KR102481135B1 - 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 또는 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida) 감염성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물, 사료 조성물 및 상기 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는 PRRSV 또는 파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 노박덩굴 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 PRRSV에 대한 우수한 항바이러스 활성을 나타내며, 기회 상재균인 파스튜렐라 멀토시다에 의해 돼지 대식세포주에서 유발되는 염증성 인자들의 분비 및 발현을 억제하는 효과를 나타내고, 나아가 PRRSV 유도 돼지 폐렴 동물 모델 및 파스튜렐라 멀토시다 유도 마우스 모델에서 호흡기 질환을 억제하는 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 PRRSV 또는 파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

노박덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating infectious disease containing extract of Celastrus orbiculatus Thunb}

본 발명은 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 또는 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida) 감염성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물, 사료 조성물 및 상기 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 또는 파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)는 이름에도 알 수 있듯이 임신 모돈에는 유산, 사산 및 미라화 등의 번식장애를 유발하고, 어린 자돈에게는 특징적으로 간질성 폐렴과 성장저해를 일으키는 것으로 알려져 있다 (Snijder and Spaan, 2007. Fields Virology). PRRSV는 1980 년대 후반에 처음 미국에서 발생이 보고되었으며 1990 년대 초반에 유럽에서 발생이 보고 되었다 (Keffaver, 1989. Am. Assoc . Swine Pract. Newsletter; Wensvoort et al., 1992. J. Vet. Diagn . Invest.). 이후, 유럽, 미국, 아시아 등 전 세계적으로 발생되어 양돈산업에 막대한 경제적인 피해를 주고있다. 국내는 물론 전 세계적으로 PRRSV가 다발하여, 모돈에서는 어느 정도 항체를 보유하고 있어, 신생자돈에서의 간질성 폐렴은 잘 발생하지 않는다. 문제는 이유 후에 모체이행항체가 떨어지면, 이 때 PRRSV에 감염되고, PCV2 (Porcine circovirus type 2)나 이차성의 세균성 폐렴 균주에 복합감염 되어, PRDC (Porcine respiratory disease complex)가 발생하게 된다. 현재 PRRSV 제어를 위한 바이러스 타겟이 밝혀져 있지 않으며, 주로 광범위한 항바이러스제로 사용되는 인터페론 및 면역증강을 이용한 항바이러스 작용연구가 대부분이다. 따라서, PRRSV에 대한 효과적인 백신이 전 세계적으로 개발되어 있지 않아, PRRSV에 의한 피해뿐만 아니라 이로 인해 2차적으로 PRDC도 다발하고 있는 실정이다.

한편, 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida)는 돼지에서 호흡기 내의 상재균인 동시에 호흡기 질환을 유발하는 병원체이다. 돼지 호흡기 질병은 불현성 감염 또는 만성으로 내과하는 경우가 많으므로 양돈농가에서 병의 심각성을 제대로 알기란 쉽지 않다. 또한, 현대의 양돈산업의 대규모화로 인해 돼지 호흡기 질병의 발생 가능성은 점점 증가되고 있어, 이의 방제는 더욱 어려운 실정이다. 현재 가축에서의 항생제 및 항균제 사용은 축산물의 안전성 문제로 인해 규제가 날로 강화되고 있는데, 특히 배합사료에 첨가되는 항생제 사용규제가 향후 더욱 강화될 것으로 보이며, 잔류검사 강화로 축산 농가들도 휴약 기간이 긴 항생제 사용을 기피하고 있다. 또한 항생제의 남용으로 항생제 내성 병원균들이 나타남으로써 대체 항균 물질의 개발이 필요한 상황이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 돼지 호흡기 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 노박덩굴 추출물이 PRRSV 또는 파스튜렐라 멀토시다의 감염성 질환에 대하여 우수한 예방 및 치료 효과를 가지는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida) 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 파스튤라 멀토시다 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (Procine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.

본 발명에서 용어, "노박덩굴 (Celastrus orbiculatus Thunb)"은 노박덩굴과 (Celastraceae)의 덩굴식물종으로 노박따위나무, 노방패너울, 노랑꽃나무라고도 하며, 노박덩굴 줄기는 약용으로 남사등이라고도 한다. 노박덩굴은 생리통, 머리가 아플 때, 통증완화 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 노박덩굴 추출물이 바이러스 또는 세균의 감염성 질환에 대해 예방 또는 치료 효과를 가진다는 사실은 전혀 보고된바 없었다.

본 발명에서 노박덩굴은 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 직접 채취한 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 노박덩굴의 추출물은 초음파 추출법, 마이크로웨이브 추출법, 교반추출법, 초임계 추출법, 여과법 및 환류추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용하여 추출된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 노박덩굴 추출물은 물, C₁ ~ C₄의 또는 이들의 혼합용매로부터 추출된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 세척 및 건조로 이물질이 제거된 노박덩굴을 분쇄하여 얻은 노박덩굴 건조물을 물, C₁ ~ C₄의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출할 수 있다. 또한, 노박덩굴 건조물을 세절한 후 추출용기에 넣고 C₁ ~ C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매를 넣고 일정기간 상온에서 방치한 다음, 여과하여 추출물을 얻을 수 있다. 이때, 추출은 상온에서 1 주 동안 방치하거나, 상온에서 교반 추출하는 것일 수 있고, 이후에 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다. 또한, 상기 노박덩굴 건조물을 80 ~ 90 의 열수와 함께 환류 장치에 연결하여 6 시간 동안 방치한 다음, 이를 여과하여 열수 추출물을 얻을 수 있다. 이후에 농축 또는 동결건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다. 이때, 추출용매는 노박덩굴 건조중량의 2 ~ 20 배로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적 일 실시예에서는 노박덩굴을 분말화 한 후, 분말화 된 노박덩굴의 중량대비 20 배의 에탄올을 가하여 노박덩굴 에탄올 추출물을 제조하였다 (실시예 1).

본 발명에서 용어, "돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염성 질환"은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)의 감염에 의해서 매개될 수 있는 모든 질환을 의미한다. PRRSV는 외피를 가진 작은 바이러스이며, 약 15 Kb 크기의 단일가닥의 양성-극성 RNA를 게놈으로 가지는 것으로 알려져 있다. 분류학적인 측면에서 PRRSV는 Arteriviridas 과의 Arterivirus 속에 속한다. PRRSV의 축산업 측면에서의 가장 큰 특징은 바이러스의 지속 감염과 다른 자돈으로의 전파가 쉽게 일어난다는 것이다. PRRSV는 한 번 노출 시 돼지에서 만성의 지속적인 감염을 일으킨다. 또한, 바이러스는 수개월 동안 임상증상이 명확히 나타나지 않고 돼지의 감수성 세포 내에서 복제된다. 이것은 PRRSV 전파의 가장 중요한 특징으로, 한 번 감염된 모돈은 감염 후 99 일까지도 바이러스를 전파시킬 수 있다는 보고가 있다.

본 발명에서, 상기 PRRSV 감염성 질환은 돼지생식기호흡기증후군, 돼지 파스튜렐라 폐렴, 돼지 마이코플라즈마 폐렴, 돼지 위축성 비염, 돼지 흉막 폐렴, 글래써병, 이유 후 전신성 소모성 증후군 또는 돼지호흡기복합증후군일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, PRRSV 감염에 의해 유발될 수 있는 질환은 모두 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.

특히, 돼지호흡기복합증후군 (Porcine respiratory disease complex, PRDC)은 국내 양돈산업에서 가장 악질적인 고질병으로서 30 ~ 70 %의 발병률과 많게는 50 %의 육성돈 폐사율로 막대한 경제적 피해를 유발하고 있다. 하지만 PRDC는 단독으로 발생되는 것이 아니라 1) 사양관리 실패(밀사, 돈사 내 심한 온도차, 환기불량, 위생불량 등)에 의해 돼지의 호흡기 면역능이 떨어지고, 2) PRRS 바이러스와 PCV2뿐만 아니라, 간혹 돼지 인플루엔자 바이러스와 같은 호흡기 바이러스가 감염하여 그 자체로도 폐렴을 유발하며, 3) 여기에 기회 상재균인 P. multocida, M. hyopneumoniae, A. pleuropneumoniae, H. parasuis가 감염되면 PRDC가 발생하게 된다. 이와 같이 PRDC는 다양한 원인에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 따라서 PRDC를 제어하기 위해서는 1) 사양관리, 2) PRRSV에 대한 백신 혹은 치료제 투여, 3) 다양한 세균성 원인체들에 대한 백신 및 치료제 투여가 필요할 수 있다. 백신 및 치료제 측면에서 보면, 현재 PCV2에 대한 백신이 개발되어, 국내에서 이유자돈전신성소모성증후군이 현저히 감소되었다. 그러나 아직까지 PRRSV에 대한 백신 혹은 치료제가 개발되었다는 사실은 전혀 보고된바 없다.

본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 PRRSV 감염성 질환의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 상기 PRRSV 감염성 질환은 PRRSV 외에 추가적으로 PCV-2 (Porcine circo virus type 2), PPV (Porcine parvovirus), PEV (Porcine entero virus) 및 SIV (Swine influenza virus)와 같은 바이러스, 또는 맨하이미아 해모리티카 (Mannheimia haemolytica), 해모필러스 솜너스 (Haemopilus somnus), 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida), 마이코플라즈마 히오뉴모니아 (Mycoplasma hyopneumoniae) 및 흉막폐렴균 (Actinobacillus pleuropneumonia)에 감염된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 노박덩굴 추출물이 PRRSV 감염에 의해 유도되는 톨유사수용체 (TLR2, TLR3, TLR7)와 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-8 및 IL-1β의 발현을 억제하는 것을 확인하였다 (도 1 내지 도 3). 또한, 본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는, 노박덩굴 추출물이 PRRSV에 대한 높은 항바이러스 활성을 가진다는 것을 생체 외 및 생체 내에서 구체적인 실험을 통해 확인하였다 (표 2 및 도 5). 따라서 상기 결과를 통해, 본 발명자들은 노박덩굴 추출물이 PRRSV 감염성 질환의 예방 및 치료에 우수한 효과가 있음을 직접적으로 확인하였다.

본 발명의 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 ~ 50 중량%로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 투여시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미한다. 본 발명의 노박덩굴 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 노박덩굴 추출물을 포함하는 약학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 노박덩굴 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 개체에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 상기 제형은 예를 들어, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은, 투여되는 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들어 0.1 내지 100 mg/㎏의 양으로 1 일 1 회 내지 수 회 투여될 수 있다. 또한 노박덩굴 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있으므로, 상기 기재된 범위에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 않고, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 상기 비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이들에 제한되지 아니한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물이다.

노박덩굴 추출물, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염성 질환 등에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때 상기 사료용 조성물은 PRRSV 감염성 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "사료"는 개체의 생명을 유지하고 상기 개체를 사육하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미한다. 특히, 본 발명의 사료 조성물은 PRRSV 감염성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하므로, 추가적으로 사료를 섭취하는 개체가 필요로 하는 에너지, 단백질, 지질, 비타민, 광물질 등의 영양소를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 예컨대, 곡물류, 근과류, 식품가공부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등의 식물성 사료 또는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질, 동물성 플랑크톤류, 어분 등의 동물성 사료가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 사료 조성물은 사료 첨가제의 형태로 이용될 수도 있다. 상기의 사료 첨가제용 노박덩굴 추출물은 20 내지 90 % 농축 액이거나 분말 또는 과립형태일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 사료 조성물은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨 (catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물 (rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 사료 조성물은 동물에게 단독으로, 또는 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.

또한, 상기 사료 조성물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 투여되는 것일 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.

상기 사료 조성물을 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 추출물의 투여 형태는 이들을 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 또한 이들은 질환의 개선 및 예방상 유용한 다른 물질을 함유할 수 있다.

상기의 사료 조성물은 침지, 분무 또는 혼합하여 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 노박덩굴 추출물을 포함하는 사료의 배합 방법은, 노박덩굴 추출물을 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1 ㎏당 약 1 g 내지 100 g의 양으로 혼입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어질 수 있으며, 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성할 수 있다. 이때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거칠 수 있다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는, 상기 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

노박덩굴 추출물, 투여, 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 감염성 질환은 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 양태는, 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida) 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이다.

노박덩굴 추출물 및 약학적 조성물은 앞서 설명한 바와 같다.

돼지들이 돼지생식기호흡기증후군 바이러스, 돼지써코바이러스, 돼지인플루엔자바이러스, 마이코플라즈마와 같은 1 차 병원체들에 감염되어 면역기능이 저하되면, 이후 2 차 기회 상재균이 복합감염되어 결국 PRDC의 형태로 피해를 입게 되는 것이 국내 양돈장의 전형적인 발병양상이다. 특히, 파스튜렐라 멀토시다는 그람음성 비운동성 간균으로, 동물에서 다양한 질환을 유발하여 축산산업에 있어 심각한 경제적 피해를 초래하고 있다. 따라서 파스튜렐라 멀토시다에 의한 동물 질환 발생을 효과적으로 막을 수 있고 감염 치료에도 활용될 수 있는 방안의 개발이 필요하다.

파스튜렐라 멀토시다에 의한 감염 억제 및 치료를 위해 항생제가 널리 사용되고 있는데, 최근 항생제 내성균의 증가로 그 효과가 계속 떨어지고 있으며 동물에 항생제 사용에 대한 규제 강화로 항생제 외의 다른 효과적 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명에서, 용어 "파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환"은 파스튜렐라 멀토시다 감염에 의해 발생할 수 있는 모든 질환을 의미한다. 상기 질환은 예컨대, 돼지 파스튜렐라 폐렴, 돼지 마이코플라즈마 폐렴, 돼지생식기호흡기증후군, 이유 후 전신성 소모성증후군 또는 돼지호흡기복합증후군일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환은, 파스튜렐라 멀토시다 이외에, 추가적으로 PRRSV (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), PCV-2 (Porcine circo virus type 2), PPV (Porcine parvovirus), PEV (Porcine entero virus) 및 SIV (Swine influenza virus)와 같은 바이러스, 또는 맨하이미아 해모리티카 (Mannheimia haemolytica), 해모필러스 솜너스 (Haemopilus somnus), 마이코플라즈마 히오뉴모니아 (Mycoplasma hyopneumoniae) 및 흉막폐렴균 (Actinobacillus pleuropneumonia)과 같은 세균 감염에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 노박덩굴 추출물이 파스튜렐라 멀토시다에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-8의 분비 발현을 억제하는 것을 확인하였고 (도 6 및 도 7), 나아가 구체적 신호전달 기전과 관련하여 TLR1, TLR2, TLR6에 대한 우수한 발현 억제 효능이 있음을 확인하였다 (도 8). 또한, 본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는, 노박덩굴 추출물이 파스튜렐라 멀토시다 감염 마우스 동물 모델에서 60 % 수준의 생존율을 나타내어, 파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환에 현저한 효과를 보이는 것을 확인하였다 (도 9). 따라서 본 발명의 노박덩굴 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환의 예방 또는 치료 용도로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는, 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물이다.

노박덩굴 추출물, 파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환 및 사료 조성물은 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 양태는, 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 파스튤라 멀토시다 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법이다.

노박덩굴 추출물, 투여, 파스튤라 멀토시다 감염성 질환의 예방 및 치료는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 노박덩굴 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스에 대한 우수한 항바이러스 활성을 나타내며, 기회 상재균인 파스튜렐라 멀토시다에 의해 돼지 대식세포주에서 유발되는 염증성 인자들의 분비 및 발현을 억제하는 효과를 나타내고, 나아가 PRRSV 유도 돼지 폐렴 동물 모델 및 파스튜렐라 멀토시다 유도 마우스 모델에서 호흡기 질환을 억제하는 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 PRRSV 또는 파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 원숭이 신장세포주인 MARC-145 세포에서 PRRSV 감염에 의해 유도되는 톨유사수용체 발현에 대한 노박덩굴 추출물의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 원숭이 신장세포주인 MARC-145 세포에서 PRRSV 감염에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 발현에 대한 노박덩굴 추출물의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 원숭이 신장세포주인 MARC-145 세포에서 PRRSV의 감염에 의해 유도되는 세포병변에 대한 노박덩굴 추출물의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 PRRSV 감염 전 실험에 사용된 포유자돈에 대해 PRRSV-감염 여부를 확인한 것이다.
도 5는 PRRSV의 감염에 따른 폐렴유발에 대한 노박덩굴 추출물의 방어 및 유발억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 돼지 대식세포에서 파스튜렐라 멀토시다의 감염에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 분비에 대한 노박덩굴 추출물의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 돼지 대식세포에서 파스튜렐라 멀토시다의 감염에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 발현에 대한 노박덩굴 추출물의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 돼지 대식세포에서 파스튜렐라 멀토시다의 감염에 의해 유도되는 톨유사수용체 발현에 대한 노박덩굴 추출물의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 파스튜렐라 멀토시다 감염 마우스 모델에서 노박덩굴 추출물이 마우스의 체중 (상단) 및 생존율 (하단)에 미치는 영향을 확인한 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 노박덩굴 추출물의 제조

본 발명에서 사용된 노박덩굴 (Celastrus orbiculatus Thunb)은 일반적으로 자연에서 쉽게 채집할 수 있는 것으로, 추출물을 효율적으로 얻기 위하여 파우더 형태로 분쇄하여 사용하였다.

노박덩굴 60 kg을 분쇄하고, 상기 분쇄물에 95 %의 에탄올 (EtOH) 300 ℓ를 가하여 실온에서 14 일간 방치하였다. 그 다음, 이를 여과지로 여과한 후 농축하여 노박덩굴의 에탄올 추출물 (2.7 kg)을 수득하였다.

실험예 1: MARC-145 세포에서 노박덩굴 추출물의 PRRSV ( Procine reproductive and respiratory syndrome virus) 유발 염증인자 저해활성 측정

PRRSV (Procine reproductive and respiratory syndrome virus)에 대한 노박덩굴 추출물의 염증인자 저해 효과를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

공시바이러스는 PRRSV의 표준주로서 LMY (NCBI accession number DQ473474)를 사용하였고, 원숭이 신장세포주인 MARC-145 세포는 농림축산검역본부에서 분양 받아 사용하였다. 또한, 시험시료는 상기 실시예 1에서 제조한 노박덩굴 에탄올 추출물을 DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹여 농도 별로 준비하였다.

먼저, 완전배지 (α-MEM, 0.1 % 항생제, 10 % FBS)를 첨가한 96-웰 마이크로플레이트에 MARC-145 세포를 2 × 10⁵ 개의 세포/웰이 되도록 접종하고, 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. MARC-145 세포가 단층 (monolayer)이 되면 항생제만 포함된 α-MEM 배지로 3 회 세척하였다. 그 다음, 시험시료인 노박덩굴 에탄올 추출물을 바이러스 접종 1 시간 전에 미리 처리하였다. MARC-145 세포에 PRRSV를 100 ㎕ (100 TCID50) 씩 각각 접종하여, 37 ℃에서 24 시간 동안 감염 시켰다. 그 다음, TRIzol 시약 (Gibco)을 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 분리하고, 분리된 전체 RNA의 흡광도를 측정하여 정량한 후, cDNA 합성 키트 (1st strand cDNA synthesis kit, Takara bio)를 이용하여 1 ㎍의 RNA로 cDNA를 합성하였다. 각 튜브 당 2 ㎕의 cDNA, 각각 0.5 ㎕의 센스 및 안티센스 프라이머 용액 (0.4 μM), 12.5 ㎕의 SYBR Premix Ex Taq (Takarabio) 및 9.5 ㎕의 dH₂O를 함께 혼합하여 총 25 ㎕가 되도록 하였다. TNF-α, IL-6, IL-8 및 TLR1-9의 mRNA의 발현 수준은 Thermal Cycler Dice Real Time System (Analytik Jena, Germany) 소프트웨어를 이용하여 real-time PCR 결과를 분석하여 확인하였다. 본 발명에서 사용된 모든 프라이머 서열 정보를 다음 표 1에 나타내었다.

표적 cDNA	Forward sequence	Reverse sequence
Porcine TNF-alpha	GCACTGACCACCACCAAG (서열번호 1)	CTGGCAGCCACATTCCAG (서열번호 2)
Porcine IL-6	CAACGATGATGCACTTGCAGA (서열번호 3)	CTCCAGGTAGCTATGGTACTCCAGA (서열번호 4)
Porcine IL-8	GGCCAGCATTCACAAGTCTTC (서열번호 5)	AAGGTAGGATGGGGGCTGAA (서열번호 6)
Porcine TLR1	TTTCCTACAGACGGCCAGCAG (서열번호 7)	ATGACGCCTCGGTGATCCTG (서열번호 8)
Porcine TLR2	CACCAGGACCTACCTGGAG (서열번호 9)	GCATCGGACCAAGACTGGC (서열번호 10)
Porcine TLR6	CTCAAAGCTCTCATGGCAC (서열번호 11)	CATCATCCTCTTCAGCGAC (서열번호 12)
Porcine beta actin	GGCATCCACGAAACTACCTT (서열번호 13)	TGATCTCCTTCTGCATCCTG (서열번호 14)
Monkey TNF-alpha	GGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTT (서열번호 15)	CTTGTCACTTGGGGTTCGAG (서열번호 16)
Monkey IL-6	CTCAGGGATGCAATGCCACT (서열번호 17)	TTGCAGAAGAGAGCCAACCAA (서열번호 18)
Monkey IL-8	GGACCACACTGCGTCAATAC (서열번호 19)	TCTCCACAACCCTAGACACC (서열번호 20)
Monkey IL-1 beta	GTACCTGTCCTGCGTGTTGA (서열번호 21)	TTGGGGAATTGGGCAGACTC (서열번호 22)
Monkey TLR1	TGGACAGCCAAACGGAACA (서열번호 23)	AAAGGGCCTGATACCCCCAT (서열번호 24)
Monkey TLR2	CCTTCACTCAGGAGCAGCAA (서열번호 25)	TCAGCAGGAACAGAGCACAG (서열번호 26)
Monkey TLR3	GCCTATTTGCCACACACTTCC (서열번호 27)	GTGGAGGATGCACACAGCAT (서열번호 28)
Monkey TLR4	TCACCCTTTAGCCCAGAACT (서열번호 29)	CAGACGTCATCCTGGCATCA (서열번호 30)
Monkey TLR5	GACCCTCTGCCCCTAGAATAAG (서열번호 31)	GCCTCTCAGTGGTGTTGAGG (서열번호 32)
Monkey TLR6	CAGTCCACCGGAAGTCTCTA (서열번호 33)	GGAGGACTCATACCCACATTCT (서열번호 34)
Monkey TLR7	ATGATGACAGCAAGTCACCTCT (서열번호 35)	GTCTTCCAGTTTGGCCACCA (서열번호 36)
Monkey TLR8	CCATTTTCTCTTCTCGGCCAC (서열번호 37)	GGAAAAGGCAGGTCAGCATTG (서열번호 38)
Monkey TLR9	ATGTTTGCCCAGCTCTCACA (서열번호 39)	GTGAACGAGTGCTCGTGGTA (서열번호 40)
Monkey beta actin	ATCGTGATGGACTCCGGTGA (서열번호 41)	AGACTCGTCATACTCCTGCTT (서열번호 42)

그 결과, 노박덩굴 추출물은 PRRSV 감염에 의해 유도되는 톨유사수용체 (TLR2, TLR3, TLR7)와 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 억제하는 효과를 나타냈다 (도 1 및 도 2).

실험예 2: 돼지 폐 대식세포에서 노박덩굴 추출물의 PRRSV 유발 염증인자 저해활성 측정

완전배지 (α-MEM, 0.1 % 항생제, 10 % FBS)를 첨가한 96-웰 마이크로플레이트에 돼지 폐 대식세포주인 3D4/31 세포를 2×10⁵ 개의 세포/웰이 되도록 넣고 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 돼지 폐 대식세포가 단층이 되면 PRRSV를 10⁶ TCID₅₀농도로 접종하여 1 시간 동안 반응시킨 후, 노박덩굴 에탄올 추출물을 0, 10, 20, 40 ㎍/ml 농도로 처리하고 24 시간 동안 반응을 시켰다. 세포 배양 후, ELISA 어세이 키트를 이용하여 회수한 배지에서 염증성 사이토카인의 농도변화를 측정하였다.

그 결과, 노박덩굴 추출물은 PRRSV에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 IL-6 및 IL-8의 분비를 억제하는 효과를 나타냈다 (도 3).

실험예 3: PRRSV에 대한 노박덩굴 추출물의 세포변성 저해 효과 측정

노박덩굴 추출물의 PRRSV 저해 효과를 하기와 같은 실험을 통해 확인하였다.

공시바이러스는 PRRSV의 표준주로서 LMY (NCBI accession number DQ473474)를 사용하였고, 원숭이 신장세포주인 MARC-145 세포는 농림축산검역본부에서 분양 받아 사용하였다. 또한, 시험시료는 상기 실시예 1에서 제조한 노박덩굴 에탄올 추출물을 사용하였다.

먼저, 완전배지(α-MEM, 0.1% antibiotics, 10% FBS)를 첨가한 96-웰 마이크로플레이트에 MARC-145 세포를 2 × 10⁵ 개의 세포/웰이 되도록 넣고 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. MARC-145 세포가 단층이 되면 항생제만 포함된 α-MEM 배지로 3 회 세척하였다. MARC-145 세포에 100 TCID₅₀의 PRRSV를 100 ㎕씩 각각 접종하여 37 ℃에서 1 시간 동안 감염 시켰다. 1 시간 후 바이러스를 제거하고 PBS로 1 회 세척하였다. 그 다음, 음성 대조군 (control, 비감염 + 시료 비처리군), 바이러스 대조군 (virus control, 감염 + 시료 비처리군), 양성 대조군 (감염 + mycophenolic acid, MPA 100 μM) 및 시험군 (감염 + 시험 시료 100 ㎍/㎖)은 세포독성시험을 통해 독성을 나타내지 않는 범위에서 MARC-145 세포에 처리 후, 바이러스 대조군에서 완전히 세포 변성 효과 (cytopathic effect, CPE)가 나올 때까지 37 ℃에서 45 - 72 시간 배양하였다. 배양 후 세포 생존율을 알아보기 위해, EZ-Cytox 세포 생존율 어세이 키트 (water-soluble tetrazolium salt method)를 이용하였다. 각 웰에 10 ㎕ 시약을 넣은 후 37 ℃에서 3 시간 반응시킨 다음, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 저해도는 하기 [수학식 1]에 의해 계산되었다.

[수학식 1]

* 상기 식에서, O.D 값은 450 nm에서 측정한 흡광도 값을 의미한다.

그 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 노박덩굴 추출물은 PRRSV에 대해 높은 항바이러스 활성을 가진다는 것을 알 수 있었다.

시험 물질	CPE reduction (%)
	PRRSV (LMY strain)
Mycophenolic acid (100 μM)	73.0 ± 2.2
노박덩굴 에탄올 추출물 (100 ㎍/ml)	76.2 ± 1.8

또한, 도립현미경 상에서 세포 형태를 관찰한 결과, 바이러스 대조군은 MARC-145 세포가 거의 파괴되어 90 - 100 % 세포변성 효과가 나타났으며, 바이러스와 노박덩굴 에탄올 추출물을 처리한 시험군은 음성대조군과 유사하게 세포가 유지됨을 확인하였다.

실험예 4: PRRSV 감염 돼지모델을 이용한 노박덩굴 추출물의 항바이러스 활성 검증

노박덩굴 추출물의 항바이러스 활성을 추가적으로 확인하기 위하여, PRRSV 감염 돼지모델을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

공시바이러스는 ATCC로부터 구입한 표준주 VR2332를 사용하였고, 자돈은 PRRSV 백신을 비접종한 landrace 계통 3 일령 신생 자돈 총 15 두를 동물전문납품업체로부터 공급 받아 사용하였다. 공급받은 포유자돈의 혈액을 채취하고 BIONOTE의 PRRS 항체 엘리자 키트를 이용해 PRRSV 항체가 검사를 수행하였다.

그 결과 실험에 사용할 포유자돈은 모두 S/P 비율 값 (sample-to-positive)이 0.4 이하의 음성으로 판정되었고, PRRSV에 감염이 되지 않음을 확인하였다 (도 4).

그 다음, 동물 그룹을 음성 대조군 (mock, 비접종 + 비투여), 공격접종 양성대조군 (virus control, 공격접종 + 비투여) 및 시험군 (공격접종 + 노박덩굴 에탄올 추출물 400 mg/kg/day 투여)의 총 3 개의 그룹으로 나누고, 각 그룹 당 5 두씩 구성하였다. 바이러스 공격접종은 PRRSV의 감염 역가를 1×10⁵ PFU/ml로 하여, 각각 두당 2 ml씩 근육 접종하였다. 시험물질 투여는 바이러스 공격접종 7 일 전부터 공격접종 후 7 일까지 14 일 동안 노박덩굴 에탄올 추출물을 400 mg/kg/day 용량으로 경구투여하였다. 그 다음, 매일 임상증상을 관찰하여 기록하였고, 바이러스 접종 후 7 일째에 부검하여 육안소견 및 형태학적 변화를 검사하였다 (표 3).

그룹	용량	투여 경로
음성 대조군	PBS	P.O
양성 대조군	PBS	P.O
시험군	노박덩굴 에탄올 추출물 400 mg/kg/day	P.O

구체적으로, PRRSV 감염에 의한 폐렴 임상증상을 호흡장애와 임상증상을 기준으로 5 개 단계인 0: normal, 1: slight, 2: mild, 3: moderate, 4: sever dyspnea로 구분하였고, 부검 시 육안병변 지수는 0: normal, 1: slight, 2: mild, 3: moderate, 4: severe interstitial pneumonia로 구분하여 검사를 하였다.

그 결과, 음성 대조군 그룹은 규칙적인 호흡과 부검 시 정상의 폐를 가지고 있었고 양성 대조군 그룹은 접종 5 일부터 침울과 호흡곤란이 관찰 되었으며, 부검 시 폐의 전엽에 걸쳐 충혈 및 출혈, 그리고 모든 엽에서 고무질감을 갖는 간질성 폐렴양상을 나타내었다. 노박덩굴 추출물 투여그룹은 접종 후 정상적인 호흡과 활동성을 보였으며, 부검 시 폐의 조직소견을 관찰한 결과, 양성 대조군 그룹과 비교 시 정상에 가까운 mild한 폐렴양상을 보였다 (도 5). 결론적으로 상기 결과를 통해, 노박덩굴 추출물이 PRRSV 감염성 질환에 있어서 우수한 항바이러스 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 5: 파스튜렐라 멀토시다 ( Pasteurella multocida ) 감염성 질환에 대한 노박덩굴 추출물의 효능 검증

5-1. 세포 배양

ATCC로부터 구입한 돼지 대식세포주 3D4/31(CRP-2844TM)는 RPMI1640 배지 (10 % 열-불활성화 FBS 및 1 % 페니실린-스트렙토마이신)에서 37 ℃, 5 % CO₂ 조건 하에 배양하였다.

5-2. 파스튜렐라 멀토시다 배양 및 대식세포에 처리

돼지 대식세포에서 세균 감염으로 유발된 항염증 효능을 검증하기 위해 ATCC로부터 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida)를 구입하여 사용하였다. 파스튜렐라 멀토시다 처리 시에는 배지 100 ml에서 배양한 후 계열 희석에 의해 균체 수 (CFU/ml)를 확인하였다. 그 다음, 세포에 감염시킬 만큼의 균 수를 계산하여 배양한 뒤 PBS로 두 번 세척하고, 100 ℃에서 5 분간 열-불활성화하여 세포에 처리하였다.

돼지 대식세포주 3D4/31을 6-웰 플레이트에 2 × 10⁶ 개의 세포/웰로 접종하고, 노박덩굴 추출물을 100 ㎍/ml의 농도로 1 시간 전처리하였다. 그 다음, 상기 준비한 파스튜렐라 멀토시다를 8 × 10⁸ CFU/ml로 처리하여 감염시키고 회수한 뒤, 염증성 인자인 TNF-α, IL-6 및 IL-8의 변화를 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 기법과 Real-time PCR 분석법을 통해 확인하였다. 이때 Quercetin 10 ㎍/ml은 항염증 효과를 가져 양성 약물로 사용하였다.

5-3. 돼지 폐 대식세포에서 파스튜렐라 멀토시다에 의해 유도되는 염증인자 억제 효능 검증

EILSA 실험을 위해 코팅 완충액 (1 L 증류수 안에 8.40 g NaHCO₃, 3.56 g Na₂CO₃을 녹임, pH 9.5)에 포획항체 (TNF-α, IL-6, IL-8)를 각각 1 : 250의 비율로 희석시킨 뒤 각 웰에 100 ㎕씩 분주하고 37 ℃에서 3 시간 동안 반응시켰다. 그 다음, 세척 완충액 (0.05% Tween-20 PBS)으로 3 번 세척하였다. 그 다음, Assay Diluent (10 % FBS)를 각 웰 당 200 ㎕씩 분주한 뒤 37 ℃에서 1 시간 반응 시키고 이를 다시 세척 완충액으로 3 번 세척하였다. 그 다음, 분석을 위한 샘플을 각 웰당 100 ㎕씩 분주한 뒤 37 ℃에서 2 시간 반응 시키고 5 번 세척하였다. 그 다음, 검출 항체 (TNF-α, IL-6, IL-8)와 효소 반응액을 각각 1 : 250으로 Assay Diluent에 희석하고 각 웰당 100 ㎕씩 워킹 용액을 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응 시킨 후 각각 1 분 동안 7 회 세척하였다. 마지막으로 기질 용액을 100 ㎕씩 분주하고 빛을 차단한 뒤 30 분 방치한 다음, 50 ㎕의 중지 용액을 처리한 후 ELISA reader 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Real-time PCR 분석을 위해 배양한 세포에서 RNA를 추출하였다. RNA 분리 키트 (RNAiso Plus reagent, Takarabio)를 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 분리하고, 분리된 전체 RNA의 흡광도를 측정하여 정량한 후, 2 ㎍의 RNA로 cDNA를 합성하였다. 각 튜브 당 2 ㎕의 cDNA, 각 1 ㎕의 센스 및 안티센스 프라이머 용액 (0.4 μM), 12.5 ㎕의 SYBR Premix Ex Taq (Takarabio) 및 9.5 ㎕의 dH₂O를 함께 혼합하여 총 25 ㎕가 되도록 하였다. TNF-α, IL-6, IL-8, TLR1-9의 mRNA의 발현 정도는 Thermal Cycler Dice Real Time System (Analytik Jena, Germany) 소프트웨어를 이용하여 real-time PCR 결과를 분석하였다.

그 결과, 노박덩굴 추출물은 파스튜렐라 멀토시다에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-8의 분비 및 발현을 억제하였다 (도 6 및 도 7).

또한, 신호전달 억제 기전을 확인하기 위해 파스튜렐라 멀토시다 감염에 의한 TLR 발현을 억제할 수 있는지 확인한 결과, 노박덩굴 추출물은 TLR1, TLR2, TLR6에 대한 우수한 발현 억제 효능이 있었고, TLR 신호전달 억제를 통해 활성을 가짐을 확인하였다 (도 8).

5-4. 파스튜렐라 멀토시다 감염 마우스 모델을 이용한 노박덩굴 추출물의 효능 검증

파스튜렐라 멀토시다 감염에 대한 노박덩굴 추출물의 효능을 평가하기 위하여, 마우스를 마취시킨 후 1 × 10⁶ CFU/ml 농도의 파스튜렐라 멀토시다 균주를 100 ㎕씩 비강 내 접종시켰다. 접종 직후부터 노박덩굴 추출물을 300 또는 500 mg/kg 농도로 각각의 그룹에 하루 1 회 경구 투여하였다. 매일 1 회 체중을 측정하였으며, 이와 함께 마우스의 임상증상 (폐사여부)을 확인하였다.

그 결과, 파스튜렐라 멀토시다 감염그룹 마우스가 접종 1 일 후에 100 % 폐사하였으나, 500 mg/kg 투여그룹에서는 3 일째까지 60 %의 생존율을 보였다 (도 9). 따라서 상기 결과를 통해 본 발명의 노박덩굴 추출물이 파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환에 우수한 효과를 가짐을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Composition for preventing or treating infectious disease containing extract of Celastrus orbiculatus Thunb <130> P17-175-KRI <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine TNF-alpha primer-F <400> 1 gcactgacca ccaccaag 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine TNF-alpha primer-R <400> 2 ctggcagcca cattccag 18 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine IL-6 primer-F <400> 3 caacgatgat gcacttgcag a 21 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine IL-6 primer-R <400> 4 ctccaggtag ctatggtact ccaga 25 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine IL-8 primer-F <400> 5 ggccagcatt cacaagtctt c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine IL-8 primer-R <400> 6 aaggtaggat gggggctgaa 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine TLR1 primer-F <400> 7 tttcctacag acggccagca g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine TLR1 primer-R <400> 8 atgacgcctc ggtgatcctg 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine TLR2 primer-F <400> 9 caccaggacc tacctggag 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine TLR2 primer-R <400> 10 gcatcggacc aagactggc 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine TLR6 primer-F <400> 11 ctcaaagctc tcatggcac 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine TLR6 primer-R <400> 12 catcatcctc ttcagcgac 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine beta actin primer-F <400> 13 ggcatccacg aaactacctt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine beta actin primer-R <400> 14 tgatctcctt ctgcatcctg 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TNF-alpha primer-F <400> 15 ggttcctcag cctcttctcc tt 22 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TNF-alpha primer-R <400> 16 cttgtcactt ggggttcgag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey IL-6 primer-F <400> 17 ctcagggatg caatgccact 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey IL-6 primer-R <400> 18 ttgcagaaga gagccaacca a 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey IL-8 primer-F <400> 19 ggaccacact gcgtcaatac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey IL-8 primer-R <400> 20 tctccacaac cctagacacc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey IL-1 beta primer-F <400> 21 gtacctgtcc tgcgtgttga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey IL-1 beta primer-R <400> 22 ttggggaatt gggcagactc 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR1 primer-F <400> 23 tggacagcca aacggaaca 19 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR1 primer-R <400> 24 aaagggcctg atacccccat 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR2 primer-F <400> 25 ccttcactca ggagcagcaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR2 primer-R <400> 26 tcagcaggaa cagagcacag 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR3 primer-F <400> 27 gcctatttgc cacacacttc c 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR3 primer-R <400> 28 gtggaggatg cacacagcat 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR4 primer-F <400> 29 tcacccttta gcccagaact 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR4 primer-R <400> 30 cagacgtcat cctggcatca 20 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR5 primer-F <400> 31 gaccctctgc ccctagaata ag 22 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR5 primer-R <400> 32 gcctctcagt ggtgttgagg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR6 primer-F <400> 33 cagtccaccg gaagtctcta 20 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR6 primer-R <400> 34 ggaggactca tacccacatt ct 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR7 primer-F <400> 35 atgatgacag caagtcacct ct 22 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR7 primer-R <400> 36 gtcttccagt ttggccacca 20 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR8 primer-F <400> 37 ccattttctc ttctcggcca c 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR8 primer-R <400> 38 ggaaaaggca ggtcagcatt g 21 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey TLR9 primer-F <400> 39 atgtttgccc 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6. 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteuralla multocida) 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 파스튜렐라 멀토시다 감염성 질환은 돼지 파스튜렐라 폐렴, 돼지 마이코플라즈마 폐렴, 돼지생식기호흡기증후군, 이유 후 전신성 소모성증후군 및 돼지호흡기복합증후군으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
   
8. 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteuralla multocida) 감염성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
   
9. 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 돼지에 투여하는 단계를 포함하는, 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteuralla multocida) 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법.

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