KR102536066B1

KR102536066B1 - 붉은 곰팡이 유래 구리 반응성 프로모터, 이를 포함하는 재조합벡터 및 이를 이용한 단백질 생산방법

Info

Publication number: KR102536066B1
Application number: KR1020210012905A
Authority: KR
Inventors: 손호경; 김시은; 박지연; 최소영; 문희지; 신지영; 김정은
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2023-05-24
Also published as: KR20220110363A

Abstract

본 발명은 붉은 곰팡이(Fusarium graminearum)에서 유래한 구리 반응성(copper-responsive) 프로모터, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 구리 반응성 프로모터는 배지의 구리 농도에 따라 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자의 목적 단백질의 발현을 효과적으로 조절할 수 있으며, 본 발명에 따른 구리 반응성 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물은 구리 결핍 조건에서의 목적 단백질 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

붉은 곰팡이 유래 구리 반응성 프로모터, 이를 포함하는 재조합벡터 및 이를 이용한 단백질 생산방법{Copper-responsive promoter from Fusarium graminearum, recombinant vector carrying the promoter and its application for protein production}

본 발명은 붉은 곰팡이(Fusarium graminearum)에서 유래한 구리 반응성(copper-responsive) 프로모터, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.

붉은 곰팡이(Fusarium graminearum)는 전 세계적으로 밀, 보리, 벼, 옥수수 생산량에 막대한 피해를 입히는 주요 식물병원균이다. 또한 이 곰팡이는 트라이코세신(trichothecenes), 지랄레논(zearalenone), 오로푸자린(aurofusarin)과 같은 인축에 유해한 이차대사산물을 다량 생산한다. 이러한 농업, 사료, 식품산업에서의 중요성으로 말미암아 최근 전 세계적으로 붉은 곰팡이에 대한 분자생물학적 연구가 널리 수행되고 있다. 붉은 곰팡이의 분자생물학 연구를 위해 가장 널리 활용되는 방법은 목표 유전자 결손(targeted gene deletion), 과 발현(overexpression), 형광단백질 표지 등이다. 하지만 필수유전자에 대한 연구를 위해서는 조건적 유전자 발현 시스템(conditional gene expression system)의 개발이 요구된다. 현재 붉은 곰팡이에서 이용 가능한 조건적 유전자 발현 시스템은 지랄레논을 이용한 지랄레논 유도성 프로모터(zearalenone-inducible promoter)가 유일하다. 하지만 지랄레논 유도성 프로모터는 지랄레논 농도가 증가함에 따라 발현량을 증가시키는 기능만을 가지고 있으며, 지랄레논 연구에서는 사용할 수 없다는 단점이 있다.

대한민국 공개특허 제10-2011-0067211호

본 발명의 목적은 미량의 구리에 의해 특이적으로 발현을 조절할 수 있는 구리 반응성 프로모터 및 이를 포함하는 재조합벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 재조합벡터에 의해 형질 전환된 미생물을 제공하고, 배지의 구리 농도 조절을 통해 상기 재조합벡터 또는 형질전환 미생물을 이용하여 특이적으로 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 구리 반응성 프로모터가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 구리 반응성 프로모터를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 재조합 벡터는 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 기재된 재조합 벡터에 의해 형질전환된, 형질전환 미생물이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 미생물은 붉은 곰팡이(Fusarium graminearum)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면,

상기 형질전환 미생물을 구리 결핍 배지에서 배양하여 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키는 단계; 및

상기 유전자 발현에 의해 생산된 목적 단백질을 분리하는 단계; 를 포함하는, 단백질 생산방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 형질전환 미생물을 구리 결핍 조건에서 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면,

서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 구리 반응성 프로모터 및 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

미생물에 상기 재조합 벡터를 도입하는 단계; 및

상기 재조합 벡터가 도입되어 구리 결핍 조건에서 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하는 미생물을 선별하는 단계; 를 포함하는, 구리 반응성 형질전환 미생물의 제조방법이 제공된다.

본 발명에 따른 구리 반응성 프로모터는 배지의 구리 농도에 따라 이에 작동 가능하게 연결된 목적 유전자의 목적 단백질의 발현을 효과적으로 조절할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 구리 반응성 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물은 구리 결핍 조건에서의 목적 단백질 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

그러나 본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 황산구리와 BCS처리 농도에 따라 구리 반응성 유전자들의 전사 수준을 분석한 그래프이다.
도 2의 A는 황산구리와 BCS처리 농도에 따라 FCR1의 전사 수준을 분석한 그래프이다.
도 2의 B는 완전배지에 황산구리 10μM 와 BCS 25μM를 처리한 후, 시간에 따른 FCR1의 전사량을 분석한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환한 붉은 곰팡이에 황산구리 10μM 와 BCS 25μM를 처리하고 3일 후 형광현미경으로 관찰한 GFP 리포터 어세이 결과이다.
도 5는 양이온 스트레스 조건(0.1 M LiCl)에서 양이온 민감성 유전자인 FgENA5의 프로모터를 FCR1의 프로모터(P _FCR1 )로 치환한 균주(P _FCR1 -FgENA5), 붉은 곰팡이 야생형 균주(WT), FgENA5 결손변이체(HK146), FgENA5 과발현체(HK147)에 황산구리와 BCS를 처리하였을 때 각 농도 별 균사생장 결과이다.
도 6은 소포체 스트레스 조건(0, 2, 5 μg/ml tunicamycin)에서 필수유전자 FgIRE1의 프로모터를 P _FCR1 로 치환한 균주(P _FCR1 -FgIRE1), 붉은 곰팡이 야생형 균주(WT)에 황산구리 10μM 와 BCS 25μM를 처리하였을 때의 균사생장 결과이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명은 본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 구리 반응성 프로모터가 제공된다.

본 발명에서 용어 "프로모터"는 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 외래 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다.

본 발명의 프로모터는 붉은 곰팡이(Fusarium graminearum)에서 유래한 것으로서, 본 연구자들에 의해 FCR1(Fusarium graminearum copper responsive 1)이라 명명된 FGSG_00773 유전자의 5'-인접지역(flanking region)의 1009 bp로부터 유래하였다.

구체적으로, 본 발명의 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 자연 유래 또는 인위적으로 합성한 염기서열이 모두 본 발명의 프로모터로서 이용될 수 있다.

또한, 서열번호 1의 염기서열은 그 하류(downstream) 즉, 염기서열의 3' 말단 쪽에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 '발현'을 유도할 수 있다.

본 발명에서 용어 "재조합 벡터"는 숙주세포에서 목적으로 하는 외래 유전자를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 벡터를 의미한다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서와 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

본 발명에서 용어 "작동 가능하게 연결된"은 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면,

미생물에 상기 재조합 벡터를 도입하는 단계; 및

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 구리 유도성 유전자 FCR1 ( Fusarium graminearum copper responsive 1)의 선발

기존에 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 균주와 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans) 균주에서 구리 반응성 유전자로 알려진 CTR4 유전자의 서열과 일치율이 가장 높은 세 가지 유전자 (FGSG_06061, FGSG_07059, FGSG_00773)를 붉은 곰팡이(Fusarium graminearum)에서 선발하였다.

완전배지에 황산구리 200μM와 구리 킬레이트제 (BCS, bathocuproinedisulfonic acid) 300μM을 처리하고 붉은 곰팡이 야생형 균주를 각각 1시간, 4시간, 8시간 및 12시간 배양한 후, quantitative reverse transcription (qRT)-PCR을 수행하여 각각의 유전자의 전사량을 분석하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 세 유전자 중 FGSG_00773 유전자가 구리에 대한 반응성이 가장 높게 나타나는 것을 확인하였으며, FGSG_00773 유전자를 FCR1(Fusarium graminearum copper responsive 1)로 명명하였다.

실시예 2. 구리 및 구리 킬레이트제(bathocuproinedisulfonic acid; BCS) 처리 하의 FCR1 유전자 발현 프로파일

완전배지에 황산구리(10-200μM)와 구리 킬레이트제(BCS, bathocuproinedisulfonic acid) (25-300μM)을 처리하고, 붉은 곰팡이 야생형 균주를 12시간 배양한 후, quantitative reverse transcription (qRT)-PCR을 수행하여 FCR1의 전사량을 분석하였다.

프라이머	염기서열(5'→3')
00773-RT-F	TCAATGGCAAAGAAGGCAACAC
00773-RT-R	TAGCCAACAGCATGACAAAGTAGG

그 결과, 도 2의 A에 나타낸 바와 같이, 황산구리 10μM 이상에서 FCR1 유전자의 전사량이 현격히 감소하였으며, BCS 25μM 이상에서 FCR1 유전자의 전사량이 현격히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.다음으로, 황산구리 10μM와 BCS 25μM을 처리한 후 시간대별(1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간 및 48 시간)로 FCR1 유전자의 전사량을 분석하였다. 그 결과, 도 2의 B에 나타낸 바와 같이, 황산구리 처리 조건에서는 12시간 이후에도 FCR1 유전자의 전사량 감소가 유지된 반면, BCS 처리 조건에서는 8시간까지 FCR1 유전자의 전사량이 증가하다가 8시간 이후 조건에서는 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과에 비추어 보아 FCR1 유전자는 구리 반응성 유전자임을 확인할 수 있다.

실시예 3. GFP 리포터 어세이

FCR1 유전자의 5'-인접지역(flanking region) 1009 bp을 P _FCR1 로 명명하고, P _FCR1 프로모터의 구리 반응성 여부 및 단백질 발현 시스템으로서 활용 가능성을 확인하기 위해 GFP(Green fluorescent protein) 리포터 어세이를 진행하였다.

붉은 곰팡이 야생형 균주의 유전체에서 P _FCR1 프로모터 부위를 증폭하고, pIGPAPA 벡터에서 GFP 유전자를 증폭하여, P _FCR1 프로모터와 GFP 유전자를 연결하였다. 이후 TA cloning 방법을 통해 pGEM-T-easy 벡터에 해당 서열을 삽입함으로써 FCR1의 프로모터(P _FCR1 )에 의해 GFP 유전자의 발현이 조절되는 벡터를 제조하였다.

상기 방법에 따라 제조된 벡터의 모식도를 도 3에 나타내었다.

상기 제조된 벡터를 붉은 곰팡이 야생형 균주의 세포벽을 제거한 원형질체에 삽입하여, 구리 조건에 따라 GFP 유전자의 발현이 조절되는 돌연변이체를 제조하였다.

제조된 돌연변이체에 황산구리 10μM 와 BCS 25μM를 처리하고 3일 후 관찰한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 황산구리를 처리한 조건에서는 GFP 발현이 거의 확인되지 않은 반면, BCS를 처리한 조건에서는 무처리구 대비 GFP 발현량이 증가한 것을 알 수 있었다.

이러한 GFP 리포터 어세이 결과는 FCR1 유전자의 5'-인접지역(flanking region) 1009 bp 부위가 구리 결핍 조건에서 특이적으로 발현을 유도하는 P _FCR1 프로모터로서 작동할 수 있음을 시사한다. 따라서, 상기 P _FCR1 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 붉은 곰팡이를 이용하면 배양액의 구리 농도에 따라 단백질 생산을 조절할 수 있을 것이다.

실시예 4. 프로모터 치환에 의한 구리 반응성 프로모터 작동 실험

(1) 구리 농도에 따른 유전자 발현 조절

본 발명자의 선행연구에서는 0.1 M LiCl에 의해 유도되는 양이온 스트레스 조건에서 중요한 역할을 하는 양이온 민감성 유전자인 FgENA5를 보고한 바 있다{Son, 2015 #33}(Son, H., Park, A. R., Lim, J. Y. and Lee, Y.-W. (2015) Fss1 is involved in the regulation of an ENA5 homologue for sodium and lithium tolerance in Fusarium graminearum. Environmental microbiology, 17, 2048-2063).

본 실시예에서는 본 발명의 구리 반응성 프로모터를 이용하여 FgENA5의 유전자 발현 조절 연구를 수행하였다.

FgENA5의 프로모터를 FCR1의 프로모터(P _FCR1 )로 치환한 균주(P _FCR1 -FgENA5)를 제작하기 위해, 붉은 곰팡이 야생형 균주의 유전체에서 P _FCR1 프로모터와 FgENA5 유전자 부위를 증폭하였다.

P _FCR1 프로모터와 FgENA5 유전자를 연결한 서열을 붉은 곰팡이 야생형 균주의 세포벽을 제거한 원형질체에 삽입하여, FgENA5의 유전자의 프로모터가 P _FCR1 프로모터로 치환되도록 하였다. 이를 통해, 구리 조건에 따라 FgENA5 유전자의 발현이 조절되는 돌연변이체를 제작하였다.

본 실험에서는 붉은 곰팡이 야생형 균주(WT), FgENA5의 프로모터를 FCR1의 프로모터(P _FCR1 )로 치환한 균주(P _FCR1 -FgENA5), 그리고 선행연구에서 제조된 FgENA5 결손변이체(HK146), FgENA5 과발현체(HK147)를 연구에 사용 사용하였다. 해당 균주들을 완전배지(CM) 및 양이온 스트레스 조건(0.1 M LiCl)에서 황산구리 (0, 10, 50μM)와 BCS (0, 25, 50μM)를 처리하여 5일 동안 배양하였다.

그 결과, FgENA5의 프로모터를 본 발명의 프로모터(P _FCR1 )로 치환한 균주 P _FCR1 -FgENA5에서 황산구리를 처리하였을 때 FgENA5 유전자 발현이 감소된 형질을 나타내고, BCS를 처리하였을 때에는 FgENA5 유전자가 과발현하는 형질을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 5). 상기에 나타난 바와 같이, 본 발명의 P _FCR1 프로모터는 구리 농도에 따라 붉은 곰팡이 유전자의 발현을 세밀하게 조절할 수 있음을 확인할 수 있다.

(2) 필수 유전자 연구

다음으로, 본 발명의 P _FCR1 프로모터가 필수유전자 연구에 활용될 수 있을지 확인하기 위해, tunicamycin(TM)에 의해 유도되는 소포체(endoplasmic reticulum) 스트레스에 중요한 역할을 하는 필수유전자로 알려진 FgIRE1의 프로모터를 P _FCR1 로 치환한 균주를 제조하였다.

FgIRE1의 프로모터를 FCR1의 프로모터(P _FCR1 )로 치환한 균주(P _FCR1 -FgIRE1)를 제작하기 위해, 붉은 곰팡이 야생형 균주의 유전체에서 P _FCR1 프로모터와 FgIRE1 유전자 부위를 증폭하였다.

P _FCR1 프로모터와 FgIRE1 유전자를 연결한 서열을 붉은 곰팡이 야생형 균주의 세포벽을 제거한 원형질체에 삽입하여, FgIRE1의 유전자의 프로모터가 P _FCR1 프로모터로 치환되도록 하였다. 이를 통해, 구리 조건에 따라 FgIRE1 유전자의 발현이 조절되는 돌연변이체를 제작하였다.

FgIRE1의 프로모터를 P _FCR1 로 치환한 P _FCR1 -FgIRE1균주와 붉은 곰팡이 야생형 균주(WT)에 황산구리 10μM 와 BCS 25μM를 처리하고, 5일 동안 소포체 스트레스 조건 (0, 2, 5 μg/ml tunicamycin)에서 배양하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 10μM 황산구리를 처리하였을 때 소포체 스트레스 조건에서 균사생장이 현격히 감소하였으며, 25μM BCS 처리한 경우에는 동일한 소포체 스트레스 조건에서 증가된 균사생장을 보였다. 이러한 결과는 본 발명의 P _FCR1 프로모터가 필수유전자 연구와 필수유전자 발현 조절에도 활용될 수 있음을 나타낸다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> Copper-responsive promoter from Fusarium graminearum, recombinant vector carrying the promoter and its application for protein production <130> KP21-0011-SNU <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1009 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCR1(Fusarium graminearum copper responsive 1) <400> 1 gtggaacgtg gtggaagagt gacgatggtc tatggaaatc aggggcacgg ctgcgagggg 60 cagatgtggc cgacgatcgg atcctctgcc tgtctacact gtcagacctg tggtttctca 120 tgcaacgttt cttttatatc gctgccgact ttattctatc ctataggagt tcggattcta 180 gtgagaatat caaacgtaag ctctgccaag tgtgccatta ttatacatga tccctagtct 240 gagatagaat ccacaccaac aatgaattac gcgttccact gtgaaatata tagtagtata 300 taatattaat tttgatccct tgtgatttct agcctagatg atagatcact gttgggctgg 360 atcatctggt ggatcaccag cctccaatga catggacgta gcataattcc accacacaaa 420 aacaaggaca aacgttggaa tagagtaatc aactaagctg cctacgggta gtttgtagat 480 aacaagtcca tatccatgtc ctttgcccca ttcccaaaag ataagaacgc ctctttctct 540 aacacgatgg accgcaaaat cagagcacat tcaacacccc tgcactaaaa tactcagccc 600 atgaaaactt gctcaaacat tcgcaaagct aggccatcgt ctgatactta cacggaaaaa 660 tcaactcatc tatgtcctat tccagtctaa tagtacgata atggatagag ttcattgggg 720 gagcggaaag tggaaaaggt agaaataaca ctgaggccgc ccttttcttt tcgtccctgg 780 gttaacatat tttagacttt ggcacctttg ttaggtttac acaatctgat ttgttctatc 840 tggacatctc cttccgtgtc ttttcatcta cacatcccga atcaaagaca tcccttgtct 900 ttgtcgcatc catcgatcga taccgtcaac gccgcccaag acaacctcca acacagcttc 960 gacaatgaat cacgatatgc atatgactgg catgtcagaa actgccacc 1009

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 구리 반응성 프로모터.
서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 구리 반응성 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
제2항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 더 포함하는 것인, 재조합 벡터.
제3항에 기재된 재조합 벡터에 의해 형질전환된, 형질전환 미생물.
제4항에 있어서,
상기 미생물은 붉은 곰팡이(Fusarium graminearum)인, 형질전환 미생물.
제4항의 형질전환 미생물을 구리 결핍 배지에서 배양하여 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키는 단계; 및
상기 유전자 발현에 의해 생산된 목적 단백질을 분리하는 단계; 를 포함하는, 단백질 생산방법.
제4항의 형질전환 미생물을 구리 결핍 조건에서 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현방법.
서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 구리 반응성 프로모터 및 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
미생물에 상기 재조합 벡터를 도입하는 단계; 및
상기 재조합 벡터가 도입되어 구리 결핍 조건에서 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하는 미생물을 선별하는 단계; 를 포함하는, 구리 반응성 형질전환 미생물의 제조방법.