮아져 경제적이지 못한 문제가 야기될 수 있다.
또한, 상기 눈꽃동충하초 균사체의 건중량은 목질원료의 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간과 하기의 수학식 1과 같은 상관관계를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
[수학식 1]
Y1=-1292.94187+17.78612X1+18.92425X2+2.11464X3
-0.019375X1X2-0.006276X1X3+0.008177X2X3-0.070169X1 2-0.292175X2 2-0.008818X3 2
(상기 수학식 1에서 Y1은 눈꽃동충하초 균사체의 건중량(mg/mL), X1은 목질원료의 분말도, X2는 목질원료의 함량 및 X3는 배양시간을 의미함.)
이때, 상기 눈꽃동충하초 균사체의 최대 건중량을 얻기 위한 상기 목질원료의 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 100 내지 140 mesh, 20 내지 40 g/L, 50 내지 100시간인 것을 특징으로 하며, 바람직하게 상기 목질원료의 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 118.533 mesh, 29.734 g/L, 91.4861 시간일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 눈꽃동충하초 균사체의 배양방법에 따라 배양된 눈꽃동충하초 균사체를 제공한다.
상기와 같이 배양된 눈꽃동충하초 균사체는 코디세핀이 함유되어 있으므로 면역증강활성, 항암활성을 위한 건강기능식품으로도 이용될 수 있을 것이다. 이에, 본 발명은 상기의 눈꽃동충하초 균사체의 배양방법에 따라 배양된 눈꽃동충하초 균사체를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품은 유효성분인 본 발명에 따라 배양된 눈꽃동충하초 균사체 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 눈꽃동충하초 균사체의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 눈꽃동충하초 균사체의 건중량을 예측하는 방법에 있어서, (a) 박스 벤켄 계획법(Box-Behnken design)으로 목질원료의 분말도(X1), 배지의 목질원료의 함량(X2), 배양시간(X3)에 대하여, -1, 0 및 1로 코드화하여 실험범위를 설계하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 설계된 실험범위로, 상기 목질원료의 분말도, 배지의 목질원료의 투입량 및 배양시간에 대한 실험값을 얻는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 실험값을 이용하여 하기 수학식 1로 표시되는 이차 회귀식 모델을 도출하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 도출된 수학식 1로 표시되는 이차 회귀식 모델을 변량분석(ANOVA)하여 상기 눈꽃동충하초 균사체의 건중량을 예측하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 건중량 예측방법을 제공한다.
[수학식 1]
Y1=-1292.94187+17.78612X1+18.92425X2+2.11464X3
-0.019375X1X2-0.006276X1X3+0.008177X2X3-0.070169X1 2-0.292175X2 2-0.008818X3 2
(상기 수학식 1에서 Y1은 눈꽃동충하초 균사체의 건중량(mg/mL), X1은 목질원료의 분말도(코드단위), X2는 목질원료의 함량(코드단위) 및 X3는 배양시간(코드단위)을 의미함.)
이때, 상기 눈꽃동충하초 균사체의 최대 건중량을 얻기 위한 상기 목질원료의 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 100 내지 140 mesh, 20 내지 40 g/L, 50 내지 100시간인 것을 특징으로 하며, 바람직하게 상기 목질원료의 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 118.533 mesh, 29.734 g/L, 91.4861 시간일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<참고예> 공시재료
동충하초 균사체의 생장량을 평가하기 위하여 눈꽃동충하초(Paecilomyces javanicus; P. javanicus)(KCCM 60299)를 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 분양받았다(도 1).
<
실시예
1>
목질원료
첨가에 따른 동충하초 균사체의 액체배양기술 확립
1. 목질 수종에 따른 동충하초 균사체의 액체배양기술 확립
1-1. 눈꽃동충하초(
Paecilomyces
javanicus
)의 목질 액체배양 및 생장량 분석
동충하초 균사체의 균사체량 증대를 위한 배양환경 조건을 확립하기 위하여 SDB(Sabouraud dextrose broth) 액체배양 배지 (pH 4.5; glucose 20 g/L; peptone 10 g/L)를 이용하였다.
상기 KCCM으로부터 분양받은 눈꽃동충하초(Paecilomyces javanicus) 균주를 PDA(Potato Dextrose Agar) 평판배지에서 4℃에 보존하면서 15일 간격으로 계대배양 하였으며, 균사 생장을 위해 PDA 평판배지를 이용하여 항온배양기에서 25℃로 7일간 배양하였다. 이후, 배양된 균사의 가장자리 부위를 직경 5 mm 코르크 보러를 사용하여 3core씩 액체배지에 접종하여 24℃에서 3일간 진탕배양 (100 rpm)하여 균사체량을 분석하였으며, 균사체 함량은 7일간 배양하여 분석하였다.
상기 액체배지는 100 mL 삼각플라스크에 SDB 배지 50 mL와 목질원료를 20 g/L 투입 후 121℃에서 15분간 살균한 다음 실온에서 냉각시켜 사용하였으며, 상기 목질 원료는 소나무, 삼나무, 백합나무, 참나무이며, 목질 액체배지 제조를 위하여 4종 목질원료 목부의 분쇄 및 0.15 mm 이하 (100 mesh pass)의 목분을 조제하여 이용하였다(도 2).
또한, 배양된 눈꽃동충하초 균사체의 생산량은 Carvajal et al. (2012)의 건중량 측정법에 의해 하기의 방법으로 측정되었다.
① 배양이 끝난 균사체 배양액을 falcon tube에 옮김.
② 원심분리 (4000 rpm, 10 min, 2회, Union 32R Plus, HANIL, Korea)를 실시하여 배양액과 균사체 분리.
③ 균사체에 담겨있는 falcon tube를 60℃에서 24시간 건조.
④ 미리 측정한 falcon tube의 전건무게를 이용하여 균사체 무게 도출.
1-2. 눈꽃동충하초(
Paecilomyces
javanicus
)의 목질 수종에 따른 액체배양의 생장량
P. javanicus 균사체의 목질 수종에 따른 액체배양 배지의 균사체 생장량은 도 3에 나타냈다.
결과적으로, P. javanicus 균사체는 참나무, 삼나무 및 백합나무 목분이 투입된 액체배지에서 가장 높은 균사체 건 중량(mycelia dry weight)를 나타냈으며, 특히 참나무 목분이 투입된 액체배지에서 균사체량은 12.0 mg/mL으로, 미처리구(대조구) 균사체량인 6.2 mg/mL 보다 1.9배 이상 높은 mycelia dry weight를 나타냄을 확인하였다. 이러한 눈꽃동충하초 균사체에서 생장량의 증대는 목분의 첨가가 액체배양에서 탄소원의 대체 효과를 나타냈기 때문일 것으로 추측된다.
2. 목질 첨가비율에 따른 동충하초 균사체의 액체배양기술 확립
2-1. 눈꽃동충하초(
Paecilomyces
javanicus
)의 목질 액체배양 및 생장량 분석
액체배지에 목질원료를 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L 및 30 g/L로 혼합하였으며, 목분을 투입하지 않은 액체배지(미처리)를 대조구로 사용하였다. 목질원료는 동충하초 균사체의 생장량 증대에 효과적인 것으로 확인된 참나무 (100 mesh pass)를 이용하였다.
상기 액체배지는 100 mL 삼각플라스크에 50 mL SDB 액체배지를 투입하고, PDA 평판배지에서 7일간 배양된 균사의 가장자리 부위를 직경 5 mm 코르크 보러를 사용하여 3core씩 접종하고, 액체배양은 24℃, 100 rpm의 shaking incubator에서 수행하였으며, 7일간 배양된 동충하초 배양액은 균사체량 분석에 이용하였다.
또한, 배양된 눈꽃동충하초 균사체의 생산량은 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 측정되었다.
2-2. 눈꽃동충하초(
Paecilomyces
javanicus
)의 목질 첨가비율에 따른 액체배양의 생장량
P. javanicus 균사체의 참나무 목분 (100 mesh pass)의 액체배지 투입량에 따른 액체배양 배지의 균사체 생장량은 도 4에 나타냈다.
결과적으로, P. javanicus 균사체는 액체배지에 투입되는 참나무 목분의 함량이 증가함에 따라 mycelia dry weight가 유의적으로 증가하는 것으로 확인되었다 또한, P. javanicus는 참나무 목분을 5-10 g/L 투입했을 때 미처리구와 유의성이 없는 것으로 확인되었으며, 20-30 g/L 투입했을 때 미처리구보다 유의적으로 증가된 mycelia dry weight를 나타내는 것으로 확인되었다. 특히 30 g/L를 액체배지에 투입했을 때 액체배지에서 균사체량은 13.38 mg/L 으로 가장 높은 mycelia dry weight를 나타냈으며, 미처리구(대조구) 균사체량인 6.2 mg/mL 보다 약 2.1배 증가함을 확인하였다.
3. 목질
분말도에
따른 동충하초 균사체의 액체배양기술 확립
3-1. 눈꽃동충하초(
Paecilomyces
javanicus
)의 목질 액체배양 및 생장량 분석
참나무 목분의 분말도는 100 mesh pass 120 mesh on, 120 mesh pass 140 mesh on 및 140 mesh pass로 조제하여 사용하였다(도 5).
상기 100 mesh, 120 mesh 및 140 mesh는 각각 0.15 mm, 0.125 mm 및 0.105 mm의 sieve size를 의미하며, sieve를 이용한 분급을 수행하기 전, 참나무 칩을 grinder를 이용하여 분쇄하여 이용하였다. Grinder를 이용하여 목분 제조시, grinder의 내부 온도가 과열되지 않도록 주의하여 사용하였으며, 참나무 칩은 grinder에 투입하기 전에 전정가위를 사용하여 2 cm × 2 cm 이하의 크기로 제조하였다. 목분 제조 후, 함수율을 측정하여 건 중량(dry weight)을 기준으로 액체배지에 투입하였다.
상기 참나무 목분의 분말도 조건만 달리하여 실시예 1-1과 동일한 방법으로 액체배양 하였으며, 배양된 눈꽃동충하초 균사체의 생산량 또한 실시예 1-1과 동일한 방법으로 측정되었다.
3-2. 눈꽃동충하초(
Paecilomyces
javanicus
)의 목질
분말도에
따른 액체배양의 생장량
P. javanicus 균사체의 액체배지에 투입된 참나무 목분의 분말도에 따른 액체배양 배지의 균사체 생장량은 도 6에 나타냈다.
결과적으로, 동충하초 균사체량은 참나무 목분의 분말도에 영향을 받는 것으로 확인되었으며, 특히 분말도가 높아짐에 따라 균사체량 또한 유의적으로 증가함을 확인하였다.
이러한 눈꽃동충하초 균사체에서 생장량의 증대는 참나무 목분의 분말도가 높아짐에 따라 표면적이 증가하고, 이로 인하여 참나무 목분이 탄소원으로써 효과적으로 작용했을 것으로 추측된다.
<실시예 2> 목질원료 전처리에 따른 동충하초 균사체의 액체배양기술 확립
1. 전처리된 목질 첨가에 따른 동충하초 균사체의 액체배양기술 확립
1-1. 눈꽃동충하초(
Paecilomyces
javanicus
)의 목질 액체배양 및 생장량 분석
액체배지에 투입된 전처리된 참나무 목분이 동충하초 균사체량에 미치는 영향을 평가하였다. 참나무 목분(140 mesh pass)의 전처리 방법은 1% NaOH, hot water 및 에탄올(ethanol) 처리를 적용하였다.
상기 1% NaOH와 ethanol 전처리는 참나무 목분(140 mesh pass)과 전처리액을 부피기준 1:20 비율로 혼합하여 30℃ shaking incubator에서 overnight로 반응시켰으며, 반응이 종료된 후 Whatman filter paper No. 2를 사용하여 감압여과 후 잔사를 60℃ 건조기에서 72시간 건조하여 사용하였다. 또한, 상기 Hot water 전처리는 참나무 목분(140 mesh pass)과 증류수를 부피기준 1:20으로 혼합 후 121℃ autoclave에서 1시간 동안 반응시킨 후 Whatman filter paper No. 2를 사용하여 감압 여과하였으며, 여과 후 잔사를 60℃ 건조기에서 72시간 건조하여 사용하였다. 전처리된 참나무 목분은 도 7에 나타내었다.
상기 참나무 목분의 전처리 조건만 달리하여 실시예 1-1과 동일한 방법으로 액체배양 하였으며, 배양된 눈꽃동충하초 균사체의 생산량 또한 실시예 1-1과 동일한 방법으로 측정되었다.
1-2. 눈꽃동충하초(
Paecilomyces
javanicus
)의 목질 전처리에 따른 액체배양의 생장량
P. javanicus 균사체의 액체배지에 투입된 참나무 목분의 전처리 용매에 따른 액체배양 배지의 균사체 생장량은 도 8에 나타냈다.
결과적으로, 참나무 분말을 1% NaOH로 전처리한 후 잔사를 동충하초 액체배지에 투입했을 때, hot water 및 ethanol 전처리한 참나무 분말을 투입했을 때 보다 높은 균사체량을 나타냄을 확인하였다.
이러한 눈꽃동충하초 균사체에서 생장량의 증대는 참나무 목분의 알칼리 추출 후 잔사는 페놀 물질 등 리그닌 일부가 제거되어 버섯 균사체 생장에 유리하게 작용했을 것으로 추측된다.
<
실시예
3> 동충하초 균사체의 목질 액체배지와 LED 광의 복합 배양 기술 확립
1. 눈꽃동충하초(
Paecilomyces
javanicus
)의 목질 액체배지 및 LED 광의 복합 배양 및 생장량 분석
목질 액체배지와 LED 단일광의 복합 공정에 따른 동충하초 균사체 생장량 변화를 평가하기 위하여 shaking incubator에 설치된 LED 복합광을 이용하였다.
상기 복합광은 red*blue(660+450 nm) 3:7 비율을 사용하였으며, 광스펙트럼측정기 (LI-180)을 이용하여 단일광을 혼합(복합광 혼합은 LED 전문업체인 빛솔 LED에서 조절 및 검증)하였다. 광원은 배양액의 약 30 cm 높이에 설치되었으며, 광도는 64.9~108.0 pmol·m-2·s- 1 로 설정하여 12 h/day로 조사하였다. 대조군으로 암배양, 형광등 및 UV-A 조건으로 배양하였다.
또한, 상기 목질 액체배지는 1% NaOH 처리된 참나무 목분(140 mesh)을 30 g/L 투입하였다.
상기 목질 액체배지 및 LED 광의 조건에 따라 실시예 1-1과 동일한 방법으로 액체배양 하였으며, 배양된 눈꽃동충하초 균사체의 생산량 또한 실시예 1-1과 동일한 방법으로 측정되었다.
2. 눈꽃동충하초(
Paecilomyces
javanicus
)의 목질 액체배지 및 LED 광의 복합 배양에 따른 생장량
P. javanicus 균사체의 전처리된 참나무가 투입된 액체배지 및 LED 광의 복합 배양에 따른 배지의 균사체 생장량은 도 9에 나타냈다.
결과적으로, 전처리된 참나무를 이용한 목질 액체배지와 LED 광의 복합 배양 적용이 눈꽃동충하초의 균사체량 증대에 효과적임을 확인하였다.
<
실시예
4> 균사체의 최대 생장량을 위한 액체배양 배지의 최적 제어 조건 도출
상기 실시예 1 내지 3에서 도출된 결과를 이용하여 눈꽃동충하초 균사체 생장량 증대를 위한 1% NaOH로 전처리된 참나무 목분의 투입조건을 최적화하기 위하여 최적 배지 조성 제어 조건은 반응 표면 모델(Response Surface Model;RSM)의 박스 벤켄 계획법(Box-Benkhen design;BBD) 실험설계를 이용하였으며, 프로그램은 Design-Expert Software Version 12를 이용하였다.
고정 인자는 눈꽃동충하초(P. javanicus) 균사체이며, 변수는 목질 분말조건(Particle size; X1), 배지의 목질 투입량(Input weight; X2), 배양시간(Incubation time; X3)으로 설정하였다. 이때, 변수의 범위는 예비 실험을 통하여 설정하였으며, BBD 실험 설계는 하기 표 1에서와 같이 총 17조건으로 설정하였다.
| Run |
독립변수(Independent variables)
(coded) |
독립변수(Independent variables)
(actual) |
P. javanicus 균사체 건중량 (Mycelia dry weight), mg/mL | |||||||
| X 1 | X 2 | X 3 | X 1 | X 2 | X 3 | Y 1 | ||||
| 1 | 0 | -1 | -1 | 120 | 20 | 24 | 77.5 | |||
| 2 | 0 | 0 | 0 | 120 | 30 | 72 | 131.8 | |||
| 3 | 0 | 0 | 0 | 120 | 30 | 72 | 143.8 | |||
| 4 | -1 | 0 | 1 | 100 | 30 | 120 | 118.7 | |||
| 5 | -1 | 1 | 0 | 100 | 40 | 72 | 73.6 | |||
| 6 | 0 | 0 | 0 | 120 | 30 | 72 | 125.6 | |||
| 7 | 1 | 0 | -1 | 140 | 30 | 24 | 68.5 | |||
| 8 | 0 | 0 | 0 | 120 | 30 | 72 | 133.7 | |||
| 9 | 1 | -1 | 0 | 140 | 20 | 72 | 91.5 | |||
| 10 | -1 | 0 | -1 | 100 | 30 | 24 | 68.2 | |||
| 11 | 0 | 0 | 0 | 120 | 30 | 72 | 144.9 | |||
| 12 | 0 | -1 | 1 | 120 | 20 | 120 | 95.9 | |||
| 13 | 0 | 1 | -1 | 120 | 40 | 24 | 69.1 | |||
| 14 | 1 | 1 | 0 | 140 | 40 | 72 | 70.6 | |||
| 15 | 1 | 0 | 1 | 140 | 30 | 120 | 94.9 | |||
| 16 | 0 | 1 | 1 | 120 | 40 | 120 | 103.2 | |||
| 17 | -1 | -1 | 0 | 100 | 20 | 72 | 79.0 | |||
| Independent variables | Levels | |||||||||
| -1 | 0 | 1 | ||||||||
| X1: Particle size, mesh | 100 | 120 | 140 | |||||||
| X2: Input weight, g | 20 | 30 | 40 | |||||||
| X3: Incubation time, h | 24 | 72 | 120 | |||||||
도 10은 각 인자간의 상호관계를 반응 표면으로 나타낸 3차원 반응 표면 그래프, 도 11은 유도된 2차 다항방정식 회귀식 모델 및 도 12는 상기 2차 회귀식 모델을 변량분석(ANOVA)하여 상기 눈꽃동충하초 균사체의 건중량 예측을 나타낸 것으로, 결과적으로 눈꽃동충하초 균사체의 최대 균사체량은 14.9355 mg/mL이며, 이때의 분말도는 118.533 mesh, 투입량은 29.734 g/L, 배양시간은 91.4861 시간인 것으로 확인되었다.
도출된 예측식을 이용하여 분말도, 투입량, 배양시간의 데이터로부터 동충하초 균사체의 균사체량을 예측할 수 있을 것으로 판단되며, 이때의 예측값은 실측값과 P value <0.001의 신뢰도를 나타내는 것으로 확인되었다.
Claims (16)
100 내지 140 mesh의 분말도를 갖는 목질원료를 1 내지 5% 농도의 NaOH로 전처리하는 단계;
눈꽃동충하초 균사를 상기 목질원료가 투입된 액체 배지에 접종하는 단계; 및
접종된 배지를 광조건에서 배양하여 눈꽃동충하초 균사체를 얻는 배양단계; 를 포함하고,
상기 눈꽃동충하초 균사체의 건중량은,
목질원료의 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간과 하기의 수학식 1과 같은 상관관계를 가지는 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법:
[수학식 1]
Y1=-1292.94187+17.78612X1+18.92425X2+2.11464X3
-0.019375X1X2-0.006276X1X3+0.008177X2X3-0.070169X1 2-0.292175X2 2-0.008818X3 2
(상기 수학식 1에서 Y1은 눈꽃동충하초 균사체의 건중량(mg/mL), X1은 목질원료의 분말도, X2는 목질원료의 함량 및 X3는 배양시간을 의미함.)
눈꽃동충하초 균사를 상기 목질원료가 투입된 액체 배지에 접종하는 단계; 및
접종된 배지를 광조건에서 배양하여 눈꽃동충하초 균사체를 얻는 배양단계; 를 포함하고,
상기 눈꽃동충하초 균사체의 건중량은,
목질원료의 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간과 하기의 수학식 1과 같은 상관관계를 가지는 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법:
[수학식 1]
Y1=-1292.94187+17.78612X1+18.92425X2+2.11464X3
-0.019375X1X2-0.006276X1X3+0.008177X2X3-0.070169X1 2-0.292175X2 2-0.008818X3 2
(상기 수학식 1에서 Y1은 눈꽃동충하초 균사체의 건중량(mg/mL), X1은 목질원료의 분말도, X2는 목질원료의 함량 및 X3는 배양시간을 의미함.)
제 1항에 있어서,
상기 목질원료는 참나무, 소나무, 삼나무 및 백합나무로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법.
상기 목질원료는 참나무, 소나무, 삼나무 및 백합나무로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법.
제 1항에 있어서,
상기 목질원료는 액체 배지 1L에 20 내지 40 g으로 포함되는 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법.
상기 목질원료는 액체 배지 1L에 20 내지 40 g으로 포함되는 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법.
삭제
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제 1항에 있어서,
상기 배양은 3일 내지 7일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법.
상기 배양은 3일 내지 7일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 목질원료의 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 100 내지 140 mesh, 20 내지 40 g/L, 50 내지 100시간인 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법.
상기 목질원료의 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 100 내지 140 mesh, 20 내지 40 g/L, 50 내지 100시간인 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법.
제 10항에 있어서,
상기 목질원료의 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 118.533 mesh, 29.734 g/L, 91.4861 시간인 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법.
상기 목질원료의 분말도, 배지의 목질원료 함량 및 배양시간의 배양조건은 각각 118.533 mesh, 29.734 g/L, 91.4861 시간인 것을 특징으로 하는 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법.
제 1항의 방법에 따라 배양된 눈꽃동충하초 균사체.
제 1항의 방법에 따라 배양된 눈꽃동충하초 균사체를 포함하는 건강기능식품.
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| KR1020200165588A KR102600164B1 (ko) | 2020-12-01 | 2020-12-01 | 목질 액체배지와 led를 이용한 눈꽃동충하초 균사체의 함량을 증대하는 배양방법 |
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