KR102579848B1 - 항진균 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 진균증의 치료에 유용한 명세서에 정의된 바와 같은 화합물, 이를 함유하는 조성물 및 이의 치료 용도에 관한 것이다.

Description

항진균 화합물{ANTIMYCOTIC COMPOUND}
본 발명은 진균증의 치료에 유용한 화합물, 이를 함유하는 조성물 및 치료 용도에 관한 것이다.
진균 감염의 발생률은 지난 20년간 크게 증가했으며, 침입형은 특히 면역손상 또는 면역억제 환자에서, 이환 및 사망의 주요 원인이다. 간질 칸디다증, 폐 아스퍼질러스증, 및 최근에 생겨난 기회감염 진균이 이러한 진균증을 일으키는 가장 흔한 인자이다. 진균을 함께 결합시키고 이들을 이들의 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 기질에 부착되게 하는 세포외 기질(ECM)을 생성할 수 있다는 것이 진균의 특별한 특징이다. 이 바이오필름은 숙주 면역계의 적대적인 환경으로부터 그들을 보호하고 미생물 살해에 저항하는 역할을 한다(Kaur and Singh, 2013).
폐 아스퍼질러스증은 비침습적 질병으로 고통받는 환자와 침습성 상태의 환자로 나눌 수 있다. 아스퍼질러스증에 알레르기 성분(ABPA로 알려짐; 알레르기성 기관지 폐 아스퍼질러스증)이 있는 환자를 그렇지 않은 환자와 비교하여 환자를 특성화하기 위해 더 세분화된 하위-분류가 사용된다. 폐 아스퍼질러스증에 관여되는 요인은 급성, 예컨대 고용량의 면역-억제제 또는 중환자실에서 인튜베이션에의 노출일 수 있다. 대안적으로, 그들은 만성, 예컨대 TB에 의한 이전의 감염일 수 있다(Denning et al., 2011a). 아스퍼질러스에 의한 만성 폐감염은 광범위하고 영구적인 폐 손상을 일으킬 수 있으며, 경구용 아졸 약물로 평생 치료해야 한다(Limper et al., 2011).
아스퍼질러스 감염이 임상적 천식에서 중요한 역할을 할 수 있다는 연구가 증가하고 있다(Chishimba et al., 2012; Pasqualotto et al., 2009). 더욱이, 최근 발표된 연구 결과는 COPD를 갖는 환자에서 임상 결과가 좋지 않음을 아스퍼질러스 감염과 연관짓고 있다(Bafadhel et al., 2013). 유사하게 교차-상관(cross-sectional) 연구는 가래 및 폐기능 악화에서, 아스퍼질러스 속(Aspergillus spp .) 및 칸디다 속(Candida spp .) 사이의 연관성을 보여준다(Chotirmall et al., 2010; Agbetile et al., 2012).
침습성 아스퍼질러스 증(IA)은 면역손상 환자, 예를 들어, 동종 줄기세포 이식 또는 고형 장기 이식(예컨대 폐 이식)을 받는 환자에서 높은 사망률을 보인다. 면역손상 환자에서 보고된 IA의 첫 사례는 1953년에 발생하였다. 이 사건은 치료 요법으로 코티코스테로이드 및 세포독성 화학요법의 도입과 동시에 일어났다(Rankin, 1953). 침습성 아스퍼질러스 증은 백혈병 및 다른 혈액학성 악성종양의 높은 발생률과 관련 사망률을 고려할 때 치료에서 주요 관심사이다. 사망률은 보통 50%를 초과하고(Lin et al., 2001), 경구용 트리아졸 의약을 이용함에도 불구하고, 장기 비율은 동종 조혈줄기세포 이식 환자에서 90%에 달할 수 있다(Salmeron et al., 2012). 고형 장기 이식(특히 폐)을 받는 환자의 경우, 고용량 스테로이드를 사용하면 환자가 감염에 취약해지고(Thompson and Patterson, 2008) 이는 심각한 문제이다. 이 질병은 면역손상이 덜 심한 환자 집단에서도 나타났다. 이들은 내재성 COPD 또는 간경변으로 고통받는 환자들, 고용량 스테로이드를 받는 환자들, 및 중심정맥카테터(central venous catheter)가 장착되거나 기계적 인공호흡에 의지하는 개체들을 포함한다(Dimopoulos et al., 2012).
기존의 항진균 의약은 주로 경구 또는 전신으로 투여된다. 이러한 통상적으로 이용되는 전달 경로는 폐 기도 감염의 치료에 좋지 않으며, 이는 감염 부위에서 달성되는 약물 농도가 장기에서의 농도보다 낮기 때문이다. 이것은 특히 독성 부위인 간에 대해 그러하다: 보리코나졸로 치료되는 환자의 최대 15%가 증가된 트랜스아미나제 수준을 겪는다(Levin et al., 2007; Lat and Thompson, 2011). 간 노출은 또한 간 P450 효소의 저해로부터 발생하는 상당한 약물 상호작용을 초래한다(Jeong, et al., 2009; Wexler et al., 2004).
또한, 임상 및 농업 분야 모두에서 트리아졸의 광범위한 사용은 일부 지역에서 내성 진균증을 증가시키고 문제를 야기했다 (Denning et al., 2011b; Bowyer and Denning, 2014).
개선된 효능 및 보다 우수한 전신 내성 프로파일을 제공하는 항진균 의약에 대한 시급한 의학적 필요성이 명확해졌다.
발명의 요약
일 양태로서, 본 발명은 4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-트리아졸-1-일)메틸)-5-(2,4-디플루오로페닐)테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)-N-(4-플루오로페닐)벤즈아미드인 하기 화합물 (I), 및 약제학적으로 허용되는 그의 염(이하 "본 발명의 화합물"로 칭한다)을 제공한다:
Figure 112017048060482-pct00001
하기에 개시된 생물학적 데이터는 본 발명의 화합물인, 화합물 (I)이 시험관 내 분석에서 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 성장에 대한 강력한 억제제라는 것을 보여준다. 면역손상 마우스에서 화합물 (I)은 아스퍼질러스 푸미가투스 감염의 강력한 억제를 증명하였다. 화합물 (I)의 다른 바람직한 특성이 본 명세서에 기재된다.
도 1은 아스퍼질러스 푸미가투스 감염되고 면역손상된 호중구 감소증 마우스의 폐에서 CFU에 대한 화합물 (I)의 예방 및 치료 효과를 나타낸다.
도 2 및 도 3은 아스퍼질러스 푸미가투스 감염되고 면역손상된 호중구 감소증 마우스의 BALF 및 혈청 각각에서, 갈락토만난 농도에 대한 화합물 (I)의 예방 및 치료 효과를 나타낸다.
도 1 내지 3에서, 기호 *** 는 P<0.001의 유의성을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
반응식 1: 경로 1-3에 의한 화합물 (I)의 제조
Figure 112017048060482-pct00002
상업적으로 입수 가능한 출발 물질로부터 화합물 (I)의 제조를 위해 개발된 세가지의 대안적 수렴적 경로가 상기에 기재되어 있다 (반응식 1). 이들 합성 방법은 화학식 (IV)의 벤조산 에스테르 중간체가 제조되는 방식이 상이하다.
경로 1
적절하게 보호된 피페라진 유도체 (XII)와 4-브로모-2-메틸페놀 (XIVa)의 전형적인 조건 하 버크월드(Buchwald) 커플링 반응은 모노 N-아릴화 피페라진 (XI)을 제공한다. 이러한 변형에 적합한 질소 보호기는 우레탄으로써, Boc기 (P = CO2 tBu)를 사용하는 것이다. 당업자는 이러한 종류의 변형에 영향을 미치기 위한 다양한 조건이 사용될 수 있음을 알 것이다. 특히, 팔라듐 촉매 및 RuPhosG3 및 RuPhos와 같은 포스핀 리간드는 염기 존재 하 통상적으로 사용되며, 예를 들어, 세슘 카보네이트 또는 리튬 헥사메틸디실아자이드이다. 기본 조건에서, 생성된 페놀 (XI)를 토실레이트 (IX)와 알킬화하면, 에테르 (VII)가 생성된다. 토실레이트 (IX)는 구조적으로 안정하고, 널리 이용 가능한 비휘발성 (고체) 시약이고, 상업척 출처로부터 높은 거울상체 순도에서; 대응되는 메실레이트와 같은 다른 친전자성 유도체 및 할로메틸 (예:클로로메틸 및 브로모메틸) 유도체가 이러한 변형의 적절한 대안으로 예상된다. 질소 보호기의 제거는 일-치환된 피페라진 (V)을 나타낸다. Boc 유도체 (Rb=CO2 tBu)의 경우, 아민 탈보호 단계는 전형적으로 카바메이트를 강한 무기산 또는 유기산, 예컨대 TFA에, 순수하게 또는 용매, 예컨대 DCM에서 노출시킨다. 아민 (V)과 알킬 4-브로모벤조에이트 (VI)의 제2 버크월드 커플링은, 염기성 조건 및 촉매 작용하에서, Ra가 저급 알킬, 예컨대 C1-5 알킬, 예를 들어 메틸 또는 에틸, 또는 tert-부틸인 N,N'-비스아릴화(bisarylated) 생성물 (IV)이 생기게 한다.
경로 2
벤조에이트 에스테르 중간체 (IV)는, 단일 팔라듐-매개 커플링이 요구되는 대안적 과정에서 얻을 수 있다. 표준 버크월드 커플링 조건 하, 브로모페놀 (XIVa)과 모노 N-아릴화 피페라진 유도체 [(X), Ra=저급 알킬, 예컨대 C1-5 알킬, 예를 들어 메틸 또는 에틸, 또는 tert-부틸]의 반응은 1,4-비스아릴피페라진 (VIII)을 생성한다. 페놀성 생성물과 토실레이트 (IX)의 O-알킬화는, 상기에 기재된 바와 같이, 상업적으로 입수 가능한 출발 물질로부터 2단계에 의해 에테르 생성물 (IV)을 제공한다.
경로 3
몇몇 경우에 동일 또는 유사한 합성 변형을 상이한 순서로 수행하는 것이 유리하다는 상기에서 설명한 제조 경로 (반응식 1)로부터, 공정의 전반적인 효율 및/또는 이로부터 수득한 물질의 품질을 향상시킬 수 있음이 인식될 것이다. 예를 들어, 브로모페놀 (XIVa)는 상기에 서술된 2개의 단계를 역순으로 수행함으로써, 화학식 (IV)의 화합물로 변형될 수 있다. 이런 식으로, 상기 페놀의 토실레이트 (IX) 처리는 화학식 (XIII)의 에테르 유도체를 제공한다. 이 아릴 브로마이드 기질은 위에 기재된 바와 같은 버크월드 커플링 조건 하, 화학식 (X)의 N-아릴피페라진과 반응하여 화학식 (IV)의 중간체를 제공할 수 있다.
중간체 (IV)로부터 화합물 (I)의 제조
몇몇 경우에, 예를 들어 Ra가 메틸 또는 에틸인 경우, 유리 벤조산 (II)의 생성은 에스테르 (IV)를 물 존재 하 염기로 처리함으로써 간편하게 수행된다. 전형적인 조건은 물 및 적합한 수성 혼합 용매의 혼합물 중, 알칼리 금속 수산화물, 예컨대 리튬 수산화물로 처리하는 것을 포함한다. 다른 경우, tert-부틸 에스테르에서와 같이, 산성 조건 하 가수분해 단계를 수행하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 상호전환을 위한 통상적인 시약은, 유기용제, 예컨대 IPA와 같은 유기 용매의 존재 하, 강한 무기산, 예를 들어 염산을 포함한다.
당업계에 널리 알려진 표준 아미드 커플링 조건 하, 벤조산 생성물 (II)을 4-플루오로아닐린으로 처리하는 것은, 본 발명의 화합물 (I)을 제공한다. 예를 들어 반응은, DMF와 같은 극성 비양성자성 용매에서, 비친핵성 유기 염기, 전형적으로 DIPEA 등의 존재 하, 산 (II) 및 4-플루오로아닐린을 커플링제 HOBt 및 EDCl와 혼합함으로써 수행될 수 있다.
반응식 2: 경로 4에 의한 화합물 (I)의 제조
Figure 112017048060482-pct00003
경로 4
본 발명의 화합물은 명세서에 기재된 제조기술의 또 다른 변형을 사용하여 생성할 수 있다 (반응식 2). 이 대안적 과정 (경로 4)에서 아미드 결합 형성은 한 단계로서 수행되고 에테르 결합의 생성은 최종 합성 변형이 된다. 4-플루오로아닐린 (III)을 4-브로모벤조일 클로라이드 (XX)로 아실화하는 것은 아닐리드 단편 (XIX)을 제공한다. 이미 언급한 바와 같이, 이러한 아미드 생성물은 당업계에서 널리 선택 가능한 펩티드 커플링제를 포함하는 다양한 활성화제를 직접적으로 사용하여, 상응하는 아민 및 벤조산으로부터 제조될 수 있다. 상기 기재된 방식의 촉매 존재 하, 아릴 브로마이드 생성물을 적합한 모노-보호 피페라진 (XII)과 함께 버크월드 커플링 조건으로 처리하는 것은 화학식 (XVIII)의 중간체가 생기게 한다. Boc 보호기 [P=CO2 tBu]의 경우에, 원하는 N-아릴 피페라진 (XVII)은 강산에 짧은 노출로 쉽게 얻는다. 예를 들어, TFA로 처리하여, 이를 감압 증발로 반응 매질로부터 간편하게 제거할 수 있다. 화합물 (I)의 페놀성 전구체, [(XV); Rc=H]가 브로모-아니솔 (XIVb)과의 제2 버크월드 커플링으로부터 2단계로 유도되고, 메틸 에테르 중간체 [(XVI) Rc=Me]를 수득하고, 삼브롬화 붕소로 O-탈알킬화시켰다. 페놀 (XV)는 이전에 기재된 방식으로 토실레이트 시약 (IX)으로 재-알킬화함으로써 화합물 (I)로 전환하였다.
보호기 및 제거 방법은 문헌("Protective Groups in Organic Synthesis", Theodora W. Greene 및 Peter G. M. Wuts, John Wiley & Sons Inc; 4th Rev Ed., 2006, ISBN-10: 0471697540)에 기재되어 있다. 아미드 제조방법에 대한 검토는 문헌("Amide bond formation and peptide coupling" Montalbetti, C.A.G.N. 및 Falque, V. Tetrahedron, 2005, 61, 10827-10852) 에서 다루고 있다.
따라서 본 발명은 또한 화학식 (II)의 화합물; 또는 이의 활성화 유도체(예컨대 산 할라이드, 예: 산 클로라이드 또는 산무수물); 또는 이의 염을 하기 화학식 (III)의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는, 화합물 (I) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 제조방법을 제공한다:
Figure 112017048060482-pct00004
Figure 112017048060482-pct00005
상기 식에서
Ra는 수소를 나타낸다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 (XV)의 화합물 또는 이의 염을 화학식 (IX)의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는 화합물 (I) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 제조방법을 제공한다:
Figure 112017048060482-pct00006
Figure 112017048060482-pct00007
상기 식에서
Z는 이탈기, 예컨대 p-톨릴SO2O 또는 이의 염을 나타낸다.
화학식 (I) 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 특히, 상기 화합물의 약제학적으로 허용되는 산 부가 염을 포함한다. 화학식 (I)의 화합물의 약제학적으로 허용되는 산 부가 염은, 화학식 (I)의 화합물이 형성할 수 있는 치료학적으로 활성인 무-독성 산 부가 염을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용되는 산 부가 염은 유리 염기 형태를, 적합한 용매 또는 용매 혼합물 중에서 이러한 적합한 산으로 처리함으로써 간편하게 얻을 수 있다. 적합한 산은, 예를 들어, 무기산, 예를 들어 할로겐화수소산, 예를 들어 염산 또는 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등; 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 하이드록시아세트산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 사이클라민산, 살리실산, p-아미노살리실산, 파모산 등을 포함한다.
역으로 상기 염 형태는 적절한 염기로 처리하여 유리 염기 형태로 전환될 수 있다.
화학식 (I)의 화합물의 정의는 상기 화합물의 모든 토토머를 포함하는 것으로 의도된다.
화학식 (I)의 화합물의 정의는 문맥상 특별히 다르게 나타내지 않는 한, 상기 화합물의 모든 용매화물(상기 화합물의 염의 용매화물을 포함함)을 포함하는 것으로 의도된다. 용매화물의 예는 수화물을 포함한다.
본 발명의 화합물은 상기 하나 이상의 원자가 자연 발생 또는 비-자연 발생 동위원소인 실시양태를 포함한다. 일 실시양태에서 동위원소는 안정한 동위원소이다. 따라서 본 발명의 화합물은, 예를 들어 중수소 함유 화합물 등을 포함한다.
본원발명은 또한 정의된 화합물의 모든 다형성 형태로 확장된다.
본원에 기재된 화학식 (II), (IV), (V), (VII), (VIII), (XIII) 및 (XV)의 신규한 중간체 및 이의 염은, 본 발명의 추가 양태를 형성한다. 염은 약제학적으로 허용되는 염(상기에 언급한 바와 같음) 및 비-약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 산(예: 카르복실산)의 염은 소듐, 포타슘, 마그네슘 및 칼슘염을 포함하는 제1족 및 제2족의 금속염을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명의 화합물이 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 임의로 조합된 약제학적 조성물이 제공된다.
적절하게는, 본 발명의 화합물은 폐 또는 코에 국소적으로, 특히 폐에 국소적으로 투여된다. 따라서, 일 양태에서 하나 이상의 국소적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 임의로 조합된 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
폐 또는 코 투여에 적절한 조성물은 분말, 액체 용액, 액체 현탁액, 용액 또는 현탁액을 포함하는 점비액, 또는 가압 또는 비-가압 에어로졸을 포함한다.
상기 조성물은 단위 투약 형태로 간편하게 투여될 수 있으며 제약 분야에서 널리 공지된 임의의 방법, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985)]에 기재된 방법으로, 제조될 수 있다.
코 또는 폐에 대한 국소적 투여는 수용액 또는 현탁액과 같은 비-가압 제제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 제제는 분무기(nebuliser), 예를 들어 핸드-헬드(hand-held) 및 휴대용, 또는 가정 또는 병원용(즉, 휴대용이 아님)에 의해 투여될 수 있다. 예시적인 장치는 RESPIMAT 흡입기이다. 제제는 물, 완충제, 등장화제, pH 조절제, 점도 조절제, 계면 활성제 및 공-용매(예: 에탄올)와 같은 부형제를 포함할 수 있다. 현탁액 및 에어로졸 제제(가압 또는 비가압)는 전형적으로 본 발명의 미세 분할 형태, 예를 들어 0.5-10 μm의 D50, 예를 들어 약 1-5 μm형태를 포함할 것이다. 입자 크기 분포는 D10, D50 및 D90 값을 사용하여 표현할 수 있다. 입자 크기 분포의 D50 중간값은 분포를 절반으로 나눈 마이크론 단위의 입자 크기로 정의된다. 본원에서 사용된 Dv 값은 레이저 회절을 사용하여 측정된 입자 크기 분포를 의미한다. 유사하게, 레이저 회절과 관련하여 사용된 D10 및 D90 값은 Dv10 및 Dv90 값을 의미하며, 분포의 10%가 D10 값 아래에 있고, 분포의 90%가 D90 값 아래에 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 수성 매질에 현탁된 미립자 형태의 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 수성 매질은 전형적으로 물 및 완충제, 등장화제, pH 조절제, 점도 조절체 및 계면활성제로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다.
코 또는 폐에 대한 국소적 투여는 또한 에어로졸 제제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 에어로졸 제형은 전형적으로 클로로플루오로카본(CFC) 또는 하이드로플루오로카본(HFC)과 같은 적절한 에어로졸 추진체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 포함한다. 적절한 CFC 추진체는 트리클로로모노플루오로메탄 (추진체 11), 디클로로테트라플루오로메탄 (추진체 14) 및 디클로로플루오로메탄 (추진체 12)을 포함한다. 적합한 HFC 추진제는 테트라플루오로에탄 (HFC-134a) 및 헵타플루오로프로판 (HFC-227)을 포함한다. 추진체는 전형적으로 총 흡입 조성물의 40중량%-99.5중량%, 예를 들어 40중량%-90중량%를 포함한다. 제제는 보조-용매(예: 에탄올) 및 계면활성제(예: 레시틴, 소르비탄 트리올레이트 등)를 포함하는 부형제를 포함할 수 있다. 다른 가능한 부형제는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 글리세린 등을 포함한다. 에어로졸 제제는 캐니스터 내에 포장되고, 적절한 투여량은 계량 밸브(예: Bespak, Valois 또는 3M에 의해 공급됨, 대안적으로 Aptar, Coster 또는 Vari에 의해 공급됨)에 의해 전달된다.
폐에 대한 국소적 투여는 또한 건조-분말 제제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 건조 분말 제제는 미세 분할된 본 발명의 화합물, 전형적으로 1-10 μm의 MMD 또는 0.5-10 μm의 D50, 예를 들어 약 1-5 μm형태를 포함할 것이다. 본 발명 화합물의 분말은 미세화 공정 또는 유사 크기축소 공정에 의해 제조될 수 있다. 미세화는 Hosokawa Alpine에 의해 제조된 것과 같은 제트밀을 사용하여 수행될 수 있다. 생성된 입자 크기 분포는 레이저 회절(예: Malvern Mastersizer 2000S 기구)을 사용하여 측정될 수 있다. 제제는 전형적으로 국소적으로 허용되는 희석제, 예컨대 락토오스, 글루코오스 또는 만니톨(바람직하게는 락토오스), 비교적 큰 입자 크기, 예를 들어 MMD의 50 μm이상, 100 μm이상, 또는 D50의 40-150 μm을 함유할 것이다. 본 발명에서 사용된, 용어 "락토오스" 는 α-락토오스 일수화물, β-락토오스 일수화물, α-락토오스 무수물, β-락토오스 무수물 및 무정형(amorphous) 락오토스를 포함하는 락토오스-함유 성분을 의미한다. 락토오스 성분은 미분화, 체질(sieving), 분쇄, 압축, 응집 또는 분무 건조에 의해 처리될 수 있다. 다양한 형태의 상업적으로 입수 가능한 형태의 락토오스도 포함되며, 예를 들어 Lactohale® (inhalation grade 락토오스; DFE Pharma), InhaLac®70 (sieved lactose for dry powder inhaler; Meggle), Pharmatose® (DFE Pharma) 및 Respitose® (sieved inhalation grade lactose; DFE Pharma) 상품이다. 일 실시양태에서, 락토오스 성분은 α-락토오스 일수화물, α-락토오스 무수물 및 무정형(amorphous) 락오토스로 이루어진 그룹에서 선택된다. 구체적으로, 락토오스는 α-락토오스 일수화물이다.
건조 분말 제제는 또한 소듐 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 다른 부형제를 함유할 수 있다.
건조 분말 제제는 전형적으로 건조 분말 흡입기 (DPI)장치를 사용하여 전달된다. 건조 분말 전달 시스템의 예로는 SPINHALER, DISKHALER, TURBOHALER, DISKUS, SKYEHALER, ACCUHALER 및 CLICKHALER가 있다. 건조 분말 전달 시스템의 다른 예는 ECLIPSE, NEXT, ROTAHALER, HANDIHALER, AEROLISER, CYCLOHALER, BREEZHALER/NEOHALER, MONODOSE, FLOWCAPS, TWINCAPS, X-CAPS, TURBOSPIN, ELPENHALER, MIATHALER, TWISTHALER, NOVOLIZER, PRESSAIR, ELLIPTA, ORIEL dry powder inhaler, MICRODOSE, PULVINAL, EASYHALER, ULTRAHALER, TAIFUN, PULMOJET, OMNIHALER, GYROHALER, TAPER, CONIX, XCELOVAIR 및 PROHALER이다.
본 발명의 화합물은 또한 다른 내부 또는 외부 표면 (예: 점막 표면 또는 피부)에 국소 투여되거나 또는 경구 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 그러한 투여 경로에 대해 통상적으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 화합물은 진균증의 치료 및 진균증과 연관된 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.
본 발명의 일 실시양태에서, 진균증의 치료 및 진균증과 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에 있어서, 본 발명의 화합물의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상의 진균증을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상의 진균증과 연관된 질환의 예방 또는 치료방법이 제공된다.
진균증은 특히, 아스퍼질러스 속(Aspergillus spp.), 예컨대 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 또는 아스퍼질러스 플루란스(Aspergillus pullulans), 특히 아스퍼질러스 푸미가투스에 의해 유발될 수 있다. 진균증은 또한 칸디다 속(Candida spp .), 예컨대 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 칸디다 글라브라타(Candida albicans), 리조퍼스 속(Rhizopus spp .), 예컨대 리조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae ), 크립토코커스 속(Cryptococcus spp .), 예컨대 크립토코커 스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 카에토미움 속(Chaetomium spp .), 예컨대 카에토미움 글로보슘(Chaetomium globosum), 페니실리움 속(Penicillium spp.), 예컨대 페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum) 또는 트리코파이 톤 속(Trichophyton spp .), 예컨대 트리코파이톤 루브럼(Trichophyton rubrum)에 의해 발생할 수도 있다.
진균증과 연관된 질환은, 예를 들어 폐 아스퍼질러스증이다.
본 발명의 화합물은 진균증의 발병 전에 상기 화합물을 투여함으로써 예방에 사용될 수 있다.
대상은 인간 및 동물 대상, 특히 인간 대상을 포함한다.
본 발명의 화합물은 아스퍼질러스 푸미가투스 감염과 같은 진균증의 치료 및 위험한 대상에서 아스퍼질러스 푸미가투스 감염과 같은 진균증과 연관된 질환의 예방 또는 치료에 특히 유용하다. 위험한 대상에는 미숙아, 선천적 폐 또는 심장 결함을 가진 어린이, 면역손상 대상 (예: HIV 감염으로 고통받는 사람들), 천식 환자, 낭포성 섬유증을 가진 대상, 노인 및 심장 또는 폐에 영향을 미치는 만성 건강 상태 (예: 울혈심부전 또는 만성폐쇄성폐질환)로 고통받는 대상을 포함한다.
본 발명의 화합물은 아졸 저항성 아스퍼질러스 푸미가투스 감염과 같은 아졸 저항성 진균증, 특히 포사코나졸과 병용되는 아졸 저항성 진균증 치료에 유용하다.
본 발명의 화합물은 제2 또는 추가 활성 성분과 조합하여 투여될 수 있다. 제2 또는 추가 활성 성분은, 예를 들어, 다른 항진균 의약 (예컨대 보리코나졸 또는 포사코나졸), 암포테리신 B, 에키노칸딘 (예컨대 카스포펀진) 및 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-CoA 환원효소의 억제제 (예컨대 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 플루바스타틴)중에서 선택될 수 있다.
제2 또는 추가 활성 성분은 아스퍼질러스 푸미가투스 감염과 같은 진균증 또는 아스퍼질러스 푸미가투스 감염과 같은 진균증과 연관된 질환 또는 아스퍼질러스 푸미가투스 감염과 같은 진균증의 합병증의 치료 또는 예방에 적합한 활성 성분을 포함한다.
본 발명의 화합물은 제2 또는 추가 활성 성분과 함께 제제화될 수 있거나 제2 또는 추가 활성 성분은 동일 또는 상이한 경로에 의해 개별적으로 투여되도록 제제화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 항진균류, 예컨대 보리코나졸 또는 포사코나졸로 이미 전신적으로 치료된 환자에게 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 화합물은 공동-투여(co-administered), 예를 들어, 암포테리신 B, 에키노칸딘(예컨대 카스포펀진) 및 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-CoA 환원효소의 억제제(예컨대 로바스타틴, 프라바스타틴 또는 플루바스타틴)중에서 선택되는 하나 이상의 제제와 함께 제제화될 수 있다.
본 발명의 화합물은 대안적으로(또는 부가적으로) 공동-투여, 예를 들어, 칸디시딘, 필리핀, 하마이신, 나타마이신, 나이스타틴, 리모시딘, 비포나졸, 부토코나졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 펜티코나졸, 이소코나졸, 케토코나졸, 루리코나졸, 미코나졸, 오모코나졸, 옥시코나졸, 세르타코나졸, 술코나졸, 티오코나졸, 알바코나졸, 에피나코나졸, 에폭시코나졸, 플루코나졸, 이사부코나졸, 이트라코나졸, 프로피코나졸, 라부코나졸, 터코나졸, 아바펀진, 아모롤핀, 부테나핀, 나프티핀, 테르비나핀, 아니둘라펀진, 미카펀진, 벤조산, 시클로피록스, 플루시토신 (5-플루오로시토신), 그리세오풀빈, 톨나프테이트 및 운데실렌산 중에서 선택되는 하나 이상의 제제와 함께 제제화될 수 있다.
바람직한 조합 파트너는 인트라코나졸, 보리코나졸, 카스포펀진 및 포사코나졸을 포함한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, (a) 하나 이상의 희석제 또는 담체와 임의로 조합된 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물; (b) 하나 이상의 희석제 또는 담체와 임의로 조합된 제2 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물; (c) 하나 이상의 희석제 또는 담체와 임의로 조합된 제3 또는 추가 활성 성분을 각각 함유하는 임의의 하나 이상의 추가 약제학적 조성물; 및 (d) 약제학적 조성물의 투여를 필요로 하는 대상에게 투여하기 위한 지침서를 포함하는 부품 키트를 제공한다. 이를 필요로 하는 대상은 아스퍼질러스 푸미가투스 감염과 같은 진균증으로 고통받거나 민감할 수 있다.
본 발명의 화합물은 적절한 간격으로, 예를 들어 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회 또는 1일 4회 투여될 수 있다.
평균 체중 (50-70kg)의 인간에게 적합한 투여량은 약 50 μg 내지 10 mg/일, 예를 들어 500 μg 내지 5 mg/일일 것으로 예상되나, 정확한 투여량은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 화합물은 하기의 유리한 특성 중 하나 이상을 가질 것으로 예상된다:
- 특히 폐 또는 코에 국소 투여 후, 강력한 항진균 활성, 특히 아스퍼질러스 속, 예컨대 아스퍼질러스 푸미가투스, 또는 칸디다 속, 예컨대 칸디다 알비칸스 또는 칸디다 글라브라타, 리조퍼스 속, 예컨대 리조퍼스 오리재, 크립토코커스 속, 예컨대 크립토코커스 네오포르만스, 카에토미움 속, 예컨대 카에토미움 글로보슘, 페니실리움 속, 예컨대 페니실리움 크리소게넘 또는 트리코파이톤 속, 예컨대 트리코파이톤 루브럼에 맞서는 활성;
- 폐에서의 장기간의 작용, 바람직하게는 1일 1회 투여;
- 폐 또는 코에 대한 국소적 투여 후 낮은 전신적 노출; 및
- 특히 폐 또는 코에 국소적 투여 후, 허용되는 안전성 프로파일.
실험 섹션
본원발명에서 사용되는 약어는 하기에 정의된다 (표 1). 정의되지 않은 약어는 일반적인 의미를 전달하기 위한 것이다.
약어
ABPA 알레르기성 기관지 폐 아스퍼질러스증
aq 수용성
ATCC 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션
BALF 기관지 폐포 세척액
BEAS2B SV40-불멸의 인간 기관지 상피 세포주
Boc tert-부틸옥시카보닐
br 넓은
BSA 소혈청알부민
CC50 50% 세포 독성 농도
CFU 집락 형성 단위(s)
CLSI 임상 및 실험실 표준 연구소
COI 색인을 자르다
conc 농축
d 이중선
DCM 디클로로메탄
DFB50 대조군의 50%의 진균가 되는데 걸리는 일수
DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민
DMAP 4-디메틸아미노피리딘
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMF N,N-디메틸포름아미드
DMSO 디메틸 설폭사이드
DSS 덱스트란 소듐 설페이트
EBM 내피 기본 배지
ECM 세포외 기질
EDCI.HCl N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드
EGM2 내피 세포 성장 배지 2
EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
(ES+) 전자분무이온화, + 모드
Et 에틸
Et3N 트리에틸아민
EtOAc 에틸 아세테이트
FBS 소태아혈청
GM 갈락토만난
HPAEC 인간 폐동맥 내피 세포
HOBt.H2O 1-하이드록시벤조트리아졸 모노-하이드레이트
HPLC 역상 고속 액체 크로마토그래피
hr 시간(s)
IA 침습성 아스퍼질러스증
i.n. 비강의
IPA 2-프로판올
i.t. 기관-내
LC-MS 액체 크로마토그래피-질량 분석법
Li Hep 리튬 헤파린
LiHMDS 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드
m multiplet
(M+H)+ 양성화된 분자 이온
MDA 말론디
Me 메틸
MeCN 아세토니트릴
MeOH 메탄올
MHz 메가헤르츠
MIC50 50%의 최소 억제 농도
MIC75 75%의 최소 억제 농도
MIC90 90%의 최소 억제 농도
min 분(s)
MMD 질량 중앙 지름
MOI 감염다중도
MOPS 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산
m/z: 질량-전하 비율
NCPF National Collection of Pathogenic Fungi
NMR 핵 자기 공명(분광학)
NT 실험되지 않음
OD 광학 밀도
PBS 인산 완충 식염수
P 보호기
q 사중선
RT 실온
RP HPLC 역상 고속 액체 크로마토그래피
RPMI Roswell Park Memorial Institute medium
RuPhos 2-디사이클로헥실포스피노-2', 6'-디이소프로폭시비페닐
RuPhosG3 (2-디사이클로헥실포스피노-2', 6'-디이소프로폭시비페닐)[2-(2'-아미노-1, 1'-비페닐)]팔라듐 (II)메탄술포네이트
s 단일선
sat 포화
sc 피하의
SDS 소듐 도데실 설페이트
t 삼중선
TFA 트리플루오로 아세트산
THF 테트라하이드로퓨란
TR34/L98H 코돈 98에서 류신-히스티딘 치환을 포함하는 아스퍼질러스 푸미가투스 균주 및 34-bp 종열 반복
일반적인 과정
모든 출발 물질 및 용매는 상업적 출처로부터 입수하거나 문헌 인용에 따라 제조하였다. 달리 언급하지 않으면, 모든 반응물을 교반하였다. 유기 용액을 무수 황산마그네슘상에서 통상적으로 건조시켰다.
분석 방법
역상 HPLC 방법:
Waters Xselect CSH C18 XP 컬럼, 40 ℃에서 2.5 μm (4.6 x 30 mm); 254 nm에서 UV 검출을 사용하여 4분 이상 0.1% v/v 포름산을 함유 (방법 a) 또는 물 중의 10 mM NH4HCO3 을 함유 (방법 b)하는 H2O-MeCN 구배로 용출되는 유속 2.5-4.5 mLmin-1
구배 정보: 0-3.00 분, 95% H2O-5% MeCN 에서 5% H2O-95% MeCN 으로 점진적으로 감소; 3.00-3.01 분, 5% H2O-95% MeCN 에서 유지, 유속이 4.5 mL min-1로 증가; 3.01-3.50 분, 5% H2O-95% MeCN 에서 유지; 3.50-3.60 분, 95% H2O-5% MeCN 으로 복귀하고, 유속을 3.50 mL min-1로 감소; 3.60-3.90 분, 95% H2O-5% MeCN 에서 유지; 3.90-4.00 분, 95% H2O-5% MeCN 에서 유지, 유속을 2.5 mL min-1로 감소시켰다.
1 H NMR 분광법:
1H NMR 스펙트럼은 참조로서 잔류 비중축합 용매를 사용하여 400 MHz에서 Bruker Advance III 분광기상에서 수득하였고, 달리 명시하지 않는 한 DMSO-d6에서 측정하였다.
화합물 (I)의 제조를 위한 합성 방법
tert -부틸 4-(4- 하이드록시 -3- 메틸페닐 )피페라진-1- 카보네이트 .
Figure 112017048060482-pct00008
tert-부틸피페라진-1-카복실레이트 (XIIa) (7.44 g, 40.0 mmol), 4-브로모-2-메틸페놀 (6.23 g, 33.3 mmol), RuPhos (311 mg, 0.67 mmol) 및 RuPhos G3 (557 mg, 0.67 mmol)으로 채워진 플라스크를 진공 배기하고, 질소로 3회 채웠다. LiHMDS (THF 중 1M, 100 mL, 100 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 70 ℃에서 3시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 1M 염산 (100 mL)의 첨가에 의해 종료한 다음, 1M aq.NaHCO3 (100 mL)로 중화하였다. 수성층을 EtOAc (3 x 100 mL)로 추출하고 배합한 유기 추출물을 건조시켰다. 휘발성 물질을 진공 하 제거하여 조 생성물을 수득하고, 이를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 120 g, 이소헥산 중 0-100% EtOAc 구배 용출)로 정제하여 표제 화합물인 중간체 (XIa)를 담갈색 고체로 수득하였다 (7.80 g, 78%); Rt 2.07 분 (방법 b); m/z 293 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 1.41 (9H, s), 2.07 (3H, s), 2.86-2.88 (4H, m), 3.41-3.43 (4H, m), 6.58-6.65 (2H, m), 6.71 (1H, d) 및 8.72 (1H, s).
1-(4-((( 3 R ,5 R )-5-((1 H -1,2,4- 트리아졸 -1-일) 메틸 )-5-(2,4- 디플루오로페닐 )테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진.
Figure 112017048060482-pct00009
DMSO (60 mL) 중 중간체 (XIa) (7.80 g, 25.1 mmol)의 용액에 수산화소듐 수용액 (3.0 mL, 12.5 M, 37.6 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하고, 이어서 ((3S,5R)-5-((1H-1,2,4-트리아졸-1-일)메틸)-5-(2,4-디 플루오로페닐)테트라하이드로퓨란-3-일)메틸-4-메틸벤젠설포네이트 (IX) (APIChem, 카탈로그 번호: AC-8330, 12.4g, 27.6 mmol)로 나누어 처리하였다. 반응 혼합물을 30 ℃에서 18시간 동안 교반하고, 실온으로 냉각시키고 물(200 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 EtOAc (3 x 200 mL)로 추출하고, 배합한 유기 추출물을 염수 (2 x 200 mL)로 세척한 다음, 건조 시키고 진공 하 증발시켜 갈색 오일을 수득하였다. 1H NMR에 의한 조 (crude) Boc-보호 생성물 (VIIa)의 분석은 약 10%의 알켄을 함유한다는 것을 나타내었다: (R)-1-((2-(2,4-디플루오로페닐)-4-메틸렌테트라하이드로퓨란-2-일)메틸)-1H-1,2,4-트리아졸은 부산물로 생성된다. 조 우레탄 (VIIa)을 DCM (150ml)에 넣고 TFA (39.0ml, 502mmol)로 처리하였다. 실온에서 2시간 후, 반응 혼합물을 진공 농축시켜 휘발성 물질의 대부분을 제거한 후, EtOAc (200 mL)로 희석하고 NaOH 수용액 (2 M, 200 mL)으로 세척하였다. 수상을 분리시키고 EtOAc (2 x 200 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 염수 (2 x 200 mL)로 세척한 후 건조 시키고 진공 하 증발시켜 담갈색 오일을 수득하였다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 80 g, DCM 중 0-10% 0.7 M NH3/MeOH, 구배 용출)로 정제하여 표제 화합물인 중간체 (V)를 점성의 담갈색 오일로 수득하였다 (9.46 g, 80 %); Rt 1.91 분 (방법 b); m/z 470 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.07 (3H, s), 2.15 (1H, dd), 2.36-2.42 (1H, m), 2.52-2.56 (1H, m), 2.79-2.81 (4H, m), 2.87-2.90 (4H, m), 3.66 (1H, dd), 3.73-3.77 (2H, m), 4.04 (1H, t), 4.57 (2H, dd), 6.64 (1H, dd), 6.70-6.75 (2H, m), 6.99 (1H, td), 7.25-7.34 (2H, m), 7.76 (1H, s) 및 8.34 (1H, s).
메틸 4-(4-(4-((( 3 R ,5 R )-5-((1 H -1,2,4- 트리아졸 -1-일) 메틸 )-5-(2,4- 디플루오로페닐 )테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)벤조에이트.
Figure 112017048060482-pct00010
중간체 (V) (9.00 g, 19.2 mmol), 메틸-4-브로모벤조에이트 (VIa) (4.95 g, 23.0 mmol), RuPhos (0.18 g, 0.38 mmol, 2 mol%), RuPhosG3 (0.32 g, 0.38 mmol, 2 mol%) 및 세슘 카보네이트 (9.99 g, 30.7 mmol)로 채워진 플라스크를 진공 배기하고, DMF (150 mL)를 첨가하기 전에 질소로 3회 채웠다. 혼합물을 80 ℃에서 22시간 동안 가열한 후, 고온인 상태에서, 물 (150 mL)에 부어 갈색 검을 형성하였다. 추가의 물 (300 mL)을 첨가하고 수상을 DCM (2 x 200 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 배합하고 진공에서 농축시켜 갈색 오일을 수득하고, 물 (100 mL)에 부었다. 생성된 침전물을 여과로 회수한 다음 THF (100 mL)에 재-현탁시켰다. 혼합물을 1시간 동안 환류 하 가열하고, 그 시간 동안 크림 현탁액을 생성하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 생성된 침전물을 여과로 회수하고, THF (2 x 50 mL)로 세척한 후 진공 하 건조시켜 표제 화합물인 중간체 (IVa)를 담황색 고체로 수득하였다 (9.48 g, 79 %); Rt 2.79 분 (방법 b); m/z 604 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.09 (3H, s), 2.16 (1H, dd), 2.37-2.43 (1H, m), 2.52-2.58 (1H, m), 3.11-3.14 (4H, m), 3.43-3.46 (4H, m), 3.68 (1H, dd), 3.74-3.79 (5H, s overlapping over m), 4.05 (1H, dd), 4.58 (2H, dd), 6.75 (2H, br s), 6.85 (1H, br d), 7.00 (1H, td), 7.04 (2H, d), 7.25-7.34 (2H, m), 7.76 (1H, s), 7.81 (2H, d) 및 8.34 (1H, s).
에틸 4-(4-(4- 하이드록시 -3- 메틸페닐 )피페라진-1-일) 벤조에이트 .
Figure 112017048060482-pct00011
DMF (213 mL) 중 에틸 4-(피페라진-1-일)벤조에이트 (Xa) (20.0 g, 85.0 mmol) 및 4-브로모-2-메틸페놀 (19.2 g, 102 mmol)의 용액으로 채워진 플라스크를 진공 배기하고, 질소로 3회 채웠다. RuPhos G3 (1.43 g, 1.71 mmol)을 첨가하고 플라스크를 진공 배기하고 질소로 다시 채웠다. 반응 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고, LiHMDS (17.1 g, 102 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 10분 동안 교반한 다음, 중탕 냄비에서 냉각시키고 LiHMDS (20.0 g, 120 mmol)를 5분 간격으로 같은 분량(7 x 2.85 g)으로 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 0 ℃로 냉각시키고 2M 염산 (200 mL)으로 처리하여 pH 6-7이 되게 하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하고 이어서 EtOAc (220 mL)로 추출하였다. 수성층을 분리하고 EtOAc (4 x 50 mL)로 추출하고 배합한 유기물을 염수 (6 x 50 mL)로 세척한 다음, 건조시키고 진공 하 증발시켜 크림 고형물을 수득하였다. 이소헥산 및 IPA (1:1, 150 mL)의 혼합물을 첨가하고 현탁액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과로 수집하고, 필터 케이크를 이소헥산 및 IPA (1:1, 2 x 10 mL)의 혼합물, 이어서 이소 헥산 (4 x 10 mL)으로 세척하고, 40 ℃에서 18시간 동안 진공 하 건조시켜 표제 화합물인 중간체 (VIIIa)를 크림색 고체로 수득하였다 (15.3 g, 50%)를; Rt 2.29 분 (방법 b); m/z 341 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ:1.29 (3H, t), 2.09 (3H, s), 3.06-3.09 (4H, m), 3.42-3.44 (4H, m), 4.24 (2H, dd), 6.66 (2H, br s), 6.76 (1H, br s), 7.03 (2H, d), 7.80 (2H, d), 8.72 (1H, s).
에틸 4-(4-(4-((( 3 R ,5 R )-5-((1 H -1,2,4- 트리아졸 -1-일) 메틸 )-5-(2,4- 디플루오로페닐 )테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)벤조에이트.
Figure 112017048060482-pct00012
DMF (110 mL) 중 중간체 (VIIIa) (15.3 g, 44.9 mmol)의 용액을 0 ℃로 냉각 하고 소듐 에톡사이드 (3.13 g, 46.1 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 0 ℃에서 10분 동안 교반한 다음 토실레이트 (IX) (20.2 g, 44.9 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 50 ℃로 1시간 동안 가열한 후 실온으로 냉각시켰다. 염산 (1M, 60 mL) 및 물 (200 mL)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반 한 다음 DCM (150 mL)으로 추출하였다. 수성층을 분리하고 DCM (2 x 50 mL)으로 추출하고 배합한 유기물을 염수 (4 x 30 mL)로 세척한 후, 건조시키고 진공 하 증발시켜 크림색 고형물을 수득하였다. 고체를 이소헥산 및 IPA (80 mL)의 동등 혼합물에 현탁시키고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 고체를 여과로 수집하고, 이소-헥산 및 IPA 1:1 (3 x 20 mL)의 혼합물로 세척한 후, 40 ℃에서 18시간 동안 진공 하 건조시켜 표제 화합물인 중간체 (IVb)를 백색 고체로 수득하였다 (16.4g, 56 %); Rt 2.92 분 (방법 b); m/z 618 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 1.29 (3H, t), 2.10 (3H, s), 2.16 (1H, dd), 2.37-2.42 (1H, m), 2.52-2.58 (1H, m), 3.12-3.14 (4H, m), 3.43-3.46(4H, m), 3.68 (1H, dd), 3.74-3.79 (2H, m), 4.05 (1H, dd), 4.24 (2H, dd), 4.58 (2H, dd), 6.76 (2H, br s), 6.86 (1H, br s), 6.98-7.05 (3H, m), 7.26-7.34 (2H, m), 7.77 (1H, s), 7.81 (2H, d), 8.34 (1H, s).
1-((( 2 R ,4 R )-4-((4- 브로모 -2- 메틸페녹시 ) 메틸 )-2-(2,4- 디플루오로페닐 ) 테트라하이드로퓨란 -2-일)메틸)-1 H- 1,2,4-트리아졸.
Figure 112017048060482-pct00013
DMSO (10 mL) 중 4-브로모-2-메틸 페놀 (920 mg, 4.89 mmol)의 용액에 수산화소듐 수용액 (0.39 mL, 12.5 M, 4.89 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하고, 토실 레이트 (IX) (2.00 g, 4.45 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 60 ℃에서 72시간 동안 교반한 다음 실온으로 냉각시키고 물 (25 mL)과 EtOAc (20 mL) 사이에 분배시켰다. 유기상을 분리 및 보유하고, 수성층을 EtOAc (3 x 25 mL)로 추출하였다. 배합한 유기 추출물을 염수 (3 x 15 mL)로 세척한 후, 건조시키고 진공 하 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 12g, DCM 중 0-30 % EtOAc, 구배 용출)로 정제하여 표제 화합물인 중간체 (XIII)를 무색 오일로 수득하였다 (1.84 g, 86 %); Rt 2.78 분 (방법 a); m/z 464 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.09 (3H, s), 2.17 (1H, dd), 2.37-2.43 (1H, m), 2.52-2.60 (1H, m), 3.72-3.78 (2H, m), 3.82 (1H, dd), 4.00-4.06 (1H, m), 4.57 (2H, dd), 6.82 (1H, d), 7.00 (1H, td), 7.25-7.34 (4H, m), 7.76 (1H, s), 8.34 (1H, s).
에틸 4-(4-(4-((( 3 R ,5 R )-5-((1 H -1,2,4- 트리아졸 -1-일) 메틸 )-5-(2,4- 디플루오로페닐 )테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)벤조에이트.
Figure 112017048060482-pct00014
에틸 4-(피페라진-1-일)벤조에이트 (X) (103 mg, 0.44 mmol), 중간체 (XIII) (170 mg, 0.37 mmol), RuPhos (8.5 mg, 18 μmol), RuPhos G3 (14.2 mg, 18 μmol) 및 세슘 카보네이트 (191 mg, 0.59 mmol)로 채워진 바이알을 비우고 DMF (3.0 mL)를 첨가하기 전에 질소로 3회 다시 채웠다. 혼합물을 80 ℃에서 18시간 동안, 이어서 100 ℃에서 24시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 물 (10 mL)과 EtOAc (10 mL) 사이에 분배시켰다. 유기상을 분리 및 보유하고, 수성층을 EtOAc (3 x 10 mL)로 추출하였다. 합한 유기물을 염수 (3 x 10 mL)로 세척한 후, 건조시키고 진공 하 증발시켰다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 12 g, 이소헥산 중 0-100 % EtOAc, 구배 용출)로 정제하여 표제 화합물인 중간체 (IVb)를 백색 고체로 수득하였다(100mg, 43 %).
4-(4-(4-((( 3 R ,5 R )-5-((1 H -1,2,4- 트리아졸 -1-일) 메틸 )-5-(2,4- 디플루오로페닐 )테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)벤조산.
메틸 에스테르 (IVa)의 가수 분해
Figure 112017048060482-pct00015
DMSO (370 mL) 중 중간체 (IVa) (9.00 g, 14.9 mmol)의 현탁액에 물 (37.0 mL) 중 수산화리튬 용액 (1.79 g, 74.5 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 70 ℃에서 22시간 동안 가열한 후 실온으로 냉각시키고, 물 (1000 mL)로 희석하고 1M 수성 염산 (80 mL)을 첨가하여 산성화시켰다 (약 pH 2). 혼합물을 냉각 수조에서 2시간 동안 냉각시키고, 생성된 침전물을 여과하여 수집하였다. 필터 케이크를 물 (3 x 80 mL)로 세척하고 50 ℃에서 진공 하 건조시켜 표제 화합물인 중간체 (II)를 백색 고체로 수득하였다 (4.66 g, 54 %); Rt 2.21 분 (방법 1a); m/z 590 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.10 (3H, s), 2.16 (1H, dd), 2.37-2.43 (1H, m), 2.52-2.58 (1H, m), 3.12-3.14 (4H, m), 3.42-3.45 (4H, m), 3.68 (1H, dd), 3.74-3.79 (2H, m), 4.05 (1H, dd), 4.58 (2H, dd), 6.76 (2H, br s), 6.86 (1H, br d), 6.97-7.03 (3H, m), 7.25-7.34 (2H, m), 7.77-7.80 (3H, m), 8.34 (1H, s) 및 12.31 (1H, s).
에틸 에스테르 (IVb)의 가수 분해
DMSO (375 mL) 중 중간체 (IVb) (16.4 g, 26.6 mmol)의 현탁액에 물 (50 mL) 중 수산화리튬 용액 (3.18 g, 74.5 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 70 ℃에서 22시간 동안 가열한 다음 실온으로 냉각시키고, 물 (500 mL)에 붓고 2M 염산 (70 mL)을 첨가하여 산성화시켰다 (약 pH 5-6). 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 생성된 고체를 여과 수집하고 물 (2 x 20 mL) 및 디에틸 에테르 (3 x 30 mL)로 세척한 후, 40 ℃에서 18시간 동안 진공 하 건조시켜, 표제 화합물인 중간체 (II)를 황갈색 고체로 수득하였다 (14.2 g, 84%); Rt 2.26 분 (방법 1a); m/z 590 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.09 (3H, s), 2.16 (1H, dd), 2.37-2.42 (1H, m), 2.52-2.58 (1H, m), 3.12-3.14 (4H, m), 3.42-3.44 (4H, m), 3.68 (1H, dd), 3.74-3.79 (2H, m), 4.05 (1H, dd), 4.58 (2H, dd), 6.75 (2H, br s), 6.86 (1H, br s), 6.97-7.03 (3H, m), 7.26-7.34 (2H, m), 7.77-7.80 (3H, m), 8.34 (1H, s), 12.31 (1H, br s).
4- 브로모 - N -(4- 플루오로페닐 )벤즈아미드.
Figure 112017048060482-pct00016
THF (15 mL) 중 4-플루오로아닐린 (III) (0.85 mL, 9.00 mmol), 트리에틸아민 (1.88 mL, 13.5 mmol) 및 DMAP (0.11 g, 0.90 mmol)의 용액에 4-브로모벤조일 클로라이드 (XX) (2.37 g, 10.8 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 유지시킨 후, EtOAc (100 mL) 및 1M 염산 (100 mL) 사이에 분배시켰다. 유기 상을 분리하고, 1M 염산 (100 mL), 포화 NaHCO3 수용액 (100 mL) 및 염수 (100 mL)로 순차적으로 세척한 후, 건조시키고 진공 배기하였다. 조 잔류물을 따뜻한 DCM (100 mL)에서 분쇄하고, 혼합물을 환류 하 가열하여 백색 현탁액을 수득하고, 이를 실온으로 냉각시켰다. 생성된 침전물을 여과로 수집하여 표제 화합물인 중간체 (XIX)를 백색 고체로 수득하였다 (1.81 g, 65 %); Rt 2.23 분; m/z 294/296 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 7.20 (2H, t), 7.74-7.79 (4H, m), 7.90 (2H, d) 및 10.36 (1H, s).
tert -부틸 4-(4-((4- 플루오로페닐 ) 카바모일 )페닐)피페라진-1- 카복실레이트 .
Figure 112017048060482-pct00017
tert-부틸 피페라진-1-카복실레이트 (XII) (4.00 g, 215 mmol), 중간체 (XIX) (6.63 g, 22.6 mmol), RuPhos (100 mg, 0.215 mmol) 및 RuPhos G3 (180 mg, 0.215 mmol)로 채워진 플라스크를 진공 배기하고, 질소로 3회 채웠다. LiHMDS (THF 중의 1M, 75.0 mL, 75.0 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 70 ℃에서 5시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 혼합물을 EtOAc (150 mL)와 1M 염산 (150 mL) 사이에 분배시켰다. 유기 상을 분리 및 보유하고, 수성상을 EtOAc (3 x 150 mL)로 추출하였다. 조합된 유기물을 건조시키고 진공 하 농축시켜 갈색 고체를 수득하고, 이를 이소헥산 및 디에틸 에테르의 혼합물 (1:1, 100 mL)중에서 분쇄하였다. 수득한 생성물을 여과로 수집하고, 이소헥산 및 디에틸 에테르의 혼합물 (1:1, 25 mL)로 세척한 후, 40 ℃에서 진공 하 건조시켜 표제 화합물인 중간체 (XVIII)를 황갈색 고체로 수득하였다 (6.44 g, 85 %); Rt 2.40 분 (방법 a); m/z 400 (M+H)+; 1H NMR δ: 1.43 (9H, s), 3.27-3.30 (4H, m), 3.45-3.48 (4H, m), 7.03 (2H, d), 7.14-7.18 (2H, m), 7.74-7.79 (2H, m), 7.88 (2H, d), 9.99 (1H, s).
N -(4- 플루오로페닐 )-4-(피페라진-1-일)벤즈아미드.
Figure 112017048060482-pct00018
DCM (200 mL) 중 중간체 (XVIII) (6.44 g, 16.1 mmol)의 용액에 TFA (24.7 mL, 322 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 진공 하 증발시켰다. 톨루엔 (5.0 mL)을 첨가하고 혼합물을 다시 진공 하 증발시켰다. 생성 된 오일을 DCM (90 mL)과 메탄올 (10 mL)의 혼합물에 용해 시키고, 이어서 물 (50 mL)과 포화 NaHCO3 수용액의 혼합물로 추출하였다. 유기 상을 분리 및 보유하고, 수성층을 DCM 및 메탄올의 혼합물 (9:1, 3 x 100 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 건조시키고 진공 하 농축시켜 표제 화합물인 중간체 (XVII)를 갈색 고체로 수득하였다 (3.74 g, 70 %); Rt 1.02 분 (방법 a); m/z 300 (M+H)+; 1H NMR δ: 2.81-2.83 (4H, m), 3.18-3.20 (4H, m), 6.99 (2H, d), 7.14-7.18 (2H, m), 7.74-7.80 (2H, m), 7.85 (2H, d), 9.99 (1H, s).
N -(4- 플루오로페닐 )-4-(4-(4- 메톡시 -3- 메틸페닐 )피페라진-1-일)벤즈아미드.
Figure 112017048060482-pct00019
4-브로모-1-메톡시-2-메틸벤젠 (XIVb) (406 mg, 2.02 mmol), 중간체 (XVII) (550 mg, 1.84 mmol), RuPhos (43 mg, 0.092 mmol) 및 RuPhos G3 (77 mg, 0.092 mmol)로 채워진 플라스크를 진공 배기하고 질소로 3회 채웠다. LiHMDS (9.2 mL, THF 중의 1M, 9.2 mmol)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 70 ℃에서 8시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 1M aq.염산 (9.0 mL)의 첨가에 의해 혼합물을 켄칭시키고, 이어서 물 (15 mL)과 EtOAc (15 mL) 사이에 분배시켰다. 유기층을 분리 및 보유하고, 수성층을 EtOAc (2 x 15 mL)로 추출하였다. 조합된 유기물을 염수 (20 mL)로 세척한 후, 건조시키고 진공 배기하였다. 수득한 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 12g, 이소헥산 중 0-100 % EtOAc, 구배 용출)로 정제하여 황색 고체를 수득하였다. 이 물질을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 4 g, DCM 중 0-10 % EtOAc, 구배 용출)로 재정제하여, 표제 화합물인 중간체 (XVI)를 회백색 고체로 수득하였다 (83mg, 11 %); Rt 2.27 분 (방법 a); m/z 420 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.13 (3H, s), 3.13-3.16 (4H, m), 3.42-3.45 (4H, m), 3.72 (3H, s), 6.77-6.88 (3H, m), 7.08 (2H, d), 7.17 (2H, t), 7.75-7.80 (2H, m), 7.89 (2H, d), 10.02 (1H, s).
N -(4- 플루오로페닐 )-4-(4-(4- 하이드록시 -3- 메틸페닐 )피페라진-1-일)벤즈아미드.
Figure 112017048060482-pct00020
0 ℃에서 DCM (5.0 mL) 중 중간체 (XVI)의 현탁액에 (83 ㎎, 0.20 mmol) 삼브롬화 붕소의 용액 (0.59 mL, DCM 중 1M, 0.59 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 교반하고, 8시간 동안 실온으로 가온시킨 다음, 이어서 물 (15 mL) 및 DCM (10 mL)사이에 분배시켰다. 유기층을 분리 및 보유하고, 수성층을 DCM 및 MeOH의 혼합물 (90:10, 5 x 15 mL)로 추출하였다. 합한 유기물을 건조시키고 진공 배기하여 조 생성물을 수득하고, 이를 플래시 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 4.0g, DCM 중의 0-3 % MeOH, 구배 용출)에 의해 정제하여 표제 화합물인 중간체 (XV)를 베이지색 고체로 수득하였다 (61 mg, 72%); Rt 1.73분 (방법 a); m/z 406 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.10 (3H, s), 3.08-3.11 (4H, m), 3.41-3.43 (4H, m), 6.67 (2H, br s), 6.77 (1H, br s), 7.07 (2H, d), 7.17 (2H, t), 7.76-7.80 (2H, m), 7.89 (2H, d), 8.73 (1H, s), 10.01 (1H, s).
4-(4-(4-((( 3 R ,5 R )-5-((1 H -1,2,4- 트리아졸 -1-일) 메틸 )-5-(2,4- 디플루오로페 닐)테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)- N -(4-플루오로페닐)벤즈아미드.
1. 벤조산 중간체 (II)로부터 화합물 (I)의 제조.
Figure 112017048060482-pct00021
피리딘 (30 mL) 중의 중간체 (II) (2.50 g, 4.24 mmol), EDCI (1.63 g, 8.48 mmol) 및 DMAP (30 mg, 0.21 mmol)의 현탁액에 4-플루오로아닐린 (0.41 mL, 4.3 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 60 ℃에서 2시간 동안 가열한 다음 실온으로 냉각시켰다. 혼합물을 물 (60 mL)로 희석시키고 5분 동안 교반하여 고체를 생성시키고, 이를 여과로 수집한 다음 물 (3 x 10 mL) 및 디에틸 에테르 (2 x 15 mL)로 세척하여 황갈색 가루를 수득하였다. 수득한 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 40g, DCM 중 0-3 % MeOH, 구배 용출)로 정제하여 화합물 (I)을 황색 고체로 수득하였다 (2.47 g, 85 %); Rt 2.60 분 (방법 a); m/z 683 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.10 (3H, s), 2.15 (1H, dd), 2.37-2.43 (1H, m), 2.53-2.58 (1H, m), 3.13-3.16 (4H, m), 3.42-3.44 (4H, m), 3.68 (1H, dd), 3.74-3.79 (2H, m), 4.05 (1H, dd), 4.58 (2H, dd), 6.76 (2H, br s), 6.86 (1H, br s), 6.99 (1H, td), 7.08 (2H, d), 7.16 (2H, t), 7.25-7.35 (2H, m), 7.76-7.80 (3H, m), 7.89 (2H, d), 8.34 (1H, s) 및 10.00 (1H, s).
2. 페놀 중간체 (XV)로부터 화합물 (I)의 제조.
Figure 112017048060482-pct00022
DMSO (1.5 mL) 중 중간체 (XV) (19 mg, 0.047 mmol)의 용액에 수산화소듐 수용액 (1M, 98 μL, 0.098 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 후, DMSO (0.5 mL) 중 토실레이트 (IX) (APIChem, 카탈로그 넘버 : AC-8330, 23.2 mg, 0.052 mmol)의 용액으로 처리하였다. 반응 혼합물을 60 ℃에서 2시간 동안 교반하고, 실온으로 냉각시키고 물 (10 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 EtOAc (3 x 10 mL)로 추출하고, 합한 유기 추출물을 건조시키고 진공 배기하여 갈색 오일을 수득하였다. 수득한 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 4 g, DCM 중 0-2 % MeOH, 구배 용출)로 정제하여 베이지색 고체 (23mg)를 수득하였다. 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 4.0 g, DCM 중 0-50% EtOAc, 구배 용출)로 재정제하여 화합물 (I)을 회백색 고체로 수득하였다 (14mg, 42%); Rt 2.60 분 (방법 a); m/z 683 (M+H)+ (ES+).
4-(4-(4-((( 3 R ,5 R )-5-((1 H -1,2,4- 트리아졸 -1-일) 메틸 )-5-(2,4- 디플루오로페닐 )테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)- N -(4-플루오로페닐-2,3,5,6-d 4 )벤즈아미드.
화합물 (I)의 테트라-중수소 유도체의 제조
Figure 112017048060482-pct00023
피리딘 (1.5 mL) 중 중간체 (II) (200 mg, 0.34 mmol), EDCI (130 mg, 0.68 mmol) 및 DMAP (2.1 mg, 0.02 mmol)의 현탁액에 4-플루오로아닐린-2 3,5,6-d4의 용액 (43 mg, 0.37 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 60 ℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (10 mL)로 희석시키고 5분 동안 교반하여 침전물을 생성시켰다. 고체를 여과로 수집하고 물 (3 x 2.0 mL)로 세척한 다음 DCM 및 MeOH (9:1, 5.0 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 혼합물을 상 분리기에 통과시키고 유기 용액을 진공 배기하여 황갈색 고체 (200 mg)를 수득하였다. 이렇게 수득한 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (SiO2, 12 g, DCM 중 0-2 % MeOH, 구배 용출; SiO2, 40 g, DCM 중 0-2.5% MeOH, 구배 용출)로 2회 정제하여, 회백색 분말을 수득하였다.
고체를 DMSO (0.75 mL)에 현탁시키고, 용해가 완료될 때까지 5분 동안 60 ℃로 가열하였다. 생성된 용액을 실온으로 냉각시키고 물 (1.0 mL)로 처리하여 침전물을 수득하였다. 현탁액을 실온에서 20분 동안 교반하고, 고체를 여과로 수집하고, 물 (3 x 0.5 mL)로 세정하고, 50 ℃에서 3일 동안 또는 진공 하 건조시켜 표제 화합물인 (I) 4 [2 H]을 백색 고체로 수득하였다 (147 mg, 62%); Rt 2.59 분 (방법 1a); m/z 687 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.10 (3H, s), 2.16 (1H, dd), 2.37-2.43 (1H, m), 2.52-2.60 (1H, m), 3.13-3.16 (4H, m), 3.42-3.44 (4H, m), 3.68 (1H, dd), 3.74-3.79 (2H, m), 4.05 (1H, dd), 4.58 (2H, dd), 6.76 (2H, br s), 6.86 (1H, br s), 7.00 (1H, td), 7.08 (2H, d), 7.25-7.35 (2H, m), 7.77 (1H, s), 7.89 (2H, d), 8.34 (1H, s) 및 10.01 (1H, s).
경로 2에 의한 화합물 (I) 제조의 스케일-업
경로 2에 대해 상기에 기술된 합성 방법 (반응식 1)은, 1.0kg 이상의 API 규모로 본 발명의 화합물을 제조하는데 성공적으로 이용되었다 (반응식 3). 4-피페라지닐 벤조에이트 [중간체 (VIII)]가 에틸 에스테르 ( VIIIa ) 또는 상응하는 tert-부틸 에스테르 (VIIIb) 중 어느 하나를 포함하는 방법의 두 가지 변형 예가 개발되었다. 이들 화합물 모두 토실레이트 (IX)와 결합하여 벤조산 (II)에 상응하는 에스테르 전구체를 제공할 수 있다. 에틸 에스테르의 경우, 유리 산은 비누화에 의해 얻어지며, tert-부틸 유도체는 산분해에 의해 탈-에스테르화된다. 이 합성 캠페인에 채택된 절차는 아래에 묘사되며 여기에 설명되어 있다.
반응식 3: 화합물 (I) 합성의 스케일-업.
Figure 112017048060482-pct00024
분석 및 분광학 방법
이 실험 섹션과 관련된 분석 및 분광학 방법은 아래와 같다.
LCMS 분석을 위한 역상 HPLC 조건:
XBridge BEH 페닐 4.6 x 150 mm 컬럼; 2.5 μm (예:Waters #186006720) 40 ℃; 유속 1.0 mL.min-1 은 0.1 % 포름산을 함유하는 정제된 H2O-MeCN 구배로 25분에 걸쳐 300 nm에서 UV 검출을 사용하여 용출되었다. 주입량 5 μL. 기울기 정보: 0-2분, 95% H2O-5% MeCN에서 유지; 2-15분, 95% H2O-5% MeCN에서 10% H2O-90% MeCN으로 램프(ramped); 15-25 분, 10% H2O-90% MeCN에서 유지.
1 H NMR 분광학:
1H NMR 스펙트럼은 JOEL ECX 400MHz 분광기를 사용하여 수집하였다. 잔류 비 중축합 용매를 참조(reference)로 사용하였으며, 달리 명시하지 않는 한, 샘플을 DMSO-d6에서 처리하였다.
에틸 4-(4-(4- 하이드록시 -3- 메틸페닐 )피페라진-1-일) 벤조에이트 .
Figure 112017048060482-pct00025
무수 DMF (5.0 L) 중 에틸 4-(1-피페라지닐)벤조에이트 (Xa) (500 g, 2.13 mol) 및 4-브로모-2-메틸 페놀 (479 g, 2.56 mol)의 용액을, 혼합물을 진공 및 이어서 질소 대기 하 3회 교대로 놓음으로써 가스를 제거하였다. 이어서, 내부 온도를 35 ℃ 미만으로 유지하면서 (수조 냉각), 혼합물을 RuPhos G3 (35.7 g, 0.043 mol) 및 LiHMDS 용액 (THF 중 1.0 M, 2560 mL, 2.56 mol)으로 처리하였다. 이어서 LiHMDS 용액 (THF 중 1.0M)을 20-35 ℃에서 2분 간격으로 14 등분 (14 x 213 mL, 총 2.98 L, 2.98 mol)으로 첨가하였다. 생성된 용액을 18-25 ℃에서 30분 동안 교반한 후, HPLC에 의한 분석에서 에틸 4-(1-피페라지닐)벤조에이트 0.6%가 반응이 완료된 것으로 나타났다.
반응 혼합물을 온도를 40 ℃ 미만으로 유지하면서, 2M 염산 (5.50 L)을 첨가하여 pH 7.6으로 조정한 후, EtOAc (3.00 L)를 첨가하고 생성된 상을 분리하였다. 수성상을 EtOAc (2 x 3.00 L, 이어서 2 x 2.00 L)로 추출하고 배합한 유기물을 포화 염수 (8 x 1.00 L)로 세척하고, MgSO4상에서 건조시킨 후 진공 하 증발시켜 담갈색 유성 고체를 수득하였다. 조 생성물을 20-25 ℃에서 30분 동안 IPA (2.50 L) 중에서 슬러리화하고, 생성된 고체를 여과하여 수집하였다. 필터 케이크를 IPA (2 x 500 mL)로 세척하고 흡인 건조시키고 고체를 50 ℃에서 진공으로 건조시켜 표제 화합물인 중간체 (VIIIa)를 황갈색 고체로 수득하였다 (380.0 g, 52%, HPLC 순도 97.2%);Rt 11.01 분; m/z 341.3 (M+H)+ (ES+).
팔라듐 잔사의 수준을 제어하기 위해, 여러 배치(batch)로부터의 생성물을 합하여 (1900 g, 잔여 Pd 108 ppm), THF (19.0 L)에 용해 시키고 18-25 ℃에서 MP-TMT 수지 (250 g)로 처리하였다. 혼합물을 이 온도에서 24시간 동안 교반한 다음 수지를 여과에 의해 제거하고 THF (3.49 L)로 세척하였다. 여액을 진공 하 증발 건조시키고, 생성된 고체를 IPA (4.75 L) 중 18-25 ℃에서 1시간 동안 슬러리화하고, 여과하여 수집하였다. 필터 케이크를 IPA (500 mL)로 세척하고, 흡인 건조시키고 50 ℃에서 진공 하 건조시켜 표제 화합물인 중간체 (VIIIa)를 회백색 고체로 수득하였다 (1789 g, 94%, 잔여 Pd 17 ppm).
에틸 4-(4-(4-((( 3 R ,5 R )-5-((1 H -1,2,4- 트리아졸 -1-일) 메틸 )-5-(2,4- 디플루오로페닐 )-테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)벤조에이트.
Figure 112017048060482-pct00026
15-25 ℃에서 무수 DMF (17.8 L) 중 중간체 (VIIIa) (1780 g, 5.23 mol)의 용액에 소듐 에톡사이드 (391 g, 5.75 mol)를 첨가하였다. 45분 후 토실레이트 (IX) (2586 g, 5.75 mol)를 한번에 첨가하고, 60-65 ℃에서 5시간 동안 계속 교반하였다. HPLC에 의한 분석은 반응이 본질적으로 완료됨을 나타냈다(남은 출발 물질 1.67 %). 혼합물을 18-25 ℃로 냉각시키고, 생성된 현탁액을 30 ℃ 미만의 온도를 유지하면서 물 (18.0 L)로 처리하였다. 15-25 ℃로 45분 동안 냉각시킨 후, 고체를 여과에 의해 수집하고 물 (2 x 7.14 L)로 세척하였다. 축축한 필터 케이크를 환류하에 에탄올 (8.92 L) 중에서 2시간 동안 슬러리화한 다음, 혼합물을 15-25 ℃로 냉각시키고 18시간 동안 교반하였다. 그렇게 수득한 고체를 여과로 수집하고, 에탄올 (2 x 1.78 L)로 세척한 후 50 ℃에서 진공 하 건조시켜 표제 화합물인 중간체 (IVb)를 회백색 고체로 수득하였다 (2855 g, 88%, HPLC 순도 95.97%); Rt 14.99 min; m/z 618.5 (M+H)+ (ES+).
4-(4-(4-((( 3 R ,5 R )-5-((1 H -1,2,4- 트리아졸 -1-일) 메틸 )-5-(2,4- 디플루오로페닐 )-테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)벤조산 모노- 하이드로클로라이드 .
Figure 112017048060482-pct00027
18-25 ℃에서 DMSO (1.45 L) 및 물 (5.90 L)의 혼합물 중 중간체 (IVb)의 현탁액 (1467 g, 2.38 mol)에 물 중 KOH의 50% w/w 용액 (2.93 L)을 첨가하였다. 현탁액을 90-95 ℃에서 18시간 동안 가열한 후, HPLC 분석은 반응이 완료되었음을 나타내었다 (출발 물질 0.16%, 생성물 97.9%). 반응 혼합물을 40-50 ℃로 냉각시키고 IPA (14.9 L) 및 물 (4.42 L)의 혼합물을 첨가하였다. 15-25 ℃로 냉각시킨 후, 40 ℃ 이하의 내부 온도를 유지하면서 진한 염산 (3.12L)을 첨가하여 pH 1-2로 조정하였다. 생성된 현탁액을 15-25 ℃로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 수집하고, 흡인 건조시키고, 이어서 90-95 ℃에서 30분 동안 물 (7.40 L) 중에 슬러리화하였다. 15-25 ℃로 냉각시킨 후, 고체를 여과로 수집하고, 물 (2 x 1.48 L)로 세척하고 흡인 건조하였다. 진공 하 50 ℃에서 추가 건조시켜 표제 화합물인 중간체 (II)를 백색 고체로 수득하였다 (1329 g, 89%, HPLC 순도 99.0%; 염소 함유량: 6.61 w/w % [이론 5.66 w/w %]; Rt 12.92 분; m/z 590.4 (M+H)+ (ES+).
tert -부틸 4-(4-(4- 하이드록시 -3- 메틸페닐 )피페라진-1-일) 벤조에이트 .
Figure 112017048060482-pct00028
무수 DMF (1.00 L) 중 tert-부틸 4-(피페라진-1-일)벤조에이트 (Xb) (100 g, 381 mmol) 및 4-브로모-2-메틸페놀 (85.5 g, 457 mmol)의 용액을, 혼합물을 진공 및 이어서 질소 하에서 3회 교대로 놓음으로써 가스를 제거하였다. 상기 절차에 따라, 15-25 ℃에서 RuPhos G3 (6.38g, 7.62mmol)을 첨가한 후, 온도를 15-30 ℃로 유지하면서 (수조 냉각), 5분에 걸쳐 THF 중 LiHMDS의 용액 (1.06 M, 432 mL, 457 mmol)을 첨가하였다. 5분 동안 교반한 후, LiHMDS의 용액의 추가 분취량 (THF 중 1.06 M)을 반응 혼합물에 14등분으로 (14 x 36 mL, total 504 mL, 533 mmol) 2분 간격으로 첨가하고, 16 ℃-21 ℃의 발열을 일으켰다. 반응물을 15-25 ℃에서 밤새 교반하고 (이 시점에서 HPLC는 목적 생성물 72%의 형성을 나타냄) 혼합물의 pH를 2M 염산 (약 900 mL)을 첨가하여 7.3으로 조정하였다. 수성상을 분리시키고 EtOAc (1.0 L, 500 mL 및 2 x 250 mL)로 반복하여 추출하였다. 배합한 유기물을 염수 (6 x 400 mL)로 세척하고, MgSO4상에서 건조시키고, 진공 하 농축시켜 점착성 황색 고체를 수득하였다. 이렇게 수득한 고체를 IPA (500 mL)에 현탁시키고 15-25 ℃에서 1시간 동안 교반하였다. 현탁액을 여과하고 필터 케이크를 IPA (250 mL, 200 mL)로 세척하고, 흡인 건조하였다. 50 ℃에서 진공 하 생성물을 추가로 건조시켜 표제 화합물인 중간체 (VIIIb)를 회백색 고체로 수득하였다 (105.6 g, 75%, HPLC 순도 97.1%); Rt 12.23 분; m/z 369.3 (M+H)+ (ES+)
tert -부틸 4-(4-(4-(((3 R ,5 R )-5-((1 H -1,2,4-트리아졸-1-일)메틸)-5-(2,4-디플루오로페닐)-테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)벤조에이트.
Figure 112017048060482-pct00029
DMF (500 mL) 중 중간체 (VIIIb) (100 g, 271 mmol)의 용액에 질소 대기 하 소듐 에톡사이드 (22.2 g, 325 mmol)를 첨가하여 온화한 발열 (20 내지 22.0 ℃)을 일으켰다. 15-25 ℃에서 45분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 토실레이트 (IX) (146.4 g, 325 mmol)로 처리 한 다음, 60-65 ℃에서 2시간 동안 가열하였다. 생성된 혼합물의 HPLC 분석은 반응이 본질적으로 완료됨을 나타내었고 (4.4% 잔류 페놀, 14.6% 토실레이트, 77.6% 생성물) 혼합물을 40-45 ℃로 냉각시키고 IPA (800 mL)를 첨가하였다. 이어서, 약간의 헤이즈가 지속될 때까지 (500 mL 요구됨) 40-45 ℃에서 물을 적가하고 그 지점에서 종자로서 작은 샘플의 생성물 (100 ㎎, 0.15 mmol)을 첨가하고 혼합물을 40-45 ℃에서 10분 동안 교반하여 침전이 시작되었는지 확인하였다. 물 (500 mL)을 40-45 ℃에서 적가하고, 이어서 현탁액을 15-25 ℃로 냉각시켰다. 생성된 고체를 여과로 수집하고, 물 (3 x 200 mL)로 세척한 후 50 ℃에서 진공 하 건조하여 조 생성물을 회백색 고체로 수득하였다 (155.9 g, 89 %, HPLC 순도 94.8 %). 이 물질의 일부 (85.0 g)를 용해가 완료될 때까지 65-75 ℃에서 가열하여 IPA (510mL)에 용해시켰다. 그 후 용액을 15-25 ℃로 냉각시키고 30분 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과로 수집하고, IPA (2 x 85 mL)로 세척하고, 50 ℃에서 진공 하 건조시켜 표제 화합물인 중간체 (IVc)를 백색 고체로 수득하였다 (83.4g, 87% 총 생산량, HPLC 순도 98.2%); Rt 15.74 분; m/z 646.6 (M+H)+ (ES+).
4-(4-(4-((( 3 R ,5 R )-5-((1 H -1,2,4- 트리아졸 -1-일) 메틸 )-5-(2,4- 디플루오로페닐 )-테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)벤조산 모노- 하이드로클로라이드 .
Figure 112017048060482-pct00030
물 (250 mL) 및 IPA (417 mL)의 혼합물 중 tert-부틸 벤조에이트 (IVc)의 현탁액 (83.4 g, 129 mmol)에, 35 ℃ 이하의 내부 온도를 유지하면서, 물 (167 mL) 중 진한 염산의 용액 (167 mL)을 첨가하였다. 이어서, 생성된 용액을 35 ℃에서 24시간 동안 유지시켰고 (고형물 형성은 2-3시간 후 관찰됨), HPLC 분석은 반응이 본질적으로 완료되었음을 나타내었다 (0.6 % 잔류 에스테르, 98.1 % 생성물). 혼합물을 15-25 ℃로 냉각시키고, IPA (417 mL)를 첨가하고, <40 ℃에서 수성 NaOH (10 M, 200 mL)를 첨가하여 pH를 약 10으로 조정하여 용액을 수득하였다. <40 ℃에서 진한 염산 (25 mL)을 가하여 pH를 1-2로 재조정 하였다. 생성된 현탁액을 15-25 ℃로 냉각시키고, 고체를 여과하여 수집하였다. 필터 케이크를 물 (834 mL)에 재현탁시키고, 80-85 ℃로 가열한 다음, 30분 동안 교반하였다. 이어서 현탁액을 15-25 ℃로 냉각시키고 고체를 여과로 수집하고, 물 (2 x 83 mL)로 세척하고, 50 ℃에서 진공 하 건조시켜 표제 화합물인 중간체 (II)를 (모노-하이드로클로라이드 염으로서)백색 고체로서 수득하였다 (64.6 g, 80%, HPLC 순도 97.6%); Rt 12.92 분; m/z 590.4 (M+H)+ (ES+).
4-(4-(4-((( 3 R ,5 R )-5-((1 H -1,2,4- 트리아졸 -1-일) 메틸 )-5-(2,4- 디플루오로페닐 )-테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)-N-(4-플루오로페닐)벤즈아미드.
<40 ℃에서 벤조산 (II)의 모노-염산염 (1001 g, 1.60 mol) 및 DMF (5020 mL) 중 HOBt.H2O (216. g, 1.41 mol)의 현탁액에, DIPEA (840 mL, 4.823 mol), 이어서 4-플루오로아닐린 (181 mL, 1.91 mol), 이어서 EDCI.HCl (368 g, 1.92 mol)를 첨가하였다. 혼합물을 60-65 ℃에서 17시간 동안 가열하고, HPLC 분석으로 반응이 완료되었음을 나타냈다 (출발 물질 또는 반응 중간체가 검출되지 않음, 82.63% 생성물). 생성된 용액을 15-25 ℃로 냉각시키고 <35 ℃에서 물 (15.2 L)로 켄칭시키고, 다시 15-25 ℃로 냉각하고 1시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과 수집하고, 물 (2 x 2.00 L)로 세척하고 흡인 건조하였다. 필터 케이크를 물 (5.00 L) 중에 15-25 ℃에서 45분 동안 재-슬러리화하고, 고체를 여과로 수집하고, 물 (2 x 2.00 L)로 세척하고 진공 하 건조시켜 표제 화합물인 화합물 (I)을 회백색 고체로 수득하였다 (1101 g, ~100%, HPLC 순도 95.8%); Rt 14.46 분; m/z 683.5 (M+H)+ (ES+); 1H NMR δ: 2.10 (3H, s), 2.16 (1H, dd), 2.37-2.43 (1H, m), 2.50-2.58 (1H, m), 3.13-3.15 (4H, m), 3.41-3.44 (4H, m), 3.67 (1H, dd), 3.74-3.78 (2H, m), 4.05 (1H, t), 4.55 (1H, d), 4.61 (1H, d), 6.76 (2H, s), 6.86 (1H, s), 7.00 (1H, d,t), 7.08 (2H, d), 7.17 (2H, t), 7.26-7.35 (2H, m), 7.76-7.80 (2H, m), 7.77 (1H, s), 7.89 (2H, d), 8.35 (1H, s) 및 10.02 (1H. S).
생물학적 테스트 : 실험적 방법
플랑크톤 진균 성장 평가
a . 레자주린 - 마이크로역가(Resazurin - microtiter ) 분석
이 분석은 수정된, 공지된 방법 (Monteiro et al., 2012)을 사용하여 수행되었다. 아스퍼질러스 푸미가투스 (NCPF2010, Public Health England, Wiltshire)의 포자를 사부로드 덱스트로오스 한천 (Sabouraud dextrose agar)에서 3일 동안 배양하였다. PBS-tween (10 mL, 0.05% Tween-20, 100 U/mL 페니실린(Penicillin) 및 100 U/mL 스트렙토마이신(Streptomycin)을 함유한 PBS)으로 세척하여 사부로드 덱스트로오스 한천 배지에서 원액 포자 현탁액을 제조하였다. 포자수를 노이바우어 (Neubauer) 혈구계를 사용하여 평가하고, PBS를 사용하여, 106 포자/mL로 조정하였다. 포자의 작동 현탁액 (104 포자/mL)을 필터 멸균 MOPS RPMI-1640 (50 mL; 2 mM L- 글루타민, 2% 글루코스 및 0.165 M MOPS를 함유하는 RPMI-1640, NaOH로 pH 7로 완충)에서 제조하였다. 포자 현탁액에 레자주린 소듐 염 (1% 용액 100 μL, Sigma-Aldrich, Dorset, UK)을 첨가하고 잘 혼합했다. 포자 현탁액-레자주린 혼합물 (100 μL/웰)을 384-웰 플레이트 (카탈로그 번호 353962, BD Falcon, Oxford, UK)에 첨가하였다. 동시에, 시험 화합물 (0.5 μL DMSO 용액)을 100 μL의 포자-레자주린 혼합물에 4회에 걸쳐 첨가하여 Integra VIAFLO 96 (Intergra, Zizers, Switzerland)을 사용하여 0.5%의 최종 DMSO 용액을 제공하였다. 비-포자 대조 웰을 위해, 포자-레자주린 혼합물 대신에 MOPS-RPMI-레자주린 용액 (100 μL)을 첨가하였다. 플레이트를 Breathe Easier membrane (Catalog No Z763624, Sigma-Aldrich, Dorset, UK)으로 덮고 (35 ℃, 5% CO2), 접종한 웰의 형광이 대조 웰의 형광의 2배가 될 때까지(약 24시간) 배양하였다 (35 ℃, 5% CO2). 다중-스캐너 (Clariostar: BMG, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 각 웰의 형광 (545 nm (자극) / 590 nm (방출), gain 800, 초점 높이 5.5 mm)을 측정하였다. 각 웰에 대한 억제율을 계산하고 MIC50, MIC75 및 MIC90 값을 각각의 시험 화합물에 대해 생성된 농도-반응 곡선으로부터 계산하였다.
b . 브로쓰 마이크로희석 (Broth microdilution ) 분석
이 분석은 EUCAST (Rodriguez- Tudela et al., 2008)에 의해 발표된 수정된 방법을 사용하여 수행되었다. Public Health England, Wiltshire의 아스퍼질러스 푸미가투스 포자 (NCPF2010, NCPF7010 (메티오닌 220 돌연변이), NCPF7099 (글리신 G54 돌연변이); St Louis Hospital, Paris, France의 TR34/L98H 돌연변이를 사부로드 덱스트로오스 한천 배지에서 3일 동안 배양하였다. PBS-tween (10 mL, 0.05% Tween-20, 100 U/mL 페니실린 및 100 U/mL 스트렙토마이신을 함유한 PBS)으로 세척하여 사부로드 덱스트로오스 한천 배지에서 원액 포자 현탁액을 제조하였다. 포자수는 노이바우어 혈구계를 사용하여 평가한 다음 PBS로 106 포자/mL 로 조정하였다. 포자의 작동 현탁액 (2 × 105 포자/mL)을 멸균된 필터, BSA MOPS RPMI-1640 (50 mL; 2 mM L-글루타민, 0.5% BSA, 2% 글루코스, 0.165 M MOPS를 함유하는 RPMI-1640, NaOH로 pH 7로 완충됨)에서 준비하였다. 분석을 위해, BSA MOPS RPMI-1640 (50μL/ 웰)을 384-웰 플레이트 (Catalogue number 353962, BD Falcon, Oxford, UK)에 처음으로 첨가하였다. 이어서, 시험 화합물 (0.5 μL DMSO 용액)을 Integra VIAFLO 96 (Integra, Zizers, Switzerland)을 사용하여 4회에 걸쳐 첨가하고, 플레이트 믹서를 사용하여 잘 혼합하였다. 이어서, 상기 제조된 작용 포자 현탁액 50 μL를 포자가 없는 대조 웰을 제외한 모든 웰에 첨가하였다. 포자가 없는 대조 웰에서는, 대신 BSA MOPS-RPMI 용액 (50 μL/웰)을 첨가하였다. 플레이트를 플라스틱 뚜껑으로 덮고, 48시간 동안 배양 (35 ℃에서 주위 공기와 함께임)하였다. 각 웰의 OD는 멀티-스캐너(Clariostar: BMG, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 결정되었다. 각 웰에 대한 억제율을 계산하고 MIC50, MIC75 및 MIC90 값을 각각의 시험 화합물에 대해 생성된 농도-반응 곡선으로부터 계산하였다.
진균 패널 스크리닝은 Eurofins Panlabs Inc.에 의해 수행되었다. 시험 물품의 MIC 및 MIC50 값은 임상 및 실험실 표준 협회 (Clinical and Laboratory Standards Institute)의 가이드라인에 따라, 효모 (CLSI M27-A2), (CLSI, 2002) 및 사상 균류 (CLSI M38-A) (CLSI, 2008)에 대한 브로쓰 마이크로희석(broth microdilution)방법에 따라 결정되었다.
기관지 상피 세포의 아스퍼질러스 푸미가투스 감염
BEAS2B 세포를 10% FBS RPMI-1640 내 96-웰 플레이트 (100 μL; 30,000 세포/웰; 카탈로그 번호 3596, Sigma Aldrich, Dorset, UK)에 시딩(seed)하고 실험 전 하루 동안 배양 (37 ℃, 5 % CO2)하였다. 시험 화합물 (0.5 μL DMSO 용액) 또는 비히클 (DMSO)을 각각의 웰에 첨가하여 0.5 %의 최종 DMSO 농도를 얻었다. BEAS2B 세포를 아스퍼질러스 푸미가투스 (20 μg; Public Health England) 분생 현탁액 (10% FBS RPMI-1640 중 0.5x105 /ml)으로 감염시키기 전에 시험 화합물과 함께 1시간 동안 배양 (35 ℃, 5 % CO2)하였다. 플레이트를 24시간 동안 배양 하였다(35 ℃, 5 % CO2). 상등액 (50 μL)을 수집하고, 사용하기 전까지, 냉동 (-20 ℃)한 PCR 플레이트 (카탈로그 번호 L1402-9700, Starlab, Milton Keynes, UK)에 옮겨 놓았다. 해동 후, R7-PBS 용액 (95 μL, PBS에 1:4 R7; Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA, USA)을 첨가하여 상등액 (5 μL)을 1:20으로 희석하였다. 이 샘플 (50 μL)의 GM 수준은 Platelia GM-EIA 키트 (Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA, USA)를 사용하여 측정하였다. 각 웰에 대한 저해 백분율을 계산하고 IC50 값을 각 시험 화합물에 대해 생성된 농도-반응 곡선으로부터 계산하였다.
인간 폐포 이중층의 아스퍼질러스 푸미가투스 감염
인간 폐포 상피 세포와 내피 세포의 이중층으로 구성된 인간 폐포의 시험관 내 모델을, 이전에 기술된 바 (Hope et al., 2007).와 같이 제조하였다. 이 시스템은 시험 화합물을 상부 ("공기" 공간) 및/또는 하부 ("체계적" 공간) 구획으로 투여할 수 있게 한다. 이러한 유연성은 화합물 (I)을 상부 챔버에 투여하고 포사코나졸 또는 다른 항진균 의약을 하부 챔버에 투여함으로써 병용 요법의 효과를 조사하는데 이용되었다. 일차 인간 폐동맥 내피 세포 (HPAEC)를 수확하고 EGM-2 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)에서 106 세포/mL로 희석하였다. 트랜스웰을 역전시키고 세포 현탁액 (100 μL/웰)을 각각의 트랜스웰의 바닥에 도포하였다. 반전된 트랜스웰을 실온에서 유동 후드 내에서 2시간 동안 배양한 후, 이들을 직립 상태로 두었다. EGM-2 배지를 하부 (700 μL/웰) 및 상부 (100 μL/웰) 구획에 첨가하고 트랜스웰을 48시간 동안 배양 (37 ℃, 5 % CO2)하였다. 하부 구획의 EGM-2 배지를 새로운 EGM-2 배지로 교체하였다. A549 세포를 수확하고 10% EBM 중 5x105 세포/mL로 희석한 다음, 모든 트랜스웰의 상부 구획 (100 μL/웰)에 첨가하고 플레이트를 72시간 동안 배양 (37 ℃, 5 % CO2)하였다. 아스퍼질러스 푸미가투스의 칸디다 (이트라코나졸 민감성 균주 NCPF2010 및 이트라코나졸 내성 균주 TR34-L98H)를 사부로드 덱스트로오스 한천 배지에서 3일 동안 각각 배양하였다. PBS-tween (10 mL; 0.05% Tween-20, 100 U/mL 페니실린 및 100 U/mL 스트렙토마이신을 함유하는 PBS)으로 세척함으로써 사부로드 덱스트로오스 한천 배지에서 각 균주의 원액 포자 현탁액을 제조하였다. 포자 수를 노이바우어 혈구계를 사용하여 평가하고 PBS로 106 포자/mL로 조정하였다. 포자 분양 물은 사용 직전에 EBM (105 포자/mL)으로 제조하였다.
시험 화합물 및 참조 화합물 (또는 비히클로서의 순수한 DMSO) 을 하부 구획 처리를 위한 24-웰 플레이트 (3 μL/웰, 600 μL의 2% FBS EBM 포함) 및 상부 구획 처리를 위한 96-웰 플레이트의 적절한 웰에 첨가하고, 0.5%의 최종 DMSO 농도를 제공하였다. 상부 구획의 배지를 흡인하고 적합한 시험 및 참조 화합물, 또는 비히클을 함유한 배지를 첨가하였다 (100 μL/웰). 트랜스웰을 시험 화합물 및 참조 화합물 또는 DMSO 비히클을 함유하는 24-웰 플레이트에 옮겼다. 1시간 동안 배양한 후 (35 ℃, 5% CO2), 각 트랜스웰의 상부 구획에 포자 현탁액 (10 μL/웰)을 첨가 하였다. 그 후 플레이트를 24시간 동안 배양 (35 ℃, 5% CO2)하였다. 각 구획 (5 μL/구획)의 상등액을 모으고 저장하였다 (-20 ℃). 상등액을 수거한 후 매질을 매일 교체하고, 모든 웰을 시험 화합물 및 참조 화합물 또는 DMSO로, 위에서 기재한 대로 3일 동안 처리하였다. 샘플은 모든 트랜스웰에서 진균 성장이 눈으로 보일 때까지 계속 수집되었다. 낮은 구획에 있는 상등액의 GM 수준은 아스퍼질러스 푸미가투스 침입의 지표로서 ELISA (BioRad, CA, USA)에 의해 측정되었다.
세포 생존 능력 : 레자주린 분석
BEAS2B 세포를 실험 하루 전에 RPMI-LHC8 (RPMI-1640 및 LHC8 배지를 동일한 비율로 혼합함)의 384-웰 플레이트 (100 μL; 3000 / 웰 /; BD 팰콘, 카탈로그 번호 353962)에 시딩하였다. 무-세포 대조 웰을 위해, RPMI-LHC8 (100 μL)을 첨가하였다. Integra VIAFLO 96 (Integra, Zizers, Switzerland)을 사용하여 시험 화합물 (DMSO 용액 0.5 μL)을 첨가하여 0.5% 농도의 최종 DMSO를 얻었다. BEAS2B 세포를 각 시험 화합물과 함께 1일 동안 배양 (RPMI-LHC8에서 37 ℃ / 5% CO2)하였다. 레자 주린 원액 용액 (5 μL, 0.04%)을 첨가한 후, 플레이트를 추가로 4시간 동안 배양 (37 ℃ / 5% CO2)하였다. 545 nm (자극) 및 590 nm (방출)에서의 각 웰의 형광은 다중 스캐너 (Clariostar : BMG Labtech)를 사용하여 측정하였다. 세포 생존률의 손실률은 비히클 (0.5% DMSO) 처리에 대한 각 웰에 대해 계산하였다. 필요에 따라, 각 시험 화합물에 대한 농도-반응 곡선으로부터 생성된 농도-반응 곡선으로부터 CC50 값을 계산하였다.
생체 내 항-진균 활성
아스퍼질러스 푸미가투스 (ATCC 13073 [균주: NIH 5233], American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)는 Malt agar (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan) 플레이트에서 6-7일 동안 실온 (24 ± 1 ℃)에서 성장하였다. 포자를 무균적으로 한천 플레이트에서 제거하고 0.05% 트윈 (Tween) 80 및 0.1% 한천을 갖는 멸균 증류수에 현탁시켰다. 감염 당일에, 혈구 계수기로 포자 수를 평가하고, 접종원(inoculum)은 생리식염수의 1.67 x 108 포자 mL-1 농도를 얻도록 조정하였다.
면역억제 및 호중구 감소를 유도하기 위해, A/J 마우스 (수컷, 5주령)에게 감염 3일, 2일 및 1일 전에 하이드로코르티손 (Sigma H4881; 125 mg/kg, sc,)을 투여하고, 감염 2일 전에 사이클로포스파미드 (Sigma C0768; 250 mg/kg, ip)를 투여하였다. 0일째에, 동물을 포자 현탁액 (35 μL의 비강-내)으로 감염시켰다.
시험 화합물을 비강-내 (생리 식염수 중 0.08-2.00 mg/mL의 현탁액 35 μL) 1일 1회, 0일에 감염 30분 전 및 1일, 2일 및 3일 (예방치료를 대표함) 또는 1일, 2일 및 3일에만 (치료를 대표함) 투여되었다. 연장된 예방적 치료를 위해, 시험 화합물 (생리 식염수 중 0.0032 또는 0.016 mg/mL의 현탁액 35 μL)을 비강-내로 1 일 1회 7일; 0일에 감염 30분 전, 그 후 감염 후 1, 2 및 3일 또는 0일에만 투여하였다. 이러한 치료 패러다임의 효과를 치료 접종 1일 및 30분 전에, 그리고 감염 후 1, 2 및 3일로 제한했을 때; 또는 감염 전 1일 및 30분으로 더 감소했을 때 얻은 효과와 비교하였다. 동물 체중을 매일 모니터링하고 0일째 체중과 비교하여 ≥20%의 감소를 보이는 동물은 도태되었다.
마지막 투여 6시간 후, 동물을 마취시키고, 기관을 삽관하고, BALF를 수집 하였다. 폐포 세포의 총수는 혈구계를 사용하여 결정하였고, 폐포 대식세포와 호중구의 수는 anti-mouse MOMA2-FITC (macrophage) 또는 anti-mouse 7/4 (neutrophil)을 사용한 FACS 분석 (EPICS® ALTRA II, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)에 의해, 각각 이전에 보고된 것처럼 (Kimura et al., 2013) 결정되었다. BALF 중 IFN-γ 및 IL-17, 혈청 내 IL-6 및 TNF-α 수준은 Quantikine® mouse IFN-γ, IL-17, IL-6 또는 TNF-α ELISA kit (R&D systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)을 사용하여 각각 결정되었다. MDA, 산화 스트레스 마커는, OxiSelect® TBARS 분석 키트 (MDA Quantitation, Cell Biolabs Inc, San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 혈청 내 아스퍼질러스 GM은 Platelia GM-EIA 키트 (Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA, USA)를 사용하여 측정하였다. 컷-오프 지수는 다음 식에 의해 계산되었다: 컷-오프 지수 = 샘플의 OD / 키트에 제공된 컷-오프 컨트롤에서의 OD. 조직 진균 로드 분석을 위해, 폐 조직 100 mg을 무균적으로 제거하고 0.2 mL 멸균 증류수 0.1% 한천으로 균질화시켰다. 연속적으로 희석된 폐 균질물을 맥아 한천 플레이트 (50 μL/플레이트)에 도말하고, 24±1 ℃에서 72 내지 96시간 동안 배양하였다. 각 플레이트의 A. 푸미가투스의 콜로니를 계수하고 진균 역가를 폐 조직 1g 당 CFU로 나타내었다.
심하게 면역억제된, 호중구 감소성 A/J 마우스에 (수컷, 5주령), 감염 전 3일 동안 하이드로코르티손 (Sigma H4881; 125 mg/kg, sc,)을 매일 투여하고 감염 2일전 사이클로포스파미드 (Sigma C0768; 250 mg/kg, ip)를 투여한 것을, 경구 투여된 화합물 (I) 및 포사코나졸 투여의 병용 효과를 평가하기 위해 사용하였다. 0일째에, 아스퍼질러스 푸미가투스 (ATCC 13073 [균주: NIH 5233])의 포자 현탁액 (생리 식염수 중 1.67 x 108 포자/ml) 35 μL를 비강 내로 감염시켰다. 등장성 생리 식염수 (0.4 mg/mL)에서 현탁액으로 제조된 화합물 (I)을 감염 후 1-6 일에 비강 내 주사 (35 μL/마우스)로 1일 1회 투약하였다. 포사코나졸 (1 mg/kg)은 감염 후 1-6일에 1일 1회 경구 투여하였다. 체중과 생존을 7일까지 매일 모니터링하였다.
스크리닝 결과 요약
화합물 (I)은 레자주린 분석법에 의해 평가된 바와 같이 아졸 민감성 아스퍼 질러스 푸미가투스 진균 성장 및 기관지 상피 세포의 진균 감염 모두에 대한 강력한 억제 활성을 입증한다 (표 2). 이들 분석 시스템에서 화합물 (I)은 보리코나졸 및 암포테리신 B보다 유의하게 큰 효능을 나타내었고, 포사코나졸과 유사한 효능을 보였다. 화합물 (I)과의 인큐베이션은 적어도 10 μM까지의 농도에서 BEAS2B 기관지 상피 세포의 생존 능력에 전혀 또는 거의 영향을 미치지 않았다.
아스퍼질러스 푸미가투스 (NCPF2010)진균 성장, BEAS2B 기관지 상피 세포의 진균 감염 및 BEAS2B 세포 생존능에 대한 보리코나졸, 포사코나졸, 암포테리신 B 및 화합물 (I)의 처리 효과.
표시된 분석 시스템의 MIC 50 / MIC 75 / CC 50 값 (nM)
처리
(시험 화합물) 		플랑크톤 진균성장 1 BEAS2B 세포
의 감염 2 		BEAS2B
세포 생존능 3
MIC 50 MIC 75 MIC 50 CC 50
보리코나졸 90.8 168 154 >28600
포사코나졸 3.64 6.94 4.48 >14300
암포테리신 B 28.5 64.4 nt 977
화합물 (I) 1.98 5.02 5.43 >12200
화합물 (I).4[ 2 H] nt nt 3.15 >14600
표 각주: 1. 레자주린-마이크로역가 분석; 2. 기관지 상피 세포; 3. n = 1-5;
화합물 (I)은 또한 브로쓰 마이크로희석 분석 (표 3)에서 평가된 바와 같이 플랑크톤 진균성장에 대한 강력한 억제 활성을 나타낸다. 이 분석에서, 화합물 (I)은 포사코나졸, 보리코나졸 및 암포테리신 B보다 포사코나졸-내성 균주 (NCPF7099, NCPF7100 및 TR34/L98H) 및 포사코나졸-민감성 균주 (NCPF2010)에서 현저하게 더 큰 효능을 보였다.
아스퍼질러스 푸미가투스 분리물의 플랑크톤 진균 성장에 대한 보리코나졸, 포사코나졸, 암포테리신 B 및 화합물 (I)로의 처리 효과
처리
(시험 화합물) 		표시된 아스퍼질러스 푸미가투스 균주에 대한 MIC 75 값 (nM) 1
NCPF2010 NCPF7099 NCPF7100 L98H
보리코나졸 496 96.7 596 >2860
포사코나졸 15.3 112 71.5 150
암포테리신 B 382 365 >1080 209
화합물 (I) 13.6 16.5 19.7 56.7
화합물 (I).4[ 2 H] 14.7 13.7 28.6 70.0
표 각주: 1. 브로쓰 마이크로희석 분석, n = 1-3
화합물 (I)의 광범위한 진균 병원균의 성장에 대한 영향을 CLSI 브로쓰 마이크로희석 방법을 사용하여 평가하였다. 화합물 (I)은 리조퍼스 오리재, 카에토미움 글로보슘, 페니실리움 크리소게넘 및 트리코파이톤 루브럼뿐만 아니라 일부 칸디다 속의 성장에 대한 강력한 억제제로 밝혀졌다 (표 4).
소정의 범위의 진균 종의 성장에 대한 화합물 (I)의 효과.
화합물 (I) 보리코나졸 포사코나졸
진균 작용제 균주 MIC 50 MIC 100 MIC 50 MIC 100 MIC 50 MIC 100
(μg/mL) (μg/mL) (μg/mL)
아스퍼질러스 플라부스 ATCC204304 1.0 >8.0 1.0 2.0 0.063 0.13
아스퍼질러스 플루란스 ATCC9348 >8.0 >8.0 >8.0 >8.0 0.25 1.0
칸디다 알비칸스 20240.047 0.031 >8.0 0.031 >8.0 0.031 >8.0
ATCC10231 0.13 >8.0 0.25 >8.0 0.13 >8.0
20183.073 0.5 >8.0 4.0 >8.0 0.25 >8.0
20186.025 >8.0 >8.0 >8.0 >8.0 >8.0 >8.0
칸디다 글라브라타 ATCC36583 0.5 >8.0 0.25 >8.0 0.5 >8.0
R363 0.5 >8.0 >8.0 >8.0 0.5 >8.0
리조퍼스 오리재 ATCC11145 0.063 2.0 8.0 >8.0 0.13 >8.0
크립토코커스 네오포르만스 ATCC24067 0.008 1.0 0.016 1.0 0.016 0.25
카에토미움 글로보슘 ATCC44699 0.063 >8.0 0.5 1.0 0.13 0.25
페니실리움 크리리소게넘 ATCC9480 0.031 >8.0 1.0 2.0 0.063 0.13
트리코파이톤 루브럼 ATCC10218 <0.008 0.031 <0.008 0.063 <0.008 0.031
표 각주: MIC50/MIC100 = 육안 검사 (CLSI)에 의한 진균 성장의 50% 및 100% 억제에 필요한 농도.
화합물 (I) (상부 챔버에서 0.1 μg/mL) 또는 포사코나졸 (하부 챔버에서 0.01 μg/mL)로 단일 요법은 인간 폐포 이중 막에서 1일째에 GM 생산을 억제하였다. 그러나, 이들 처리의 억제 효과는 그 이후 빠르게 사라졌다 (표 5). 대조적으로, 화합물 (I)과 포사코나졸의 조합 처리는 감염 후 침입의 지속적인 억제를 나타내었다. 결과적으로, 조합 처리에 대한 DFB50은 5.48일이었고, 어느 한 화합물 단독의 값보다 훨씬 더 길다. 조합 요법의 이러한 상승 작용 또는 부가 효과는 화합물 (I)의 처치가 인트라코나졸, 보리코나졸 또는 카스포퍼진 (caspofungin)과 병용될때도 확인되었다 (결과는 나타내지 않음).
인간 폐포 이중층 (트랜스웰)의 하부 챔버로의 아스퍼질러스 푸미가투스 (NCPF 2010) 침습에 대한 화합물 (I), 포사코나졸 및 처리 조합의 효과
지시된 OD 값의 처리를 위한 하부 챔버에서의 GM 수준
( % 억제 vs. 조절)l
처리 일수 비히클 화합물 (I) 1
상부 챔버 		포사코나졸 2
하부 챔버 		조합 처리
0 0 0 0 0
1 0.68 0.091 (86) 0.064 (91) 0.007 (99)
2 1.19 1.15 (3.4) 1.01 (15) 0.011 (99)
3 1.19 1.14 (3.7) 1.14 (4.1) 0.025 (98)
4 1.18 1.13 (4.5) 1.17 (1.1) 0.11 (91)
5 1.18 1.18 (0.3) 1.18 (-0.6) 0.42 (64)
6 1.18 1.18 (-0.3) 1.19 (-1.1) 0.73 (38)
7 1.18 1.16 (0.9) 1.17 (0.3) 1.15 (2.0)
8 1.16 1.13 (2.8) 1.15 (0.8) 1.12 (3.7)
지시된 처리의 DFB 50 값 1.13 1.45 5.48
표 각주: 1. 0.1 μg/mL로 투여; 2. 0.01 μg/mL로 투여; DFB 50 : 대조군의 50%의 균질 존재량에 도달하기까지 소요된 일수
또한, 이 조합 처리는 아스퍼질러스 푸미가투스의 아졸 저항성 균주에 감염된 이중층에서 시험하였다: TR34-L98H. (표 6) 상부 챔버의 화합물 (I) (1 μg/mL) 또는 하부 챔버의 포사코나졸 (0.1 μg/mL) 단독 요법은 제한된 이점을 보였다. 대조적으로, 화합물 (I)과 포사코나졸의 조합은 하부 챔버 내로 진균 침입에 대한 현저한 억제 효과를 나타내었다. 병용 처리의 유익한 효과는 감염 후 1일째에 관찰되었지만 2일 후에 사라졌다.
폐포 이중층 세포계(트랜스웰)의 하부 챔버로의 아스퍼질러스 푸미가투스 (TR34-L98H 균주 침습에 대한 화합물 (I), 포사코나졸 및 병용 처리의 효과
지시된 처리에 대한 하부 챔버에서의 GM 수준
OD 값 (대조군 대비 억제%)l
처리 일수 화합물 (I) 1
상부 챔버 		포사코나졸 2
하부 챔버 		조합 처리
0 0 0 0
1 0.35 0.039 (88) 0.013 (96)
2 0.99 1.02 (-2.7) 0.082 (92)
3 0.99 0.97 (1.7) 0.54 (45)
4 1.01 1.02 (-1.4) 1.09 (-8.8)
지시된 처리에 대한 DFB 50 값 1.10 1.64 2.93
표 각주: 1. 1 μg/mL로 투여; 2. 0.1 μg/mL로 투여; DFB 50 : 대조군의 50%의 균질 존재량에 도달하기까지 소요된 일수
접종 (예방적 처리) 후 0일과 1-3 일에 면역 결핍성 호중구 감소증 마우스에 비강 내 투여한 경우, 화합물 (I)은 아스퍼질러스 푸미가투스 감염으로 인한 3일 동안 체중 감량을 감소시키는데 있어서 포사코나졸에 비해 우수한 효과를 보였다 (표 7).
아스퍼질러스 푸미가투스 감염에 의해 면역손상된 호중구 감소증 마우스의 체중 감소에 대한 화합물 (I) 및 포사코나졸의 처리 효과 비교
약물 처리 1 아스퍼질러스 푸미가투스 감염으로 인한 체중 감소 2
(체중 감량 억제 % )
1일 2일 3일
비히클 + 포자 9.2 ± 1.5 14.3 ± 1.9 19.3 ± 1.4
포사코나졸 7.3 ± 2.0 (21) 13.4 ± 1.9 (6) 18.1 ± 2.0 (6)
화합물 (I) 6.1 ± 1.8 (34) 8.7± 2.5 (39) 11.1 ± 5.6 (42)
표 각주: 1. 비강-내 0.4 mg/mL 투여; 2. 0일째 동물 중량과 비교한 체중 감소%.
또한, 화합물 (I)에 의한 예방적 및 치료적 처리는 포사코나졸에 폐의 진균 로드뿐만 아니라 감염 후 BALF 및 혈청 모두의 GM 농도에 대해 우수한 효과를 보였다. 예방적 및 치료적 투여 요법에 사용된 화합물 (I)에 대한 데이터를 표 8 및 도 1, 2 및 3에 나타내었다. 1, 2 및 3 (표 9에 제시된 ID50 값).
아스퍼질러스 푸미가투스 감염되고 면역손상된 호중구 감소증 마우스에서 폐 중 CFU 및 BALF 및 혈청 중 갈락토만난 농도에 대한 화합물 (I)의 예방적 및 치료적 처리 효과.
처리 요법 약물 농도
(mg/mL) 		반응 억제 %
CFU
(/mg 폐) 		BALF 중 GM ( COI ) 혈청 중 GM ( COI )
비히클 + 포자 없음 28.4 ± 16.9 4.8 ± 0.40 5.3 ± 1.1
화합물 (I):
예방적 처리 		0.08 15.2 ± 13.7 (46) 0.70 ± 0.39 (85) 0.81 ± 0.52 (85)
0.4 2.1 ± 1.6 (93) 0.37 ± 0.46 (92) 0.24 ± 0.18 (95)
2 0.8 ± 0.7 (97) 0.13 ± 0.02 (97) 0.18 ± 0.07 (97)
화합물(I):
치료적 처리 		0.4 3.8 ± 1.0 (87) 0.24 ± 0.06 (95) 0.29 ± 0.11 (95)
2 1.9 ± 1.7 (93) 0.22 ± 0.14 (95) 0.25 ± 0.19 (95)
10 0.5 ± 0.3 (98) 0.11 ± 0.05 (98) 0.24 ± 0.11 (95)
표 각주: 균질 로드에 대한 데이터는 평균의 평균 ± 표준 오차 (SEM; n = 5-6)로 표시된다.
아스퍼질러스 푸미가투스 감염되고 면역손상된 호중구 감소증 마우스에서 폐 중 진균 로드 및 BALF 및 혈청 중 갈락토만난 농도에 대한 포사코나졸 및 화합물 (I)의 예방적 처리에 대한 ID50 값
약물 물질
(예방 요법) 		표시된 반응에 대한 ID 50 값 (mg/mL)
폐 진균 로드 BALF 중 GM 혈청 중 GM
화합물 (I) 0.086 <0.08 <0.08
포사코나졸 0.24 1.3 0.47
화합물 (I)의 예방적 처치는 포사코나졸과 유사한 방식으로 BALF에서 염증 세포 축적을 억제하였다 (표 10). 또한, 화합물 (I)의 예방적 처치는 포사코나졸에 비해 IL-17, IFNγ 및 BALF에서의 MDA 농도 및 독립적인 실험에서 화합물 (I) 및 포사코나졸에 대한 비교 ID50 값을 표 11에 나타내었다.
아스퍼질러스 푸미가투스 감염되고 면역손상된 호중구 감소증 마우스의 BALF로 대식세포 및 호중구 축적에 대한 화합물 (I)의 예방적 및 치료적 처리효과.
처리 약물 농도
(mg/mL) 		BAL중 세포 수 x10 5 /mL( 억제% )
마이크로파지 호중구
비히클 + 포자 0.65 ± 0.14 0.49 ± 0.09
화합물 (I):
예방적 처리 		0.08 0.40 ± 0.15 (38) 0.37 ± 0.04 (24)
0.4 0.32 ± 0.07 (51) 0.26 ± 0.12 (47)
2 0.26 ± 0.05 (60) 0.22 ± 0.04 (55)
화합물(I):
치료적 처리 		0.4 0.43 ± 0.05 (34) 0.38 ± 0.04 (22)
2 0.40 ± 0.11 (38) 0.34 ± 0.05 (31)
10 0.32 ± 0.07 (51) 0.27 ± 0.08 (45)
표 각주: 세포 수에 대한 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM), N = 5-6으로 나타냈다.
아스퍼질러스 푸미가투스 감염되고 면역손상된 호중구 감소증 마우스에서 BALF 중 IL-17, IFNγ 및 MDA 수준에 대한 포자코나졸 및 화합물 (I)의 예방적 처리에 대한 ID50 값.
약물 물질
(예방 요법) 		표시된 바이오마커에 대한 ID 50 값 (mg/mL)
IL-17 IFNγ MDA
화합물(I) 0.074 <0.08 0.11
포사코나졸 0.61 0.22 0.69
또한, 예방적 또는 치료적으로 투여된 BALF에서의 IFNα, IL-17 및 MDA 수준에 대한 화합물 (I)의 효과를 나타내는 데이터를 표 12에, 혈청, IL-6 및 TNF에 대한 효과를 표 13에 나타내었다.
아스퍼질러스 푸미가투스 감염되고 면역손상된 호중구 감소증 마우스에서 BALF 중 IFNα, IL-17 및 MDA 수준에 대한 화합물 (I)의 예방적 및 치료적 처리 효과.
처리 요법 약물 농도
(mg/mL) 		BALF 중 바이오마커 농도
(억제%)
IFNγ
( pg /mL) 		IL-17
(pg/mL) 		MDA
(μg/mL)
비히클 + 포자 9.2 ± 1.0 19.8 ± 3.6 1.8 ± 0.2
예방적 화합물 (I)
 0.08 3.7 ± 1.7 (60) 9.8 ± 5.3 (51) 0.96 ± 0.32 (47)
0.4 3.0 ± 0.8 (67) 6.7± 4.9 (66) 0.57 ± 0.22 (68)
2 2.5 ± 0.3 (73) 3.2 ± 0.8 (84) 0.34 ± 0.05 (81)
치료적 화합물(I)
 0.4 4.3 ± 2.2 (53) 8.5 ± 2.9 (57) 0.45 ± 0.10 (75)
2 3.3 ± 0.8 (64) 4.0 ± 0.8 (80) 0.37 ± 0.10 (79)
10 2.1 ± 0.3 (77) 2.9 ± 0.7 (85) 0.25 ± 0.05 (86)
표 각주: 바이오 마커 농도에 대한 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM), N = 5-6으로 표시된다.
아스퍼질러스 푸미가투스 감염되고 면역손상된 호중구 감소증 마우스에서 혈청 중 IL-6 및 TNFα에 대한 화합물 (I)의 예방적 및 치료적 처리의 효과
처리 요법 약물 농도
(mg/mL) 		바이오마커 농도( pg /mL)
(억제%)
IL-6 TNFα
비히클 + 포자 284 ± 112 25.6 ± 8.0
화합물 (I)
예방적 처리 		0.08 159 ± 73.3 (44) 11.8 ± 5.9 (54)
0.4 86.3 ± 46.9 (70) 7.3 ± 3.5 (71)
2 44.5 ± 12.2 (84) 4.7 ± 0.4 (82)
화합물 (I)
치료적 처리 		0.4 51.7 ± 16.8 (82) 6.2 ± 0.5 (76)
2 44.2 ± 11.4 (84) 5.5 ± 0.7 (79)
10 35.9 ± 10.4 (87) 4.9 ± 0.6 (81)
표 각주: 바이오 마커 농도에 대한 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM), N = 5-6으로 표시된다.
화합물 (I)의 치료법은 아스퍼질러스 푸미가투스 감염, 면역손상 및 호중구 감소증 마우스에서 폐 진균 로드, 혈청 갈락토만난 수준 및 BALF 사이토카인 농도의 강력한 억제를 유지하는 것으로 밝혀졌다 (표 7, 8 9 및 10 및 도. 1, 2 및 3).
아스퍼질러스 푸미가투스 감염, 면역손상, 호중구 감소증 마우스에서의 바이오 마커에 대한 화합물 (I)의 연장된 예방적 투여의 효과를 평가하였다. 화합물 (I)의 확장된 예방은 이전의 바이오 마커 연구 (표 14)에서 사용된 것보다 25배 낮은 용량으로 BALF와 혈청 모두의 GM 농도뿐만 아니라 폐의 진균 로드를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 7일간의 예방 조치가 추가된 하루 동안의 예방적 치료보다 더 큰 항진균 효과를 나타내기 때문에, 반복 투여시 폐에 항진균 효과가 축적되는 것으로 나타났다.
화합물의 폐 활동 지속성은 -7일째부터 0일째 처리가 -1일 및 0일째 처리에서 발생하는 것보다 3일째 우수한 항진균 효과를 나타냈다는 사실을 암시한다. 그럼에도 불구하고 이 단축 투여 프로토콜은 여전히 보호적이다.
아스퍼질러스 푸미가투스 감염되고 면역-손상된 호중구 감소증 마우스에서 폐 중 진균 로드 (CFU) 및 BALF 및 혈청 중 GM 농도에 대한 화합물 (I)의 연장된 예방 용량의 효과.
처리 요법 1
(1일 용량)

화합물 (I) 용량
(μg/mL)
반응값 및 억제 % 3
CFU (/mg 폐) BALF 중 GM (COI) 혈청 중 GM( COI )
비히클 + 포자 2 없음 34.7±10.7 5.1±0.9 4.3±1.0
-7 내지 +3 3.2 8.3±2.0 (76) 2.6±0.36 (49) 1.8±0.43 (58)
-1 내지 +3 3.2 9.5±3.3 (73) 2.8±0.71 (45) 2.2±0.69 (49)
-7 내지 +3 16 5.0±2.3 (86) 1.7±0.39 (67) 1.4±0.20 (67)
-1 내지 +3 16 6.1±2.8 (82) 2.2±0.61 (57) 1.6±0.41 (63)
-7 내지 0 16 6.7±1.7 (81) 2.3±0.52 (55) 1.7±0.59 (60)
-1, 0 16 13.1±2.6 (62) 4.5±0.50 (12) 4.0±0.88 (7)
표 각주: 1. N 값은 모든 약물 치료군에서 6; 2. N 값은 비히클 처리군에서 5; 3. 진균 로드 및 GM 수준에 대한 데이터는 비히클에 대한 평균 및 표준 편차의 평균 ± 표준 오차로 표시된다.
아스퍼질러스 푸미가투스 접종 후 심각한 면역손상된 호중구 감소증 마우스에서 국소 투여된 화합물 (I)의 처리와 경구 포사코나졸의 병용 생존율에 대한 영향을 평가하였다. 화합물 (I) (0.4 mg/mL, 비강 내 투여) 또는 포사코나졸 (1.0 mg/kg, 경구 투여) 단독 처리는 처리 효과가 제한적이었다. 대조적으로, 화합물 (I)과 포사코나졸의 조합은 감염 후 생존 시간에 현저한 증가를 보였다 (표 15).
아스퍼질러스 푸미가투스에 감염된 심하게 면역손상된 호중구 감소증 마우스에서 생존에 대한 단일 요법으로의 화합물 (I) 및 포사코나졸 또는 조합의 효과
처리 요법 용량 (루트) 7일째 생존자 수 (%) 중앙 생존(일) 생존을 위한 로그-랭크 테스트
(감염 대비)
비히클 없음 0/6 (0) 5 -
화합물 (I) 0.4 mg/mL (in) 0/6 (0) 6 p<0.05
포사코나졸 1 mg/kg, (po) 0/6 (0) 6.5 유의성 없음
화합물 (I) + 포사코나졸 0.4mg/mL (in)

1mg/kg (po)		 5/6 (83) 미정 p<0.001
표 각주: N = 8/그룹이다.
생체 내 약물동력학
이것은 동물의 폐 (예: 마우스)에 투여되는 폐, 치료제 및 투여된 화합물에 대한 결과적인 전신 노출을 특성화하기 위해 투약 후 다양한 시점에서 수집된 혈장에 일반적으로 사용되는 절차이다. 본 발명의 화합물은 이러한 생체 내 시스템에서 시험될 수 있다.
화합물 (I)의 생물학적 프로파일 요약
화합물 (I)은 아스퍼질러스 푸미가투스 플랑크톤 성장 및 기관지 상피 세포 감염의 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌다. 화합물 (I)은 또한 포사코나졸 내성 및 보리코나졸 내성 아스퍼질러스 푸미가투스 균주의 성장을 억제하였고, 포사코나졸보다 더 큰 효과를 나타내는, 이들 균주에 대한 보리코나졸 및 이트라코나졸을 포함한다. 또한 화합물 (I)은 칸디다 속 뿐 아니라 리조퍼스 오리재, 크립토코커스 네오포르만스, 카에토미움 글로보슘, 페니실리움 크리소게넘 및 트리코파이톤 루브 럼의 성장에 대한 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌다. 시험관 내 모델의 폐포에서, 화합물 (I)은 단일 요법으로서 및 포사코나졸과 병용 투여시 아스퍼질러스 침입에 대한 인상적인 활성을 나타냈다. 생체 내에서, 아스퍼질러스 푸미가투스 감염, 면역손상, 호중구 감소증 마우스, 화합물 (I)은 예방적으로 또는 치료로서 투여되는지 여부와 관계없이 아스퍼질러스 푸미가투스 감염의 강력한 억제 및 관련 폐 면역 반응을 나타냈다. 화합물 (I)은 또한 감염 의존성 체중 감소를 감소시키는데 매우 효과적이었다. 이러한 억제 효과는 포사코나졸보다 우수했다. 화합물 (I)의 유익한 항진균 효과가 예방 및 치료 환경 모두에서 관찰되는 것이 중요하다.
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명세서 및 청구범위 전체에서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, '포함하는' 이라는 표현 및 '포함하고 있는' 과 같은 변형은, 명시된 성분, 단계, 성분 그룹 또는 단계 그룹을 포함하지만 다른 성분, 단계, 성분 그룹 또는 단계 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.

Claims (24)

  1. 4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-트리아졸-1-일)메틸)-5-(2,4-디플루오로페닐)테트라하이드로퓨란-3-일)메톡시)-3-메틸페닐)피페라진-1-일)-N-(4-플루오로페닐)벤즈아미드인 하기 화합물 (I) 또는 약제학적으로 허용되는 그의 염:
    .
  2. 진균증의 치료 또는 진균증과 연관된 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 제1항에 따른 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    진균증이 아스퍼질러스 속의 종(Aspergillus spp.)에 의한 것인, 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    아스퍼질러스 속의 종이 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 또는 아스퍼질러스 플루란스(Aspergillus pullulans)인 것인, 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    아스퍼질러스 속의 종이 아스퍼질러스 푸미가투스인 것인, 약제학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    아스퍼질러스 속의 종이 아졸 저항성 아스퍼질러스 푸미가투스인 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제2항에 있어서,
    진균증이 칸디다 속의 종(Candida spp.), 리조퍼스 속의 종(Rhizopus spp.), 크립토코커스 속의 종(Cryptococcus spp.), 카에토미움 속의 종(Chaetomium spp.), 페니실리움 속의 종(Penicillium spp.), 또는 트리코파이톤 속의 종(Trichophyton spp.)에 의한 것인, 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    칸디다 속의 종이 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)이고, 리조퍼스 속의 종이 리조퍼스 오리재(Rhizopus oryzae)이고, 크립토코커스 속의 종이 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)이고, 카에토미움 속의 종이 카에토미움 글로보슘(Chaetomium globosum)이고, 페니실리움 속의 종이 페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum)이고, 트리코파이톤 속의 종이 트리코파이톤 루브럼(Trichophyton rubrum)인 것인, 약제학적 조성물.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 임의로 조합되는 것인, 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    제2 또는 추가의 활성 성분을 포함하는, 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    제2 또는 추가의 활성 성분이 항진균 의약, 암포테리신 B, 에키노칸딘 및 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-CoA 환원효소의 억제제 중에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    제2 또는 추가의 활성 성분이 칸디시딘, 필리핀, 하마이신, 나타마이신, 나이스타틴, 리모시딘, 비포나졸, 부토코나졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 펜티코나졸, 이소코나졸, 케토코나졸, 루리코나졸, 미코나졸, 오모코나졸, 옥시코나졸, 세르타코나졸, 술코나졸, 티오코나졸, 알바코나졸, 에피나코나졸, 에폭시코나졸, 플루코나졸, 이사부코나졸, 이트라코나졸, 프로피코나졸, 라부코나졸, 터코나졸, 아바펀진, 아모롤핀, 부테나핀, 나프티핀, 테르비나핀, 아니둘라펀진, 미카펀진, 벤조산, 시클로피록스, 플루시토신 (5-플루오로시토신), 그리세오풀빈, 톨나프테이트 및 운데실렌산 중에서 선택되거나; 또는
    제2 또는 추가의 활성 성분이 보리코나졸, 포사코나졸, 카스포펀진, 로바스타틴, 프라바스타틴, 또는 플루바스타틴 중에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  13. 하기 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 염; 또는

    하기 화학식 (IV)의 화합물 또는 그의 염; 또는

    (상기 식에서, Ra는 C1-5 알킬을 나타낸다.)
    하기 화학식 (V)의 화합물 또는 그의 염; 또는

    하기 화학식 (VII)의 화합물 또는 그의 염; 또는

    (상기 식에서, P는 tert-부틸옥시카보닐 (CO2 tBu) 기를 나타낸다.)
    하기 화학식 (XIII)의 화합물 또는 그의 염:
    .
  14. 하기 화학식 (VIII)의 화합물 또는 그의 염; 또는

    (상기 식에서, Ra는 C1-5알킬을 나타낸다.)
    하기 화학식 (XV)의 화합물 또는 그의 염:
    .
  15. 제1항에 따른 화합물 (I) 또는 그의 염의 제조방법으로서,
    화학식 (II)의 화합물; 또는 그의 산 할라이드 또는 산무수물; 또는 그의 염을 4-플루오로아닐린 또는 그의 염과 반응시키는 것; 또는

    화학식 (XV)의 화합물 또는 그의 염을 화학식 (IX)의 화합물 또는 그의 염과 반응시키는 것을 포함하는, 제조방법:


    (상기 식에서, Z는 이탈기를 나타낸다.).
  16. 화학식 (II)의 화합물 또는 그의 염의 제조방법으로서,

    화학식 (XIII)의 화합물 또는 그의 염을 화학식 (X)의 화합물 또는 그의 염과 반응시켜;


    (상기 식에서, Ra는 C1-5 알킬을 나타낸다.)
    화학식 (IV)의 화합물 또는 그의 염을 제공하고;

    (상기 식에서, Ra는 C1-5 알킬을 나타낸다.)
    이어서 알킬 에스테르를 가수분해하여 상기 화학식 (II)의 화합물을 제공하는 것을 포함하는, 제조방법.
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