KR102529024B1 - 조혈, 면역-종양학 요법, 및 지질단백질 및 아포지질단백질 수준 조절에서의 베타-락탐의 치료 용도 - Google Patents

조혈, 면역-종양학 요법, 및 지질단백질 및 아포지질단백질 수준 조절에서의 베타-락탐의 치료 용도 Download PDF

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Abstract

혈청 중의 CD4+ T-림프구의 수를 증가시키는 치료를 필요로 하는 대상체의 혈청 중의 CD4+ T-림프구의 수를 증가시키는 방법이며, 대상체에게 환자의 혈청 중의 CD4+ T-림프구의 수를 증가시키는 데 유효한 양의 β-락탐의 L-이성질체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
[대표도]
도 6A 및 도 6B

Description

조혈, 면역-종양학 요법, 및 지질단백질 및 아포지질단백질 수준 조절에서의 베타-락탐의 치료 용도
본 발명은 조혈, 면역-종양학 요법, 및 지질단백질 및 아포지질단백질 수준 조절에서의 좌선성 β-락탐의 용도에 관한 것이다.
인간 백혈구 엘라스타제 (HLE, EC.3.4.21.37)는 림프성 및 골수성 세포가 과립을 형성하기에는 너무 미숙할 때 이들 세포의 개체발생에서 초기에 세포 표면에 대해 독점적으로 표적화되는 (HLE-CS) 단일 분자 단백질로서 합성되고 프로세싱되는 세린 프로테이나제이다. 그러나, HLE는 세포가 과립을 형성하는 능력을 전개할 때 개체발생에서 추후에 과립 구획화에 대해 표적화된다 (HLE-G) (Gullberg et al., 1995; Garwicz et al., 2005). HLE-G는 효소 활성을 갖는 반면, HLE-CS는 수용체로서 작용하며, 효소 활성을 갖는다는 증거는 없다.
HLE-G의 효소 활성을 제어하기 위한 주요 생리학적 메커니즘은 풍부한 프로테이나제 억제제 알파-1 프로테이나제 억제제 (α1PI, α1 항트립신)이다. HLE-G와 결합될 때, α1PI 또는 HLE-G 중 어느 것도 절단되지 않는 공유 유사 복합체가 형성된다 (Dementiev et al., 2006). 유사하게, α1PI가 HLE-CS와 결합할 때, 효소 활성의 완료를 수반하는 것으로 보이지 않는 복합체가 형성되고, 이러한 복합체는 기능적으로 관련된 수용체의 분극 및 세포 운동성을 유도한다 (Wolf et al., 2003). 기능적으로 관련된 수용체는 케모카인 수용체 CXCR4 (CD184), CD4 및 T 세포 항원 수용체 (TcR)를 포함한다.
건강한 개체에서는, α1PI의 98%가 활성 형태이다. 정상 범위는 18-53 μM 활성 및 0-11 μM 불활성 α1PI이다 (Bristow et al., 2001). 활성 α1PI는 동적 평형에서 2개의 이소형, 즉: 1) HLE-CS와 비가역적으로 결합하는 천연 α1PI, 및 2) HLE-CS와 가역적으로 결합하는 티올-변형된 α1PI로 혈액에서 순환된다 (Tyagi, 1991).
불활성 α1PI는 미생물 또는 숙주 세포로부터 방출된 인자에 의한 활성 α1PI의 변형을 통해 감염 또는 염증 동안 발생한다. 불활성 α1PI는 HLE-G 또는 HLE-CS와 복합체를 형성함으로써 발생할 수 있으며, HLE 이외의 프로테이나제, 또는 산소화에 의해 절단된다. 그의 불활성화된 형태에서, α1PI는 저밀도 지질단백질 (LDL), apoB, 및 LDL 수용체 패밀리의 구성원 (LDL-RFM)과 결합하며, 그에 의해 α1PI는 세포 내로의 LDL 흡수를 촉진시킨다 (Mashiba et al., 2001; Janciauskiene et al., 2001).
이동하는 세포의 최첨단에서 활성 α1PI를 HLE-CS와 결합시키면, 다른 기능적으로 관련된 수용체와의 LDL-RFM의 응집 및 분극이 유도된다 (Bristow et al., 2003; 2008; Bristow and Flood, 1993). 세포 운동은 동일한 세포 상의 LDL-RFM이 α1PI C-말단 도메인 (C-36, VIRIP)을 포함하는 상호 작용을 통해 α1PI-HLE-CS 복합체와 결합하는 세포의 후미에 기능적으로 연관된 수용체를 포함한 HLE-CS 복합체를 재배치한다 (Kounnas et al., 1996; Janciauskiene et al., 2001). 이러한 상호 작용은 응집체 내의 기능적으로 관련된 수용체를 포함한 LDL-RFM, 및 이들과 결합된 대상, 예컨대 지질단백질 및 바이러스의 내재화 (세포내 이입)를 유도한다. 이러한 작용은 이동하는 세포의 후미를 추가로 후퇴시킴으로써 전진 운동을 촉진시킨다 (Kounnas et al., 1996; Cao et al., 2006; Bristow et al., 2003; Bristow et al., 2013).
세포내 이입된 수용체의 재순환 및 이동하는 세포의 최첨단에서의 분극에 이은 후미에서의 세포내 이입은 컨베이어 벨트와 다소 유사하게 작동한다. 이러한 컨베이어 벨트 메커니즘과 관련된 구성 요소 중 하나가 누락되거나 차단되면, 세포는 이동을 중지한다. 예를 들어, 박테리아, 뱀에 물린 상처, 혈액 응고, 및 대부분의 다른 비정상적인 상황은 α1PI를 포함한 센티넬 프로테이나제 억제제를 절단하는 비정상적인 프로테아제를 생산한다. α1PI가 불활성화되면, 그의 수용체 HLE-CS와 더 이상 결합할 수 없다. α1PI-HLE-CS 복합체의 부재하에서는, LDL-RFM이 세포내 이입을 위해 촉발되지 않으며, 이는 혈액 세포의 이동을 정지시킨다. 이러한 기계론적인 프로세스는 영양소 (예를 들어, 지질단백질 및 인슐린 커플링된 글루코스), 독성 물질 (예를 들어, 바이러스, 박테리아 효소, 염증 산물), 또는 불활성 물질 (예를 들어, 재순환된 수용체)에 대한 환경을 샘플링하기 위해 면역 세포를 이동시키는 방법을 제공한다. 이러한 프로세스의 역학으로 인해, 좌선성 β-락탐을 사용하여 HLE-CS를 표적화하면 조혈, 지질단백질 수준, 및 원치 않는 조직 분해를 조절할 수 있다.
세포 운동성은 수용체의 활성화 및 불활성화에 의해 생산된 선택적이고 순차적인 부착 및 방출로부터 발생하며 (문헌 [Wright and Meyer, 1986; Ali et al., 1996]), 결과적으로 관련 막 단백질의 최첨단 또는 후미로의 극성 분리, 및 세포 내의 상이한 위치에서 시작하는 Ca++ 파의 시계 방향과 시계 반대 방향 전파 둘 다로부터 발생한다 (Kindzelskii and Petty, 2003). 따라서, 복잡한 프로세스의 여러 측면이 정량화될 수 있다. 세포 운동성을 정량화하기 위한 가장 직접적이고 가장 용이하게 해석되는 방법은 화학주성제, 예컨대 α1PI에 반응하는 부착성 세포의 계수이다.
본 출원인의 계류중인 미국 특허 출원 번호 13/302,821는 항레트로바이러스 요법을 받고 있는 대상체에서 순환성 CD4+ T-림프구의 수를 증가시키는 방법이며, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 대상체에서 순환성 CD4+ T-림프구의 수를 증가시키는 데 유효한 양의 활성 α1PI를 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 출원인의 계류중인 미국 특허 출원 번호 13/948,446은 대상체에서 LDL 수준, HDL 수준, 콜레스테롤 수준, 및 트리글리세리드 수준을 조정하는 방법이며, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 활성 α1PI를 포함하는 제약 조성물을 투여하고; 그에 의해 대상체에서 LDL 수준, HDL 수준, 콜레스테롤 수준, 및 트리글리세리드 수준의 분배를 조정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
α1PI의 조혈 역할은 지금까지 치료적으로 이용되지 않았다. 고 비용과 공급 부족으로 인해 그의 사용이 제한되었다. α1PI의 이전 치료적 적용은 유전성 α1PI 결핍증으로 진단된 환자에서 폐기종 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)에서 발생하는 것과 같은 호흡 곤란을 완화시키기 위한 목적으로 증대시키는 것으로 제한되었다. 상업적으로, α1PI는 PROLASTIN®-C [그리폴스 써라퓨틱스 인크. (Grifols Therapeutics Inc.; 미국 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크)] 및 ZEMAIRA® [CSL 베링 LLC (CSL Behring LLC; 미국 펜실베니아주 킹 오브 프로이센)]를 포함한 몇몇 공급처로부터, 인간 혈장으로부터 단리된 동결침전물 제제로서 이용 가능하다.
관련 기술분야에서 필요한 것은 α1PI에 대한 대체물로서 작용하는 소분자이다. 본 발명은 하기의 치료를 필요로 하는 대상체에서 폐기종 및 COPD에서 발생하는 것과 같은 호흡 곤란의 치료를 위해 분해성 효소 활성을 저지하고, 지질단백질 및 아포지질단백질 수준을 조정하고, 순환성 CD4+ 또는 CD8+ T-림프구의 수 (CD4/CD8 비율)를 조절하는 데 유용한 이러한 소분자 화합물을 제공한다.
예상치 못하게도, L-암피실린을 포함한 5가지 부류 모두의 β-락탐 항생제가 가용성 과립 관련 엘라스타제 (HLE-G) 및 세포 표면 엘라스타제 (HLE-CS)와 결합하고, 수용체 분극을 유도하며 세포 운동성을 자극한다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 이들은 α1PI의 생물학적 활성이므로, β-락탐은 HLE-CS와 결합하는 데 있어서 α1PI에 대한 대체물로서 사용될 수 있으며, 이에 의해 인간 대상체에서 지질단백질 및 아포지질단백질 수준을 조정하고 순환성 CD4+ 또는 CD8+ T-림프구의 수 (CD4/CD8 비율)를 조절할 수 있을 뿐만 아니라 폐기종 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)에서 발생하는 것과 같은 호흡 곤란의 치료를 위해 분해적 효소 활성을 저지시킬 수 있다. 추가로, 일부 β-락탐, 예컨대 L-암피실린은 면역 증강성일 수 있는 반면, 세펠락신(Cephelaxin)과 같은 다른 β-락탐은 면역 억제성일 수 있다. α1PI를 포함하여, 세포를 표적으로 하는 대부분의 약물은 고 용량 또는 고 친화도가 저 용량 또는 저 친화도만큼 효과적이지 않고 각각의 약물의 최적 용량이 그 사이에 있는 종 모양의 곡선을 나타낸다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기의 치료를 필요로 하는 대상체에게 환자의 혈청 중의 CD4/CD8 비율을 증가시키는 데 유효한 양의 좌선성 β-락탐, 예컨대 L-암피실린을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 혈청 중의 CD4+ T-림프구의 수를 증가시키거나 또는 CD8+ 림프구의 수를 감소시킴으로써 CD4/CD8 비율을 증가시키는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하기의 치료를 필요로 하는 대상체에게 환자의 혈청 중의 CD4/CD8 비율을 감소시키는 데 유효한 양의 좌선성 β-락탐, 예컨대 L-세팔렉신을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 혈청 중의 CD4+ T-림프구의 수를 감소시키거나 또는 CD8+ 림프구의 수를 증가시킴으로써 CD4/CD8 비율을 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 환자의 혈청 중의 CD4/CD8 비율, CD4+ T-림프구의 수 및 CD8+ 림프구의 수를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
추가 실시양태에서 β-락탐은 세펨으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시양태에서, β-락탐은 페남으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시양태에서, β-락탐은 모노박탐으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시양태에서, β-락탐은 페넴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시양태에서, β-락탐은 카르바페넴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 추가 실시양태에서, 대상체는 영양 실조 또는 HIV-1 질환에서 또는 암 요법에서 발생하는 것과 같은 속발성 면역 결핍증을 앓고 있다.
다른 추가 실시양태에서, 대상체는 암을 앓고 있고, 면역 체크포인트 억제제로 치료받고 있다.
다른 추가 실시양태에서, 대상체는 자가면역 또는 이식편 대 숙주 질환에서 발생하는 것과 같은 면역 과다활성화를 앓고 있다.
또 다른 실시양태에서, 대상체는 유전성 α1PI 결핍증을 앓고 있다.
또 다른 실시양태에서, 대상체 내에서의 CD4/CD8 비율 또는 CD4+ T-림프구의 수는 바람직하지 않게 낮다.
또 다른 실시양태에서, 대상체 내에서의 CD4/CD8 비율 또는 CD4+ T 림프구의 수는 바람직하지 않게 높아, 면역 억제 요법을 필요로 한다.
또 다른 실시양태에서, 대상체는 흑색종, 신장 세포 암종, 비-소세포 폐암, 방광암, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 및 뇌암을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고형 종양을 앓고 있는 환자이다.
또 다른 실시양태에서, 대상체는 환경 독소, 예컨대 방사선 또는 화학요법에 노출된 환자이다.
또 다른 실시양태에서, 대상체는 바이러스성 감염, 박테리아성 감염, 및 영양 실조로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 병태를 앓고 있다.
또 다른 실시양태에서, 대상체는 자가면역 질환을 앓고 있다.
또 다른 실시양태에서, 대상체는 이식편 대 숙주 질환을 앓고 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 LDL 수준, HDL 수준, 콜레스테롤 수준; 및 식이 지방, LDL, HDL 및 콜레스테롤 및 다른 지질단백질 및 아포지질단백질로부터 유래되거나 또는 이로부터 생성되는 다른 지질단백질 및 아포지질단백질 수준을 조정하는 방법이며, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 β-락탐을 포함하는 제약 조성물을 투여하고; 그에 의해 대상체에서 LDL 수준, HDL 수준, 콜레스테롤 수준; 및 식이 지방, LDL, HDL, 콜레스테롤, 및 다른 지질단백질 및 아포지질단백질로부터 유래되거나 또는 이로부터 생성되는 다른 지질단백질 및 아포지질단백질의 수준을 조정하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 β-락탐을 투여하기 전에, 상기 대상체의 혈청 중의 LDL 수준, HDL 수준, 콜레스테롤 수준; 및 식이 지방, LDL, HDL, 콜레스테롤, 및 다른 지질단백질 및 아포지질단백질로부터 유래되거나 또는 이로부터 생성되는 다른 지질단백질 및 아포지질단백질의 수준을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 β-락탐을 투여한 후에, 상기 대상체의 혈청 중의 LDL 수준, HDL 수준, 콜레스테롤 수준; 및 식이 지방, LDL, HDL, 콜레스테롤, 및 다른 지질단백질 및 아포지질단백질로부터 생성되거나 또는 이로부터 유래된 다른 지질단백질 및 아포지질단백질의 수준을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
또한 또 다른 실시양태에서, 조정은 LDL 수준; 및 LDL로부터 생성되거나 또는 이로부터 유래된 지질단백질 및 아포지질단백질의 수준을 저하시키는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 조정은 HDL 수준; 및 HDL로부터 생성되거나 또는 이로부터 유래된 지질단백질 및 아포지질단백질의 수준을 증가시키는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 조정은 apoB48 또는 apoB100 수준; 및 apoB48 또는 apoB100으로부터 생성되거나 또는 이로부터 유래된 지질단백질 및 아포지질단백질의 수준을 조정하는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 동물이다.
또 다른 실시양태에서, 스타틴, PCSK9 억제제, 피브레이트, 니아신, 및 담즙산 격리제로 이루어진 군으로부터 선택되는 LDL 억제제 또는 콜레스테롤 저하 약물이 대상체에게 투여된다.
특히 바람직한 실시양태에서 β-락탐은 L-암피실린 염이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서 LDL의 수준; 및 LDL로부터 생성되거나 또는 이로부터 유래된 다른 지질단백질 및 아포지질단백질의 수준이 저하된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서 HDL의 수준; 및 HDL로부터 생성되거나 또는 이로부터 유래된 다른 지질단백질 및 아포지질단백질의 수준이 증가된다.
다른 추가 실시양태에서 본 발명은 선천성 α1PI 결핍증을 앓고 있는 환자 및 COPD를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 상기 환자에게 유효량의 β-락탐을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또한 또 다른 실시양태에서 본 발명은 L-암피실린의 트로메타민 염을 포함하는 물질의 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서 본 발명은 L-암피실린의 트로메타민 염 및 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
다른 추가 실시양태에서 본 발명은 선천성 α1PI 결핍증을 앓고 있는 환자 및 COPD를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 상기 환자에게 유효량의 β-락탐을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 폐기종 및 COPD에 의해 야기된 호흡 곤란을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 β-락탐을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부 사항은 첨부 도면 및 하기 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특색, 목적 및 이점은 본 명세서, 도면 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1A-1C는 HLE-CS와 결합하는 것이 인간 백혈병 세포의 케모카인 유도된 운동을 억제하고 인간 줄기 세포의 운동을 증강시킨다는 것을 입증해 주는 그래프이다. 도 1A는 케모카인 CXCL12α (●), CCL3 (■), CCL4 (▲), 및 CCL5 (▼)에 반응하거나 또는 프로테이나제 억제제 α1PI (▲), 항트롬빈 III (ATIII) (■), 및 항-키모트립신 (α1ACT)에 반응한 계수된 부착성 세포를 도시하고; 도 1B는 HIV 허용 (플러스) 클론 10 (●)이 HLE에 대한 합성 펩티드 억제제인 MAAPVCK에 의해 부착되도록 자극되었고 키모트립신에 대한 합성 펩티드 억제제인 TPCK에 의해 부착되도록 자극되었지만, HIV 비-허용 (마이너스) 클론 17 (■)은 그렇지 않았다는 것을 도시한다. 플러스 클론 10 (●)은 HIV 융합 펩티드 (FLGFL)에 반응하여 부착되도록 자극되었지만, 마이너스 클론 17 (■)은 그렇지 않았다. 어느 서브클론도 트롬빈 효능제 펩티드 (SFLLRN)에 의해 영향을 받지 않았다. α1PI의 2가지 상이한 제제는 32.7% 활성 (●) 및 8.3% 활성 (■)인 것으로 결정되었고; 도 1C는 이들 2가지 α1PI 제제에 의해 자극된 플러스 클론 10이 활성 α1PI의 동등한 최적 농도에 반응하였지만, 불활성 α1PI의 상이한 농도에 반응하였다는 것을 도시한다.
도 2A 및 2B는 D-암피실린의 항생제 활성 (2A)과 L-암피실린의 항생제 활성 (2B)을 비교하는 뮐러-힌턴(Mueller-Hinton) 한천 플레이트의 사진이다.
도 3A 및 3B는 L-암피실린에 의해 유도된 세포 이동 및 세포내 이입의 자극을 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명에 따라 비히클, 에제티미브(ezetimibe) (10 mg/kg), L-암피실린 (50 mg/kg), 또는 L-암피실린 (5 mg/kg)으로 처리된 식이 유발 비만 (DIO) 마우스에서 LDL 수준의 정규화된 % 변화를 보여주는 그래프이다.
도 5는 리토나비어(ritonavir) 요법에서 1명의 비감염, 비처리 자원자 및 2명의 HIV-1 감염된 개체로부터 수거된 말초 단핵 혈액 세포 (PMBC)를 사용하여 수행된 cDNA 마이크로어레이 분석이며; 비감염 세포에 대한 HIV-1 감염된 세포의 유전자 발현 비율을 계산하였다.
도 6A 및 6B는 L-암피실린으로 처리한지 2주 후 T 림프구의 수 (도 6A) 및 T 전구 세포의 수 (도 6B)에 있어서의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 7(A)는 L-암피실린으로 처리되거나 또는 항-PD-1로 처리되거나 또는 항-PD-1과 조합하여 L-암피실린으로 처리된 대표적인 종양의 사진이다. 도 7(B)는 각각의 마우스에서 좌측 신장 중량과 우측 신장 중량 간의 차이로서 결정된 각각의 군 내의 평균 종양 중량을 나타내는 막대 그래프이다.
도 8(A 및 B)은 D-암피실린 (8A) 및 L-암피실린 (8B)의 절대 배위를 나타내는 다이아그램이다.
정의
용어 "약"또는 "대략"은 통상적으로, 값의 유형 및 측정 방법에 대해 허용되는 오차 범위 내에 있음을 의미한다. 예를 들어, 이는 소정의 값 또는 범위의 20% 이내, 보다 바람직하게 10% 이내, 가장 바람직하게 5% 이내를 의미할 수 있다. 또 다른 한편으론, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약"은 소정의 값의 약 로그 (즉, 한 자릿수), 바람직하게 그 값의 2배 이내를 의미한다.
"활성 α1PI"는 엘라스타제 활성을 억제할 수 있는 능력을 갖는 혈장 또는 다른 유체에서의 완전한 길이의 비-변형된 α1PI의 분획이다.
"불활성 α1PI"는 엘라스타제 활성을 억제할 수 있는 능력을 갖지 않는 혈장 또는 다른 유체에서의 α1PI의 분획이다. 활성 α1PI는 단백질 분해적 절단, 프로테이나제 복합체 형성, 항체 복합체 형성 또는 산화에 의해 불활성화될 수 있다.
"β-락탐 항생제"는 세팔로스포린 (세펨); 페니실린 (페남); 모노박탐; 페넴 및 카르바페넴으로 이루어진 군의 구성원으로서 본원에 정의된다.
L-암피실린과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 "살균 활성이 실질적으로 없다"는 것은 2014 임상 및 실험실 표준 연구소 (CLSI) 기준에 따라 암피실린 내성 대 감수성 이. 콜라이(E. coli)에 대한 4배 투여량 차이로서 정의된다 (2014 CLSI M100-S24의 표 2A) (CLSI, 2014). D-암피실린과 L-암피실린 간의 투여량 차이가 10배이기 때문에, L-암피실린이 유효한 항생제인 것으로 간주되지 않는다.
용어 "감소하다", "감소된", "저하된", "저하" 또는 "하향 조절된"은 모두 통계적으로 유의미한 양만큼 감소하는 것을 의미하기 위해 본원에서 일반적으로 사용된다. 그러나, 의심을 피하기 위해, "저하된", "저하", "하향 조절된", "감소된" 또는 "감소하다"는 참조 수준과 비교 시 적어도 10% 만큼의 감소, 예를 들어, 참조 수준과 비교 시 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 만큼의 감소, 또는 100% 감소 (즉, 참조 샘플과 비교 시 부재 수준) 포함, 또는 참조 수준과 비교 시 10 내지 100%의 임의의 감소, 또는 참조 수준과 비교 시 적어도 약 0.5배, 또는 적어도 약 1.0배, 또는 적어도 약 1.2배, 또는 적어도 약 1.5배, 또는 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 감소, 또는 1.0배 내지 10배의 임의의 감소 또는 그 초과를 의미한다.
용어 "증가된", "증가하다" 또는 "상향 조절된"은 모두 통계적으로 유의미한 양 만큼 증가하는 것을 일반적으로 의미하기 위해 본원에 사용되며; 어떠한 의심도 피하기 위해, 용어 "증가된" 또는 "증가하다"는 참조 수준과 비교 시 적어도 10%의 증가, 예를 들어, 참조 수준과 비교 시 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 증가, 또는 100% 증가 포함, 또는 참조 수준과 비교 시 10 내지 100%의 임의의 증가, 또는 참조 수준과 비교 시 적어도 약 0.5배, 또는 적어도 약 1.0배, 또는 적어도 약 1.2배, 또는 적어도 약 1.5배, 또는 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 1.0배 내지 10배의 임의의 증가 또는 그 초과를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "조정하다" 또는 "조정하는 것"은 증가하거나 또는 감소하는 것, 또는 증가 또는 감소, 예를 들어 HDL 수준의 증가 또는 LDL 수준의 감소 또는 면역 세포의 수에 있어서의 증가, 또는 면역 세포의 수에 있어서의 감소를 지칭한다.
HDL, LDL 및 콜레스테롤로부터 유래된 지질단백질 및 아포지질단백질의 비제한적 예는 킬로마이크론, 지질단백질(들), 중간 밀도 지질단백질 (IDL), 초저밀도 지질단백질 (VLDL), 및 아포지질단백질 A, B, C, D, E, H, 및 L을 포함한 아포지질단백질 (apo), 및 apoA-I, apoA-II, apoA-IV, apoA-V, apoB48, apoB100, apoC-I, apoC-II, apoC-III, 및 apoC-IV를 포함한 그의 분자 변이체를 포함한다. 교환 가능한 아포지질단백질 (apoA, apoC 및 apoE)은 동일한 게놈 구조를 가지며 공통 조상 유전자로부터 진화된 다유전자 패밀리의 구성원이다. ApoA1 및 ApoA4는 염색체 11 상의 APOA1/C3/A4/A5 유전자 클러스터의 일부이다. 아포지질단백질의 수백 개의 유전적 다형성이 보고되었으며, 이들 중 다수는 문헌 (Holmes et al., 2011)에 개시된 바와 같이 그들의 구조 및 기능을 변경시킨다.
일부 실시양태에서, "수준"은 그 자체가 2가지 상태 간의 수준 비교를 반영하는 상대적 수준일 수 있다. 상대적 수준은 2가지 상태 (예를 들어, 건강한 상태와 병든 상태) 간의 비교 (예를 들어, 비율, 차이, 로그 차이, 백분율 변화 등)를 반영한다. 상대적 수준의 사용은 측정 관련 변동 (예를 들어, 실험실 직원, 실험실, 측정 장치, 시약 로트/제제, 검정 키트 등)을 어느 정도 배제하기 때문에 일부 경우에 유리하다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용량 또는 양에 적용하기 위해 상호 교환적으로 사용된 용어 "치료상 유효한" 및 "유효량"은 이를 필요로 하는 동물에게 투여 시 원하는 활성을 초래하기에 충분한 조성물, 화합물 또는 제약 제형의 양을 지칭한다. 본 발명의 맥락 내에서, 용어 "치료상 유효한"은 본원에 명시된 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 감소시키거나 또는 없애기에 충분한 조성물, 화합물 또는 제약 제형의 그 양을 지칭한다. 활성 성분의 조합물이 투여될 때, 이러한 조합물의 유효량은 개별적으로 투여되는 경우에 유효할 것인 각각의 성분의 양을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 치료 제형의 투여량은 질환 또는 병태의 성질, 환자의 병력, 투여 빈도, 투여 방식, 숙주로부터 작용제의 제거 등에 따라 다양할 것이다. 초기 용량은 더 클 수 있고, 더 작은 유지 용량이 이어질 수 있다. 용량은 유효한 투여량 수준을 유지하기 위해, 예를 들어 매주, 격주, 매일, 주 2회 등으로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 활성제, 즉 β-락탐 및 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함한다.
용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 페트로리움, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등을 포함한 오일일 수 있다. 물 또는 식염수 수용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 바람직하게, 특히 주사 가능한 용액을 위한 담체로서 이용된다. 또 다른 한편으론, 담체는 결합제 (압축된 환제용), 유동 촉진제, 캡슐화제, 향미제, 및 착색제 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고체 투여 형태 담체일 수 있다. 적합한 제약 담체는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기재되어 있다.
제약 조성물로 제형화될 때, 본 발명의 치료 화합물을 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 문구 "제약상 허용되는"이란 일반적으로 생리학적으로 허용 가능한 것으로 여겨지고 전형적으로 인간에게 투여될 때 알레르기성 또는 유사한 유해 반응, 예컨대 급성 위연동 이상항진, 현기증 등을 일으키지 않는 분자 대상 및 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 유도체"는 수용자에게 투여 시 본 발명의 화합물, 또는 그의 활성 대사 산물 또는 잔류물을 (직접 또는 간접적으로) 제공할 수 있는, 본 발명의 화합물의 임의의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 전구약물, 예를 들어 에스테르를 의미한다. 이러한 유도체는 과도한 실험 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 인식될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 문헌 [Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th Edition, Vol 1: Principles and Practice]의 교시를 참조하는데, 이는 그러한 유도체를 교시하는 정도로 본원에 참조로 포함된다. 바람직한 제약상 허용되는 유도체는 염, 용매화물, 에스테르, 카르바메이트, 및 포스페이트 에스테르이다. 특히 바람직한 제약상 허용되는 유도체는 염, 용매화물, 및 에스테르이다. 가장 바람직한 제약상 허용되는 유도체는 염 및 에스테르이다.
모든 부류의 β-락탐은 양성자 공여 기, 예를 들어 카르복실산 또는 플루오린화 수소산을 함유하여, 제약상 허용되는 염으로 용이하게 변환될 수 있다. 제약상 허용되는 염의 비-제한적 예는 벤자틴, 칼슘, 콜리네이트, 디에탄올아민, 디에틸아민, 리신, 마그네슘, 메글루민, 피페라진, 칼륨, 프로카인, 은, 나트륨, 트로메타민 또는 아연을 포함한 양이온과 함께 형성될 수 있다. 추가로, 제약상 허용되는 염의 비-제한적 예는 아세테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 브로마이드, 캄포르술포네이트, 클로라이드, 클로르테오필리네이트, 시트레이트, 에탄디술포네이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 힙푸레이트, 아이오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우릴술페이트, 말레이트, 말레에이트, 메실레이트, 메틸술페이트, 나프토에이트, 납실레이트, 니트레이트, 옥타데세노에이트, 올레에이트, 옥살레이트, 파모에이트, 포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 숙시네이트, 술페이트, 술포살리실레이트, 타르트레이트, 토실레이트, 또는 트리플루오로아세테이트를 포함한 음이온과 함께 형성될 수 있다 (Paulekuhn et al., 2007).
본 발명에 의해 제공된 조성물을 그대로 요법에 사용하는 것이 가능하지만, 제약 제형으로, 예를 들어 의도된 투여 경로 및 표준 제약 실무와 관련하여 선택된 적합한 제약 부형제, 희석제 또는 담체와의 혼합물로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 활성 조성물, 또는 그의 제약상 허용되는 유도체를, 제약상 허용되는 부형제, 희석제, 및/또는 담체와 연합하여 포함하는 제약 조성물 또는 제형을 제공한다. 이러한 부형제, 희석제 및/또는 담체는 제형의 다른 성분과 화합성이고 그의 수용자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용되어"야만 한다.
특히 바람직한 실시양태에서 β-락탐은 트로메타민 [(히드록시메틸)아미노메탄, CAS 번호 77-86-1]을 사용하여 제조되고 (트로메타민; (2S,5R,6R)-6-{[(2S)-2-아미노-2-페닐아세틸]아미노}-3,3-디메틸-7-옥소-4-티아-1-아자비시클로[3.2.0]헵탄-2-카르복실산)을 생산하는 L-암피실린의 트로메타민 염이다. L-암피실린 트로메타민 염은 D-암피실린 나트륨 염 (나트륨; (2S,5R,6R)-6-[[(2R)-2-아미노-2-페닐아세틸]아미노]-3,3-디메틸-7-옥소-4-티아-1-아자비시클로[3.2.0]헵탄-2-카르복실레이트)의 부분입체 이성질체이다. L-암피실린 트로메타민 염은 과학 문헌에서 보고된 바 없지만, 브루커 어센드(Bruker Ascend™) 700 MHz 분광계를 이용한 핵 자기 공명 양성자와 탄소 분석에 의해 본 발명자들은 그의 구조를 확인하였다.
L-암피실린 및 D-암피실린은 키랄 출발 물질을 사용하여 합성적으로 또는 반합성으로 생산되기 때문에, 이들은 라세미 혼합물로서 발견되지 않는다 (실시예 6). L-암피실린은 pH 8.6에서 트로메타민에 가용성이고 100% 변성 에탄올에는 가용성이지 않는 반면, D-암피실린은 pH 8.6에서 트로메타민에 거의 가용성이지 않고, 6133 g/L 물뿐만 아니라 100% 변성 에탄올에서 가용성이다 (본 발명자들에 의해 실험적으로 입증되고 문헌 [Bartzatt et al., 2007]에 개시됨).
본 발명의 조성물 또는 제약 제형은 인간 또는 수의학용으로 사용하기에 편리한 임의의 방식으로 투여하기 위해 제형화될 수 있다.
인간 요법의 경우, 각각의 활성제를 포함하는 제약 제형 또는 조성물은 식품 의약국 (FDA)에 의해 설정된 바와 같은 우수 제조 프로세스 (GMP) 표준에 따라 제조된다. 품질 보증 (QA) 및 품질 관리 (QC) 표준은 순도 및 기능에 대한 시험 및 다른 표준 조치를 포함할 것이다.
염증 치료 및 면역 체계의 반응성 조절에 관한 광범위한 지식이 있지만, 속발성 면역 결핍증 환자의 경우에는 단지 2가지의 FDA 승인 치료 옵션, 즉 감마 글로불린 주입 및 골수 이식이 있다. 이러한 2가지 옵션 모두는 고통스럽고 심각한 안전상의 문제가 있으며 제한된 효능을 제공한다. 암 치료 유발 면역 결핍증을 가진 모든 환자, 모든 HIV 감염 환자, 다른 바이러스 유발 또는 환경 유발 면역 결핍증을 가진 모든 환자는 속발성 면역 결핍증을 치료할 치료제가 없기 때문에 어려움을 겪는다.
본 발명자들은 이전에, 인간 단백질 α1PI가 그의 세포 표면 수용체인 HLE-CS와 결합함으로써 속발성 면역 결핍증 환자에서 면역 체계를 복원하는데 안전하고도 유효하다는 것을 발견하였다. 속발성 면역 결핍증이 있는 다수의 환자를 치료하기 위해 α1PI를 사용하는 것은 공급 및 비용 문제로 인해 경제적으로 실현 가능하지 않지만, HLE-CS와 결합함으로써 α1PI의 생물학적 활성을 모방하는 합성 약물이 관련 기술분야에 필요하다.
살균 활성이 실질적으로 없는 (본원에 정의된 바와 같음) D-암피실린의 L-이성질체의 염 (이하, "L-암피실린")을 포함한 β-락탐의 L-이성질체가, 하기 목적을 위해 α1PI에 대한 대체물로서의 그의 용도를 위해 필요한 활성 α1PI의 생물학적 특성을 갖고 있다는 놀랍고도 예상치 못한 발견이 본원에 개시된다:
(1) 선천성 α1PI 결핍증을 앓고 있는 환자에서 폐기종 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)에서 발생하는 것과 같은 호흡 곤란을 완화시키는 것;
(2) 조혈 조직으로부터 림프구-수임 전구 세포의 동원을 유도함으로써 면역 기능 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 것. 이로써, 암, 아테롬성 경화증, 자가면역, 줄기 세포 이식, 장기 이식, HIV-1 감염, 미생물성 감염, 백혈병, 및 면역 체계의 세포에 의해 영향을 받는 다른 질환으로 인해 그러한 치료가 필요한 개체에서 상승된 수준의 순환성 T 림프구가 생산된다.
(3) 조직 전반에 걸쳐 지질단백질 및 아포지질단백질을 수송하는 T-림프구를 상승시킬 수 있는 그의 능력의 결과로서, 지질단백질 및 아포지질단백질 수준, 예를 들어, HDL 및 LDL 및 콜레스테롤 수준; 및 식이 지방, HDL 및 LDL 및 콜레스테롤로부터 유래된 다른 지질단백질 및 아포지질단백질을 조절함으로써 고지혈증을 앓고 있는 환자를 치료하는 것;
(4) 종양을 앓고 있는 암 환자를 치료하는 것;
(5) 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 종양을 앓고 있는 암 환자를 치료하는 것.
소분자, 예컨대 좌선성 β-락탐이 활성 α1PI의 생물학적 특성을 가지며 전술한 방법에서 대체물로서 사용될 수 있다는 것은 놀랍고도 예상치 못한 일이다.
L-암피실린 및 그의 염은 본 발명에서 사용하기에 특히 바람직한데, 이는 하기 실시예 3에 나타낸 바와 같이, L-암피실린은 본원에 정의된 바와 같이 살균 활성을 실질적으로 갖지 않기 때문이다.
본 발명의 L-암피실린 및 다른 좌선성 β-락탐의 기능적 능력
본 발명에 따르면, L-암피실린 ((2S, 5R, 6R)-6-((S)-2-아미노-2-페닐아세트아미도)-3,3-디메틸-7-옥소-4-티아-1-아자비시클로[3.2.0]헵탄-2-산, CAS # 19379-33-0) 및 다른 β-락탐은 본원에 기재된 방법에서 α1PI에 대한 대체물로서 사용될 수 있다. 본 발명자들은 L-암피실린이 가용성 및 세포 표면 엘라스타제와 결합하고 지질단백질 및 아포지질단백질 수준을 조정하며, 수용체 분극을 유도하고, 세포 운동성을 자극하며, 그러한 치료를 필요로 하는 대상체의 혈청에서 CD4+ T-림프구의 수를 증가시킨다는 것을 발견하였다.
이들 특성에 근거하여, L-암피실린 및 다른 좌선성 β-락탐은 그러한 치료를 필요로 하는 대상체의 혈청 중의 CD4+ T-림프구의 수를 조절하여, 선천성 α1PI 결핍증을 앓고 있는 환자를 포함한 대상체에서 LDL 수준, HDL 수준, 콜레스테롤 수준; 및 LDL, HDL, 콜레스테롤, 및 다른 지질단백질 및 아포지질단백질로부터 생성되거나 또는 이로부터 유래된 다른 지질단백질 및 아포지질단백질의 수준을 조정하는 방법에 사용될 수 있다.
하기 실시예 2에 제시된 바와 같이, β-락탐은 가용성 엘라스타제와 결합하고 이를 불활성화시킨다:
가용성 형태의 엘라스타제 또는 HLE-G를 억제할 수 있는 물질의 능력을 측정하는 절차는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (미국 특허 6,887,678; Bristow et al., 1998). 간략하게, 가용성 인간 백혈구 엘라스타제 (HLE-G)를 시험 물질과 함께 2분 동안 인큐베이션하고, 이 혼합물에 엘라스타제 기질 숙신-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-니트로아닐리드 [SA3NA, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)]를 부가한다. 405 nm에서의 색상 변화를 측정함으로써 결과를 검출한다. 이들 결과로부터 IC50을 계산한다.
하기 실시예 4에 제시된 바와 같이, L-암피실린은 수용체 분극을 유도하고 세포 운동성을 자극한다.
수용체 분극을 유도하는 절차가 보고되었다 (Bristow et al., 2003). 관심 세포 (단핵구, 림프구, 호중구 또는 다른 혈액 세포, 예를 들어 백혈병 세포)는 표준 기술 (예를 들어, 문헌 [Messmer et al., 2002]에 개시된 바와 같음)을 사용하여 혈액 또는 조직으로부터 단리되고 L-암피실린과의 반응성에 관하여 조사된다.
수용체 분극을 조사하기 위해, β-락탐의 연속 희석액을 부가하여 현미경 슬라이드를 준비한다. 세포를 현미경 슬라이드에 부가하고 37℃ 하에 가습된 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션한다. 부착되지 않은 세포는 세척에 의해 제거되고, 부착된 세포는 4% 파라포름알데히드의 적용에 의해 고정시킨 후, 부착된 세포를 광학 현미경 검사로 계수하고 공초점 현미경 검사를 이용하여 촬영한다.
하기 실시예 4에서 입증된 바와 같이, L-암피실린은 세포 운동성을 자극한다. 공초점 현미경 검사를 사용하여, L-암피실린으로 처리된 세포가 세포 운동성을 진행하는 세포의 형태를 나타냈다는 것을 입증하였다.
L-암피실린이 림프구-수임된 전구 세포를 동원한다는 것을 입증하기 위해, 잭슨 라보라토리(Jackson Laboratory) C57BL/6 식이 유발 비만 (DIO) 당뇨병 마우스 모델이 사용된다. DIO 마우스 모델은 림프계 또는 골수계 세포를 동원하고 LDL 수준을 저하시킬 수 있는 L-암피실린의 능력을 평가하는 데 사용된다.
본 발명에 사용하기 위한 좌선성 β-락탐의 치료 유효량
제조업체에 따르면, α1PI 결핍증을 치료하기 위한 PROLASTIN-C® (인간 α1PI)에 대한 권장 요법은 0.08 ml/kg/분의 속도로 매주 60 mg/kg의 주입을 반복하는 것이다. PROLASTIN-C®의 특이적 활성은 70%이며, 여기서 특이적 활성은 패키지 삽입물에 기재된 바와 같이 엘라스타제 활성의 억제로서 정의된다. 따라서, α1PI의 권장 용량은 α1PI의 정상 수준의 절반을 달성하기 위한 42 mg/kg의 활성 α1PI 및 α1PI의 정상 수준을 달성하기 위한 84 mg/kg 또는 1.53 밀리몰/kg이다. L-암피실린의 질량은 349.41 mg/몰이므로, 1.53 밀리몰/kg은 0.53 mg/kg이고, 이는 L-암피실린의 표적 용량이다. 비교하면, 박테리아성 감염을 치료하기 위한 D-암피실린의 소아 용량은 50 내지 100 mg/kg/일 (6 시간마다)이고, 소아 혈액 용적은 70 ml/kg이며; 따라서 D-암피실린의 소아 용량은 50 내지 100 mg/70ml이며, 이는 2 내지 4 밀리몰/일 또는 6시간마다 (q6hr) 0.7 내지 1.3 밀리몰과 등가이다. 흔히 사용되는 성인 용량은 750 내지 1500 mg/일 (q6hr)이며, 성인 혈액 용적은 5 L이며, 이는 0.4 내지 0.9 밀리몰/일 또는 0.2 내지 0.3 밀리몰 q6hr과 등가이다. 따라서, 흔히 사용되는 D-암피실린의 용량은 L-암피실린의 치료상 유효한 용량과 대략 등가이다. α1PI 치료는 주입에 의해 매주 제공되는 반면, L-암피실린은 필요한 경우에 경구로 더 자주 투여될 수 있다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 이러한 본 발명의 실시양태에 사용하기 위한 좌선성 β-락탐의 치료 유효량은 성인의 경우에 하루에 4회 (qid) 투여되는 약 100 mg 내지 약 3000 mg/kg 체중이고, 소아의 경우에는 약 10 mg 내지 200 mg/kg qid일 것이다.
좌선성 β-락탐에 대한 바람직한 투여 경로는 경구이지만, 다른 경로, 예컨대 피하 주사, 근육내 주사 및 국소 투여가 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 L-암피실린은 BOC 사이언시스 (BOC Sciences; 미국 뉴욕주 셜리)를 포함한 다수의 공급처로부터 상업적으로 이용 가능하다. L-암피실린 및 L-암피실린의 염은, 예를 들어, 하기 실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 다른 β-락탐에 대한 상업적 공급처는 하기 실시예 9에 제시된다.
치료 결과 측정:
치료가 가용성 엘라스타제 억제 활성에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위해, 개체를 대상으로 활성 및 불활성 α1PI 혈액 수준의 변화에 관하여 매주 모니터링한다 (Bristow et al., 1998) (미국 특허 6,887,678). 간략하게, 일정량의 활성 부위 적정된 엘라스타제를 37℃ 하에 2분 동안 혈청의 연속 희석액과 함께 인큐베이션한 후 엘라스타제 기질을 부가하였다. 잔류의 억제되지 않은 엘라스타제에 의해 절단된 기질 분자의 결정은 혈액 중의 활성 및 불활성 α1PI의 분자를 계산하기 위해 사용된다. 활성 및 불활성 α1PI 활성의 측정 상의 변화에 이어, 이러한 변화가 혈액 중의 β-락탐의 존재로 인해 활성 및 불활성 α1PI를 측정하는 데 있어서의 생리학적 변화 또는 간섭에 기인한 것인지를 결정한다. β-락탐 치료를 받는 환자의 경우, 치료 전, 치료 동안 및 치료 후에 활성 및 불활성 α1PI를 측정한다.
표적화된 혈액 세포 집단의 수준에 있어서의 변화를 유도하는 것에 대한 치료의 유효성를 결정하기 위해, 치료된 개체를 대상으로, 유동 세포계수법을 사용하여 완전한 혈구 계수 및 격차에 있어서의 변화 뿐만 아니라 특이적 서브세트의 혈액 세포, 예컨대 CD4+ 림프구 세포 및 HLE-CS+ 세포에 있어서의 변화에 관하여 매주 모니터링한다 (Bristow et al., 2001; Bristow, 2001; US 특허 6,858,400). 간략하게, 100 μl의 전혈을 의료 진단을 위해 FDA에 의해 승인된 형광-표지된 모노클로날 항체 [예를 들어, 비디 다이아그노스틱스 (BD Diagnostics; 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크)로부터 상업적으로 이용 가능함]의 패널과 함께 인큐베이션한다. 이들 항체는 관심 세포 집단을 독특하게 확인하는 세포 수용체를 특이적으로 인식하도록 선택된다. 모노클로날 항체와 결합되는 혈액 중의 세포의 확인 및 계수는 유동 세포계수법을 사용하여 수행된다.
좌선성 β-락탐은 또한, 대상체에서 LDL 수준, HDL 수준, 콜레스테롤 수준; 및 LDL, HDL 및 콜레스테롤로부터 생성되거나 또는 이로부터 유래된 다른 지질단백질 및 아포지질단백질, 예컨대 apoA, apoB, apoC, 및 apoE의 수준을 조정하는 방법이며, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 β-락탐을 포함하는 제약 조성물을 투여하고; 그에 의해 대상체에서 LDL 수준, HDL 수준 및 콜레스테롤 수준; 및 LDL, HDL, 콜레스테롤 및 다른 지질단백질 및 아포지질단백질로부터 생성되거나 또는 이로부터 유래된 다른 지질단백질 및 아포지질단백질의 수준을 조정하는 것을 포함하는 방법에 사용될 수 있다.
하나의 바람직한 실시양태에서, LDL의 수준; 및 LDL로부터 생성되거나 또는 이로부터 유래된 다른 지질단백질 및 아포지질단백질의 수준이 저하된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서 HDL의 수준; 및 HDL로부터 생성되거나 또는 이로부터 유래된 다른 지질단백질 및 아포지질단백질의 수준이 증가된다.
좌선성 β-락탐은 또한, 대상체에서 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 수를 조정하기 위해 조혈을 조절하는 방법이며, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 β-락탐을 포함하는 제약 조성물을 투여하고; 그에 의해 CD4+ CD8+ 전구 T 세포의 수 및 이로써 생성되는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 수를 조정하는 것을 포함하는 방법에 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 선천성 α1PI 결핍증을 앓고 있는 환자 및 COPD를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이며, 상기 환자에게 유효량의 β-락탐을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또한 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 L-암피실린의 트로메타민 염을 포함하는 물질의 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 L-암피실린의 트로메타민 염 및 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 그의 범위를 제한하지 않으면서 본 발명을 추가로 설명하기 위한 하기 실시예에 기재된다.
실시예 1: α1PI는 인간 백혈병 세포의 SDF-1 유도된 이동을 억제하고 인간 줄기 세포의 이동을 증강시킨다
인간 급성 골수성 백혈병 세포 (AML)는 HLE-G를 분비할 뿐만 아니라 CXCR4/SDF-1 축에 의해 조절되는 방식으로 세포 표면 상에서 HLE-CS를 구성적으로 발현한다 (Tavor et al., 2005). AML 세포와 α1PI를 미리 인큐베이션하면, 시험 관 내 트랜스웰 검정을 사용하여 시험된 모든 AML 세포에서 SDF-1 의존적 이동이 상당히 감소되었다 (Tavor et al., 2005). 추가로, 마우스 모델에서, α1PI는 이식 된 인간 줄기 세포의 골수로의 귀소 및 골수로부터 이식된 AML 세포의 유출을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Lapidot and Petit, 2002). 그 영향은 HLE-CS에 대한 α1PI의 작용에 의해 발생하는 것으로 나타났다 (Bristow et al., 2008; Bristow et al., 2012).
AML 세포를 α1PI로 처리할 때, SDF-1-유도된 슈도포디아(pseudopodia) 형성이 방지되었다. 이러한 결과는 SDF-1로 미리 처리함으로써 α1PI-유도된 슈도포디아 형성 및 세포 이동 억제가 방지되었다는 것을 명확하게 보여준 (도 1), U937 전단핵구 세포주를 사용한 이전 연구와 대조적이다 (Bristow et al., 2003). 이러한 차이는 세포에 대한 α1PI의 영향의 역학을 조사함으로써 해결되었으며, 분화 단계 및 세포와의 상호 작용 순서에 따라 다양한 세포의 세포 이동을 촉진시키는 데 있어서의 α1PI 및 SDF-1의 중요성을 강조한다 (Bristow et al., 2013).
부착 검정을 위해, 멸균 커버슬립 [12 mm 직경, 시그마(Sigma)]을 내독소가 없는 물로 세척하고, 칼슘 및 마그네슘을 수반하지 않은 HBSS 중에 하기 자극제 중 하나의 다양한 희석물을 함유하는 10 μl 용적을 전달함으로써 제조하였다: CCL3 [MIP-1α, 페프로텍, 인크. (Peprotech, Inc.; 미국 뉴저지주 로키 힐)], α1PI CCL4, (MIP-1β, 페프로텍), CCL5, (RANTES, 페프로텍), CXCL12, (SDF-1, 페프로텍), (Cat.#A6150, lot#82H9323, 시그마), α1PI (A9024, lot#115H9320, 시그마), α1 항키모트립신 [α1ACT, 칼바이오켐 (Calbiochem; 미국 캘리포니아주 라호이아)], 항트롬빈 III [ATIII (시그마)], C1 에스테라제 억제제 (C1inh, 칼바이오켐), 메톡시숙시닐-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Val-클로로메틸케톤 (MAAPVCK, 시그마), N-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸케톤 (TPCK, 시그마), 트롬빈 효능제를 대표하는 합성 펩티드 (SFLLRN, Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn), 또는 10% EtOH에 가용화된 HIV 융합 도메인을 대표하는 합성 펩티드 (FLGFL, Phe-Leu-Gly-Phe-Leu).
전술한 바와 같이 화학유인 물질로 제조된 커버 슬립에, 90 μl HBSS 중의 106개의 세포를 균일하게 혼합하고, 탈수 없이 37℃ 하에 가습된 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 자극제의 상호 작용 효과를 검출하기 위해, 세포를 80 μl 용적으로 10 μl의 하나의 자극제로 미리 제조된 커버슬립에 전달하고, 균일하게 혼합하며, 37℃ 하에 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 부가의 자극제를 각각의 커버슬립에 10 μl 용적으로 전달하고, 미리 인큐베이션된 세포와 균일하게 혼합하며, 37℃ 하에 30 내지 60분 동안 인큐베이션하였다. 비-부착성 세포가 없는 커버슬립을 엄격하게 세척한 후, 부착성 세포를 2.5 μM의 핵 염색, 아크리딘 오렌지를 함유하는 PBS 중의 4% 파라포름알데히드와 함께 20℃ 하에 10분 동안 인큐베이션함으로써 고정시켰다. 슬라이드를 차이스 악시오스콥(Zeiss Axioskop) 상에서 에피-조명 UV 현미경 검사함으로써 조사하였다. 평균 및 표준 편차는 적어도 3개의 필드/커버슬립에서 부착성 세포를 계수함으로써 결정되었다.
도 1에는 (A) 케모카인 CXCL12α (●), CCL3 (■), CCL4 (▲), 및 CCL5 (▼)에 반응하거나 또는 프로테이나제 억제제 α1PI (▲), ATIII (■), 및 α1ACT (●)에 반응한 계수된 부착성 세포가 도시된다. 평균 및 표준 편차는 자극된 부착과 자극되지 않은 부착 간의 차이를 나타낸다. (B) 플러스 클론 10 (●)이 HLE에 대한 합성 펩티드 억제제인 MAAPVCK에 의해 부착되도록 자극되었고 키모트립신에 대한 합성 펩티드 억제제인 TPCK에 의해 부착되도록 자극되었지만, 마이너스 클론 17 (■)은 그렇지 않았다. 플러스 클론 10 (●)은 HIV 융합 펩티드 (FLGFL)에 반응하여 부착되도록 자극되었지만, 마이너스 클론 17 (■)은 그렇지 않았다. HIV 융합 펩티드 FLGFL을 10% EtOH에 가용화시키고, 펩티드의 부재하에 10% EtOH와 함께 인큐베이션된 세포의 자극되지 않은 부착은 36±6개 세포/필드였다. 어느 서브클론도 트롬빈 효능제 펩티드 (SFLLRN)에 의해 영향을 받지 않았다. α1PI의 2가지 상이한 제제는 32.7% 활성 (●) 및 8.3% 활성 (■)인 것으로 결정되었다. (C) 이들 2가지 α1PI 제제에 의해 자극된 플러스 클론 10은 활성 α1PI의 동등한 최적 농도에 반응하였지만, 불활성 α1PI의 상이한 농도에 반응하였다. 부착은 각각의 화학유인 물질에 대해 최적화되었고, 각각의 화학유인 물질에 의해 유도된 부착은 3가지 초과의 별도의 실험에서 열거되었다.
24시간 주기에 걸친 다양한 시점에서 다양한 효능제에 의해 자극된 부착의 조사는 30 내지 60분에 최적의 효과가 검출될 수 있었다는 것을 보여주었다. 동일한 조건을 사용하는 독립적인 실험에서 클론의 부착은 변하지 않았다. 독립적인 실험들 간의 U937 서브클론의 자극되지 않은 부착은, 세포를 배양한 소 혈청에 의해 전체적으로 설명될 수 있으며, 이는 세포가 이전에 입증된 바와 같이 공지되지 않은 혈청 성분에 의해 컨디셔닝되었다는 것을 시사한다 (Bristow et al., 2001; Bristow et al., 2003).
실시예 2: 활성에 관한 β-락탐의 스크리닝; 엘라스타제 프로테이나제 활성의 억제 (HLE-G) 및 세포성 부착의 자극 (HLE-CS).
화합물을 대상으로 50% 억제 활성 (IC50) 대 75 μM 가용성 과립-관련 인간 백혈구 엘라스타제 (HLE-G)에 관하여 스크리닝하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, α1PI는 그의 기지의 등몰 관계와 일치하는 HLE-G 농도의 절반인 38 μM의 IC50을 나타냈다. 세펨, 페남, 모노박탐, 페넴, 및 카르바페넴은 219±48 μM의 IC50 평균 값을 나타냈으며, 이는 β-락탐이 IC50에서 HLE-G에 대한 화합물의 몰 과량에서 HLE와 결합하는 데 유효하다는 것을 시사한다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 5가지 부류 모두의 β-락탐은 HLE-G 및 HLE-CS와 결합한다.
<표 1>
5가지 부류 모두의 β-락탐은 HLE-G 및 HLE-CS와 결합한다
Figure 112019095116714-pct00001
* HLE-G (75 μM) 대비 화합물의 IC50. 비교를 위해, α1PI은 IC50에서 38 μM이다.
** IC50에서 HLE-G에 대한 화합물의 몰 과량.
*** 각각의 화합물-처리된 웰에 2,000개의 U937 세포를 부가하였다. 비교를 위해 (도 1C 참조), α1PI의 최적의 농도는 10,000개의 U937 세포 당 0.5 nm이며, 75±19개의 부착성 세포를 산출한다.
실시예 3: L-암피실린은 항생제 활성을 실질적으로 갖고 있지 않다
항생제 활성에 관하여 스크리닝하기 위해, 커비-바우어(Kirby-Bauer) 디스크 시험에 대한 임상 실험실 표준 연구소 (CLSI) 승인 프로토콜을 수행하여 D-암피실린의 항생제 활성과 L-암피실린의 항생제 활성을 비교하였다.
D-암피실린-감수성 이. 콜라이 DH5-알파를 LB 브로쓰에서 밤새 배양하고, <300 X 106 CFU에 대해 맥팔랜드(McFarland) 탁도 표준 0.05를 사용하여 세포 농도를 보정하였다. 이러한 농도의 세포에서, 박테리아는 뮐러-힌턴 한천 플레이트 상에 확산되었다. 필터 디스크 (6 mm 직경)를 한천 위에 놓아 두고 각각의 디스크에, 50 mM 농도로 시작하는 10배 연속 희석액 중의 10 μl의 D-암피실린 또는 L-암피실린을 적용하였다. 37℃ 하에 16시간 동안 인큐베이션한 후, 억제 영역에 대해 플레이트를 조사하였다. 그 결과가 도 2A 및 2B에 도시되어 있다.
도 2A에서, 5 mM 및 0.5 mM D-암피실린의 억제 영역의 직경 (각각 10시 방향에서 3 cm 및 8시 방향에서 1.5 cm)은 도 2B에서의 50 mM 및 5 mM L-이성질체의 억제 영역의 직경과 등가였다 (각각 12시 방향에서 2.8 cm 및 10시 방향에서 1.4 cm). 이들 결과는 L-이성질체가 D-암피실린과 비교하여 10배 더 적은 항생제 활성을 가진다는 것을 입증해 준다.
D-암피실린의 소아 용량은 50 내지 100 mg/kg/일 (6시간마다)이고, 소아 혈액 용적은 70 ml/kg이며; 따라서 D-암피실린의 소아 용량은 50 내지 100 mg/70ml이며, 이는 2 내지 4 mM/일 또는 6시간마다 (q6hr) 0.7 내지 1.3 mM과 등가이다. 흔히 사용되는 성인 용량은 750 내지 1500 mg/일 (q6hr)이고, 성인 혈액 용적은 5 L이며, 이는 0.4 내지 0.9 mM/일 또는 0.2 내지 0.3 mM q6hr과 등가이다. D-암피실린은 커비-바우어 디스크 시험에서 소아 용량의 범위 내에 있고 성인 용량을 초과하는 0.5 mM에서 활성을 나타낸다. 그러나, L-암피실린은 10배 더 높은 농도 (5 mM)에서 동등한 활성을 나타내며 0.5 mM 농도에서는 항생제로서 효과적이지 않은데, 이는 이러한 투여량에서 사용될 경우 항생제로서 효과적이지 않다는 것을 명확하게 보여준다. 암피실린 내성 대 감수성 이. 콜라이에 대한 2014 임상 및 실험실 표준 연구소 (CLSI) 기준은 4배 투여량 차이이다. D-암피실린과 L-암피실린 간의 투여량 차이는 10배이기 때문에, L-암피실린은 유효한 항생제가 아니다 (표 2A, 2014 CLSI M100-S24) (CLSI, 2014).
실시예 4: L-암피실린에 의한 세포 이동 및 세포내 이입의 자극.
수용체 분극: U937 클론 10 세포를 AIM-V 무혈청 배지에서 밤새 배양하였다. 세포를 펠렛화하고, 2x106개/ml로 AIM-V에 재현탁시키며, 부착을 방지하기 위해 미리 코팅된 에펜도르프 튜브에 250 μl (5 X 105개 세포)를 부가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 15분 동안 양성 대조군 (α1PI, PROLASTIN®-C 또는 ZEMIRA®), D-암피실린, L-암피실린 또는 음성 대조군 (AIM-V 배지)으로 미리 컨디셔닝하여, 이전에 밝혀진 바와 같이 세포 표면 인간 백혈구 엘라스타제 (HLE-CS), CD4+, CXCR4, T 세포 항원 수용체 (TcR), 및 초저밀도 지질단백질 수용체 (VLDLR)를 포함한 기능적으로 관련된 혈장 막 수용체의 분극을 유도하였다 (Bristow, et al. 2013).
결합 및 세포내 이입: 입체 형태적으로 및 기능적으로 무손상인 외피 당단백질을 갖는 비감염성 바이러스로 이루어진, AT 2 화학적적으로 불활성화된 SHIV 제제는 AIDS 백신 프로그램 [SAIC 프레더릭 (SAIC Frederick; 미국 메릴랜드주 프레더릭)]에 의해 제공되었다. 결합은 허용하지만, 세포내 이입을 방지하는 2℃ 하에 2시간 동안 세포를 바이러스 (106개 세포 당 30 ng p27 또는 p24)로 펄싱하였다. 또 다른 한편으론, 결합과 세포내 이입을 허용하는 37℃ 하에 2시간 동안 세포를 바이러스로 펄싱하였다. 2시간 동안 펄싱한 후, 세포를 현미경 검사를 위해 알시안 블루(Alcian blue) 슬라이드에 고정시켰다. 시험 세포에서의 불활성화된 바이러스의 존재는 면역조절 실험실, NIAID, NIH에 의해 제공되는 도데카머성 인간 CD4+-IgG1을 사용하여 검출되었다. 이러한 시약은 입체 형태적으로 무손상인 HIV 1/SIV 외피 gp120을 특이적으로 인식한다. CD4-IgG1은 HRP-접합된 Rb 항-인간 IgG (시그마)를 사용하여 검출되었다. CD4+ IgG-표지된 세포를 티라미드 시그널 증폭 시스템 [라이프 사이언스 프로덕츠 (Life Science Products; 미국 매사추세츠주 보스톤)]을 사용하여 오레곤 488 플루오로크롬에 커플링시켰다. 일부 경우에, 슬라이드 상에 염색된 세포를 차단 단계 동안 0.05% 사포닌을 사용하여 투과시키고, 핵 염색 염료, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 추가로 염색하고, 고정시키고, 차이스 악시오플란(Zeiss Axioplan)을 사용하여 에피형광 현미경 검사하거나 또는 펄킨 엘머 오퍼레타(Perkin Elmer Operetta) 고 함량 영상화 시스템을 사용하여 공초점 현미경 검사함으로써 조사하였다. 세포를 3B로부터 2 μm 스캐닝을 사용하여 분석하였다.
L-암피실린으로 미리 컨디셔닝된 세포의 공초점 영상은 세포의 부착된 표면 위 6 μm에서 포착되었다.
그 결과가 도 3A 및 3B에 도시되어 있다. 도 3A에서, 2℃ 하에 유지된 세포는 수용체 분극을 나타냈다. SHIV는 편광된 세포의 원형질 막에서만 검출되었으며, 세포 내부에서는 결코 검출되지 않았다. 세포를 둥글게 하였고 세포 이동의 증거는 나타내지 않았다. 도 3B에서, 37℃ 하에 유지된 세포는 세포 이동의 연장되는 최첨단 및 후퇴하는 후미 특징을 나타냈다. SHIV는 세포의 내부에서, 최첨단에서 현저하게 관형 구조를 따라, 그리고 이동하는 세포의 후미에서의 엔도솜 내에서 검출되었다. 완충제 단독의 존재 하에서는 SHIV 결합이 없었다 (도시되지 않음). DAPI는 핵을 나타낸다. 막대는 25 μm을 나타내고, 화살표는 이동하는 세포의 운동 방향을 도시한다.
실시예 5: L-암피실린은 LDL 수준을 저하시킨다.
널리 공지된 잭슨 라보라토리 (미국 메인주 바 하버) C57BL/6 식이 유발 비만 (DIO) 마우스 모델은 인간의 대사 증후군 및 상승된 LDL 수준을 나타낸다. 마우스에게 다양한 기간 동안 고 지방 식이 (60% 지방) 또는 정상 식이 (10% 지방)를 공급하고 지질단백질 수준을 측정하였다. 10% DIO와 비교 시, 60% DIO는 총 콜레스테롤, HDL 및 LDL 수준이 상당히 상승되었지만 (p <0.001), 트리글리세리드 수준 (Tg)은 아니다 (도 4).
마우스는 경구 섭식에 의해 에제티미브 (10 mg/kg) 또는 L-암피실린 (50 mg/kg 또는 5 mg/kg)으로 매일 치료를 받았다.
최근에 시행된 인간 임상 시험 (NCT01731691)에 사용된 프로토콜에 따라, 마우스 말초 혈액을 혈액 수집 튜브에 수집하고, 베크만 쿨터(Beckman Coulter) AU680 화학 시스템을 사용하여 혈청을 지질단백질 수준에 관하여 분석하였다. 또한, CD3, CD4 및 CD8을 포함한 림프구 서브세트를 정량하기 위해 세포를 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. 기준선 수준 (치료 전)과 비교 시, 지질단백질 수준 (총 콜레스테롤, HDL, LDL, apoA, apoB, apoC, apoE를 포함하나 이에 제한되지는 않는다) 및 상기 언급된 세포 마커를 발현하는 혈액 세포를 정량화하여 치료에 기인한 변화를 결정하였다.
식이 유발 비만 마우스 (DIO, 잭슨 라보라토리)에게 17주 동안 60% 지방 식이를 공급하였다. 12마리의 마우스를 비히클 대조군 (군 1), 에제티미브 [제티아(Zetia), 케이맨 케미칼(Cayman Chemical)], 10 mg/kg, (군 2), L-암피실린 (50 mg/kg), (군 3), 및 L-암피실린 (5 mg/kg), (군 4)을 포함한 4가지 연구 부문 각각에 배정하였다. 화합물을 1주에 5일 경구 섭식에 의해 전달하였다. 혈청 샘플을 제3주, 제6주 및 제8주에 수집하고 글루코스, 총 콜레스테롤, 트리글리세리드, HDL, LDL 및 비-에스테르화된 지방산의 수준에 관하여 분석하였다.
마우스는 연구 내내 DIO 식이로 유지되었기 때문에, 비히클 대조군 (군 1)에서는 체중 및 LDL 수준이 증가하였다. 화합물의 유효성을 비교하기 위해, 비히클의 평균 값에 대한 비율을 형성함으로써 각각의 처리군 내의 평균 값을 정규화하였고, 그러한 비율은 하기 공식을 사용하여 정규화된 % 변화로서 표현되었다:
100-(처리 평균/비히클 평균 * 100).
그 결과가 도 4에 도시되어 있다. 제6주에, L-암피실린, 5 mg/kg (군 4, 흑색 막대)에 대한 정규화된 평균 % 변화는 -41.0 ± 20.5%이고 에제티미브 (군 2, 회색 막대)에 대한 것은 - 43.8 ± 29.6%인데, 이는 비히클 (군 1, 격자형 막대) 또는 L-암피실린, 50 mg/kg (군 3, 백색 막대) (각각 10% 및 3.7%) 보다 유의적으로 더 낮다 (P=0.001).
실시예 6: L-암피실린의 화학적 합성.
화합물의 단계별 화학적 합성이 상세히 기재된다.
Figure 112019095116714-pct00002
Figure 112019095116714-pct00003
Figure 112019095116714-pct00004
실시예 7: 정상적이고 건강한 개체의 조혈에서의 α1PI
HIV-1 비감염된 개체에서는 CD4+ T 림프구 계수치 (이하 "CD4 계수치")가 세포 표면 인간 백혈구 엘라스타제 (HLE-CS, 활성 α1PI 수준)를 발현하는 세포의 수, 및 케모카인 수용체 CXCR4를 발현하는 세포의 수에 의해 조절된다는 것이 이전에 입증되었다 [r2 = 0.92, p, 0.001, n = 31; 참고 공개 (Bristow et al., 2012)의 표 1]. HIV-1 감염된 환자에서는, 활성 α1PI가 질환 프로세스로 인해 결핍되고, 이는 활성 α1PI가 CD4+ 계수치에 대한 속도 제한이 되는 상황이다 [참고 공개 (Bristow et al., 2001)의 표 1]. 본 발명자들은 활성 α1PI가 HIV-1 감염된 개체에서 CD4+ 계수치와 강하게 상관 관계가 있다는 것을 입증하였다 [r2 = 0.927, p <0.0001, n = 26; 참고 공개 (4)의 도 1].
임상 시험에서, 치료적 α1PI 투여는 HIV-1 감염으로 인한 후천성 α1PI 결핍증을 동반한 HIV-1 감염된 환자 및 유전성 α1PI 결핍증을 동반한 HIV-1 비감염된 환자에서 CD4+ 계수치의 증가를 유발시킨다는 것이 입증되었다. 이는 α1PI가 HIV-1 질환의 존재 또는 부재 하에 CD4+ 계수치를 조절한다는 것을 확인시켜 준다 [참고 공개 (Bristow et al., 2010)의 도 1]. α1PI가 CD4+ 계수치를 조절하는 메커니즘은 조직을 통한, 구체적으로 CD4+ T-림프구가 생성되는 흉선을 통한 세포의 이동을 유도하는 것이란 사실이 입증되었다. HLE-CS (활성 α1PI와 결합하는 수용체) 및 초저밀도 지질단백질에 대한 수용체 (VLDLR, 불활성 α1PI과 결합하는 수용체)를 발현하는 T-림프구에 대한 순환성 α1PI의 결합은, 동일한 세포 상에서 VLDLR에 대한 α1PI-HLE-CS 복합체의 결합을 촉진시키는 입체 형태적 변화를 초래하며, 이는 수용체 응집체의 세포내 이입 및 세포의 전진 운동을 유도하는 상황이다 (Bristow et al., 2013).
새로운 증거 (미공개 관찰 내용)는 HIV-1 비감염된 개체에서 CD4+ 계수치가 다음 4가지 변수의 조합과 선형적으로 상관 관계가 있다는 것을 명확하게 보여준다: 1) HLE-CS 및 VLDLR을 발현하는 T-림프구 (Ly)의 수, 2) 활성 α1PI 수준, 3) 불활성 α1PI 수준, 및 4) T 세포 항원 수용체 재배열 절제 원 (sjβTREC, 새로운 T-림프구의 생성에 특이적인 바이오마커). 이러한 증거는 α1PI가 전구 세포로부터 새로운 CD4+ 세포의 생성을 유도한다는 것을 확인시켜 준다 (표 2). α1PI가 CD4+ 계수치를 조절하는 메커니즘은 흉선을 통한 조혈 전구 세포의 이동을 유도하는 것이다 (흉선 세포 생산). 예상된 바와 같이, B 세포 (CD19+)는 sjβTREC와 상관 관계가 없는 것으로 밝혀졌지만 (r = -0.221, P = 0.259, n = 28), HLE-CS+ VLDLR+ T-림프구, 활성 및 불활성 α1PI 수준과는 선형으로 상관 관계가 있는 것으로 밝혀졌다 (표 2). 놀랍게도, 적혈구 (RBC)는 또한, HLE-CS+ VLDLR+ T-림프구, 활성 및 불활성 α1PI 수준과 선형으로 상관 관계가 있었다 (표 2). 호중구 및 단핵구 세포는 이들 변수 중 어떠한 것과도 상관 관계가 없었다 (표 2). α1PI가 CD4+ 계수치를 조절하는 메커니즘은 흉선을 통한 조혈 전구 세포의 이동을 유도하는 것이다 (흉선 세포 생산). 예상된 바와 같이, B 세포 (CD19+)는 sjβTREC와 상관 관계가 없는 것으로 밝혀졌지만 (r = -0.221, P = 0.259, n = 28), HLE-CS+ VLDLR+ T-림프구, 활성 및 불활성 α1PI 수준과는 선형으로 상관 관계가 있는 것으로 밝혀졌다 (표 2). 놀랍게도, 적혈구 (RBC)는 또한, HLE-CS+ VLDLR+ T-림프구, 활성 및 불활성 α1PI 수준과 선형으로 상관 관계가 있었다 (표 2). 호중구 및 단핵구 세포는 이들 변수 중 어떠한 것과도 상관 관계가 없었다 (표 2).
흉선 세포 생산은 출생 전에 발생하며, 성인기를 통해 노년기의 삶으로 계속 이어지는데, 이때 흉선이 새로운 CD4+ T-림프구를 생산할 수 있는 능력을 상실한다. 따라서, 치료적 α1PI, 및 본 발명에 따라, β-락탐은 CD4+ T-림프구의 수가 정상 이하이거나 또는 정상 이하가 될 것으로 예상되는 경우 속발성 면역 결핍증의 치료 또는 예방에 권고된다. 후천성 면역 결핍증으로서 공지되기도 한 속발성 면역 결핍증은 다양한 면역억제제, 예를 들어, 영양 실조, 노화 및 특별한 의약 (예를 들어, 화학요법, 장기 이식 후 투여되는 질환-변형 면역억제 약물, 글루코코르티코이드)으로 인해 발생할 수 있다. 또한, α1PI, 및 본 발명에 따라, β-락탐은 LDL 수준이 상승된 대사 증후군을 동반한 개체의 치료에서 유사하게 권고된다.
인간 임상 시험으로부터, 하기 상관 관계가 밝혀졌다:
1) 증가된 총 콜레스테롤 및 LDL은 증가된 apoB100과 상관 관계가 있었다 (각각 r=0.82, P=2E-07, n=36 및 r=0.89, P=2E-07, n=36). 이는 apoB100이 LDL과 결합하는 것으로 널리 알려져 있기 때문인 것으로 예상된다 (Veniant et al., 1998);
2) 증가된 트리글리세리드는 증가된 apoB48 (r=0.89, P=2E-07, n=36) 및 증가된 CD4+ T-림프구와 상관 관계가 있었고, 이러한 상관 관계는 HIV-1 질환에서 α1PI 요법에 의해 증폭되었지만 (r=0.48, P=0.014, n=26), 감소된 단핵구와 상관 관계가 있다 (r=-0.69, P<2E-07, n=36). 이는 apoB48이 트리글리세리드와 결합하고 트리글리세리드가 주로 CD4+ T 세포에 의해 수송되는 것으로 널리 알려져 있기 때문인 것으로 예상된다 (Stalenhoef et al., 1984; Bristow et al., 2013);
3) 증가된 HDL은 증가된 apoA1과 상관 관계가 있었고 (r=0.82, P<9.7E-10, n=36); 이는 apoA1이 HDL과 결합하는 것으로 널리 알려져 있기 때문인 것으로 예상된다 (Fagerberg et al., 2014).
4) 증가된 총 α1PI는 감소된 CD3+ T-림프구 (r=-0.66, P<1E-06, n=36) 및 감소된 CD8+ T-림프구와 상관 관계가 있었으며, 이러한 경우 상관 관계는 α1PI 요법에 의해 증폭되었다 (r=-0.69, P<8E-05, n=25). 이는 증가된 α1PI가 증가된 CD4+ T 림프구와 상관 관계가 있고 증가된 CD4+ T 림프구는 감소된 CD8+ T 림프구와 상관 관계가 있는 것으로 밝혀졌기 때문인 것으로 예상된다 (Bristow et al., 2012).
예기치 않은 결과는 α1PI 요법에 의한 지질단백질의 조절을 명확하게 보여주었다:
1) 증가된 총 α1PI는 감소된 apoB48과 상관 관계가 있었고, 이러한 상관 관계는 HIV-1 질환에서 α1PI 요법에 의해 증폭되었다 (r=-0.80, P<2E-06, n=26);
2) 증가된 활성 α1PI는 감소된 HDL과 상관 관계가 있었다 (r=-0.51, P<0.002, n=36);
3) 증가된 HDL은 증가된 apoA1과 상관 관계가 있었고 (r=0.82, P<9.7E-10, n=36); 이는 apoA1이 HDL과 결합하는 것으로 널리 알려져 있기 때문인 것으로 예상된다 (Fagerberg et al., 2014).
4) 증가된 활성 α1PI는 감소된 apoA1과 상관 관계가 있었다 (r=-0.61, P=7E-05, n=36);
5) 증가된 활성 α1PI는 감소된 림프구와 상관 관계가 있었다 (r=-0.66, P=7.7E-06, n=36);
6) 증가된 불활성 α1PI는 증가된 림프구와 상관 관계가 있었고, 이러한 상관 관계는 HIV-1 질환에서 α1PI 요법에 의해 증폭되었다 (r=0.42, P=0.037, n=26);
7) 증가된 apoB100은 증가된 혈소판과 상관 관계가 있었고, 이러한 상관 관계는 HIV-1 질환에서 α1PI 요법에 의해 증폭되었다 (r=0.46, P=0.018, n=26);
8) 증가된 apoB48은 감소된 CD19% (% B 세포) 및 감소된 적혈구와 상관 관계가 있었다 (각각 r=-0.38, P=0.24, n=36 및 r=-0.33, P=0.05, n=36);
9) 증가된 apoB48은 감소된 총 α1PI와 상관 관계가 있었고, 이러한 상관 관계는 HIV-1 질환에서 α1PI 요법에 의해 증폭되었다 (r=-0.80, P=2E-07, n=26);
10) 증가된 총 α1PI는 증가된 apoB100과 상관 관계가 있었다 (r=0.66, P=9E-06, n=36);
11) 증가된 총 α1PI는 감소된 apoE와 상관 관계가 있었다 (r=-0.56, P=5E-04, n=35);
12) 증가된 총 α1PI는 감소된 % CD3+HLE+ T 림프구 (r=-0.41, P=0.014, n=35) 및 감소된 CD3+HLE+ T 림프구 (r=-0.14, P=0.014, n=35)와 상관 관계가 있었지만, 치료 후에는 그렇지 않았다;
13) 증가된 총 α1PI는 새롭게 생성된 CD4 T 세포의 마커인 증가된 sjβTREC와 상관 관계가 있었다 (r=0.42, P=0.057, n=21).
α1PI와 LDL 이외의 지질단백질 간의 관계는 이전에 보고되지 않았기 때문에 이러한 결과는 예상치 못한 일이다. 이러한 예상치 못한 결과는 apoB48을 사용하는 트리글리세리드가 림프를 통해 장에서부터 CD4+ 세포를 통해 혈액으로 수송된다는 사실과, 추가로 증가된 총 α1PI가 CD4+ 세포를 감소시키고 apoB48을 감소시킨다는 사실을 입증시켜 준다. 흥미롭게도, HIV-1 질환에서의 α1PI 요법은 α1PI가 apoB48 수준을 조절하고 α1PI 및 apoB48 수준이 α1PI가 LDL 수준에 대한 피드백 조절에 있는 것과 동일한 방식으로 피드백 조절에 있음을 입증시켜 주는, 증가된 총 α1PI와 감소된 apoB48 간의 상관 관계를 증폭시켰다 (Bristow et al., 2013). 이들 데이터는 증가된 α1PI가 감소된 apoB48을 생산함으로써, 식이 지방을 흡수할 수 있는 능력을 감소시켜 트리글리세리드 수준을 감소시킨다는 것을 입증시켜 준다. LDL 수준은 LDL (mg/dL) = 총 콜레스테롤 (mg/dL) - HDL (mg/dL) - 트리글리세리드 (mg/dL)/5와 같은 프리드발트(Friedwald) 공식을 사용하여 계산할 수 있기 때문에, 이러한 결과는 트리글리세리드를 저하시키는 것이 LDL 수준을 직접적으로 저하시킨다는 것을 보여준다. 증가된 총 α1PI는 감소된 CD3+HLE+ T-림프구 (초기 T 세포) 및 증가된 sjβTREC (초기 흉선 이주자)와 상관 관계가 있었으며, 이는 T 세포의 생성과 운명이 α1PI에 의해 조절된다는 이전의 보고서를 뒷받침해준다.
<표 2>
정상적이고 건강한 개체에서의 혈구 계수치에 대한 다중 선형 회귀 분석.
Figure 112019095116714-pct00005
a. 4명의 정상적이고 건강한 개체로부터 수득된 9개의 주간 혈액 샘플로부터 측정을 수득하였다. 독립 변수와 종속 변수에 대한 값은 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 세포 계수치는 절대 값을 나타낸다. 유동 세포계수법을 사용하여 CD3+CD4+ 림프구 게이트 (Ly)에서 HLECS +VLDLR+ 세포를 정량화하였다. 활성 및 불활성 α1PI 수준을 이전에 보고된 바와 같이 혈청에서 정량화하였다 (Bristow et al., 1998).
b. 시험력 α = 0.05를 사용하여 종속 변수 대 독립 변수의 관계를 결정하기 위해 다중 선형 회귀를 수행하였다. 종속 변수는 다중 선형 회귀에 상당히 기여한 경우에 독립 변수와 유의적으로 관련이 있는 것으로 간주되었다 (P <0.05).
실시예 8: 엘라스타제 억제제와 지질단백질 간의 피드백 조절을 입증시켜 주는 cDNA 마이크로어레이 분석.
α1PI가 세포 수준에서 조절 경로에 참여함으로써 지질단백질 수준을 조절하는지의 여부를 조사하기 위해, cDNA 마이크로어레이 분석을 2개의 독립적인 1차 배양 준비 및 DNA 마이크로어레이 실행에서 수행하였다. x at 및 s, at로 종결되는 프로브 세트는 분석에서 삭제되었고, 비감염된 1명의 개체 및 리토나비어 요법에서 2명의 HIV-1 감염된 개체로부터 수거된 단핵구 세포 (Mo/MØ)를 분석하여, 이전에 보고된 바와 같이 (Modarresi et al., 2009), 14,500개의 기능적으로 명확히 규명된 유전자 및 3,900개의 발현된 서열 태그 클러스터를 포함한 18,400개의 유전자의 차등 발현 패턴을 결정하였다. 데이터는 2개의 독립적인 1차 배양 준비 및 DNA 마이크로어레이 실행에서 수행된 대규모 마이크로어레이를 사용하여 수득되었고, HIV-1 감염된 세포 대 비감염된 세포의 유전자 발현 비율을 계산하였다 (Modarresi et al., 2009). 2배 초과로 변화된 지질단백질 및 프로테이나제 억제제 기능을 수반한 모든 유전자가 도시된다. x at 및 s, at로 종결되는 프로브 세트는 분석에서 삭제되었다. 그 결과가 도 5에 도시되어 있다.
유전자 발현의 분석는 HIV-1 비감염된 대조군으로부터의 세포와 비교해서 HIV-1 감염된 개체로부터의 세포에서 7개의 프로테이나제 억제제가 상향 조절되었다는 것을 보여 주었다 (도 5). 이들 중에서, 오브알부민 (>254배), 엘라핀 (>66배), 피부 유래 항-류코프로테이나제 (>60배), 트롬보스폰딘 (>50배), 및 α1PI (>17배)을 포함한 5개가 인간 백혈구 엘라스타제 (HLE)와 결합하는 것으로 공지되어 있으며; 1개 (헤파린 보조 인자, >46배)는 α1PI와 결합하고; 1개 (조직 인자 경로 억제제, >99배)는 LDL과 결합한다. 4개의 다른 프로테이나제 억제제의 수준은 >12배 감소되었지만, 이들 억제제 중 어느 것도 HLE, α1PI 또는 지질단백질과 결합하는 것으로 공지되어 있지 않다. LDL 수용체 (LDLR) 및 LDL 수용체 관련 단백질 5 (LRP5)는 각각 4배 및 8배 증가하였다 (데이터는 제시되지 않음).
대조적으로, 12개의 LDL-결합 지질단백질 중에서, 스캐빈저 수용체 부류 B (>28배), 지방산 결합 단백질 4 (>19배), 시냅토타그민 III (>18배), 지방산 결합 단백질 7 (>17배), 지질단백질 Lp(a)-유사 2 (>14배), 아포지질단백질 L5 (>5배), 아포지질단백질 E (>4배), 아포지질단백질 B mRNA 편집 단백질 (>3배), 및 아포지질단백질 C-IV (>2배) 및 아포지질단백질 L6 (>2배)을 포함한 10개의 발현이 >2배 감소되었다. 2개의 지질단백질, 즉 아포지질단백질 D (>6배) 및 LDL 수용체 관련 단백질 5 (>8배)는 상향 조절되었다.
α1PI 처리가 대상체에서 감소된 LDL을 생산하였기 때문에, 이러한 마이크로어레이 분석은 α1PI가 LDL 및 많은 다른 지질단백질과 음성 피드백 조절에 있다는 것을 입증시켜 준다.
실시예 9: 본 발명에 사용하기 위한 β-락탐 화합물
본 발명에서 사용하기 위해 스크리닝된 화합물이 하기에 제시된다. 하기에 제시된 바와 같은 2가지 상이한 검정이 사용되었다. 본 발명에 사용되기 위해, 상기 화합물은 두 검정에서 D-암피실린과 적어도 동일한 활성을 가져야만 한다.
검정 1: 상기 실시예 2에 기재되고 이전에 공개된 바와 같은 (Bristow et al., 1998) HLE의 억제 (마이크로플레이트 검정, 플레이트 당 10회 시험). 이러한 검정은 가용성 인간 백혈구 엘라스타제 (HLE-G)에 대한 상기 화합물의 유효한 결합을 입증시켜 준다. 효력의 비교로서 D-암피실린이 포함되었다. 각각의 화합물을 일정한 농도의 0.5 μM 엘라스타제와 비교하여 0.016 μM 내지 2 μM의 최종 농도를 갖는 2배 연속 희석액에서 시험하였다.
검정 2: 이전에 공개된 바와 같이 (Bristow et al., 2008) 화합물-코팅된 유리 (마이크로웰 현미경 슬라이드, 슬라이드 당 5회 시험)에 대한 세포의 부착. 부착은 세포 이동에 있어서의 제1 단계이며, 칼슘, 마그네슘, 시그널링 또는 에너지를 필요로 하지 않는다. 이러한 검정은 세포 표면 인간 백혈구 엘라스타제 (HLE-CS)에 대한 상기 화합물의 유효한 결합을 입증시켜 준다. 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 10-웰 현미경 슬라이드의 각각의 웰에, 웰 당 0.1 nM 내지 100 nM의 최종 농도를 수반한 10배 연속 희석액으로 10 μl의 화합물을 부가하였다. 각각의 웰에 1x104개의 세포를 부가하였다. 세포를 세척 및 고정시킨 후, 부착성 세포의 수를 현미경으로 계수하였다.
시험된 화합물 (n=11):
I. 세팔로스포린 (세펨)
1) 세팔렉신 (CAS# 15686-71-2) (케이맨 케미칼 9002009)
2) 세푸록심 (CAS# 55268-75-2) [아메리칸 커스텀 케미칼즈 코포레이션(American Custom Chemicals Corp.) API0001919]
II. 페니실린 (페남)
1) 암피실린 (참조 활성) (CAS# 63-53-4) (아메리칸 커스텀 케미칼즈 코포레이션 API0001474)
2) 페니실린 V (CAS# 87-08-1) (아메리칸 커스텀 케미칼즈 코포레이션 API0000755)
3) 디클록사실린 (CAS# 3116-76-5) (아메리칸 커스텀 케미칼즈 코포레이션 API0004676)
4) 아목시실린 (CAS# 34642-77-8) (아메리칸 커스텀 케미칼즈 코포레이션 API0015005)
5) L-암피실린 (CAS # 19379-33-0)
III. 모노박탐
1) 아즈트레오남(Aztreonam) (CAS# 78110-38-0) (아메리칸 커스텀 케미칼즈 코포레이션 API0001576)
2) 에제티미브 (CAS# 163222-33-1) (아메리칸 커스텀 케미칼즈 코포레이션 API0002672)
IV. 페넴
1) 파로페넴 (CAS# 122547-49-3) (아메리칸 커스텀 케미칼즈 코포레이션 API0002676)
V. 카르바페넴
1) 도리페넴 (CAS# 148016-81-3) (아메리칸 커스텀 케미칼즈 코포레이션 API0000543)
실시예 10: 생체 내 전임상 연구: T 세포 수에 대한 L-암피실린의 효과
T 림프구를 상승시킬 수 있는 L-암피실린의 능력을 조사하기 위해, C57BL6 마우스 (부문 당 6마리 마우스, 2개 부문)에게 비히클 대조군 (군 1) 또는 L-암피실린 (5 mg/kg, 군 2)을 투여하였다. 화합물은 1주에 5일 경구 섭식에 의해 전달되었다. 이소형 대조군을 수반한 마우스 T 림프구 서브세트 항체 칵테일 [비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)]을 사용하여 유동 세포계수법에 의해 CD3e, CD4, 및 CD8a T 세포의 검출을 위해 혈액을 매주 수집하였다. 본 연구는 스토니 브룩(Stony Brook) 대학교 (미국 뉴욕주 스토니 브룩)의 실험실 동물 연구부에서 수행되었다. 알파-1 바이오로직스(Alpha-1 Biologics)에 의해 염색 및 통계적 분석이 수행되었고, 샘플은 BD LSR포르테사(LSRFortessa) 기기를 사용하여 스토니 브룩 병원의 유동 세포계수법 실험실에 의해 획득되었다.
L-암피실린으로 처리한 지 2주 후에, 비히클 대조군과 비교 시, CD3+ T 세포 (P<0.05) (도 6A) 및 CD4+CD8+ 이중 양성 미성숙 전구 T 세포 (P<0.04) (도 6B)에서 통계적으로 유의미한 증가가 있었다. 스튜던츠 T-시험을 사용하여 데이터를 정상적으로 분배하고 비교하였다. 비히클에 대한 CD3+ T 세포에 있어서의 평균 % 변화는 -11%였고, CD4+CD8+ 전구 세포에 대한 것은 -13%였다. L-암피실린 (5 mg/kg)에 대한 CD3+ T 세포에 있어서의 평균 % 변화는 +16%였고, CD4+CD8+ 전구 세포에 대한 것은 +38%였다. 기준선으로부터의 평균 퍼센트 변화는 도 6A 및 6B에 나타내고, 여기서 % 변화 = 100 x [(처리 평균-기준선)/기준선]이다.
실시예 11: L-암피실린은 항-PD-1과 조합하여 고형 종양을 치료한다.
악성 세포는 파괴를 위해 T 세포에 의해 검출되거나 또는 표적화되지 않기 때문에 종양이 체내에 지속된다. 종양 세포를 효과적으로 표적화할 수 있는 T 세포의 능력은, T 세포 활성을 완화시키고 억제하는 수용체와 리간드의 쌍인 면역 체크포인트로서 작용하기 위해 제공되는 분자의 종양 세포에 의한 과다발현으로 인해 종양 환경에서 빈번하게 손상된다. 이러한 이유로 인해, 면역 체크포인트 억제제를 개발하는 것이 최근에 암 치료제에서 중요한 목표가 되었다. 예를 들어, 프로그램된 세포 사멸 단백질-1 (PD-1)은 종양 세포에 의해 과다발현되는 리간드 (PDL-1)와 결합하여 T 세포 기능을 억제하는 T 세포 상의 수용체이다. PD-1 또는 PD-L1과 결합하는 모노클로날 항체는 흑색종, 신장 세포 암종, 비-소세포 폐암, 방광암, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 및 뇌암을 포함한 다수의 암에서 종양 크기를 감소시키고 예후를 개선시키는 현저하게 유효한 면역 체크포인트 억제제인 것으로 밝혀졌다. 면역 체크포인트 억제제의 치료 용도 및 발생된 T 세포 활성 상의 증가는 T 세포 항-종양 활성을 증강시키고, 종양-침윤성 CD4+ 헬퍼 T 세포를 증가시키며 예후를 개선시키는 데 실질적인 유효성을 보여주었다.
L-암피실린은 T 세포의 수준을 상승시키기 때문에, L-암피실린은 고형 종양을 치료하는 데 유효할 것이라는 가설을 세웠다. 이러한 가설을 시험하기 위해, BALB/c 마우스 (부문 당 6마리 마우스, 4개 부문)에게 동계 종양 세포주 RENCA (ATCC CRL-2947)를 좌측 신장 캡슐에 동소적으로 이식하였다. 종양 성장 1주 후, 마우스를 항-PD1 또는 그의 이소형 대조군 [각각 바이오엑스셀 (BioXCell; 미국 뉴햄프셔주 웨스트 레바논), BE0146 및 BE0089]으로 3주 동안 4일마다 최적 이하 용량 (7 mg/kg)으로 IP 처리하였고, L-암피실린 5 mg/kg으로 매일 경구 섭식에 의해 처리하였다. 이전에 결정된 생체 내 데이터로부터 용량을 결정하였다 (Levingston and Young, 2017). 연구 부문은 하기 표 3에 제시되어 있다.
<표 3>
Figure 112019095116714-pct00006
치료 용량을 결정하기 위해 체중을 주당 3회 수득하였다. 림프구 프로파일 [CD3, CD4, CD8, 및 미성숙 T 세포 (CD4+CD8+ 이중 양성, DP)]의 측정을 위해 매주 혈액을 수집하였다. 연구 종료일에 마우스를 안락사시키고 샘플을 하기와 같이 수집하였다:
a) 종양 세포의 전이를 검출하기 위한 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직학적 염색을 위한 폐;
b) 좌측 및 우측 신장 중량;
c) 종양의 물리적 외관 및 크기.
비처리된 마우스, 항-PD-1로 처리된 마우스, 및 L-암피실린으로 처리된 마우스에는 검출 가능한 종양이 있었다 (도 7). 반대로, 항-PD-1과 L-암피실린의 조합물로 처리된 6마리 마우스 중 어느 것에서도 검출 가능한 종양이 없었다. 치료로 인한 부작용은 검출되지 않았다.
절제된 신장을 육안으로 검사하고 촬영하였다. 대표적인 종양이 도 7A에 도시되어 있다. 각각의 군 내의 평균 종양 중량은 각각의 마우스에서 좌측 신장 중량과 우측 신장 중량 간의 차이로서 결정되었다 (도 7B).
실시예 12: 물리적 특성
D-암피실린 (CAS 번호 69-53-4) 및 L-암피실린 (CAS 번호 19379-33-0)은 부분입체 이성질체이다. 생물학적 시스템에서, 부분입체 이성질체인 약물은 상이한 화학 반응을 나타내며, 예를 들어 D-암피실린은 에탄올에 가용성인 반면 L-암피실린은 그렇지 않다.
D-암피실린 및 L-암피실린의 절대 배위는 각각 도 8(A) 및 8(B)에 도시되어 있다.
참고문헌 목록
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본 발명은 본원에 기재된 구체적 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 본원에 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속한다.
추가로 모든 값은 근사치이며 설명을 위해 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
특허, 특허 출원, 간행물, 생성물 설명, 및 프로토콜은 본 출원 전반에 걸쳐 인용되며, 그의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Claims (32)

  1. 대상체에서 고지혈증, COPD 또는 고형 종양을 치료하는 방법에 사용되는, β-락탐을 포함하는 제약 조성물이며,
    여기서 β-락탐은 상기 대상체의 혈청에서 CD4+ T-림프구의 수를 증가시키는데 유효한 양의 L-암피실린 또는 L-암피실린의 제약상 허용되는 염이고, 상기 방법은 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, L-암피실린이 L-암피실린의 나트륨 염인, 제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 염이 L-암피실린의 트로메타민 염인, 제약 조성물.
  4. 제1항에 있어서, L-암피실린의 트로메타민 염 및 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하고, 여기서 상기 L-암피실린은 살균 활성을 실질적으로 갖지 않는, 제약 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 대상체가 인간 또는 비-인간 동물인, 제약 조성물.
  6. 제3항에 있어서, L-암피실린의 트로메타민 염이 살균 활성을 실질적으로 갖지 않는, 제약 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 고형 종양이 흑색종, 신장 세포 암종, 비-소세포 폐암, 방광암, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 또는 뇌암인, 제약 조성물.
  8. 제3항에 있어서, 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가로 포함하는, 제약 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 고형 종양이 흑색종, 신장 세포 암종, 비-소세포 폐암, 방광암, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된, 제약 조성물.
  10. 고지혈증, COPD 또는 고형 종양을 치료하는데 사용하기 위한, L-암피실린의 트로메타민 염을 포함하는 제약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는, 제약 조성물.
  12. 제10항에 있어서, L-암피실린이 살균 활성을 실질적으로 갖지 않는, 제약 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 담체가 물, 식염수 수용액, 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제약 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 담체가 결합제, 유동 촉진제, 캡슐화제, 향미제, 및 착색제로 이루어진 군으로부터 선택된 고체 투여 형태 담체인, 제약 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 담체가 땅콩 오일, 참깨 오일, 대두 오일 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 오일인, 제약 조성물.
  16. 제10항에 있어서, L-암피실린의 트로메타민 염이 트로메타민을 사용하여 제조된 것인, 제약 조성물.
  17. L-암피실린의 트로메타민 염을 포함하는 고지혈증, COPD 또는 고형 종양을 치료하기 위한 경구 투여용 제약 조성물.
  18. 제17항에 있어서, L-암피실린의 트로메타민 염이 살균 활성을 실질적으로 갖지 않는, 경구 투여용 제약 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 상기 고형 종양은 흑색종, 신장 세포 암종, 비-소세포 폐암, 방광암, 자궁경부암, 위암, 간암, 췌장암, 또는 뇌암인, 경구 투여용 제약 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 항-PD-1을 추가로 포함하는 고형 종양을 치료하기 위한, 제약 조성물.
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