JP2017536382A

JP2017536382A - 抗真菌化合物

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Publication number: JP2017536382A
Application number: JP2017528775A
Authority: JP
Inventors: 美裕須納瀬; クリストファーコーリートーマス; 一洋伊藤; ラペポートガース; ストロングピーター
Original assignee: プルモシデリミテド
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2015-12-04
Publication date: 2017-12-07
Anticipated expiration: 2035-12-04
Also published as: US20170037035A1; EA033736B1; US20190023697A1; CA2963625A1; SG11201702835RA; CN107001343A; WO2016087878A1; IL251631B; HK1244795A1; ES2786374T3; CN112375073A; HUE048685T2; PL3227277T3; EP3227278A1; AU2015356795A1; US20190276441A1; US10093659B2; US20200399253A1; US10450304B2; US20200031809A1

Abstract

本発明は、真菌症の治療において有用な本明細書に定義されている化合物、それを含む組成物、及び治療法におけるその使用に関する。【選択図】なし

Description

(発明の分野)
本発明は、真菌症の治療において有用な化合物、それを含む組成物、及び治療法におけるその使用に関する。

(発明の背景)
真菌感染症の発生は過去20年間で大幅に増加しており、侵襲性形態は、とりわけ、免疫不全又は免疫抑制患者における罹患及び死亡の主な原因である。播種性カンジダ症、肺アスペルギルス症、及び新興日和見真菌は、これらの重篤な真菌症を生じさせる最も一般的な因子である。真菌が、それらを結びつけ、かつそれらをそのインビトロ又はインビボ基質に接着させる細胞外マトリックス(ECM)を生成させることができることが真菌の特有の特徴である。これらのバイオフィルムは、真菌を宿主免疫系の好ましくない環境から保護し、抗微生物薬による殺傷に抵抗する役割を果たす(Kaur及びSinghの文献、2013)。

肺アスペルギルス症は、非侵襲性疾患に罹患している患者と侵襲性状態を有する患者に分けることができる。アスペルギルス症に対するアレルギー成分(ABPA;アレルギー性気管支肺アスペルギルス症として知られる)を示す患者をアスペルギルス症に対するアレルギー成分を示さない患者と比較して特徴付けるために、さらなる細区分が用いられる。肺アスペルギルス症を促進する因子は、高用量の免疫抑制薬への曝露又は集中治療室での挿管への曝露などの、急性のものであり得る。或いは、この因子は、過去のTBによる感染などの、慢性のものであり得る(Denningらの文献、2011a)。アスペルギルスによる慢性肺感染は、患者に広範かつ永続的な肺損傷を負わせ、経口アゾール薬による生涯にわたる治療を要求することがある(Limperらの文献、2011)。

相次ぐ研究により、アスペルギルス感染症が臨床的喘息において重要な役割を果たし得ることが示唆されている(Chishimbaらの文献、2012; Pasqualottoらの文献、2009)。さらに、最近発表された研究により、アスペルギルス感染症とCOPDの患者におけるより悪い臨床転帰とが関連付けられている(Bafadhelらの文献、2013)。同様に、横断的研究により、喀痰中のアスペルギルス属の種及びカンジダ属の種の存在と肺機能の悪化との関連が示されている(Chotirmallらの文献、2010; Agbetileらの文献、2012)。

侵襲性アスペルギルス症(IA)は、免疫不全患者、例えば、同種幹細胞移植又は固形臓器移植(例えば、肺移植)を受けている免疫不全患者で高い死亡率を示す。免疫不全患者で報告された最初のIAの症例は、1953年に発生した。この事象は、治療レジメンへのコルチコステロイド及び細胞傷害性化学療法の導入と重なっていた(Rankinの文献、1953)。侵襲性アスペルギルス症は、その高い発生率及び関連死亡率を考慮すると、白血病及び他の血液悪性腫瘍の治療における大きな関心事である。死亡率は、通常、50％を超え(Linらの文献、2001)、長期発生率(long term rates)は、経口トリアゾール薬が利用できるにもかかわらず、同種造血幹細胞移植レシピエントにおいて90％に達することがある(Salmeronらの文献、2012)。(特に肺の)固形臓器移植を受けている患者において、高用量のステロイドの使用は、患者を感染にかかりやすくし(Thompson及びPattersonの文献、2008)、これは、深刻な問題である。この疾患は、あまり重篤でない免疫不全患者集団でも見られる。これらには、原因となるCOPD又は肝硬変に罹患している者、高用量ステロイドを受けている患者、及び中心静脈カテーテルを装着されている人又は人工呼吸器によって維持されている人が含まれる(Dimopoulosらの文献、2012)。

既存の抗真菌薬は、主に、経口又は全身投与される。これらの一般的に利用される送達経路は、感染部位で達成される薬物濃度が器官における濃度よりも低い傾向があるため、肺気道感染の治療には弱い。これは、とりわけ、解毒部位(a site of toxicity)である肝臓について言え:ボリコナゾールで治療された患者の最大15％がトランスアミナーゼレベルの上昇に苦しむ(Levinらの文献、2007; Lat及びThompsonの文献、2011)。肝臓の曝露は、肝臓P450酵素の阻害に起因する顕著な薬物相互作用も生じさせる(Jeongらの文献、2009; Wexlerらの文献、2004)。

さらに、病院と農業の両方における、トリアゾールの広範な使用は、ますます増加する、問題のある耐性真菌症の発生をいくつかの場所でもたらしている(Denningらの文献、2011b; Bowyer及びDenningの文献、2014)。

改善された効力及びより良好な全身忍容性プロファイルをもたらす新規の抗真菌薬に対する喫緊の医学的ニーズが存在することは明々白々である。

(発明の概要)
第1の態様において、本発明は、4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)-N-(4-フルオロフェニル)ベンズアミドである化合物(I)及びその医薬として許容し得る塩(以後、「本発明の化合物」と呼ばれることもある)を提供する。

本明細書で以下に開示される生物学的データにより、本発明の化合物である化合物(I)が、インビトロアッセイにおいて、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)の成長の強力な阻害剤であることが明らかになっている。免疫抑制マウスにおいて、化合物(I)は、アスペルギルス・フミガーツス感染の強力な阻害を示した。化合物(I)の他の望ましい特性が本明細書に記載されている。

(図面の簡単な説明)
図1は、アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全の好中球減少症マウスの肺におけるCFUに対する化合物(I)による予防的及び治療的処置の効果を示している。図2は、アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全の好中球減少症マウスのBALF及び血清中のガラクトマンナン濃度に対する化合物(I)による予防的及び治療的処置の効果を示している。図3は、アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全の好中球減少症マウスのBALF及び血清中のガラクトマンナン濃度に対する化合物(I)による予防的及び治療的処置の効果を示している。図1〜3において、^***という記号は、P＜0.001の有意性を示す。

(発明の詳細な説明)
(スキーム1:経路1〜3による化合物(I)の調製)

市販の出発材料からの化合物(I)の生成のために開発されてきた3つの選択可能な収束経路が上に示されている(スキーム1)。これらの合成方法は、式(IV)の進んだ安息香酸エステル中間体が調製される様式が異なる。

(経路1)
好適に保護されたピペラジン誘導体(XII)と4-ブロモ-2-メチルフェノール(XIVa)との、そのような反応に一般に利用される条件下でのブッフバルトカップリングにより、モノN-アリール化ピペラジン(XI)が提供される。そのような変換のための好適な窒素保護基は、Boc基(P＝CO₂ ^tBu)を用いるウレタンとしてのものである。当業者は、この種の変換に影響を及ぼすために多種多様な条件を使用し得ることを理解しているであろう。特に、パラジウム触媒並びにRuPhosG3及びRuPhosなどのホスフィン配位子は、塩基、例えば、炭酸セシウム又はヘキサメチルジシラザンリチウムの存在下でルーチンに利用される。得られるフェノール(XI)の、塩基性条件下での、トシレート(IX)によるアルキル化により、エーテル(VII)が生成する。トシレート(IX)は、市販供給源から高いエナンチオマー純度で広く入手可能である立体配置的に安定な非揮発性(固体)試薬であるが;他の求電子性誘導体、例えば、対応するメシレート、並びにハロメチル(例えば、クロロメチル及びブロモメチル)誘導体は、この変換のための好適な代替物として期待される。窒素保護基の除去により、モノ-置換ピペラジン(V)が現れる。Boc誘導体(R^b＝CO₂ ^tBu)の場合、アミン脱保護工程は、通常、ニート又はDCMなどの溶媒の存在下のいずれかでの、強い鉱酸又はTFAなどの強い有機酸へのカルバメートの曝露により行われる。アミン(V)とアルキル 4-ブロモベンゾエート(VI)との塩基性条件下及び触媒の作用下での第2のブッフバルトカップリングにより、N,N'-ビスアリール化生成物(IV)(ここで、R^aは、低級アルキル、例えば、C_1-5アルキル、例えば、メチル又はエチル、或いはtert-ブチルを表す)が生じる。

(経路2)
安息香酸エステル中間体(IV)は、単一のパラジウム媒介カップリングのみが必要とされる代替プロセスで得ることができる。ブロモフェノール(XIVa)とモノN-アリール化ピペラジン誘導体[(X)、R^a＝低級アルキル、例えば、C_1-5アルキル、例えば、メチル又はエチル、或いはtert-ブチル]との、標準的なブッフバルトカップリング条件下での反応により、1,4-ビスアリールピペラジン(VIII)が生じる。上記のような、トシレート(IX)による、このフェノール性生成物のO-アルキル化により、市販の出発材料から、2工程で、エーテル生成物(IV)が直接提供される。

(経路3)
場合によっては、プロセスの全効率及び/又はそこから得られる材料の品質を向上させるために、同じ又は同様の合成変換を異なる順序で実施することが有利であることが上で概説されている調製経路(スキーム1)から理解されるであろう。例えば、ブロモフェノール(XIVa)を、上で概説されている2工程を逆の順序で実施することにより、式(IV)の化合物に変換することができる。この方法で、トシレート(IX)による該フェノールの処理により、式(XIII)のエーテル誘導体が提供される。この臭化アリール基質を、先に記載されているようなブッフバルトカップリング条件下で、式(X)のN-アリールピペラジンと反応させて、式(IV)の中間体を提供することができる。

(中間体(IV)からの化合物(I)の調製)
場合によっては、例えば、R^aが、メチル又はエチルである場合、遊離安息香酸(II)の生成は、水の存在下での塩基によるエステル(IV)の処理により、好都合に行われる。典型的な条件としては、水と好適な水混和性溶媒の混合物中での、水酸化リチウムなどの水酸化アルカリ金属による処理が挙げられる。他の例では、tert-ブチルエステルの場合と同様、酸性条件下で加水分解工程を実施することが有利である場合がある。そのような相互変換のための一般的な試薬としては、水混和性の有機溶媒、例えば、IPAの存在下の、強い無機酸、例えば、塩酸が挙げられる。

当技術分野で広く利用される、標準的なアミドカップリング条件下での4-フルオロアニリンによる安息香酸生成物(II)の処理により、本発明の化合物である化合物(I)が提供される。例えば、該反応は、酸(II)及び4-フルオロアニリンを、DMFなどの極性非プロトン性溶媒中、非求核性有機塩基、典型的には、DIPEAなどの存在下で、カップリング剤HOBt及びEDCIと混合することにより行われる。

(スキーム2:経路4による化合物(I)の調製)

(経路4)
本発明の化合物は、本明細書に記載の調製技術のまた別のバリエーション(スキーム2)を用いて組み立てることもできる。この代替プロセス(経路4)では、第1工程として、アミド結合形成が行われ、エーテル結合の生成が最終的な合成変換を構成する。4-ブロモベンゾイルクロリド(XX)による4-フルオロアニリン(III)のアシル化により、アニリド断片(XIX)が提供される。既に述べたように、そのようなアミド生成物は、その幅広い選択肢が当技術分野で利用可能である、ペプチドカップリング試薬を含む種々の活性化剤を用いて、対応するアミン及び安息香酸から直接調製することができる。臭化アリール生成物を、触媒の作用下、上に記録された方法で、好適なモノ保護ピペラジン(XII)を用いるブッフバルトカップリング条件に供すると、式(XVIII)の中間体が生じる。Boc保護基[P＝CO₂ ^tBu]の場合、所望のN-アリールピペラジン(XVII)は、減圧下での蒸発によって後に反応媒体から好都合に除去される、例えば、TFAでの処理による、強酸への短時間の曝露によって容易に得られる。その後、化合物(I)のフェノール性前駆体[(XV); R^c＝H]を、ブロモ-アニソール(XIVb)との第2のブッフバルトカップリングから2工程で誘導して、メチルエーテル中間体[(XVI) R^c＝Me]を生じさせ、その後、三臭化ホウ素でO-脱アルキル化した。その後、フェノール(XV)を、先に記載した方法で、トシレート試薬(IX)による再アルキル化により、化合物(I)に変換した。

保護基及びその除去手段は、「有機合成における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)」、Theodora W. Greene及びPeter G. M. Wuts著、John Wiley & Sons社刊;第4版、2006, ISBN-10: 0471697540に記載されている。アミドの調製方法の総説は:「アミド結合形成及びペプチドカップリング(Amide bond formation and peptide coupling)」、Montalbetti, C.A.G.N.及びFalque, V.の文献、Tetrahedron, 2005, 61, 10827-10852で取り上げられている。

したがって、本発明は、化合物(I)又はその医薬として許容し得る塩を調製する方法であって、式(II)の化合物:又はその活性化誘導体(例えば、酸ハロゲン化物、例えば、酸塩化物もしくは酸無水物);或いはその塩

(式中:
R^aは水素を表す)
を;式(III)の化合物:又はその塩

と反応させることを含む、方法も提供する。

本発明は、化合物(I)又はその医薬として許容し得る塩を調製する方法であって、式(XV)の化合物:又はその塩

を;式(IX)の化合物:又はその塩

(式中:
Zは、脱離基、例えば、p-トリルSO₂Oを表す)
と反応させることを含む、方法も提供する。

式(I)の化合物の医薬として許容し得る塩には、特に、該化合物の医薬として許容し得る酸付加塩が含まれる。式(I)の化合物の医薬として許容し得る酸付加塩は、式(I)の化合物が形成することができる治療的に活性のある無毒な酸付加塩を含むことが意図される。これらの医薬として許容し得る酸付加塩は、遊離塩基形態を、好適な溶媒又は溶媒混合物中にて、そのような適当な酸で処理することによって好都合に得ることができる。適当な酸は、例えば、無機酸、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば、塩酸もしくは臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など;又は有機酸、例えば、酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、p-アミノサリチル酸、パモン酸などを含む。

逆に、該塩形態を、適当な塩基での処理によって、遊離塩基形態に変換することができる。

式(I)の化合物の定義は、該化合物の全ての互変異性体を含むことが意図される。

式(I)の化合物の定義は、文脈により別途具体的に示されない限り、該化合物の全ての溶媒和物(該化合物の塩の溶媒和物を含む)を含むことが意図される。溶媒和物の例としては、水和物が挙げられる。

本開示の化合物には、指定された1以上の原子が天然又は非天然の同位体である実施態様が含まれる。一実施態様において、該同位体は、安定同位体である。したがって、本開示の化合物には、例えば、重水素含有化合物などが含まれる。

本開示は、本明細書で定義される化合物の全ての多形形態にも及ぶ。

本明細書に記載されるような、式(II)、(IV)、(V)、(VII)、(VIII)、(XIII)、及び(XV)の化合物の新規の中間体並びにこれらの塩は、本発明のさらなる態様を形成する。塩には、医薬として許容し得る塩(例えば、上記の塩)及び医薬として許容し得ない塩が含まれる。酸(例えば、カルボン酸)の塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、及びカルシウム塩を含む第1族及び第2族金属塩が挙げられる。

一実施態様において、本発明の化合物を、任意に1以上の医薬として許容し得る希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物が提供される。

本発明の化合物は、肺又は鼻に局所的に、特に、肺に局所的に投与されることが好適である。したがって、一実施態様において、本発明の化合物を、任意に1以上の局所に許容される希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物が提供される。

肺又は鼻腔内投与用の好適な組成物は、粉末、液体溶液、液体懸濁液、溶液もしくは懸濁液を含む点鼻剤、又は加圧もしくは非加圧エアロゾルを含む。

該組成物は、単位剤形で好都合に投与することができ、例えば、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第17版、Mack Publishing Company, Easton, PA.,(1985)に記載されているような、医薬分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。該組成物は、複数単位剤形で好都合に投与することもできる。

鼻又は肺への局所投与は、水性溶液又は懸濁液などの非加圧製剤の使用によって達成することができる。そのような製剤は、ネブライザー、例えば、手持ち式及び携帯式であり得るネブライザー又は家庭もしくは病院で使用するための(すなわち、非携帯式の)ネブライザーによって投与することができる。装置例は、RESPIMAT吸入器である。該製剤は、水、緩衝剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、粘性調節剤、界面活性剤、及び共溶媒(例えば、エタノール)などの賦形剤を含むことができる。懸濁液及びエアロゾル製剤(加圧式又は非加圧式を問わない)は、通常、微細に分割された形態の、例えば、0.5〜10μm、例えば、約1〜5μmのD₅₀を有する、本発明の化合物を含む。粒径分布は、D₁₀、D₅₀、及びD₉₀値を用いて表すことができる。粒径分布のD₅₀中央値は、分布を二分するミクロン単位の粒径と定義される。レーザー回折から得られる測定は、体積分布と記載される方が正確であり、したがって、この手順を用いて得られるD₅₀値は、Dv₅₀値(体積分布の中央値)と呼ばれる方が意味が通る。本明細書で使用されるように、Dv値は、レーザー回折を用いて測定される粒径分布を指す。同様に、レーザー回折との関連で使用されるD₁₀及びD₉₀値は、Dv₁₀及びDv₉₀値を意味するものと理解され、それぞれ、分布の10％がD₁₀値よりも下に位置し、分布の90％がD₉₀値よりも下に位置する粒径を指す。

本発明の具体的な一態様によれば、水性媒体に懸濁した微粒子形態の本発明の化合物を含む医薬組成物が提供される。水性媒体は、通常、水並びに緩衝剤、浸透圧調整剤、pH調整剤、粘性調節剤、及び界面活性剤から選択される1以上の賦形剤を含む。

鼻又は肺への局所投与は、エアロゾル製剤の使用によって達成することもできる。エアロゾル製剤は、通常、好適なエアロゾル噴射剤、例えば、クロロフルオロカーボン(CFC)又はハイドロフルオロカーボン(HFC)に懸濁又は溶解した活性成分を含む。好適なCFC噴射剤としては、トリクロロモノフルオロメタン(噴射剤11)、ジクロロテトラフルオロメタン(噴射剤114)、及びジクロロジフルオロメタン(噴射剤12)が挙げられる。好適なHFC噴射剤としては、テトラフルオロエタン(HFC-134a)及びヘプタフルオロプロパン(HFC-227)が挙げられる。噴射剤は、通常、全吸入組成物の40重量％〜99.5重量％、例えば、40重量％〜90重量％を含む。該製剤は、共溶媒(例えば、エタノール)及び界面活性剤(例えば、レシチン、トリオレイン酸ソルビタンなど)を含む、賦形剤を含むことができる。他の可能な賦形剤としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、グリセリンなどが挙げられる。エアロゾル製剤はキャニスターに包装され、好適な用量は(例えば、Bespak、Valois、又は3Mによるか、或いはAptar、Coster、又はVariによって供給されるような)定量バルブによって送達される。

肺への局所投与は、乾燥粉末製剤の使用によって達成することもできる。乾燥粉末製剤は、微細に分割された形態の、通常、1〜10μmのMMD又は0.5〜10μm、例えば、約1〜5μmのD₅₀を有する、本開示の化合物を含む。微細に分割された形態の本発明の化合物の粉末は、微粒子化プロセス又は同様のサイズ低下プロセスによって調製することができる。微粒子化は、ジェットミル、例えば、Hosokawa Alpineによって製造されているものを用いて実施することができる。得られる粒径分布は、(例えば、Malvern Mastersizer 2000S機器による)レーザー回折を用いて測定することができる。該製剤は、通常、局所で許容される希釈剤、例えば、通常、比較的大きい粒径、例えば、50μm以上、例えば、100μm以上のMMD又は40〜150μmのD₅₀の、ラクトース、グルコース、又はマンニトール(好ましくは、ラクトース)を含む。本明細書で使用されるように、「ラクトース」という用語は、α-ラクトース一水和物、β-ラクトース一水和物、α-ラクトース無水物、β-ラクトース無水物、及び非晶質ラクトースを含む、ラクトース含有成分を指す。ラクトース成分は、微粒子化、篩別、ミリング、圧縮、凝集、又はスプレー乾燥によって処理することができる。様々な形態の市販型のラクトースも包含され、これには、例えば、Lactohale(登録商標)(吸入等級ラクトース; DFE Pharma)、InhaLac(登録商標)70(乾燥粉末吸入器用の篩別ラクトース; Meggle)、Pharmatose(登録商標)(DFE Pharma)、及びRespitose(登録商標)(篩別吸入等級ラクトース; DFE Pharma)製品がある。一実施態様において、該ラクトース成分は、α-ラクトース一水和物、α-ラクトース無水物、及び非晶質ラクトースからなる群から選択される。好ましくは、該ラクトースはα-ラクトース一水和物である。

乾燥粉末製剤は、他の賦形剤、例えば、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、又はステアリン酸マグネシウムも含み得る。

乾燥粉末製剤は、通常、乾燥粉末吸入器(DPI)装置を用いて送達される。例となる乾燥粉末送達系としては、SPINHALER、DISKHALER、TURBOHALER、DISKUS、SKYEHALER、ACCUHALER、及びCLICKHALERが挙げられる。乾燥粉末送達系のさらなる例としては、ECLIPSE、NEXT、ROTAHALER、HANDIHALER、AEROLISER、CYCLOHALER、BREEZHALER/NEOHALER、MONODOSE、FLOWCAPS、TWINCAPS、X-CAPS、TURBOSPIN、ELPENHALER、MIATHALER、TWISTHALER、NOVOLIZER、PRESSAIR、ELLIPTA、ORIEL乾燥粉末吸入器、MICRODOSE、PULVINAL、EASYHALER、ULTRAHALER、TAIFUN、PULMOJET、OMNIHALER、GYROHALER、TAPER、CONIX、XCELOVAIR、及びPROHALERが挙げられる。

本発明の化合物は、別の内部もしくは外部表面(例えば、粘膜表面もしくは皮膚)に局所投与することも、又は経口投与することもできる。本発明の化合物は、そのような投与経路用に好都合に製剤化することができる。

本発明の化合物は、真菌症の治療において及び真菌症と関連する疾患の予防又は治療のために有用である。

本発明の一態様において、真菌症の治療ための及び真菌症と関連する疾患の予防又は治療のための薬剤の製造における本発明の化合物の使用が提供される。

本発明の別の態様において、真菌症を有する対象の治療方法であって、該対象に、本発明の化合物の有効量を投与することを含む、方法が提供される。

本発明の別の態様において、対象における真菌症と関連する疾患の予防又は治療方法であって、該対象に、本発明の化合物の有効量を投与することを含む、方法が提供される。

真菌症は、特に、アスペルギルス属の種、例えば、アスペルギルス・フミガーツス又はアスペルギルス・プルランス(Aspergillus pullulans)、とりわけ、アスペルギルス・フミガーツスによって引き起こされ得る。真菌症は、カンジダ属の種、例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)又はカンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、リゾプス属の種、例えば、リゾプス・オリゼ(Rhizopus oryzae)、クリプトコックス属の種、例えば、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ケトミウム属の種、例えば、ケトミウム・グロボスム(Chaetomium globosum)、ペニシリウム属の種、例えば、ペニシリウム・クリソゲヌム(Penicillium chrysogenum)、及びトリコフィトン属の種、例えば、紅色白癬菌(Trichophyton rubrum)によっても引き起こされ得る。

真菌症と関連する疾患は、例えば、肺アスペルギルス症である。

本発明の化合物は、該化合物を真菌症の発症前に投与することにより、予防的状況で使用することができる。

対象には、ヒト及び動物対象、とりわけ、ヒト対象が含まれる。

本発明の化合物は、とりわけ、真菌症、例えば、アスペルギルス・フミガーツス感染症の治療に、及びリスクのある対象における真菌症、例えば、アスペルギルス・フミガーツス感染症と関連する疾患の予防又は治療に有用である。リスクのある対象には、早産児、肺又は心臓の先天性欠陥を有する子供、免疫不全対象(例えば、HIV感染に罹患している対象)、喘息患者、嚢胞性線維症を有する対象、高齢対象、及び心臓又は肺に影響を及ぼす慢性的な健康障害(例えば、鬱血性心不全又は慢性閉塞性肺疾患)に罹患している対象が含まれる。

本発明の化合物は、特にポサコナゾールと組み合わせた、アゾール耐性真菌症、例えば、アゾール耐性アスペルギルス・フミガーツス感染症の治療にも有用である。

本発明の化合物は、第2の又はさらなる活性成分と組み合わせて投与することができる。第2の又はさらなる活性成分は、例えば、他の抗真菌剤(例えば、ボリコナゾール又はポサコナゾール)、アムホテリシンB、エキノカンジン(例えば、カスポファンギン)、及び3-ヒドロキシ-3-メチル-グルタリル-CoAレダクターゼの阻害剤(例えば、ロバスタチン、プラバスタチン、又はフルバスタチン)から選択することができる。

第2の又はさらなる活性成分には、真菌症、例えば、アスペルギルス・フミガーツス感染症又は真菌症、例えば、アスペルギルス・フミガーツス感染症と関連する疾患又は真菌症、例えば、アスペルギルス・フミガーツス感染症と併発する状態の治療又は予防に好適な活性成分が含まれる。

本発明の化合物は、第2のもしくはさらなる活性成分と共製剤化することができ、又は第2の又はさらなる活性成分は、同じもしくは異なる経路で別々に投与されるように製剤化することができる。

例えば、本発明の化合物は、ボリコナゾール又はポサコナゾールなどの抗真菌薬による全身治療を既に受けている患者に投与することができる。

例えば、本発明の化合物は、アムホテリシンB、エキノカンジン、例えば、カスポファンギン、及び3-ヒドロキシ-3-メチル-グルタリル-CoAレダクターゼの阻害剤、例えば、ロバスタチン、プラバスタチン、又はフルバスタチンから選択される1以上の薬剤と共投与する、例えば、共製剤化することができる。

本発明の化合物は、その代わりに(又はさらに)、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン、ナタマイシン、ナイスタチン、リモシジン、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、アバファンギン、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン、アニデュラファンギン、ミカファンギン、安息香酸、シクロピロックス、フルシトシン(5-フルオロシトシン)、グリセオフルビン、トルナフテート、及びウンデシレン酸から選択される1以上の薬剤と共投与する、例えば、共製剤化することができる。

好ましい組合せパートナーとしては、イントラコナゾール、ボリコナゾール、カスポファンギン、及びポサコナゾールが挙げられる。

本発明の一態様によれば、(a)本発明の化合物を、任意に1以上の希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物;(b)第2の活性成分を、任意に1以上の希釈剤又は担体と組み合わせて含む、医薬組成物;(c)任意に、各々第3の又はさらなる活性成分を、任意に1以上の希釈剤又は担体と組み合わせて含む、1以上のさらなる医薬組成物;及び(d)それを必要とする対象への該医薬組成物の投与のための指示書を含むパーツのキットが提供される。それを必要とする対象は、真菌症、例えば、アスペルギルス・フミガーツス感染症に罹患するか又はそれに罹患しやすい可能性がある。

本発明の化合物は、好適な間隔で、例えば、1日に1回、1日に2回、1日に3回、又は1日に4回、投与することができる。

平均体重(50〜70kg)のヒトに対する好適な投与量は、約50μg〜10mg/日、例えば、500μg〜5mg/日であると考えられるが、投与されるべき正確な用量は、当業者により決定されることができる。

本発明の化合物は、以下の有利な属性のうちの1つ又は複数を有すると考えられる:
・とりわけ、肺又は鼻への局所投与後の、強力な抗真菌活性、特に、アスペルギルス属の種、例えば、アスペルギルス・フミガーツスに対する活性、又はカンジダ属の種、例えば、カンジダ・アルビカンス又はカンジダ・グラブラータ、リゾプス属の種、例えば、リゾプス・オリゼ、クリプトコックス属の種、例えば、クリプトコックス・ネオフォルマンス、ケトミウム属の種、例えば、ケトミウム・グロボスム、ペニシリウム属の種、例えば、ペニシリウム・クリソゲヌム、又はトリコフィトン属の種、例えば、紅色白癬菌に対する活性;
・好ましくは、1日1回の投与と合致する、肺での長い作用持続時間;
・肺又は鼻への局所投与後の低い全身曝露;及び
・とりわけ、肺又は鼻への局所投与後の、許容される安全性プロファイル。

(実験の節)
本明細書で使用される略語を以下に定義する(表1)。定義されていない略語はいずれも、その一般的に認められている意味を伝えることが意図される。
表1:略語

(一般的手順)
出発材料及び溶媒は全て、商業的供給源から得られたか、又は文献引用に従って調製されたかのいずれかであった。別途明記されない限り、反応液は全て撹拌した。有機溶液は、ルーチンに無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。

(分析法)
(逆相HPLC法:)
Waters Xselect CSH C18 XPカラム、2.5μm(4.6×30mm)、40℃;流量2.5〜4.5mL 分^-1、0.1％v/vギ酸(方法a)又は水中の10mM NH₄HCO₃(方法b)のいずれかを含むH₂O-MeCN勾配で4分かけて溶出させ、254nmでのUV検出を利用する。勾配情報: 0〜3.00分、95％H₂O-5％MeCNから5％H₂O-95％MeCNに上昇させる; 3.00〜3.01分、5％H₂O-95％MeCNで保持し、流量を4.5mL 分^-1に増大させる; 3.01〜3.50分、5％H₂O-95％MeCNで保持する; 3.50〜3.60分、95％H₂O-5％MeCNに戻し、流量を3.50mL 分^-1に減少させる; 3.60〜3.90分、95％H₂O-5％MeCNで保持する; 3.90〜4.00分、95％H₂O-5％MeCNで保持し、流量を2.5mL 分^-1に減少させる。

(¹H NMR分光法:)
¹H NMRスペクトルは、残存する非重水素化溶媒を参照として用いて、400MHzで、Bruker Advance IIIスペクトロメーターで獲得し、別途指定されない限り、DMSO-d₆中で泳動させた。

(化合物(I)の調製のための合成方法)
(tert-ブチル 4-(4-ヒドロキシ-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-カルボキシレート)

tert-ブチルピペラジン-1-カルボキシレート(XIIa)(7.44g、40.0mmol)、4-ブロモ-2-メチルフェノール(6.23g、33.3mmol)、RuPhos(311mg、0.67mmol)、及びRuPhos G3(557mg、0.67mmol)を仕込んだフラスコから空気を排出し、窒素を3回再充填した。LiHMDSの溶液(THF中1M、100mL、100mmol)を添加し、反応混合物を70℃で3時間加熱した。RTに冷却した後、該混合物を1M塩酸(100mL)の添加によりクエンチし、その後、1M水性NaHCO₃(100mL)で中性化した。水層をEtOAc(3×100mL)で抽出し、合わせた有機抽出物を乾燥させた。揮発性物質を真空中で除去すると、粗生成物が得られ、これを、フラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO₂、120g、イソヘキサン中0〜100％EtOAc、勾配溶出)により精製すると、表題化合物の中間体(XIa)が薄茶色の固体(7.80g、78％)として得られた; R^t 2.07分(方法b); m/z 293(M+H)⁺(ES⁺);

(1-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン)

中間体(XIa)(7.80g、25.1mmol)のDMSO(60mL)溶液に、水性水酸化ナトリウム(3.0mL、12.5M、37.6mmol)を添加した。混合物をRTで10分間撹拌し、その後、((3S,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メチル 4-メチルベンゼンスルホネート(IX)(APIChem製、カタログ番号: AC-8330、12.4g、27.6mmol)で少しずつ処理した。反応混合物を30℃で18時間撹拌し、RTに冷却し、水(200mL)を添加した。得られた混合物をEtOAc(3×200mL)で抽出し、合わせた有機抽出物をブライン(2×200mL)で洗浄し、その後、乾燥させ、真空中で蒸発させると、茶色の油状物が得られた。¹H NMRによる粗Boc保護生成物(VIIa)の分析により、該生成物が排出副生成物として形成された、〜10％のアルケン:(R)-1-((2-(2,4-ジフルオロフェニル)-4-メチレンテトラヒドロフラン-2-イル)メチル)-1H-1,2,4-トリアゾールを含むことが示された。粗ウレタン(VIIa)をDCM(150mL)中に取り、TFA(39.0mL、502mmol)で処理した。RTで2時間後、反応混合物を真空中で濃縮して、揮発性物質の大部分を除去し、その後、EtOAc(200mL)で希釈し、水性NaOH(2M、200mL)で洗浄した。水相を分離し、EtOAc(2×200mL)で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン(2×200mL)で洗浄し、その後、乾燥させ、真空中で蒸発させると、薄茶色の油状物が得られた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO₂、80g、DCM中0〜10％の0.7M NH₃/MeOH、勾配溶出)により精製すると、表題化合物の中間体(V)が粘性のある薄茶色の油状物(9.46g、80％)として得られた; R^t 1.91分(方法b); m/z 470(M+H)⁺(ES⁺);

(メチル 4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)ベンゾエート)

中間体(V)(9.00g、19.2mmol)、メチル-4-ブロモベンゾエート(VIa)(4.95g、23.0mmol)、RuPhos(0.18g、0.38mmol、2mol％)、RuPhosG3(0.32g、0.38mmol、2mol％)、及び炭酸セシウム(9.99g、30.7mmol)を仕込んだフラスコから空気を排出し、窒素を3回再充填した後、DMF(150mL)を添加した。混合物を80℃で22時間加熱し、その後、まだ熱いうちに、水(150mL)に注ぎ入れると、茶色のゴム状物質が形成した。さらなる水(300mL)を添加し、水相をDCM(2×200mL)で抽出した。有機抽出物を合わせ、真空中で濃縮すると、茶色の油状物が得られ、これを水(100mL)に注ぎ入れた。得られた沈殿物を濾過により回収し、その後、THF(100mL)に再懸濁させた。混合物を還流状態で1時間加熱し、その間に、クリーム色の懸濁液が形成された。混合物をRTに冷却し、得られた沈殿物を濾過により回収し、THF(2×50mL)で洗浄し、その後、真空中で乾燥させると、表題化合物の中間体(IVa)が薄黄色の固体(9.48g、79％)として得られた; R^t 2.79分(方法b); m/z 604(M+H)⁺(ES⁺);

(エチル 4-(4-(4-ヒドロキシ-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)ベンゾエート)

エチル 4-(ピペラジン-1-イル)ベンゾエート(Xa)(20.0g、85.0mmol)及び4-ブロモ-2-メチルフェノール(19.2g、102mmol)のDMF(213mL)溶液を仕込んだフラスコから空気を排出し、窒素を3回再充填した。RuPhos G3(1.43g、1.71mmol)を添加し、フラスコから空気を排出し、窒素を再充填した。反応混合物を0℃に冷却し、LiHMDS(17.1g、102mmol)を添加した。反応液をRTで10分間撹拌し、その後、水浴中で冷却し、LiHMDS(20.0g、120mmol)を同じ分量(7×2.85g)で5分間の間隔で添加した。得られた溶液をRTで30分間撹拌し、その後、0℃に冷却し、2M塩酸(200mL)で処理して、6〜7のpHとした。混合物をRTで15分間撹拌し、その後、EtOAc(220mL)で抽出した。水層を分離し、EtOAc(4×50mL)で抽出し、合わせた有機物をブライン(6×50mL)で洗浄し、その後、乾燥させ、真空中で蒸発させると、クリーム色の固体が得られた。イソヘキサンとIPA(1:1、150mL)の混合物を添加し、懸濁液をRTで30分間撹拌した。固体を濾過により回収し、フィルターケーキをイソヘキサンとIPA(1:1、2×10mL)の混合物、次いで、イソヘキサン(4×10mL)で洗浄し、真空中、40℃で18時間で乾燥させると、表題化合物の中間体(VIIIa)がクリーム色の固体(15.3g、50％)として得られた; R^t 2.29分(方法b); m/z 341(M+H)⁺(ES⁺);

(エチル 4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)ベンゾエート)

0℃に冷却した中間体(VIIIa)(15.3g、44.9mmol)のDMF(110mL)溶液に、ナトリウムエトキシド(3.13g、46.1mmol)を添加し、混合物を0℃で10分間撹拌し、その後、トシレート(IX)(20.2g、44.9mmol)で処理した。反応混合物をRTに温めておき、50℃に1時間加熱し、その後、RTに冷却した。塩酸(1M、60mL)及び水(200mL)を添加し、混合物をRTで30分間撹拌し、その後、DCM(150mL)で抽出した。水層を分離し、DCM(2×50mL)で抽出し、合わせた有機物をブライン(4×30mL)で洗浄し、その後、乾燥させ、真空中で蒸発させると、クリーム色の固体が得られた。この固体をイソヘキサンとIPA(80mL)の等量混合物に懸濁させ、RTで1時間撹拌した。固体を濾過により回収し、イソ-ヘキサンとIPA(3×20mL)の1:1の混合物で洗浄し、その後、真空中、40℃で18時間乾燥させると、表題化合物の中間体(IVb)が白色の固体(16.4g、56％)として得られた; R^t 2.92分(方法b); m/z 618(M+H)⁺(ES⁺);

(1-(((2R,4R)-4-((4-ブロモ-2-メチルフェノキシ)メチル)-2-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル)-1H-1,2,4-トリアゾール)

4-ブロモ-2-メチルフェノール(920mg、4.89mmol)のDMSO(10mL)溶液に、水性水酸化ナトリウム(0.39mL、12.5M、4.89mmol)を添加し、混合物をRTで10分間撹拌し、その後、トシレート(IX)(2.00g、4.45mmol)で処理した。反応混合物を60℃で72時間撹拌し、その後、RTに冷却し、水(25mL)とEtOAc(20mL)に分配した。有機相を分離し、保持し、水層をEtOAc(3×25mL)で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン(3×15mL)で洗浄し、その後、乾燥させ、真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO₂、12g、DCM中0〜30％EtOAc、勾配溶出)により精製すると、表題化合物の中間体(XIII)が無色の油状物(1.84g、86％)として得られた; R^t 2.78分(方法a); m/z 464(M+H)⁺(ES⁺);

エチル 4-(ピペラジン-1-イル)ベンゾエート(X)(103mg、0.44mmol)、中間体(XIII)(170mg、0.37mmol)、RuPhos(8.5mg、18μmol)、RuPhos G3(14.2mg、18μmol)、及び炭酸セシウム(191mg、0.59mmol)を仕込んだバイアルから空気を排出し、窒素を3回再充填した後、DMF(3.0mL)を添加した。混合物を80℃で18時間、その後、100℃で24時間加熱した。反応混合物をRTに冷却し、水(10mL)とEtOAc(10mL)に分配した。有機相を分離し、保持し、水層をEtOAc(3×10mL)で抽出した。合わせた有機物をブライン(3×10mL)で洗浄し、その後、乾燥させ、真空中で蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO₂、12g、イソヘキサン中0〜100％EtOAc、勾配溶出)により精製すると、表題化合物の中間体(IVb)が白色の固体(100mg、43％)として得られた。

(4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)安息香酸)
(メチルエステル(IVa)の加水分解)

中間体(IVa)(9.00g、14.9mmol)のDMSO(370mL)懸濁液に、水酸化リチウム(1.79g、74.5mmol)の水(37.0mL)溶液を添加した。混合物を70℃で22時間加熱し、その後、RTに冷却し、水(1000mL)で希釈し、1M水性塩酸(80mL)の添加により、(〜pH 2に)酸性化した。混合物を氷浴中で2時間冷却し、得られた沈殿物を濾過により回収した。フィルターケーキを水(3×80mL)で洗浄し、真空中、50℃で乾燥させると、表題化合物の中間体(II)が白色の固体(4.66g、54％)として得られた; R^t 2.21分(方法1a); m/z 590(M+H)⁺(ES⁺);

(エチルエステル(IVb)の加水分解)
中間体(IVb)(16.4g、26.6mmol)のDMSO(375mL)懸濁液に、水酸化リチウム(3.18g、74.5mmol)の水(50mL)溶液を添加した。混合物を70℃で22時間加熱し、その後、RTに冷却し、水(500mL)に注ぎ入れ、2M塩酸(70mL)の添加により、(〜pH 5〜6に)酸性化した。混合物をRTで30分間撹拌し、得られた固体を濾過により回収し、水(2×20mL)及びジエチルエーテル(3×30mL)で洗浄し、その後、真空中、40℃で18時間乾燥させると、表題化合物の中間体(II)が褐色の固体(14.2g、84％)として得られた; R^t 2.26分(方法1a); m/z 590(M+H)⁺(ES⁺);

(4-ブロモ-N-(4-フルオロフェニル)ベンズアミド)

4-フルオロアニリン(III)(0.85mL、9.00mmol)、トリエチルアミン(1.88mL、13.5mmol)、及びDMAP(0.11g、0.90mmol)のTHF(15mL)溶液に、4-ブロモベンゾイルクロリド(XX)(2.37g、10.8mmol)を添加した。反応混合物をRTで1時間保持し、その後、EtOAc(100mL)と1M塩酸(100mL)に分配した。有機相を分離し、1M塩酸(100mL)、飽和水性NaHCO₃(100mL)、及びブライン(100mL)で順次洗浄し、その後、乾燥させ、真空中で蒸発させた。粗残渣を温かいDCM(100mL)から粉砕し、混合物を還流状態で加熱すると、白色の懸濁液が得られ、これをRTに冷却させておいた。得られた沈殿物を濾過により回収すると、表題化合物の中間体(XIX)が白色の固体(1.81g、65％)として得られた; R^t 2.23分; m/z 294/296(M+H)⁺(ES⁺);

(tert-ブチル 4-(4-((4-フルオロフェニル)カルバモイル)フェニル)ピペラジン-1-カルボキシレート)

tert-ブチルピペラジン-1-カルボキシレート(XII)(4.00g、215mmol)、中間体(XIX)(6.63g、22.6mmol)、RuPhos(100mg、0.215mmol)、及びRuPhos G3(180mg、0.215mmol)を仕込んだフラスコから空気を排出し、窒素を3回再充填した。LiHMDS(THF中1M、75.0mL、75.0mmol)の溶液を添加し、反応混合物を70℃で5時間加熱した。RTに冷却した後、該混合物をEtOAc(150mL)と1M塩酸(150mL)に分配した。有機相を分離し、保持し、水相をEtOAc(3×150mL)で抽出した。合わせた有機物を乾燥させ、真空中で濃縮すると、茶色の固体が得られ、これをイソヘキサンとジエチルエーテル(1:1、100mL)の混合物中で粉砕した。そのようにして得られた生成物を濾過により回収し、イソヘキサンとジエチルエーテル(1:1、25mL)の混合物で洗浄し、その後、真空中、40℃で乾燥させると、表題化合物の中間体(XVIII)が褐色の固体(6.44g、85％)として得られた; R^t 2.40分(方法a); m/z 400(M+H)⁺;

(N-(4-フルオロフェニル)-4-(ピペラジン-1-イル)ベンズアミド)

中間体(XVIII)(6.44g、16.1mmol)のDCM(200mL)溶液に、TFA(24.7mL、322mmol)を添加した。反応液をRTで2時間撹拌し、その後、真空中で蒸発させた。トルエン(5.0mL)を添加し、混合物を真空中で再蒸発させた。得られた油状物をDCM(90mL)とメタノール(10mL)の混合物中に取り、その後、水(50mL)と飽和水性NaHCO₃(50mL)の混合物で抽出した。有機相を分離し、保持し、水層をDCMとメタノール(9:1、3×100mL)の混合物で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ、真空中で濃縮すると、表題化合物の中間体(XVII)が茶色の固体(3.74g、70％)として得られた; R^t 1.02分(方法a); m/z 300(M+H)⁺;

(N-(4-フルオロフェニル)-4-(4-(4-メトキシ-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)ベンズアミド)

4-ブロモ-1-メトキシ-2-メチルベンゼン(XIVb)(406mg、2.02mmol)、中間体(XVII)(550mg、1.84mmol)、RuPhos(43mg、0.092mmol)、及びRuPhos G3(77mg、0.092mmol)を仕込んだフラスコから空気を排出し、窒素を3回再充填した。LiHMDS(9.2mL、THF中1M、9.2mmol)の溶液を添加し、反応混合物を70℃で8時間加熱した。RTに冷却した後、該混合物を1M水性塩酸(9.0mL)の添加によりクエンチし、その後、水(15mL)とEtOAc(15mL)に分配した。有機層を分離し、保持し、水層をEtOAc(2×15mL)で抽出した。合わせた有機物をブライン(20mL)で洗浄し、その後、乾燥させ、真空中で蒸発させた。そのようにして得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO₂、12g、イソヘキサン中0〜100％EtOAc、勾配溶出)により精製すると、黄色の固体が得られた。この材料をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO₂、4g、DCM中0〜10％EtOAc、勾配溶出)により再精製すると、表題化合物の中間体(XVI)がオフホワイト色の固体(83mg、11％)として得られた; R^t 2.27分(方法a); m/z 420(M+H)⁺(ES⁺);

(N-(4-フルオロフェニル)-4-(4-(4-ヒドロキシ-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)ベンズアミド)

0℃の中間体(XVI)(83mg、0.20mmol)のDCM(5.0mL)懸濁液に、三臭化ホウ素(0.59mL、DCM中1M、0.59mmol)の溶液を添加した。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、RTに8時間温めておき、その後、水(15mL)とDCM(10mL)に分配した。有機層を分離し、保持し、水層をDCMとMeOH(90:10、5×15mL)の混合物で抽出した。合わせた有機物を乾燥させ、真空中で蒸発させると、粗生成物が得られ、これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO₂、4.0g、DCM中0〜3％MeOH、勾配溶出)により精製すると、表題化合物の中間体(XV)がベージュ色の固体(61mg、72％)として得られた; R^t 1.73分(方法a); m/z 406(M+H)⁺(ES⁺);

(4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)-N-(4-フルオロフェニル)ベンズアミド)
(1.安息香酸中間体(II)からの化合物(I)の調製)

中間体(II)(2.50g、4.24mmol)、EDCI(1.63g、8.48mmol)、及びDMAP(30mg、0.21mmol)のピリジン(30mL)懸濁液に、4-フルオロアニリン(0.41mL、4.3mmol)を添加し、反応混合物を60℃で2時間加熱し、その後、RTに冷却した。該混合物を水(60mL)で希釈し、5分間撹拌すると、固体が生じ、これを濾過により回収し、その後、水(3×10mL)及びジエチルエーテル(2×15mL)で洗浄すると、褐色の粉末が得られた。そのようにして得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO₂、40g、DCM中0〜3％MeOH、勾配溶出)により精製すると、化合物(I)が黄色の固体(2.47g、85％)として得られた; R^t 2.60分(方法a); m/z 683(M+H)⁺(ES⁺);

(2.フェノール中間体(XV)からの化合物(I)の調製)

中間体(XV)(19mg、0.047mmol)のDMSO(1.5mL)溶液に、水性水酸化ナトリウム(1M、98μL、0.098mmol)を添加した。混合物をRTで10分間撹拌し、その後、トシレート(IX)(APIChem製、カタログ番号: AC-8330、23.2mg、0.052mmol)のDMSO(0.5mL)溶液で処理した。反応混合物を60℃で2時間撹拌し、RTに冷却し、水(10mL)を添加した。得られた混合物をEtOAc(3×10mL)で抽出し、合わせた有機抽出物を乾燥させ、真空中で蒸発させると、茶色の油状物が得られた。そのようにして得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO₂、4g、DCM中0〜2％MeOH、勾配溶出)により精製すると、ベージュ色の固体(23mg)が得られた。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO₂、4.0g、DCM中0〜50％EtOAc、勾配溶出)により再精製すると、化合物(I)がオフホワイト色の固体(14mg、42％)として得られた; R^t 2.60分(方法a); m/z 683(M+H)⁺(ES⁺)。

(4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)-N-(4-フルオロフェニル-2,3,5,6-d₄)ベンズアミド)
(化合物(I)のテトラ-ジュウテリオ誘導体の調製)

中間体(II)(200mg、0.34mmol)、EDCI(130mg、0.68mmol)、及びDMAP(2.1mg、0.02mmol)のピリジン(1.5mL)懸濁液に、4-フルオロアニリン-2,3,5,6-d₄(43mg、0.37mmol)のピリジン(0.5mL)溶液を添加し、反応混合物を60℃で1時間加熱した。該反応混合物をRTに冷却し、水(10mL)で希釈し、5分間撹拌すると、それにより、沈殿が生じた。固体を濾過により回収し、水(3×2.0mL)で洗浄し、その後、DCMとMeOH(9:1、5.0mL)の混合物中に取った。該混合物を相分離器に通し、有機溶液を真空中で蒸発させると、褐色の固体(200mg)が得られた。そのようにして得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO₂、12g、DCM中0〜2％MeOH、勾配溶出; SiO₂、40g、DCM中0〜2.5％MeOH、勾配溶出)により2回精製すると、オフホワイト色の粉末が得られた。

該固体をDMSO(0.75mL)に懸濁させ、溶解し終わるまで60℃に5分間加熱した。得られた溶液をRTに冷却し、水(1.0mL)で処理すると、それにより、沈殿が生じた。懸濁液をRTで20分間撹拌し、固体を濾過により回収し、水(3×0.5mL)ですすぎ、真空中、50℃で(又は3日間)乾燥させると、表題化合物の(I) 4[²H]が白色の固体(147mg、62％)として得られた; R^t 2.59分(方法1a); m/z 687(M+H)⁺(ES⁺);

(経路2による化合物(I)の調製のスケールアップ)
経路2についての上記の合成方法(スキーム1)は、1.0kgを超えるAPIのスケールで本発明の化合物を調製するためにうまく利用されている(スキーム3)。4-ピペラジニルベンゾエート[中間体(VIII)]がエチルエステル(VIIIa)又は対応するtert-ブチルエステル(VIIIb)のいずれかから構成されるこの方法の2つの変化形が開発されている。これらの化合物を両方ともトシレート(IX)とカップリングさせて、安息香酸(II)の対応するエステル前駆体を生じさせることができる。エチルエステルの場合、遊離酸が鹸化によって得られるが、tert-ブチル誘導体は酸分解によって脱エステル化される。この合成作戦に採用される手順は、以下に示され、本明細書に記載されている。

(スキーム3:化合物(I)の合成のスケールアップ)

(分析法及び分光法)
この実験の節に関する分析法及び分光法を以下に提示する。

(LCMS分析のための逆相HPLC条件:)
XBridge BEHフェニル4.6×150mmカラム; 2.5μm(Waters製 #186006720)、40℃;流量1.0mL.分^-1、0.1％ギ酸を含む精製H₂O-MeCN勾配で25分かけて溶出させ、300nmでのUV検出を利用する。注入量5μL。勾配情報: 0〜2分、95％H₂O-5％MeCNで保持; 2〜15分、95％H₂O-5％MeCNから10％H₂O-90％MeCNに上昇させる; 15〜25分、10％H₂O-90％MeCNで保持する。

(¹H NMR分光法:)
JOEL ECX 400MHzスペクトロメーターを用いて¹H NMRスペクトルを収集した。残存する非重水素化溶媒を参照として用い、別途指定されない限り、試料をDMSO-d₆中で泳動させた。

エチル 4-(1-ピペラジニル)ベンゾエート(Xa)(500g、2.13mol)及び4-ブロモ-2-メチルフェノール(479g、2.56mol)の無水DMF(5.0L)溶液を、真空下、その後、窒素雰囲気下に該混合物を交互に3回置くことにより脱気した。その後、該混合物を、内部温度を35℃未満に維持しながら(水浴冷却)、RuPhos G3(35.7g、0.043mol)とLiHMDS(THF中、1.0M、2560mL、2.56mol)の溶液とで処理した。その後、LiHMDS(THF中、1.0M)の溶液を、20〜35℃で、2分間隔で、14等分(14×213mL、合計2.98L、2.98mol)で添加した。得られた溶液を18〜25℃で30分間撹拌し、その後、HPLCによる分析により、0.6％のエチル 4-(1-ピペラジニル)ベンゾエートが残存していることが示され、反応は終了していると判断された。

反応混合物を、温度を40℃未満に維持しながら、2M塩酸(5.50L)の添加によりpH 7.6に調整し、その後、EtOAc(3.00L)を添加し、得られた相を分離した。水相をEtOAc(2×3.00L、その後、2×2.00L)で抽出し、合わせた有機物を飽和ブライン(8×1.00L)で洗浄し、MgSO₄上で乾燥させ、その後、真空中で蒸発させると、薄茶色の油性固体が得られた。粗生成物を、IPA(2.50L)中、20〜25℃で30分間スラリー化させ、得られた固体を濾過により回収した。フィルターケーキをIPA(2×500mL)で洗浄し、吸引乾燥させ、その後、固体を、真空下、50℃で乾燥させると、表題化合物の中間体(VIIIa)が薄褐色の固体(380.0g、52％、HPLC純度97.2％)として得られた; R^t 11.01分; m/z 341.3(M+H)⁺(ES⁺)。

パラジウム残渣のレベルを制御するために、いくつかのバッチからの生成物を合わせ(1900g、残存Pd 108ppm)、THF(19.0L)中に取り、18〜25℃で、MP-TMT樹脂(250g)で処理した。混合物をこの温度で24時間撹拌し、その後、樹脂を濾過により除去し、THF(3.49L)で洗浄した。濾液を真空中で蒸発乾固させ、得られた固体を、IPA(4.75L)中、18〜25℃で1時間スラリー化させ、濾過により回収した。フィルターケーキをIPA(500mL)で洗浄し、吸引乾燥させ、その後、真空中、50℃で乾燥させると、表題化合物の中間体(VIIIa)がオフホワイト色の固体(1789g、94％、残存Pd 17ppm)として得られた。

(エチル 4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)-テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)ベンゾエート)

15〜25℃の中間体(VIIIa)(1780g、5.23mol)の無水DMF(17.8L)溶液に、ナトリウムエトキシド(391g、5.75mol)を添加した。45分後、トシレート(IX)(2586g、5.75mol)を一度に添加し、60〜65℃で5時間撹拌し続けた。HPLCによる分析により、反応が本質的に終了している(1.67％の出発材料が残存している)ことが示された。混合物を18〜25℃に冷却し、得られた懸濁液を、温度を30℃未満に維持しながら、水(18.0L)で処理した。15〜25℃に45分間冷却した後、固体を濾過により回収し、水(2×7.14L)で洗浄した。湿ったフィルターケーキを、エタノール(8.92L)中、還流状態で2時間スラリー化させ、その後、混合物を15〜25℃に冷却し、18時間撹拌した。そのようにして得られた固体を濾過により回収し、エタノール(2×1.78L)で洗浄し、その後、真空中、50℃で乾燥させると、表題化合物の中間体(IVb)がオフホワイト色の固体(2855g、88％、HPLC純度95.97％)として得られた; R^t 14.99分; m/z 618.5(M+H)⁺(ES⁺)。

(4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)-テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)安息香酸一塩酸塩)

18〜25℃のDMSO(1.45L)と水(5.90L)の混合物中の中間体(IVb)(1467g、2.38mol)の懸濁液に、水(2.93L)中のKOHの50％w/w溶液を添加した。懸濁液を90〜95℃で18時間加熱し、18時間経った後、HPLC分析により、反応が終了していること(0.16％の出発材料が残存、97.9％の生成物)が示された。反応混合物を40〜50℃に冷却し、IPA(14.9L)と水(4.42L)の混合物を添加した。15〜25℃に冷却した後、内部温度を40℃未満に維持しながら、濃塩酸(3.12L)の添加によりpHを1〜2に調整した。得られた懸濁液を15〜25℃に冷却し、固体を濾過により回収し、吸引乾燥させ、その後、水(7.40L)中、90〜95℃で30分間スラリー化させた。15〜25℃に冷却した後、固体を濾過により回収し、水(2×1.48L)で洗浄し、吸引乾燥させた。真空中、50℃でさらに乾燥させると、表題化合物の中間体(II)が白色の固体(1329g、89％、HPLC純度99.0％;塩素含有量: 6.61w/w％[理論5.66w/w％])として得られた; R^t 12.92分; m/z 590.4(M+H)⁺(ES⁺)。

(tert-ブチル 4-(4-(4-ヒドロキシ-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)ベンゾエート)

tert-ブチル 4-(ピペラジン-1-イル)ベンゾエート(Xb)(100g、381mmol)及び4-ブロモ-2-メチルフェノール(85.5g、457mmol)の無水DMF(1.00L)溶液を、真空下、その後、窒素雰囲気下に該混合物を交互に3回置くことにより脱気した。この手順の後、RuPhos G3(6.38g、7.62mmol)を15〜25℃で添加し、その後、温度を15〜30℃に維持しながら(水浴冷却)、LiHMDSのTHF(1.06M、432.mL、457mmol)溶液を5分かけて添加した。5分間撹拌した後、LiHMDS(THF中、1.06M)の溶液のさらなるアリコートを、反応混合物に、2分間隔で、14等分(14×36mL、合計504mL、533mmol)で添加すると、16℃〜21℃の発熱が生じた。反応液を15〜25℃で一晩撹拌し(この時点で、HPLCにより、所望の生成物の72％の生成が示された)、2M塩酸(〜900mL)の添加により、混合物のpHを7.3に調整した。水相を分離し、EtOAc(1.0L、500mL、及び2×250mL)で繰り返し抽出した。合わせた有機物をブライン(6×400mL)で洗浄し、MgSO₄上で乾燥させ、真空中で濃縮すると、粘性のある黄色の固体が得られた。そのようにして得られた固体をIPA(500mL)に懸濁させ、15〜25℃で1時間撹拌した。懸濁液を濾過し、フィルターケーキをIPA(250mL、200mL)で洗浄し、吸引乾燥させた。生成物を、真空中、50℃でさらに乾燥させると、表題化合物の中間体(VIIIb)がオフホワイト色の固体(105.6g、75％、HPLC純度97.1％)として得られた; R^t 12.23分; m/z 369.3(M+H)⁺(ES⁺)。

(tert-ブチル 4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)-テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)ベンゾエート)

窒素雰囲気下の中間体(VIIIb)(100g、271mmol)のDMF(500mL)溶液に、ナトリウムエトキシド(22.2g、325mmol)を添加すると、軽い発熱(20〜22.0℃)が生じた。15〜25℃で45分間撹拌した後、反応混合物をトシレート(IX)(146.4g、325mmol)で処理し、その後、60〜65℃で2時間加熱した。HPLCによる得られた混合物の分析により、反応が本質的に終了していること(4.4％のフェノールが残存、14.6％のトシレート、77.6％の生成物)が示され、混合物を40〜45℃に冷却し、IPA(800mL)を添加した。その後、微かなかすみが持続するまで(500mL必要)、水を40〜45℃で滴加し、この時点で、生成物の少量の試料(100mg、0.15mmol)をシードとして添加し、確実に沈殿が開始されるように、混合物を40〜45℃で10分間撹拌した。水(500mL)を40〜45℃で滴加し、その後、懸濁液を15〜25℃に冷却した。得られた固体を濾過により回収し、水(3×200mL)で洗浄し、その後、真空中、50℃で乾燥させると、粗生成物がオフホワイト色の固体(155.9g、89％、HPLC純度94.8％)として得られた。この材料の一部(85.0g)を、溶解し終わるまで65〜75℃で加熱することにより、IPA(510mL)中に溶解させた。その後、溶液を15〜25℃に冷却し、30分間撹拌した。得られた固体を濾過により回収し、IPA(2×85mL)で洗浄し、真空中、50℃で乾燥させると、表題化合物の中間体(IVc)が白色の固体(83.4g、87％全収率、HPLC純度98.2％)として得られた; R^t 15.74分; m/z 646.6(M+H)⁺(ES⁺)。

水(250mL)とIPA(417mL)の混合物中のtert-ブチルベンゾエート(IVc)(83.4g、129mmol)の懸濁液に、内部温度を35℃未満に維持しながら、濃塩酸(167mL)の水(167mL)溶液を添加した。その後、得られた溶液を35℃で24時間保持し(2〜3時間後に固体形成が認められた)、この時点で、HPLC分析により、反応が本質的に終了していること(0.6％のエステルが残存、98.1％の生成物)が示された。混合物を15〜25℃に冷却し、IPA(417mL)を添加し、＜40℃での水性NaOH(10M、200mL)の添加により、pHを〜10に調整すると、溶液が得られた。その後、＜40℃での濃塩酸(25mL)の添加により、pHを1〜2に再調整した。得られた懸濁液を15〜25℃に冷却し、固体を濾過により回収した。フィルターケーキを水(834mL)に再懸濁し、80〜85℃に加熱し、その後、30分間撹拌した。その後、懸濁液を15〜25℃に冷却し、固体を濾過により回収し、水(2×83mL)で洗浄し、真空中、50℃で乾燥させると、(一塩酸塩としての)表題化合物の中間体(II)が白色の固体(64.6g、80％、HPLC純度97.6％)として得られた; R^t 12.92分; m/z 590.4(M+H)⁺(ES⁺)。

(4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)-テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)-N-(4-フルオロフェニル)ベンズアミド)

＜40℃のその一塩酸塩としての安息香酸(II)(1001g、1.60mol)及びHOBt.H₂O(216.g、1.41mol)のDMF(5020mL)の撹拌懸濁液に、DIPEA(840mL、4.823mol)、次いで、4-フルオロアニリン(181mL、1.91mol)、その後、EDCI.HCl(368g、1.92mol)を添加した。混合物を60〜65℃で17時間加熱し、その時点で、HPLCによる分析により、反応が終了していること(出発材料も反応中間体も検出されない、82.63％の生成物)が示された。得られた溶液を15〜25℃に冷却し、＜35℃で、水(15.2L)でクエンチし、その後、15〜25℃に再冷却し、1時間撹拌した。得られた固体を濾過により回収し、水(2×2.00L)で洗浄し、吸引乾燥させた。フィルターケーキを、水(5.00L)中、15〜25℃で45分間再スラリー化させ、固体を濾過により回収し、水(2×2.00L)で洗浄し、真空中で乾燥させると、表題化合物の化合物(I)がオフホワイト色の固体(1101g、〜100％、HPLC純度95.8％)として得られた; R^t 14.46分; m/z 683.5(M+H)⁺(ES⁺);

(生物学的試験:実験方法)
(浮遊性真菌成長の評価)
(a.レサズリンマイクロタイターアッセイ)
このアッセイは、公開されている方法の改変版を用いて実施した(Monteiroらの文献、2012)。アスペルギルス・フミガーツス(NCPF2010, Public Health England, Wiltshire)の胞子をサブローデキストロース寒天中で3日間培養した。PBS-tween(10mL; 0.05％Tween-20、100U/mLペニシリン、及び100U/mLストレプトマイシンを含むPBS)で洗浄することにより、ストック胞子懸濁液をサブローデキストロース寒天培養物から調製した。Neubauer血球計算盤を用いて胞子数を評価し、PBSを用いて10⁶胞子/mLに調整した。胞子の作業懸濁液(10⁴胞子/mL)をフィルター滅菌済MOPS RPMI-1640(50mL; NaOHでpH 7に緩衝化した、2mM L-グルタミン、2％グルコース、及び0.165M MOPSを含むRPMI-1640)中で調製した。レサズリンナトリウム塩(100μLの1％溶液; Sigma-Aldrich, Dorset, UK)を胞子懸濁液に添加し、よく混合した。胞子懸濁液-レサズリン混合物(100μL/ウェル)を384ウェルプレート(カタログ番号353962, BD Falcon, Oxford, UK)に添加した。同時に、試験化合物(0.5μL DMSO溶液)を、Integra VIAFLO 96(Intergra, Zizers, Switzerland)を用いて、100μLの胞子-レサズリン混合物に4連で添加して、0.5％の最終DMSO溶液を提供した。非胞子対照ウェルについては、胞子-レサズリン混合物の代わりに、MOPS-RPMI-レサズリン溶液(100μL)を添加した。プレートをBreathe Easier膜(カタログ番号Z763624, Sigma-Aldrich, Dorset, UK)で覆い、接種したウェル中の蛍光が対照ウェルの蛍光の2倍になるまで(約24時間)、インキュベートした(35℃、5％CO₂)。各ウェルの蛍光(545nm(励起)/590nm(放出)、ゲイン800、焦点高さ5.5mm)を、マルチスキャナー(Clariostar: BMG, Buckinghamshire, UK)を用いて決定した。各ウェルについての阻害率を計算し、MIC₅₀、MIC₇₅、及びMIC₉₀値を、各試験化合物について作成された濃度-応答曲線から計算した。

(b.微量液体希釈アッセイ)
このアッセイは、EUCASTによって公開された方法の改変版を用いて実施した(Rodriguez-Tudelaらの文献、2008)。アスペルギルス・フミガーツス(Public Health England, WiltshireからのNCPF2010、NCPF7010(メチオニン220突然変異)、NCPF7099(グリシンG54突然変異); St Louis Hospital, Paris, FranceからのTR34/L98H突然変異体)の胞子をサブローデキストロース寒天中で3日間培養した。PBS-tween(10mL; 0.05％Tween-20、100U/mLペニシリン、及び100U/mLストレプトマイシンを含むPBS)で洗浄することにより、ストック胞子懸濁液をサブローデキストロース寒天培養物から調製した。Neubauer血球計算盤を用いて胞子数を評価し、その後、PBSで10⁶胞子/mLに調整した。胞子の作業懸濁液(2×10⁵胞子/mL)をフィルター滅菌済BSA MOPS RPMI-1640(50mL; NaOHでpH 7に緩衝化した、2mM L-グルタミン、0.5％BSA、2％グルコース、0.165M MOPSを含むRPMI-1640)中で調製した。このアッセイのために、BSA MOPS RPMI-1640(50μL/ウェル)を384ウェルプレート(カタログ番号353962, BD Falcon, Oxford, UK)の全体にまず添加した。その後、Integra VIAFLO 96(Integra, Zizers, Switzerland)を用いて、試験化合物(0.5μL DMSO溶液)を4連で添加し、プレートミキサーを用いてよく混合した。その後、上記のように調製した50μLの作業胞子懸濁液を、非胞子対照ウェルを除く全てのウェルに添加した。非胞子対照ウェルについては、BSA MOPS-RPMI溶液(50μL/ウェル)を代わりに添加した。プレートをプラスチック製の蓋で覆い、(35℃、周囲空気で)48時間インキュベートした。マルチスキャナー(Clariostar: BMG, Buckinghamshire, UK)を用いて、各ウェルの530nmでのODを決定した。各ウェルについての阻害率を計算し、各試験化合物について作成された濃度-応答曲線からMIC₅₀、MIC₇₅、及びMIC₉₀値を計算した。

真菌パネルのスクリーニングは、Eurofins Panlabs社が実施した。臨床検査標準協会(Clinical and Laboratory Standards Institute)のガイドラインである、酵母(CLSI M27-A2)の微量液体希釈法(CLSIの文献、2002)及び糸状菌(CLSI M38-A)の微量液体希釈法(CLSIの文献、2008)に従って、試験品のMIC及びMIC₅₀値を決定した。

(気管支上皮細胞のアスペルギルス・フミガーツス感染)
BEAS2B細胞を10％FBS RPMI-1640に入れて96ウェルプレート(100μL; 30,000細胞/ウェル;カタログ番号3596, Sigma Aldrich, Dorset, UK)に播種し、その後、1日間インキュベートした(37℃、5％CO₂)後、実験した。試験化合物(0.5μL DMSO溶液)又はビヒクル(DMSO)を各ウェルに添加して、0.5％の最終DMSO濃度を生じさせた。BEAS2B細胞を試験化合物とともに1時間インキュベートした(35℃、5％CO₂)後、アスペルギルス・フミガーツス(20μL; Public Health England)分生胞子懸濁液(10％FBS RPMI-1640中、0.5×10⁵/ml)を感染させた。プレートを24時間インキュベートした(35℃、5％CO₂)。上清(50μL)を回収し、PCRプレート(カタログ番号L1402-9700, Starlab, Milton Keynes, UK)に移し、これを使用するまで凍結させた(-20℃)。解凍後、R7-PBS溶液(95μL; R7対PBSは1:4; Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA, USA)を添加することにより、上清(5μL)を1:20希釈した。これらの試料(50μL)中のGMレベルを、Platelia GM-EIAキット(Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA, USA)を用いて測定した。各ウェルについての阻害率を計算し、各試験化合物について作成された濃度-応答曲線からIC₅₀値を計算した。

(ヒト肺胞二重層のアスペルギルス・フミガーツス感染)
ヒト肺胞上皮細胞及び内皮細胞の二重層からなるヒト肺胞のインビトロモデルを以前に記載されている通りに調製した(Hopeらの文献、2007)。この系は、上の区画(「大気」空間)及び/又は下の区画(「全身」空間)への試験化合物の投与を可能にする。この柔軟性は、化合物(I)を上部チャンバーに投与し、ポサコナゾール又は他の抗真菌剤を下部チャンバーに投与することによって組合せ治療の効果を研究するために利用されている。初代ヒト肺動脈内皮細胞(HPAEC)を採取し、EGM-2培地(Lonza, Basel, Switzerland)中で10⁶細胞/mLに希釈した。トランスウェルを裏返しにし、細胞懸濁液(100μL/ウェル)を各トランスウェルの底に適用した。裏返しにしたトランスウェルを、気流フード内で、RTで2時間インキュベートし、その後、それらを上向きに返した。EGM-2培地を下の区画(700μL/ウェル)及び上の区画(100μL/ウェル)に添加し、トランスウェルを48時間インキュベートした(37℃、5％CO₂)。その後、下の区画のEGM-2培地を新鮮なEGM-2培地と交換した。A549細胞を採取し、10％EBM中で5×10⁵細胞/mLに希釈し、その後、全てのトランスウェルの上の区画(100μL/ウェル)に添加し、プレートを72時間インキュベートした(37℃、5％CO₂)。アスペルギルス・フミガーツス(イトラコナゾール感受性株NCPF2010及びイトラコナゾール耐性株TR34-L98H)の分生胞子をサブローデキストロース寒天中で3日間別々に培養した。PBS-tween(10mL; 0.05％Tween-20、100U/mLペニシリン、及び100U/mLストレプトマイシンを含むPBS)で洗浄することにより、両株のストック分生胞子懸濁液をサブローデキストロース寒天培養物から調製した。Neubauer血球計算盤を用いて分生胞子数を評価し、PBSで10⁶分生胞子/mLに調整した。分生胞子の作業ストックを使用直前にEBM中で調製した(10⁵分生胞子/mLの濃度)。

試験化合物及び参照化合物(又はビヒクルとしてのニートのDMSO)を、下の区画の処理用の24ウェルプレート(3μL/600μLの2％FBS EBMを含むウェル)及び上の区画の処理用の96ウェルプレート(1μL/200μLの2％FBS EBMを含むウェル)の適当なウェルに添加して、0.5％の最終DMSO濃度を提供した。上の区画の培地を吸引し、適当な試験化合物及び参照化合物、又はビヒクルを含む培地を添加した(100μL/ウェル)。その後、トランスウェルを、試験化合物及び参照化合物又はDMSOビヒクルを含む24ウェルプレートに移した。1時間のインキュベーション(35℃、5％CO₂)の後、分生胞子懸濁液(10μL/ウェル)を各トランスウェルの上の区画に添加した。その後、プレートを24時間インキュベートした(35℃、5％CO₂)。各区画からの上清(5μL/区画)を回収し、保存した(-20℃)。上清の回収後、培地を毎日交換し、全てのウェルを、上記のように、試験化合物及び参照化合物又はDMSOで3日間処理した。真菌の成長が全てのトランスウェルにおいて目で見えるまで、試料を回収し続けた。その後、下の区画の上清中のGMのレベルをアスペルギルス・フミガーツス侵入の指標としてELISA(BioRad, CA, USA)により測定した。

(細胞生存:レサズリンアッセイ)
BEAS2B細胞をRPMI-LHC8(同じ割合で組み合わせたRPMI-1640及びLHC8培地)に入れて384ウェルプレート(100μL; 3000/ウェル/; BD Falcon,カタログ番号353962)に播種し、1日後に実験した。無細胞対照ウェルについては、RPMI-LHC8(100μL)を添加した。試験化合物(0.5μLのDMSO溶液)を、Integra VIAFLO 96(Integra, Zizers, Switzerland)を用いて添加して、0.5％の最終DMSO濃度を生じさせた。BEAS2B細胞を各試験化合物とともに1日間インキュベートした(RPMI-LHC8中、37℃/5％CO₂)。レサズリンストック溶液(5μL、0.04％)を添加した後、プレートをさらに4時間インキュベートした(37℃/5％CO₂)。545nm(励起)及び590nm(放出)での各ウェルの蛍光を、マルチスキャナー(Clariostar: BMG Labtech)を用いて決定した。細胞生存の損失率を、各ウェルについて、ビヒクル(0.5％DMSO)処理と比べて計算した。適切な場合、CC₅₀値を、各試験化合物についての濃度-応答曲線から作成された濃度-応答曲線から計算した。

(インビボ抗真菌活性)
アスペルギルス・フミガーツス(ATCC 13073[株: NIH 5233]、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection), Manassas, VA, USA)を、麦芽寒天(Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan)プレート上で、RT(24±1℃)で6〜7日間成長させた。胞子を寒天プレートから無菌的に取り除き、0.05％Tween 80及び0.1％寒天を含む滅菌蒸留水に懸濁させた。感染当日に、胞子数を血球計算盤により評価し、1.67×10⁸胞子mL^-1の生理食塩水の濃度を得るように、接種材料を調整した。

免疫抑制及び好中球減少を誘導するために、A/Jマウス(雄、5週齢)に、感染3日前、2日前、及び1日前に、ヒドロコルチゾン(Sigma H4881; 125mg/kg、sc)を投与し、感染2日前に、シクロホスファミド(Sigma C0768; 250mg/kg、ip)を投与した。0日目に、動物に胞子懸濁液(鼻腔内に35μL)を感染させた。

試験化合物を、0日目の感染30分前、並びにその後、1日目、2日目、及び3日目に(予防的処置を表す)、又は1日目、2日目、及び3日目のみに(治療的処置を表す)、1日1回、鼻腔内に投与した(生理食塩水中0.08〜2.00mg/mLの懸濁液35μL)。予防的処置の延長のために、試験化合物(生理食塩水中0.0032又は0.016mg/mLの懸濁液35μL)を、1日1回、7日間;その後、0日目の感染30分前、並びにそれ以降、感染後1日目、2日目、及び3日目にか、又は0日目のみにかのいずれかで、鼻腔内に投与した。これらの処置パラダイムの効果を、処置を接種1日及び30分前、その後、感染後1日目、2日目、及び3日目に制限するか;又は1日及び感染30分前のみに一層さらに減らしたときに得られるものと比較した。動物の体重を毎日モニタリングし、その0日目の体重と比較して、≧20％の低下を示したものを選抜した。

最後の投与から6時間後、動物に麻酔をかけ、気管にカニューレを挿入し、BALFを回収した。肺胞細胞の総数を血球計算盤を用いて決定し、肺胞マクロファージ及び好中球の数を、以前に報告されている通りに(Kimuraらの文献、2013)、それぞれ、抗マウスMOMA2-FITC(マクロファージ)又は抗マウス7/4(好中球)を用いるFACS解析(EPICS(登録商標) ALTRA II, Beckman Coulter社、Fullerton, CA, USA)により決定した。BALF中のIFN-γ及びIL-17、並びに血清中のIL-6及びTNFαのレベルを、それぞれ、Quantikine(登録商標)マウスIFN-γ、IL-17、IL-6、又はTNF-α ELISAキット(R&D systems社、Minneapolis, MN, USA)を用いて決定した。酸化的ストレスマーカーのMDAを、OxiSelect(登録商標) TBARSアッセイキット(MDA Quantitation; Cell Biolabs社、San Diego, CA, USA)を用いてアッセイした。血清中のアスペルギルスGMを、Platelia GM-EIAキット(Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA, USA)を用いて決定した。カットオフ指数を、式:カットオフ指数＝試料中のOD/キットに提供されているカットオフ対照中のODにより計算した。組織真菌負荷アッセイのために、100mgの肺組織を無菌的に除去し、滅菌蒸留水に入れて0.2mLの0.1％寒天中でホモジナイズした。段階希釈した肺ホモジネートを麦芽寒天プレート(50μL/プレート)上にプレーティングし、24±1℃で72〜96時間インキュベートした。各プレート上のA.フミガーツスのコロニーを計数し、真菌力価を肺組織のグラム当たりのCFUとして提示した。

感染前に3日間、1日1回、ヒドロコルチゾン(Sigma H4881; 125mg/kg、sc)が投与され、感染前に2日間、シクロホスファミド(Sigma C0768; 250mg/kg、ip)が投与されていた、重度に免疫抑制された好中球減少症A/Jマウス(雄、5週齢)を用いて、鼻腔内投与された化合物(I)と経口投与されたポサコナゾールの組合せ治療の効果を評価した。0日目に、動物に、アスペルギルス・フミガーツス(ATCC 13073[株: NIH 5233])の35μLの胞子懸濁液(生理食塩水中、1.67×10⁸胞子/mL)を鼻腔内に感染させた。等張食塩水(0.4mg/mL)中の懸濁液として調製された化合物(I)を、感染後1〜6日目に、1日1回、鼻腔内注射(35μL/マウス)によって投与した。ポサコナゾール(1mg/kg)を、感染後1〜6日目に、1日1回、経口投与した。体重及び生存を7日目まで毎日モニタリングした。

(スクリーニング結果のまとめ)
化合物(I)は、レサズリンアッセイにより評価されるアゾール感受性アスペルギルス・フミガーツスの真菌成長と気管支上皮細胞の真菌感染の両方に対する強力な阻害活性を示す(表2)。これらのアッセイ系において、化合物(I)は、ボリコナゾール及びアムホテリシンBよりも有意に大きい効力、並びにポサコナゾールと同様の効力を示した。化合物(I)とのインキュベーションは、少なくとも10μMまでの濃度でBEAS2B気管支上皮細胞の生存に対する効果が全く又はほとんどなかった。
表2 アスペルギルス・フミガーツス(NCPF2010)の浮遊性真菌成長に対する、BEAS2B気管支上皮細胞の真菌感染に対する、及びBEAS2B細胞生存に対するボリコナゾール、ポサコナゾール、アムホテリシンB、及び化合物(I)による処理の効果

表脚注: 1.レサズリンマイクロタイターアッセイ; 2.気管支上皮細胞; 3. n＝1〜5;

化合物(I)は、微量液体希釈アッセイで評価したとき、浮遊性真菌成長に対する強力な阻害活性も示す(表3)。このアッセイにおいて、化合物(I)は、ポサコナゾール耐性株(NCPF7099、NCPF7100、及びTR34/L98H)とポサコナゾール感受性株(NCPF2010)の両方に対して、ポサコナゾール、ボリコナゾール、及びアムホテリシンBよりも有意に大きい効力を示した。
表3 アスペルギルス・フミガーツスの分離株の浮遊性真菌成長に対するボリコナゾール、ポサコナゾール、アムホテリシンB、及び化合物(I)による処理の効果

表脚注: 1.微量液体希釈アッセイ、n＝1〜3

広範囲の真菌病原体の成長に対する化合物(I)の効果を、CLSI微量液体希釈法を用いて評価した。化合物(I)は、リゾプス・オリゼ、クリプトコックス・ネオフォルマンス、ケトミウム・グロボスム、ペニシリウム・クリソゲヌム、及び紅色白癬菌、並びに一部のカンジダ属の種(表4)の成長の強力な阻害剤であることが分かった。
表4 様々な真菌種の成長に対する化合物(I)の効果

表脚注: MIC₅₀/MIC₁₀₀＝目視検査(CLSI)による真菌成長の50％及び100％阻害に必要とされる濃度

化合物(I)(上部チャンバー中、0.1μg/mL)又はポサコナゾール(下部チャンバー中、0.01μg/mL)のどちらかによる単剤療法は、1日目にヒト肺胞二重層でGM産生を阻害した。しかしながら、これらの処理の阻害効果は、その後、急速に失われた(表5)。対照的に、化合物(I)とポサコナゾールとの組合せ処理は、感染後の侵入の持続的阻害を示した。その結果、組合せ処理についてのDFB₅₀は5.48日であり、どちらかの化合物のみについての値よりもはるかに長かった。組合せ療法のこの相乗的又は相加的効果は、化合物(I)による処理を、イントラコナゾール、ボリコナゾール、又はカスポファンギンによる処理と組み合わせたときにも確認された(結果は示さない)。
表5 ヒト肺胞二重層(トランスウェル)の下部チャンバーへのアスペルギルス・フミガーツス(NCPF2010)侵入に対する化合物(I)、ポサコナゾール、及び処理組合せの効果

表脚注: 1. 0.1μg/mLで投与した; 2. 0.01μg/mLで投与した; DFB₅₀:対照の50％の真菌量に達するのにかかる日数

さらに、この組合せ処理を、アスペルギルス・フミガーツスのアゾール耐性株:TR34-L98Hに感染した二重層で試験した(表6)。上部チャンバー中の化合物(I)(1μg/mL)又は下部チャンバー中のポサコナゾール(0.1μg/mL)による単剤療法は、限られた有益性を示した。対照的に、化合物(I)とポサコナゾールの組合せは、下部チャンバーへの真菌の侵入に対する顕著な阻害効果を示した。組合せ処理の有益な効果は、感染後1日目には観察されたが、2日目以後、消失した。
表6 肺胞二重層細胞システム(トランスウェル)の下部チャンバーへのアスペルギルス・フミガーツス(TR34-L98H株)の侵入に対する化合物(I)、ポサコナゾール、及び処理組合せの効果

表脚注: 1. 1μg/mLで投与した; 2. 0.1μg/mLで投与した; DFB₅₀:対照の50％の真菌量に達するのにかかる日数

直接比較で、0日目及び接種後1〜3日目に、免疫不全好中球減少症マウスに鼻腔内投与した(予防的処置)とき、化合物(I)は、3日間にわたって測定された、アスペルギルス・フミガーツスの感染によって引き起こされる体重減少の軽減に対して、ポサコナゾールよりも優れた効果を示した(表7)。
表7:アスペルギルス・フミガーツスの感染によって引き起こされる免疫不全好中球減少症マウスの体重減少に対する化合物(I)及びポサコナゾールによる処置の効果の比較

表脚注: 1. 0.4mg/mLで鼻腔内に投与した; 2. 0日目の動物体重と比較した％体重減少

さらに、化合物(I)による予防的及び治療的処置は、感染後の肺における真菌負荷に対して及びBALFと血清の両方におけるGM濃度に対して、ポサコナゾールよりも優れた効果を示した。予防的及び治療的投与レジメンで使用される、化合物(I)のデータを表8並びに図1、2、及び3に示す(ID₅₀値を表9に示す)。
表8:アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全好中球減少症マウスの肺におけるCFU並びにBALF及び血清におけるガラクトマンナン濃度に対する化合物(I)による予防的及び治療的処置の効果

表脚注:真菌負荷のデータは、平均±平均の標準誤差として示されている(SEM; n＝5〜6)。
表9:アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全好中球減少症マウスの肺における真菌負荷並びにBALF及び血清におけるガラクトマンナン濃度に対するポサコナゾール及び化合物(I)による予防的処置のID₅₀値

化合物(I)による予防的処置は、ポサコナゾールと同様の様式で、BALFにおける炎症細胞蓄積を阻害した(表10)。さらに、化合物(I)による予防的処置は、BALFにおけるIL-17、IFNγ、及びMDA濃度に対して、ポサコナゾールよりも優れた阻害効果を示した。独立した実験における化合物(I)及びポサコナゾールの比較ID₅₀値を表11に示す。
表10:アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全好中球減少症マウスのBALFへのマクロファージ及び好中球の蓄積に対する化合物(I)による予防的及び治療的処置の効果

表脚注:細胞数のデータは、平均±平均の標準誤差(SEM)として示されている。N＝5〜6。
表11:アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全好中球減少症マウスのBALFにおけるIL-17、IFNγ、及びMDAレベルに対するポサコナゾール及び化合物(I)による予防的処置のID₅₀値

さらに、予防的にか又は治療的にかのいずれかで投与したときの、BALFにおけるIFNγ、IL-17、及びMDAのレベルに対する化合物(I)の効果を示すデータを表12に示し、血清のIL-6及びTNFαに対する効果を表13に示す。
表12:アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全好中球減少症マウスのBALFにおけるIFNγ、IL-17、及びMDAレベルに対する化合物(I)による予防的及び治療的処置の効果

表脚注:バイオマーカー濃度のデータは、平均±平均の標準誤差(SEM)として示されている、N＝5〜6。
表13:アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全好中球減少症マウスの血清におけるIL-6及びTNFαレベルに対する化合物(I)による予防的及び治療的処置の効果

表脚注:バイオマーカー濃度のデータは、平均±平均の標準誤差(SEM)として示されている。N＝5〜6。

化合物(I)による治療的処置は、アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全好中球減少症マウスにおける肺真菌負荷、血清ガラクトマンナンレベル、及びBALFサイトカイン濃度の強力な阻害を維持することも分かった(表7、8、9、及び10;並びに図1、2、及び3)。

アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全好中球減少症マウスにおけるバイオマーカーに対する化合物(I)の予防的投与の延長の効果も評価した。化合物(I)による予防の延長は、以前のバイオマーカー研究で使用された用量よりも25倍低い用量で、肺における真菌負荷、及びBALFと血清の両方におけるGM濃度を阻害することが分かった(表14)。さらに、7日間の予防が、追加される1日間の予防的処置よりも大きい抗真菌効果をもたらしたので、このデータは、反復投与時の肺における抗真菌効果の蓄積を示唆している。肺における化合物の作用の持続は、-7日目〜0日目の処置が、-1日目及び0日目のみの処置から得られるものよりも優れた抗真菌効果を3日目に生じさせたという発見により示唆される。とは言え、この短縮された投与プロトコルも依然として防御的であった。
表14:アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全好中球減少症マウスの肺における真菌負荷(CFU)並びにBALF及び血清におけるGM濃度に対する化合物(I)の予防的投与の延長の効果

表脚注: 1. N値は、全ての薬物処置群について6である; 2. N値は、ビヒクル処置群について5である; 3.真菌負荷及びGMレベルのデータは、ビヒクルに対する、平均±平均の標準誤差及び阻害率として示されている。

局所投与される化合物(I)の処置と経口ポサコナゾールとを組み合わせることの生存に対する影響を、アスペルギルス・フミガーツスを接種した後の重症免疫不全好中球減少症マウスで評価した。化合物(I)(鼻腔内投与される、0.4mg/mL)又はポサコナゾール(経口投与される、1.0mg/kg)による単剤療法は、非常に限られた治療的利益しか示さなかった。対照的に、化合物(I)とポサコナゾールの組合せは、感染後の生存時間に関して顕著な増加を示した(表15)。
表15 アスペルギルス・フミガーツスに感染した重度免疫不全好中球減少症マウスにおける生存に対する単剤療法としての又は組み合わせた化合物(I)及びポサコナゾールの効果

表脚注:群当たりN＝8。

(インビボ薬物動態)
肺用治療剤が、動物、例えば、マウスの肺に投与され、結果として生じる、投与された化合物への全身曝露を特徴付けるために、血漿が投与後の様々な時点で回収されるのは一般的に使用される手順である。本発明の化合物は、そのようなインビボ系で試験することができる。

(化合物(I)の生物学的プロファイルのまとめ)
化合物(I)は、アスペルギルス・フミガーツスの浮遊性成長及び気管支上皮細胞感染の強力な阻害剤であることが分かった。化合物(I)は、ポサコナゾール耐性及びボリコナゾール耐性アスペルギルス・フミガーツス分離株の成長も阻害し、これらの株に対するポサコナゾール、ボリコナゾール、及びイントラコナゾールよりも大きい効力を示した。化合物(I)は、リゾプス・オリゼ、クリプトコックス・ネオフォルマンス、ケトミウム・グロボスム、ペニシリウム・クリソゲヌム、及び紅色白癬菌、並びに一部のカンジダ属の種の成長の強力な阻害剤であることも分かった。肺胞のインビトロモデルでは、化合物(I)は、単剤療法としても、ポサコナゾールと組み合わせて投与されたときでも、アスペルギルス侵入に対する見事な活性を示した。インビボでは、アスペルギルス・フミガーツスに感染した免疫不全好中球減少症マウスにおいて、化合物(I)は、予防的に投与されるのであれ、治療として投与されるのであれ、アスペルギルス・フミガーツス感染及び関連する肺免疫応答の強力な阻害を示した。化合物(I)は、感染依存的体重減少を軽減するのにも極めて有効であった。これらの阻害効果は、ポサコナゾールの阻害効果よりも優れていた。化合物(I)の有益な抗真菌効果が、予防的状況と治療的状況の両方で認められることは意義深い。

(参考文献)

本明細書及び以下の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上、別途要求されない限り、「含む(comprise)」という語並びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」などの変化形は、記載された整数、工程、整数の群、又は工程の群の包含を意味するのであって、任意の他の整数、工程、整数の群、又は工程の群を除外するものではないことが理解されるであろう。

Claims

化合物、すなわち、4-(4-(4-(((3R,5R)-5-((1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)メチル)-5-(2,4-ジフルオロフェニル)テトラヒドロフラン-3-イル)メトキシ)-3-メチルフェニル)ピペラジン-1-イル)-N-(4-フルオロフェニル)ベンズアミドである化合物(I);又はその医薬として許容し得る塩

。
医薬としての使用のための、請求項1記載の化合物。
真菌症の治療における使用のための又は真菌症と関連する疾患の予防もしくは治療における使用のための、請求項1記載の化合物。
真菌症の治療のための又は真菌症と関連する疾患の予防もしくは治療のための薬剤の製造における、請求項1記載の化合物の使用。
真菌症を有する対象の治療方法であって、該対象に、請求項1記載の化合物の有効量を投与することを含む、前記方法。
対象における真菌症と関連する疾患の予防又は治療方法であって、該対象に、請求項1記載の化合物の有効量を投与することを含む、前記方法。
前記真菌症がアスペルギルス属の種によって引き起こされる、請求項3〜6のいずれか一項記載の使用のための化合物、使用、又は方法。
前記アスペルギルス属の種が、アスペルギルス・フミガーツス又はアスペルギルス・プルランス、とりわけ、アスペルギルス・フミガーツスである、請求項7記載の使用のための化合物、使用、又は方法。
前記アスペルギルス属の種が、アゾール耐性アスペルギルス・フミガーツスである、請求項7記載の使用のための化合物、使用、又は方法。
前記真菌症が、カンジダ属の種、例えば、カンジダ・アルビカンス又はカンジダ・グラブラータ、リゾプス属の種、例えば、リゾプス・オリゼ、クリプトコックス属の種、例えば、クリプトコックス・ネオフォルマンス、ケトミウム属の種、例えば、ケトミウム・グロボスム、ペニシリウム属の種、例えば、ペニシリウム・クリソゲヌム、又はトリコフィトン属の種、例えば、紅色白癬菌によって引き起こされる、請求項3〜6のいずれか一項記載の使用のための化合物、使用、又は方法。
第2の又はさらなる活性成分と組み合わせた医薬としての使用のための、請求項1記載の化合物。
任意に1以上の医薬として許容し得る希釈剤又は担体と組み合わせた、請求項1記載の化合物を含む医薬組成物。
第2の又はさらなる活性成分を含む、請求項12記載の医薬組成物。
前記第2の又はさらなる活性成分が、抗真菌剤(例えば、ボリコナゾール又はポサコナゾール)、アムホテリシンB、エキノカンジン(例えば、カスポファンギン)、及び3-ヒドロキシ-3-メチル-グルタリル-CoAレダクターゼの阻害剤(例えば、ロバスタチン、プラバスタチン、又はフルバスタチン)から選択される、請求項11記載の使用のための化合物又は請求項13記載の医薬組成物。
前記第2の又はさらなる活性成分が、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン、ナタマイシン、ナイスタチン、リモシジン、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、アバファンギン、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン、アニデュラファンギン、ミカファンギン、安息香酸、シクロピロックス、フルシトシン(5-フルオロシトシン)、グリセオフルビン、トルナフテート、及びウンデシレン酸から選択される、請求項11記載の使用のための化合物又は請求項13記載の医薬組成物。
式(II)の化合物又はその塩

。
式(IV)の化合物又はその塩

(式中、R^aはC_1-5アルキルを表す)。
式(V)の化合物又はその塩

。
式(VII)の化合物又はその塩

(式中、Pは、窒素保護基、例えば、Bocを表す)。
式(VIII)の化合物:又はその塩

(式中、R^aはC_1-5アルキルを表す)。
式(XIII)の化合物:又はその塩

。
式(XV)の化合物:又はその塩

。
請求項1記載の化合物(I)又はその医薬として許容し得る塩を調製する方法であって、式(II)の化合物:もしくはその活性化誘導体;又はその塩

を;式(III)の化合物:又はその塩

と反応させることを含む、前記方法。
請求項1記載の化合物(I)又はその医薬として許容し得る塩を調製する方法であって、式(XV)の化合物:又はその塩

を;式(IX)の化合物:又はその塩

(式中:
Zは、脱離基、例えば、p-トリルSO₂Oを表す)
と反応させることを含む、前記方法。