KR102579011B1 - 소포로리피드 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 캔디다 속 효모균을 배양하여 생산되는 산화형 및 락톤형 소포로리피드 침전액으로부터 특이취, 색상, 점도 등의 물성이 개선된 소포로리피드를 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

소포로리피드 정제 방법{METHOD FOR PURIFYING SOPHOROLIPID}
본 발명은 캔디다 속 효모균을 배양하여 생산되는 산화형 및 락톤형 소포로리피드 침전액으로부터 특이취, 색상, 점도 등의 물성이 개선된 소포로리피드를 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다.
계면활성제는 단량체 한 분자 안에 친수성기와 소수성기를 모두 가지고 있는 화합물로, 2가지 이상의 물질이 형성하고 있는 계면에 흡착되어 계면 장력을 저하시키는 기능을 가지고 있다. 수용액 상태에서 이온을 띄는 이온성 계면활성제와 이온화가 되지 않는 비이온성 계면활성제로 크게 분류할 수 있으며, 또 다른 분류 기준으로는 화학적 합성에 의해 생산되는 화학 계면활성제와 박테리아, 효모 및 곰팡이 등의 미생물에 의해 생산되는 생물 계면활성제 등이 있다. 그 중 생물 계면활성제는 인체에 대해 낮은 독성을 보이고, 단순한 구조 및 구성 물질을 가져 생분해가 쉽게 이루어진다. 또한, 계면활성제는 수용액 상태에서 특정 농도 이상이 되면 계면 장력이 더는 감소하지 않고 유지됨과 동시에 미셀을 형성하는 특성을 보인다. 이때의 미셀을 형성하는 농도를 임계 미셀 농도(CMC, Critical Micelle Concentration) 이라고 하며, 생물 계면활성제는 화학적 합성에 의해 만들어진 계면활성제와 비교해 CMC가 낮아 화학 계면활성제에 비해 더욱 나은 세정력 등을 나타내 화학 계면활성제의 대체품으로 많은 연구가 진행되고 있다.
생물 계면활성제는 박테리아, 효모 및 곰팡이 등의 미생물의 생합성 대사경로를 통해 생산되는 모든 종류의 계면활성제를 의미하며, 구조에 따라 당지질, 리포펩타이드 및 리포단백질, 중성지방 및 인지질, 고분자 계면활성제, 입자 계면활성제 등으로 분류된다. 소포로리피드는 글루코오스 두 분자가 β-1,2 결합한 소포로스(Sophorose)와 수산기가 존재하는 지방산, 특히 16개(C16) 또는 18개(C18)의 탄소 사슬로 이루어진 불포화 지방산, 한 분자가 결합한 단순한 구조로 이루어져 있으며, 세정력이 높고, 세균 및 진균에 대한 높은 항균력을 보여, 화장품, 식품 등의 다양한 분야에서 이용되고 있다.
효모균으로부터 생산되는 소포로리피드의 구조는 크게 산화(Acidic)형 소포로리피드 및 Closed 유형의 락톤(Lactone)형 소포로리피드, 2가지 유형으로 나눌 수 있으며, 구조에 따른 항균력과 물성이 달리 나타난다. 현재 연구된 바로는 소포로리피드가 주로 효모균에 의한 배양을 통해 생산이 되며, 그 가운데 캔디다 속 균주가 높은 생산농도를 보이는 것으로 알려져 있으며, Candida bombicola 균주가 특히 높은 생산성을 나타내 해당 균주에 대해 연구가 많이 이뤄지고 있고, 생산 연구에 사용되고 있다[Kurtzman et al, FEMS microbiology letters,　311(2), 140-146. (2010)].
[화학식 1]
캔디다 속 효모균 가운데 캔디다 봄비콜라(Candida bombicola)는 탄소원인 포도당 및 불포화 지방산의 공급원인 오일 등을 일정 농도로 유지되도록 유가식 배양(Fed-batch culture)을 진행할 때 최대 300 g/L의 소포로리피드 생산 농도를 보이는 것으로 알려졌으며, 일반적으로 캔디다 봄비콜라의 배양을 통해 생산되는 소포로리피드의 경우, 산화형과 락톤형이 각각 30-40%, 60-70%의 비율로 구성된다. 락톤형 소포로리피드는 산화형 소포로리피드에 비해 낮은 CMC를 나타냈으며, 세정력이 더 우수하다. 산화형 소포로리피드가 세균에 대한 항균력을 거의 보이지 않는 반면, 락톤형 소포로리피드는 여드름 균인 Propionibacterium acnes 등의 균에 대한 항균력을 보였다. 산화형은 락톤형에 비해 HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance) 값이 높은데, 이는 산화형이 물에 대한 용해도가 높은 것을 나타내며, 친수성 계면활성제로서 가용화제로 작용할 수 있음을 의미한다.
세정력, 항균력 등의 기능성을 보이는 생물 계면활성제인 소포로리피드를 포함한 당지질 구조의 계면활성제의 분리 및 정제 방법으로는 유기 용매 등을 이용한 추출법, 버퍼 등을 이용한 결정화법 등이 대표적이며, 정제에 사용되는 물질에 따라 산화형 및 락톤형 소포로리피드 혼합물의 비율 및 조성이 달라지고, 순도 및 수율에도 영향을 준다. 앞선 정제 방법 가운데 유기 용매를 이용한 정제에서는 헥산 및 에틸아세트산을 주로 사용하는데, 유기 용매의 사용은 인체에 독성을 나타내기 때문에 잔류 용매가 제거되지 않으면 사용에 제약이 있으며, 그 정제 순도 또한 낮다. 버퍼 등을 이용한 결정화 방법은 산화형 및 락톤형 소포로리피드 가운데 특정 구조의 소포로리피드를 높은 순도로 분리할 수 있으나, 그 수율이 낮은 것이 단점이다. 그 외에도 컬럼을 이용한 정제 방법이 있으나, 소포로리피드의 회수가 어렵고, 유기 용매를 사용하기 때문에 유기 용매를 이용한 추출법과 마찬가지로 화장품 등 적용에 문제가 발생할 수 있다[Saraya Co., Ltd. (2015). E.P. Patent No. 2821495A1].
더욱이, 유기 용매를 이용한 추출 등을 통해 정제된 산화형 및 락톤형 소포로리피드 혼합물은 물질의 특성상 점도가 높아 화장품 제형에 있어 다루는 것이 용이하지 않으며, 특이취 및 탁한 색상 또한 화장품을 비롯한 세정제 등의 생활용품 등 다양한 분야의 적용에 있어 어려움이 있다. 특이취의 경우, 소포로리피드의 친수성기 부분의 아세틸기의 제거를 통해 개선될 수 있지만, 이를 위해서는 강염기 처리 또는 효소를 이용한 방법이 있는데, 소포로리피드가 분해되거나 그 전환 효율이 떨어지는 단점이 있다.
본 발명의 과제는 유기 용매 등을 사용하지 않는 친환경적인 방법을 통해 특이취, 색상 및 점도가 개선된 소포로리피드를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 달성하기 위해 본 발명은
(1) 캔디다 속 효모균 배양액의 소포로리피드 침전물을 한외여과하는 단계;
(2) 한외여과 잔류액에 에탄올과 활성탄을 추가하여 흡착시킨 후 활성탄 및 에탄올을 제거하는 단계; 및
(3) 단계 (2)로부터 얻어진 용액에 물을 혼합하여 수용액을 제조하고, 상기 수용액의 pH를 pH 5 이상 pH 7 미만으로 조절하는 단계
를 포함하는 소포로리피드 정제 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 유기용매를 사용하지 않는 친환경적인 방법을 통해, 특이취, 냄새, 색상, 유동성 등의 물성이 개선된 소포로리피드를 수득이 가능하므로 화장품 제형을 비롯한 다양한 분야에 적용이 가능하다.
도 1은 캔디다 속 효모균의 배양을 통해 생산된 소포로리피드 침전물을 분획분자량 10,000 Da 한외 여과막으로 여과한 후 분리된 소포로리피드의 확인을 위해 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)를 이용해 산화형 소포로리피드와 락톤형 소포로리피드의 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 캔디다 속 효모균의 배양을 통해 생산된 소포로리피드 침전물을 분획분자량 10,000 Da 한외 여과막으로 여과한 다음 분획분자량 3,000 Da 한외 여과막으로 분리하여, 분리된 소포로리피드의 확인을 위해 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)를 이용해 산화형 소포로리피드와 락톤형 소포로리피드의 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 한외여과 처리된 산화형 및 락톤형 소포로리피드 혼합물에 활성탄과 에탄올을 추가하여 흡착시킨 후 활성탄 및 에탄올을 제거하는 공정을 수행 전 및 후의 소포로리피드의 외관을 관찰한 사진이다.
도 4는 한외여과 처리된 산화형 및 락톤형 소포로리피드 혼합물에 활성탄과 에탄올을 추가하여 흡착시킨 후 활성탄 및 에탄올을 제거한 후, 소포로리피드의 확인을 위해 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)를 이용해 산화형 소포로리피드와 락톤형 소포로리피드의 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 활성탄 및 에탄올을 제거한 후 물을 혼합한 후 수용액의 pH를 조절한 뒤, 소포로리피드의 확인을 위해 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)를 이용해 산화형 소포로리피드와 락톤형 소포로리피드의 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 정제방법을 통해 정제된 소포로피리드 외관을 관찰한 사진이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 소포로리피드 제조방법은,
(1) 캔디다 속 효모균 배양액의 소포로리피드 침전물을 한외여과하는 단계;
(2) 한외여과 잔류액에 에탄올과 활성탄을 추가하여 흡착시킨 후 활성탄 및 에탄올을 제거하는 단계; 및
(3) 활성탄 제거 후 얻어진 용액에 물을 혼합하여 수용액을 제조하고, 상기 수용액의 pH를 pH 5 이상 pH 7 미만으로 조절하는 단계
를 포함한다.
이하 각 단계별로 상세히 설명한다.
(1) 캔디다 속 효모균 배양액의 소포로리피드 침전물을 한외여과한다 .
먼저 캔디다 속 효모균 배양액으로부터 생산된 소포로리피드 침전물을 회수하여 막 여과를 이용해 산화형 및 락톤형 소포로리피드를 분리 정제한다. 막 여과는 정제 대상이 되는 물질과 제거하고자 하는 불순물 등의 물질의 분자량 차이를 이용해 특정 공극 크기(Pore size)를 가진 막을 이용해 그 공극 크기를 기준으로 하여 물질을 분리 정제하는 방법이다.
구체적으로, 본 발명은 한외여과를 이용하여 소포로리피드 침전물로부터 산화형 및 락톤형 소포로리피드를 분리 및 정제한다. 이는 계면활성제의 구조적 특성 가운데, 양친매성 구조, 즉 한 분자 안에 친수성기와 소수성기를 모두 가지는 특성에 기인하는데, 유기용매나 수용액 내에서 pH 또는 온도에 따라 계면활성제가 특정 농도에 미셀(Micelle) 구조를 형성한다. 계면활성제가 계면에 흡착되어 계면 장력을 저하시키는데, 특정 농도 이상이 되면 계면 장력을 더 이상 감소시키지 않고 그 수치가 유지되며, 해당 농도를 임계 미셀 농도(CMC)로 정하게 되는데, CMC 이상의 농도에서는 미셀이 형성된다. 미셀은 계면활성제 단량체가 모여서 집적되는 집합체이다.
수용액에서는 계면활성제의 친수성 작용기 부분이 구 형태의 바깥으로 향하고, 소수성 작용기 부분이 가운데에 핵을 형성하는 구조를 가지는데, 이러한 구조를 미셀이라고 한다. 소포포리피드는 산화형 및 락톤형이 표준상태에서 각각 0.1 wt% 및 0.01 wt%의 CMC 값을 가지는데, 해당 농도 이상에서는 용해된 소포로리피드 외의 소포로리피드 단량체가 집적되어 미셀을 형성하게 된다. 계면활성제가 미셀을 형성하게 되면 물질의 구조 및 온도, 농도 등에 따라 집합체 내 그 계면활성제 단량체의 수가 달라지는데, 이는 Aggregation Number(NAgg)로 나타낼 수 있다. 문헌 상에서 소포로리피드의 Aggregation number는 6으로 즉, 소포로리피드가 미셀을 형성하게 되면 6개의 단량체가 하나의 미셀을 형성하게 된다. 산화형 및 락톤형 소포로리피드의 단량체 분자량이 각각 706 g/mol 및 688 g/mol 이므로, 수용액 상에서 소포로리피드는 미셀 구조로서 평균적으로 1 몰 당 산화형은 4240 g 그리고 락톤형은 4130 g의 분자량을 가지게 된다.
상기 소포로리피드의 미셀 구조 형성 시 분자량을 기준으로 하여, 분자량에 따른 막 여과 진행에 적합한 여과 막의 공극 크기를 선별하기 위해 제거 대상이 되는 배양액 조성 물질, 단백질, 대사산물들의 분자량을 확인하였다. 배양액 내 조성 물질 중 탄소원인 포도당은 180 g/mol, 불포화지방산을 포함한 오일류는 280 g/mol, 색소 성분은 약 400 g/mol 으로 대부분 1000 g/mol 이하이다. 단백질의 경우, 분자량의 분포가 넓어 분자량 10,000 Da 이상에서 상대적으로 큰 분자량의 단백질 제거를 위한 한외여과 처리가 필요하다. 이에 본 발명의 상기 한외여과는 포도당, 오일을 포함하는 배양액 조성물질, 단백질, 대사산물 등의 불순물을 제거하기 위해 분획분자량 10,000 Da 한외여과막으로 여과하는 단계와, 분자량 1,000 내지 3,000 Da 이하의 불순물을 분리하기 위해 분획분자량 1,000 내지 3,000 Da 한외여과막으로 여과하는 단계를 수행할 수 있다.
분획분자량 10,000 Da 한외여과막으로 여과하는 단계를 거쳐 단백질과 같은 큰 분자를 제거한 후, 분획분자량 1,000 내지 3,000 Da 한외여과막으로 여과하여 분자량 1,000 내지 3,000 Da 이하의 불순물을 분리한다. 이때, 물에 용해되지 않고 분산된 소포로리피드 및 미셀을 형성하는 소포로리피드는 막을 통과하지 못하고 여과 막 밖에서 농축되게 된다. 막 여과 진행으로 농축된 산화형 및 락톤형 소포로리피드 혼합물을 회수하여, 진공 농축 및 건조를 진행한다.
(2) 이어서 한외여과 잔류액에 에탄올과 활성탄을 추가하여 흡착시킨 후 활성탄 및 에탄올을 제거한다.
막 여과를 통해 분리 정제된 산화형 및 락톤형 소포로리피드 혼합물에 활성탄처리를 통해 높은 탁도의 갈색 색상과 이취 유발 물질을 제거하는 공정이다. 활성탄은 탄소를 주성분으로 하는 다공성 물질이며, 그 구조 및 특성에 따라 다양한 물질에 흡착능을 보인다. 식물, 석탄 등을 원료로 하며, 수증기 또는 인산 등의 산 처리를 통해 활성화가 진행되며, 그 입자의 크기에 따라 분말활성탄, 입상활성탄, 조립활성탄 등으로 분류된다. Å 단위의 미세한 기공이 활성탄 전체에 존재하여, 고체 분자뿐만 아니라 액체, 기체 분자 또한 흡착한다. 그 목적은 주로 탈색, 탈취 및 불순물 제거로 하며, 적용분야로는 대기오염방지, 폐수처리 등 다양하다.
소포로리피드는 물에 대한 용해도는 유기 용매에 비해 상대적으로 낮으며, 메탄올, 에탄올, 에틸아세트산 등 용매에 용해가 잘 되나 친환경 용매를 사용하기 위해 유기농 에탄올에 소포로리피드를 용해시켰다. 이때 에탄올은 순도 95% 이상인 것이 바람직하다. 유기농 에탄올에 소포로리피드 혼합물, 활성탄을 첨가한 후 교반을 진행한다.
소포로리피드 혼합물은 에탄올 100 중량부에 대해 5 내지 15 중량부, 활성탄은 에탄올 100 중량부에 대해 5 내지 15 중량부의 비율로 처리하여 수행할 수 있다. 활성탄의 처리량이 상기 범위 미만이면 첨가에 따른 탈색, 탈취 등의 효과가 미미하고, 반대로 상기 범위를 초과하면 첨가에 따라 탈색, 탈취 등의 효과가 더 이상 개선되지 않는다.
이때 활성탄은 분말, 조립, 입상, 시트상, 섬유상 등 어떠한 형상이든 관계 없이 사용할 수 있다. 구체적으로 이취 유발 물질 제거와 색상 및 탁도 개선을 위해 분말 활성탄을 사용하는 것이 바람직하다.
활성탄 처리를 마친 산화형 및 락톤형 소포로리피드는 여과를 통해 활성탄을 제거한 후 진공 농축을 통해 소포로리피드를 용해하였던 에탄올을 완전히 제거해준다. 유기농 에탄올을 사용하였지만, 에탄올이 잔류할 시 화장품 원료의 사용에서 피부에 자극을 유발할 수 있다. 에탄올 제거의 확인은 GC(Gas chromatography) 분석으로 한다. 잔류 에탄올이 제거된 산화형 및 락톤형 소포로리피드 혼합물은 그 점도가 굉장히 높아 고온에서는 유동성을 보이지만, 상온에서는 거의 유동성을 보이지 않는다.
(3) 활성탄 및 에탄올 제거 후 얻어진 용액에 물을 혼합하여 수용액을 제조하고, 상기 수용액의 pH를 pH 5 이상 pH 7 미만으로 조절한다.
점도 개선을 위하여 물을 첨가한 후 pH 조절을 통해 소포로리피드 혼합물의 유동성을 확보한다. 소포로리피드는 pH 5.0 이상에서 물에 대한 그 용해도가 높아지며, pH 7.0 이상에서는 소포로리피드 분자가 분해되는 경향이 있다. 소포로리피드가 물에 용해되면 pH 가 낮아지는데, 이에 착안하여 소포로리피드 혼합물에 물을 첨가하여 pH 가 5.0 이하로 떨어질 시 NaOH와 같은 염기를 계속적으로 첨가하여 pH를 5 이상 7 미만, 바람직하기로 pH 5 내지 6으로 조절한다. 이때 단계 (2)로부터 얻어진 용액과 물은 1:1 내지 7:3의 중량비로 혼합될 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 산화형 및 락톤형 소포로리피드 분리 정제
5 L 발효기 내 배지부피는 2 L 로서, 배지 1 L당 100.0 g 포도당, 5.0 g 비동물성 맥아 추출물, 1.0 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4·7H2O, 0.1 g, CaCl2·2H2O, 0.1 g NaCl, 50.0 g 유채유로 조성된 배양액을 이용해 유가식 배양(fed-batch culture) 를 수행하였다. 시드 배양액은 200 ml 배양 배지가 든 1 L 라운드형 삼각플라스크를 이용해 제조하였다. 미생물 균주가 가장 활발한 증식활동을 하는 early exponential phase에서 배양을 멈추고, 이 세포들을 회수한 후 시드 배양액으로 이용하여 발효기에 접종하였다. 배양조건은 배양온도 25℃ 용존 산소 농도(Dissolved Oxygen, DO) 30% 가 되도록 유지하며, pH 는 5.0으로 배양 배지를 제조한 후, 미생물이 성장하면서 pH 가 3.5로 감소하면, 4N NaOH 이용해 pH를 3.5로 일정하게 유지하였다. 배양액 내의 포도당과 오일의 농도가 일정수준 이하로 감소하게 되면, 간헐적 방법을 통해 포도당 농도 5~6%(w/v), 유채유 2~3%(w/v)를 유지할 수 있게 공급하도록 하였다.
상기 5 L 발효기를 이용해 최적화된 배양 조건에서 진행된 캔디다 봄비콜라 균주의 배양의 결과로, 360 시간 배양을 통해 250 g/L 의 생산농도와 0.69 g/L/h 의 생산성을 확인할 수 있었으며, 정치하여 층 분리한 후 하층에 침전된 소포로리피드 침전물을 회수하여 분리 정제 및 후속 공정을 진행하였다.
캔디다 속 효모균의 배양을 통해 생산된 소포로리피드 침전물로부터 배양액 조성물질, 단백질, 대사산물 등의 불순물을 제거하고 산화형 및 락톤형 소포로리피드 혼합물을 분리 및 정제하기 위해 막 여과, 상세하게는 한외 여과를 진행하였다. 배양액 내 단백질의 경우, 그 분자량 분포가 다양하며 상대적으로 큰 분자량의 단백질은 전처리를 통해 제거하여야 막 여과 진행 시 막이 막히는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 분획분자량 10,000 Da에 해당하는 공극 크기의 한외 여과를 진행하는 것은 1차적으로 분자량이 큰 단백질 및 불순물을 제거하는데 그 목적을 둔다.
여과에서 분리된 소포로리피드의 확인을 위해 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)를 이용해 산화형 소포로리피드와 락톤형 소포로리피드의 분석을 진행하였다. 최종적으로 소포로리피드를 20 % MeOH 에 용해시켜 분석 샘플을 만들었으며, 소포로리피드 HPLC 분석에서 사용된 컬럼은 Optimapak C18 이며, 분석 조건은 컬럼온도 25 ℃, UV detector 207 nm 이며, Acetonitrile(A)과 물을 이동상으로 사용하여 시간대별로 농도 gradient(0-15분 20%A, 15-40분 80%A, 40-50분 100%A, 50-70분 100%A, 70-80분 20%A)를 주어 0.5 ml/분의 flow rate 로 진행하였다.
도 1은 캔디다 속 효모균의 배양을 통해 생산된 소포로리피드 침전물을 분획분자량 10,000 Da 한외 여과막으로 여과한 후 분리된 소포로리피드의 확인을 위해 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)를 이용해 산화형 소포로리피드와 락톤형 소포로리피드의 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 1을 참조하면, 33 분 대에서 44 분 대 사이에 존재하는 산화형 소포로리피드의 피크, 그리고 49 분 대와 53 분 대에 존재하는 락톤형 소포로리피드의 피크를 확인할 수 있었다.
상대적으로 큰 분자량의 불순물이 제거된 산화형 및 락톤형 소포로리피드 혼합물의 분리 및 정제를 위해 분획분자량 3,000 Da에 해당하는 공극 크기의 한외 여과 막을 이용하여 막 여과를 진행하였다. 수용액에서 미셀을 형성하는 산화형 및 락톤형 소포로리피드의 경우 분자량 약 4,100 ~ 4,200 g/mol 이며, 배양액 조성물질 및 색소 물질 등 제거 대상이 되는 불순물의 분자량은 대부분 1,000 g/mol 이하로 예상된다. 막 여과 결과물을 농축 및 건조한 후 회수하여 HPLC 분석을 진행하였다. 막 여과 결과로 막 바깥 쪽에 농축된 산화형 및 락톤형 소포로리피드 혼합물을 회수하여 진공 농축 및 건조한 후 HPLC 분석을 진행하였다. 도 2를 참조하면, 당류 및 오일 등의 배양액 주요 조성물질은 제거되었으며, 산화형 및 락톤형 소포로리피드의 함량이 증가한 것을 확인할 수 있다.
상기 막 여과를 통해 회수한 산화형 및 락톤형 소포로리피드 혼합물은 탁한 색상과 이취를 가지고 있으며, 그 점도 또한 높아 화장품 제형에 사용하기에는 문제점이 있다. 따라서 소포로리피드 혼합물의 탁한 색상의 개선 및 이취 유발 물질의 제거를 목적으로 활성탄 처리를 진행하였다. 사용된 활성탄은 입자 크기에 따른 입상활성탄, 조립활성탄, 분말활성탄으로 분류하였으며, 더욱 상세하게는 전처리 방법 및 공극 크기에 따라 불순물 제거에 미치는 영향이 달라진다.
소포로리피드는 물에 비해 유기용매에 상대적으로 높은 용해도를 나타내며, 메탄올, 에탄올, 에틸아세트산 등의 유기용매가 이에 해당된다. 활성탄 처리에 있어 소포로리피드가 충분히 용해되어 있어야 활성탄과 접촉하여 활성탄이 본 기능을 할 수 있기 때문에 용매를 사용하되, 친환경적인 측면에서 유기농 에탄올을 사용하였다. 에탄올에 에탄올 100 중량부 대비 소포로리피드 10 중량부 첨가하여 용해한 후, 소포로리피드와 동일한 양의 조립활성탄, 입상활성탄 및 분말활성탄을 각각 첨가한 후 교반을 진행하였다. 12 내지 24 시간을 교반시킨 후 활성탄은 각각 여과를 통해 제거하고, 회수한 액은 진공농축 및 건조를 통해 소포로리피드 혼합물로부터 에탄올을 제거하였다. 잔류 에탄올은 GC 를 이용하여 분석하며, 불검출된 것을 확인하였다. 회수한 소포로리피드의 색 및 냄새에 관한 관능검사를 진행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, 분말활성탄으로 활성탄 처리를 한 소포로리피드 혼합물은 이취가 감소하여 거의 나지 않으며, 높은 탁도 및 갈색 색상에서 투명한 호박색을 띄며 탁한 색상 또한 개선되었다. 유동성 또한 활성탄 처리 전에 비해 개선된 것을 확인할 수 있다. 도 4를 참조하면, 최종적으로 막 여과 소포로리피드 혼합물 대비 80 % 이상의 회수율을 나타냈다.
막 여과 및 활성탄 처리를 통해 분리 및 정제된 산화형 및 락톤형 소포로리피드 혼합물은 그 함량이 높고, 이취 및 탁한 색상이 개선되었으나, 여전히 화장품 제형 등을 포함한 다양한 분야에서의 적용에 있어서는 높은 점도가 문제가 된다.
이를 개선하기 위해 소포로리피드 혼합물에 물을 혼합한 후 pH 조절을 통해 소포로리피드 혼합물의 유동성을 개선하고자 실험을 진행하였다. 소포로리피드는 pH 5.0 이상에서 물에 대한 상대적으로 높은 용해도를 보이며, 소포로리피드가 용해되면 pH 가 떨어지게 된다. 이에 착안하여, 소포로리피드와 물을 5:5, 6:4 또는 7:3 의 중량비로 하여 pH 가 5.0 이하로 떨어질 시 1N NaOH 를 첨가하여 pH 5.0 이상, 더욱 상세하게는 pH 6.0 으로 유지하였으며, pH 7.0 이상에서는 소포로리피드 분자가 깨지는 현상이 발생할 수 있다.
HPLC 분석 결과 높은 농도의 NaOH 첨가 시, 소포로리피드 분자 내 아세틸기가 제거가 동반되며, 분자가 깨지는 현상이 발생하는 것으로 미루어보아 NaOH 농도는 1N 로 고정하여 진행하였다. 소포로리피드 혼합물과 물이 층분리 없이 혼합되었을 때, pH 조절 및 교반을 중단하고 유동성을 확인하고 색 및 냄새에 대한 관능검사를 진행하였으며, 소포로리피드 혼합물의 함량을 확인하기 위해 HPLC 분석 또한 진행하였다. 그 결과로, HPLC 분석 결과, 아세틸기의 제거가 동반되었음을 확인하였고, 락톤형 소포로리피드의 함량이 낮아지고, 산화형 소포로리피드의 함량이 소량 늘어나 산화형 및 락톤형 소포로리피드의 비율이 40 : 60 이 되었다(도 5). 물 혼합 및 pH 조절 전의 높은 점도의 소포로리피드 혼합물의 유동성이 개선되어 기벽에 묻음이 없는 정도의 흐름성을 보였으며, 물이 혼합되어 색상이 희석되어 투명해지는 결과도 보였다(도 6).

Claims (4)

  1. (1) 캔디다 속 효모균 배양액의 소포로리피드 침전물을 한외여과하는 단계;
    (2) 한외여과 잔류액에 에탄올과 활성탄을 추가하여 흡착시킨 후 활성탄 및 에탄올을 제거하는 단계; 및
    (3) 단계 (2)로부터 얻어진 용액에 물을 혼합하여 수용액을 제조하고, 상기 수용액의 pH를 pH 5 이상 pH 7 미만으로 조절하는 단계를 포함하고,
    상기 한외여과는
    분획분자량 10,000 Da 한외여과막으로 여과하는 단계와,
    분획분자량 1,000 내지 3,000 Da 한외여과막으로 여과하는 단계를 포함하고,
    상기 활성탄은 에탄올 100 중량부에 대해 5 내지 15 중량부로 첨가되는 것인, 소포로리피드 정제 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 수용액의 pH는
    수산화나트륨(NaOH) 첨가에 의해 조절되는 것인, 소포로리피드 정제방법.
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