KR102567014B1 - 신규 면역 자극 마크롤라이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역 자극 마크롤라이드 (macrolide)를 제공한다. 상기 마크롤라이드는 바이러스성 질환 및 암의 치료에 유용하다.

Description

신규 면역 자극 마크롤라이드

본 발명은 면역 시스템을 자극할 수 있는 신규 마크롤라이드 (macrolide) 화합물을 제공한다. 본 발명은 의약, 특히 HIV와 같은 바이러스성 질환, 만성 염증성 질환의 치료 및 면역 시스템 자극이 효과적인 암에 사용하기 위한 신규 화합물에 관한 것이다. 상기 화합물은 또한 백신 접종에서 면역 조절 보조제로서 사용될 수 있다. 상기 신규 마크롤라이드는 면역 시스템의 조절 효과를 극대화하면서도, 치료적으로 원하지 않는 직접적인 항박테리아 효과를 최소화한다. 본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 제조방법 및 상기 화합물의 의약 용도를 제공한다.

에리트로마이신 (erythromycin) 및 아지트로마이신 (azithromycin)과 같은 마크롤라이드는 세균 감염 치료에 수 년간 사용되어 왔다. 에리트로마이신은 방선균류 (actinomycete) 사카로폴리스포라 에리트레아 (Saccharopolyspora erythraea)의 발효에 의해 생성된 폴리케타이드 (polyketide) 천연 생성물 마크롤라이드이다. 아지트로마이신은 에리트로마이신의 반합성 아잘라이드 유도체 (semisynsthetic azalide derivative)이다. 에리트로마이신과 같은 마크롤라이드의 항박테리아 활성을 개시하고 있는 많은 참고 문헌이 존재한다. 이 항박테리아 메커니즘은 박테리아 50S 박테리아 리보솜의 P-site에 결합하여 tRNA의 결합을 방해하는 분자를 통해 달성된다.

많은 문헌은 반합성 및 생합성 공학을 통해 에리트로마이신 유사체의 생성을 개시하고 있다. 특히, 에리스로마이신, 데소사민 (desosamine) 및 마이카로즈 (mycarose)에서 글리코실 그룹의 반합성적 제거방법을 개시하고 있다. 에리트로마이신 아글리콘 (erythromycin aglycone)에 대체 글리코실 그룹을 첨가하기 위한 생물변형 (biotransformation)에 관한 다른 방법도 개시하고 있다 (Gaisser et al., 2000, Schell et al., 2008 및 WO2001079520 참조). 그러나 상기 간행 논문의 주요 초점은 항박테리아 에리트로마이신 유사체를 생성하는 것이다.

직접적인 항박테리아 활성이 없는 마크롤라이드로부터의 면역 자극 활성은 종래에 보고된 바 없다. 놀랍게도, 본 발명의 화합물 (화합물 1, 도 1)이 면역 시스템의 여러 세포 타입에 강력한 면역 자극 효과를 갖는다는 것을 발견했다. 1μM의 화합물 1 (도 1)로 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)의 in vitro 자극 24 내지 48시간 이후, 활성화 마커 CD69가 CD4 T 세포 및 B 세포에서 상향 조절되었다 (도 2). T- 및 B- 세포에서 MHC class I 분자의 상향 조절을 관찰하였는데 (도 3), 이는 바이러스 항원 제시에 대한 바이러스 항원의 영향을 나타낸다. 화합물 1로 PBMC 집단에서 단핵구의 자극은 항원 제시 분자 MHC class II (HLA-DR)뿐만 아니라 공동 자극 분자 CD80의 상향 조절을 유도하였다 (도 4). 대식세포로 분화된 단핵구 또한 화합물 1에 의한 자극의 반응으로 CD80가 상향 조절되었다 (도 5). 또한, 화합물 1로 자극된 PBMC는 면역 억제성 사이토카인 IL-10의 생산증가와 함께 변화된 사이토카인 프로파일을 나타내어, 특정 조건 아래에서 면역 억제 효과를 나타낸다. 화합물 1의 면역학적 효과에 대한 추가적인 분석은 유동 세포 계측법으로 측정한 6일간의 자극후 T 세포의 변화된 사이토카인 유도성 증식 프로파일을 나타냈다 (도 7). 또한, 바이러스 특이적 T 세포 증식은 화합물 1에 의해 영향을 받았다. CMV 항원 및 화합물 1의 존재 하에 배양된 거대세포바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 감염 공여자 유래의 PBMC는 IL7 수용체 α (CD127)의 발현이 증가된 활성화된 CMV 특이적 CD8+ T 세포의 표현형이 변화되었다 (도 8). CD127은 T 세포의 항상성, 분화 및 기능에 중요하며 HIB 및 기타 만성 바이러스성 질환의 발병도와 관련이 있다 (Crawley et al Sem Imm 2012). 요약하면, 화합물 1은 항원 제시, 공동자극 및 T 세포 활성화 및 증식에 영향을 주어 면역 반응을 특이적으로 활성화 및 변형시키는 놀라운 능력을 갖는다. 이러한 많은 연구에서, 종래 Schell et al, 2008 (화합물 20으로)에 게재된 변형 클리코실레이션을 갖는 다른 마크롤라이드 에리트로마이신 관련 유사체인 화합물 2는 분석에서 거의 또는 전혀 활성을 나타내지 않았기 때문에 포함되었다.

따라서, 본 발명의 일 관점에서, 화학식 (I)의 비-항박테리아 면역 자극 마크롤라이드, 화합물1을 제공한다.

화학식 I

본 발명의 범위 내에서 본 발명은 또한 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 용매화합물, 거울상 이성질체 (enantiomer) 또는 부분입체이성질체 (diastereomer)이다.

상기 화합물은 본 발명에서 정의된 바와 같이 실질적인 항박테리아 활성을 갖지 않는다.

본 발명의 다른 관점에서, 아글리콘 (aglycone)을 화학식 II와 함께 3-하이드록실 위치에서 글리코실화하는 생물변형 균주 (biotransformation strain)의 배양물에 첨가하는 단계를 포함하는 화학식 (I)의 화합물의 제조방법을 제공한다.

화학식 II

본 발명의 바람직한 실시예에서, 생물변형 균주는 AngMII (서열번호 1) 또는 AngMIII에 대하여 70% 이상의 상동성을 가지거나 100% 상동성과 같은 95%이상의 상동성을 갖는 글리코실전이효소 (glycosyltransferases)를 발현한다.

두 개의 아미노산 서열 또는 두 개의 핵산 서열 사이의 상동성은 파라미터 "동일성"에 의해 기술된다. 서열의 정렬 및 상동성 스코어의 계산은 예를 들어, 전체 스미스-워터맨 정렬 (full Smith-Waterman alignment)을 이용하여 수행될 수 있다. 기본 점수표 BLOSUM50 및 동일성 점수표 (identity matrix)은 각각 단백질 및 DNA 정렬에 사용된다. 갭에서 첫 번째 잔기에 대한 패널티는 단백질의 경우 -12, DNA의 경우 -16이며, 갭에서 추가적인 잔기에 대한 패널티는 단백질의 경우 -2, DNA의 경우 -4이다. 정렬은 FASTA 패키지 버전 v20u6을 사용하여 만들 수 있다. 단백질 서열의 다중 정렬은 "Clustal W"를 사용하여 만들 수 있다. DNA 서열의 다중 정렬은 단백질 정렬을 주형으로 사용하여 만들 수 있으며, 아미노산을 DNA 서열에서 상응하는 코돈으로 대체할 수 있다. 또는, 아미노산 서열 및 DNA 서열을 정렬하기 위해 상이한 소프트웨어가 사용될 수 있다. 두 아미노산 서열의 정렬은 예를 들어, EMBOSS 패키지 (http://emboss.org) 버전 2.8.0의 Needle 프로그램을 사용하여 결정된다. 사용된 치환 점수표 (substitution matrix)는 BLOSUM62이고, 갭 발생 패널티 (gap open penalty)는 10이고, 갭 확장 패널티 (gap extension penalty)는 0.5이다.

일반적 화학 방법

통상의 기술자는 본 발명의 화합물이 공지된 방식의 다양한 방법으로 제조될 수 있음을 인식할 것이다. 하기의 경로는 화학식 (I)의 화합물의 합성에 사용될 수 있는 몇 가지 방법의 단순한 예이다.

하나의 일반적인 경로에서, 에리트로마이신 A는 아지트로마이신을 생성하기 위해 반합성적 조작을 받는다. 이러한 변형 방법은 공지되어 있으나 (US 3 478 014; US 4 328 334; US 4 474 768, Glansdorp et al., 2008), 이러한 경로 또는 다른 경로에서의 변형은 동일한 목적으로 사용될 수 있다. 마이카로즈/클라디노즈 및/또는 데소사민은 글리코시드 (glyside) 절단과 같은 추가적인 화학적 방법에 의해 제거된다. 간략하게, 하나의 방법에서 당은 산을 처리하여 제거될 수 있다. 아미노 당의 제거를 용이하게 하기 위해 디메틸아민을 산화하여 N-Oxide를 형성시킨 후, 열 분해에 의해 제거하는 것이 필요하다. 생성된 5-O 당 및 3-O 당은 산성 분해에 의해 제거될 수 있다. 적절한 방법은 LeMahieu (1974) 및 Djokic, S., et al., 1988에 의해 교시된다. 마지막으로 상기 화합물은 아미노 당을 첨가하는 박테리아 균주를 사용하여 생물변형된다.

본 발명의 화합물의 일반적 용도

본 발명의 화합물은 의학, 의학 연구 또는 이러한 용도의 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 하기의 "본 발명의 화합물"이라는 용어가 의학적 용도 또는 약제학적 조성물과 연관되어 사용될 때, 상기 용어는 상기 화합물이 이러한 용도로 알려져 있지 않다면 화학식 1의 화합물을 포함하는 것으로도 의도된다.

본 발명의 화합물은 직접적인 항박테리아 효과를 최소화하기 위해 고안되었지만, 면역 활성화 특성에 중점을 둔다. 박테리아 E. coli, S. salivarius, L. casei, B. longum 또는 M. luteus의 배양물에 화합물 1을 첨가할 때, 항박테리아 효과가 없거나 최소화 되는 것으로 확인된다. 숙주 세포에 영향을 미치는 분리된 면역 자극 특성을 가지는 화합물이 가지는 이점은 박테리아 내성의 발달을 회피할 수 있다는 것이다. 또한, 설사 및 위막대장염 (pseudomebraneous colitis)을 유발하는 클로스트리듐 디피실리균 (Clostridium difficile)의 과증식 위험이 있는 장내 미생물에 영향을 미치는 마크롤라이드의 잘 알려진 부작용을 회피할 수 있다. 많은 바이러스 및 암은 면역 인식을 회피하기 위한 매커니즘을 개발했다. 즉, HLA 발현의 하향조절을 통해 T 세포에 의한 탐지를 회피한다. 본 발명의 화합물의 매커니즘은 감염된 세포에서의 HLA 분자의 활성화 및 증가된 발현에 의존한다. HLA 분자는 감염된 세포의 제거를 허락하는 T 세포에 대한 인식 신호를 나타내기 위해 세포 내 감염 인자 유래의 펩타이드를 로딩하고 제시한다.

본 명세서에 개시된 본 발명의 화합물은 바이러스성 물질 (viral agent)에 감염되거나 HIV, 아데노바이러스 (Adenovirus), 알파바이러스 (Alphavirus), 아르보바이러스 (Arbovirus), 보르나 병 (Borna Disease), 분야바이러스 (Bunyavirus), 칼리시바이러스 (Calicivirus), 첨규 콘딜로마 (Condyloma Acuminata), 코로나바이러스 (Coronavirus), 콕삭키바이러스 (Coxsackievirus), 거대세포바이러스 (Cytomegalovirus), 댕기열 바이러스 (Dengue fever virus), 전염성 농창 (Contageous Ecthyma), 엡스타인 바 바이러스 (Epstein-Barr virus), 전염성 홍반 (Erythema Infectiosum), 한타바이러스 (Hantavirus), 바이러스성 출혈열 (Viral Hemorrhagic Fever), 바이러스성 간염 (Viral Hepatitis), 단순 헤르페스 바이러스 (Herpes Simplex Virus), 수두 대상포진 바이러스 (Herpes Zoster virus), 감염 단핵구증 (Infectious Mononucleosis), 인플루엔자 (Influenza), 랏사 열 바이러스 (Lassa Fever virus), 홍역 (Measles), 볼거리 (Mumps), 물 사마귀 (Molluscum Contagiosum), 파라믹소바이러스 (Paramyxovirus), 모래파리 열 (Phlebotomus fever), 폴리오마바이러스 (Polyoma-virus), 리프트 계곡 열 (Rift Valley Fever), 풍진 (Rubella), 지연 질환성 바이러스 (Slow Disease Virus), 천연두 (Smallpox), 아급성 경화성 범뇌염 (Subacute Sclerosing Panencephalitis), 종양 바이러스 감염 (Tumor Virus Infections), 웨스트 나일 바이러스 (West Nile Virus), 황열 바이러스 (Yellow Fever Virus), 광견병 바이러스 (Rabies Virus) 및 호흡기 장애 바이러스 (Respiratory Syncitial Virus)와 같은 바이러스성 질환에 감염된 환자의 치료와 같은 면역 반응 자극이 유용한 질환 (diseases), 장애 (disorder), 상태 (condition) 및 증상 (symptom)을 치료하는데 사용될 수 있다.

또한, 상기 화합물은 암치료에 사용하기에 적합한 것으로 고려된다. 특히, 부신암 (Adrenal Cancer), 항문암 (Anal Cancer), 담도암 (Bile Duct Cancer), 방광암 (Bladder Cancer), 골암 (Bone Cancer), 뇌/CNS 종양 (Brain/CNS Tumors), 유방암 (Breast Cancer), 캐슬만씨 병 (Castleman Disease), 자궁경부암 (Cervical Cancer), 결장/직장암 (Colon/Rectum Cancer), 자궁내막암 (Endometrial Cancer), 식도암 (Esophagus Cancer), 안암 (Eye Cancer), 담낭암 (Gallbladder Cancer), 위장관 카르시노이드 종양 (Gastrointestinal Carcinoid Tumors), 위장관 기질 종양 (Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST)), 임신영약막질환 (Gestational Trophoblastic Disease), 호지킨 병 (Hodgkin Disease), 카포시육종 (Kaposi Sarcoma), 신장암 (Kidney Cancer), 후두종 (Laryngeal) 및 하인두암 (Hypopharyngeal Cancer), 급성 골수성 백혈병 (Acute Myeloid Leukemia), 만성 림프구성 백혈병 (Chronic Lymphocytic Leukemia), 급성 림프구성 백혈병 (Acute Lymphocytic Leukemia), 만성 골수성 백혈병 (Chronic Myeloid Leukemia), 만성 골수세포 백혈병 (Chronic Myelomonocytic Leukemia), 간암 (Liver Cancer), 비-소세포 폐암 (Non-Small Cell Lung Cancer), 소세포 폐암 (Small Cell Lung Cancer), 폐 카르시노이드 종양 (Lung Carcinoid Tumor), 림프종 (Lymphoma), 악성중피종 (Malignant Mesothelioma), 다발성 골수종 (Multiple Myeloma), 골수이형성 증후군 (Myelodysplastic Syndrome), 비강 및 부비동 암 (Nasal Cavity and Paranasal Sinus Cancer), 비인두암 (Nasopharyngeal Cancer), 신경 아세포종 (Neuroblastoma), 비-호지킨 림프종 (Non-Hodgkin Lymphoma), 구강 및 인두 암 (Oral Cavity and Oropharyngeal Cancer), 골육종 (Osteosarcoma), 난소암 (Ovarian Cancer), 췌장암 (Pancreatic Cancer), 음경암 (Penile Cancer), 뇌하수체암 (Pituitary Tumors), 전립선암 (Prostate Cancer), 망막세포종 (Retinoblastoma), 횡문근육종 (Rhabdomyosarcoma), 침샘암 (Salivary Gland Cancer), 기저 및 편평 세포 피부암 (Basal and Squamous Cell Skin Cancer), 흑색종 (Melanoma), 메르켈 세포 피부암 (Merkel Cell Skin Cancer), 소장암 (Small Intestine Cancer), 위암 (Stomach Cancer), 고환암 (Testicular Cancer), 흉선암 (Thymus Cancer), 갑상선암 (Thyroid Cancer), 자궁암 (Uterine Sarcoma), 질암 (Vaginal Cancer), 외음부암 (Vulvar Cancer), 왈덴-스트룀 마크로글로불린혈증 (Walden-strom Macroglobulinemia), 욀름스 종양 (Wilms Tumor)이 있다.

따라서, 종래 기술의 마크롤라이드에 비하여 본 발명의 화합물의 유리한 성질은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:

- 직접적인 항박테리아 활성의 감소

- MHC class I 자극 개선

- 면역조절 (immunomodulation) 개선

- 항원 제시 세포의 활성화 개선

- T 세포 반응 개선

- 항 바이러스성 활성 개선

- MHC class II 항원 제시 개선

본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물

본 발명은 본 발명의 화합물과 함께 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 희속제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 또한, 본 발명의 화합물과 함께 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 포함하는 약학 키트를 제공한다. 본 발명은 하나 이상의 화장용으로 또는 수의학적으로 허용되는 부형제와 함께 본 발명의 화합물을 포함하는 화장용 또는 수의학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학, 화장용 또는 수의학 조성물은 임의의 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비제한적인 예로 비경구적으로, 경구적으로, 국소적으로 또는 점막 (볼점막 (buccal), 설하 (sublingual), 경피 (transdermal), 질내 (vaginal), 직장내 (rectal), 코 (nasal), 안구 (ocular) 등을 포함한다)을 통해, 의료 장치 (예, 스텐트) 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 치료는 일정기간 동안 단일 투여 또는 복수 투여로 이루어질 수 있다.

치료는 치료하고자 하는 특정 질환 및 치료받을 환자의 체중 및 나이에 따라 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회 등으로 투여될 수 있다. 치료는 또한 예를 들어 드롭을 통한 주입에 의한 정맥 투여와 같은 연속 투여에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 화합물은 그 자체로 투여될 수 있지만, 하나 이상의 허용 가능한 담체와 함께, 약학적 제형으로 제공하는 것이 바람직하다. 상기 담체 (들)는 본 발명의 화합물과 양립 가능하고, 수용자에게 해롭지 않다는 의미에서 “허용 가능 (acceptable)” 해야 한다. 적합한 담체의 예는 하기에 자세히 설명한다.

제형 (formulation)은 단위 투약 형태 (a unit dosage form)를 포함하는 적절한 투약 형태로 편리하게 제공될 수 있으며, 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 성분 (본 발명의 화합물)을 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 제제는 활성 성분을 액체 담체 또는 미세하게 분쇄한 고체 담체 또는 그 둘 모두와 균일하고 (uniformly), 친밀하게 (intimately) 결합시킨 후, 필요한 경우 생성물을 성형함으로써 제조된다.

본 발명의 화합물은 일반적으로 통상적인 경구 또는 임의의 비경구 경로에 의한 일반적인 임의의 투여 경로에 의해 투여될 수 있고, 활성 성분을 포함하는 약학적 제형으로 투여될 수 있고, 선택적으로 비독성 유기 또는 무기, 산 또는 염기, 부가 염의 형태로 투여될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 투여 형태에 따라 투여될 수 있다. 치료하고자 하는 환자 및 장애뿐만 아니라, 투여 경로에 따라, 상기 조성물은, 다양한 투여량 및/또는 빈도로 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물은 제조 및 저장 조건에서 안정적이어야 한다. 따라서, 필요한 경우 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 용액, 분산액 (dispersion), 에멀젼 (emulsion) 및 현탁액과 같은 액체 제형의 경우 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 식물성 오일 및 이의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질 (dispersion medium)일 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 화합물은 향료 또는 착색제를 함유하는 정제, 캡슐, 필름, 질좌약 (ovules), 엘릭서, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태로 경구 (orally), 볼 점막내 (buccally) 또는 설하 (sublingually) 투여될 수 있다.

경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은 각각 소정의 양의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 카세제 (cachets) 또는 정제와 같은 별개의 유닛 (unit)으로 제공될 수 있으며; 복수의 유닛 예를 들어, 정제 또는 캡슐의 제형으로: 분말 또는 과립으로서; 수성 액상 (aqueous liquid) 또는 비수성 (non- aqueous liquid) 액상의 용액 또는 현탁액으로서; 오일-인-워터 액상 에멀젼 (oil-in-water liquid emulsion) 또는 워터-인-오일 액상 에멀젼 (water-in-oil liquid emulsion)으로서 존재할 수 있다. 상기 활성 성분은 볼루스 (bolus), 연질제 (electuary) 또는 페이스트 (paste)로 제공될 수 있다.

경구 투여에 적합한 본 발명의 화합물의 용액 또는 현탁액은 또한 물, 알코올 폴리올 등을 포함하는 하나 이상의 용매뿐만 아니라, pH 조절제 (pH-adjusting agent), 안정화제 (stabilizing agents), 계면활성제 (surfactants), 용해제 (solubilizers), 분산제 (dispersing agents), 방부제 (preservatives), 향료 (flavors) 등의 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 특정한 예로서, N,N-디메틸아세트아마이드 (N,N-dimethylacetamide), 분산제 (dispersants), 예로서, 폴리솔베이트 80, 계면활성제 (surfactants) 및 용해제 (solubilisers), 예로서, 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol), Phosal 50 PG (포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine), 대두-지방산 (soya-fatty acids), 에탄올, 모노/디글리세라이드 (mono/diglycerides), 프로필렌 글리콜 (propylene glycol) 및 아스코르빌 팔미테이트 (ascorbyl palmitate)로 구성됨)가 포함된다. 본 발명의 제제는 또한, 에멀젼의 형태일 수 있으며, 상기 화학식 (I)의 화합물은 오일-인-워터 에멀젼 또는 워터-인-오일 에멀젼과 같은 에멀젼에 존재할 수 있다. 상기 오일은 예를 들어 대두 오일 (soy bean oil), 잇꽃 오일 (safflower oil) 또는 이의 혼합물과 같은 천연 또는 합성 오일 또는 임의의 오일 유사 물질일 수 있다.

정제 (tablet)는 미정질 셀룰로오스 (microcrystalline cellulose), 락토오즈 (lactose) (예, 락토오즈 모노수화물 (lactose monohydrate) 또는 무수락토오즈 (lactose anyhydrous)), 시트르산 나트륨 (sodium citrate), 탄산 칼슘 (calcium carbonate), 이염기성 칼슘 포스페이트 (dibasic calcium phosphate) 및 글리신 (glycine), 부틸화 히드록시톨루엔 (butylated hydroxytoluene, E321), 크로스포비돈 (crospovidone), 하이프로멜로오즈 (hypro-mellose), 탄수화물 (바람직하게는 옥수수, 감자, 타피오카 전분), 나트륨 전분 글리콜레이트 (sodium starch glycollate), 크로스카멜로오즈 나트륨 (croscarmellose sodium) 및 특정 복합 규산염 (certain complex silicates)과 같은 붕해제 (disintegrants) 및 폴리비닐파이롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈 (hydroxypropylmethylcellulose, HPMC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈 (hydroxy-propylcellulose, HPC), macrogol 8000, 수크로즈 (sucrose), 젤라틴 및 아카시아와 같은 과립 결합제 (granulation binders)와 같은 부형제를 함유할 수 있다. 또한 마그네슘 스테아레이트 (magnesium stearate), 스테아르산 (stearic acid), 그리세릴 베헤네이트 (glyceryl behenate) 및 탈크 (talc)와 같은 윤활제가 포함될 수 있다.

정제는 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축 정제는 선택적으로 결합제 (예, 포비돈 (povidone), 젤라틴, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오즈 (hydroxypropylmethyl cellulose)), 윤활제 (lubricant), 불활성 희석제 (inert diluent), 방부제, 붕해제 (disintegrant) (예, sodium starch glycolate, cross-linked povidone, cross-linked sodium carboxymethyl cellulose), 표면 활성제 (surface-active) 또는 분산제 (dispersing agent)와 혼합된 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 제형 (free-flowing form)의 활성 성분을 적절한 기계에서 압축함으로써 제조할 수 있다. 성형 정제 (Moulded Tablet)는 불활성 액체 희석제로 습윤화된 분말 화합물의 혼합물을 적절한 기계에서 성형하여 제조할 수 있다. 상기 정제는 선택적으로 코팅되거나 스코어링 될 수 있으며, 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위해, 예를 들어, 다양한 비율의 하이드록시프로필메틸 셀룰로오즈를 사용하여, 정제 안의 활성 성분을 느리게 또는 조절적으로 방출할 수 있도록 제형화 될 수 있다.

유사한 유형의 고형 조성물은 또한 젤라틴 캡슐내의 충전제로서 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 바람직한 부형제로서 락토오즈, 전분, 셀룰로오즈, 유당 또는 고분자 폴리에틸린 글리콘을 포함한다. 수성 현탁액 및.또는 엘릭서의 경우, 본 발명의 화합물을 및 각종 감미제 (sweetening) 또는 향료, 착색료, 염료와 함께, 유화제 (emulsifying agent) 및/또는 현탁제와 함께, 물,에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린과 같은 희석제와 함께 또는 이의 조합과 함께 배합될 수 있다.

구강 내 국소 투여에 적합한 제형은 설탕 및 아카시아 또는 트라가칸트 (tragacanth)와 같은 향료 첨가 베이스 (flavoured basis)에 활성 성분을 함유하는 마름모꼴 캔디 (lozenges); 젤라틴 및 글리세린 또는 설탕 및 아카시아와 같은 불활성 베이스에 활성 성분을 함유하는 빨아먹는 캔디 (pastilles); 및 적절한 액상 담체에 활성성분을 함유하는 구강 세정제를 포함한다.

국소 투여에 적합한 약학 조성물은 연고 (ointments), 크림 (creams), 현탁제 (suspensions), 로션 (lotions), 파우더 (powders), 용액 (solutions), 페이스트 (pastes), 젤 (gels), 침윤형 드레싱 (impregnated dressings), 스프레이 (sprays), 에어로졸 (aerosols) 또는 오일, 피부전달 장치 (transdermal devices), 산포제 (dusting powders) 및 이의 유사체와 같은 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 활성제를 함유하는 통상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 따라서, 이들은 또한, 보존제, 약물 침투를 보조하는 용매, 크림 또는 연고에서의 피부연화제 (emollient), 로션을 위한 에탄올 또는 올레일 알코올 (oleyl alchol)과 같은 상용의 통상적인 담체 및 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 담체는 조성물의 약 1% 내지 약 98%로 존재할 수 있다. 좀더 일반적으로는 조성물의 약 80% 이상을 형성할 수 있다. 단지 일 예로서, 크림 또는 연고는 약 5 중량% 내지 10 중량%의 상기 화합물을 함유하는 충분한 양의 친수성 물질 및 물을 혼합하여 제조된다.

경피 투여에 적합한 약학 조성물은 장기간 동안 수용자의 표피와 긴밀한 접촉을 유지하도록 의도된 별개의 패치로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 이온 도입법 (iontophoresis)으로 패치에서 활성 약제를 전달할 수 있다.

외부 조직, 예를 들어 입 및 피부에의 적용에 있어서, 조성물은 바람직하게는 국소 연고 또는 크림으로서 도포된다. 연고로 제형화 되는 경우에, 활성제는 파란핀계 (paraffininc) 또는 수성 연고 베이스 (water-miscible ointment base)와 함께 사용될 수 있다.

다르게는, 상기 활성제는 오일-인-워터 크림 베이스 또는 워터-인-오일 베이스를 가지는 크림으로 제형화될 수 있다.

비경구 투여를 위해, 활성 성분 및 무균 비히클, 예로써 이에 제한되지는 않으나, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일, 바람직하게는 물을 사용하여 유체 단위 복용 형태 (luid unit dosage forms)를 제조한다. 상기 활성 성분은 사용된 비히클 및 농도에 따라 콜로이드화, 현탁 또는 비히클에 용해될 수 있다. 용액을 제조할 때, 상기 활성 성분은 주사를 위해 물에 용해될 수 있고, 적절한 바이알 또는 앰플에 충전되고 밀봉되기 전에 필터 멸균 될 수 있다.

유리하게는, 국소 마취제, 방부제 및 완충제와 같은 제제가 비히클에 용해될 수 있다. 안정성을 향상시키기 위해, 조성물은 바이알에 충전된 후 동결될 수 있고, 물은 진공에서 제거될 수 있다. 그 후, 감압 하에 동결 건조된 분말을 바이알에 밀봉하고, 사용하기 전에 액체로 재구성시키기 위해 부수적인 주사용수 바이알이 보충될 수 있다.

주사 용도에 적합한 본 발명의 약학 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액을 포함한다. 또한, 조성물은 상기 주사용 수용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말의 형태일 수 있다. 모든 경우에, 최종 주사용 형태는 멸균되어야 하고 주사의 용이성을 위해 실질적으로 유체여야 한다.

비경구적 현탁액은 활성 성분이 용해되지 않고 비히클 중에 현탁되고 여과에 의해 멸균을 수행할 수 없다는 점을 제외하고는 용액과 실질적으로 동일한 방식으로 제조된다. 활성 성분은 멸균 비히클 중에 현탁되기 전에 에틸렌 옥사이드 (ethylene oxide)에 노출시킴으로써 멸균될 수 있다. 유리하게는 계면 활성제 또는 습윤제가 활성 성분의 균일한 분포를 용이하게 하기 위해 조성물에 포함된다.

상기한 성분 이외에, 본 발명의 제형은 당해 제제의 유형과 관련하여 본 기술 분야에 통상적인 다른 제형을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다, 예를 들어 경구 투여에 적합한 것으로서 향미제를 포함할 수 있다. 본 기술 분야의 통상의 기술자는 적합한 제형을 선택하는 방법 및 이를 제조하는 방법을 알 것이다 (예, Remington's Pharmaceutical Sciences 18편 이후 참조.). 본 기술 분야의 통상의 기술자는 적합한 투여 경로 및 투여량을 선택하는 법을 알 것이다.

본 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명의 화합물의 최적의 각 복용의 간격 및 복용량이 치료되는 증상의 성질 및 범위, 투여 형태, 경로 및 부위에 의해 결정될 것이며, 치료할 특정 대상의 나이 및 증상 및 의사가 궁극적으로 사용할 적절한 복용량을 결정할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 복용은 적절하게 반복될 수 있다. 부작용이 발생하는 경우 정상적인 임상 수행에 따라 투여량 및/또는 빈도를 변경하거나 줄일 수 있다.

본 명세서에서 언급된 모든 %값은 문맥상 다르게 요구되지 않는 한, % w/w이다.

정의

관사 "a" 및 "an"은 본 명세서에서 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상의 것 (즉, 적어도 하나)을 가리키기 위해 사용된다. 예를 들어, "an analogue"는 하나의 유사체 (analogue) 또는 그 이상의 유사체를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "본 발명의 화합물 (들)"은 상호 교환적으로 사용되며, 화학식 I의 화합물을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "직접적인 항박테리아 효과"는 박테리아 rRNA 복합체에 결합함으로써 일어나는 에리트로마이신 및 유사체의 항박테리아 활성을 의미한다. 이 효과는 숙주 면역 시스템 구성 요소의 존재를 필요로 하지 않으므로 in vitro 최소 억제 농도 (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 분석 및 디스크 억제 분석 (disk inhibition assays)과 같은 표준 항박테리아 분석에서 알 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "실질적인 항박테리아 활성을 갖지 않는다"는 본 발명의 실시예 2에 따라 E. coli, S. salivarius, L. casei 및 B. longum에서 화합물의 항박테리아 활성에 대해 시험하였을 때, 본 발명의 화합물이 >64 μg/ml의 MIC 값을 가진다는 것을 의미한다.

본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 무기 또는 유기산 또는 염기뿐만 아니라 4차 암모늄 산 부가 염 (quaternary ammonium acid addition salts)으로부터 형성된 통상적인 염을 포함한다. 더욱 구체적인 예로서, 적합한 산성 염의 예로서, 염화수소 (hydrochloric), 브롬화수소 (hydrobromic), 황산 (sulphuric), 인산 (phosphoric), 질산 (nitric), 과염소산 (perchloric), 푸마르산 (fumaric), 아세트산 (acetic), 프로피온산 (propionic), 숙신산 (succinic), 글리콜산 (glycolic), 포름산 (formic), 젖산 (lactic), 말레산 (maleic), 타르타르산 (tartaric), 시트르산 (citric), 팔모산 (palmoic), 말론산 (malonic), 하이드록시말레산 (hydroxymaleic), 페닐아세트산 (phenylacetic), 글루탐산 (glutamic), 벤조산 (benzoic), 살리실산 (salicylic), 톨루엔황산 (toluenesulfonic), 메탄황산 (methanesulfonic), 나프탈렌-2-황산 (naphthalene-2-sulfonic), 벤젠황산 (benzenesulfonic) 나프탈화수소산 (hydroxynaphthoic), 요오드화수소산 (hydroiodic), 말산 (malic), 스테로산 (steroic), 타닌산 (tannic) 및 이의 유사체를 포함한다. 옥살산 (oxalic)과 같은 산은 약학적으로 허용되는 것은 아니지만 본 발명의 화합물 및 이에 약학적으로 허용되는 염을 얻기 위한 중간체로서, 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다. 적합한 기본 염의 더욱 구체적인 예로서 나트륨 (sodium), 리튬 (lithium), 칼륨 (potassium), 마그네슘 (magnesium), 알루미늄 (aluminium), 칼슘 (calcium), 아연 (zinc), N,N'-디벤질에틸렌다이아민 (N,N'-dibenzylethylenediamine), 클로로프로카인 (chloroprocaine), 콜린 (choline), 다이에탄올아민 (diethanolamine), 에틸렌다이아민 (ethylenediamine), N-메틸글루카마인 (N-methylglucamine) 및 프로카인 염 (procaine salts)을 포함할 수 있다.

도 1. 마크롤라이드 에리트로마이신 A, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3 및 E703의 구조.
도 2. T- 및 B- 세포에서 CD69 상향 조절. PBMC는 24시간 동안 화합물 1, 화합물 2 및 활성화 조절 LPS 및 IFN-γ로 처리되었다. 유동 세포 계측법을 이용하여 CD4+ T 세포 집단 (좌측) 및 CD19+ B 세포 집단 (우측)에서 조기 활성화 마커인 CD69의 발현이 측정되었다. 값은 3회의 샘플에서 평균 형광 강도 (mean fluorescent intensity), MFI 및 오차막대 표준 편차 (error bars standard deviation)를 나타낸다.
도 3. T- 및 B- 세포에서 HLA-A, B, C 상향 조절. PBMC는 24시간 동안 화합물 1 또는 2 및 활성화 조절 LPS 및 IFN-γ로 처리되었다. 유동 세포 계측법을 이용하여 CD4+ T 세포 집단 (좌측) 및 CD19+ B 세포 집단 (우측)에서 HLA-A, B, C의 발현이 측정되었다. 값은 3회의 샘플에서 평균 형광 강도, MFI 및 오차막대 표준 편차를 나타낸다.
도 4. 혈액 단핵구에서 CD80 및 HLA-DR 상향 조절. PBMC는 24시간 동안 화합물 1 또는 2뿐만 아니라 활성화 조절 LBS 및 IFN-γ로 처리되었다. 유동 세포 계측법을 이용하여 단핵구 세포 집단에서 CD80 및 HLA-DR의 발현이 측정되었다. 값은 3회의 샘플에서 평균 형광 강도, MFI 및 오차막대 표준 편차를 나타낸다.
도 5. 혈액 단핵구에서 CD80 상향 조절. PBMC는 24시간 동안 화합물 1 또는 2뿐만 아니라 활성화 조절 LBS 및 IFN-γ로 처리되었다. 유동 세포 계측법을 이용하여 단핵구 세포 집단에서 CD80의 발현이 측정되었다. 값은 3회의 샘플에서 평균 형광 강도, MFI 및 오차막대 표준 편차를 나타낸다.
도 6. 화합물 1로 48시간 또는 1주동안 자극 후 ELISA로 측정한 PBMC로부터의 IL-10 생산.
도 7. 화합물 1로 자극한 6일 후 증식 염료 Celltrace violet (Invitrogen) 및 유동 세포 계측법으로 측정한 CD4 T 세포의 증식. 처리되지 않은 세포 (UNT) 또는 화합물 2가 대조군으로 사용되었다.
도 8. 화합물 1과 함께 배양 후 유동 세포 계측법으로 측정한 CMV 특이적 CD8 T 세포에서의 IL-7 수용체 α (CD127)의 상향 조절.
도 9: 5일 동안 화합물 1 또는 2의 존재 또는 부존재 하에 CMV 펩타이드로 성장시킨 PBMC (CMV+ 공여자 유래)로부터의 인터페론-감마 분비 (cytometric bead assay로 측정).
도 10: 48시간 동안 표시된 화합물로 자극된 대식세포로부터의 인터페론-감마 분비 (cytometric bead assay로 측정).
도 11: 48시간 동안 표시된 화합물로 자극된 PBMC 또는 대식세포로부터의 케모카인 RANTES 분비 (cytometric bead assay로 측정).
도 12: 48시간 동안 표시된 화합물로 자극된 PBMC 또는 대식세포로부터의 IL12p70 분비 (cytometric bead assay로 측정).
도 13: 48시간 동안 표시된 화합물로 자극된 PBMC, 대식세포 또는 CD4 T 세포로부터 IL1b 분비 (cytometric bead assay로 측정).
도 14: 표시된 용량의 화합물 1을 24시간 전에 주사한 C57bl/6 마이스의 혈액 중 %CD25 high 세포. CD25 발현은 유동 세포 계측법으로 측정하였다.
도 15: 표시된 화합물을 24시간 전에 주사한 3마리의 개별 C57bl/6 마이스의 비장에서의 %MHC class I high CD11b+ 세포. MHC class I 및 CD11b 발현은 유동 세포 계측법으로 측정하였다.

실험 방법

재료

달리 명시되지 않는 경우 하기 실시 예에서 사용된 모든 시약은 상업적 출처로부터 얻어진 것이다.

항체

항-CD80 V450, 항-CD69 PE, 항 HLA-DR APC-R700, 항 CD127-APC 및 항-Anti-HLA-A,B,C FITC는 BD Biosciences에서 구매하였다. T cell 증식 분석을 위한 Celltrace violet은 Invitrogen에서 구매하였다. ELISA 항체는 BD Biosciences에서 구매하였다.

배지

25mM HEPES, L-글루타민 (L-glutamine), 피루브산 나트륨 (Sodium pyruvate), 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, Gibco), 100μg/mL 페니실린 (penicillin) 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (streptomycin)으로 보충된 RPMI-1640 (Invitrogen).

일반적 생물학 방법

면역 자극에 대한 본 발명의 화합물의 효과는 하기의 하나이상의 방법을 사용하여 시험될 수 있다.

일반적 화합물 방법

화합물 분석 - 용해도 및 용액 내 안정성

발효 브로스 (fermentation broths) 및 화합물의 분석

하기와 같이 수득된 발효 브로스의 앨리?? (aliquot)을 동일한 부피의 에틸 아세테이트 (ethyl acetate)로 30분동안 격렬하게 진탕시킨 후, 원심 분리에 의해 분리하거나 이미 분리된 화합물을 메탄올 : 물 (9:1. 0.1 mg/ml)에 용해시키고, 원심 분리로 분리하였다. 상등액을 LC-MS 및 LC-MS/MS로 분석하고, 크로마토그래피는 40℃로 가열된 Luna HPLC 컬럼 (250 × 4.6 mm; Phe-nomenex, Macclesfield, UK)을 이용하여 염기-비활성 Luna C18 역상 실리카 (base-deactivated Luna C18 reversed-phase silica, 5 micron 입자 크기)상에서 수행되었다. 4차 펌프 (quaternary pump), 오토 샘플러 (auto sampler), 컬럼 오븐 (column oven) 및 다이오드 어레이 검출기 (diode array detector)를 포함하는 Agilent 110HPLC 시스템은 Bruker Esquire ion trap MS에 연결되었다.

이동 상 A (Mobile phase A) = 물 중 0.1% 포름산

이동 상 B (Mobile phase B) = 아세토니트릴 (acetonitrile) 중 0.1% 포름산

그라디언트 (Greadient): T= 0 min, B = 50%; T= 4.5 min, B = 50%; T = 7 min, B = 100 %; T= 10.5 min, B = 100 %; T = 10.75 min, B = 50 %; T = 13 min, B = 50%.

화합물을 LC-MS 및 LC-MS/MS로 동정하고 내부 표준 (internal standard)에 대해 LC-MS/MS로 정량하였다.

유동 세포 계측법에 의한 마커 발현의 분석

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 Ficoll-Paque 밀도 원심 분리를 통해 건강한 공여자로부터 정제하였다. 세포를 25mM HEPES, L-글루타민 (L-glutamine), 피루브산 나트륨 (Sodium pyruvate, Sigma), 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, Gibco), 100μg/mL 페니실린 (penicillin) 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (streptomycin, Hyclone)으로 보충된 완전 RPMI-1640 (Invitrogen)에서 37℃, 5% CO2에서 24 내지 72시간 동안 배양하고 증가된 농도의 화합물 1 및 2로 자극하였다. 그 뒤, 세포를 PBS로 세척하고 세포 표면 마커에 특이적인 단일클론 항체로 염색하였으며, BD FACS Canto II 유동 세포 계측기를 사용하여 유동 세포 계측법으로 분석하였다. 모든 샘플은 두번 시험되었다.

거대세포바이러스 (Cytomegalovirus, CMV) 배양

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 Ficoll-Paque 밀도 원심 분리를 통해 건강한 공여자로부터 정제하였다. 상기 PBMC를 PBS 중의 5 mM celltrace violet (Invitrogen)으로 표지하고 완전한 세포 배양 배지로 세척하였다. 상기 표지된 PBMC는 25mM HEPES, L-글루타민 (L-glutamine), 피루브산 나트륨 (Sodium pyruvate, Sigma), 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, Gibco), 100μg/mL 페니실린 (penicillin) 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (streptomycin, Hyclone)으로 보충된 AIM-V 배지에서 37℃, 5% CO2에서 6 내지 8일 동안 CMV pp65 단백질 (1μg 펩타이드/ml, JPT)를 스패닝 (spanning)하는 펩타이드 라이브러리의 존재 아래 배양되었다. 세포 증식은 BD FACS Canto II 유동 세포 계측기를 사용하여 유동 세포 계측법을 사용하여 평가되었다.

ELISA

상등액 IL-10은 완전한 RPMI 배지, 37℃, 5% CO2에서 2.5 μM의 화합물 1 및 100U/mL IL-2 (Miltenyi Biotechnologies)와 48시간 및 7일 동안 배양한 후, 표준 샌드위치 ELISA (BD Biosciences의 모든 항체)로 측정되었다.

TLR2 분석

표준 분석 조건을 사용하는 invivogen 에서의 세포 리포터 분석을 사용하여 재조합 HEK-293-TLR 세포주에서 샘프과 대조군을 2 개씩 테스트했다. 상기 세포주는 인간 TLR2 단백질뿐만 아니라 분비된 알카라인 포스파테이즈 (SEAP)인 리포터 유전자를 기능적으로 과발현한다. 상기 리포터 유전자의 생산은 NFκB 유도성 프로모터에 의해 유도된다. TLR 리포터 세포주 활성화 결과는 광학 밀도값 (OD)으로 주어진다.

각 시험체 20 μl을 사용하여 최종 반응 부피 200 μl에서 hTLR2 리포터 세포주를 자극하였다. 샘플을 적어도 2가지 농도 -20 μM 및 10 μM으로 2회에 걸쳐 테스트했다.

세포 침투성의 평가 (양방향)

10μM의 시험체를 Caco-2 세포 단일막 (Caco-2 cell monolayers, 37℃에서 HBSS buffer 중 0.3% DMSO 및 5μM LY) 첨단 (A) 표면 (apical surface)에 첨가하고 90분 배양한 후, 기저 측면 (B) 부위 (basolateral compartment)로의 화합물 침투를 측정하였다. 이는 능동 수송을 조사하기 위해 반대 방향으로도 수행되었다 (basolateral에서 apical). LC-MS/MS는 시험군 및 표준 대조군 화합물의 수준을 정량화하는데 사용되었다. 유출율은 B에서 A로의 침투성을 B에서 A로의 침투성으로 나누어 계산하였다.

약물 침투성: Papp = (VA / (면적 × 시간)) × ([약물]수용체 / (([약물]초기, 공여자) × 희석 계수).

대사 안정성 평가 (마이크로좀 안정성 분석)

마이크로좀에서 대사율은 하기와 같이 테스트되었다:

인간 간 (liver) 마이크로좀을 버퍼 C (0.1 M 인산 칼륨 버퍼 (Potassium Phosphate buffer), 1.0 mM EDTA, pH 7.4)에 2.5mg/ml의 농도로 희석했다. 마이크로좀 안정성 연구는 웰에 30μL의 1.5μM 화합물 스피킹 용액 (compound spiking solution, 1.5μL의 500μM 스피킹용액 (1μM의 최종 시험 농도로 생성된 190μL ACN에 10μL의 10mM DMSO 저장 용액) 및 479.75μL의 버퍼 C 에 18.75μL의 20mg/mL 간 마이크로좀)을 첨가하여 수행되었다. 모든 샘플은 37℃에서 약 15분동안 사전 배양하였다. 이어서, 부드럽게 혼합하면서 15μL의 NADPH 용액 (6mM)을 첨가하여 반응을 개시하였다. 앨리?? (40μL)을 0, 5, 15, 30 및 45분에 제거하고 내부 표준 (internal standard, 135μL)을 함유한 ACN으로 ??칭 (quenching)하였다. 단백질은 원심분리 (4000rpm, 15분)를 통해 제거하고, 샘플 플레이트를 LC-MS/MS로 화합물 농도에 따라 분석하였다. 그 후, 반감기를 표준방법으로 계산하여 분석물의 농도와 원래 존재량을 비교하였다.

실시예

실시예 1: 화합물 1의 제조

az-AG의 제조

아지트로마이신 아글리콘 (Azithromycin aglycone)은 종래 문헌에 개시된 방법을 사용하여 생성하였다 (Djokic, S., et al., 1988). 간단히 말해 아지트로마이신은 3-O 및 5-O 당의 산성 제거에 의해 아지트로마이신 아글리콘으로 전환된다. 상기 5-O 아미노 당은 먼저 산화되고 절단을 위해 열분해된다 (pyrolyzed).

에리트로마이신 아글리콘을 (에리트로놀라이드, erythronolides) 글리코실화 할 수 있는 생물 변형 균주의 제조

S. erythraea 18A1 (pAES52)의 제조

actII-ORF4 pactI/III 발현 시스템과 함께 angAI, angAII, angCVI, ang-orf14, angMIII, angB, angMI 및 angMII을 포함하는 발현 플라스미드 pAES52 (Rowe et al., 1998)를 하기와 같이 생성하였다.

앙골라마이신 당 (angolamycin sugar) 생합성 유전자는 American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, USA)에서 얻은 Saccharopolys. eurythermus ATCC23956 균주의 코스미드 라이브러리 (cosmid library)로부터 증폭되었다. 생합성 유전자 클러스터 서열은 EU038272.1, EU220288.1 및 EU232693.1로 GeneBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 에 기탁되었다 (Schell, 2008).

생합성 유전자 카세트는 종래 개시된 방법 (Schell, 2008, ESI)으로 pSG144에서 조립되었으며, 당 생합성에 필요한 8가지가 얻어질 때까지, 순차 유전자 (sequential gene)를 추가하여 플라스미드 pAES52벡터를 생성하였다.

pAES52는 균주 18A1으로 형질전환되었다 (WO2005054265).

S.erythraea 18A1으로의 pAES52의 형질전환

pAES52는 표준 방법 (Kieser et al 2000, Gaisser et al. 1997)을 사용하여 원형질체 (protoplast)에 의해 S. erythraea 18A1로 형질전환되었다. 생성된 균주를 ISOM-4522로 명명하고, 이는 2017년 1월 24일 NCIMB(ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, UK)에 수탁번호: NCIMB 42718로 기탁되었다.

S. erythraea SGT2 (pAES54)의 제조

actII-ORF4 pactI/III 발현 시스템 (Rowe et al., 1998)과 함께 angAI, angAII, angCVI, ang-orf14, angMIII, angB, angMI 및 angMII를 포함하는 발현 플라스미드 pAES54를 다음과 같이 생성하였다.

앙골라 마이신 당 생합성 유전자는 American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, USA)에서 얻은 S. eurythermus ATCC23956 균주의 코스미드 라이브러리 (cosmid library)로부터 증폭되었다. 생합성 유전자 클러스터 서열은 EU038272, EU220288 및 EU232693으로 기탁되었다 (Schell, 2008).

생합성 유전자 카세트는 종래 개시된 방법 (Schell, 2008, ESI)으로 pSG144에서 조립되었으며, 당 생합성에 필요한 8가지가 얻어질 때까지, 순차 유전자 (sequential gene)를 추가하여 플라스미드 pAES52벡터를 생성하였다.

플라스미드 pAES54는 actII-ORF4 pactI/III 프로모터 시스템을 포함하는 11,541bp의 Spel-Nhel 단편을 라이게이션 (ligation)하여 제조하였으며, 8개의 ang 유전자는 아프라마이신 (apramycin) 내성 유전자, oriC, 스트렙토마이세트 (streptomycetes)로 형질전환 하기 위한 oriT 및 통합형 형질전환 (integrative transformation)을 위한 attP 부위를 갖는 phiBT1을 함유하는 pGP9 유래의 5,087bp Xbal-Spel 단편과 함께 pAES52로부터 추출하였다 (양립가능한 Nhel 및 Xbal 부위는 라이게이션 중 제거되었다).

이어서, pAES54를 S. erythraea SGT2 (Gaisser et al. 2000, WO2005054265)로 형질전환시켰다.

S. erythraea SGT2로의 pAES54의 형질전환

pAES54는 표준 방법을 사용하여 S. erythraea로의 접합 (conjugation)에 의해 전달되었다. 요약하면, E.coli pUZ8002를 표준 방법을 통해 pAES54로 형질전환하고, 아프라마이신 (Apramycin, 50μg/mL), 카나마이신 (Kanamycin, 50μg/mL), 클로람페니콜 (Chloramphenicol, 33 μg/mL) 셀렉션을 가지는 2TY 위에 도말하였다. 이 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다. 이의 콜로니는 늦은 로그 페이즈 (late log phase)에 도달할 때까지 37℃에서 배양된 신선한 액체 2TY 배양물을 셋팅하는데 사용되었다. 세포를 수확하고, 세척하고, S. erythraea SGT2의 포자와 혼합하고, R6의 플레이트 위에 도말하고, 28℃에서 배양하였다. 24시간 후, 상기 플레이트에 3mg 아프라마이신 및, 2.5mg 날리딕스산 (nalidixic acid)을 함유하는 1mL의 멸균수로 오버레이 (overlay)하고 28℃에서 5 내지 7일간 추가 배양하였다. 상기 플레이트상의 접합수용체 (Exconjugants)를 아프라마이신 (100μg/mL)을 함유한 R6의 새로운 플레이트로 옮겼다.

선택적 생물변형 균주

선택적으로, BIOT-2945 (Schell et al., 2008)이 생물변형 균주로서 사용될 수 있으며, 이는 또한 앙골로사민 (angolosamine)을 에리트로놀라이드 (erythronolides)에 추가하기 때문이다.

아지트로마이신 아글리콘의 생물변형

SV2 배지 (40 mL) 및 8 uL 티오트렙톤 (thiostrepton, 25 mg/mL)을 함유하는 아지트로마이신 아글리콘의 생물변형 Erlenmeyer 플라스크 (250mL)에 ISOM-4522 균주의 포자스톡 0.2mL를 접종하고, 2.5cm throw와 함께 30℃ 및 300rpm 진탕 조건에서 48시간 동안 배양하였다.

SV2 배지

EryPP 배지 (7mL)를 함유하는 멸균 번지드 팔콘 튜브 (Sterile bunged falcon tubes, 50 mL)를 준비하고 항생제 없이 시드 플라스크의 배양물로 접종하였다 (팔콘 튜브 당 0.5mL). 24시간 동안 팔콘을 30℃에서 배양 및 300rpm에서 2.5cm throw와 함께 진탕하였다.

ERRYPP 배지

24시간 후, 아지트로마이신 아글리콘 (DMSO 중 0.5mM, 50μL)을 각 팔콘 튜브에 첨가하고, 2.5 throw로 300rpm에서 추가 6일 동안 배양을 계속하였다.

화합물 1의 분리

전체 브로스 (broth)를 pH 9.5로 조정하고 1 볼륨의 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기층을 원심분리 (3,500rpm 25분) 후 흡입하여 수집하였다. 유기층을 진공 아래에서 결합하고 환원시켜 화합물 1을 함유하는 갈색 수지 (gum)를 나타내었다. 상기 추출물을 에틸 아세테이트 (200mL) 및 수성 염화 암모늄 (aqueous Ammonium Chloride, 50% 농축 용액 20ml) 사이에 분할하였다. 분할 후, 유기층을 추가 부피 (200ml)의 염화 암모늄 수용액으로 추출하였다. 이어서, 결합된 수성 층을 수산화 나트륨 (sodium hydroxide)으로 pH 9.6으로 조정하고, 1 부피 당량 (1 volume equivalent)의 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 유기층을 진공에서 유기층을 결합하고 갈색 고체로 환원시켰다. 사익 추출물을 실리카 컬럼에 적용하고, 하기의 물질로 단계적으로 (500ml 로트 (lots)에) 분리하였다:

화합물 1은 주로 F 및 G에 있었다. 이들 용매를 합하고 진공 아래에서 환원시켜 화합물 1을 함유하는 갈색 고체를 수득하였다. 이어서, 이 물질을 예비 HPLC (C18 Gemini NX 컬럼, 용매로서 20mM 암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴을 갖는 페노메넥스 (phenomenex)로 정제하였다. 표적 화합물을 함유하는 분획을 모으고 건조시켰으며, C18 SPE 카트리지에서 탈염하였다.

실시예 2: 직접적인 항박테리아 활성

일반적인 장내 박테리아의 4개 균주 (Escherichia coli, Streptococcus salivarius subsp. salivarius, Lactobacillus casei 및 Bifidobacterium longum subsp. infantis)와 일반적인 포유류 피부 분리 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus) 마크롤라이드 화합물의 생체 활성을 최소 억제 농도 (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 분석을 사용하여 평가하였다. 박테리아 균주는 NCIMB로부터 얻은 M.luteus를 제외하고 DSMZ (Brunswick, Germany)로부터 구매하여 -80℃에서 20% 글리세롤 안에 보관되었다. 양성 대조군 (아지트로마이신 및 에리트로마이신), 및 시험 화합물 1 및 2의 스톡 용액 (stock solution, 100% DMSO)을 256μg/mL의 작업 스톡 농도로 브로스에 희석하였다 (최종 분석 시험 농도 범위 128μg/mL 내지 0.00391μg/mL). 다른 모든 화합물의 스톡 용액을 128μg/mL의 작업 스톡농도로 브로스에 희석하였다 (최종 분석 시험 농도 범위 64μg/mL 내지 0.00195μg/mL). 호기성으로 37℃에서 배양한 M.luteus를 제외하고는 37℃의 무산소 챔버에서 적절한 브로스에서 배양하였다. 18h 배양물을 0.1의 OD595로 브로스에 희석하고 1:10으로 더 희석하였다. 96-웰 플레이트에서, 이중으로, 시험 화합물의 작업 스톡 200μL를 웰 1로 옮기고 브로스에 단계적으로 희석하였다 (1:2). 100μL 박테리아 현탁액을 각 웰에 앨리??하고 완전히 혼합하였다. 적잘한 멸균 대조군을 포함시키고, 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 무산소 챔버에서 또는 호기성으로 (M.luteus) 배양하였다. MIC는 육안으로 성장이 보이지 않는 첫 번째 웰의 시험 화합물의 농도로 결정되었다.

	Escherichia coli	Streptococcus salivarius	Lactobacillus casei	Bifidobacterium longum	Micrococcus luteus
아지트로마이신	<8 μg/ml	<0.5 μg/ml	<1.0 μg/ml	>64 μg/ml	0.125 μg/ml
에리트로마이신	>64 μg/ml	<0.06 μg/ml	<0.25 μg/ml	>64 μg/ml	<0.0625 μg/ml
화합물 1	>64 μg/ml	>64 μg/ml	>64 μg/ml	>64 μg/ml	>256 μg/ml
EM703					64-128 μg/ml

표 1에 나타난 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 화합물 1은 시험된 박테리아 균주에 대한 어떠한 항박테리아 활성도 나타내지 않고, 에리트로마이신 및 아지트로마이신은 다수의 균주에 대해 강력한 활성을 나타낸다.

실시예 3: 면역 자극 활성의 평가

인간 말초 혈액 단핵 세포 (Human peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)를 Ficoll-Paque 밀도 원심분리로 건강한 공여자로부터 정제하였다. 세포를 25mM HEPES, L-글루타민 (L-glutamine), 피루브산 나트륨 (Sodium pyruvate, Sigma), 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, Gibco), 100μg/mL 페니실린 (penicillin) 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 (streptomycin)으로 보충된 RPMI-1640 (Invitrogen)에서 배양하였다. 세포는 24시간 (연구 1-4) 또는 48시간 내지 1주 (연구 5) 동안 37℃, 5% CO2에서 조직 배양 플레이트의 화합물 1 및 2의 농도를 증가시켜 자극하였다. 상기 세포를 플레이트에서 제거하여 PBS로 세척하고, BD Pharmingen의 단일 클론 항체 및 FACS Canto II 유동 세포 계측기를 사용하여 유동 세포 계측법으로 세포 특이적 표면 마커 및 MHC class I의 발현을 분석하였다.

완전한 RPMI 배지, 37℃, 5% CO2-에서 2.5μM의 화합물 1 및 100U/mL IL-2 (Miltenyi Biotechnologies)와 함께 48시간 및 7일간 배양한 후, 표준 샌드위치 ELISA (BD Biosciences의 모든 항체)로 상등액 IL-10을 측정하였다.

연구 1: 1μM 화합물 1로 24시간의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 in vitro 자극 후 (도 1), 활성화 마커 CD69는 CD4+ T 세포 및 B 세포에서 상향 조절되었다 (도 2).

연구 2: T- 및 B- 세포에서 MHC class I (HLA-ABC) 분자의 상향 조절이 관찰되었는데 (도 3), 이는 바이러스 항원의 항원 제시에 대한 영향을 나타낸다.

연구 3: 화합물 1을 사용한 PBMC의 자극은 단핵구에서의 MHC class II (HLA-DR) 분자뿐만 아니라 공동 자극 분자 CD80의 상향 조절을 유도하였다 (도 4).

연구 4: 화합물 1에 의한 자극에 반응하여 대식세포로 분화된 단핵구도 CD80을 상향 조절하였다 (도 5).

연구 5: 48시간 및 7일간 화합물 1로 자극된 PBMC는 샌드위치 ELISA로 측정한 면역억제 사이토카인 IL-10의 생산 증가와 함께 변화된 사이토카인 프로파일을 나타내었다. 이는 특정 조건 아래에서의 면역 억제 효과를 나타낸다 (도 6).

연구 6: PMC를 화합물 1로 자극하고 IL-2 (Miltenyi Biotechnologies) 및 Cell Trace Violet Dye (Invi-trogen)의 존재 아래에서 RPMI 배지에서 6일동안 배양하였다. 증식은 유동 세포 계측법으로 측정하였다. 화합물 1의 면역학적 효과의 분석은 T세포의 변화된 사이토카인 유도된 증식 프로파일을 나타내었다 (도 7).

연구 7: 바이러스 특이적 T 세포 증식 또한 화합물 1에 의해 영향을 받았다. CMV 항원 및 화합물 1의 존재 아래에서 6일동안 배양된 거대세포바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 감염 기증자 유래의 PBMC는 유동 세포 계측법으로 측정된 IL-7 수용체 α (CD127)의 발현이 증가된 활성화된 CMV 특이적 CD8+T 세포의 표현형을 변화시켰다 (도 7). CD127은 T 세포의 항상성, 분화 및 기능에 중요하며, 감소된 발현은 HIV 및 기타 만성 바이러스성 질환의 발병도 (disease severity)와 관련이 있다 (Crawley et al Sem Imm 2012).

이로부터 알 수 있듯이, 화합물 1은 항원 제시, 공동 자극 및 T 세포의 활성화 및 증식에 영향을 미쳐, 면역 반응을 특이적으로 활성화 및 변형시키는 놀라운 능력을 갖는다. 이러한 연구들 중 많은 부분에서, 이전의 Schell et al, 2008에서 (화합물 20으로서) 발표된, 변형된 글리코실화를 갖는 또 다른 관련 마크롤라이드 에리트로마이신 유사체인 화합물 2가 포함되었고, 분석에서 거의 또는 전혀 활성이 없는 것으로 나타났다.

연구 8: CMV 감염 공여자 유래의 PBMC는 CMV 항원의 존재 아래에서 화합물 1 또는 2의 처리에 노출 또는 미처리하여 3일간 배양되었다. 화합물 1에의 노출은 높은 수준의 IFN-감마의 분비를 유도하였지만, 항원만의 배양 또는 화합물 2와 함께 항원의 배양은 IFN-감마 분비를 유도하지 않았다 (도 9).

연구 9: 48시간 동안 화합물 1 또는 2에 노출된 건강한 공여자 유래의 대식세포. 화합물 1에 노출된 대식세포만이 IFN-감마를 분비하는 반면 미처리 대식세포 및 화합물 2에 노출된 대식세포는 IFN-감마를 분비하지 않았다 (도 10). 따라서, 화합물 1은 건강한 공여자 유래의 대식세포에서 IFN-감마의 분비를 유도할 수 있다.

연구 10: 2일간 화합물 1 또는 2에 노출된 PBMC 및 대식세포 (도 11). PBMC에서 RANTES의 기저 발현 (Basal expression)은 화합물 2에 의해 영향을 받지 않았지만, 화합물 1은 2배 이상의 발현의 상향 조절을 유도했다. RANTES의 발현은 대식세포에서 매우 적었고 (miniscule), 화합물 1은 높은 발현을 유도하였다.

연구 11: 2일간 화합물 1 또는 2에 노출된 PBMC 및 대식세포. PBMC 및 대식세포는 화합물 1에 반응하여 IL-12p70을 분비하는 반면, 화합물 2는 처리되지 않은 세포에서와 같이 분비를 유도하지 못했다 (도 12).

연구 12: 2일간 화합물 1 및 2에 노출된 PBMC, 대식세포 및 CD4+ T 세포. IL-1β의 분비는 화합물 1에 의해 대식세포에서 증가되었고 PBMC에서 약간 증가한 반면, CD4+ T 세포에서는 IL-1β의 증가가 유도되지 않았다 (도 13).

연구 13: 화합물 1을 0.165 mg/kg 내지 5 mg/kg으로 C57bl/6 마이스에 i.v. 투여하였다. 5mg/kg의 가장 높은 용량으로 투여된 동물에서 CD25+ 세포 존재량이 증가하였고, 동일한 그룹에서 체중이 증가하였다 (표시되지 않음).

연구 14: 화합물 1 또는 2를 C57bl/6 마이스에 i.v. 투여하였다. 25시간후에 비장을 제거하고, CD11b+ 비장 세포에서 MHC class I 발현을 평가하였다. 화합물 1은 높은 MHC I 발현으로 비장 세포의 증가를 유도하였으나, 화합물 2를 주사한 마우스의 비장 세포에서는 아무런 효과도 관찰되지 않았다.

실시예 4: TLR2에 대한 활성의 평가

화합물은 TLR2 수용체의 자극을 측정한 TLR2 리포터 분석 (일반적 방법 참조)을 사용하여 시험되었다. 자극 효과는 분비된 알카라인 포스파테이즈 (SEAP)의 방출로 인한 음성 대조군 (OD) 대비 광학밀도의 증가로서 측정되었으며, 하기 표2에 나타내었다.

	20μM 시험물질 첨가 후 OD	10μM 시험물질 첨가 후 OD	5μM 시험물질 첨가 후 OD
에리트로마이신 A (Erythromycin A)	0.045	0.065	0.035
아지트로마이신 (Azithromycin)	0.031	0.045	0.029
화합물 2	0.044	0.010	0.046
화합물 1	0.458	0.202	0.111
EM703	-0.033	-0.024	-0.040
화합물 3	-0.026	-0.015	-0.043

보여진 바와 같이, 화합물 1은 5μM까지의 농도에서 TLR2를 자극하는 반면, 에리트로마이신 A, 아지트로마이신, EM703 (예, EP1350510 참조) 및 Schell et al, 2008에서 이전에 공개된 변형된 글리코실화를 갖는 관련 마크롤라이드 에리트로마이신 유사체인 화합물 2 및 3은 20μM까지의 농도에서 거의 자극을 나타내지 않았다.

실시예 5: caco-2 침투성의 평가

화합물은 표준 caco-2 양방향 침투성 분석을 사용하여 시험되었다 (일반적인 방법 참조). 생성된 데이터를 표 3에 나타내었다.

	A에서 B로의 투과성 (PappХ106/cm·s-1)	유출율 (Efflux ratio)
아지트로마이신 (Azithromycin)	<0.14	>77.6
화합물 1	0.32	63.4
EM703	<0.15	>108

표 3의 데이터로부터 보여진 바와 같이, 화합물 1은 아지트로마이신 및 EM703보다 더 많은 세포 침투성을 가지며 낮은 유출율을 갖는다 (예, EP1350510 참조).

실시예 6: 대사 안정성 평가

본 발명의 화합물의 대사 안정성은 표준 인간 마이크로좀 안정성 분석으로 평가되었다 (일반적인 방법 참조). 보다 긴 반감기를 갖는 화합물은 투약 이후에도 보다 긴 반감기를 가질 것으로 예상되며, 복용 주기를 줄이는 것이 더욱 유용할 수 있다. 짧은 반감기를 갖는 화합물은 활성 물질이 환자의 시스템에 들어가면 빠르게 분해되는 ‘소프트 약물 (soft drug)’로 사용하는데 더 유용할 수 있다. 화합물의 반감기는 하기 표 4에 나타내었다:

	T1/2 (분)
아지트로마이신 (Azithromycin)	245
에리트로마이신 (Erythromycin)	31
화합물 1	108
EM703	97

참조문헌

1. Gonadotropin secretion and its control. Fink G, The physiology of reproduction 1998.

2. Immunomodulatory actions of gonadal steroids may be mediated by gonadotro-pin-releasing hormone. Jacobson J D and Ansari M A, Endocrinology 2004;145(1):330-6.

3. Unusual morphologic features of uterine leiomyomas treated with gonadotropin-releasing hormone agonists: massive lymphoid infiltration and vasculitis. McClean G and McCluggage W G, Int J Surg Pathol.2003;11(4):339-44.

4. Massive lymphocytic infiltration of uterine leyomyomas associated with GnRH agonist treatment. Bardsley V et al., Histopathology 1998;33(1):80-2.

5. Chronic plasma cell endometritis in hysterectomy specimens of HIV-infected women: a retrospective analysis. Kerr-Layton J A et al., Infect Dis Obstet Gynecol. 1998;6(4):186-90

6. Serum dihydrotestosterone and testosterone concentrations in human immuno-deficiency virus-infected men with and without weight loss. Arver S et al., J Androl 1999;20(5):611-8.

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8. Gonadotropin-releasing hormone increases CD4-T-lymphocyte numbers in an animal model of immunodeficiency. Jacobson J D et al., J Allergy Clin Immunol. 1999;104:653-8.

9. Second gene for gonadotropin-releasing hormone in humans. White et al., PNAS 1998; Jan 6;95(1):305-9.

10. A transcriptionally active human type II gonadotropin-releasing hormone recep-tor gene homolog overlaps two genes in the antisense orientation on chromo-some 1q.12. Morgan et al., Endocrinology. 2003 Feb;144(2):423-36

11. Gonadotropin-releasing hormone (GnRH)-binding sites in human breast cancer cell lines and inhibitory effects of GnRH antagonists. Eidne et al., J Clin Endo-crinol Metab.1987 Mar;64(3):425-32

특허 및 특허출원을 포함하여 본 명세서에서 언급된 모든 참고 문헌은 가능한 최대한의 참고 자료로서 본 발명에 포함된다.

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Claims (8)

1. 화학식 (I)의 화합물
   
   화학식 (I)
   또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항의 화합물을 포함하는 바이러스 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물로,
   상기 바이러스 감염은 에이즈(AIDS), 보르나병(Borna Disease), 성기 사마귀(Condyloma Acuminata), 댕기 열(Dengue fever), ORF(Contagious Ecthyma), EI(Erythema Infectiosum), 바이러스성 출혈열(Viral Hemorrhagic Fever), 바이러스성 간염(Viral Hepatitis), 단순 포진(Herpes Simplex), 감염단핵구증(Infectious Mononucleosis), 인플루엔자(Influenza), 랏사 열(Lassa Fever), 홍역(Measles), 볼거리(Mumps), 전염성연속종(Molluscum Contagiosum), 플레보토무스 열(Phlebotomus fever), 리프트 계곡 열(Rift Valley Fever), 풍진(Rubella), 두창(Smallpox), 아급성 경화성 범뇌염(Subacute Sclerosing Panencephalitis), 종양 바이러스 감염(Tumor Virus Infections), 웨스트 나일 열(West Nile Fever), 황열(Yellow Fever) 및 광견병(Rabies)으로 구성된 군에서 선택되는 질병을 유발하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
5. 삭제
6. 제4항에 있어서, 상기 암은 부신 암(Adrenal Cancer), 항문암(Anal Cancer), 담관암(Bile Duct Cancer), 방광암(Bladder Cancer), 골암(Bone Cancer), 뇌/CNS 종양(Brain/CNS Tumors), 유방암(Breast Cancer), 캐슬만 병(Castleman Disease), 자궁경부암(Cervical Cancer), 결장/직장 암(Colon/Rectum Cancer), 자궁내막암(Endometrial Cancer), 식도암(Esophagus Cancer), 안암(Eye Cancer), 담낭암(Gallbladder Cancer), 위장관 카르시노이드 종양(Gastrointestinal Carcinoid Tumors), 위장관 기질 종양(Gastrointestinal Stromal Tumor; GIST), 임신 융모 질환(Gestational Trophoblastic Disease), 호지킨 병(Hodgkin Disease), 카포시 육종(Kaposi Sarcoma), 신장암(Kidney Cancer), 후두 및 하인두암(Laryngeal and Hypopharyngeal Cancer), 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia), 만성 림프구성 백혈병(Chronic Lymphocytic Leukemia), 급성 림프구성 백혈병(Acute Lymphocytic Leukemia), 만성 골수성 백혈병(Chronic Myeloid Leukemia), 만성 골수단핵구 백혈병(Chronic Myelomonocytic Leukemia), 간암(Liver Cancer), 비소세포 폐암(Non-Small Cell Lung Cancer), 소세포 폐암(Small Cell Lung Cancer), 폐 카르시노이드 종양(Lung Carcinoid Tumor), 림프종(Lymphoma), 악성 중피종(Malignant Mesothelioma), 다발성 골수종(Multiple Myeloma), 골수 이형성 증후군(Myelodysplastic Syndrome), 비강 및 부비동 암(Nasal Cavity and Paranasal Sinus Cancer), 비인두암(Nasopharyngeal Cancera), 신경 모세포종(Neuroblastoma), 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin Lymphoma), 구강 및 구인두암(Oral Cavity and Oropharyngeal Cancer), 골육종(Osteosarcoma), 난소암(Ovarian Cancer), 췌장암(Pancreatic Cancer), 음경암(Penile Cancer), 뇌하수체 종양(Pituitary Tumors), 전립선 암(Prostate Cancer), 망막모세포종(Retinoblastoma), 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma), 침샘암(Salivary Gland Cancer), 기저 및 편평 세포 피부암(Basal and Squamous Cell Skin Cancer), 흑색종(Melanoma), 메르켈 세포 피부암(Merkel Cell Skin Cancer), 소장암(Small Intestine Cancer), 위암(Stomach Cancer), 고환암(Testicular Cancer), 흉선암(Thymus Cancer), 갑상선암(Thyroid Cancer), 자궁육종(Uterine Sarcoma), 질암(Vaginal Cancer), 외음부암(Vulvar Cancer), 왈덴스트룀마크?峨紡觀恬건泰?(Waldenstrom Macroglobulinemia) 및 윌름스 종양(Wilms Tumor)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
   
7. 제1항의 화합물의 치료적으로 유효한 양을 이를 필요로 하는 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염성 질환의 예방 또는 치료방법으로,
   상기 바이러스 감염성 질환은 에이즈(AIDS), 보르나병(Borna Disease), 성기 사마귀(Condyloma Acuminata), 댕기 열(Dengue fever), ORF(Contagious Ecthyma), EI(Erythema Infectiosum), 바이러스성 출혈열(Viral Hemorrhagic Fever), 바이러스성 간염(Viral Hepatitis), 단순 포진(Herpes Simplex), 감염단핵구증(Infectious Mononucleosis), 인플루엔자(Influenza), 랏사 열(Lassa Fever), 홍역(Measles), 볼거리(Mumps), 전염성연속종(Molluscum Contagiosum), 플레보토무스 열(Phlebotomus fever), 리프트 계곡 열(Rift Valley Fever), 풍진(Rubella), 두창(Smallpox), 아급성 경화성 범뇌염(Subacute Sclerosing Panencephalitis), 종양 바이러스 감염(Tumor Virus Infections), 웨스트 나일 열(West Nile Fever), 황열(Yellow Fever) 및 광견병(Rabies)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염성 질환의 예방 또는 치료방법.
   
8. 제1항에 정의된 화합물의 제조방법으로,
   아글리콘 (aglycone)을 화학식 (II)와 함께 3-하이드록실 위치에서 글리코실화하는 생물변형 균주 (biotransformation strain)의 배양물에 첨가하는 단계를 포함하고,
   상기 생물변형 균주는 서열번호 1 (AngMII) 또는 서열번호 2 (AngMIII)와 70% 이상의 상동성을 갖는 글리코실전이효소 (glycosyltransferases)를 발현하는 것을 특징으로 하는 화합물의 제조방법.
   
   화학식 (II)