KR102548495B1

KR102548495B1 - 클루이베로마이세스 마르시아누스 jma-1 균주를 이용한 3-하이드록시 프로피온산의 생산방법

Info

Publication number: KR102548495B1
Application number: KR1020210047312A
Authority: KR
Inventors: 하석진; 강경곤; 박재범; 권덕호
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2023-06-26
Also published as: KR20220141138A

Abstract

본 발명은 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) JMA-1 균주를 이용한 3-하이드록시 프로피온산의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에서는 3-하이드록시 프로피온산을 효과적으로 발현시킬 수 있는 벡터 및 호스트(host)를 발굴하였다. 이를 통하여, 본 발명은 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주로부터 3-하이드록시 프로피온산의 발현을 효율적으로 유도할 수 있었다.

Description

클루이베로마이세스 마르시아누스 JMA-1 균주를 이용한 3-하이드록시 프로피온산의 생산방법 {Production method for 3-Hydroxypropionic acid with Kluyveromyces marxianus JMA-1}

본 발명은 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) JMA-1 균주를 이용한 3-하이드록시 프로피온산의 생산방법에 관한 것이다.

3-하이드록시 프로피온산 (3-Hydroxypropionic acid, 3-HP)은 고부가가치를 지닌 다양한 상업용 복합체들을 만들 수 있는 기초 물질 중 하나이다. 특히, 폴리(3-HP)와 같은 생분해성 고분자를 만드는데 주로 이용되며, 이렇게 생산된 폴리에스터의 경우 기존의 석유 기반 물질보다 생분해성이 우수하며 재생이 가능하다는 장점이 있어, 3-HP 생산과 관련된 연구들이 활발하게 진행되고 있다. 현재, 3-HP의 생산은 주로 생물학적 방법을 이용해 진행되며, 주로 폐간균(Klebsiella pneumonia), 대장균(Escherichia coli), 효모균(Saccharomyces cerevisiae) 등의 균주가 이용되고 있다.

한편, 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)는 열내성을 가진 것으로 알려진 효모 중 하나로, 일반적인 효모에 비해 비교적 높은 온도에서도 생육이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 열내성 균주를 이용할 경우 높은 온도에서 생육이 가능하기 때문에 냉각에 소모되는 비용을 감소시킬 수 있으며, 오염에 대한 위험이 줄어들 수 있다.

또한, 열내성 균주의 특성을 활용하여 바이오매스를 이용한 유용물질 생산 시 SSF(simultaneous saccharification and fermentation) 공정을 활용한 생산수율 및 생산성 증가도 기대할 수 있다. 클루이베로마이세스 마르시아누스는 자일로스를 대사할 수 있어, 목질계 바이오매스를 이용할 경우 기존의 균주보다 다양한 기질의 효율적인 이용이 가능하다.

하지만, 클루이베로마이세스 마르시아누스는 연구된 기간이 비교적 짧기 때문에 유전자 정보와 유전자 편집 도구가 미흡한 상황으로, 이를 해결하기 위해 유전공학적 접근을 통해 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주를 개량하려는 시도들이 계속되고 있는 실정이다.

한국등록특허 제10-2120996호(2020.06.03)에는, 3-하이드록시프로피온산 생산용 형질전환 메탄자화균 및 이의 용도에 관하여 개시되어 있다. 한국공개특허 제10-2015-0051081호 (2015.05.11)에는, 전사 인자 조작을 통하여 재프로그래밍된 유전자를 발현하는 내산성이 증가된 클루베로마이세스 마르시아누스에 관하여 개시되어 있다.

본 발명은 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주를 이용하여 3-하이드록시 프로피온산을 생산함에 있어, 이의 생산수율을 높일 수 있는 방법을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 MCR (malonyl-CoA reductase) 유전자가 과발현되도록 형질전환되며, ACC1 (Acetly-CoA carboxylase 1) 유전자가 과발현되도록 형질전환된 재조합 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus)를 제공한다.

본 발명의 재조합 클루이베로마이세스 마르시아누스에 있어, 상기 MCR (malonyl-CoA reductase) 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 핵산서열로 구성되고, 상기 ACC1 (Acetly-CoA carboxylase 1) 유전자는 바람직하게는 서열번호 6의 핵산서열로 구성되는 것이 좋다.

이때, 상기 재조합 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus)는, 바람직하게는 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) JMA-1 균주 (수탁번호: KCTC18897P)인 것이 좋다.

한편, 본 발명은 상기의 재조합 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus)를 배양하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시 프로피온산 (3-Hydroxypropionic acid)의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 3-하이드록시 프로피온산 생산방법에 있어, 상기 배양은, 바람직하게는 호기성 조건에서 수행되는 것이 좋다.

본 발명의 3-하이드록시 프로피온산 생산방법에 있어, 상기 배양은, 바람직하게는 기질로 해양바이오매스를 이용하는 것이 좋다.

본 발명에서는 3-하이드록시 프로피온산을 효과적으로 발현시킬 수 있는 벡터 및 호스트(host)를 발굴하였다. 이를 통하여, 본 발명은 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주로부터 3-하이드록시 프로피온산의 발현을 효율적으로 유도할 수 있었다.

도 1은 본 발명 재조합 균주의 3-HP 생합성 경로를 나타낸 모식도이다.
도 2는 교반속도에 따른 3-하이드록시 프로피온산의 생합성 결과를 비교한 결과이다.
도 3은 진탕 삼각 플라스크 (Baffled flask)를 이용한 3-하이드록시 프로피온산의 생합성 결과를 비교한 결과이다.
도 4는 갈락토오스를 기질로 이용한 3-하이드록시 프로피온산의 생합성 결과를 비교한 결과이다.

클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) 균주를 이용한 3-HP 생산의 경우, 코엔자임-B₁₂(Coenzyme-B_12,Co-B₁₂)를 필요로 하는 글리세롤 탈수과정에 의해 진행된다. 또 다른 경로로 말로닐-코에이(malonyl-CoA)를 기질로 이용할 수 있는 경로도 존재하며, 말로닐-코에이는 대부분의 세포에 존재하는 중간물질로 이를 이용한 3-HP 생합성 경로의 경우 추가적인 기질을 필요로 하지 않는다는 장점이 있다. 또한, 3-HP는 바이오매스의 고부가가치 제품이므로 친환경 소재로, 생분해성을 가지며 무해하다는 장점이 있다.

따라서, 본 발명은 추가적인 기질의 필요없이 효과적으로 3-HP를 생산하기 위하여 연구한 결과, MCR (malonyl-CoA reductase) 유전자가 과발현되도록 형질전환되며, ACC1 (Acetly-CoA carboxylase 1) 유전자가 과발현되도록 형질전환된 재조합 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus)를 개발하여 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 재조합 클루이베로마이세스 마르시아누스에 있어, 상기 MCR (malonyl-CoA reductase) 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 핵산서열로 구성되고, 상기 ACC1 (Acetly-CoA carboxylase 1) 유전자는 바람직하게는 서열번호 6의 핵산서열로 구성되는 것이 좋다.

더욱 구체적으로, 본 발명의 재조합 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus, K. marxianus)는 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주에서 효과적으로 발현되도록 K. marxianus에 맞춰, 클로로플렉서스 아우란티아쿠스 (Chloroflexus aurantiacus) 균주로부터 유래한 코돈 최적화된 말로닐-코에이 환원효소(Malonyl-CoA reductase, MCR) 유전자 (서열번호 1)를 랜덤 인터그레이션(random integration) 방법을 이용하여 K. marxianus 17555-JBP2 균주에 도입하고, 순차적으로 클루이베로마이세스 마르시아누스 17555 균주로부터 유래한 코돈 최적화된 아세틸-코에이 카르복실라제 1 (Acetly-CoA carboxylase 1, ACC1) 유전자 (서열번호 6)를 랜덤 인터그레이션 방법을 이용하여 K. marxianus JBP2_MCR1 균주에 도입하여 최종적으로 'K. marxianus JMA-1'을 제작하고, 해당 균주에서 상기한 유전자들의 과발현을 유도함으로써, 3-HP를 생산할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 상기 재조합 클루이베로마이세스 마르시아누스는, 바람직하게는 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) JMA-1 균주 (수탁번호: KCTC18897P)인 것이 좋다.

이에, 본 발명은 또한 상기의 'K. marxianus JMA-1 (수탁번호: KCTC18897P)'을 제작하기 위해 이용되는 서열번호 1 내지 9 중 선택되는 어느 하나 이상의 핵산서열 또는 상기 핵산서열이 삽입된 벡터를 추가로 더 제공할 수도 있다.

본 발명에서, 용어 "유전자"는 유전정보를 결정하는 구조단위를 의미하는 것으로, 단백질의 아미노산 서열 또는 기능 RNA(tRNA, rRNA 등)의 염기 배열을 결정하는 정보를 가지는 구조 유전자, 및/또는 구조유전자의 발현을 제어하는 조절유전자(예를 들면, 프로모터, 억제자(repressor), 작동유전자(operator) 등)를 포함한다. 본 발명에서 용어 "유전자"는 유전자의 산물을 생성하기 위해 전사되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일가닥 쪽을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들면 "유전자의 뉴클레오티드 서열"은 유전자의 산물을 생성하기 위해 전사되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일가닥에 포함된 기능을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 구조유전자의 발현을 제어하는 뉴클레오티드 서열을 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg²⁺의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.

상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오티드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오티드의 변형이 가능하다. 또한, 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용하는 '발현'이라는 용어는, 본 발명의 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주가 자체적으로 발현시킬 수 없는 효소를, 인위적으로 발현시키기 위해 외부 유래의 유전자를 균주 내로 도입하여 발현시키는 것을 의미하고, '과발현'이라는 용어는 본 발명의 클루이베로마이세스 마르시아누스 균주가 자체적으로 해당 효소를 암호화하는 유전자를 가져 스스로 발현시킬 수 있으나, 대량생산을 위한 목적으로 이의 발현량을 증대시키기 위해 인위적으로 해당 효소의 발현량을 증대시켜 과발현한 것을 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드(핵산)의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "재조합 미생물(균주)"은 재조합 벡터로 형질전환된 것을 말한다. 본 발명에서 "형질전환"은 본 발명에 따른 프로모터, 또는 추가적으로 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입 하는 것을 의미한다. 또한, 형질전환된 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다.

이때, 상기 배양은, 바람직하게는 호기성 조건에서 수행되는 것이 좋다. 본 발명의 일 실시예에서는 삼각 플라스크(erlenmeyer flask)를 이용하는 대신 진탕 삼각 플라스크(baffled flask)를 이용하였을 시, 3-HP의 생산량 및 생산성이 모두 크게 증가하였음을 확인하였다.

또한, 상기 배양은, 바람직하게는 기질로 해양바이오매스를 이용하는 것이 좋은데, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 재조합 균주가 기질로 글루코오스 및 갈락토오스 모두를 이용하여 3-HP를 생산할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명 재조합 균주의 해양바이오매스의 주성분인 글루코스와 갈락토오스를 모두 이용한 3-HP 생합성능을 확인하였다.

또한, 상기 배양은, 바람직하게는 50 내지 500rpm, 더욱 바람직하게는 100 내지 300rpm에서 수행되는 것이 좋은데, 해당 조건에서 본 발명의 재조합 균주의 3-HP 생산량 및 생산성이 모두 크게 증가함을 확인하였기 때문이다. 균주의 배양에 관한 일반적인 기술들은 널리 알려져 있기 때문에, 상기 교반속도, 기질이용 및 호기조건 외에 다른 사항에 관한 설명은 생략하기로 한다.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

<실시예 1: 유전자 최적화 및 발현 벡터의 개발>

본 발명에서 재조합 K. marxianus 균주를 이용하여 글루코스로부터 3-HP를 생합성하기 위해서는, 아세틸-코에이(acetyl-CoA)를 말로닐-코에이(malonyl-CoA)로 전환하는 아세틸-코에이 카르복실라제(acetyl-CoA carboxylase)와 말로닐 코에이를 3-HP로 전환하기 위한 말로닐-코에이 환원효소(malonyl-CoA reductase)의 발현이 요구된다.

따라서, 본 실험은 본 발명 재조합 균주의 3-HP 생합성 경로를 구성한 모식도 (도 1)를 기준으로 효과적인 3-HP 생산을 위하여, 하기와 같이 유전자를 최적화하고 발현 벡터를 개발하였다. 도 1은 본 발명 재조합 균주의 3-HP 생합성 경로를 나타낸 모식도이다.

1. 말로닐-코에이 환원효소(Malonyl-CoA reductase, MCR ) 유전자의 과발현

클로로플렉서스 아우란티아쿠스 (Chloroflexus aurantiacus) 균주로부터 유래한 말로닐-코에이 환원효소(Malonyl-CoA reductase, MCR) 유전자를 클루이베로마이세스 마르시아누스 (K. marxianus) 균주에 삽입하기 위하여, Integrated DNA Technologies, Inc.의 홈페이지에서 제공하는 Codon Optimization Tool을 이용하여 MCR 유전자의 코돈 최적화를 진행한 후 마크로젠(Seoul, Republic of Korea)사에 의뢰하여 DNA 합성을 진행하였다.

구체적으로, 본 실험의 코돈 최적화된 MCR 유전자(서열번호 1)를 확보하기 위하여, MCR_F_SpeI(서열번호 2) 및 MCR_R_XhoI(서열번호 3) 프라이머를 이용하여 PCR을 통한 유전자 증폭을 진행하였다. 그 후, 코돈 최적화된 MCR 유전자의 염기서열을 기존 MCR 유전자의 염기서열과 비교하였다. 본 발명의 코돈 최적화된 MCR 유전자는 기존 클로로플렉서스 아우란티아쿠스 (Chloroflexus aurantiacus)로부터 유래한 MCR 유전자와 그 서열에 차이가 있어, 상이한 서열을 가짐을 확인하였다 (미도시).

이후, 제한효소를 이용하여 확보한 유전자를 pJSKM316-GPD 벡터에 삽입한 후, ScURA3_F (서열번호 4) 및 CYC_R (서열번호 5) 프라이머를 이용하여 MCR 및 CYC-terminator 유전자를 포함한 DNA 카세트를 PCR을 통해 증폭하였다. 한편, 코돈 최적화된 MCR 유전자의 서열 및 MCR 유전자가 과발현된 클루이베로마이세스 마르시아누스를 제작하기 위한 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

또한, 클루이베로마이세스 마르시아누스 17555-JBP2 균주에 MCR 유전자를 포함한 DNA 카세트를 삽입하기 위해 Ez-Yeast Transformation Kit (MP biochemicals, California, USA)를 사용하였으며, 형질전환 이후 MCR 유전자를 포함한 DNA 카세트가 삽입된 균주를 선별하기 위해 우라실(uracil)이 결여된 합성배지에 도말한 후 30℃ 온도조건에서 3일간 배양하여 선별하였다. 본 발명에서는 이렇게 선별한 균주를 'K. marxianus JBP2_MCR1'이라 명명하기로 한다.

상기 단계의 상세한 내용은 본 발명자가 기존 공지한 'Kluyveromyces marxianus 균주를 이용한 3-Hydroxypropionic acid 생산(Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 35(4): 337-341 (2020))'에 관한 문헌을 참고할 수 있다.

서열번호	서열명	핵산서열 (5'→3')
1	코돈 최적화된 MCR 유전자	ATGAGCGGGACAGGCAGATTGGCCGGTAAAATTGCACTGATCACCGGAGGGGCCGGTAATATCGGAAGCGAGTTGACCAGACGTTTTTTGGCTGAAGGCGCCACAGTTATCATCTCTGGTCGTAACCGTGCAAAGTTAACTGCACTGGCTGAAAGGATGCAAGCAGAAGCGGGAGTCCCGGCTAAAAGAATCGACCTGGAGGTTATGGACGGATCTGACCCGGTCGCTGTCCGTGCTGGGATAGAGGCGATTGTAGCCAGGCATGGACAAATTGACATATTGGTGAACAATGCGGGAAGTGCCGGGGCGCAACGTAGACTGGCCGAGATTCCCTTAACTGAGGCAGAATTAGGTCCAGGTGCAGAAGAGACTCTACACGCCTCCATTGCCAACCTATTAGGAATGGGCTGGCACTTAATGCGTATCGCCGCTCCCCACATGCCGGTAGGCTCAGCAGTGATTAATGTTTCTACCATCTTTTCCAGGGCCGAATACTATGGTCGTATACCGTATGTGACGCCCAAAGCCGCCCTTAACGCGTTAAGCCAGCTAGCAGCACGTGAGTTGGGGGCAAGGGGCATTCGTGTCAATACCATATTTCCCGGCCCTATCGAATCCGATAGAATCAGGACCGTATTTCAGCGTATGGATCAACTAAAAGGCAGACCCGAAGGCGATACTGCGCACCATTTCTTGAACACAATGCGTTTATGTAGGGCTAATGACCAAGGAGCACTTGAACGTAGATTTCCGAGCGTTGGCGACGTAGCGGATGCTGCTGTCTTCTTAGCGTCTGCAGAGAGTGCGGCTTTATCAGGGGAAACTATTGAGGTTACGCACGGCATGGAGCTACCAGCCTGTTCCGAGACAAGCTTATTGGCACGTACCGATTTAAGGACTATTGACGCGAGCGGGAGGACTACCCTAATCTGCGCCGGAGATCAAATCGAGGAGGTAATGGCATTGACTGGAATGTTGAGAACATGCGGCAGTGAGGTGATCATCGGTTTTCGTTCCGCCGcCGCCCTGGCGCAGTTTGAGCAGGCTGTGAACGAAAGTCGTCGTCTGGCAGGAGCCGACTTTACCCCGCCGATCGCGCTTCCTCTAGATCCTAGAGATCCAGCGACCATTGATGCCGTTTTTGATTGGGGGGCGGGAGAGAACACTGGGGGGATTCATGCCGCTGTGATCTTGCCGGCGACATCCCATGAGCCTGCCCCGTGCGTGATTGAGGTTGACGACGAGAGAGTCTTGAATTTCTTGGCGGATGAGATAACAGGTACGATCGTGATCGCTTCCAGGCTTGCCCGTTATTGGCAATCCCAAAGACTGACGCCCGGTGCCCGTGCTAGGGGCCCGAGGGTAATCTTTCTGTCCAATGGAGCTGACCAGAATGGCAACGTCTACGGAAGAATCCAGAGTGCTGCGATCGGACAGCTTATTAGGGTTTGGAGGCATGAAGCTGARTTGGATTATCAGAGAGCGTCAGCCGCTGGCGATCATGTGCTTCCTCCGGtATGGGCTAATCAGATCGTAAGATTCGCGAACAGAAGTCTAGAAGGCCTAGAATTCGCGTGTGCTTGGACGGCGCAACTTCTTCATTCCCAGCGTCACATCAACGAAATCACCTTGAATATACCGGCTAATATTTCTGCGACCACCGGCGCCAGAAGCGCCAGCGTAGGATGGGCCGAATCACTGATCGGATTACACCTAGGGAAGGTGGCGCTGATAACCGGAGGTTCTGCTGGGATAGGCGGTCAAATCGGGAGACTGTTGGCGTTGAGTGGCGCTCGTGTGATGCTGGCCGCTAGAGACCGTCACAAGCTGGAGCAGATGCAAGCCATGATTCAATCTGAGTTGGCGGAAGTCGGTTATACCGACGTAGAAGATCGTGTACACATCGCACCTGGTTGCGATGTATCCTCCGAGGCACAACTTGCGGATCTTGTCGAAAGAACGCTTAGCGCCTTTGGGACTGTTGACTATTTAATCAACAATGCAGGCATAGCTGGTGTAGAGGAAATGGTTATAGATATGCCTGTAGAGGGTTGGCGTCACACGTTGTTCGCCaATTTAATCAGCAACTATTCATTGATGCGTAAATTAGCGCCTCTAATGAAAAAGCAAGGCTCAGGATACATCTTAAATGTGTCCAGTTATTTCGGAGGCGAGAAAGACGCGGCTATACCTTACCCTAACAGAGCGGATTACGCCGTCTCCAAGGCGGGTCAAAGAGCCATGGCGGAGGTCTTTGCGAGGTTTTTAGGTCCCGAAATTCAGATAAATGCAATCGCGCCAGGGCCGGTGGAAGGCGATAGATTAAGGGGCACTGGCGAAAGGCCTGGGCTATTTGCGAGACGTGCTCGTCTGATCCTTGAAAACAAGAGGCTAAATGAATTACACGCAGCTCTAATCGCTGCCGCGAGAACGGACGAAAGGAGCATGCACGAGCTAGTTGAGTTGCTTTTACCGAATGACGTTGCCGCCCTTGAACAAAATCCTGCAGCTCCGACTGCTCTTAGAGAGTTGGCGAGAAGGTTTAGGTCTGAAGGTGATCCAGCCGCTTCATCTTCATCTGCGTTGTTGAATAGAAGTATCGCGGCAAAATTACTGGCCAGATTACATAATGGAGGATACGTGCTGCCCGCAGATATATTCGCGAACTTGCCAAACCCTCCGGATCCCTTTTTCACGAGAGCACAGATCGACCGTGAAGCCCGTAAGGTTAGAGACGGCATCATGGGTATGCTGTACCTTCAGCGTATGCCTACAGAATTTGACGTGGCCATGGCCACCGTCTATTATTTGGCCGACAGAAATGTTAGCGGAGAAACTTTTCACCCCTCAGGTGGACTTAGATATGAGAGAACACCCACAGGGGGGGAGTTGTTCGGCTTACCTTCCCCAGAGCGTTTGGCCGAGCTTGTGGGTTCAACTGTTTACCTGATAGGCGAGCACCTAACGGAGCACCTTAACTTATTAGCTAGAGCGTATCTAGAGCGTTATGGAGCAAGACAAGTTGTAATGATAGTTGAAACAGAAACAGGGGCAGAGACGATGCGTAGGCTTTTACATGACCACGTCGAAGCCGGTCGTCTTATGACAATTGTCGCTGGAGACCAGATCGAAGCTGCCATAGATCAAGCTATTACGAGATATGGGAGACCTGGACCAGTCGTTTGTACGCCATTCAGGCCTCTACCAACCGTGCCTTTGGTTGGTCGTAAGGATAGTGACTGGTCCACCGTTTTAAGTGAGGCAGAGTTTGCTGAGTTATGCGAACACCAACTGACACACCATTTCAGAGTAGCTCGTAAGATTGCACTGTCTGATGGGGCCAGTCTTGCCCTTGTAACTCCCGAGACCACTGCCACTTCTACTACCGAACAGTTTGCCTTGGCAAACTTTATTAAGACCACTCTTCATGCGTTCACCGCTACCATTGGCGTTGAATCTGAACGTACAGCACAACGTATTCTAATAAATCAGGTTGATCTAACCAGACGTGCAAGGGCCGAAGAACCGCGTGACCCACACGAGAGGCAGCAAGAACTAGAGAGGTTTATCGAAGCTGTCCTGTTGGTCACTGCTCCGCTGCCACCTGAAGCTGATACCCGTTATGCTGGGAGGATACACCGTGGTAGAGCCATAACCGTATAA
2	MCR_F_SpeI	GGACTAGTATGAGCGGGACAGGCA
3	MCR_R_XhoI	CCGCTCGAGTTATACGGTTATGGCTCTACCACG
4	ScURA3_F	TTCAATTCAATTCATCATTT
5	CYC_R	GGCCGCAAATTAAAGCCTTC

2. 아세틸-코에이 카르복실라제 (Acetyl-CoA carboxylase 1, ACC1 ) 유전자의 과발현

클루이베로마이세스 마르시아누스 17555 균주의 아세틸-코에이 카르복실라제 1 (Acetly-CoA carboxylase 1, ACC1) 유전자를 상기 과정 1에서 선별한 클루이베로마이세스 마르시아누스 JBP2_MCR1 균주에 삽입하여, ACC1 유전자가 과발현된 클루이베로마이세스 마르시아누스 JMA-1 균주를 제작하고자 하였다.

구체적으로, 본 실험의 코돈 최적화된 ACC1 유전자(서열번호 6)를 확보하기 위하여, ACC1_F_Xma1 (서열번호 7) 및 AAC1_R_Xho1 (서열번호 8) 프라이머를 이용하여 PCR을 통한 유전자 증폭을 진행하였다. 그 후, 코돈 최적화된 ACC1 유전자의 염기서열을 기존 ACC1 유전자의 염기서열과 비교하였다. 본 발명의 코돈 최적화된 ACC1 유전자는 기존 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus) 17555로부터 유래한 ACC1 유전자와 그 서열에 차이가 있어, 상이한 서열을 가짐을 확인하였다 (미도시).

이후, 제한효소를 이용하여 확보한 유전자를 pJSKM316-GPD 벡터에 삽입한 후 ScURA3_F (서열번호 9) 및 CYC_R (서열번호 5) 프라이머를 이용하여 ACC1 및 CYC-terminator 유전자를 포함한 DNA 카세트를 PCR을 통해 증폭하였다. 한편, 코돈 최적화된 ACC1 유전자가 과발현된 클루이베로마이세스 마르시아누스를 제작하기 위한 프라이머 서열을 하기 표 2에 나타내었다.

또한, 클루이베로마이세스 마르시아누스 JBP2_MCR1 균주에 ACC1 유전자를 포함한 DNA 카세트를 삽입하기 위하여, Ez-Yeast Transformation Kit (MP biochemicals, California, USA)를 사용하였으며, 형질전환 이후 ACC1 유전자를 포함한 DNA 카세트가 삽입된 균주를 선별하기 위해 우라실(uracil)이 결여된 합성배지에 도말한 후 30℃ 온도조건에서 3일간 배양하여 선별하였다. 본 발명에서는 이렇게 선별한 균주를 'K. marxianus JMA-1'이라 명명하고, 2021년 03월 30일에 한국생명공학연구원에 이를 수탁하여, 수탁번호 KCTC18897P를 부여받았다.

서열번호	서열명	핵산서열 (5'→3')
6	코돈 최적화된 ACC1 유전자	ATGAGTGAAGAAAATCTTTCTGAGGTTTCCATTTCTCAGAGCCAACAGTATGAAGTTACTGACTTCAGTCACAGACATTCAAAACTAGCGCCACATTTCATCGGGTTAAACACTGTTGACAAAGTCGAAGATTCTCCATTAAAGGAATTTGTTAAATCACATGGCGGTCATACAGTCATCTCAAAAATCTTGATCGCAAACAATGGTATTGCTGCCGTAAAAGAGATCAGATCCGTACGTAAGTGGTCTTACGAAATTTTTGGCGATGAAAGGACTGTACAATTCGTAGCAATGGCTACACCAGAAGATCTTGAAGCAAATGCGGAATACATCCGTATGGCTGATCAGTATATCGAAGTTCCAGGTGGAACAAATAACAATAACTACGCTAACGTCGACCTTATCGTAGAAGTTGCTGAAAGAGCCGATGTTGATGCCGTTTGGGCTGGTTGGGGTCATGCTTCCGAAAATCCTCTGCTTCCAGAAAGATTGGCTGCTTCCAAGAGAAAAATCATCTTTATTGGTCCACCAGGTAACGCAATGAGATCTCTAGGTGACAAGATTTCGTCAACTATTGTCGCCCAACATGCCAAGGTTCCATGTATTCCATGGTCAGGTACTGGCGTCGATGAAGTCCACATAGATAAGGAAACTAACCTAGTTTCTGTCGATGAAGAAGTATACCAAAAAGGTTGCTGTTCCTCTCCAGAAGATGGTTTAAAGAAAGCTAAACAAATTGGCTTTCCAGTGATGATCAAGGCATCAGAAGGTGGTGGTGGTAAAGGTATCAGAAAGGTCGAAAATGAAGAAGAATTCCTTTCATTGTATCAACAAGCTGCTAACGAAATTCCAGGTTCTCCAATTTTCATTATGAAGTTGGCTGGTAAAGCCCGTCATTTGGAAGTTCAATTGCTTGCTGATCAATACGGTACTAATATTTCTCTATTCGGTCGTGACTGTTCCGTTCAAAGACGTCATCAAAAAATCATCGAAGAAGCCCCTGTCACTATTGCAAAGCCTCAAACATTCACAGAAATGGAAAAGGCAGCAGTTAGATTAGGTCAATTAGTCGGTTACGTGTCTGCAGGTACAGTTGAATACTTATACTCGCATGACGAGGATAAGTTCTACTTCTTGGAATTAAACCCAAGATTACAAGTGGAGCATCCAACTACCGAAATGGTCACAGGTGTGAACTTACCAGCAGCTCAGTTGCAAATTGCAATGGGTATCCCAATGCATAGAATTAGAGACATTAGATTGCTTTACGGTGTCGATCCAAAGAGCGCCTCGGAGATTGATTTCGAATTTTCCACTCCAGAATCTTCCAAGACTCAAAGAAAACCAATCCCTAAGGGTCACTGTACTGCTTGTCGTATCACTTCTGAAGATCCAAATGAAGGTTTCAAGCCATCAGGTGGTGCTTTACACGAACTAAACTTCCGTTCTTCTTCTAACGTTTGGGGTTATTTCTCTGTTGGTAATAACGGTGGTATCCACTCGTTCTCAGATTCTCAATTTGGTCATATTTTCGCCTTCGGAGAGAATAGACAGGCTTCCAGAAAGCATATGGTTGTTGCATTGAAGGAGTTATCGATTAGAGGTGATTTCAGAACTACTGTTGAATATTTGATCAAATTGTTGGAGACTGAAGACTTCGAAGACAACACCATCACTACTGGTTGGTTAGATGATTTGATCTCCCAAAAGATGACAGCTGAAAAGCCTGATCCAACTCTATCAGTCATCTGTGGTGCAGCAACCAAGGCTCACATTGCCTCAGAACAAGCCAGACAAGAATATATTGCTTCCTTGAAAAGAGGTCAAGTTCCTAACAAATCCTTGTTACAAACCATGTATCCTATAGAGTTCATTCACGATGGAATGAGATACAAATTCACTGTTGCTAAATCTGCAGATGACCGTTACACCCTATTTATTAATGGTTCGAAGTGTGAAGTTGGTGCAAGAAAACTTTCCGACGGTGGTTTACTAATTGCAGTTGGTGGTAAATCCCATACTATCTACTGGAAGGAAGAGGTTTCTGCTACAAGACTATCCATTGATTCCAAGACTACCCTATTAGAGGTCGAAAATGATCCTACTCAATTAAGAACCCCATCGCCAGGTAAGTTGGTGAAGTTTTTAGTTGAAAATGGCGACCATGTCATTGCAGGACAACCTTATGCTGAAGTTGAAGTTATGAAAATGCAAATGCCATTGATTTCTCAAGAAAATGGTATTGTTCAACTTTTGAAACAGCCTGGTTCGACTCTTGCAGCTGGTGATATTCTTGCCATTTTATCTTTGGATGATCCAAGTAAGGTAAAACACGCAAAGCCATACGAAGGTATGTTACCTGAAATGGGCTCACCAATTGTTGAAGGTACCAAGCCAGCTTACAAGTTCAAATCTTTAGTCACTACCTTGGAAAATATTTTGAAGGGATATGATAACCAAGTTATTATGAAAACTTCCTTGCAACAGTTGATTGAAGTATTGAGACAACCAGAGCTTCCTTATTCTGAATGGAAATTGCAGGTTTCTGCCTTGCATTCCAGACTTCCTCCTCATTTAGATGAACAACAAGAACAACTAGTTAGCCGCTCTTTCAAGAGAGGTGCTGATTTCCCAGCAAGACAATTGGGTAAGATGTTTGAAGCTGCTCTAAATGACCCTAATGTCGATCCACTTTTCCACACCACCATCGAACCACTTCTTGACATCACTAATCGTTATTCTAACGGTTTGGCTTCTCATGAACATTTCGTGTTTGCGACGTTCTTAGAGAATTATTACAATGTCGAAAAGTTGTTCTCGGGCTCCAATGTTCGTGAAGAAGATGTCATCTTAAGACTACGTGATGAGAACCCAGATGATTTGGACAAGGTTGTTCTGACTGTTCTTGCCCATTCTAGAGTTTCTGCCAGAAACAACTTGATATTGGCAATTTTGAAGCATTACCAACCTTTGTGCAAATTGAAGTCTGAAATTGCTGCCGCCATTGAGAAACCATTAAAGCATATTGTCGAATTGGAATCAAAGGCTACTGCAAAGGTTGCTCTACAAGCCAGAGAAATTTTAATTCAAGGTGCTCTACCATCCATTAAGGAGAGAACGGACCAAATTCAATACATATTAAAGTCTTCTGTTTTGAGCACTTCATATGGTTCGACTGAAAGCAAACGCACTAAACCTGATTTAGAAGTTTTGAAGGACTTGATTGACTCAAACTACGTCGTGTTTGATGTTTTATCTCAATTTTTGACTAACTCTGACGACGCTGTTGCAGCCGCAGCCGCTGAAGTCTACATCAGAAGAGCATACAGAGCTTACACAATTGGGGACTTGATGCATTTCAAGACCTCTGGCTCTCCAGTGGTCGAATGGAAGTTCCAACTACCATCTGCAGCATTTACTTCTATGCCTCAAGTCAAGAGTAAGTTGGGTATGAACAGAGCAATCTCCGTTTCCGATTTGACATACGTTTCCGAAGGCGAGAACCAACCACTGAGAACTGGTTTGTTGATTCCTGCCAAACATCTTGATGATGTTGACGGAATCCTATCATCTGCTCTCTCTATGATTCCTCCTCACCATGTGTCTACTGGACCAGCTCCAGATAGATCAGGCTCTTCTTCTGCTAGCTTGTCTAATGTTGCCAATGTTGTGGTTAATTCTACTGAAGGATTTGAATCTGAGTCTGAAGTGTTACTAAGATTAAAGGAGATCTTAGACTTGAACAAACAGGCTCTTGTAGAATCTGCTATCCGTCGTATCACATTTGTGTTTGGTTACAGCGATGGTACTTATCCAAAATACTATACTTTCCGTGGTCCAAACTACAATGAAGATGAGACTATTCGTCATATAGAACCTGCATTGGCTTTCCAACTTGAGTTGGGTAAAATGTCGAACTTTAACATTAGACAAATCTTTACCGAGAACAGAAACATCCACGTATATGAAGCTGTTGGTAAGAACTCTCCTGTAGACAAGAGATTCTTCACAAGAGGTATCATTAGAACCGGTCGTATTCGCGATGACATCTCAATTGTTGAATATTTGACTTCTGAAGCAAATAGATTGATGAGTGACATCTTGGATAACTTAGAAATTATCGACACCTCCAATTCCGACTTGAATCATATCTTCATCAACTTTTCTGCTGTTTTCGATGTTTCTCCAGAAGATGTGGAAGCTGCATTCGGTGGCTTCTTGGAAAGATTTGGTAGAAGATTATTGAGACTTCGTGTTGCTGCTGCTGAGATTAGAATCATCATCAAAGACCCTCAAACAGGTACACCAGTTCCCCTAAGAGCTTTGATTAACAATGTTTCTGGATTTGTTGTCAAAACTGAATTGTACACGGAAGTGAAGAATGCCCAAGGTGAGTGGATCTTTAAGTCTTTAGACAAGCCTGGTTCCATGCACTTAAGACCAATTGCAACACCATACCCCGCTAAGGAGTGGTTGCAACCTAAGCGTTACAAGGCCCATCTAATGGGTACTACTTATGTTTACGATTTCCCCGAATTGTTCCGCCAAGCTATTGTTACTCAATGGAAGAAGTATTCTCCAAAGAAGAAATTGTCTGATGACTTCTTTATTGCTAACGAATTGATTGAAGACGAAAATGGAGAACTCACTGAAGTTGATCGTGAATTAGGTGCAAACAACATTGGTATGGTTGCTTTCAAGGTGACAGCTAAGACTCCAGAATACCCACATGGTCGTCAATTCGTGATTGTTGCAAACGATATCACCTACAAAATCGGTTCTTTCGGTCCACAAGAAGATGAATTCTTCAACAAGGTTACTGAGTATGCAAGAAAGAGAGGTATTCCACGTGTCTACTTGTCTGCCAACTCTGGTGCTAGAATTGGCATTGCTGAAGAGTTGGTTCCATTATTCCAAATTGCATGGAATGATGAAAAAGATCCTTCTAAGGGTTTCCAATACTTATGGCTCACAGATGAAGCTTTGGAAGAACTCAGAGCCCAAGGTAAGGAAAACTCTGTTGTTACTCAACGTGTTGTCGAAGAAGGAAAGGCAAGAAATATTATCACTGCTATTATTGGTAGCGAAGATGGTCTTGGTGTTGAGTGTTTGAAGGGTTCAGGTTTAATTGCCGGTGCAACTTCTAGGGCTTACAAGGACATCTTCACTATTACTTTAGTGACTTGTAGATCGGTTGGTATTGGTGCATACTTGGTTAGACTAGGTCAAAGAGCAATTCAAATTGAAGCTCAACCTATCATCTTGACCGGTGCTCCTGCTATTAACAAGCTTTTGGGTAGAGAAGTTTACTCATCTAACTTGCAATTGGGTGGTACTCAAATCATGTACAACAATGGTGTTTCTCACTTAACTGCCCCTGATGATCTAGCTGGTGTTGAGAAGATCATGAATTGGTTATCTTATATTCCTGCTAAGAGAGATCTTCCTGTTCCTATTTTAGAATCTGACGATAAATGGGATAGACTTGTCGACTTTACACCAACAACCAACGAGCAATATGATGTTAGATGGATGATTGAAGGTCGTGAGACTGAGGAAGGTTTCCAATATGGTTTGTTCGATAAAGGCTCCTTCCAAGAAACTTTGTCTGGCTGGGCTAGAGGTGTTGTTACTGGTAGAGCTCGTTTAGGTGGTATTCCATTAGGTGTTATTGCTGTCGAAACACGTATCGTTGAAAATCTAATTCCAGCTGATCCAGCTAACCCAGATTCCACCGAAATGTTGATTCAAGAGGCTGGTCAAGTGTGGTATCCAAACTCCGCTTTCAAGACAGCCCAAGCTATCAACGATTTCAACCACGGTGAGCAATTGCCTCTAATGATTCTAGCAAACTGGAGAGGTTTCTCTGGTGGTCAACGTGATATGTACAATGAAGTCTTGAAATACGGTTCTTTCATTGTCGATGCTCTAGTAGATTATAAACAACCAATCATTACTTACATTCCACCAACTGGTGAATTAAGAGGTGGTTCTTGGGTTGTTGTTGATCCAACTATTAATGCTGACCAAATGGAAATGTATGCTGATATCAATTCTAGAGCTGGTGTTCTAGAACCTGAAGGTATGGTTGGTATCAAATACCGTAGAGAAAAGTTGCTAGCTACTATGGCTAGGTTGGACGACAAGTATAGAGCTTTGAAGGACAGATTCGCAAACCCTGACTTAACCCCAGAGGAACACCAACAAGTCTCTAAGGAGCTTGCTGAACGTGAGAAGCAACTACTACCAATCTATCACCAAATCACTGTTCAATTCGCTGATTTACATGATAGGTCTGGTCGTATGTTGGCAAAGGGTGTAATCAGAAAAGAGCTGAACTGGCCAGAATCCCGTCGTTTCTTCTTCTGGAGATTAAGAAGAAGATTAAATGAAGAGTACCTAATGAGAAGATTGAACAATGAGCTAGGATCAGCCTCAAGATTGGAGAAGATGGCTAGAATTAGATCATGGTACCCTGCATCCGTCAGCTTGGATGACGATAGACAAGTTGCTACTTGGATCGAAGAGAACTATCAACTCCTAGATGAACAAATCAAGAGTGTTAAGCTAGAAGCCTTTGCACAAAACTTGGCTAAATCTATCAGAAATGACCATGATAACTCTATTAACGGTTTGGCTGAAGTCTTGAAGCTCTTATCTGTTAAGGACAAAGAAAAGCTTCAAAAGGCTTTGGAATGA
7	ACC1_F_Xma1	atgagtgaagaaaatctttctg
8	AAC1_R_Xho1	tcattccaaagccttttgaag
9	ScURA3_F	cggcatcagagcagattgtactgagagtgc

<실시예 2: 배양 및 발효 조건에 따른 3-HP 생합성 비교>

상기 실시예 1에서 제조한 것으로 MCR (malonyl-CoA reductase) 유전자가 과발현되도록 형질전환되며, ACC1 (Acetly-CoA carboxylase 1) 유전자가 과발현되도록 형질전환된 재조합 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) JMA-1를 이용하여 배양 조건에 따른 3-HP의 생합성 정도를 비교하였다.

균주 (효모, JMA-1 균주)의 성장은 600㎚ 파장에서 OD값을 UV-visible spectrophotometer (Biomate 5, Thermo, NY)를 이용하여 측정하였다. 배양 중 대사물질(자일로스, 자일리톨, 에탄올) 분석은 high-performance liquid chromatography (HPLC 1200 Series, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에 Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) column (Phenomenex Inc., Torrance, CA)을 부착하여 분석을 수행했다.

분석 조건은 HPLC에 부착되어 있는 RID (refractive index detector)를 이용했으며, 용매는 0.005N H₂SO₄를 사용하였고, 50℃조건에서 분당 0.6㎖의 용매를 사용하는 조건으로 분석을 진행하였다.

배양액의 3-HP를 분석하기 위하여 HPLC Chromaster (Hitachi, Japan)와TSKgel G3000SWXL HPLC Column을 이용하여 분석을 수행하였으며, DAD(diode array detector)를 이용하여 207㎚ 파장으로 분석하였다. 용매로는 메탄올(Sigma Aldrich, MO, USA) 5%, 인산(phosphoric acid) 0.05%를 이용하였으며, 30℃ 조건에서 분당 0.8㎖의 용매를 사용하는 조건으로 분석을 진행하였다.

1. 교반속도에 따른 3-HP 생합성 비교 결과

균주(효모, JMA-1 균주)의 전배양은 SC 배지(Synthetic complete medium, Yeast nitrogen base without amino acids and with ammonium sulfate: 6.7 g/L)를 사용하였으며, 글루코스(glucose) 20g/L를 첨가하여 사용하였다. 접종에 사용한 균주는 -80℃에서 글리세롤 스톡(glycerol stock) 방법으로 보관한 균주를 사용하였으며, SCD₂₀배지에 1% 농도로 접종하여 200rpm, 30℃의 조건에서 전배양을 진행하였다. 또한, 전배양 후 대수기에 회수하여 멸균 증류수로 2회 세척하여 본배양에 이용하였다.

한편, 3-HP 생산을 위한 발효실험을 위해 250㎖ 삼각 플라스크에 글루코스 80g/L가 첨가된 50㎖의 YPD₈₀배지를 사용하였다. 배양은 삼각 플라스크(erlenmeyer flask)를 사용하였으며, 교반속도는 100 또는 200rpm으로 하였고, 30℃의 온도조건에서 발효를 진행하였다.

교반속도를 100 또는 200rpm으로 달리하며 배양을 수행한 결과, 도 2의 하단 표와 같이, 클루이베로마이세스 마르시아누 JMA-1 균주는 100rpm 및 200rpm 조건에서 각각 5.79±0.94g/L 및 5.88±0.88g/L의 3-HP를 생합성하였다.

또한, 클루이베로마이세스 마르시아누 JMA-1 균주의 3-HP 생산성은 100rpm에서 0.24±0.02g/L·h에 비해 200rpm에서 0.49±0.07g/L·h으로 생산성이 2배 증가한 것으로 확인되었다 (도 2). 도 2는 교반속도에 따른 3-하이드록시 프로피온산의 생합성 결과를 비교한 결과이다.

2. 진탕 삼각 플라스크(baffled flask)를 이용한 3-HP 생합성 비교 결과

본 실험에서는 호기적 조건이 3-HP 생합성에 미치는 결과를 확인하기 위하여, 상기 1의 3-HP 생합성 비교 결과에서 배양에 삼각 플라스크(erlenmeyer flask)를 이용하는 대신 진탕 삼각 플라스크(baffled flask)를 이용하는 것을 제외하고는 상기 1의 3-HP 생합성 비교 결과와 동일한 방법으로 균주(효모, JMA-1 균주)의 전배양 및 발효를 진행하였다. 또한, 상기에서 생산량과 생산성이 모두 높게 평가된 200rpm 조건에서 실험을 진행하였다.

삼각 플라스크 대신 진탕 삼각 플라스크를 이용한 호기적 조건에서 배양을 수행한 결과, 3-HP의 생합성량이 삼각 플라스크를 이용하여 배양하였을 때보다 크게 증가하여 8.97g/L의 3-HP 생합성량을 나타내었다.

또한, 3-HP의 생합성량도 크게 증가하여 8.97g/L의 3-HP 생합성량을 나타내었다 (도 3). 도 3은 진탕 삼각 플라스크 (Baffled flask)를 이용한 3-하이드록시 프로피온산의 생합성 결과를 비교한 결과이다.

3. 갈락토오스(galactose)를 기질로 이용한 3-HP 생합성 비교 결과

본 실험에서는 해양바이오매스(marine biomass)의 일종인 갈락토오스를 기질로 이용하였을 시 3-HP 생합성에 미치는 결과를 확인하기 위하여, 상기 1의 3-HP 생합성 비교 결과에서, 250㎖ 삼각 플라스크에 글루코스 80g/L가 첨가된 50㎖의 YPD₈₀배지를 이용하는 대신, 동일 배지에 갈락토오스 80g/L를 첨가하는 것을 제외하고는 상기 1의 3-HP 생합성 비교 결과와 동일한 방법으로 균주(효모, JMA-1 균주)의 전배양 및 발효를 진행하였다. 또한, 상기에서 생산량과 생산성이 모두 높게 평가된 200rpm 조건에서 실험을 진행하였다.

갈락토오스를 기질로 이용한 결과, 기질로 글루코스 대신에 갈락토오스를 사용한 경우에도 글루코스와 유사한 9.13g/L의 3-HP 생합성량을 나타내었다 (도 4). 도 4는 갈락토오스를 기질로 이용한 3-하이드록시 프로피온산의 생합성 결과를 비교한 결과이다.

따라서, 본 발명의 재조합 균주는 해양바이오매스의 주성분인 글루코스와 갈락토오스를 모두 이용하여 3-HP를 생합성할 수 있다는 장점을 갖는다.

한국생명공학연구원

KCTC18897P

20210330

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Production method for 3-Hydroxypropionic acid with Kluyveromyces marxianus <130> YP-21-056 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is codon optimizated MCR gene. <400> 1 atgagcggga caggcagatt ggccggtaaa attgcactga tcaccggagg ggccggtaat 60 atcggaagcg agttgaccag acgttttttg gctgaaggcg ccacagttat catctctggt 120 cgtaaccgtg caaagttaac tgcactggct gaaaggatgc aagcagaagc gggagtcccg 180 gctaaaagaa tcgacctgga ggttatggac ggatctgacc cggtcgctgt ccgtgctggg 240 atagaggcga ttgtagccag gcatggacaa attgacatat tggtgaacaa tgcgggaagt 300 gccggggcgc aacgtagact ggccgagatt cccttaactg aggcagaatt aggtccaggt 360 gcagaagaga ctctacacgc ctccattgcc aacctattag gaatgggctg gcacttaatg 420 cgtatcgccg ctccccacat gccggtaggc tcagcagtga ttaatgtttc taccatcttt 480 tccagggccg aatactatgg tcgtataccg tatgtgacgc ccaaagccgc ccttaacgcg 540 ttaagccagc tagcagcacg tgagttgggg gcaaggggca ttcgtgtcaa taccatattt 600 cccggcccta tcgaatccga tagaatcagg accgtatttc agcgtatgga tcaactaaaa 660 ggcagacccg aaggcgatac tgcgcaccat ttcttgaaca caatgcgttt atgtagggct 720 aatgaccaag gagcacttga acgtagattt ccgagcgttg gcgacgtagc ggatgctgct 780 gtcttcttag cgtctgcaga gagtgcggct ttatcagggg aaactattga ggttacgcac 840 ggcatggagc taccagcctg ttccgagaca agcttattgg cacgtaccga tttaaggact 900 attgacgcga gcgggaggac taccctaatc tgcgccggag atcaaatcga ggaggtaatg 960 gcattgactg gaatgttgag aacatgcggc agtgaggtga tcatcggttt tcgttccgcc 1020 gccgccctgg cgcagtttga gcaggctgtg aacgaaagtc gtcgtctggc aggagccgac 1080 tttaccccgc cgatcgcgct tcctctagat cctagagatc cagcgaccat tgatgccgtt 1140 tttgattggg gggcgggaga gaacactggg gggattcatg ccgctgtgat cttgccggcg 1200 acatcccatg agcctgcccc gtgcgtgatt gaggttgacg acgagagagt cttgaatttc 1260 ttggcggatg agataacagg tacgatcgtg atcgcttcca ggcttgcccg ttattggcaa 1320 tcccaaagac tgacgcccgg tgcccgtgct aggggcccga gggtaatctt tctgtccaat 1380 ggagctgacc agaatggcaa cgtctacgga agaatccaga gtgctgcgat cggacagctt 1440 attagggttt ggaggcatga agctgarttg gattatcaga gagcgtcagc cgctggcgat 1500 catgtgcttc ctccggtatg ggctaatcag atcgtaagat tcgcgaacag aagtctagaa 1560 ggcctagaat tcgcgtgtgc ttggacggcg caacttcttc attcccagcg tcacatcaac 1620 gaaatcacct tgaatatacc ggctaatatt tctgcgacca ccggcgccag aagcgccagc 1680 gtaggatggg ccgaatcact gatcggatta cacctaggga aggtggcgct gataaccgga 1740 ggttctgctg ggataggcgg tcaaatcggg agactgttgg cgttgagtgg cgctcgtgtg 1800 atgctggccg ctagagaccg tcacaagctg gagcagatgc aagccatgat tcaatctgag 1860 ttggcggaag tcggttatac cgacgtagaa gatcgtgtac acatcgcacc tggttgcgat 1920 gtatcctccg aggcacaact tgcggatctt gtcgaaagaa cgcttagcgc ctttgggact 1980 gttgactatt taatcaacaa tgcaggcata gctggtgtag aggaaatggt tatagatatg 2040 cctgtagagg gttggcgtca cacgttgttc gccaatttaa tcagcaacta ttcattgatg 2100 cgtaaattag cgcctctaat gaaaaagcaa ggctcaggat acatcttaaa tgtgtccagt 2160 tatttcggag gcgagaaaga cgcggctata ccttacccta acagagcgga ttacgccgtc 2220 tccaaggcgg gtcaaagagc catggcggag gtctttgcga ggtttttagg tcccgaaatt 2280 cagataaatg caatcgcgcc agggccggtg gaaggcgata gattaagggg cactggcgaa 2340 aggcctgggc tatttgcgag acgtgctcgt ctgatccttg aaaacaagag gctaaatgaa 2400 ttacacgcag ctctaatcgc tgccgcgaga acggacgaaa ggagcatgca cgagctagtt 2460 gagttgcttt taccgaatga cgttgccgcc cttgaacaaa atcctgcagc tccgactgct 2520 cttagagagt tggcgagaag gtttaggtct gaaggtgatc cagccgcttc atcttcatct 2580 gcgttgttga atagaagtat cgcggcaaaa ttactggcca gattacataa tggaggatac 2640 gtgctgcccg cagatatatt cgcgaacttg ccaaaccctc cggatccctt tttcacgaga 2700 gcacagatcg accgtgaagc ccgtaaggtt agagacggca tcatgggtat gctgtacctt 2760 cagcgtatgc ctacagaatt tgacgtggcc atggccaccg tctattattt ggccgacaga 2820 aatgttagcg gagaaacttt tcacccctca ggtggactta gatatgagag aacacccaca 2880 gggggggagt tgttcggctt accttcccca gagcgtttgg ccgagcttgt gggttcaact 2940 gtttacctga taggcgagca cctaacggag caccttaact tattagctag agcgtatcta 3000 gagcgttatg gagcaagaca agttgtaatg atagttgaaa cagaaacagg ggcagagacg 3060 atgcgtaggc ttttacatga ccacgtcgaa gccggtcgtc ttatgacaat tgtcgctgga 3120 gaccagatcg aagctgccat agatcaagct attacgagat atgggagacc tggaccagtc 3180 gtttgtacgc cattcaggcc tctaccaacc gtgcctttgg ttggtcgtaa ggatagtgac 3240 tggtccaccg ttttaagtga ggcagagttt gctgagttat gcgaacacca actgacacac 3300 catttcagag tagctcgtaa gattgcactg tctgatgggg ccagtcttgc ccttgtaact 3360 cccgagacca ctgccacttc tactaccgaa cagtttgcct tggcaaactt tattaagacc 3420 actcttcatg cgttcaccgc taccattggc gttgaatctg aacgtacagc acaacgtatt 3480 ctaataaatc aggttgatct aaccagacgt gcaagggccg aagaaccgcg tgacccacac 3540 gagaggcagc aagaactaga gaggtttatc gaagctgtcc tgttggtcac tgctccgctg 3600 ccacctgaag ctgatacccg ttatgctggg aggatacacc gtggtagagc cataaccgta 3660 taa 3663 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is MCR_F_SpeI primer for amplification of MCR gene of sequence No. 1. <400> 2 ggactagtat gagcgggaca ggca 24 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is MCR_R_XhoI primer for amplification of MCR gene of sequence No. 1. <400> 3 ccgctcgagt tatacggtta tggctctacc acg 33 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is ScURA3_F primer for amplification of CYC-terminator gene. <400> 4 ttcaattcaa ttcatcattt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is CYC_R primer for amplification of CYC-terminator gene. <400> 5 ggccgcaaat taaagccttc 20 <210> 6 <211> 6699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is codon optimizated ACC1 gene. <400> 6 atgagtgaag aaaatctttc tgaggtttcc atttctcaga gccaacagta tgaagttact 60 gacttcagtc acagacattc aaaactagcg ccacatttca tcgggttaaa cactgttgac 120 aaagtcgaag attctccatt aaaggaattt gttaaatcac atggcggtca tacagtcatc 180 tcaaaaatct tgatcgcaaa caatggtatt gctgccgtaa aagagatcag atccgtacgt 240 aagtggtctt acgaaatttt tggcgatgaa aggactgtac aattcgtagc aatggctaca 300 ccagaagatc ttgaagcaaa tgcggaatac atccgtatgg ctgatcagta tatcgaagtt 360 ccaggtggaa caaataacaa taactacgct aacgtcgacc ttatcgtaga agttgctgaa 420 agagccgatg ttgatgccgt ttgggctggt tggggtcatg cttccgaaaa tcctctgctt 480 ccagaaagat tggctgcttc caagagaaaa atcatcttta ttggtccacc aggtaacgca 540 atgagatctc taggtgacaa gatttcgtca actattgtcg cccaacatgc caaggttcca 600 tgtattccat ggtcaggtac tggcgtcgat gaagtccaca tagataagga aactaaccta 660 gtttctgtcg atgaagaagt ataccaaaaa ggttgctgtt cctctccaga agatggttta 720 aagaaagcta aacaaattgg ctttccagtg atgatcaagg catcagaagg tggtggtggt 780 aaaggtatca gaaaggtcga aaatgaagaa gaattccttt cattgtatca acaagctgct 840 aacgaaattc caggttctcc aattttcatt atgaagttgg ctggtaaagc ccgtcatttg 900 gaagttcaat tgcttgctga tcaatacggt actaatattt ctctattcgg tcgtgactgt 960 tccgttcaaa gacgtcatca aaaaatcatc gaagaagccc ctgtcactat tgcaaagcct 1020 caaacattca cagaaatgga aaaggcagca gttagattag gtcaattagt cggttacgtg 1080 tctgcaggta cagttgaata cttatactcg catgacgagg ataagttcta cttcttggaa 1140 ttaaacccaa gattacaagt ggagcatcca actaccgaaa tggtcacagg tgtgaactta 1200 ccagcagctc agttgcaaat tgcaatgggt atcccaatgc atagaattag agacattaga 1260 ttgctttacg gtgtcgatcc aaagagcgcc tcggagattg atttcgaatt ttccactcca 1320 gaatcttcca agactcaaag aaaaccaatc cctaagggtc actgtactgc ttgtcgtatc 1380 acttctgaag atccaaatga aggtttcaag ccatcaggtg gtgctttaca cgaactaaac 1440 ttccgttctt cttctaacgt ttggggttat ttctctgttg gtaataacgg tggtatccac 1500 tcgttctcag attctcaatt tggtcatatt ttcgccttcg gagagaatag acaggcttcc 1560 agaaagcata tggttgttgc attgaaggag ttatcgatta gaggtgattt cagaactact 1620 gttgaatatt tgatcaaatt gttggagact gaagacttcg aagacaacac catcactact 1680 ggttggttag atgatttgat ctcccaaaag atgacagctg aaaagcctga tccaactcta 1740 tcagtcatct gtggtgcagc aaccaaggct cacattgcct cagaacaagc cagacaagaa 1800 tatattgctt ccttgaaaag aggtcaagtt cctaacaaat ccttgttaca aaccatgtat 1860 cctatagagt tcattcacga tggaatgaga tacaaattca ctgttgctaa atctgcagat 1920 gaccgttaca ccctatttat taatggttcg aagtgtgaag ttggtgcaag aaaactttcc 1980 gacggtggtt tactaattgc agttggtggt aaatcccata ctatctactg gaaggaagag 2040 gtttctgcta caagactatc cattgattcc aagactaccc tattagaggt cgaaaatgat 2100 cctactcaat taagaacccc atcgccaggt aagttggtga agtttttagt tgaaaatggc 2160 gaccatgtca ttgcaggaca accttatgct gaagttgaag ttatgaaaat gcaaatgcca 2220 ttgatttctc aagaaaatgg tattgttcaa cttttgaaac agcctggttc gactcttgca 2280 gctggtgata ttcttgccat tttatctttg gatgatccaa gtaaggtaaa acacgcaaag 2340 ccatacgaag gtatgttacc tgaaatgggc tcaccaattg ttgaaggtac caagccagct 2400 tacaagttca aatctttagt cactaccttg gaaaatattt tgaagggata tgataaccaa 2460 gttattatga aaacttcctt gcaacagttg attgaagtat tgagacaacc agagcttcct 2520 tattctgaat ggaaattgca ggtttctgcc ttgcattcca gacttcctcc tcatttagat 2580 gaacaacaag aacaactagt tagccgctct ttcaagagag gtgctgattt cccagcaaga 2640 caattgggta agatgtttga agctgctcta aatgacccta atgtcgatcc acttttccac 2700 accaccatcg aaccacttct tgacatcact aatcgttatt ctaacggttt ggcttctcat 2760 gaacatttcg tgtttgcgac gttcttagag aattattaca atgtcgaaaa gttgttctcg 2820 ggctccaatg ttcgtgaaga agatgtcatc ttaagactac gtgatgagaa cccagatgat 2880 ttggacaagg ttgttctgac tgttcttgcc cattctagag tttctgccag aaacaacttg 2940 atattggcaa ttttgaagca ttaccaacct ttgtgcaaat tgaagtctga aattgctgcc 3000 gccattgaga aaccattaaa gcatattgtc gaattggaat caaaggctac tgcaaaggtt 3060 gctctacaag ccagagaaat tttaattcaa ggtgctctac catccattaa ggagagaacg 3120 gaccaaattc aatacatatt aaagtcttct gttttgagca cttcatatgg ttcgactgaa 3180 agcaaacgca ctaaacctga tttagaagtt ttgaaggact tgattgactc aaactacgtc 3240 gtgtttgatg ttttatctca atttttgact aactctgacg acgctgttgc agccgcagcc 3300 gctgaagtct acatcagaag agcatacaga gcttacacaa ttggggactt gatgcatttc 3360 aagacctctg gctctccagt ggtcgaatgg aagttccaac taccatctgc agcatttact 3420 tctatgcctc aagtcaagag taagttgggt atgaacagag caatctccgt ttccgatttg 3480 acatacgttt ccgaaggcga gaaccaacca ctgagaactg gtttgttgat tcctgccaaa 3540 catcttgatg atgttgacgg aatcctatca tctgctctct ctatgattcc tcctcaccat 3600 gtgtctactg gaccagctcc agatagatca ggctcttctt ctgctagctt gtctaatgtt 3660 gccaatgttg tggttaattc tactgaagga tttgaatctg agtctgaagt gttactaaga 3720 ttaaaggaga tcttagactt gaacaaacag gctcttgtag aatctgctat ccgtcgtatc 3780 acatttgtgt ttggttacag cgatggtact tatccaaaat actatacttt ccgtggtcca 3840 aactacaatg aagatgagac tattcgtcat 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aagactccag aatacccaca tggtcgtcaa 4740 ttcgtgattg ttgcaaacga tatcacctac aaaatcggtt ctttcggtcc acaagaagat 4800 gaattcttca acaaggttac tgagtatgca agaaagagag gtattccacg tgtctacttg 4860 tctgccaact ctggtgctag aattggcatt gctgaagagt tggttccatt attccaaatt 4920 gcatggaatg atgaaaaaga tccttctaag ggtttccaat acttatggct cacagatgaa 4980 gctttggaag aactcagagc ccaaggtaag gaaaactctg ttgttactca acgtgttgtc 5040 gaagaaggaa aggcaagaaa tattatcact gctattattg gtagcgaaga tggtcttggt 5100 gttgagtgtt tgaagggttc aggtttaatt gccggtgcaa cttctagggc ttacaaggac 5160 atcttcacta ttactttagt gacttgtaga tcggttggta ttggtgcata cttggttaga 5220 ctaggtcaaa gagcaattca aattgaagct caacctatca tcttgaccgg tgctcctgct 5280 attaacaagc ttttgggtag agaagtttac tcatctaact tgcaattggg tggtactcaa 5340 atcatgtaca acaatggtgt ttctcactta actgcccctg atgatctagc tggtgttgag 5400 aagatcatga attggttatc ttatattcct gctaagagag atcttcctgt tcctatttta 5460 gaatctgacg ataaatggga tagacttgtc gactttacac caacaaccaa cgagcaatat 5520 gatgttagat ggatgattga aggtcgtgag actgaggaag gtttccaata tggtttgttc 5580 gataaaggct ccttccaaga aactttgtct ggctgggcta gaggtgttgt tactggtaga 5640 gctcgtttag gtggtattcc attaggtgtt attgctgtcg aaacacgtat cgttgaaaat 5700 ctaattccag ctgatccagc taacccagat tccaccgaaa tgttgattca agaggctggt 5760 caagtgtggt atccaaactc cgctttcaag acagcccaag ctatcaacga tttcaaccac 5820 ggtgagcaat tgcctctaat gattctagca aactggagag gtttctctgg tggtcaacgt 5880 gatatgtaca atgaagtctt gaaatacggt tctttcattg tcgatgctct agtagattat 5940 aaacaaccaa tcattactta cattccacca actggtgaat taagaggtgg ttcttgggtt 6000 gttgttgatc caactattaa tgctgaccaa atggaaatgt atgctgatat caattctaga 6060 gctggtgttc tagaacctga aggtatggtt ggtatcaaat accgtagaga aaagttgcta 6120 gctactatgg ctaggttgga cgacaagtat agagctttga aggacagatt cgcaaaccct 6180 gacttaaccc cagaggaaca ccaacaagtc tctaaggagc ttgctgaacg tgagaagcaa 6240 ctactaccaa tctatcacca aatcactgtt caattcgctg atttacatga taggtctggt 6300 cgtatgttgg caaagggtgt aatcagaaaa gagctgaact ggccagaatc ccgtcgtttc 6360 ttcttctgga gattaagaag aagattaaat gaagagtacc taatgagaag attgaacaat 6420 gagctaggat cagcctcaag attggagaag atggctagaa ttagatcatg gtaccctgca 6480 tccgtcagct tggatgacga tagacaagtt gctacttgga tcgaagagaa ctatcaactc 6540 ctagatgaac aaatcaagag tgttaagcta gaagcctttg cacaaaactt ggctaaatct 6600 atcagaaatg accatgataa ctctattaac ggtttggctg aagtcttgaa gctcttatct 6660 gttaaggaca aagaaaagct tcaaaaggct ttggaatga 6699 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is ACC1_F_Xma1 primer for amplification of ACC1 gene of sequence No. 6. <400> 7 atgagtgaag aaaatctttc tg 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is AAC1_R_Xho1 primer for amplification of ACC1 gene of sequence No. 6. <400> 8 tcattccaaa gccttttgaa g 21 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is ScURA3_F primer for amplification of CYC-terminator gene. <400> 9 cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 30

Claims

서열번호 1의 핵산서열로 구성된 MCR (malonyl-CoA reductase) 유전자가 과발현되도록 형질전환되며,
서열번호 6의 핵산서열로 구성된 ACC1 (Acetly-CoA carboxylase 1) 유전자가 과발현되도록 형질전환된 재조합 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) JMA-1 균주 (수탁번호: KCTC18897P).
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제1항의 재조합 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus) JMA-1 균주 (수탁번호: KCTC18897P)를 배양하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시 프로피온산 (3-Hydroxypropionic acid)의 생산방법.
제4항에 있어서,
상기 배양은,
호기성 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시 프로피온산 (3-Hydroxypropionic acid)의 생산방법.
제4항에 있어서,
상기 배양은,
기질로 글루코오스 또는 갈락토오스를 이용하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시 프로피온산 (3-Hydroxypropionic acid)의 생산방법.