KR102557921B1

KR102557921B1 - 이뮤노피씨알에 사용되는 전립선 특이적 항원 검출용 조성물, 키트 및 그 응용

Info

Publication number: KR102557921B1
Application number: KR1020210023407A
Authority: KR
Inventors: 박영석; 이찬효; 이혜진
Original assignee: 주식회사 팍스젠바이오
Priority date: 2021-02-22
Filing date: 2021-02-22
Publication date: 2023-07-20
Also published as: KR20220119929A

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴크레오타이드를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 유효성분으로 포함하는 전립선 특이적 항원 검출용 조성물, 서열번호 2 및 3에 기재된 서열로 이루어진 프라이머쌍을 포함하는 전립선 특이적 항원 검출용 키트 및, 그 키트를 이용하여 혈액 (혈청, 혈장), 소변 등의 체외 가검물을 사용하여 체외 전립선염, 전립선비대증, 전립선암의 선별 진단에 대한 정보 제공방법에 관한 것이다.

Description

이뮤노피씨알에 사용되는 전립선 특이적 항원 검출용 조성물, 키트 및 그 응용{COMPOSTION FOR DETECTING PSA USING IMMUNO-PCR, KIT THEREFOR AND USE OF THE SAME}

본 발명은 이뮤노피씨알에 사용되는 전립선 특이적 항원 검출용 조성물, 키트 및 그 응용에 관한 것이다.

전립선은 정액에서의 한 성분인 유체를 생성하는 남성의 호두-크기의 샘(gland)이다. 전립선은 조직의 외부 층에 의해 에워싸인 2개 이상의 로브(lobe) 또는 섹션을 갖는다. 전립선은 직장의 앞에 그리고 방광(urine bladder) 바로 아래에 위치하며, 요도를 감싼다.

전립선암은 2018년 미국 남성 기준 신규 암환자 발생 1위, 암 사망 원인 2위로 알려져 있다. 한국에서는 2016년 남성 기준 신규 암환자 발생 4위로 알려져 있다. 전립선암은 대개 암이 진행된 후에만 증상이 있어서 선별검사가 예후를 결정하는 중요한 요인이 될 수 있으며, 현재, 전립선암의 진단 및 모니터링은 전형적으로는 환자의 혈액에서 전립선 특이적 항원(prostate specific antigen: PSA)의 농도를 측정함으로써 수행될 수 있다. PSA의 농도가 여러 시점에서 수행된 몇몇의 연속적 측정에서 뚜렷하게 높은 경우, 그 평가는 전립선암의 개연성(probability)이 존재한다는 것이다. 이 시점에서, 전립선암을 검증하기 위해 생검(biopsy)이 수행될 수 있다.

PSA는 전립선의 분비 세포에서 생성되는 237개의 아미노산의 단일 쇄로 구성된 단백질이다. 이들 분비 세포는 전체 전립선 샘에서 발견될 수 있다. PSA는 전립선암에 대해 잘 확립되고 전반적으로 연구된 마커이다.

PSA 상승은 이러한 특이항원이 상승하는 질환을 말한다. PSA가 비정상적인 수치를 보이면 암일 가능성이 있다. 그러나 전립선 비대증, 전립선염의 경우에도 PSA 수치가 상승할 수 있으므로, PSA 검사는 암을 의심하는 유용한 검사이지만 이 검사 자체가 암을 의미하지는 않는다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허공개번호 제10-2018-0053756호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 PSA 탐지용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 PSA 탐지용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 검체 중 PSA의 이상수치 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴크레오타이드를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 유효성분으로 포함하는 전립선 특이적 항원 검출용 조성물을 제공한다.

용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소) 을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 서열은 서열번호 2 및 3에 기재된 서열로 이루어진 것이 바람직하고,

상기 프로브 서열은 서열번호 4에 기재된 서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 서열번호 2 및 3에 기재된 서열로 이루어진 프라이머쌍을 포함하는 전립선 특이적 항원 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 서열번호 4에 기재된 서열로 이루어진 프로브를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 플레이트, 필름, 항체 코팅 분말, 세척 버퍼, 블록킹 버퍼, 대조군, 캡쳐 항체, 제품사용 설명서 및 검출 항체-올리고를 더욱 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한, 본 발명의 제품사용 설명서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다.

안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.

또 본 발명은 하나는 플레이트에 우선 흡착하는 PSA 포획 항체로 다른 하나는 올리고뉴크레오타이드와 접합된 PSA 탐지 항체를 사용하여, 반응 시간 동안 검체에 존재하는 PSA는 플레이트에 흡착된 PSA 항체와 결합하고 이미 항원-항체 접합에 올리고뉴크레오타이드가 접합된 PSA 항체가 결합하여 "샌드위치"를 형성하게 되고, 이어서 결합하지 않은 물질은 제거하고, 고정상에 결합된 복합체의 양은 PSA의 양에 비례하게 되고, 실시간 PCR 방법으로 측정하며, 여기서 상기 실시간 PCR 방법에서는 PSA 탐지 항체에 결합된 염기 서열을 인식하는 특이적인 서열번호 2 및 3의 프라이머와 형광 물질로 표지된 프로브를 이용하여 실시간으로 증폭 산물의 양을 측정하여 검체 중 PSA를 검출하는 단계를 포함하는 체외 전립선염, 전립선비대증, 전립선암의 선별 진단에 대한 정보 제공방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 이뮤노 피씨알을 이용하여 혈액이나 소변으로부터 유래한 샘플에서 PSA를 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플을 PSA에 대한 챕쳐 항체에 반응시키고, 상기 PSA를 인지할 수 있는 항체-올리고뉴크레오타이드 또는 압타머를 반응시키고, 상기 항체-올리고뉴크레오타이드 또는 압타머를 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 주형으로 사용하여 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2 및 3의 프라이머의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.

이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.

본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광, 화학발광단 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine) Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단 및/또는 3' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.

또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 RT-PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용할 수 있다.

표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam& Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명의 신규한 프라이머 쌍과 형광이 표지된 프로브가 요구되며, 본 발명에서 특정한 염기서열로 특정된 해당 프라이머 및 프로브를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기에서 FAM과 Quen(Quencher)는 형광염료를 의미한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 사람의 혈액(혈청, 혈장)에 존재하는 PSA (Total Prostate Specific Antigen)를 면역 중합효소연쇄반응 기술로 검출하여 전립선염, 전립선비대증, 전립선암 등의 선별 진단에 도움을 주는 체외진단용 의료기기(예를 들어 키트)에 관한 것이다.

본 발명의 키트(PaxSens^TM PSA Immuno-PCR Kit)는 혈청검체(serum)에서 PSA의 이상수치 여부를 검출할 수 있도록 설계된 체외진단키트이다.

본 발명의 PaxSens^TM PSA Immuno-PCR Kit는 ELISA기술과 Real-time PCR기술이 결합된 Immuno-PCR 기술로 항원을 검출하는 키트이다.

좀 더 상술하면, 본 발명의 PaxSens PSA Immuno-PCR Kit는 면역 중합효소연쇄반응 (Immuno-PCR) 기술을 이용하여 전립선 특이 항원 (Total Prostatic Specific Antigen)을 검출 제품으로 ELISA기술과 Real-time PCR기술이 결합된 방법을 사용한다.

Immuno-PCR 기술은 항원을 검출하는 기술로 ELISA기술과 Real-time PCR기술이 결합된 방법이다.

Sandwich ELISA기술에서는 두 개의 서로 다른 PSA 항체를 이용하여 하나는 플레이트에 우선 흡착하는 PSA 포획 항체로 다른 하나는 oligonucleotide와 접합된 PSA 탐지 항체로 사용한다.　반응 시간 동안 검체에 존재하는PSA는 플레이트에 된 PSA 항체와 결합하고 이미 항원-항체 접합에 oligonucleotide가 접합 PSA 항체가 결합하여 "Sandwich"를 형성하게 된다.　이어서 결합하지 않은 물질은 제거하고, 고정상에 결합된 복합체의 양은 PSA의 양에 비례하게 되고, Real-time PCR 방법으로 측정한다. Real-time PCR기술에서는 본 발명에서 고안된 PSA 탐지 항체에 결합된 염기 서열을 인식하는 특이적인 프라이머와 형광 물질로 표지된 프로브를 이용하여 실시간으로 증폭 산물의 양을 측정하여 검체 중 PSA를 검출한다.

본 발명의 키트는 일정 농도 이상의 PSA 수치를 Immuno-PCR 기술을 적용하여 확인할 수 있다. PSA는 전립선염, 전립선비대증, 전립선암 등의 진단을 위한 선별 검사시 사용되는 종양마커이며, 전립선 조직검사의 필요성을 결정하는데 도움이 된다. 미국 암협회 (https://www.cancer.org/)에 따르면, PSA의 수치가 2.5 ng/ml - 10 ng/ml사이는 gray zone으로 평가하고, 10 ng/ml 이상이면 전립선암의 가능성이 있다고 평가한다.

본 발명에서 사용된 분석장치는 QuantStudio 3 Real-Time PCR Instrument(유전자증폭장치, A28132, 체외 수인 15-1251호)이다.

본 발명에서 고안된 프라이머 및 프로브는 우수한 반복성 및 정확성을 가지며, 이러한 프라이머 및 프로브를 포함하는 키트는 정밀도, 분석적 및 임상적 민감도와 분석적 및 임상적 특이도가 우수하였다.

도 1은 이뮤노 피씨알과 ELISA의 기술에 대한 비교 그림,
도 2는 본 발명의 프라이머/프로브 서열의 반복성 실험 결과를 나타낸 그림,
도 3은 프라이머/프로브 서열의 정확성 실험 결과를 나타낸 그림,
도 4a는 본 발명의 키트의 외부 형태이고, 도 4b와 c는 각각 컴포넌트 1과 2의 내부 형태이다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1. 주형과 프라이머/프로브 서열 개발

1) PSA 검출을 위해 비특이적 결합을 막고 정확성을 확보하기 위하여 현재까지 발표된 생물의 genome에서 일치하는 sequence가 없는 것을 미국 국립생물정보센터 (NCBI) DB를 통하여 검증하고 PSA 특이적 검출을 위하여 Template로 개발하였다.

Template 서열(서열번호 1): CTATCAGTGTCAGAGAGCACATCTATGGACGGACGACTTGGTCACGGGAAAGACAACACTCGTTTCTTGAACTTGCTAGG

GC (%): 48.8

2) Immuno-PCR 수행 시 증폭 성능을 위하여 Template와 완벽하게 일치하며, Primer와 Probe 간의 간섭이 발생하지 않는 Oligo sequence를 확인하여 Primer와 Probe로 개발하였다.

Primer mix

(1) Primer forward Sequence(서열번호 2): TCAGTGTCAGAGAGCACATCTA

GC (%): 45.5

(2) Primer reverse Sequence(서열번호 3): AGCAAGTTCAAGAAACGAGTGT

GC (%): 40.9

(3) Probe Sequence(서열번호 4): FAM - ACGGACGACTTGGTCACGGGAAAGA - BHQ1

GC (%): 56.0

실시예 2. Primer/Probe 성능

1) 반복성

동일 Primer/Probe 농도와 동일 PCR 조건에서 반복 test를 수행하였고, 그 결과를 도 2 및 표 1에 기재하였다.

No.	Average
1	16.975
2	16.864
3	16.925
4	16.807
5	16.855
6	16.946
7	16.989
8	17.074
9	17.024
10	16.882

도 2 및 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 동일 조건의 10회 반복 시험으로 검체 간에 Ct 값의 차이가 0.3 Ct 이하로 확인되어 정확도가 확인되었다.

2) 정확성

Immuno-PCR 기술을 설계하고 PSA antigen의 검출 성능을 확인하였다. PSA antigen을 40 ng/ml-0.04 ng/ml의 농도로 1/10씩 연속 희석하여 2반복으로 검출한 결과 Ct값이 antigen의 농도에 반비례한 것으로 확인되었다. 이는 검출대상의 농도가 높아질수록 Ct 값이 낮아지는 real-time PCR의 원리에 일치하는 결과임을 보여주었다(도 3 및 표 2).

항원 희석 농도	PCR 결과 (Ct)		평균 값 (Ct)
log 4	8.79	8.63	8.71
log 3	11.99	12.13	12.06
log 2	15.25	15.44	15.35
log 1	18.47	18.57	18.52

도 2 및 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 희석으로 10배 농도 차이의 검체 간에 Ct 값의 차이가 3.3 Ct로 확인되어 정확도가 확인되었다.

실시예 3: 본 발명의 키트 및 그 사용

1. 검사 전 준비사항

- PaxSens PSA Immuno-PCR kit의 구성 시약 구성은 아래 표 3과 같다.

번호	구성 시약	용도	구입처 (국가) 또는 제조처
1	Plate	ELISA 및 PCR 반응용	Thermo Fisher Scientific (미국)
2	Immuno-Film	Plate 실링용	Excel Scientific (미국)
3	PCR-Film	PCR 실링용	Bio-Rad Laboratories (미국)
4	Antibody coating powder	ELISA 반응용	Sigma-Aldrich (미국)
5	Wash buffer (PBS)	ELISA 반응용	Thermo Fisher Scientific (미국)
6	Blocking buffer (BSA)	ELISA 반응용	Thermo Fisher Scientific (미국)
7	Control (Human PSA)	반응 결과 확인용	Fitzgerald Industries International (미국)
8	Capture antibody	ELISA 반응용	Fitzgerald Industries International (미국)
9	Detection antibody-oligo	PCR 반응용	Fitzgerald Industries International (미국) 제노텍 (한국)
10	PCR premix	PCR 반응용	엔지노믹스 (한국)
11	Primer mix	PCR 반응용	제노텍 (한국)

-모든 시약은 사용 시작 전 해동하여 사용한다.

-Antibody coating powder는 사용 전에 증류수 10 ml 과 희석하여 사용하고, 희석 후에는 2℃ ~ 8℃ 온도로 보관한다.

- Blocking buffer는 사용 전에 PBS에 10% 농도로 희석한다.

- 검체수에 맞는 Plate tube를 사용하고, 사용하지 않는 Plate tube는 Plate tray에서 분리하여 파우치에 보관한다.

2. 검사과정

1)Antibody coating powder를 증류수 10 ml 과 희석하여 antibody coating 용액을 제조한다.

2)Antibody coating 용액과 Capture antibody를 1000:1로 희석하고, Plate의 각 well 에 30 ㎕씩 분주한다.

3)Plate를 Immuno-Film 으로 밀봉하여 4℃에서 12시간 반응한다.

4)Immuno-Film 과 Well의 용액을 제거하고 Wash buffer 150 ㎕로 3회 washing 한다.

5)Plate의 각 well 에 Blocking buffer를 230 ㎕씩 분주한다.

6)Plate를 Immuno-Film 으로 밀봉하고 상온(25℃)에서 250 rpm 교반과 함께 1 시간 반응한다.

7)Immuno-Film 과 Well의 용액을 제거하고 Wash buffer 250 ㎕로 3회 washing 한다.

8)Plate의 2개 웰에 Control을 30 ㎕씩 분주하고 나머지 웰에 검체를 30 ㎕씩 2반복 (2개 well) 분주한다.

9)Plate를 Immuno-Film 으로 밀봉하고 상온(25℃)에서 250 rpm 교반과 함께 2 시간 반응한다.

10)Immuno-Film 과 Well의 용액을 제거하고 Wash buffer 150 ㎕로 3회 washing 한다.

11)Plate의 각 well 에 Detection antibody-oligo를 30 ㎕씩 분주한다.

12)Plate를 Immuno-Film 으로 밀봉하고 상온(25℃)에서 250 rpm 교반과 함께 1 시간 반응한다.

13)Immuno-Film 과 Well의 용액을 제거하고 Wash buffer 150 ㎕로 6회 washing 한다.

14)Plate를 tube를 tray에서 분리하여 96 well PCR tube rack (불포함)으로 옮겨둔다.

15)PCR 혼합물을 표 4와 같이 준비한다.

Components	1 Test
PCR premix	20 ㎕
Primer mix	20 ㎕
Total	40 ㎕

16)PCR 혼합물을 각 웰에 40 ㎕씩 분주하고 PCR-Film으로 밀봉한다.

17)Plate를 표 5의 PCR 반응조건에서 QuantStudio 3 장비를 이용하여 qPCR을 수행한다.

Step	Temperature	Times	Cycles
1	50˚C	4min	1 cycle
2	95˚C	4min	1 cycle
3	95˚C	15sec	30 cycles
4*	55˚C	1min	30 cycles
* FAM Detect

18)PCR 종료 후 결과를 판독한다.

3. 판정기준치

1) 판정 기준치 (Cut off value) 기준

미국 암협회 (https://www.cancer.org/)에서 제안하는 전립선암 환자 선별검사의 PSA 경계범위인 2.5 ng/ml - 10 ng/ml를 Gray zone으로 선정하였다. Gray zone의 중간값에 해당하는 6.25 ng/ml 농도의 Control을 이용하여 3.75 ng/ml 농도 차이에 해당하는 1.23 Ct를 이용하여 음성판정 기준값과 양성판정 기준값을 계산하였다.

2) 판정 기준치 (Cut off value) 산출

(1) Control의 평균 Ct 값을 구한다.

Control의 1번째 측정 Ct 값 + Control의 2번째 측정 Ct 값/2

(2) 판정 기준치를 구한다.

음성판정 기준치= Control의 평균 Ct 값 + 1.23 Ct

양성판정 기준치 = Control의 평균 Ct 값 - 1.23 Ct

(3) 검체의 IPCR 결과 Ct 값에 따라 검체를 판정하였다(표 6 참조).

Target Ct	결과 판정
검체 Ct > 음성판정 기준치	PSA 수치가 음성판정 기준치를 초과한다. “PSA detected, less than cut off”으로 보고.
양성판정 기준치 > 검체 Ct > 음성판정 기준치	PSA 수치가 판정 기준치 범위 내에 있다. "Cut off of PSA detected"으로 보고. PSA 이상수치 판단은 의사의 소견에 따른다.
검체 Ct < 양성판정 기준치	PSA 수치가 양성판정 기준치를 미달한다. “PSA detected, greater than cut off”으로 보고.

4. 정도관리

1) 본 키트에 Control의 평균 Ct 값은 12.9 Ct 이상 13.6 Ct 이하이어야 한다.

2) 반복 시험에 따른 두 값은 차이가 0.33 Ct 이하이어야 한다

만약이 기준에 적합하지 않을 경우에는 시험 기술상의 문제나 변질로 원인을 확인하여 재시험을 실시한다.

본 발명의 키트의 성능은 하기와 같다.

1. 분석적 민감도

공란한계 (Limit of blank, LOB): 18.5 Ct

공란한계는 분석물질이 없는 검체에서 95 % 확률로 관찰될 가능성이 있는 증폭 형광의 Ct값을 (60 회, 블랭크 검체 평균값 + 2SD) 계산하여 LOB를 분석하였다.

최소검출한계 (Limit of detection, LOD): 0.1 ng/ml

최소검출한계는 검출될 수 있는 최저 분석물질의 농도로 분석하였다(표 7 참조).

일련번호	검체 농도 (ng/ml)	반복횟수	PSA 검출수	PSA 검출율 (%)
1	50.0	20	20	100
2	10.0	20	20	100
3	1.0	20	20	100
4	0.1	20	20	100
5	0.01	20	5	25
6	0	20	0	0

2. 분석적 특이도

간섭반응

본 발명의 키트(PaxSens PSA Immuno-PCR Kit)의 간섭반응 평가 결과, 아래 물질의 각 농도에서 본 제품의 성능에 영향을 미치지 않는 것으로 확인하였다(표 8 참조).

간섭 물질	사용 농도
Hemoglobin	15mg/dl
Bilirubin	100 mg/dl
Flutamide	10 ug/ml
diethylstilbestrol	5 ug/ml
Aspirin	600 ug/ml

교차반응

본 발명의 키트(PaxSens PSA Immuno-PCR Kit)의 특이도 (Specificity) 평가 결과, 아래 물질의 각 농도에서 반응성이 확인되지 않아 본 제품의 성능에 영향을 미치지 않는 것으로 확인하였다(표 9 참조).

교차반응 물질	사용 농도
CEA	100 ng/ml
CEA	10 ng/ml
PSMA	100 ng/ml
PSMA	10 ng/ml
AGR2	100 ng/ml
AGR2	10 ng/ml

3. 정밀도

기 허가 받은 Elecsys total PSA (종양표지자면역검사시약, K02080.01, 체외 수허 12-2001 호)을 이용하여 검출된 결과에 따라 시험 검체를 고, 중, 저의 양성과 음성 그리고 경계범위(gray zone) 검체로 분류하였다.

Gray zone은 미국 암협회 (https://www.cancer.org/)에서 제안하는 전립선암 환자 선별검사의 PSA 경계범위인 2.5 ng/ml - 10 ng/ml로 선정하였다.

판정 기준치 (Cut off value) 기준

Gray zone의 중간값에 해당하는 6.25 ng/ml 농도의 control을 이용하여 3.75 ng/ml 농도 차이에 해당하는 1.23 Ct를 이용하여 음성판정 기준치와 양성판정 기준치를 계산하였다.

판정 기준치 (Cut off value) 산출

(1) Control의 평균 Ct 값을 구하였다.

Control의 1번째 측정 Ct 값 + Control의 2번째 측정 Ct 값 / 2

(2) 판정 기준치를 구하였다.

음성판정 기준치 = Control의 평균 Ct 값 + 1.23 Ct

양성판정 기준치 = Control의 평균 Ct 값 - 1.23 Ct

반복성

PSA 수치가 고, 중, 저의 양성검체와 음성검체 그리고 경계범위(gray zone) 검체를 하루 2회씩 10일간 반복 시험하여 평가결과 반복성이 확인되었다(표 10 참조).

검체	NT/NR*	CV**	OPA***
PSA negative (1.0 ng/ml)	20/20	2.72	100%
PSA gray zone(4.0 ng/ml)	20/20	2.61	100%
PSA low positive(20 ng/ml)	20/20	3.94	100%
PSA medium positive (50 ng/ml)	20/20	2.62	100%
PSA high positive(400 ng/ml)	20/20	2.16	100%

* NT/NR = Number of Test / Number of Reference

** CV = Coefficient of variation

*** OPA = Overall percent agreement

<110> PaxGenBio Co., Ltd. <120> COMPOSTION FOR DETECTING PSA USING IMMUNO-PCR, KIT THEREFOR AND USE OF THE SAME <130> P21-0014HS <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template <400> 1 ctatcagtgt cagagagcac atctatggac ggacgacttg gtcacgggaa agacaacact 60 cgtttcttga acttgctagg 80 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcagtgtcag agagcacatc tagc 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agcaagttca agaaacgagt gtgc 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 4 acggacgact tggtcacggg aaaga 25

Claims

서열번호 1의 올리고뉴크레오타이드를 검출할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 유효성분으로 포함하는 전립선 특이적 항원 검출용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 서열은 서열번호 2 및 3에 기재된 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 전립선 특이적 항원 검출용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프로브 서열은 서열번호 4에 기재된 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 전립선 특이적 항원 검출용 조성물.
서열번호 2 및 3에 기재된 서열로 이루어진 프라이머쌍을 포함하는 전립선 특이적 항원 검출용 키트.
제4항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 4에 기재된 서열로 이루어진 프로브를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 특이적 항원 검출용 키트.
제4항에 있어서, 상기 키트는 플레이트, 필름, 항체 코팅 분말, 세척 버퍼, 블록킹 버퍼, 대조군, 캡쳐 항체, 제품사용 설명서 및 검출 항체-올리고를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 특이적 항원 검출용 키트.
이뮤노 피씨알을 이용하여 혈액이나 소변으로부터 유래한 샘플에서 PSA를 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 샘플을 PSA에 대한 챕쳐 항체에 반응시키고, 상기 PSA를 인지할 수 있는 항체-올리고뉴크레오타이드 또는 압타머를 반응시키고, 상기 항체-올리고뉴크레오타이드 또는 압타머를 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 주형으로 사용하여 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하고,
여기서, 상기 프라이머는 서열번호 2 및 3의 프라이머의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
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