KR102473892B1

KR102473892B1 - 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 치주질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102473892B1
Application number: KR1020220022320A
Authority: KR
Inventors: 심재현; 이림자; 류은주; 김윤지; 김혜은; 임상은
Original assignee: 쿼럼바이오 주식회사
Priority date: 2022-02-21
Filing date: 2022-02-21
Publication date: 2022-12-06

Abstract

본 출원은 신규 화합물 및 이의 치주질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 용도를 제공하며, 세포 독성이 나타나지 않아 안전하고, 상기 치주질환에 대한 예방, 개선, 및/또는 치료 효과가 우수하다.

Description

신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 치주질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물{Novel compound and composition for preventing, improving, or treating periodontal disease comprising the same as an active ingredient}

본 출원은 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 치주질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공한다.

치주질환은 치아를 둘러싸고 있는 치은과 치주인대 및 치조골 등 치아 주위조직에 나타나는 질환이다. 병의 정도에 따라 치은염(gingivitis)과 치주염(periodontitis)으로 나뉜다. 비교적 가볍고 회복이 빠른 형태의 치주질환으로 잇몸 즉, 연조직에만 국한된 형태를 치은염이라고 하고, 이러한 치은염이 잇몸과 잇몸 뼈 주변까지 진행된 경우를 치주염이라고 한다. 우리나라 19세 이상 성인의 치주질환 유병률은 29.8%이며, 연령별 치주질환 유병률은 20대가 5.1%, 30대가 15.5%, 40대가 30.1%, 50대가 47.0%, 60대가 47.6%, 70대 이상이 47.5%로 보고되고 있다. 전체적으로 연령이 증가할수록 유병률도 증가하며, 특히 50세 이상에서 유병률이 급격하게 증가하는 질병이다.

한편, 포르피로모나스 속 세균은 구강 내에 서식하는 세균의 일종으로 잇몸 사이의 공간에서 서식하면서 고름을 생성하여 치주염을 일으키는 주범으로 지목되고 있다. 특히 프로피로모나스 속 중 포르피로모나스 진지발리스는 치주염 병인에서 구강내 세균총 불균형을 유도하고, 이에 대한 숙주 면역 반응을 교란시키는 주요 병원균으로 작용한다.

또한 프로피로모나스 진지발리스가 가지고 있는 진지페인(gingipain)이라는 단백질 분해 효소는 치주질환의 예방 및 치료제 개발에 있어 중요한 표적이 되는 주요 독성 인자이다.

이에, 포르피로모나스 속 세균의 병독력을 억제하여 치주질환을 예방 및 치료할 수 있는 새로운 치료약의 개발이 시급한 실정이다.

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한국 공개특허공보 10-2019-0130983 A

본 출원의 일 예는 신규한 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

다른 예는, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 치주질환의 예방, 개선, 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.

다른 예는, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 치주질환의 예방, 개선, 및/또는 치료용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

다른 예는, 상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유효량을 치주질환의 예방, 개선, 및/또는 치료를 필요로 하는 대상(개체)에게 투여하는 단계를 포함하는, 치주질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 방법을 제공한다.

다른 예는, 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명자들은 포르피로모나스 속(genus Porphyromonas) 세균의 병독력 억제 활성을 갖는 신규한 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제조하여, 이들 화합물이 치주질환의 예방, 개선, 및/또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하여 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 일 예는 아래 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

용어의 정의

본 명세서에서 사용된 용어에 대해 이하에서 간략히 설명한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 염(pharmaceutically acceptable salt)"은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 염 형태를 의미하는 것으로, 본 발명의 경우, 화학식 1의 화합물의 생물학적 유효성 및 특성을 동등하게 보유하고, 약제학적, 생물학적 또는 다른 특성의 관점에서 바람직한 임의의 염을 총칭할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산; 또는 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염일 수 있다. 구체적인 예로서, 유리 염기 형태의 화합물과, 화학량론적 양의 적절한 산과 반응시켜 일 구현예의 화합물의 산 부가염을 얻을 수 있다. 이때, 상기 반응은 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 중에서 진행될 수 있고, 구체적으로 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴 등의 비-수성 매질 중에서 진행될 수 있다. 이외에도 약제학적으로 허용되는 염의 형태에 따라, 당업자에게 자명한 통상적인 반응에 의해 각 형태의 염을 얻을 수 있다. 또한, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염; 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산염; 또는 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린, 트리에틸아민 등의 유기염 등일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "이성질체"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 광학적 또는 입체적으로 다른 화합물 또는 그의 염을 의미한다. 이러한 이성질체, 그의 염, 및 이성질체의 혼합물(racemic mixture) 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "아릴"은 공유 파이 전자계를 가지며 적어도 하나의 링을 가지는 카보사이클릭 그룹(예를 들어, 페닐) 그룹을 의미한다. 이 용어는 모노사이클릭 또는 융합환 폴리사이클릭(즉, 탄소원자들의 인접한 쌍들을 나눠 가지는 링들) 그룹을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "헤테로아릴" 은 공유 파이 전자계를 가지며 적어도 하나의 링을 가지는 헤테로사이클릭 아릴 그룹을 의미하며, 예를 들어 퓨란, 티오펜, 피롤, 이미다졸, 옥사졸, 이속사졸, 옥사디아졸, 테트라졸, 티아졸, 이미다졸, 피라졸, 이소티아졸, 트리아졸, 티아디아졸, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 트리아진 등을 나타내지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "알킬"은 지방족 탄화수소 그룹을 의미한다. 알킬 부위는 알켄이나 알킨 부위를 전혀 포함하지 않는 "포화 알킬" 그룹일 수도 있고, 적어도 하나의 알켄 또는 알킨 부위를 포함하는 "불포화 알킬" 그룹일 수도 있다. "알켄" 부위는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합으로 이루어진 그룹을 의미하며, "알킨" 부위는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중결합으로 이루어진 그룹을 의미한다. 예컨대, "알킬"은 선형, 가지형 또는 고리형 구조를 갖는 포화 알킬 또는 불포화 알킬일 수 있다. 전형적인 알킬 그룹에는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 에테닐, 프로페닐, 부테닐 등이 포함되지만, 이들 만으로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, C1-C4-알킬은 알킬쇄에 1 내지 4 개의 탄소원자를 가지며, 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸 및 t-부틸로 이루어진 그룹에서 선택된다.

본 명세서에서, 알킬기는 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬기일 수 있고, 알콕시기는 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시기일 수 있다. 상기 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬기, 또는 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시기는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 10개 (C1-C10), 탄소수 1 내지 9개 (C1-C9), 탄소수 1 내지 8개 (C1-C8), 탄소수 1 내지 7개 (C1-C7), 탄소수 1 내지 6개 (C1-C6), 탄소수 1 내지 5개 (C1-C5), 탄소수 1 내지 4개 (C1-C4), 탄소수 1 내지 3개 (C1-C3), 탄소수 1 내지 2개 (C1-C2), 탄소수 1개 (C1), 탄소수 2 내지 10개 (C2-C10), 탄소수 2 내지 9개 (C2-C9), 탄소수 2 내지 8개 (C2-C8), 탄소수 2 내지 7개 (C2-C7), 탄소수 2 내지 6개 (C2-C6), 탄소수 2 내지 5개 (C2-C5), 탄소수 2 내지 4개 (C2-C4), 탄소수 2 내지 3개 (C2-C3), 탄소수 2개 (C2), 탄소수 3 내지 10개 (C3-C10), 탄소수 3 내지 9개 (C3-C9), 탄소수 3 내지 8개 (C3-C8), 탄소수 3 내지 7개 (C3-C7), 탄소수 3 내지 6개 (C3-C6), 탄소수 3 내지 5개 (C3-C5), 탄소수 3 내지 4개 (C3-C4), 탄소수 3개 (C3), 탄소수 4 내지 10개 (C4-C10), 탄소수 4 내지 9개 (C4-C9), 탄소수 4 내지 8개 (C4-C8), 탄소수 4 내지 7개 (C4-C7), 탄소수 4 내지 6개 (C4-C6), 탄소수 4 내지 5개 (C4-C5), 탄소수 4개 (C4), 탄소수 5 내지 10개 (C5-C10), 탄소수 5 내지 9개 (C5-C9), 탄소수 5 내지 8개 (C5-C8), 탄소수 5 내지 7개 (C5-C7), 탄소수 5 내지 6개 (C5-C6), 탄소수 5개 (C5), 탄소수 6 내지 10개 (C6-C10), 탄소수 6 내지 9개 (C6-C9), 탄소수 6 내지 8개 (C6-C8), 탄소수 6 내지 7개 (C6-C7), 탄소수 6개 (C6), 탄소수 7 내지 10개 (C7-C10), 탄소수 7 내지 9개 (C7-C9), 탄소수 7 내지 8개 (C7-C8), 탄소수 7개 (C7), 탄소수 8 내지 10개 (C8-10), 탄소수 8 내지 9개 (C8-C9), 탄소수 9개 (C9), 탄소수 9 내지 10개 (C9-C10), 또는 탄소수 10개 (C10)인 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "할로" 또는 "할로젠"은 플루오르기(-F), 클로로기(-Cl), 브로모기(-Br) 또는 아이오도기(-I)일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "헤테로사이클"은 환 탄소가 산소, 질소, 황 등으로 대체되어 있는 그룹으로서 임의로 이중결합을 포함할 수 있다. 헤테로사이클의 예로는 피롤린, 피롤리딘, 테트라하이드로퓨란, 이미다졸린, 이미다졸리딘, 피라졸린, 피라졸리딘, 피란, 피페리딘, 피페라진, 모폴린, 티오모폴린 등을 들 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

상기 "각각 독립적으로 치환"은, 치환 가능한 수소의 개수가 2개 이상인 경우, 각각의 수소는 서로 같거나 상이한 치환기로 치환될 수 있음을 의미한다.

상기 설명한 것 이외의 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.

이하, 본 출원을 보다 자세히 설명한다.

화학식 1의 화합물

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

상기 "

"는 치환되거나 비치환된 C_3-7의 사이클로알킬, 하나 이상의 이중결합을 포함하는 치환되거나 비치환된 C_3-7의 사이클로알케닐, N, O, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 포함하는 치환되거나 비치환된 C_3-7의 헤테로사이클로알킬, 하나 이상의 이중결합을 포함하고 N, O, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 포함하는 치환되거나 비치환된 C_3-7의 헤테로사이클로알케닐, 치환되거나 비치환된 C_6-10의 아릴, 또는 N, O, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 포함하는 치환되거나 비치환된 C_5-10의 헤테로아릴이고,

상기 치환된 사이클로알킬, 치환된 사이클로알케닐, 치환된 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알케닐, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴은 히드록시(-OH), 할로젠(-F, -Br, -Cl, 또는 -I), 시아노(-CN), 니트로(-NO₂), 아미노(-NH), 치환되거나 비치환된 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 및 치환되거나 비치환된 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상(본 명세서에서, "1종 이상"으로 치환됨은 동일한 치환기로 2종 이상 치환되는 경우를 포함한다: 예컨대, 2개의 OH로 치환되는 경우 등)의 치환기로 치환될 수 있고,

상기 치환된 알킬 또는 치환된 알콕시는 히드록시(-OH), 할로젠, 시아노(-CN), 니트로(-NO₂), 아미노(-NH), C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 및 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 치환기로 치환될 수 있다.

상기 R₃는 치환되거나 비치환된 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 치환되거나 비치환된 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 치환되거나 비치환된 C_3-7의 사이클로알킬, N, O, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 포함하는 치환되거나 비치환된 C_3-7의 헤테로사이클로알킬, 치환되거나 비치환된 C_6-10의 아릴, 또는 N, O, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 포함하는 치환되거나 비치환된 C_5-10의 헤테로아릴이고,

상기 치환된 알킬은 히드록시(-OH), 할로젠, 시아노(-CN), 니트로(-NO₂), 아미노(-NH), C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 및 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 치환기로 치환되거나; 치환되거나 비치환된 C_6-10의 아릴, 또는 N, O, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 포함하는 치환되거나 비치환된 C_5-10의 헤테로아릴로 치환될 수 있고,

상기 치환된 알콕시, 치환된 사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴은 히드록시(-OH), 할로젠, 시아노(-CN), 니트로(-NO₂), 아미노(-NH), C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 및 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 치환기로 치환될 수 있다.

상기 R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로(또는 모두) 수소(H), 할로젠(-F, -Br, -Cl, 또는 -I), 치환되거나 비치환된 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 치환되거나 비치환된 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 치환되거나 비치환된 C_6-10의 아릴, 또는 N, O, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 포함하는 치환되거나 비치환된 C_5-10의 헤테로아릴이고,

상기 치환된 알콕시, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴은 히드록시(-OH), 할로젠, 시아노(-CN), 니트로(-NO₂), 아미노(-NH), C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 및 C_1-5의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 치환기로 치환될 수 있다.

일 예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 아래 화합물들로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다:

1) 3-(디페닐메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(diphenylmethylene)-2-methylisoindolin-1-one},

2) 3-(디-p-톨릴메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(di-p-tolylmethylene)-2-methylisoindolin-1-one}, 및

3) 3-(비스(4-메톡시페닐)메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(bis(4-methoxyphenyl)methylene)-2-methylisoindolin-1-one}

화학식 1A의 화합물

본 출원의 일 예는 아래 화학식 1A의 화합물, 이의 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

[화학식 1A]

상기 화학식 1A에서,

상기 "

"은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

상기 R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로(또는 모두), 수소(H), 치환되거나 비치환된 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 치환되거나 비치환된 C_1-10의 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 치환되거나 비치환된 C_6-10의 아릴, 또는 N, O, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 포함하는 치환되거나 비치환된 C_5-10의 헤테로아릴이고,

상기 R₃은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

단, 상기 화학식 1A의 화합물은 다음의 화합물을 포함하지 않는다:

a) 3-(디페닐메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(diphenylmethylene)-2-methylisoindolin-1-one} (CAS No. 92172-54-8)

일 예에서, 상기 화학식 1A의 화합물은 아래 화합물들로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 것일 수 있다:

i) 3-(디-p-톨릴메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(di-p-tolylmethylene)-2-methylisoindolin-1-one}, 및

ii) 3-(비스(4-메톡시페닐)메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(bis(4-methoxyphenyl)methylene)-2-methylisoindolin-1-one}.

상기 화학식 1 또는 화학식 1A의 화합물(이하, 본 명세서에서 화학식 1 또는 화학식 1A의 화합물은 특별한 언급이 없다면 화학식 1의 화합물로 통일하여 기재한다.)의 이성질체는 상기 화학식 1의 화합물의 광학 이성질체, 입체이성질체, 또는 상기 이성질체의 혼합물(라세믹 혼합물)일 수 있다. 일 구현예에 따른 화학식 1의 화합물에서, 각 치환기는 탄소 원자의 키랄 중심에 부착될 수 있는 것으로 이해된다. 그리고, 상기 일 구현예의 화합물 상의 임의의 비대칭 탄소 원자는 (R)-, (S)- 또는 (R, S)- 배위의 어떠한 형태로도 존재할 수 있고, 적절하게는 각각의 분리된 형태인 (R)- 또는 (S)- 배위로 존재할 수 있다. 또, 일 구현예의 화합물은 가능한 임의의 이성질체 또는 이들의 혼합물 중 어떠한 형태로도 존재할 수 있고, 예를 들어, 순수한 기하 이성질체, 부분 입체 이성질체, 광학이성질체, 라세미체 또는 이들의 혼합물의 임의의 형태로 존재할 수 있다. 부가하여, 일 구현예의 화합물이 이중 결합을 갖는 경우, 이중 결합에 결합된 각 치환기는 E 또는 Z 배열일 수 있다.

화학식 1의 화합물의 활성

상기 화학식 1의 화합물은 (i) 포르피로모나스 속 세균의 병독력 억제 활성, 및/또는 (ii) 치주질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 활성을 가지는 것일 수 있다.

상기 포르피로모나스 속 세균은 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 포르피로모나스 엔도돈탈리스 (Porphyromonas endodontalis) 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 포르피로모나스 속 세균의 병독력 억제 활성은 포르피로모나스 속 세균의 쿼럼센싱을 억제하거나, 및/또는 포르피로모나스 속 세균의 병독력 인자 (예컨대, 진지페인(gingipain), 생물막(biofilm) 등)의 발현 억제 (예컨대, mRNA 전사 과정 억제, 또는 단백질 번역 과정 억제 등) 등을 통하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 진지페인은 Lysine-gingipain (Kgp), Arginine-gingipain A (RgpA), Arginine-gingipain B (RgpB) 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 포르피로모나스 속 세균의 병독력을 억제함으로써, 치주 질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 효과를 달성할 수 있다. 즉, 상기 치주 질환의 예방, 개선, 및/또는 치료는, 포르피로모나스 속 세균의 병독력 억제, 예컨대, 포르피로모나스 속 세균의 쿼럼센싱을 억제하거나, 및/또는 포르피로모나스 속 세균의 병독력 인자 (예컨대, 진지페인(gingipain), 생물막(biofilm) 등)의 발현 억제 (예컨대, mRNA 전사 과정 억제, 또는 단백질 번역 과정 억제 등) 등을 통하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 치주 질환은 치주염, 치은염 등으로부터 선택된 1종 이상의 질환일 수 있다.

본 명세서에서, "예방"이란 일 예에 따른 조성물의 투여에 의해 질병(질환)의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 일 예에 따른 조성물의 투여에 의해 질병의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란, 일 예에 따른 조성물의 투여로 질병이 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 상기 질병은 치주질환일 수 있다.

약학적 조성물

다른 예는 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 치주질환의 예방, 개선, 또는 치료 용도를 제공한다.

다른 예는 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.

다른 예는 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유효량을 치주질환의 예방, 개선, 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 치주질환의 예방, 개선, 또는 치료방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 치주질환의 예방, 개선, 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 치주질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.

이하에서는, 특별히 한정하지 않는 한, 상기 약학적 조성물의 유효성분(활성성분)으로서 화학식 1의 화합물은 상기 화합물의 이성질체, 및 상기 화합물 또는 이성질체의 약학적으로 허용 가능한 염을 모두 포괄하는 의미이며, 이들 화합물, 이성질체, 및 염 모두가 본 출원의 범주에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 다만 편의를 위하여, 본 명세서에서는, 별도의 언급이 없는 한, 상기 약학적 조성물의 유효성분으로서의 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 편의상 '화학식 1의 화합물'로 간단히 표현한다.

상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 이성질체의 약학적으로 허용 가능한 염은 화학식 1의 화합물 또는 이의 이성질체의 산부가염, 금속염, 아미노산염, 및 유기염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 산부가염은, 예컨대, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산; 또는 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염일 수 있다. 상기 금속염은 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 알칼리 금속염 또는 알칼리토 금속염일 수 있다. 상기 아미노산염은 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등에 의해 형성된 아미노산염일 수 있다. 상기 유기염은 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린, 트리에틸아민 등에 의해 형성된 유기염일 수 있다.

상기 치주질환은 앞에서 설명한 바와 같다.

상기 약학적 조성물의 투여 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 양, 염소, 등의 가축류, 닭, 오리, 거위, 꿩, 메추리, 칠면조 등의 가금류 등을 포함하는 포유류에서 선택된 1종 이상, 또는 이들로부터 유래하는 세포, 조직, 또는 이들의 배양물일 수 있다. 예컨대 상기 투여 대상은 치주질환의 예방, 개선, 및/또는 치료를 필요로 하는 대상일 수 있으며, 예컨대 인간일 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 통상적인 의약품 제제의 형태로 제제화되어 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 의약품 제제는 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 여러 가지 제제로 제조될 수 있으며, 상기 제제의 형태는 사용 방법, 투여 방법, 투여 목적 등에 따라 다양하게 결정될 수 있다.

경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 여러 가지 제제로 제조되는 경우, 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제, 부형제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하여 제제화할 수 있다.

경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 경구 투여를 위한 고형 제제로서 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형 제제는 상기 유효성분과 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 또한, 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 포함될 수 있다. 상기 액상 제제로 제제화하는 경우, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 및/또는 리퀴드 파라핀 등이 사용될 수 있으며, 임의로, 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

비경구 투여는 혈관 투여(예컨대, 동맥 투여, 정맥 투여 등), 환자의 병변 부위 (예컨대, 잇몸 등)에 주사(injection) 또는 삽입, 근육내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 비강내 투여, 경피 투여, 내피 투여, 국소 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등과 같은 임의의 편리한 경로에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용액, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성 용액 제조를 위한 비수성용제, 또는 현탁제 제조를 위한 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 비강내 투여 시, 상기 약학적 조성물을 희석하여 분무기나 분무 시스템을 통해 비강으로 흡수되도록 하는 비강 분무를 통하여 투여될 수 있으며, 상기 비강 분무를 위한 비강 분무제 또는 호흡기용 제형으로는 에어로졸제 등을 들 수 있다.

상기 약학적 조성물 내에 포함되는 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유효성분의 함량은, 전체 약학적 조성물의 중량 기준으로, 0.01중량% 내지 99.9중량%, 0.01중량% 내지 90중량%, 0.01중량% 내지 80중량%, 0.01중량% 내지 70중량%, 0.01중량% 내지 60중량%, 0.01중량% 내지 50중량%, 0.01중량% 내지 40중량%, 0.01중량% 내지 30중량%, 1중량% 내지 99.9중량%, 1중량% 내지 90중량%, 1중량% 내지 80중량%, 1중량% 내지 70중량%, 1중량% 내지 60중량%, 1중량% 내지 50중량%, 1중량% 내지 40중량%, 1중량% 내지 30중량%, 5중량% 내지 99.9중량%, 5중량% 내지 90중량%, 5중량% 내지 80중량%, 5중량% 내지 70중량%, 5중량% 내지 60중량%, 5중량% 내지 50중량%, 5중량% 내지 40중량%, 5중량% 내지 30중량%, 10중량% 내지 99.9중량%, 10중량% 내지 90중량%, 10중량% 내지 80중량%, 10중량% 내지 70중량%, 10중량% 내지 60중량%, 10중량% 내지 50중량%, 10중량% 내지 40중량%, 또는 10중량% 내지 30중량%일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 제제의 형태, 투여 방법, 투여 목적 등에 따라서 적절히 조절 가능하다.

화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 약학적 유효량은, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있으며, 하루 일회 내지 수회로 나누어 투여 또는 복용될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 다양한 투여용량 및 방법으로 투여 가능하다. 일 예에서, 상기 약학적 조성물의 1회 투여량은 0.0001 내지 1000 mg/kg, 0.0001 내지 500 mg/kg, 0.0001 내지 100 mg/kg, 0.0001 내지 90 mg/kg, 0.0001 내지 80 mg/kg, 0.0001 내지 70 mg/kg, 0.0001 내지 60 mg/kg, 0.0001 내지 50 mg/kg, 0.0001 내지 40 mg/kg, 0.0001 내지 30 mg/kg, 0.0001 내지 20 mg/kg, 0.0001 내지 10 mg/kg, 0.0001 내지 5 mg/kg, 0.001 내지 1000 mg/kg, 0.001 내지 500 mg/kg, 0.001 내지 100 mg/kg, 0.001 내지 90 mg/kg, 0.001 내지 80 mg/kg, 0.001 내지 70 mg/kg, 0.001 내지 60 mg/kg, 0.001 내지 50 mg/kg, 0.001 내지 40 mg/kg, 0.001 내지 30 mg/kg, 0.001 내지 20 mg/kg, 0.001 내지 10 mg/kg, 0.001 내지 5 mg/kg, 0.01 내지 1000 mg/kg, 0.01 내지 500 mg/kg, 0.01 내지 100 mg/kg, 0.01 내지 90 mg/kg, 0.01 내지 80 mg/kg, 0.01 내지 70 mg/kg, 0.01 내지 60 mg/kg, 0.01 내지 50 mg/kg, 0.01 내지 40 mg/kg, 0.01 내지 30 mg/kg, 0.01 내지 20 mg/kg, 0.01 내지 10 mg/kg, 0.01 내지 5 mg/kg, 0.1 내지 1000 mg/kg, 0.1 내지 500 mg/kg, 0.1 내지 100 mg/kg, 0.1 내지 90 mg/kg, 0.1 내지 80 mg/kg, 0.1 내지 70 mg/kg, 0.1 내지 60 mg/kg, 0.1 내지 50 mg/kg, 0.1 내지 40 mg/kg, 0.1 내지 30 mg/kg, 0.1 내지 20 mg/kg, 0.1 내지 10 mg/kg, 0.1 내지 5 mg/kg, 1 내지 1000 mg/kg, 1 내지 500 mg/kg, 1 내지 100 mg/kg, 1 내지 90 mg/kg, 1 내지 80 mg/kg, 1 내지 70 mg/kg, 1 내지 60 mg/kg, 1 내지 50 mg/kg, 1 내지 40 mg/kg, 1 내지 30 mg/kg, 1 내지 20 mg/kg, 1 내지 10 mg/kg, 1 내지 5 mg/kg, 2 내지 1000 mg/kg, 2 내지 500 mg/kg, 2 내지 100 mg/kg, 2 내지 90 mg/kg, 2 내지 80 mg/kg, 2 내지 70 mg/kg, 2 내지 60 mg/kg, 2 내지 50 mg/kg, 2 내지 40 mg/kg, 2 내지 30 mg/kg, 2 내지 20 mg/kg, 2 내지 10 mg/kg, 2 내지 5 mg/kg, 3 내지 1000 mg/kg, 3 내지 500 mg/kg, 3 내지 100 mg/kg, 3 내지 90 mg/kg, 3 내지 80 mg/kg, 3 내지 70 mg/kg, 3 내지 60 mg/kg, 3 내지 50 mg/kg, 3 내지 40 mg/kg, 3 내지 30 mg/kg, 3 내지 20 mg/kg, 3 내지 10 mg/kg, 3 내지 5 mg/kg, 4 내지 1000 mg/kg, 4 내지 500 mg/kg, 4 내지 100 mg/kg, 4 내지 90 mg/kg, 4 내지 80 mg/kg, 4 내지 70 mg/kg, 4 내지 60 mg/kg, 4 내지 50 mg/kg, 4 내지 40 mg/kg, 4 내지 30 mg/kg, 4 내지 20 mg/kg, 4 내지 10 mg/kg, 또는 4 내지 5 mg/kg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약학적 유효량(pharmaceutically effective amount)"은 목적하는 약학적 효과가 얻어질 수 있는 유효성분의 양을 의미하며, 경우에 따라서는 목적하는 약학적 효과 발휘를 위한 약학적 조성물 내의 유효성분의 농도 또는 투여량을 의미할 수 있다.

제조방법

다른 예에서, 화학식 1의 화합물의 제조 방법이 제공된다.

일 예에서, 상기 제조방법은 아래의 화학식 4의 화합물에 페닐보론산 또는 이의 유도체 (예컨대, 페닐보론산 (phenylboronic acid, Cas No. 98-80-6), 4-메틸페닐보론산 (4-Methylphenylboronic Acid 또는 p-Tolylboronic acid, Cas No. 5720-05-8), 또는 4-메톡시페닐보론산 ((4-methoxyphenyl)boronic acid, Cas No. 5720-07-0))을 도입하여 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

[화학식 4]

화학식 1의 화합물에서 "

"가 비치환된 C6의 아릴이고, R₃이 C1의 알킬 (메틸기)인 경우 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계는 상기 화학식 4의 화합물에 페닐보론산 (phenylboronic acid, Cas No. 98-80-6), 4-메틸페닐보론산 (4-Methylphenylboronic Acid 또는 p-Tolylboronic acid, Cas No. 5720-05-8), 또는 4-메톡시페닐보론산 ((4-methoxyphenyl)boronic acid, Cas No. 5720-07-0)을 반응시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다.

본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 화학식 1의 구조를 바탕으로 다양한 방법에 의해 화합물을 제조하는 것이 가능할 것이며, 이러한 방법들은 모두 발명의 범주에 포함되는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 본 명세서에 기재되어 있거나, 선행기술에 게시된 여러 합성법들을 임의로 조합하여 본 발명의 범주내에서 상기 화학식 1의 화합물을 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 제조 방법이 하기 제시된 것들로만 한정되는 것은 아니다.

본 출원은 화학식 1의 화합물, 이의 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 이들의 치주질환의 예방, 개선, 및/또는 치료 용도에 관한 것으로, 세포 독성이 나타나지 않아 안전하고, 상기 질병에 대한 예방, 개선, 및/또는 치료 효과가 우수하다.

도 1 및 도 2는 실시예 1 내지 실시예 3의 화합물을 각각 진지발리스균(P. gingivalis)을 배양한 배지에 농도별로(2 μM, 0.2 μM, 0.02 μM, 0.002 μM) 처리하고 진지발리스균의 생물막 형성의 정도(O.D_590nm-)를 확인하여 그래프로 나타낸 것이다. "NT"는 아무 것도 처리하지 않는 군, "DPD"는 배양배지에 화합물 DPD를 처리하고 진지발리스균을 배양한 군, "CT"는 배양배지에 DPD 대신 PBS를 처리하고 진지발리스균을 배양한 군, DPD+실시예 1, DPD+실시예 2, DPD+실시예 3은 DPD 및 실시예 화합물을 함께 처리한 군이다.
도 3a 내지 도 3e는 실시예 2의 화합물과 비교예 화합물을 각각 진지발리스균(P. gingivalis)을 배양한 배지에 농도별로(2 μM, 0.2 μM, 0.02 μM, 0.002 μM) 처리하고 진지발리스균의 생물막 형성의 정도(O.D_590nm-)를 확인하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4d는 실시예 2의 화합물과 비교예 화합물의 인간 혈장 및 래트 혈장에서의 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 진지발리스균을 배양한 배지에 실시예 1 내지 3의 화합물을 각각 처리하고 진지발리스균이 생성하는 주요 병독력 인자이자 단백질 분해효소인 3가지 진지페인(gingipain) 단백질((Lysine-gingipain (Kgp), Arginine-gingipain A (RgpA), 및 Arginine-gingipain B (RgpB)))의 발현의 정도를 그래프로 나타낸 것이다. 진지페인 유전자의 발현 수준을 정규화(normaliztion)하기 위해 16s rRNA 유전자를 사용하였다. "control"은 아무 것도 처리하지 않은 군, "DPD"는 배양배지에 화합물 DPD를 처리하고 진지발리스균을 배양한 군, DPD+실시예 1, DPD+실시예 2는 DPD 및 실시예 화합물을 함께 처리한 군이다.
도 6은 실시예 2의 화합물을 마우스 골수 유래 대식세포에 농도별로 (0.5 μM 내지 16 μM) 처리하여, 세포 독성 여부를 확인한 그래프이다. "Con"은 아무 것도 처리하지 않은 대조군이다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 3-(디페닐메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온의 제조

실시예 1의 화합물 (3-(디페닐메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(diphenylmethylene)-2-methylisoindolin-1-one} (CAS No. 92172-54-8))은 아래 단계를 수행하여 제조하였다.

단계 1: 화합물 A의 제조

[반응식 1]

Zn 분진 (Cas No. 7440-66-6, sigma aldrich) (490 mg, 7.50 mmol)을 함유하는 10 mL의 THF (Cas No. 109-99-9, sigma aldrich) 중에 트리이소프로필포스파이트 (P(i-PrO)3, Triisopropylphosphite, Cas No. 116-17-6, sigma aldrich) (2.7 ml, 11.00 mmol)를 Ar (Cas No. 7440-37-1, 성광특수가스) 하에서 0 ℃로 냉각시켰다. THF 중 CBr4 (Cas No. 558-13-4, TCI) (2.49 g, 7.50 mmol)의 용액을 P(i-PrO)3의 용액에 천천히 첨가하고, 반응물을 색이 황색으로 변할 때까지 교반하였다. 이어서, THF 중 N-메틸프탈이미드 무수물 (N-Methylphthalimide, Cas No. 550-44-7, sigma aldrich) (806 mg, 5.00 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 12 시간 동안 교반하였다. sat. aq NaHCO3 용액 (Cas No. 144-55-8, 삼전화학) (2.5 mL)을 첨가하여 퀀칭시킨 후, 이어서 상을 분리시키고, 에테르로 조 생성물을 수성층으로부터 추출하였다. 잔류물을 에테르에 용해시키고 셀라이트 패드로 여과시켰다. 생성된 여액을 회전 증발에 의해 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피 (헥산 중 50 % DCM(dichloromethane))로 정제하여, 화합물 A를 수득하였다.

단계 2: 실시예 1의 화합물 제조

아르곤 대기하에, 상기 단계 1에서 제조한 화합물 A (158 mg, 0.5 mmol), Na₂CO₃ (212 mg, 2 mmol), Pd(OAC)₂ (Cas No. 3375-31-3, TCI) (22 mg, 0.1 mmol), PPh₃ (Cas No. 603-35-0, TCI) (52 mg, 0.2 mmol), H₂O (2 ml) 및 THF (8 ml)를 쉬링크(Schlenk) 튜브에 첨가하였다. 페닐보론산 (phenylboronic acid, Cas No. 98-80-6, TCI) (1.2 mmol)을 교반 혼합물에 첨가한 다음, 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM (Cas No. 75-09-2, sigma aldrich) (10 mL)으로 추출하고, 염수로 세척하고, MgSO₄ (Cas No. 10034-99-8, 삼전화학)로 건조시키고, 여과시켰다. 조 생성물을 실리카 겔상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 실시예 1의 화합물을 수득하였다.

[실시예 1의 화합물]

실시예 2. 3-(디-p-톨릴메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온의 제조

실시예 2의 화합물 (3-(디-p-톨릴메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(di-p-tolylmethylene)-2-methylisoindolin-1-one})은 아래 단계를 수행하여 제조하였다.

단계 1: 화합물 A의 제조

상기 실시예 1의 단계 1과 동일하게 수행하여 화합물 A를 제조하였다.

단계 2: 실시예 2의 화합물 제조

아르곤 대기하에, 상기 단계 1에서 제조한 화합물 A (158 mg, 0.5 mmol), Na₂CO₃ (212 mg, 2 mmol), Pd(OAC)₂ (22mg, 0.1 mmol), PPh₃ (52 mg, 0.2 mmol), H₂O (2ml) 및 THF (8 ml)를 쉬링크(Schlenk) 튜브에 첨가하였다. 4-메틸페닐보론산 (4-Methylphenylboronic Acid 또는 p-Tolylboronic acid, Cas No. 5720-05-8, TCI) (1.2 mmol)을 교반 혼합물에 첨가한 다음, 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM (10 mL)으로 추출하고, 염수로 세척하고, MgSO₄로 건조시키고, 여과시켰다. 조 생성물을 실리카 겔상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 실시예 2의 화합물을 수득하였다.

[실시예 2의 화합물]

실시예 3. 3-(비스(4-메톡시페닐)메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온의 제조

실시예 3의 화합물 (3-(비스(4-메톡시페닐)메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(bis(4-methoxyphenyl)methylene)-2-methylisoindolin-1-one})은 아래 단계를 수행하여 제조하였다.

단계 1: 화합물 A의 제조

단계 2: 실시예 3의 화합물 제조

아르곤 대기하에, 상기 단계 1에서 제조한 화합물 A (158 mg, 0.5 mmol), Na₂CO₃ (212 mg, 2 mmol), Pd(OAC)₂ (22 mg, 0.1 mmol), PPh₃ (52 mg, 0.2 mmol), H₂O (2ml)및 THF (8 ml)를 쉬링크(Schlenk) 튜브에 첨가하였다. 4-메톡시페닐보론산 ((4-methoxyphenyl)boronic acid, Cas No. 5720-07-0, TCI) (1.2 mmol)을 교반 혼합물에 첨가한 다음, 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM (10 mL)으로 추출하고, 염수로 세척하고, MgSO₄로 건조시키고, 여과시켰다. 조 생성물을 실리카 겔상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 실시예 3의 화합물을 수득하였다.

[실시예 3의 화합물]

화합물 DPD의 제조

아래 실험예에서 사용한 화합물 DPD(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione, CAS NO. 142937-55-1)는 아래 단계 1 내지 단계 5를 수행하여 제조하였다 (Molecules. 2018 Oct; 23(10): 2545. 참조).

단계 1: 무수한 (t-butyldimethylsilyloxy)acetaldehyde (1.0 eq)의 THF 용액안에 0 ℃에서 1-propynylmagnesium bromide (0.5 M in THF, 1.3 eq)를 천천히 첨가하였다. 실온에서 3시간동안 교반하였다. 반응물 용액을 회전 증발에 의해 농축시킨 다음에 냉각한 NH4Cl 포화용액을 첨가하여 퀀칭시켰다. 이어서 반응 혼합물을 Et₂O으로 추출하고, 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과시켰다. 노란색 오일형태 물질 1을 얻었다.

단계 2: 얻은 물질 1(1.0 eq)을 MeOH에 녹여서 Dowex50WX8 100-200 mesh (100 mg/1 mL)를 첨가하여 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 생산물을 여과하여 물질 2를 얻었다.

단계 3: 얻은 물질 2(1.0 eq)에다가 cyclohexanone dimethyl ketal (3.0 eq)과 촉매 p-TSA를 참가하여 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응물 용액을 회전 증발에 의해 농축시킨 다음에 다시 Et2O에 녹여서 NaHCO3로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하여 물질 3을 얻었다.

단계 4: 얻은 물질 3은 1:1:1 의 CHCl3/ACN/H2O 용액에 넣고 NaIO4 (4.4 eq)과 RuO2_H2O (2.5% mol)를 첨가하여 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응물 용액을 회전 증발에 의해 농축시킨 다음에 DCM로 추출하고, MgSO4로 건조시켜 물질 4를 얻었다.

단계 5: 얻은 물질 4를 MeOH에 넣어서 Dowex 50WX8 resin를 첨가하여 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 여과시킨 다음에 DPD를 얻었다.

실험예 1. 진지발리스균( P. gingivalis )의 생물막 형성 억제 효과

상기 실시예 1 내지 3의 화합물의 진지발리스균(포르피로모나스 진지발리스)의 생물막 형성 억제 효과를 확인하였다.

진지발리스균(P. gingivalis, 한국구강미생물자원센터(KCOM)에서 분양받아 사용)을 배양한 배지에 실시예 1 내지 3의 화합물을 각각 처리하고, 진지발리스균의 생물막 형성의 정도를 확인하였다.

세포 배양 판(24 웰 플레이트)에 멸균된 커버 유리 슬립(둥근 모양, 12 mm 반지름)을 핀셋을 이용해 각 웰 바닥에 한 장씩 깔고, 진지발리스균(P. gingivalis)이 배양될 배지(BHI 배지 + 보충제)에 세균 간 신호물질 AI-2(Autoinducer-2)의 전구체인 DPD(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione, CAS NO. 142937-55-1) 를 10 μM 되도록 첨가하였다 (상기 배지의 성분인 BHI는 Brain Heart Infusion Medium이며, 보충제로는 헤민 (10 μg/ml)과 비타민 K (0.2 μg/ml)가 사용되었다.). 세균은 DPD를 쿼럼센싱에 이용하면서 세균의 생물막 형성이 증가되는 것으로 알려져 있다.

DPD가 포함된 배지에 실시예 화합물(실시예 1 내지 3의 화합물)을 각각 희석하여, 화합물의 최종 농도가 각각 0.002 μM, 0.02 μM, 0.2 μM, 2 μM 이 되도록 제조하였다.

만들어진 배양액을 유리 슬립이 깔린 세포 배양판에 분주하고 세균을 2 x 10⁸ cell/ml 이 되도록 접종하였다. 실시예 화합물을 처리하지 않은 양성대조군(DPD)의 경우 배지(BHI 배지 + 보충제)에 DPD를 첨가한 뒤, 동일 수의 세균을 접종하였다. 실시예 화합물과 DPD를 모두 처리하지 않은 음성대조군(CT)의 경우, 배양 배지(BHI 배지 + 보충제)에 DPD 대신 PBS(Phosphate Buffered Saline)를 동일한 양만큼 넣어주었다. 완성된 세포 배양판은 37 ℃, 혐기성 조건(10% H₂, 10% CO₂ 및 80% N₂)에서 48 시간 동안 유지시키며 세균을 배양하였다.

각 그룹별로 배양된 세균들이 유리 슬립에 형성한 생물막(Biofilm)은 1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 용액으로 15분 동안 염색시킨 후, PBS(Phosphate buffered saline) 용액으로 3번 세척한 후 아세톤-알콜(20:80,vol/vol)로 탈색하였다. 크리스탈 바이올렛을 포함한 탈색용액을 그룹별로 마이크로플레이트에 200 μl 씩 담은 후 흡광 마이크로플레이트 리더기(Absorbance Microplatereader, Epoch2, Bio-Tek,USA)를 사용하여 흡광도(OD_590nm)를 측정하고 그룹별로 비교 및 분석하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 진지발리스균을 배양하지 않은 배지(NT)에는 생물막 형성이 보이지 않았다. 배지에 PBS를 넣어 진지발리스균을 배양한 배지(CT)와 비교하여, 배지에 DPD를 넣어 진지발리스균을 배양한 배지(DPD)의 경우, 쿼럼센싱 작용을 통해 진지발리스균의 생물막 형성이 유의하게 증가하였다. 배지에 DPD와 실시예 화합물을 함께 넣어 진지발리스균을 배양한 배지(DPD+실시예 1, DPD+실시예 2, DPD+실시예 3)의 경우, DPD에 의하여 증가된 진지발리스균의 생물막이 실시예 화합물의 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다.

비교실험

상기 실시예 1 내지 실시예 3의 화합물이 비교예 화합물보다 우수한 효과가 있음을 입증하기 위하여, 아래와 같은 실험을 수행하였다. 비교예 화합물은 한국 특허공개공보 (KR 10-2019-0130983 A)의 <실시예 1>의 화합물 ((Z)-3-(브로모(페닐)메틸렌)이소벤조퓨란-1(3H)-온)을 사용하였다.

1. 진지발리스균( P. gingivalis )의 생물막 형성 억제 효과

실시예 2의 화합물과 비교예 화합물의 포르피로모나스 진지발리스 균의 생물막 형성 억제 효과를 확인하였다. 실험과정은 실험예 1과 동일한 방법으로 진행하였으며, 실험결과를 도 3a 내지 도 3e에 나타내었다.

도 3a 내지 도 3e에서 확인할 수 있는 바와 같이, 진지발리스균을 배양하지 않은 배지(NT)에는 생물막 형성이 보이지 않았다. 배지에 PBS를 넣어 진지발리스균을 배양한 배지(CT)와 비교했을 때, 배지에 DPD를 넣어 진지발리스균을 배양한 배지(DPD)의 경우에서 쿼럼센싱 작용을 통해 진지발리스균의 생물막 형성이 유의하게 증가하였다. 배지에 DPD와 화합물을 함께 넣어 진지발리스균을 배양한 배지(DPD+비교예, DPD+실시예 2)의 경우, DPD에 의하여 증가된 진지발리스균의 생물막이 화합물의 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였으며, 동일 농도에서의 진지발리스균의 생물막 형성 억제능 비교에서 비교예 화합물에 비해 실시예 2 화합물의 생물막 형성 억제능이 더 좋은 것을 확인하였다.

2. 혈장안정성

실시예 2의 화합물과 비교예 화합물의 인간 혈장 및 래트 혈장에서의 혈장안정성을 비교하였다.

1) 시료준비

실시예 2의 화합물 및 비교예 화합물과, 양성대조군으로 사용되는 물질(Eucatropine, Loterpresnol)을 DMSO에 녹여 10 mM 농도의 표준원액(stock solution)으로 만들었다. 그 후 각 시험물질의 표준원액을 희석하여 0.2 mM와 1 mM의 표준용액(working solution)으로 제조한 뒤 시험에 사용하였다 (비교예 화합물의 경우 70% acetonitrile, 실시예 2의 화합물의 경우 50% acetonitrile을 용매로 사용).

2) 시험방법

양성대조군과 시험물질 표준용액을 2종(인간, 래트)의 혈장(plasma)이 각각 1 μM, 5 μM의 농도로 포함된 튜브(tube)에 넣은 후, 37 ℃에서 시간(0, 30, 60, 120, 240 minutes)에 따라 흔들어 섞어주면서 배양하였다. 각 시간마다 혼합액 샘플을 반응 종료액(quench reagent)이 400 μl이 포함된 세포배양판(96 well plate)에 100 μl씩 분주하여 시험을 종료시키고, 원심분리(5000 x g, 10 min)한 후 상층액을 100 μl 걷어내어 200 μl의 고순도수(ultrapure water)와 섞어준 뒤 해당 용액을 LC-MS/MS 시스템에 주입하여 각 시간대의 약물을 분석함으로써 비교예와 실시예 2의 화합물에 대한 혈장안정성을 평가하였다.

3) 시험결과

인간 혈장에서의 안정성을 나타내는 결과를 도 4a(비교예 화합물) 및 도 4b (실시예 2의 화합물)에, 래트 혈장에서의 안정성을 나타내는 결과를 도 4c(비교예 화합물) 및 도 4d(실시예 2의 화합물)에 나타내었다.

도 4a 내지 도 4d에서 확인할 수 있는 바와 같이, 비교예 화합물은 인간 혈장 및 래트 혈장에서 시간이 흐름에 따라 혈장에 남아있는 화합물의 양이 감소하였으나, 실시예 2의 화합물은 혈장에 안정적으로 남아있는 것을 확인하였다.

실험예 2. 진지발리스균( P. gingivalis )의 진지페인 발현 억제 효과

진지발리스균을 배양한 배지에 실시예 화합물을 각각 처리하고, 진지발리스균이 생성하는 주요 병독력 인자이자 단백질 분해효소인 3가지 진지페인(gingipain) 단백질((Lysine-gingipain (Kgp), Arginine-gingipain A (RgpA), 및 Arginine-gingipain B (RgpB))의 발현의 정도를 확인하였다.

세균 간 신호물질(Autoinducer-2)의 전구체인 DPD (4,5-dihydroxy -2,3- pentane dione) 10 μM 과 실시예 화합물 2 μM을 포함하거나 또는 실시예 화합물을 포함하지 않은 배양액을 세포배양판(48 웰 플레이트)에 각 분주한 뒤, 진지발리스균(2x10⁸ cell/ml)을 군별로 접종하였고, 세균이 접종된 배양액은 37 ℃ 혐기성 조건(10% H₂, 10% CO₂ 및 80% N₂)에서 48시간 동안 배양하였다.

48시간 후 각 배양액을 13,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, easy-BLUETM Total RNA Extraction kit (iNtRON Biotechnology, Sungnam, Korea)를 이용하여 total RNA를 추출 후, cDNA를 합성한 뒤 real-time PCR 기법으로 진지페인 유전자의 발현을 확인하였다. cDNA는 AccuPower ® CycleScript RT PreMix dN6 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용해 합성하였고, Power SYBR^TM Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time (quantitative) reverse transcription PCR, RT-qPCR)을 실시하였다.

증폭에 사용한 primer sequence는 아래 표 1에 나타내었으며 RT-qPCR 증폭 조건은 95 ℃에서 3분간 효소를 활성화(enzyme activation)한 후, 95℃에서 10초간 변성(denaturation), 60 ℃에서 30초간 프라이머 결합(annealing) 과정을 40회 반복하였고, Bio-Rad CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용해 분석하였다. 진지페인 유전자의 발현 수준을 정규화(normaliztion)하기 위해 16s rRNA 유전자를 사용하였으며 Comparative Ct Method(ΔΔCt)를 이용하여 유전자 발현량을 계산하여 이를 도 5a 내지 도 5c에 나타내었다.

유전자	프라이머 시퀀스
Lysine-gingipain (Kgp)	fwd: 5'-CAACCAAAGCCAAGAAGA-3' (서열번호 1)rev: 5'-CGAAGCTGAAGTAGGAAC-3' (서열번호 2)
Arginine-gingipain A (RgpA)	fwd: 5'-GCTCTTTCCATAAACGTAAG-3' (서열번호 3)rev: 5'-GACACTCGTGAGATGAAG-3' (서열번호 4)
Arginine-gingipain B (RgpB)	fwd: 5'-CTTCCACTTTCACATCCTTTA-3' (서열번호 5)rev: 5'-CTGACGATGGTGATATGG-3' (서열번호 6)
16s rRNA	fwd: 5'-ACGAGTATTGCATTGAATG-3' (서열번호 7)rev: 5'-ACCCTTTAAACCCAATAAATC-3' (서열번호 8)

도 5a 내지 도 5c에 나타난 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 군(control, 대조군)과 비교하여, AI-2의 전구체인 DPD를 처리한 군(DPD)의 경우 진지발리스균이 쿼럼센싱 신호분자를 인식하여 3가지 진지페인 유전자(rgpA, rgpB, kgp)의 발현량이 모두 대조군보다 증가하였다. DPD와 실시예 화합물을 각각 함께 처리한 군(DPD+실시예 1, DPD+실시예 2)의 경우, DPD에 의해 증가된 3가지 진지페인 유전자의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다.

실험예 3. 세포 독성 평가

실시예 화합물이 마우스 골수유래 대식세포에서 세포 독성을 나타내는지 여부를 평가하였다.

분화된 대식세포는 1x10⁶ cell/ml의 농도로 48 well plate에 200 μl씩 seeding 하고 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 12시간 동안 안정화하였다. 배양한 세포의 상층액을 제거한 후 Serum free 배지에 실시예 2의 화합물은 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 μM 농도로 희석하여 200 μl씩 처리하고 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다.

이후 배양한 세포의 상층액을 제거하고 400 μg/ml 농도의 MTT 용액을 200 μl 처리한 후 7 ℃, 5% CO₂ 조건에서 4 시간 반응하였다. 이후 반응액을 제거하고 DMSO를 200 μl 첨가, 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 때, 아무것도 처리하지 않은 세포의 세포 생존율을 100% 기준으로 하여, 시료를 처리한 세포의 생존율을 계산하여 도 6에 나타내었다.

도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 2의 화합물은 마우스 골수유래 대식세포에서 16 μM 이하의 농도에서는 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Quorum Bio Co., Ltd. <120> Novel compound and composition for preventing, improving, or treating periodontal disease comprising the same as an active ingredient <130> DPP20214868KR <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_Lysine-gingipain (Kgp)_fwd primer <400> 1 caaccaaagc caagaaga 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_Lysine-gingipain (Kgp)_rev primer <400> 2 cgaagctgaa gtaggaac 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_Arginine-gingipain A (RgpA)_fwd primer <400> 3 gctctttcca taaacgtaag 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_Arginine-gingipain A (RgpA)_rev primer <400> 4 gacactcgtg agatgaag 18 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_Arginine-gingipain B (RgpB)_fwd primer <400> 5 cttccacttt cacatccttt a 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_Arginine-gingipain B (RgpB)_rev primer <400> 6 ctgacgatgg tgatatgg 18 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_16s rRNA_fwd primer <400> 7 acgagtattg cattgaatg 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_16s rRNA_rev primer <400> 8 accctttaaa cccaataaat c 21

Claims

아래 화합물들로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물, 이의 이성질체, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
1) 3-(디페닐메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(diphenylmethylene)-2-methylisoindolin-1-one},
2) 3-(디-p-톨릴메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(di-p-tolylmethylene)-2-methylisoindolin-1-one}, 및
3) 3-(비스(4-메톡시페닐)메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(bis(4-methoxyphenyl)methylene)-2-methylisoindolin-1-one}.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 3-(디-p-톨릴메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(di-p-tolylmethylene)-2-methylisoindolin-1-one}인 것인, 약학적 조성물.
삭제
삭제
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 치주질환의 예방 또는 치료는 진지페인의 발현 억제를 통해 이루어지는 것인, 약학적 조성물.
아래 화합물들로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염:
i) 3-(디-p-톨릴메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(di-p-tolylmethylene)-2-methylisoindolin-1-one}, 및
ii) 3-(비스(4-메톡시페닐)메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(bis(4-methoxyphenyl)methylene)-2-methylisoindolin-1-one}.
제7항에 있어서, 상기 화합물은 3-(디-p-톨릴메틸렌)-2-메틸이소인돌린-1-온{3-(di-p-tolylmethylene)-2-methylisoindolin-1-one}인 것인,
화합물, 이의 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염.
하기 화학식 4의 화합물에 페닐보론산 (phenylboronic acid, Cas No. 98-80-6), 4-메틸페닐보론산 (4-Methylphenylboronic Acid, Cas No. 5720-05-8), 또는 4-메톡시페닐보론산 ((4-methoxyphenyl)boronic acid, Cas No. 5720-07-0)을 도입하는 단계를 포함하는, 제7항 또는 제8항의 화합물의 제조방법:
[화학식 4]

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