KR102578621B1

KR102578621B1 - 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 t세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR102578621B1
Application number: KR1020200169659A
Authority: KR
Inventors: 이흥규; 박장현
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2020-12-07
Filing date: 2020-12-07
Publication date: 2023-09-18
Also published as: KR20220080782A

Abstract

본 발명은 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 T세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 약학조성물은 생체 내 종양의 저산소 환경에서 암을 효과적으로 사멸시킬 수 있다. 특히 뇌-혈관 방어막(Blood-Brain Barrier)의 존재로 치료 및 면역체계의 활성화가 어려운 뇌암에서 생존율을 크게 향상시키는 효과가 있으므로, 보건 및 의료 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Description

저산소 유도인자 억제제로 전처리된 T세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물 {Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising T cells pretreated with inhibitor of hypoxia-inducible factors}

본 발명은 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 T세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

암은 전세계적으로 가장 보편적인 사망원인 중의 하나이다. 약 천만 건의 새로운 케이스가 매년 발생하며, 전체 사망원인의 약 12%를 차지하여 세 번째로 많은 사망의 원인이 되고 있다. 따라서 효과적인 항암제를 개발하고자 하는 노력이 지속되어 왔으나, 뇌암의 경우 효과적인 치료제 개발이 미흡한 실정이다. 뇌암은 특히 기본적인 치료에도 불구하고 5년 생존율이 36%, 평균 생존 기간이 약 1~2년으로 생존률이 짧은 편에 속하며, 재발 가능성이 매우 높아 치료가 까다로운 종양이다. 이는 뇌암에서 면역세포를 억제하는 면역억제 기전이 매우 활발하게 작동하며, 뇌라는 장기의 특성상 뇌-혈관 방어막(Blood-Brain Barrier)의 존재로 치료 및 면역체계의 활성화가 어려운 특성을 가지기 때문이다. 또한, 뇌암은 CD8 T 세포에게 인지되기 위해 필요한 1형 MHC 분자의 발현이 매우 낮다. 뇌종양 세포에서는 1형 MHC 분자 대신 자연살해세포 수용체인 NKG2D 리간드(MICA/B 등)를 매우 높게 발현한다는 것이 알려졌는데, 이로서 NKG2D를 사용하는 감마델타 T세포나 자연살해 세포 등이 뇌종양 치료에 적합한 세포로서 주목받고 있다.

면역세포를 치료제로 이용하는 항암면역치료제는 인체의 면역체계를 활성화시켜 인체가 고유하게 가지고 있는 면역 세포가 암 세포를 공격할 수 있도록 하는 치료 방법으로서, 기존의 방사선요법, 세포독성 치료제, 표적항암제와 작용메커니즘이 전혀 상이하다. 기존의 항암제의 경우에는 암세포의 DNA 또는 발현 단백질을 타겟으로 하여 사멸시키는 반면, 항암면역치료제의 경우에는 면역세포의 기능 및 활성에 중점을 두어 면역세포가 암세포의 사멸을 유도할 수 있도록 하는 것이다. 뿐만 아니라, 기존의 항암제의 경우에는 암세포 자체를 타겟으로 하는 것이나, 항암면역치료제의 경우에는 암세포뿐만 아니라, 암세포 주변에 존재하는 종양미세환경(tumor microenvironment)을 조절한다는 특징을 갖는다. 이와 같은 특징을 갖는 항암면역치료제는 면역세포가 갖는 고유의 기억능력 때문에, 암세포가 전혀 다른 성질로 변화되지 않는 한 내성에 대한 우려가 적다는 효과를 갖는다.

본 발명은 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 T세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분으로서 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 T세포는 항암면역치료제로서 효과적으로 기능하므로, 보건 및 의료 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
(선행문헌 1) Nasim Kheshtchin, et al. Inhibition of HIF-1α enhances anti-tumor effects of dendritic cell-based vaccination in a mouse model of breast cancer. Cancer Immunology, Immunotherapy, v.65, pp.1159-1167.
(선행문헌 2) Sadhak Sengupta. Gamma-delta T cells in glioblastoma immunotherapy. Glioma, v.2(1), pp.30-36.
(선행문헌 3) KyeongJin Kim, et al. A new aspect of an old friend: the beneficial effect of metformin on anti-tumor immunity. BMB Reports 2020, v.53(10), pp.512-520.

본 발명의 목적은 뇌암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 약학조성물은 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 T세포를 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 상기 T 세포는 뇌암에 침윤되어 뇌암 세포의 직접적 사멸을 유도할 수 있는 T 세포 중에서 특히 γδ T 세포일 수 있다.

본 발명의 상기 약학조성물은 메트포민과 병용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 뇌암의 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 뇌암의 예방 또는 치료용 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 T세포를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에 서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 "뇌암"은 교모세포종, 악성신경교종, 임파선종, 배아세포종 및 전이성 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 "예방"은 발명의 상기 조성물을 이용하여 뇌암으로 인해 발생한 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명의 "치료"는 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 뇌암의 침습으로 인해 발생한 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명의 “저산소 유도인자(Hypoxia-inducible factors, HIF) 억제제”는 세포에 대한 산소 공급이 부족 상태에 빠진 경우에 유도되어 오는 단백질의 발현, 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산이 전사되지 못하도록 억제하는 물질을 의미하는 것으로, 예를 들어 하기 표 1에 기재된 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 "메트포민"은 바이구아니드계(biguanides) 경구용 당뇨병치료제로 사용되는 약물로서, 혈당 개선효과가 있으나 심혈관질환을 예방하는 효과는 증거가 아직 제한적이다. 한편, 이러한 메트포민의 작용기전은 정확하게 밝혀지지는 않았으나, 1) 미토콘드리아에서 일어나는 세포호흡을 억제하고 2) AMPK를 활성화시키며, 3) 글루카곤에 의해 유도되는 cAMP(Cyclic adenosine monophosphate)의 농도 상승을 막아 결과적으로 PKA(Protein kinase A)의 활성을 억제하고 4) 장내의 정상세균총(gut flora)에도 영향을 준다고 알려져 있다. 본 발명의 목적상 상기 메트포민은 암 세포가 과도하게 산소를 소모하는 현상을 억제함으로써, 암 세포에 침윤된 면역세포에 발생되는 저산소증을 개선시킬 수 있다.

본 발명의 상기 메트포민은 뇌암 세포에서 소모되는 산소 양을 감소시켜, 뇌암 세포 주변의 저산소증이 개선시킬 수 있고, 이로 인하여 뇌암에 침윤된 γδ T 세포의 항종양면역반응과, 뇌암 세포를 직접 표적하여 사멸시킬 수 있는 기능이 회복되어 뇌암을 매우 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 일반적으로 암 세포에 직접적으로 영향을 미치는 항암제와는 달리, 인체의 면역체계를 활성화를 통해 자가면역력을 향상시켜 인체가 고유하게 가지고 있는 면역 세포가 암 세포를 공격할 수 있도록 하는 치료제로서, 본 발명의 목적상 상기 약학조성물은 뇌암 개체에 존재하는 T 세포의 기능 및 활성을 향상시킬 수 있는 치료제를 의미한다.

본 발명의 상기 약학조성물은 항암제 또는 면역치료제와 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 카페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈블라스틴, 이다루비신, 미토마이신, 블레로마이신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 올라파립, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 5FU, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 면역치료제는 펨브롤리주맙, 이필리머맙, 니보루맙, 아테졸리주맙 및 두르발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(Elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.

본 발명의 상기 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서 상기 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 상기 약학 조성물은 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 T세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 저산소 유도인자 억제제는 AFP464, KC7F2, Chetomin, SYP-5, MK-8617, DMOG, ZINC13466751, EL-102, (Rac)-PT2399, PT-2385, ML 228, LW6 (CAY10585), Vadadustat, IDF-11774, Desidustat, PT2977, HIF-2a Translation Inhibitor, DASA-58, GSK1278863 (Daprodustat), FG-4592 (Roxadustat), IOX 2, FM19G11, HIF-C2, BAY 87-2243, PX-478 HCl, Molidustat, Echinomycin, Oroxylin A, FG-2216, JNJ-42041935, 및 2-Methoxyestradiol로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 T 세포는 CD45, CD3 및 γδ TCR로 구성된 단백질이 발현된 세포인 것인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 CD45, CD3 및 γδ TCR로 구성된 단백질이 발현된 세포는 γδ T 세포인 것인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 면역치료제로 기능하는 것인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 약학조성물은 메트포민을 추가로 포함하는 것인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 암은 뇌암인 것인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하며, 상기 암은 암 줄기세포를 포함하는 것인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, T세포에 저산소 유도인자 억제제를 처리하는 단계;를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법을 제공하고, 상기 저산소 유도인자 억제제는 AFP464, KC7F2, Chetomin, SYP-5, MK-8617, DMOG, ZINC13466751, EL-102, (Rac)-PT2399, PT-2385, ML 228, LW6 (CAY10585), Vadadustat, IDF-11774, Desidustat, PT2977, HIF-2a Translation Inhibitor, DASA-58, GSK1278863 (Daprodustat), FG-4592 (Roxadustat), IOX 2, FM19G11, HIF-C2, BAY 87-2243, PX-478 HCl, Molidustat, Echinomycin, Oroxylin A, FG-2216, JNJ-42041935, 및 2-Methoxyestradiol로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법을 제공하며, 상기 T 세포는 CD45, CD3 및 γδ TCR로 구성된 단백질이 발현된 세포인 것인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법을 제공하며, 상기 CD45, CD3 및 γδ TCR로 구성된 단백질이 발현된 세포는 γδ T 세포인 것인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법을 제공하며, 상기 제조방법은 메트포민을 혼합하는 단계;를 추가로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법을 제공하며, 상기 암은 뇌암인 것인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법을 제공하며, 상기 암은 암 줄기세포를 포함하는 것인 암의 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 약학조성물은 생체 내 종양의 저산소 환경에서 암을 효과적으로 사멸시킬 수 있다. 특히 뇌-혈관 방어막(Blood-Brain Barrier)의 존재로 치료 및 면역체계의 활성화가 어려운 뇌암에서 생존율을 크게 향상시키는 효과가 있다.

도 1의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 세포주(GL261) 및 흑생종 세포주(B16F10)에서의 산소 소모량 값을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 비장(Spleen)과 뇌암에 침윤된 면역세포(Tumor-infiltrating lymphocytes; TIL)에서 저산소 정도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 조직 내 유전자들의 발현 수준과 저산소증 유전자 마커인 HIF1α(HIF1A)의 상관관계를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4의 A 내지 C는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암에 침윤된 면역세포들에서 PD-1(Programmed cell death protein 1), TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3) 및 어넥신 V(Annexin V)의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 A 내지 F는 본 발명의 일 실시예에 따른 항종양과 관련된 면역세포를 결핍시킨 생쥐의 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 세포주(GL261)에 메트포민(metformin)을 처리한 뒤, 세포 사멸 유도 여부를 확인하고(A), 미토 스트레스 테스트(mito stress test)를 통해 산소 소모량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 유도 생쥐의 뇌 조직에서 공초점 현미경을 통해 산소 소모량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8의 A 내지 D는 본 발명의 일 실시예에 따른 메트포민에 의한 뇌암 유도 생쥐의 생존율(A), 저산소증(B), 종양 부피(C) 및 종양 무게(D)의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 메트포민에 의한 항종양 활성 기전을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10의 A 내지 D는 본 발명의 일 실시예에 따른 γδ T 세포에서 메트포민에 의한 저산소증 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 메트포민에 의한 저산소증 개선으로 인하여 γδ T 세포의 항종양 기능 회복을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12의 A 내지 C는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암에 침윤된 γδ T 세포에 발현되는 단백질의 발현 수준(A 및 B)과, 상기 세포로부터 발현되는 그랜자임 B(granzyme B)의 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 메트포민 투여와 γδ T 세포 주입의 병용투여에 따른 항종양 생존율 향상 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 세포주인 GL261에서 발현되는 H-2Kb 및 Rae-1 단백질의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 주입 생쥐에서 메트포민 및 항-TCR γδ 항체에 의한 생존율 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16의 A 내지 I는 뇌암에 침윤된 면역세포에서 발현되는 유전자의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 사람 말초혈액단핵세포(PBMC)의 분화 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 in vitro에서 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 γδ T 세포의 항뇌종양 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 in vivo에서 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 γδ T 세포의 항뇌종양 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[실시예 1] 뇌암 세포주 및 흑색종 세포주간의 산소 소모량 비교

XF96 세포 배양 마이크로플레이트(Agilent, 101085-004)의 각 웰 당 5,000개씩 뇌암 세포주 GL261(이하, 'GL261 세포주'라 함) 또는 흑색종 세포주 B16F10(이하, 'B16F10 세포주'라 함)을 각각 분주한 후 10% 우태아혈청과 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)이 포함된 DMEM을 넣고, 37℃ 및 5%의 CO₂ 조건 하에서 하루 저녁 동안 배양하였다. 배양이 완료된 세포를 멸균된 PBS(Phosphate-buffered saline)를 이용하여 세척한 뒤, 25 mM의 글루코스(glucose), 1 mM의 피루베이트(pyruvate) 및 2 mM의 글루타민(glutamine)이 포함된 XF 기초 배지 미니멀 DMEM(Agilent, 102353-100)으로 배지를 교체하고, 37℃, CO₂가 존재하지 않는 조건 하에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음, XFe96 바이오에널라이저(Bioanalyzer; Agilent)를 이용하여 미토 스트레스 테스트(Mito stress test)를 시행하였다. 여기서, 상기 미토 스트레스 테스트를 위하여, 상기 세포주에 하기 표 2에 나타낸 시료를 각각의 조건으로 처리하였다.

시홀스 웨이브 소프트웨어(Seahorse Wave software; Agilent)를 사용하여 산소 소모량(oxygen consumption rate; OCR, pmol/min) 값을 측정하여, 그 결과를 도 1의 A 및 B에 나타내었다.

도 1의 A에서 보는 바와 같이, B16F10 세포주와 비교하여, GL261 세포주에서 100 pmol/min 만큼 산소 소모량이 높은 것을 확인하였다.

도 1의 B에서 보는 바와 같이, 기초 산소 소모량(baseline OCR) 및 최대 산소 소모량(Maximal OCR) 모두 B16F10 세포주와 비교하여, GL261 세포주에서 높은 수준으로 나타나는 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해 뇌암의 경우에는 흑색종과 같은 기타 암종과 비교하여 산소 소모량이 증가되어 있어, 주변 조직에 저산소증을 유발할 수 있는 가능성이 매우 높은 것을 알 수 있다.

[실시예 2] 저산소증에 의한 뇌암 침윤 면역세포의 상태 분석

8주령의 수컷 C57BL/6 생쥐의 뇌에 5 × 10⁴개의 GL261 세포주를 주사하고, 20일 후 상기 생쥐를 안락사 한 뒤 해부하여 비장과 뇌를 분리하였다. 상기 안락사를 수행하기 1.5시간 전에 60 mg/kg의 피모니다졸(pimonidazole) (Hypoxyprobe)을 복강 주사였다.

상기 분리된 비장을 스트레이너(Strainer; SPL, 93070)를 이용해 갈아, 세포를 분리한 후 ACK 용해 완충액을 처리하여 적혈구를 제거하였다. 또한, 2 mg/ml의 콜라게나제 IV(Collagenase IV; Worthington Biochemical Corp) 및 30 μg/ml의 디엔에이즈 I(DNase I; Roche)이 포함된 미디어에 상기 뇌를 조각내어 넣고 30분간 37℃에서 배양하였다. 그런 다음, 상기 뇌 조각을 스트레이너에 넣고 잘게 갈은 뒤, 이를 30%/70%의 구배의 퍼콜(percoll; GE Healthcare, 17-0891-01)에 넣고 원심분리하여, 단핵 세포를 수득하였다. 이렇게 수득된 단핵 세포에 ACK 용해 완충액을 처리하여 적혈구를 제거하였다. 이렇게 얻어진 각각의 세포들에 CD16/32 (2.4G), CD45.2 (104), CD3 (145-2C11), CD8 (53-6.7), CD4 (GK1.5) 및 γδTCR (GL3)에 특이적인 항체를 넣고 4℃에서 30분간 배양하였다.

이후, FoxP3 fix/perm 완충액 세트(Biolegend)를 이용하여 세포를 고정하고 투과화 한 뒤, 상기 세포들에 항-피모니다졸(pimonidazole; Hypoxyprobe)을 넣고 30분간 4℃에서 배양하는 과정을 통해 상기 세포들을 염색하였다. 비장과 뇌암 조직에 존재하는 T세포(CD45+CD3+γδTCR-) 및 γδ T 세포(CD45+CD3+γδTCR+)에서 저산소 프로브(Hypoxy probe)의 형광발현정도(gMFI)를 LSR Fortessa (BD bioscience) 유세포 분석기를 이용하여 측정하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 비장(Spleen)에 존재하는 면역세포와 비교하여 뇌암에 침윤된 면역세포(tumor-infiltrating lymphoma; TIL)의 T 세포 및 γδ T 세포의 저산소 정도가 2배 이상 높았다.

[실시예 3] 저산소증에 의한 뇌암 침윤 면역세포의 상태 분석(1)

뇌암 내 저산소증이 면역세포에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, TCGA 데이터를 이용하여 뇌암 환자들의 조직에서 유전자 발현의 상관관계를 분석하였다.

구체적으로, TCGA 공개 데이터 소스를 기반으로 (http://cancergenome.nih.gov), 공개된 환자의 뇌암 조직 내 유전자들의 mRNA 발현 정도에 따라 저산소증의 대표적인 유전자 마커에 해당하는 HIF1α(HIFA)와 T 세포 탈진과 관련되어 있는 CD274, 및 세포 자살과 관련된 CASP3 유전자 발현의 상관관계를 cBioPortal (https://www.cbioportal.org)을 통해 분석하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, HIF1α(HIF1A)의 발현 수준이 증가되어 있는 조직일수록 CD274 및 CASP3의 발현 수준이 증가되어 있음을 확인하였다.

상기 결과를 통해 뇌암 내 발생되는 저산소증은 면역세포의 기능 저하와 관련성이 매우 높은 것을 알 수 있다.

[실시예 4] 저산소증에 의한 뇌암 침윤 면역세포의 상태 분석(2)

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수득한 비장 및 뇌암 조직으로부터 얻은 단핵 세포에 CD16/32 (2.4G), CD45.2 (104), CD3 (145-2C11), CD8 (53-6.7), CD4 (GK1.5), γδTCR (GL3), PD-1 (RMP1-30), TIM-3 (RMT3-23) 및 어넥신 V(Annexin V; PK136)에 특이적인 항체를 넣고, 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 그런 다음, CD4 T 세포 (CD45+CD3+γδTCR-CD4+), CD8 T 세포 (CD45+CD3+γδTCR-CD8+) 및 γδ T 세포 (CD45+CD3+γδTCR+)에서 PD-1, TIM-3 및 어넥신 V의 발현 수준을 FACS Fortessa 유세포 분석을 통해 분석하여, 그 결과를 도 4의 A 내지 C에 나타내었다.

도 4의 A 내지 C에서 보는 바와 같이, 비장(Spleen)에 존재하는 정상적인 면역 세포와 달리, 뇌암에 침윤된 면역세포에 존재하는 면역 세포인 CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 γδ T 세포 모두에서 탈진 마커에 해당하는 PD-1 및 TIM-3와, 세포자살 마커에 해당하는 어넥신 V의 발현 수준이 매우 높은 수준으로 존재하는 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해 뇌 암 세포의 과도한 산소 소모로 인하여 뇌암에 침윤된 면역세포들이 저산소 상태에 빠져 제대로된 면역 기능을 수행하지 못함을 알 수 있다.

[실시예 5] 뇌암에 침윤된 면역세포의 억제에 의한 생존율 변화 확인

8주령 C57BL/6 생쥐, CD8-/- 생쥐 또는 TCRδ -/- 생쥐의 뇌에 5 × 10⁴의 GL261 세포주를 주입하였다. 여기서, 상기 C57BL/6 생쥐에는 면역세포의 제거를 위해, 암 세포의 주입 전에는 2일 전 및 1일 전에 복강 주사를 통해 200 μg/쥐의 양으로 하기 표 3에 기재된 바와 같이 항체를 주입하고, 암 세포의 주입 후에는 7일 간격으로 3일 동안 항체를 주입하였다. 이와 같이 항체가 주입된 생쥐를 40일 동안 관찰하여 생존율을 측정하여, 그 결과를 도 5의 A 내지 F에 나타내었다.

도 5의 A 내지 F에서 보는 바와 같이, 항종양과 관련되어 있는 면역세포인 CD4 T 세포, CD8 T 세포, NK 세포 및 γδ T 세포 각각을 결핍시킨 모든 경우에서 생쥐의 생존율이 대조군과 동일하였다.

상기 결과를 통해 일반적으로 항종양과 관련된 면역세포를 결핍시켰을 때에는 생존율이 현저하게 감소되는데, 본 발명의 경우에는 생존율이 감소되지 않는 것으로 보아 뇌암에 침윤된 면역세포가 제대로된 기능을 수행하지 못하고 있음을 알 수 있다.

[실시예 6] 메트포민에 의한 뇌암 세포주의 산소 소모량 감소 확인

24웰 플레이트(Eppendorf)의 각 웰에 1 × 10⁵ 개의 GL261 세포주를 분주한 후, 10% 우태아혈청과 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)이 포함된 DMEM을 넣고, 37℃ 및 5%의 CO₂ 조건 하에서 하루 저녁 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포를 PBS를 이용하여 세척한 뒤, 0.1 mM 또는 5 mM의 메트포민(metformin; TCI, M2009)이 포함된 DMEM 배지로 교체하고 24시간 동안 추가로 배양하였다.

이후, 상기 배양된 세포를 트립신을 이용하여 플레이트에서 탈착시킨 뒤, 어넥신 V에 특이적인 항체를 넣고 4℃에서 30분 동안 배양한 뒤, 7-AAD (BD Biosciences)를 처리하고, FACS caliber (BD Biosciences)를 이용하여 유세포분석을 수행하여, 그 결과를 도 6의 A에 나타내었다. 또한, 상기 배양된 세포에서 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 산소 소모량을 측정하여, 그 결과를 도 6의 B에 나타내었다.

도 6의 A에서 보는 바와 같이, 1 mM의 메트포민을 처리한 경우뿐만 아니라, 뇌암 세포주에 5 mM에 해당하는 고용량의 메트포민을 직접 처리한 경우에 세포 사멸과 관련된 마커인 어넥신 V 및 7-AAD의 발현 수준이 증가되지 않았다.

도 6의 B에서 보는 바와 같이, 메트포민을 처리한 경우에 GL261 세포주의 사멸이 유도되지 않았으나, 뇌암 세포주에서 소모되는 산소량이 1 mM의 메트포민을 처리한 경우에는 50 pmol/min 감소되었으며, 5 mM의 메트포민을 처리한 경우에는 100 pmol/min 이상 감소되었다.

상기 결과를 통해, 메트포민은 뇌암 세포에 직접 작용하여 암 세포의 사멸을 유도할 수는 없으나, 뇌암 세포주가 소모하는 산소의 양을 현저하게 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 7] 메트포민에 의한 뇌암 조직의 산소 소모량 감소 확인

C57BL/6 생쥐의 뇌에 5 × 10⁴개의 GFP가 형질전환된 뇌암 세포주(이하, GL261-GFP라 함)를 주사하였다. 상기 GL261-GFP를 주사한 때부터 5 mg/ml의 메트포민 (TCI, M2009)를 음수에 넣어, 생쥐가 섭취할 수 있도록 하였다. 이때, 대조군으로는 물(DW)만을 섭취할 수 있도록 하였다. GL261-GFP를 주사한지 20일이 지난 후에 생쥐의 복강 내에 60 mg/kg의 피모니다졸 (Hypoxyprobe)을 주사하고 1.5시간 뒤에 상기 생쥐를 다음과 같은 과정을 통해 해부하였다. 우선, 생쥐의 심장에 PBS를 주사하여 관류한 다음, 4% PFA(Perfluoroalkoxy alkane)를 주사하여 관류하였다. 상기 생쥐의 뇌를 분리하여 4% PFA에 상온에서 1시간 고정시킨 후, 30% 수크로즈 용액에 넣어 4℃에서 3일간 배양하는 과정을 통해 탈수하였다. 이후, 상기 조직을 OCT 화합물 (Skura Finetek, 4583)에 넣고 블록을 만들어 동결시킨 뒤, 상기 블록을 20 μm의 두께로 잘랐다. 이렇게 얻어진 뇌암 조직 샘플에 0.3% Triton X-100과 5% 염소 혈청(Goat Serum)이 포함된 DPBS (랩마스터)를 처리하여 차단하였다. 그런 다음, 상기 뇌암 조직 샘플을 세척하고, APC가 결합된 항-피모니다졸과 함께 4℃에서 밤새도록 배양하는 과정을 통해 염색하였다. 마지막으로 상기 염색이 완료된 뇌암 조직 샘플을 세척한 뒤 DAPI가 첨가된 마운팅 용액 (Abcam, ab104139)을 처리한 뒤, 공초점 현미경(LSM80, Zeiss)로 관찰하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 보는 바와 같이, 뇌암이 유도된 생쥐의 뇌암 조직에서 물을 섭취한 경우(DW)와 비교하여 메트포민(Met)을 섭취한 경우에서 저산소증 마커인 항-피모니다졸이 존재하는 수준이 현저하게 감소되었다.

상기 결과를 통해 뇌암 세포주 모델에서와 동일하게 동물 모델에서 역시 메트포민을 처리하였을 때 뇌암 조직 내에서 저산소증이 현저하게 감소되는 것을 알 수 있다.

[실시예 8] 메트포민에 의한 뇌암 조직의 산소 소모량 감소를 통한 생존율 향상 효과 확인

상기 실시예 7과 동일한 방법으로 GL261 세포주가 주입된 생쥐에게 메트포민을 음수하도록 한 뒤, 40일 동안 생존율 및 뇌암 조직에서의 저산소증 정도를 측정하여, 그 결과를 도 8의 A 및 B에 나타내었다.

또한, 상기 생쥐의 뇌암 조직을 칼리퍼(Caliper)를 이용하여 장축(a) 및 단축(b)의 길이를 측정하고, (a × b²)/2의 공식에 따라 뇌암 조직의 부피를 측정하여, 그 결과를 도 8의 C에 나타내었다.

또한, 상기 생쥐에 뇌암 세포주가 주입된지 20일(d20) 및 25일(d25)째 되는 날 상기 생쥐의 뇌를 분리하여, 뇌암 부분을 적출한 뒤 저울을 이용하여 무게를 측정하여, 그 결과를 도 8의 D에 나타내었다.

도 8의 A 및 B에서 보는 바와 같이, 메트포민(Metformin)을 음수하도록 한 경우에는 대조군(DW)과 비교하여 5일 이상 생존율이 증가되었고(A), 뇌암 조직의 저산소증 역시 감소되었다(B).

도 8의 C 및 D에서 보는 바와 같이, 메트포민(Metformin)을 음수하도록 한 경우에는 대조군(DW)과 비교하여 25일 째에 종양 부피(tumor volume) 및 무게(weight) 모두 감소되었다.

상기 결과를 통해 메트포민은 뇌암 조직의 산소 소모량을 감소시킴으로써, 뇌암 조직의 부피 및 무게를 감소시켜 궁극적으로 생존율을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 9] 메트포민의 항 종양 활성 기전 확인(1)

상기 실시예 7과 동일한 방법으로 흉선이 없는 누드 생쥐(KOATECH)의 뇌에 5 × 10⁴개의 GL261 세포주를 주입하고, 메트포민을 음수하도록 한 뒤에 생존율을 확인하여, 그 결과를 도 9의 A에 나타내었다.

도 9의 A에서 보는 바와 같이, 흉선이 존재하지 않는 누드 생쥐에서는 대조군(DW)와 메트포민(metformin)을 음수하도록 한 경우 모두에서 생존율의 유의미한 차이가 확인되지 않았다.

상기 결과를 통해 메트포민에 의한 생존율이 개선되는 효과는 메트포민 자체가 암 세포주를 직접 사멸시켜 발휘되는 것이 아닌, T 세포를 매개하여 발휘되는 것임을 알 수 있다.

[실시예 10] 메트포민의 항 종양 활성 기전 확인(2)

상기 실시예 7과 동일한 방법으로 C57BL/6 생쥐의 뇌에 5 × 10⁴개의 GL261 세포주를 주입하고, 메트포민을 음수하도록 하였다. 상기 뇌암 세포주를 주입한지 20일째 상기 생쥐의 뇌를 적출하여 스트레이너로 잘게 갈았다. 그런 다음, 상기 잘게 갈린 뇌 조직을 원심분리하여 상등액을 수득한 뒤, 상등액에 존재하는 IFN-γ의 양을 ELISA를 이용하여 측정하여, 그 결과를 도 9의 B에 나타내었다.

도 9의 B에서 보는 바와 같이, 대조군(DW)과 비교하여 메트포민을 음수한 경우에 항 종양 효과를 발휘하는 사이토카인인 IFN-γ의 양이 4배 이상 증가되었다.

상기 결과를 통해 메트포민은 종양 세포의 과다 산소 소모로 인한 면역 세포의 저산소증을 개선시킴으로써, IFN-γ와 같은 항 종양 사이토카인을 분비할 수 있는 정상적인 기능을 발휘하여 뇌암이 치료되도록 할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 11] 메트포민의 항 종양 활성 기전 확인(3)

상기 실시예 7과 동일한 방법으로 C57BL/6 생쥐의 뇌에 5 × 10⁴개의 GL261 세포주를 주입하고, 메트포민을 음수하도록 하였다. 상기 뇌암 세포주를 주입한지 20일째 되는 날 뇌 조직을 적출하여 잘게 조각내었다. 그런 다음, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 단핵 세포를 분리한 뒤, 아래의 항체들과 함께 배양하여, γδ T 세포 (CD45+CD3+γδTCR+)의 분포를 FACS Fortessa (BD Bioscience) 유세포 분석기를 통해 분석하여, 그 결과를 도 10의 A에 나타내었다. 여기서, 사용된 항체는 CD16/32 (2.4G), CD45.2 (104), CD3 (145-2C11), γδTCR (GL3)에 특이적인 항체를 사용하였다.

또한, 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 C57BL/6 생쥐의 뇌에 5 × 10⁴개의 GL261-GFP를 주입하고, 메트포민을 음수하도록 한 뒤에 공초점 현미경을 이용하여 저산소증 정도를 확인하여, 그 결과를 도 10의 B에 나타내었다. 단, 여기서 관찰을 위한 항체는 Alexa Fluor 647이 결합된 염소 항-알메니안 햄스터 IgG(jackson, 127-605-160)를 사용하였다.

도 10의 A 및 B에서 보는 바와 같이, 대조군(DW)과 비교하여 메트포민을 음수함으로써, 저산소증이 완화된 경우에 γδ T 세포의 수가 3배 증가되었다.

[실시예 12] 메트포민에 의한 γδ T 세포의 저산소증 개선 효과 확인

상기 실시예 7과 동일한 방법으로 C57BL/6 생쥐의 뇌에 5 × 10⁴의 GL261 세포주를 주입하고, 메트포민을 음수하도록 하였다. 상기 뇌암 세포주를 주입한지 20일째 되는 날 뇌 조직을 적출하여 잘게 조각내었다. 그런 다음, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 단핵 세포를 분리한 뒤, 아래의 항체들과 함께 배양하여, γδ T 세포 (CD45+CD3+γδTCR+)의 분포를 FACS Fortessa (BD Bioscience) 유세포 분석기를 통해 분석하여, 그 결과를 도 10의 C 및 D에 나타내었다. 여기서, 사용된 항체는 CD16/32 (2.4G), CD45.2 (104), CD3 (145-2C11), γδTCR (GL3) 및 HIF1α(IC1935P)에 특이적인 항체를 사용하였다.

도 10의 C 및 D에서 보는 바와 같이, 대조군(DW)과 비교하여 메트포민을 음수함으로써, 뇌암에 침윤된 γδ T 세포에서 저산소증 프로브 및 HIF1α의 측정 값이 감소되었다.

상기 결과를 통해 메트포민은 종양 세포의 과다 산소 소모로 인한 면역 세포의 저산소증을 개선시킴으로써, γδ T 세포의 저산소증을 현저하게 개선시킬 수 있고 이를 통해 궁극적으로 뇌암을 매우 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 13] 메트포민에 의한 γδ T 세포의 항종양 기능 회복 확인(1)

상기 실시예 7과 동일한 방법으로 GL261 세포주가 주입된 C57BL/6 생쥐에게 메트포민(Met) 또는 물(DW)을 음수하도록 한 뒤, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 상기 생쥐의 뇌에서 분리된 단핵 세포를 분리하였다. 그런 다음, CD16/32 antibody (2.4G), CD45.2 (104), CD3 (145-2C11), γδTCR (GL3), PD-1 (RMP1-30), TIM3 (RMT3-23) 및 어넥신 V (PK136)에 특이적인 항체를 이용하여 염색한 뒤, 유세포 분석기를 통해 분석하여, 그 결과를 도 11의 A에 나타내었다.

또한, 상기 단핵 세포에 50 ng/ml의 PMA 및 1 μg/ml의 이노마이신과 1/1500으로 희석된 골지 플러그(BD Bioscience)를 처리하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, IFNγ (XMG1.2) 또는 TNFα (MP6-XT22)에 특이적인 항체와 함께 배양하고, 유세포 분석기를 통해 분석하여, 그 결과를 도 11의 B에 나타내었다.

도 11의 A 및 B에서 보는 바와 같이, 물(DW)만을 음수하도록 한 경우와 비교하여 메트포민(Met)을 음수하도록 한 경우에, 뇌암에 침윤된 면역세포인 γδ T 세포에서 PD-1 및 어넥신 V의 발현 수준이 감소되었고(A), γδ T 세포로부터 생성되는 IFNγ의 발현 수준이 10% 증가되었으며, TNFα의 발현 수준이 5% 증가되었다.

상기 결과를 통해, 메트포민에 의해 뇌암의 세포에서 세포 호흡이 감소됨으로써, 뇌암에 침윤된 면역세포의 산소 소모량이 정상 수준으로 회복되어 향상된 항 종양 기능으로 인해 뇌암을 매우 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 14] 메트포민에 의한 γδ T 세포의 항종양 기능 회복 확인(2)

상기 실시예 13과 동일한 조건으로 분리된 단핵 세포와 CD16/32 (2.4G), CD45.2 (104), CD3 (145-2C11), γδTCR (GL3), CD44 (IM7), CD27 (LG.7F9), NKG2D (CX5) 및 그랜자임 B (Granzyme B; NGZB)에 특이적인 항체를 함께 배양하여 염색한 뒤, 유세포 분석기를 통해 분석하여, 그 결과를 도 12의 A 내지 C에 나타내었다.

도 12의 A 내지 C에서 보는 바와 같이, 물(DW)만을 음수하도록 한 경우와 비교하여, 메트포민(Met)을 음수하도록 한 경우에, 뇌암에 침윤된 γδ T 세포 (CD45+CD3+γδTCR+)에서 CD44, CD27 및 NKG2D의 발현 수준이 증가되었고, γδ T 세포 (CD45+CD3+γδTCR+)로부터 생성되는 그랜자임 B의 발현 수준이 증가되었다.

상기 결과를 통해, 메트포민에 의해 뇌암 세포 주변의 저산소증이 개선됨으로써, 뇌암에 침윤된 γδ T 세포의 항종양면역반응과, 뇌암 세포를 표적하여 사멸시킬 수 있는 기능이 회복되어 뇌암을 매우 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 15] 메트포민에 의한 γδ T 세포의 항종양 기능 회복 확인(3)

저산소증 개선을 위한 메트포민 투여와 γδ T 세포 주입의 병용투여 효능을 검증하기 위해 면역결핍 NOG 마우스에 U87MG 암세포를 뇌에 심고 1주일 뒤 γδ T 세포를 같은 곳에 1/100의 비율로 주입하였다. 이 때에 메트포민은 음수로 마우스에 제공하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에서 보는 바와 같이, γδ T 세포 주입 시 뇌종양에 대해 생존이 조금 개선되는 결과를 보였지만, 그 효과가 현저하지는 않았다. 그러나 메트포민 병용투여 시 생존율이 약 80%로 증가되었다.

[실시예 16] 표적 세포에서 γδ T 세포의 리간드 발현 여부 확인

GL261 세포주가 실제 γδ T 세포의 표적이 되는지 확인하기 위하여, 상기 GL261 세포주와 H-2Kb (AF6-88.5.5.3) 및 Rae-1 (186107)에 특이적인 항체를 4℃에서 30분 동안 배양한 뒤, 유세포 분석기를 통해 분석하여, 그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에서 보는 바와 같이, GL261 세포주에서 H-2Kb의 발현 수준은 대조 피크와 비교하여 거의 유사한 정도에 불과한 반면, Rae-1의 발현 수준은 대조 피크와 비교하여 매우 높은 수준으로 증가되었다.

상기 결과를 통해 뇌암 세포주는 H-2Kb를 인지하는 CD8 T 세포가 아닌 Rae-1을 인지하여 세포 사멸을 유도하는 γδ T 세포에 의해 항종양면역반응이 일어나는 것을 알 수 있다.

[실시예 17] 표적 세포에서 γδ T 세포의 리간드 발현 여부 확인

상기 실시예 7과 동일한 방법으로 GL261 세포주가 주입된 C57BL/6 생쥐에게 메트포민(Met) 또는 물(DW)을 음수하도록 하였다. 이때, 상기 GL261 세포주의 주입 후 21일까지 7일마다 200 ㎍/쥐의 양으로 항-TCR γδ 항체(BioXcell) 또는 알메니안 햄스터 IgG(BioXcell)를 복강주사 한 뒤, 40일까지 생존율을 확인하여, 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에서 보는 바와 같이, 물만 음수하도록 한 생쥐에게 알메니안 햄스터 IgG(DW + IgG)를 주사한 경우 생존율이 30%가 안되었으나, 메트포민을 음수하도록 한 생쥐에게 알메니안 햄스터 IgG(Met+IgG)를 주사한 경우 생존율이 35%로 현저하게 증가되었다. 이렇게 메트포민을 음수하도록 하였을 때 생존율이 증가되는 현상은 항-TCR γδ 항체의 주사(Met+anti-γδTCR)에 의해 사라지는 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 메트포민에 의한 뇌암 생쥐의 생존율 증가 효과는 γδT 세포의 항종양면역반응에 의한 것임을 알 수 있다.

[실시예 18] 메트포민에 의한 γδ T 세포의 활성화 기전 확인

[18-1] 유전자 발현 분석 방법

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 물 또는 메트포민을 음수하도록 한 생쥐로부터 분리된 단핵 세포와 CD16/32 (2.4G), CD45.2 (104) 및 CD11b (M1/70)에 특이적인 항체를 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 그런 다음, 7-AAD(BD bioscience)를 처리한 뒤에 FACS Aria Ⅱ(BD bioscience) 유세포 분석기를 이용하여 CD45^hi 뇌암에 침윤된 면역세포(이하, 'CD45^hi TIL'이라 함)를 분리하였다. 이후, 10X 게노믹 크로미움 싱글-세포 3' v3 키트(genomic Chromium single-cell 3' v3 kit)를 이용하여 상기 분리된 CD45^hi TIL의 RNA 라이브러리를 제작하고, 마크로젠(한국)에서 HiSeqXten (Illumina)를 이용하여 10,000 세포/샘플 깊이(depth)로 넥스트 제너레이션 시퀀싱을 수행하였다. 시퀀싱 결과를 세포 레인저(Cell Ranger; 10X genomics, version 3.0.0)으로 로우 FASTQ 데이터를 가공하고, 참조 게놈으로 쥐 게놈 10-3.0.0(10X genomics)을 사용하여 메트릭스를 만들었으며, 전사 카운트와 세포 바코드 정보를 가공하였다. 데이터 분석은 R을 이용하여 Seurat 분석 방법을 이용하였으며, 낮은 질의 세포를 배제하기 위하여 RNA 발현량이 200 이하이거나, 물만을 음수하도록 한 경우에는 7500 이상 또는 메트포민을 음수하도록 한 경우에는 6000이상인 세포를 분석에서 제외하였다. 최종적으로 얻어진 각 데이터는 일반화데이터 함수를 이용하여 일반화한 뒤, FindVariablefeature 함수를 이용하여 유전자의 발현량을 확인하고, FindIntegrationancors 및 IntegrateData 함수를 이용하여 물만을 음수하도록 한 군의 데이터와 메트포민을 음수하도록 한 군의 데이터 값을 병합하였다. 이후, PCA(principle component analysis)를 통해 20개의 유의한 PC를 확인하였다.

FindNeighbors함수와 FindClusters 함수를 이용하여 세포들을 resolution 0.5로 세포들을 클러스터링 하고, 상기 PC들을 RunUMAP 함수를 이용해 가시화하였다. 그런 다음, 상기 클러스터들의 마커 유전자들을 FindMarkers 함수를 이용하여 확인하였으며, 이와 같이 확인된 마커들을 통해 상기 세포들의 클러스터의 리니지(lineage)를 결정하였다. 상기 확인된 마커들 중에서, γδ T 세포에서 발현되는 주요 마커에 해당하는 Trdc 유전자의 분포를 Feature Plot 함수를 통해 가시화하였다.

또한, 물만을 음수하도록 한 군의 데이터와 메트포민을 음수하도록 한 군의 데이터 값에서 FindMarker 함수를 이용하여 양 군에서 다르게 발현되는 마커를 확인하였고, 이렇게 확인된 마커 중에서 p 값이 0.05 이하로 나타나는 마커의 LogFC 값의 평균을 이용하여 히트맵을 작성하였다.

[18-2] 결과

CD45^hi TIL의 클러스터링 결과, 뇌암 조직에는 다양한 면역세포의 종류가 침윤되어 있었으며(도 16의 B), 이렇게 침윤된 면역세포에는 Trdc가 발현된 γδ T 세포가 존재하는 것을 확인하였다(도 16의 C).

물 만을 음수하도록 한 군과 비교하여, 메트포민을 음수하도록 한 군에서 γδ T 세포에서 발현되는 유전자의 종류가 상이하였다. 구체적으로, 그렌자임 B 및 CD27 유전자의 발현 수준과 Bcl2 유전자의 발현 수준 역시 감소된 반면(도 16의 D 내지 F), γδ T 세포의 활성화 및 증식과 관련된 유전자(Hivep2, Kcnk5, Rnf114, Fbxl12, CD55, Fos, S1pr1, M6pr, Sgpl1 및 Parp1)의 발현 수준이 증가되었다(도 16의 G).

또한, 물 만을 음수하도록 한 군과 비교하여, 메트포민을 음수하도록 한 군에서 γδ T 세포에서 해당 과정과 관련된 유전자(Slc2a3 및 Hk2)와, 지질대사와 관련된 유전자(Dgat1, Ndufa4 및 Plin2)의 발현 수준이 증가되었고, Smox 및 lp6k1 유전자의 발현 수준 역시 증가되었다. 반면, HIF-1α의 동시 활성화 인자로 알려진 Cbx4 유전자의 발현 수준이 감소되었다.

상기 결과를 통해 메트포민 처리에 의해 뇌암 세포에서 산소 소모량이 감소되고, 이를 통해 뇌암에 침윤된 면역세포 중에서 특히 γδ T 세포의 활성화 및 증식이 해당과정과 지질대사의 변화에 따라 증가됨에 따라, γδ T 세포가 뇌암 세포를 표적화하여 사멸시킴으로써 뇌암을 매우 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 19 ] 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 γδ T 세포의 뇌암 치료 효과 확인

[19-1] 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 γδ T 세포의 제조

건강한 사람의 혈액에서 말초혈액단핵세포(PBMC)들을 추출하였고, IL-2와 졸레드론산(Zoledronate)을 이용하여 γδ T세포 분화를 유도하였다(도 17의 A). 이들 중 약 30%가 자연살해 수용체인 NKG2D를 발현함을 확인하였다(도 17의 B).

[19-2] 저산소 유도인자 억제제로 전처리된 γδ T 세포의 항뇌종양 효과 확인

상기 실시예 19-1의 γδ T세포를 HIF1α 억제제인 Cay10585를 전처리하고, 사람 뇌종양 세포인 U87MG와 함께 in vitro에서 배양하여 세포독성을 측정하였다. 또는 HIF1α 억제제로 전처리 되지 않은 γδ T세포를 KG2D 억제 항체가 첨가된 배양액으로 사람 뇌종양 세포인 U87MG와 함께 in vitro에서 배양하여 세포독성을 측정하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에서 보는 바와 같이, γδ T세포는 in vitro에서 U87MG 세포에 대해 강한 세포독성을 보였다. 그러나 NKG2D 억제 시 세포독성이 감소하는 것으로 보아 γδ T세포의 세포독성은 NKG2D 의존적이라는 것을 알 수 있었다. HIF1α 억제는 γδ T세포의 세포독성에 영향을 주지 못하는 것으로 나타났다. 그러나 이는 in vitro 수준의 배양이 생체 내 종양의 저산소 환경을 구현하지 못한 정상 산소용존도에서의 배양이기 때문인 것으로 판단되었다. 따라서 in vivo 환경에서 시험을 진행하였다.

이를 위해, C57BL/6 생쥐의 뇌에 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 5 × 10⁴의 U87MG 세포주를 주입하고, 일주일 뒤 Cay10585를 전처리한 γδ T세포를 주입하였다. 대조군으로는 그 결과, Cay10585를 전처리하지 않은 γδ T세포를 주입하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다. 도 19에서 보는 바와 같이, HIF1α 억제제가 전처리된 γδ T세포를 주입한 경우, γδ T세포 단독 주입군 보다 매우 현저한 생존률 증가가 나타났다. 이로서, HIF1α 억제제로 전처리된 γδ T 세포를 이용하여 뇌종양을 현저히 개선시킬 수 있을을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

저산소 유도인자 억제제로 전처리된 γδT 세포를 포함하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학조성물로서,
상기 저산소 유도인자 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 LW6(CAY10585)인 것인, 약학조성물:
[화학식 1]
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제 1항에 있어서,
상기 γδ T 세포는 CD45, CD3 및 γδ TCR로 구성된 단백질이 발현된 세포인 것인, 약학조성물.
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제 1항에 있어서,
상기 약학조성물은 면역치료제로 기능하는 것인, 약학조성물.
제 1항에 있어서,
상기 약학조성물은 메트포민을 추가로 포함하는 것인, 약학조성물.
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γδ T 세포에 저산소 유도인자 억제제를 처리하는 단계;를 포함하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법으로서,
상기 저산소 유도인자 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 LW6(CAY10585)인 것인, 제조방법:
[화학식 1]
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제 9항에 있어서,
상기 γδ T 세포는 CD45, CD3 및 γδ TCR로 구성된 단백질이 발현된 세포인 것인, 제조방법.
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제 9항에 있어서,
메트포민을 혼합하는 단계;를 추가로 포함하는, 제조방법.
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