KR102465341B1 - 간, 담관 및 췌장 장애의 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하나 이상의 디펜신의 투여에 의한 간, 담관 및 췌장 장애의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 몇몇 대사 장애의 치료가 또한 본 명세의 범위내에 포함된다.

Description

간, 담관 및 췌장 장애의 치료

본 발명은 하나 이상의 디펜신 (defensin)의 투여에 의한 간, 담관 및 췌장 장애의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 몇몇 대사 장애 (metabolic disorder)의 치료가 또한 본 명세의 범위내에 포함된다.

장내 미생물군

비만 및 비만관련 질병과 같은 통상장애의 점점 증가하고 있는 유병률은 서구화된 생활양식 및 식사와 긴밀히 관련된다. 가장 두드러진 비만-관련 질병은 인슐린 내성, 진성 2형 당뇨병(T2D) 및 몇몇 암이다(Faulds & Dahlman-Wright, 2012). 이들 질병의 병인은 복잡하지만, 이들 중 다수는 조절이상 장내 미생물군 및 대사체로부터 기원할 수 있는 저등급 염증의 일반적인 상태를 특징으로 한다(Everard & Cani, 2013; Belkaid & Hand, 2014). 현대적인 인간 생활양식 및 육고기 생산과 관련된 도전들은 멀리 떨어져 있는 듯 보일 수 있지만, 손상된 장 건강은 공통분모인 것으로 보여진다. 조절이상 장건강은 실제로 비만(Ridaura et al, 2013), T2D(Qin et al, 2012), 류머티스성 관절염(Zhang et al, 2015) 및 결장직장암(Feng et al, 2015)과 같은 다수의 다양한 질병들과 관련이 있다. 최근에, 이웃하는 지역들과 비교하여 핀랜드에서 장내 미생물군 및 특히 박테로이데스(Bacteroides)로부터의 몇몇 리포폴리사카라이드의 존재와 1형 당뇨병의 보다 높은 발병률간의 관련성이 보고되었다(Leviten 2016).

비만 및 그의 동반되는 저등급 염증은 조절이상 대사 항상성의 강한 추진요인을 형성한다. 턴바우(Turnbaugh) 등(2006)은 비만-관련된 미생물군이 증가된 에너지 수확 능력을 가지며, 무균 마우스가 비만 마우스로부터의 미생물군 이식 2주 후에, 야윈 마우스로부터의 유사한 이식보다 현저하게 더 큰 지방 질량의 증가를 보임을 발견하였다. 턴바우 등(2008)은 장내 미생물 조성의 변화가, 일시적으로 고 지방/당 "서구식" 식사가 공급된 마우스에서 원래 식사로 다시 이동 후에 완전히 역전됨을 추가로 및 중대하게 발견하였다. 이러한 발견은 브리즈(Vrieze) 등(2012)에 의해 인간에서 확인되었으며, 상기 브리즈 등은 야윈 인간 공여자로부터의 장내 미생물군의 전달이 대사 증후군이 있는 개인에서 인슐린 민감성을 증가시킴을 입증하였다.

체중 및 체중증가율을 증가시키기 위한 장내 미생물군의 조작이 저-용량 항생제 및 프로바이오틱스, 예를 들어 락토바실러스 인글루비에이(Lactobacillus ingluviei)의 사용을 통해 농업용 가축에 수년간 사용되어 왔다. 체중 증가를 위한 장내 미생물군 조작은 치킨(Khan et al, 2007), 오리(Angelakis & Raoult, 2010), 및 마우스(Angelakis et al, 2012)에서 입증되었다. 인간에서, 항생제를 수용한 유아가 또한 그의 대조군보다 더 큰 것으로 밝혀진 반면(Trasande et al, 2012), 경구 항생제에의 조기 노출은 아동에서 과체중과 관련된다(Ajslev et al, 2014). 임신한 여성에서, 임신 3개월째 지방과다의 생리학적 증가 및 임신성 당뇨의 잠재적인 발생이 또한 장내 미생물군의 엄청난 변화와 관련있는 것으로 보인다(Koren et al, 2012).

장점막은 외부 환경에 노출되는 가장 큰 체표면(대략적으로 200 ㎡)이다. 이와 같이, 장 표면은 외부 물질, 식사로부터 유래되는 대사산물(대사체), 및 장에 거주하는 추정상 10¹⁴ 세균-장내 미생물군-과 긴밀히 접촉하고 있다. 따라서 장 장벽은 끊임없이 집중적인 면역감시하에 있으며, 면역계, 식사 성분 및 장내 미생물군들간에 동역학적 크로스토크를 요한다. 식사 개입은 면역 조절(Mowat & Agace, 2014) 및 장내 미생물군 조성(Walter, 2015)(이 둘은 모두 대사 항상성에 독립적이고 상승작용적으로 영향을 미친다)에 막대한 영향을 미친다. 이에 관하여, 2개의 매우 최근의 논문은 대사 항상성에 대한 미생물군-조절된 변화에 있어서 식품 첨가제의 (불리한) 잠재성을 강조하고 있다. 최근의 논문(Chassaing et al, 2015)은 식이성 유화제가 조절이상 장내 미생물군의 도입에 의해 어떻게 글루코스 내성을 해치며, 따라서 대장염 민감성뿐만 아니라 체중 증가를 증가시키는 지를 예시하였다. 상기 관찰들은 무균(GF) 마우스에서 재연될 수 없었으며, 이는 상기 장내 미생물군의 중요한 역할을 암시하였다. 유사하게, 수에즈(Suez) 등(2014)은 최근에 칼로리가 없는 인공 감미료가 어떻게 상기 장내 미생물군의 변경을 통해 대사 기능장애를 유발하는 지를 입증하였다. 상기 저자들은 GF 마우스로의 변 이동(그 후에 상기 GF 마우스는 글루코스 내성을 급속히 나타내었다)에 의해 그들의 발견을 입증하였다. 이러한 관찰은 GF 마우스에서 선구적 연구를 잘 보여주며(Backhed et al, 2007), 이는 대사 건강의 유지에 있어서 장내 미생물군의 역할을 설명한다. 상기 연구는 공생미생물의 부재하에서(이로 인해 불균형한 점막 면역 항상성이 야기된다) 지방 조직의 크기가 감소하고 고지방 식사에 대한 응답이 감소함을 보였다. 건강한 표현형으로서 통상적으로 나타나는 체중 증가의 결여에도 불구하고, 이소성 지질 축적(간 지방증 & 혈청 트리글리세라이드의 증가된 수준)이 중증 대사 장애를 생성시켰다. 인간에서, 상기 미생물군의 유전자 풍부성은 건강한 표현형과 관련되는 반면, 유전자 빈곤(낮은 유전자수)은 대사 장애의 증가된 위험성과 상관있음이 입증되었다(Chatelier et al, 2013).

베르텐부르흐(Wertenbruch) 등(2015)은 항균 펩티드 LL-37/CRAMP(카텔리시딘), 인간 베타 데펜신 2 및 보체인자 C5a의 수준이 건강한 대조군에 비해 간 질병이 있는 환자의 혈청에서 상승함을 입증하였다. 3개 마커 모두에 대한 혈청 수준은 건강한 대조군의 경우 비교적 낮지만 간 환자의 경우 상기 수준의 광범위한 변화가 존재한다. 상기 저자들은 상기 hBD-2의 상승된 수준이 담즙 상피의 증가된 재형성을 반영할 수도 있다고 억측하고 있다.

하라다(Harada) 등(2004)은 간내 담즙 상피세포, 세포주 및 담즙 중 hBD1 및 hBD-2의 수준을 연구하였다. hBD-2 발현이 활동성 염증 동안 담도에서 발견되었다. 상기 담즙 수준은 CRP의 혈청 수준과 상관있는 것으로 밝혀졌다. 상기 저자들은 hBD-2가 국소 감염 또는 활동성 염증에 응답하여 발현되며 hBD1은 담즙 항균 방어 체계의 기존의 성분일 수도 있다는 결론을 내리고 있다.

디펜신

디펜신은 건강한 미생물군유전체를 유지하고 잠재적인 병원체를 막는 작용을 하는 우성의 선천적인 숙주 방어물 중 하나를 나타낸다(Wehkamp et al, 2002 및 Salzman et al, 2007). 디펜신은 그람 양성 및 음성 세균, 진균 및 고세균에 대한 항균 활성뿐만 아니라 소염 사이토킨을 증가시키고 염증성 사이토킨을 감소시키는 소염 활성을 갖는 펩티드이다.

인간 디펜신은 그의 3개의 분자내 시스테인 디설파이드 결합의 위상을 기준으로 α- 및 β-디펜신으로 분류될 수 있는 작은 양이온성 펩티드이다. 상기 인간 α-디펜신을, 호중구 과립으로부터 최초로 단리된 것들(HNP1-4) 및 소장의 움에서 파네트 세포에 의해 발현되는 장내 디펜신(HD5 및 HD6 또는 DEFA5 및 DEFA6)으로 추가 세분할 수 있다. 상기 β-디펜신(DEFBn)은 주로 피부, 눈, 중이, 입, 기관지, 폐, 위장관, 간, 비뇨생식계, 신장, 질, 췌장 및 유선을 포함한 다양한 조직 및 기관 중의 상피세포에 의해 생산된다. 인간 β-디펜신과의 가장 잘 특성화된 구성원은 hBD1-4이다. 상기 인간 디펜신 중 일부는 본질적으로 생성되는 반면, 다른 것들은 염증전 사이토킨 또는 외인성 미생물 생성물에 의해 유도된다. 상기 인간 디펜신 중 일부는 이미 임신기간에 증가된 수준으로 양수에서 발현되어, 자궁에서 태아를 보호한다. 젖 및 특히 최초의 젖인 초유는 α- 및 β-디펜신 모두 및 카텔리시딘을 함유하지만, 이들 중 단지 소수만이 모유에 유의수준의 농도로 발견된다(Armogida et al, 2004).

리우(Liu) 등(2008)은 HNP-1 및 HNP-2(둘 다 백혈구에 의해 생성되며 혈 중 α-디펜신의 하위그룹에 속한다)가 고전적인 인슐린 신호전달 경로와 명백하게 상이한 세포내 기전을 통해 단리된 간세포에서 글리코겐 분해 및 글루코스 신생합성을 억제할 수 있음을 발견하였다.

CN104971343은 고지방 식사 및 비타민 D 결핍 식사를 한 마우스가 대사증후군에 걸림을 보고한다. 장기간의 상기와 같은 비타민 D-결핍 식사 후 디펜신의 발현은 하향-조절되며 따라서 디펜신 결핍에 이른다. 25일에 걸쳐 디펜신 HD5의 4회 투여는 부분적으로 혈장 글루코스 수준의 감소를 생성시키지만, 인슐린 내성 또는 항상성 모델 평가와 관련된 데이터는 존재하지 않는다. CN104971343은 정상적인 비타민 D 수준의 고지방 식사를 한 마우스에 대한 디펜신 HD5의 투여가 간, 췌장 또는 담관의 장애들을 치료할 수 있음을 개시하지 않는다.

상기 종래 기술은 카텔리시딘, 보체 및 베타-디펜신과 증가된 담즙 염증 또는 감염과의 상관성을 개시하고 있지만, 디펜신을 사용하여 상기 간, 췌장 또는 담관의 장애를 치료할 수 있음은 교시하거나 제시하고 있지 않다.

발명의 요약

본 명세서는 경구로 투여된 포유동물 장내 α- 및 β-디펜신이 중심성(복부 또는 내장) 체중 증가 및 지질 축적을 포함한 체중 증가를 예방하거나 치료하는 능력을 가짐을 입증한다. 상기 데이터는 포유동물 α- 및/또는 β-디펜신의 투여가 간암 및 간성 뇌병증, 담관 및 췌장을 포함한 간 질병 또는 장애뿐만 아니라 몇몇 대사 장애를 치료함을 가리킨다.

고지방 식사를 한 마우스에게 알파 또는 베타 디펜신의 투여는 간 및 내장 지방, 지방증 마커 및 간 지질 대사 마커의 발현에 영향을 미쳤으며, 이는 상기가 간 지방 및 지방증을 감소시킴을 나타낸다. 사료 섭취, 사료 효율, 지방 흡수 및 분비는 영향을 받지 않았으며, 이는 디펜신의 투여가 식욕을 변경시키지 않음을 보인다.

실시예 1에 따라, 인간 베타-디펜신 2(hBD-2)의 투여량은 고지방 식사 중인 마우스에서 체중 증가를 감소시키기에 충분하였다. 상기 hBD-2의 섭취는 주로 지방 질량 증가를 감소시켰다. 발명자들은 우세하게는 복부, 즉 간 및 내장 지방 질량 증가가 감소된다는 가설을 최초로 세웠으며; 실시예 2는 고지방 식사 중 hBD-2의 섭취 후 간 질량의 감소 성향이 관찰되는 동시에 내장 지방 질량이 실제로 현저하게 감소되었음을 보인다. 글루코스 도전 중 글루코스 내성 및 글루코스 자극된 인슐린 응답 모두 hBD-2 투여시 개선되었다. 지방 축적과 상관있는 것으로 공지된 마커의 발현은 현저하게 감소되었다. 중요하게, 음식물 섭취는 식사의 유형에 그다지 영향을 받지 않았다. 고지방 식사를 한 마우스에게 알파 디펜신 HD5의 투여는 증가된 지방산 대사를 생성시켰다.

실시예 4에 나타낸 바와 같이, 비만 마우스에게 hBD-2의 투여는 유사한 음식물 섭취에 대해서 hBD-2를 수용하지 않은 비만 마우스에 비해, 상기 투여에 이어서 체중 증가가 감소하는 경향이 있었다. hBD-2의 투여는 전체 체중의 지방 백분율을 감소시켰으며 글루코스 내성 및 인슐린 내성을 급속히 개선시켰다. 유사한 결과가 HD5의 투여시 관찰되었다.

글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 유사체의 투여는 고지방 식사를 한 마우스에서 체중 강하 효과를 가졌으며, 간에서 감소된 지방 축적 및 보다 낮은 혈장 콜레스테롤 수준을 생성시켰다.

대체로, 본 명세서에서 제공된 데이터는 알파 디펜신, 베타 디펜신, GLP-1 및 GLP-1 유사체를 사용하여 간, 담관, 또는 췌장 질병 또는 장애를 치료할 수 있음을 나타낸다.

하나의 태양에서, 본 명세서는 간, 담관, 췌장 또는 대사 질병 또는 장애의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 질병 또는 장애의 치료가 필요한 대상체(subject)에게 유효량의 포유동물 α-디펜신 및/또는 β-디펜신 및/또는 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체를 투여함을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 명세서는 간암, 담관암종 또는 췌장암의 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 포유동물 α-디펜신 및/또는 β-디펜신 및/또는 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체를 단독으로 또는 방사선-, 화학- 또는 면역요법과 함께 투여함을 포함한다.

더욱 또 다른 태양에서, 본 명세서는 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 포유동물 α-디펜신 및/또는 β-디펜신 및/또는 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체에 관한 것이다.

더욱 또 다른 태양에서, 본 명세서는 선행 청구항들 중 어느 한 항에 따른 치료를 위한 약제의 제조를 위한 포유동물 α-디펜신 및/또는 β-디펜신 및/또는 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체의 용도에 관한 것이다.

도 1. 마우스 대사에 대한 포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신의 효과를 조사하기 위한 실험 셋업의 도식적 개략도. -1주째에, 마우스를, 우리당 마우스 3마리 및 그룹당 케이지 4개가 존재하도록 그룹 및 케이지로 분할하였다. -1 내지 0주째에, 상기 마우스를 지방 분포의 평가를 위해 자기 공명 스캔에 의해 임상적으로 검사하였다. 0, 1 및 4주째에, 변의 미생물군유전체를 분석하였다. 4주째에, 상기 미생물군의 분석 외에, 상기 마우스를 스캐닝하고 혈당 및 인슐린 수준을 측정하였다. 6주째에, 에너지 소비를 상기 변의 질소 및 지질 함량을 분석함으로써 평가하였다. 7주째에, 인슐린 내성 시험(ITT)을 수행하였다. 8주째에, 경구 글루코스 내성 시험(OGTT) 및 글루코스-자극된 인슐린 분비(GSIS)를 수행하였다. 9주째(종료)에, 여러가지 분석을 수행하였다, 특히 상기 마우스를 칭량하고 스캐닝하고, 결장, 맹장 및 소장의 혈장 조성 및 미생물군 조성을 평가하였다. 또한, 단백질/RNA 분석을 근육 조직(사두근), iWAT, eWAT, iBAT, 간, 결장, 공장, 회장 및 십이지장에서 수행하였다. 조직학적 분석을 근육 조직(사두근), iWAT, eWAT, iBAT, 간, 결장, 공장, 회장 및 십이지장에서 수행한다.
도 2. 마우스 대사에 대한 포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신의 효과를 조사하기 위한 실험 셋업의 도식적 개략도. -1주째에, C57/BL/6J 마우스가 도착하였다. 0주째에, 변을 수집하였다. 0주 내지 12주째 실행 중에 상기 마우스에게 고지방 식사를 공급하였다. 12주째에, 상기 마우스를 지방 분포의 평가를 위해 자기 공명 스캔에 의해 임상적으로 검사하고, 변을 수집하고 경구 글루코스 내성 시험(OGTT) 및 글루코스-자극된 인슐린 분비(GSIS)를 수행하였다. 13-0주째에, 상기 마우스를, 우리당 마우스 4마리 및 그룹당 케이지 3개로 그룹 및 케이지로 분할하였다. 0, 12 및 13-10주째에, 변의 미생물군유전체를 분석하였다. 13-2, 13-4, 13-6, 13-8 및 13-10주째에, 상기 마우스를 스캐닝하고 혈당 및 인슐린 수준을 측정하였다. 13-9주째에, 인슐린 내성 시험(ITT)을 수행하였다. 13-10주째(종료)에, 여러가지 분석을 수행하였다, 특히 상기 마우스를 칭량하고 스캐닝하고, 결장, 맹장 및 소장의 혈장 조성 및 미생물군 조성을 평가하였다. 또한, iWAT, eWAT 및 간 중량을 측정하였다.
도 3. 인간 베타 디펜신 1-4의 클러스탈(Clustal) W(2.1) 다중 서열 정렬.
도 4. 인간 알파 디펜신 5 및 6의 클러스탈 W(2.1) 다중 서열 정렬.
도 5. 인간 호중구 펩티드 1-3의 클러스탈 W(2.1) 다중 서열 정렬.
도 6. 인간, 붉은털 원숭이, 침팬지, 오랑우탄, 염소, 양, 소, 말, 돼지 및 마우스 베타 디펜신 2의 클러스탈 W(2.1) 다중 서열 정렬.
상기 클러스탈 W 정렬에서:
*는 단일의 완전히 보존된 잔기를 갖는 위치들을 가리킨다.
:는 하기 '강한' 그룹들 중 하나가 완전히 보존됨을 가리킨다:
-S,T,A; N,E,Q,K; N,H,Q,K; N,D,E,Q; Q,H,R,K; M,I,L,V; M,I,L,F; H,Y; F,Y,W.
.는 하기 '보다 약한' 그룹들 중 하나가 완전히 보존됨을 가리킨다:
-C,S,A; A,T,V; S,A,G; S,T,N,K; S,T,P,A; S,G,N,D; S,N,D,E,Q,K; N,D,E,Q,H,K; N,E,Q,H,R,K; V,L,I,M; H,F,Y.
도 7: 저지방 식사(LFD), 고지방 식사(HFD) 또는 HFD 및 디펜신 hBD-2(HFD + P2)에 의한 마우스의 7주 처리 동안의 체중 변화(a) 및 체중 발달(b) 및 누적 사료 섭취(c).
도 8: 저지방 식사(LFD), 고지방 식사(HFD) 또는 HFD 및 디펜신 hBD-2(HFD + P2)에 의한 마우스의 7주 처리 동안의 제지방/지방 질량 () 발달. (a) 1주 및 7주째의 제지방 발달. (b) 1주 및 7주째의 지방 질량 발달.
도 9: 저지방 식사(LFD), 고지방 식사(HFD) 또는 HFD 및 디펜신 hBD-2(HFD + P2)에 의해 7주간 처리된 마우스에서 글루코스 항상성. (a) 인슐린 내성 시험(ITT). (b) 경구 글루코스 내성 시험. (c) 글루코스 자극된 인슐린 분비(GSIS). (d) 5-시간 공복 인슐린 시험.
도 10: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 hBD-2에 의한 예방 처리(고지방 + hBD-2)에 의한 마우스의 10주 처리에 걸친 체중 발달(A) 사료 효율(B) 및 에너지 섭취(C). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + hBD-2 = B; 고지방 대 고지방 + hBD-2 = C. (A) 체중 발달. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들). (B) 사료 효율(케이지에서 평균 사료 섭취에 대해 조정된 증가된 체중의 그램). 터키 보정과 함께 일원 ANOVA NB! 동시-수용으로 인한 보정 n=4. (C) 에너지 섭취. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들).
도 11: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 hBD-2에 의한 예방 처리(hBD-2)에 의한 마우스의 10주 처리에 걸친 전체 체중의 퍼센트로서 지방(A), 간 중량 그램(B) 및 정소상체 지방(eWAT) 중량 그램(C). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + hBD-2 = B; 고지방 대 고지방 + hBD-2 = C. (A) 상이한 주수 후의 전체 체중의 지방 백분율. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들). (B) 종료시 정소상체 지방 조직(내장 AT)의 중량. 터키 보정과 함께 일원 ANOVA. (C) 종료시 체중. 터키 보정과 함께 일원 ANOVA.
도 12: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 hBD-2에 의한 예방 처리(고지방 + hBD-2)에 의해 10주간 처리된 마우스에서 글루코스 항상성. (A) 경구 글루코스 내성 시험. (B) 글루코스 자극된 인슐린 분비(GSIS). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + hBD-2 = B; 고지방 대 고지방 + hBD-2 = C. (A) 7주의 경구 글루코스 내성 시험. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들). (B) oGTT 중에 측정된 7주째의 글루코스-자극된 인슐린 분비. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들).
도 13: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 hBD-2에 의한 예방 처리(고지방 + hBD-2)에 의해 10주간 처리된 마우스에서 글루코스 항상성. (A) 인슐린 내성 시험(ITT). (B) HOMA-IR. 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + hBD-2 = B; 고지방 대 고지방 + hBD-2 = C. (A) 8주의 인슐린 내성 시험. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들). (B) 9주의 항상성 모델 평가(HOMA). 터키 보정과 함께 일원 ANOVA.
도 14: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 hBD-2에 의한 예방 처리(고지방 + hBD-2)에 의해 10주간 처리된 마우스의 간에서 페록시솜 증식인자 활성화된 수용체 감마(PPARγ2) 발현(a) 및 페록시솜 조-효소 A 옥시다제 1(Acox1) 발현(b).
도 15: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 hBD-2에 의한 개입 처리(고지방 + hBD-2)에 의한 마우스의 10주 처리에 걸친 체중 발달(A) 및 체중 변화(B). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + hBD-2 = B; 고지방 대 고지방 + hBD-2 = C. (A) 체중 발달. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들). (B) 실행 기간의 끝에서 13주째로부터 다음 10주의 실험 식사에 대한 체중 변화. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들).
도 16: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 hBD-2에 의한 개입 처리(hBD-2)에 의한 마우스의 10주 처리에 걸친 전체 체중의 퍼센트로서 지방(A) 및 0-4주간의 지방 변화% 그램(B). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + hBD-2 = B; 고지방 대 고지방 + hBD-2 = C. (A) 상이한 주수에서 전체 체중의 지방 백분율. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들). (B) 실행의 끝에서부터 4주의 실험 식사에 대한 지방 백분율의 변화. 터키 보정과 함께 일원 ANOVA.
도 17: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 hBD-2에 의한 개입 처리(hBD-2)에 의한 마우스의 10주 처리에 걸친 간 중량 그램(A) 및 정소상체 지방(eWAT)의 중량 그램(B). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + hBD-2 = B; 고지방 대 고지방 + hBD-2 = C. (A) 종료시의 간 중량. 터키 보정과 함께 일원 ANOVA. (B) 종료시 정소상체 지방 조직(내장 지방)의 중량. 터키 보정과 함께 일원 ANOVA.
도 18: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 hBD-2에 의한 개입 처리(고지방 + hBD-2)에 의해 10주간 처리된 마우스에서 글루코스 항상성. (A) 케이지 1로부터 경구 글루코스 내성 시험. (B) 마우스 D1으로부터 경구 글루코스 내성 시험. (C) 인슐린 내성 시험(ITT). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + hBD-2 = B; 고지방 대 고지방 + hBD-2 = C. (A) 실행 기간의 끝에서부터(13-0주) 2주마다 반복된 경구 글루코스 내성 시험(고지방 + hBD-2 그룹의 첫 번째 케이지를 나타낸다). (B) 실행 기간의 끝에서부터(13-0주) 2주마다 반복된 경구 글루코스 내성 시험(고지방 + hBD-2 그룹의 오직 마우스 D1만을 나타낸다). (C) 9주의 인슐린 내성 시험. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들).
도 19: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 hBD-2에 의한 개입 처리(hBD-2)에 의한 마우스의 10주 처리에 걸쳐 처리된 마우스의 간에서 페록시솜 증식인자 활성화된 수용체 감마(PPARγ2) 발현(A) 및 페록시솜 조-효소 A 옥시다제 1(Acox1) 발현(B).
도 20: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 hBD-2에 의한 개입 처리(고지방 + HD5)에 의한 마우스의 10주 처리에 걸친 체중 발달(A) 사료 효율(B) 및 에너지 흡수(C). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + HD-5 = B; 고지방 대 고지방 + HD-5 = C. (A) 체중 발달. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들). (B) 사료 효율(케이지에서 평균 사료 섭취에 대해 조정된 증가된 체중의 그램). 터키 보정과 함께 일원 ANOVA NB! 동시-수용으로 인한 n=4. (C) 에너지 섭취. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들).
도 21: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 HD5에 의한 예방 처리(HD5)에 의한 마우스의 10주 처리에 걸친 전체 체중의 퍼센트로서 지방(A), 간 중량 그램(B) 및 정소상체 지방(eWAT)의 중량 그램(C). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + HD-5 = B; 고지방 대 고지방 + HD-5 = C. (A) 상이한 주수에서 전체 체중의 지방 백분율. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들). (B) 종료시 간의 중량. 터키 보정과 함께 일원 ANOVA. (C) 종료시 정소상체 지방 조직(내장 AT)의 중량. 터키 보정과 함께 일원 ANOVA.
도 22: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 HD5에 의한 예방 처리(고지방 + HD5)에 의해 10주간 처리된 마우스에서 글루코스 항상성. (A) 경구 글루코스 내성 시험. (B) 글루코스 자극된 인슐린 분비(GSIS). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + HD-5 = B; 고지방 대 고지방 + HD-5 = C. (A) 7주의 경구 글루코스 내성 시험. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들). (B) oGTT 중에 측정된 7주째의 글루코스-자극된 인슐린 분비. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들).
도 23: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 HD5에 의한 예방 처리(고지방 + HD-5)에 의해 10주간 처리된 마우스에서 글루코스 항상성. (A) 인슐린 내성 시험(ITT). (B) HOMA-IR. 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + HD-5 = B; 고지방 대 고지방 + HD-5 = C. (A) 8주째의 인슐린 내성 시험. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들). (B) 9주째의 항상성 모델 평가(HOMA). 터키 보정과 함께 일원 ANOVA.
도 24: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 HD5에 의한 예방 처리(고지방 + HD5)에 의해 10주간 처리된 마우스의 간에서 페록시솜 증식인자 활성화된 수용체 감마(PPARγ2) 발현(A) 및 페록시솜 조-효소 A 옥시다제 1(Acox1) 발현(B).
도 25: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 HD5에 의한 개입 처리(고지방 + HD5)에 의한 마우스의 10주 처리에 걸친 체중 발달(A) 및 체중 변화(B). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + HD-5 = B; 고지방 대 고지방 + HD-5 = C. (A) 체중 발달. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들). (B) 실행 기간의 끝에서 13주째로부터 다음 10주의 실험 식사에 대한 체중 변화. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들).
도 26: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 HD5에 의한 개입 처리(HD-5)에 의한 마우스의 10주 처리에 걸친 전체 체중의 퍼센트로서 지방(A) 및 0-4주간의 지방 변화% 그램(B). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + HD-5 = B; 고지방 대 고지방 + HD-5 = C. (A) 상이한 주수에서 전체 체중의 지방 백분율. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들). (B) 실행의 끝에서부터 4주까지의 실험 식사에 대한 지방 백분율의 변화. 터키 보정과 함께 일원 ANOVA.
도 27: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 HD5에 의한 개입 처리(HD-5)에 의한 마우스의 10주 처리에 걸친 간 중량 그램(A) 및 정소상체 지방(eWAT)의 중량 그램(B). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + HD-5 = B; 고지방 대 고지방 + HD-5 = C. (A) 종료시의 간 중량. 터키 보정과 함께 일원 ANOVA. (B) 종료시 정소상체 지방 조직(내장 AT)의 중량. 터키 보정과 함께 일원 ANOVA.
도 28: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 HD5에 의한 개입 처리(고지방 + HD5)에 의해 10주간 처리된 마우스에서 글루코스 항상성. (A) 케이지 2로부터 경구 글루코스 내성 시험. (B) 인슐린 내성 시험(ITT). 의미: 저지방 대 고지방 = A; 저지방 대 고지방 + HD-5 = B; 고지방 대 고지방 + HD-5 = C. (A) 실행 기간의 끝에서부터(13-0주) 2주마다 반복된 경구 글루코스 내성 시험(고지방 + HD-5 그룹의 두 번째 케이지를 나타낸다). (B) 9주째의 인슐린 내성 시험. 터키 보정과 함께 이원 ANOVA(쌓인 합치된 값들).
도 29: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방) 또는 고지방 식사 및 디펜신 HD5에 의한 개입 처리(HD-5)에 의한 마우스의 10주 처리에 걸친 마우스의 간에서 페록시솜 증식인자 활성화된 수용체 감마(PPARγ2) 발현(a) 및 페록시솜 조-효소 A 옥시다제 1(Acox1) 발현(b).
도 30: 저지방 식사(저지방), 고지방 식사(고지방), 고지방 식사 및 디펜신 hBD-2에 의한 예방 처리(고지방 + hBD-2) 또는 디펜신 HD5에 의한 예방 처리(고지방 + HD5)에 의해 10주간 처리된 마우스에서 식이성 지방의 흡수(A) 및 변 지방 함량(B).
도 31: 마우스 장 염증 및 미생물군에 대한 GLP-1 유사체(리라글루티드)의 영향을 조사하기 위한 실험 셋업의 도식적 개략도. -40주째에, C57/Bl/6J DIO 마우스가 도착하였다. 상기 마우스에게 고지방 식사 60% 지방, SSNIFF(Diet #D12492) 또는 퓨리나 사료를 38주간 공급하여 55 그램의 평균 체중을 성취하였다. -2주째로부터 상기 마우스를 단독 수용하였다. 변 샘플을 16S RNA 분석을 위해 -1일 및 27일째에 수집하였다. 회장으로부터의 샘플을 28일째에 맹장에서 2 ㎝ 떨어져 수집하였다.
도 32. HFD 38주에 이어서 HFD + GLP-1 유사체에 의한 4주 처리 동안의 그램 및 체중%로서 체중 손실.
도 33. HFD 38주 및 HFD + GLP-1 유사체 4주에 이은 종료시의 간 중량 그램.
도 34. HFD 38주 및 HFD + GLP-1 유사체 4주에 이은 종료시의 혈장 콜레스테롤 농도.
도 35. 암컷 NMRI 마우스에게 4 ㎎/㎏ hBD-2의 경구 투여에 따른 약동학적 데이터. Y-축은 hBD-2 ㎍/g 조직을 나타낸다. 결과를 그룹 평균 +/- SEM으로서 제공한다.
도 36. 각각 1 ㎎/㎏의 피하(SC) 및 정맥내(IV) 투여에 따른 hBD-2에 대한 약동학적 데이터. Y-축은 hBD-2 ㎍/㎖을 나타낸다. 상이한 곡선들은 상이한 실험 및 검출 방법(HPLC 및 ELISA)을 나타낸다.
도 37. 각각 16.5 ㎎/㎏의 피하 및 정맥내 투여에 따른 "hBD-2-알부민 융합 N-말단"에 대한 약동학적 데이터. Y-축은 ㎍/㎖의 융합 단백질 농도를 나타낸다. 결과는 4 마우스/샘플링 시간의 평균 +/- SD이다.
도 38. 각각 16.5 ㎎/㎏의 피하 및 정맥내 투여에 따른 "hBD-2-알부민 융합 C-말단"에 대한 약동학적 데이터. Y-축은 ㎍/㎖의 융합 단백질 농도를 나타낸다. 결과는 4 마우스/샘플링 시간의 평균 +/- SD이다.

본 발명은 청구항에 정의된 바와 같다.

정의:

카텔리시딘: 상기 용어는 대식세포 및 다형핵 백혈구 PMN 및 각질세포의 리소솜 중에서 발견되는 폴리펩티드의 한 과인 카텔리시딘-관련된 항균 펩티드를 지칭한다. 카텔리시딘은 침습성 세균 감염에 대한 포유동물의 선천적인 면역 방어에 중요한 역할을 한다. 펩티드의 카텔리시딘과는 상기 디펜신을 또한 포함하는 과인 항균 펩티드로서 분류된다. 상기 항균 폴리펩티드의 카텔리시딘과의 구성원들은 고도로 보존된 영역(카텔린 도메인) 및 고도로 가변성인 카텔리시딘 펩티드 도메인을 특징으로 한다. 카텔리시딘의 일례는 LL-37(서열번호 16)이 유래되는 인간 카텔리시딘이다.

디펜신: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "디펜신"이란 용어는 항균 펩티드의 디펜신 부류에 속하는 것으로서 당해 분야의 숙련가에 의해 인식되는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 디펜신은 알파 디펜신 부류 또는 베타 디펜신 부류에 속한다. 디펜신의 예는 알파 디펜신 부류에 속하는 인간 장내 알파 디펜신 5(HD5; 서열번호 8); 인간 알파 디펜신 6(HD6; 서열번호 9); 인간 호중구 펩티드 1(HNP-1); 인간 호중구 펩티드 2(HNP-2); 인간 호중구 펩티드 3(HNP-3); 및 또한 베타 디펜신 부류에 속하는 인간 베타 디펜신 1(hBD1; 서열번호 4); 인간 베타 디펜신 2(hBD-2; 서열번호 5); 인간 베타 디펜신 3(hBD3; 서열번호 6); 인간 베타 디펜신 4(hBD4; 서열번호 7), 침팬지 베타 디펜신 2(서열번호 10), 마카크 베타 디펜신 2(서열번호 11), 오랑우탄 베타 디펜신 2(서열번호 3), 마우스 베타 디펜신 3(서열번호 12), 말 베타 디펜신 2(서열번호 13), 돼지 베타 디펜신 1(서열번호 14), 염소 베타 디펜신 2(서열번호 12), 소 베타 디펜신 2(서열번호 1), 닭 베타 디펜신 2(서열번호 2)을 포함한다.

디펜신은 전구체로서 발현되며 신호 펩티드 및 또한 일부의 경우에 세포외 공간내로 분비 전의 전구-펩티드의 절단에 의해 가공된다. 상기 나타낸 서열들은 예측된 성숙한 생물활성 디펜신을 나타낸다. 당해 분야의 숙련가는 가공이 세포마다 상이할 수 있으며 생성되는 분비된 성숙한 펩티드는 상기 예측된 서열과 하나 또는 2개의 C- 또는 N-말단 아미노산이 상이할 수 있고 그들의 생물활성을 여전히 유지함을 이해할 것이다.

장:

장은 음식물을 소화기관으로 전달하기 위해 동물들에 의해 사용되는 관이며 상기 소화 기관 자체를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 인간 장은 입, 식도, 위, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장 및 항문관으로 구성된 소화계를 지칭한다.

글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1). GLP-1은 신경펩티드이며 프로글루카곤 유전자의 전사 생성물로부터 유래되는 인크레틴이다. 말초에서 GLP-1의 주요 공급원은 장 호르몬으로서 GLP-1을 분비하는 장내 L 세포이다. GLP-1의 생물학적 활성 형태는 GLP-1-(7-37) 및 GLP-1-(7-36)NH2이다. 이들 펩티드는 프로글루카곤 분자의 선택적인 절단으로부터 생성된다.

회장 L 세포에 의한 GLP-1 분비는 소장의 관강 중 영양소의 존재에 따라 변한다. 상기 호르몬의 분비촉진제(분비를 야기하거나 자극하는 작용제)는 탄수화물, 단백질 및 지질과 같은 주요 영양소를 포함한다. GLP-1은 일단 순환 중에 있으면 효소 디펩티딜 펩티다제-4에 의한 빠른 분해로 인해 2분 미만의 반감기를 갖는다.

GLP-1은 효능 있는 항고혈당 호르몬으로, 글루카곤 분비를 억제시키면서 상승하는 글루코스에 응답하여 인슐린 호르몬을 방출하도록 췌장의 베타 세포를 유도한다. 상기와 같은 글루코스-의존적인 작용은, 조절되지 않은 인슐린 방출이 혈장 글루코스 농도가 통상적인 공복 범위에 있거나 때에 맞지 않은 인슐린 주사시에 위험한 혈당 강하 - 저혈당증을 일으킬 수 있기 때문에, 특히 매력적이다. 이는, GLP-1이 혈당 수준이 공복 범위에 있을 때 더 많은 인슐린을 방출하도록 더 이상 β-세포를 자극하지 않기 때문에, GLP-1의 결과로서 발생하지는 않는다. 또한, GLP-1은 위액 분비 및 운동을 억제한다. 이는 탄수화물 흡수를 지연 및 연장시키며 포만효과에 기여한다.

리라글루티드(NN2211)는 인슐린 분비를 자극하는 내인성 대사 호르몬 GLP-1과 동일한 수용체에 결합하는, 오래 작용하는 글루카곤-유사 펩티드-1 수용체 작용물질이다.

다른 GLP-1 유사체는 엑세나티드, 릭시세나티드, 알비글루티드 및 둘라글루티드를 포함한다.

일치성: 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 뉴클레오티드 서열간의 관련성은 "일치성"이란 매개변수에 의해 기술된다. 2개의 아미노산 서열간의 일치성 정도를 EMBOSS 패키지(Rice et al., 2000, http://emboss.org), 바람직하게는 버전 3.0.0 또는 그 이후의 니들(Needle) 프로그램으로 실행되는 바와 같은 니들맨 분취 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 측정한다. 사용되는 임의의 매개변수는 10의 끊김 벌점, 0.5의 끊김 확장 벌점, 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 행렬이다. 니들 표지된 "최장 일치성"(-nobrief 옵션을 사용하여 획득됨)의 결과를 일치성 퍼센트로서 사용하며 하기와 같이 계산한다:

(일치하는 잔기 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬 중 끊김의 총 수)

치료: 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "치료" 및 "치료하는"이란 용어는 상태, 질병 또는 장애를 방지할 목적으로 환자를 관리하고 보살핌을 지칭한다. 상기 용어는 상기 환자가 앓고 있는 주어진 상태에 대한 전체 치료 스펙트럼, 예를 들어 증상 또는 합병증의 개선 또는 완화; 상기 상태, 질병 또는 장애의 진행의 지연; 상기 상태, 질병 또는 장애의 치유 또는 제거; 및/또는 상기 상태, 질병 또는 장애의 예방을 위한 활성 화합물의 투여를 포함하고자 하며, 여기에서 "예방하는" 또는 "예방"은 상기 상태, 질병 또는 장애의 발생을 방해, 감소 또는 지연시킬 목적으로 환자를 관리하고 보살핌을 지칭하는 것으로 이해되며, 증상 또는 합병증의 개시 위험을 방지하거나 감소시키기 위한 상기 활성 화합물의 투여를 포함한다. 상기 치료되는 환자는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다. 상기 치료되는 환자는 다양한 연령일 수 있다.

대상체, 환자: 대상체는 본 명세서에 개시된 포유동물의 종들 중 하나의 개체이다. 환자는 특정 장애로 진단된 대상체이다.

포유동물 알파 및 베타 디펜신

본 명세서는 간, 췌장 또는 담관 장애 및 몇몇 대사 장애의 치료에서 포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘, 예를 들어 소, 돼지, 양, 염소, 마우스, 원숭이, 말 또는 인간 베타 디펜신, 보다 바람직하게는 사람과 디펜신, 보다 바람직하게는 인간 알파 및/또는 베타 디펜신 및/또는 인간 카텔리시딘의 용도에 관한 것이다. 또 다른 실시태양에서, 본 명세서는 간, 췌장 또는 담관 장애 및 몇몇 대사 장애의 치료에서 GLP-1 유사체, 예를 들어 리라글루티드의 용도에 관한 것이다.

하나의 실시태양에서, 상기 포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및/또는 서열번호 17의 아미노산 서열 중 어느 하나에 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 일치성 정도를 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 디펜신은 서열번호 1-15 또는 17 중 하나와 10 미만, 예를 들어 8 미만, 예를 들어 5 미만, 예를 들어 4 미만, 예를 들어 3 미만, 예를 들어 2 미만의 아미노산만큼 상이하다.

바람직한 실시태양에서, 상기 인간 알파 디펜신은 알파 디펜신 5(서열번호 8) 및/또는 알파 디펜신 6(서열번호 9)으로 이루어진다. 바람직한 실시태양에서, 상기 포유동물 베타 디펜신은 인간 베타 디펜신 1(서열번호 4), 인간 베타 디펜신 2(서열번호 5), 인간 베타 디펜신 3(서열번호 6), 인간 베타 디펜신 4(서열번호 7) 및/또는 절두된 인간 베타 디펜신 2(서열번호 17)로 이루어진다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 카텔리시딘은 인간 카텔리시딘 또는 카텔리시딘으로부터 유래된 인간 LL37(서열번호 16)로 이루어진다. 바람직한 실시태양에서, 상기 GLP-1 유사체는 리라글루티드이다.

바람직한 실시태양에서, 인간 알파 디펜신은 서열번호 8의 아미노산 서열에 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 일치성 정도를 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 상기 인간 포유동물 알파 디펜신은 알파 디펜신 5(서열번호 8)로 이루어진다. 바람직한 실시태양에서, 인간 베타 디펜신은 서열번호 5의 아미노산 서열에 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 일치성 정도를 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 상기 인간 베타 디펜신은 인간 베타 디펜신 2(서열번호 5)로 이루어진다. 바람직한 실시태양에서, 인간 카텔리시딘은 서열번호 16의 아미노산 서열에 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 일치성 정도를 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 상기 인간 카텔리시딘은 인간 LL37(서열번호 16)로 이루어진다.

인간 이외의 종들의 경우, 상기 대상체를 바람직하게는 동일하거나 관련된 종들로부터 기원하는 디펜신 또는 카텔리시딘 또는 상기 동일한 종들로부터의 디펜신 또는 카텔리시딘(예를 들어 서열번호 1-3, 10-15 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 디펜신)의 아미노산 서열에 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%를 공유하는 디펜신 또는 카텔리시딘으로 치료한다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 포유동물 알파 디펜신은 인간 알파 디펜신 및/또는 마우스 알파 디펜신, 및 그의 기능상 동등한 변체를 포함한다. 바람직하게, 상기 포유동물 알파 디펜신은 인간 알파 디펜신 5, 인간 알파 디펜신 6 및 그의 기능상 동등한 변체로 이루어진다. 보다 바람직하게, 상기 포유동물 알파 디펜신은 인간 알파 디펜신 5, 및 그의 기능상 동등한 변체 또는 이종상동체로 이루어진다.

더욱 추가의 실시태양에서, 상기 포유동물 베타 디펜신은 인간 베타 디펜신 및/또는 마우스 베타 디펜신, 및 그의 기능상 동등한 변체로 이루어진다. 바람직하게, 상기 포유동물 베타 디펜신은 인간 베타 디펜신 1, 인간 베타 디펜신 2, 인간 베타 디펜신 3, 인간 베타 디펜신 4, 침팬지 베타 디펜신 2, 마카크 베타 디펜신 2, 및 마우스 베타 디펜신 3, 오랑우탄 베타 디펜신 2, 말 베타 디펜신 2, 돼지 베타 디펜신 1, 염소 베타 디펜신 2, 소 베타 디펜신 2, 또는 절두된 인간 베타 디펜신 2 및 그의 기능상 동등한 변체로 이루어진다. 보다 바람직하게, 상기 포유동물 베타 디펜신은 인간 베타 디펜신 1, 인간 베타 디펜신 2, 인간 베타 디펜신 3, 인간 베타 디펜신 4, 절두된 인간 베타 디펜신 2 및 그의 기능상 균등한 변체를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게, 상기 포유동물 베타 디펜신은 인간 베타 디펜신 2, 및 그의 기능상 동등한 변체 또는 이종상동체로 이루어진다.

더욱 추가의 실시태양에서, 상기 포유동물 카텔리시딘은 인간 카텔리시딘 및 그의 기능상 동등한 변체로 이루어진다. 바람직하게, 상기 포유동물 카텔리시딘은 인간 LL37로 이루어진다.

하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기와 같은 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 적어도 하나의 포유동물 α-디펜신의 투여를 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 제공된 방법은 상기와 같은 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 적어도 하나의 포유동물 β-디펜신의 투여를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 제공된 방법은 상기와 같은 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 적어도 하나의 포유동물 α-디펜신 및 적어도 하나의 포유동물 β-디펜신의 투여를 포함한다. 바람직한 실시태양은 포유동물 알파 디펜신 HD5 및/또는 포유동물 베타 디펜신 hBD-2의 투여를 제공한다.

다른 실시태양에서, 상기 제공된 방법은 상기와 같은 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 적어도 하나의 포유동물 카텔리시딘의 투여를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기와 같은 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 인간 LL37의 투여를 포함한다.

다른 실시태양에서, 상기 제공된 방법은 상기와 같은 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 적어도 하나의 GLP-1 유사체의 투여를 포함한다. 특정한 실시태양에서 상기 GLP-1 유사체는 리라글루티드이다.

추가의 실시태양에서, 상기 제공된 방법은 상기와 같은 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 적어도 하나의 포유동물 α-디펜신 및 적어도 하나의 포유동물 카텔리시딘의 투여를 포함한다. 바람직한 실시태양은 포유동물 알파 디펜신 HD5 및/또는 포유동물 카텔리시딘의 투여를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 상기 제공된 방법은 상기와 같은 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 적어도 하나의 포유동물 β-디펜신 및 적어도 하나의 포유동물 카텔리시딘의 투여를 포함한다. 바람직한 실시태양은 포유동물 베타 디펜신 hBD-2 및/또는 포유동물 카텔리시딘의 투여를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 GLP-1 유사체, 예를 들어 리라글루티드의 투여를 추가로 포함한다.

포유동물(예를 들어 인간) 알파 또는 베타 디펜신 또는 카텔리시딘의 "기능상 동등한 변체"는 간, 담관 또는 췌장의 염증에 대해 모 포유동물(예를 들어 인간) 알파 및/또는 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘과 대략적으로 동일한 효과를 나타내는 변형된 포유동물(예를 들어 인간) 알파 또는 베타 디펜신 또는 카텔리시딘이다. 포유동물(예를 들어 인간) 디펜신 또는 카텔리시딘의 기능상 동등한 변체는 상기 포유동물(예를 들어 인간) 디펜신 또는 카텔리시딘 아미노산 서열에 비해 1-5 아미노산 변형, 바람직하게 1-4 아미노산 변형, 보다 바람직하게 1-3 아미노산 변형, 가장 바람직하게 1-2 아미노산 변형(들), 및 특히 하나의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 바람직하게, 베타 포유동물 디펜신의 경우, 서열번호 5를 갖는 인간 베타 디펜신 2에 비교된다. 바람직하게, 알파 포유동물 디펜신의 경우, 서열번호 8을 갖는 HD5에 비교된다. 바람직하게, 포유동물 카텔리시딘의 경우, 서열번호 16을 갖는 인간 LL37에 비교된다.

본 방법들은 또한 GLP-1 유사체 또는 그의 변형된 형태의 기능상 균등물, 예를 들어 리라글루티드의 기능상 균등물의 투여를 포함할 수 있다.

"변형"이란 용어는 본 명세서에서 포유동물(예를 들어 인간) 디펜신, 포유동물 카텔리시딘 또는 GLP-1 유사체, 예를 들어 리라글루티드의 임의의 화학적 변형을 의미한다. 상기 변형(들)은 상기 아미노산(들)의 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들)뿐만 아니라 아미노산 측쇄(들)의 교체(들); 또는 아미노산 서열 중 유사한 특징을 갖는 비천연 아미노산의 사용일 수 있다. 특히 상기 변형(들)은 아미드화, 예를 들어 C-말단의 아미드화일 수 있다.

바람직하게, 아미노산 변형은 부수적인 성질, 즉 폴리펩티드의 폴딩 및/또는 활성에 그다지 영향을 미치지 않는 보존적인 아미노산 치환 또는 삽입; 단일 결실; 작은 아미노- 또는 카복시-말단 연장; 또는 순 전하 변화에 의한 정제 또는 또 다른 기능을 촉진하는 작은 연장부, 예를 들어 폴리-히스티딘 태그, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인을 갖는다. 하나의 실시태양에서 상기 작은 연장부, 예를 들어 폴리-히스티딘 태그, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인을 약 20-25 잔기 이하의 작은 링커 펩티드를 통해 상기 포유동물(예를 들어 인간) 알파 또는 베타 디펜신에 부착시키며 상기 링커는 제한 효소 절단 부위를 함유할 수 있다. 도 3 내지 6에서 클러스탈 W 정렬을 사용하여 아미노산 잔기가 단백질의 생물학적 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 치환될 수 있음을 예측할 수 있다. 상기 서열들은 클러스탈 W 2.1(http://www.genome.jp/tools/clustalw/) 및 하기의 설정들을 사용하여 정렬되었다: 끊김 벌점: 10, 끊김 확장 벌점: 0.05, 중량 변화: 없음, 단백질에 대한 친수성 잔기: GPSNDQE, 친수성 끊김: 있음, 중량 행렬:　BLOSUM(단백질의 경우).

하기 그룹(클러스탈 W, '강한' 보존 그룹)내에서 치환은 보존적 치환으로서 간주되어야 한다:

-S,T,A; N,E,Q,K; N,H,Q,K; N,D,E,Q; Q,H,R,K; M,I,L,V; M,I,L,F; H,Y; F,Y,W.

하기 그룹(클러스탈 W, '약한' 보존 그룹)내에서 치환은 반-보존적 치환으로서 간주되어야 한다:

-C,S,A; A,T,V; S,A,G; S,T,N,K; S,T,P,A; S,G,N,D; S,N,D,E,Q,K; N,D,E,Q,H,K; N,E,Q,H,R,K; V,L,I,M; H,F,Y.

보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라진), 소수성 아미노산(류신, 이소류신 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 쓰레오닌 및 메티오닌)의 그룹내에서 이루어진 치환들이다. 비활성을 일반적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Neurath and Hill (1979)]에 기재되어 있다. 가장 통상적으로 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly이다.

20개의 표준 아미노산 외에, 비-표준 아미노산(예를 들어 4-하이드록시프롤린, 6-N-메틸 리신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린, 및 알파-메틸 세린)을 야생형 폴리펩티드의 아미노산 잔기들에 대해 치환시킬 수 있다. 제한된 수의 비-보존적인 아미노산, 유전암호에 의해 암호화되지 않는 아미노산, 및 비천연 아미노산을 아미노산 잔기들에 대해 치환시킬 수 있다. "비천연 아미노산"은 단백질 합성후에 변형되었고/되었거나, 그의 측쇄(들) 중에 표준 아미노산의 경우와 상이한 화학 구조를 갖는다.

비천연 아미노산을 화학적으로 합성시킬 수 있으며, 바람직하게는 상업적으로 입수할 수 있고, 피페콜산, 티아졸리딘 카복실산, 데하이드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 및 3,3-디메틸프롤린을 포함한다.

포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체 또는 그의 펩티드 주쇄 중의 필수 아미노산은 당해 분야에 공지된 과정, 예를 들어 부위-지향된 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발(Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085)에 따라 확인될 수 있다. 후자의 기법에서, 단일 알라닌 돌연변이를 상기 분자 중의 모든 잔기에 도입시키고, 생성된 돌연변이 분자들을 생물학적 활성(즉 염증성 장 질병에 대한 활성 및/또는 TNF-알파 활성의 억제)에 대해 시험하여 상기 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기들을 확인한다. 또한 문헌[Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708]을 참조하시오. 필수 아미노산의 정체를 또한 포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체의 펩티드 주쇄와 관련된 폴리펩티드들과의 일치성의 분석으로부터 추론할 수 있다(도 3 내지 6의 클러스탈 W 정렬을 참조하시오).

단일 또는 다중 아미노산 치환을 수행할 수 있으며 공지된 돌연변이유발, 재조합 및/또는 셔플링 방법에 이어서 적합한 선별 과정, 예를 들어 문헌[Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57]; [Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156]; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625에 개시된 과정을 사용하여 시험할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 오류빈발 PCR, 파지 디스플레이(예를 들어 문헌[Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837]; 미국특허 제 5,223,409 호; WO 92/06204), 및 영역-지향된 돌연변이유발(Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127)을 포함한다.

주어진 치환의 결과를 확실히 예측할 수 없을 때, 상기 유도체들을 본 명세서에서 상술한 방법들에 따라 쉽게 분석하여 생물학적 활성의 존재 또는 부재를 판정할 수 있다.

오래 작용하는 화합물

α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘의 반감기를, 상기 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘을 또 다른 분자와 융합 또는 접합시킴으로써, 즉 상기 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘의 생체내 혈장 반감기를 제공하는 약학적으로 허용 가능한 분자에 연결된 오래 작용하는 생물학적으로 활성인 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘을 구성함으로써 연장시킬 수 있으며, 상기 반감기는 상기 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘과 동일한 방식으로 투여된 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘의 생체내 혈장 반감기에 비해 실질적으로 증가된다.

약학적으로 허용 가능한 분자에 연결된 포유동물 α-디펜신 또는 그의 유사체 또는 포유동물 β-디펜신 또는 그의 유사체 또는 인간 카텔리시딘 또는 그의 유사체를 포함하는 오래 작용하는 생물학적으로 활성인 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘은 포유동물 신생아 Fc 수용체에 결합하는 분자, 트랜스페린 또는 CH3(CH2)nCO-(여기에서 n은 8 내지 22이다) 또는 중합체 중에서 선택된다.

상기 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘 작용물질은 또한 비-포유동물 기원의 것일 수 있으며, 작은 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질 중에서 선택될 수 있다. 상기 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘 작용물질을 종래 기술 문헌에 기재된 바와 같은 다양한 방식으로, 예를 들어 비제한적으로 이작용성 링커를 통한 화학적 커플링으로, 디펜신, 예를 들어 α-디펜신 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘의 N-말단 또는 C-말단 단부를 약학적으로 허용 가능한 분자, 예를 들어 알부민 또는 알부민 유사체에 커플링시킴으로써 유전 공학적으로 상기 약학적으로 허용 가능한 분자에 연결시킬 수 있다. 특히, 상기 알부민 또는 알부민 유사체, 예를 들어 인간 알부민의 N-말단 단부를 α-디펜신 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘의 C-말단 단부, 또는 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘의 N-말단 단부에 커플링시키거나; 또는 알부민, 예를 들어 인간 알부민의 C-말단 단부를 α-디펜신 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘의 C-말단 단부, 또는 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘의 N-말단 단부에 커플링시킬 수 있다. 링커 서열을 상기 알부민과 상기 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘 쇄 사이에 삽입할 수 있다.

상기 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘 작용물질을 안정한 링커 또는 보다 불안정한 링커를 통해 약학적으로 허용 가능한 분자에 연결시킬 수 있다. 다수의 링커들, 예를 들어 이작용성 PEG 분자(예를 들어 문헌[Paige et al. Pharmaceutical Research, vol. 12, no. 12, 1995]를 참조하시오), 가수분해성 링커(Shechter et al. Bioconjugate Chem. 2005,16: 913-920 및 International Journal of Peptide Research and Therapeutics, Vol. 13, Nos. 1-2, June 2007 및 W02009095479), PDPH 및 EMCH(예를 들어 W02010092135를 참조하시오)가 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 분자에 대한 상기 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘 작용물질의 화학적 접합이 기능성 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘 활성을 강하게 감소시키는 특수한 경우에, 상기 기능성 α- 또는 β-디펜신 또는 카텔리시딘 작용물질을 방출할 수 있는 보다 불안정한 링커를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

반감기 연장을 또한 이격자, 예를 들어 γ-L-글루타밀 이격자 및 C-18 지방 이-산 쇄에 의한 펩티드 주쇄의 리신으로의 아실화를 통해 수행할 수 있다. 상기 지방 이-산 측쇄 및 이격자는 알부민에 대해 강하지만 가역적인 결합을 매개하며, 이는 주사 부위로부터의 방출을 늦추고 신장 제거를 감소시킨다.

마찬가지로, GLP-1 유사체, 예를 들어 리라글루티드의 반감기를 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 상기 언급된 방법에 의해 연장시킬 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 알파-디펜신, 베타-디펜신, 카텔리시딘 또는 GLP-1 유사체는 세포 침투 펩티드(CPP), 알부민 결합 모이어티(ABM), 검출성 모이어티(Z) 및 반감기 연장 펩티드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 추가의 모이어티를 추가로 포함한다.

다른 실시태양에서, 상기 알파-디펜신, 베타-디펜신, 카텔리시딘 또는 GLP-1 유사체는 세포 침투 펩티드(CPP), 알부민 결합 모이어티(ABM), 검출성 모이어티(Z) 및 반감기 연장 펩티드 중 어느 하나를 포함하지 않는다.

방법 및 용도

실시예 5에 입증된 바와 같이, 리라글루티드, GLP-1 유사체의 투여가 고지방 식사를 한 마우스에서 체중 강하 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 GLP-1 유사체는 또한 간 및 혈장 콜레스테롤 수준의 지방 축적을 감소시켰다. 따라서, 발명자들은 GLP-1 또는 GLP-1 유사체의 투여에 의해 간, 담관, 췌장 또는 대사 질병 또는 장애, 또는 간암, 담관암종 또는 췌장암의 치료 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 용도를 고려한다.

바람직하게, GLP-1 또는 GLP-1 유사체를 피하 또는 근육내 투여를 통해 비경구적으로 투여한다. 상기 GLP-1 유사체를 엑세나티드, 리라글루티드, 릭시세나티드, 알비글루티드 및 둘라글루티드 중에서 선택할 수 있다.

인간 알파 디펜신 5 및 인간 베타 디펜신 2 단독 또는 함께 및/또는 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체가 고지방/당 식사('서구식 식사')가 공급된 마우스에서 체중 증가, 지질 축적 및 염증을 예방 또는 치료할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 고지방/당 식사를 한 마우스는 체중이 빠르게 증가하고 임의의 치료의 부재하에서 정소상체 또는 내장 지방 및/또는 간 지방을 축적한다. 간에서 지방의 축적은 비-알콜성 지방간 질병(이는 나중의 단계에서 간 지방증, -섬유증, -경변증, 간성 뇌병증 및 최종적으로는 간암에 이르게 될 수 있다)에 이른다. 예를 들어 간에서 복부지방의 축적을 감소시킴으로써 NAFLD, NASH 및 관련 장애의 발생을 감소시키거나 예방할 수 있다.

체중 증가가 예방되거나 감소될 수 있으면, 정소상체 또는 내장 지방 및/또는 간 지방의 축적이 또한 예방되거나 감소될 수 있으며, 따라서 간암 및 간성 뇌병증, 담관 및 췌장 장애 및 몇몇 대사 장애를 포함한 간 질병의 치료 또는 예방에 잠재적인 약제로서 활성을 보인다. 따라서, 하나의 태양은 간, 담관 및 췌장 장애뿐만 아니라 본 명세서에 정의된 바와 같은 대사 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

간 장애 (liver disorder)의 예는 알콜성(IDC10: K70) 및 비-알콜성 간 질병, 독성 간 질병(IDC 10: K71), 예를 들어 지방간, 간염(IDC 10: K73 및 K75), 간경변증(IDC 10:K74), 간부전(IDC 10: K72), 섬유증(IDC 10: K74) 및 간의 경화증 및 가장 중요하게는 비-알콜성 지방간염 NASH-(IDC 10: K75.8) 및 비-알콜성 지방간 질병(NAFLD)(IDC 10: K76.0)을 포함한다. 특정한 실시태양에서 상기 간 질병은 NASH 또는 NAFLD이다.

비-알콜성 지방간 질병(NAFLD)은 비만의 급속한 성장과의 밀접한 관련으로 인해 점점 증가하는 유병률과 함께 세계에서 가장 흔한 간 질병이다. 세포 중 지질의 비정상적인 정체인 지방증은 종종 간에서 발생하지만, 다른 기관, 예를 들어 신장, 심장 및 근육에서 발생할 수도 있다. 간의 지방증은 지방간 질병(FLD)을 발생시킬 수 있으며, 이는 알콜 소비의 기여에 따라, 알콜성 또는 비-알콜성 지방간 질병(NAFLD)으로서 추가 분류될 수 있다.

단순한 지방증은 간-관련 이환율 또는 사망률의 증가된 위험과 관련되지 않지만; 비-알콜성 지방간염(NASH)은 진행된 간 섬유증 및 간경변증으로 진행할 수 있으며, 또한 증가된 간암 위험과 관련된다. NASH를 앓고 있는 대상체는 C형 간염으로 인해 간경변증이 발생하는 대상체에서의 암 발병 위험에 필적하는, 간세포 암종과 같은 암 발병의 증가된 위험(5-10%)을 갖는다. NASH는 증상을 항상 일으키지는 않기 때문에 정량분석이 어렵기는 하지만, 약 100만명의 미국인이 NASH를 앓고 있는 것으로 추정된다. 그러나, NASH는 미국에서 간 생검한 사람의 7-9%에서 진단되며 25세 이하 미국 국민에서 간 이식에 대한 주요 표시이다.

NASH는 종종 당뇨병 및/또는 인슐린 내성과 함께, 30을 초과하는 BMI(체질량 지수)를 갖는 사람들에서 나타난다. 현재, NASH는 통상적인 실험실 시험 중 가장 자주 발견된다. 추가적인 시험은 NASH의 존재를 확인하고 다른 유형의 간 질병을 배제하는데 도움이 된다. 영상화 시험(예를 들어 초음파, CT 스캔, 또는 자기 공명 영상화)은 간의 지방 축적을 밝혀낼 수 있지만 NASH를 유사한 외관을 갖는 다른 원인의 간 질병과 구분할 수 없다. NASH의 확인을 위해서는 간 생검이 필요하다. 현재 NASH의 치료에 간 이식 이외의 특정한 치료법은 없지만, 생활양식 관리가 그의 중증도를 감소시키는데 도움이 될 수 있다.

상승된 수준의 간 효소, 예를 들어 AST 및 ALT를 NAFLD 및 NASH 환자를 확인하기 위한 진단학적 과정의 부분으로 사용할 수 있다. ALT 수준은 대개 NAFLD 환자에서 AST 수준보다 더 높지만; 1을 초과하는 AST/ALT 비는 상기 질병의 진행된 섬유증 형태를 암시한다. 상기 비는 진행된 섬유증에 대한 가장 단순한 예측 모델이며, 쉽게 이용 가능한 간 기능 시험을 사용하여 계산될 수 있다. 상기 비는 그의 단순성에도 불구하고, 양호한 음성 예측값을 가지며 진행된 섬유증의 존재를 배제시키는데 사용될 수 있다.

담관 및 췌장 장애의 예는 담관염(cholangitis)(IDC: K83.0) 및 특히 원발성 경화성 담관염, 담낭염(cholecystitis)(IDC10: K81.0), 담관암종(IDC10: C22.1) 및췌장염(pancreatitis)(IDC10: K85.0)을 포함한다.

대사 장애의 예는 지단백질 대사 장애(IDC10: E78); 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolaemia)(IDC10: E78.0); 고글리세라이드혈증(hyperglyceridaemia)(IDC10: E78.1); 고지질혈증(hyperlipidaemia)(IDC10: E78.2 및 E78.4); 고카일로마이크론혈증(hyperchylomicronaemia)(IDC10: E78.3); 글리코겐 축적병(glycogen storage disease)(IDC10: E74); 스핑고지질 대사 및 지질 축적병(sphingolipid metabolism and lipid storage disorders)(IDC10: E75); 지질 축적병(lipid storage disorder)(IDC10: E75.6); 강글리오사이드증(gangliosidosis)(IDC10: E75) 및 스핑고지질증(sphingolipidosis)(IDC10: E 75.2)을 포함한다.

이들 장애의 공통점은 이들이 유전자 돌연변이의 결과이거나 또는 비만증, 이상지질혈증, 글루코스 내성 및 인슐린 내성뿐만 아니라 복부/내장 또는 간 지방의 축적과 함께 대사 증후군을 유도하는 서구식 생활양식에 의해 유발되거나 악화된다는 것이다.

바람직한 실시태양에 개시된 방법들은 적어도 포유동물 알파 디펜신 및/또는 적어도 포유동물 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체, 예를 들어 리라글루티드의 투여를 통해 상술한 바와 같은 간, 담관, 췌장 또는 대사 장애를 치료할 수 있다.

상기 개시된 방법에 의해 제공되는 치료가 필요한 대상체는 상술한 바와 같은 간, 담관, 췌장 또는 대사 장애에 걸린다.

상기 개시된 방법에 의해 제공된 치료가 필요한 대상체는 하기의 증상들 중 하나 이상이 존재할 수 있다:

· 상승된 혈압: ≥ 140/90 mmHg;

· 이상지질혈증: 트리글리세라이드(TG): ≥ 1.695　mmol/L 및 고-밀도 지단백질 콜레스테롤(HDL-C) ≤ 0.9　mmol/L(남성), ≤ 1.0　mmol/L(여성);

· 공복혈당 > 6.1 mmol/L;

· AST/ALT > 1;

· 중심성 비만: 허리:엉덩이 비 > 0.90(남성); > 0.85(여성), 또는 체질량 지수 > 30　㎏/㎡; 및

· 미세알부민뇨: 뇨 알부민 분비 비 ≥ 20 ㎍/분 또는 알부민:크레아티닌 비 ≥ 30 ㎎/g.

하나의 실시태양에서, 상기 개시된 방법에 따른 적어도 하나의 포유동물 α-디펜신 및/또는 적어도 하나의 포유동물 β-디펜신의 투여는 일반적으로 경구이다.

포유동물 알파 및 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체를 임의의 통상적인 경로에 의해 투여를 위해 제형화된 조성물 중에서 치료학적으로 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체를 경구로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 투여는 비경구, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 복강내 또는 폐이다.

일부 실시태양에서, 바람직한 실시태양의 조성물을, 동결건조물로서 안정성을 제공하는 적합한 부형제를 사용하여 동결건조물로서 제형화하고 후속으로 재수화시킬 수 있다.

포유동물 알파 디펜신 및/또는 포유동물 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체, 예를 들어 인간 알파 디펜신 및/또는 인간 베타 디펜신 및/또는 인간 카텔리시딘 및/또는 리라글루티드를 함유하는 약학 조성물을 통상적인 방법에 따라, 예를 들어 혼합, 과립화, 코팅, 용해 또는 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 포유동물 알파 디펜신 및/또는 포유동물 베타 디펜신을 함유하는 약학 조성물을 멸균 및 등장성 용액으로서 제형화한다.

상기 제공된 약학 조성물은 하나의 실시태양에서 적어도 하나의 포유동물 알파 디펜신을 포함한다. 포유동물 알파 디펜신의 예는 HD5 및 HD6이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 조성물은 포유동물 알파 디펜신 HD5를 포함한다. 상기 약학 조성물은 또 다른 실시태양에서 적어도 하나의 포유동물 베타 디펜신을 포함한다. 포유동물 베타 디펜신의 예는 hBD1, hBD-2, 절두된 hBD-2, hBD3 및 hBD4이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 조성물은 포유동물 베타 디펜신 hBD-2를 포함한다. 상기 약학 조성물은 추가의 실시태양에서 적어도 하나의 포유동물 알파 디펜신 및 적어도 하나의 포유동물 베타 디펜신을 포함한다. 포유동물 알파 디펜신의 예는 HD5 및 HD6이다. 포유동물 베타 디펜신의 일례는 hBD-2이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 조성물은 포유동물 알파 디펜신 HD5 및 포유동물 베타 디펜신 hBD-2를 포함한다. 다른 실시태양에서 상기 조성물 또는 사료 조성물은 서열번호 1-3 및 10-15 중에서 선택된 아미노산 서열뿐만 아니라 본 명세서에 정의된 바와 같은 서열 변체를 갖는 디펜신 중에서 선택된 하나 이상의 비-인간 디펜신을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 적어도 하나의 카텔리시딘, 예를 들어 인간 카텔리시딘, 예를 들어 서열번호 16의 인간 LL37을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 적어도 하나의 GLP-1 유사체, 예를 들어 리라글루티드를 포함한다.

바람직한 실시태양의 약학 조성물은 포유동물 알파 디펜신 및/또는 포유동물 베타 디펜신, 예를 들어 인간 알파 디펜신 및 인간 베타 디펜신, 및/또는 카텔리시딘, 예를 들어 인간 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체, 예를 들어 리라글루티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 포함한다.

약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 당해 분야의 숙련가들에게 친숙하다. 액체 용액으로서 제형화된 조성물의 경우, 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 염수 및 멸균수를 포함하며, 산화방지제, 완충제, 세균발육저지제, 및 다른 통상적인 첨가제를 임의로 포함할 수 있다.

상기 개시된 화합물을 경구 투여를 위해 광범위하게 다양한 제형으로 제형화할 수 있다. 고체형태 제제는 분말, 정제, 드롭스, 캡슐, 사쉐, 로젠지 및 분산성 과립을 포함할 수 있다. 경구 투여에 적합한 다른 형태는 유화액, 시럽, 엘릭서, 수용액, 수성 현탁액, 치약, 젤 치분, 츄잉검을 포함한 액체 형태 제제, 또는 사용 직전에 액체 형태 제제, 예를 들어 용액, 현탁액 및 유화액으로 전환되게 되어 있는 고체형태 제제를 포함할 수 있다.

상기 제형은 (포유동물 알파 디펜신 및/또는 포유동물 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘, 및 다른 임의의 활성 성분 외에) 담체, 충전제, 붕해제, 흐름 조절제, 당 및 감미제, 향료, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 용해제, 삼투압 조절용 염, 완충제, 희석제, 분산 및 표면-활성제, 결합제, 윤활제, 및/또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 다른 약학 부형제를 함유할 수 있다.

당해 분야의 숙련가는 포유동물 알파 디펜신 및 포유동물 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘을 적합한 방식으로, 및 승인된 실행, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro (1990)]에 기재된 바에 따라 추가로 제형화할 수 있다.

포유동물 알파 디펜신 및 포유동물 베타 디펜신, 예를 들어 인간 알파 디펜신 및 인간 베타 디펜신을 단독으로, 또는 1, 2 또는 그 이상의 다른 약학 화합물 또는 약물 물질과, 예를 들어 인슐린 또는 인슐린 유사체, 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 또는 GLP-1 유사체, 또는 디펩티딜 펩티다제-IV(DPP-IV) 억제제와, 및/또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제(들)와 병용 요법으로 사용할 수 있다.

포유동물 알파 디펜신 및/또는 포유동물 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘, 예를 들어 인간 알파 디펜신, 인간 베타 디펜신 및/또는 인간 카텔리시딘을 단독으로, 또는 1, 2 또는 그 이상의 다른 약학 화합물 또는 약물 물질과, 예를 들어 항생제; 인슐린 또는 인슐린 유사체; 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 또는 GLP-1 유사체; 글루카곤 유사 펩티드-2(GLP-2) 또는 GLP-2 유사체; 디펩티딜 펩티다제-IV(DPP-IV) 억제제; 메트포르민; 나트륨 글루코스 운반체-2(SGLT-2) 억제제; 글루카곤 수용체 길항제 및/또는 일시적 수용체 전위 양이온 채널 서브패밀리 V 구성원 1(TRPV1) 길항제와, 및/또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제(들)와 병용 요법으로 사용할 수 있다.

포유동물 알파 디펜신 및/또는 포유동물 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘, 예를 들어 인간 알파 디펜신, 인간 베타 디펜신 및 인간 카텔리시딘을 또한 화학요법, 면역요법, 방사선요법 또는 이들의 조합 중 어느 하나와 병용 요법으로 사용할 수 있다.

마찬가지로, GLP-1 유사체를 단독으로, 또는 1, 2 또는 그 이상의 다른 약학 화합물 또는 약물 물질과, 예를 들어 항생제; 인슐린 또는 인슐린 유사체; 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 또는 추가의 GLP-1 유사체; 글루카곤 유사 펩티드-2(GLP2) 또는 GLP-2 유사체; 디펩티딜 펩티다제-IV(DPP-IV) 억제제; 메트포르민; 나트륨 글루코스 운반체-2(SGLT-2) 억제제; 글루카곤 수용체 길항제 및/또는 일시적 수용체 전위 양이온 채널 서브패밀리 V 구성원 1(TRPV1) 길항제와, 및/또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제(들)와 병용 요법으로 사용할 수 있다.

GLP-1 유사체, 예를 들어 리라글루티드를 또한 화학요법, 면역요법, 방사선요법 또는 이들의 조합 중 어느 하나와 병용 요법으로 사용할 수 있다.

시험관내 합성

포유동물 알파 디펜신, 포유동물 베타 디펜신, 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체를 당해 분야에 공지된 바와 같은 통상적인 방법을 사용하여 시험관내 합성에 의해 제조할 수 있다. 다양한 상업적인 합성 장치, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드(Applied Biosystems Inc.), 벡크만(Beckman) 등의 자동화된 합성기를 이용할 수 있다. 합성기를 사용함으로써, 천연 아미노산을 비천연 아미노산, 특히 D-이성질체(또는 D-형태), 예를 들어 D-알라닌 및 D-이소류신, 부분입체이성질체, 상이한 길이 또는 작용기를 갖는 측쇄 등으로 치환시킬 수 있다.

특정한 서열 및 제조 방식은 편의성, 경제성, 필요한 순도 등에 의해 결정될 것이다.

화학적 결합이, 결합에 편리한 작용기, 예를 들어 아미드 또는 치환된 아민 형성, 예를 들어 환원적 아민화를 위한 아미노기, 티오에테르 또는 디설파이드 형성을 위한 티올기, 아미드 형성을 위한 카복실기 등을 포함하는 다양한 펩티드 또는 단백질에 제공될 수 있다.

경우에 따라, 다양한 기들을 합성 또는 발현 중 펩티드에 도입시킬 수 있으며, 이는 다른 분자 또는 표면에의 결합을 허용한다. 따라서 시스테인을 사용하여 티오에테르, 금속 이온 착체에의 결합을 위한 히스티딘, 아미드 또는 에스테르 형성을 위한 카복실기, 아미드 형성을 위한 아미노기 등을 생성시킬 수 있다.

포유동물 알파 디펜신 및 포유동물 베타 디펜신, 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체 또는 그의 기능성 균등물을 또한 통상적인 재조합 합성 방법에 따라 단리 및 정제할 수 있다. 재조합 합성을 적합한 발현 벡터 및 진핵생물 발현 시스템을 사용하여 수행할 수 있다. 용액을 발현 숙주 및 배지로 제조하고 존재하는 디펜신을 HPLC, 배제 크로마토그래피, 젤 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 또는 다른 정제 기법을 사용하여 정제할 수 있다. 이 콜라이에서 인간 베타 디펜신 2의 재조합 발현 방법은 WO 2010/007166(노보자임스(Novozymes))에 개시되어 있다.

투여량

포유동물 알파 디펜신, 포유동물 베타 디펜신, 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체, 예를 들어 인간 알파 디펜신, 인간 베타 디펜신, 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체, 예를 들어 리라글루티드를 바람직하게는 환자에게 허용 가능한 독성으로, 간 질병, 담관 또는 췌장 장애 또는 대사 장애의 치료에 유효한 양으로 약학 조성물 중에 사용한다. 포유동물 알파 디펜신, 포유동물 베타 디펜신, 포유동물 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체, 예를 들어 인간 알파 디펜신, 인간 베타 디펜신, 인간 카텔리시딘 및/또는 GLP-1 유사체를 또한 바람직하게는 치료가 필요한 환자 또는 동물에게 허용 가능한 독성으로, 간, 담관 또는 췌장의 염증을 치료하기에 유효한 양으로 약학 조성물 중에 사용한다.

상기와 같은 치료를 위해서, 적합한 투여량은 물론, 예를 들어 사용되는 화합물의 화학적 성질 및 약동학적 데이터, 개별적인 숙주, 투여 방식 및 치료되는 상태의 성질 및 중증도에 따라 변할 것이다.

일반적으로, 포유동물, 예를 들어 인간에서, 인간 알파 디펜신의 지시된 1일 투여량은 바람직하게는 약 0.1 ㎎ HD5/㎏ 체중 내지 약 10 ㎎ HD5/㎏ 체중, 보다 바람직하게 약 0.5 ㎎ HD5/㎏ 체중 내지 약 10 ㎎ HD5/㎏ 체중; 예를 들어 1 ㎎ HD5/㎏ 체중 내지 10 ㎎ HD5/㎏ 체중, 보다 바람직하게 약 1.2 ㎎ HD5/㎏ 체중 내지 약 10 ㎎ HD5/㎏ 체중, 바람직하게 약 1.2 ㎎ HD5/㎏ 체중 내지 약 5 ㎎ HD5/㎏ 체중, 훨씬 더 바람직하게 1.2 ㎎ HD5/㎏ 체중으로, 예를 들어 하루에 1, 2 또는 3회 이하의 분할 용량으로 투여된다. 유사한 투여량을 다른 알파-디펜신들에 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 알파-디펜신을 하루에 적어도 2회, 예를 들어 하루에 3회 투여한다.

하나의 실시태양에서 인간 베타 디펜신의 지시된 1일 투여량은 바람직하게는 약 0.1 ㎎ hBD-2/㎏ 체중 내지 약 10 ㎎ hBD-2/㎏ 체중, 보다 바람직하게 약 0.5 ㎎ hBD-2/㎏ 체중 내지 약 10 ㎎ hBD-2/㎏ 체중; 예를 들어 1 ㎎ hBD-2/㎏ 체중 내지 10 ㎎ hBD-2/㎏ 체중, 보다 바람직하게 약 1.2 ㎎ hBD-2/㎏ 체중 내지 약 10 ㎎ hBD-2/㎏ 체중, 바람직하게 약 1.2 ㎎ hBD-2/㎏ 체중 내지 약 5 ㎎ hBD-2/㎏ 체중, 훨씬 더 바람직하게 1.2 ㎎ hBD-2/㎏ 체중으로, 예를 들어 하루에 1, 2 또는 3회 이하의 분할 용량으로 투여된다. 유사한 투여량을 다른 베타-디펜신들에 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 베타-디펜신을 하루에 적어도 2회, 예를 들어 하루에 3회 투여한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 투여는 경구이다.

하나의 실시태양에서 인간 카텔리시딘의 지시된 1일 투여량은 바람직하게는 약 0.1 ㎎ 카텔리시딘/㎏ 체중 내지 약 10 ㎎ 카텔리시딘/㎏ 체중으로, 예를 들어 하루에 1, 2 또는 3회 이하의 분할 용량으로 투여된다. 일부 실시태양에서, 상기 카텔리시딘을 하루에 적어도 2회, 예를 들어 하루에 3회 투여한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 투여는 경구이다.

하나의 실시태양에서 GLP-1 유사체, 예를 들어 리라글루티드의 지시된 1일 투여량은 매일 바람직하게는 약 0.6 ㎎ GLP-1 유사체 내지 약 3 ㎎ GLP-1 유사체이다. 예를 들어, 리라글루티드의 투여량 섭생은 1주일간 하루에 0.6 ㎎, 이어서 1주일간 하루에 1.2 ㎎, 이어서 1주일간 하루에 1.8 ㎎, 이어서 1주일간 하루에 2.4 ㎎, 이어서 1주일 이상, 예를 들어 2주일, 예를 들어 3주일, 예를 들어 4주일, 또는 그 이상 동안 하루에 3 ㎎이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 GLP-1 유사체를 정맥내, 근육내 또는 피하 투여한다.

인간 알파 디펜신과 인간 베타 디펜신 또는 인간 카텔리시딘과의 지시된 1일 투여량은 바람직하게는 약 0.1 ㎎ 디펜신 또는 카텔리시딘/㎏ 체중 내지 약 10 ㎎ 디펜신/㎏ 체중, 보다 바람직하게 약 0.5 ㎎ 디펜신 또는 카텔리시딘/㎏ 체중 내지 약 10 ㎎ 디펜신/㎏ 체중; 예를 들어 1 ㎎ 디펜신 또는 카텔리시딘/㎏ 체중 내지 10 ㎎ 디펜신/㎏ 체중, 보다 바람직하게 약 1.2 ㎎ 디펜신 또는 카텔리시딘/㎏ 체중 내지 약 10 ㎎ 디펜신/㎏ 체중, 바람직하게 약 1.2 ㎎ 디펜신 또는 카텔리시딘/㎏ 체중 내지 약 5 ㎎ 디펜신/㎏ 체중, 훨씬 더 바람직하게 1.2 ㎎ 디펜신 또는 카텔리시딘/㎏ 체중으로, 예를 들어 하루에 1, 2 또는 3회 이하의 분할 용량으로 투여된다. 2개의 상이한 디펜신을 1회 투여량으로 투여하는 경우, 상기 투여량은 중량 기준 또는 몰 기준으로 측정된 동일하거나 또는 대략적으로 동일한 양의 상기 2개의 디펜신을 포함할 수 있다. 비가 또한, 알파 디펜신 대 베타-디펜신의 비가 중량 또는 몰 기준으로 측정된 10:1 내지 1:10, 예를 들어 5:1 내지 1:5, 예를 들어 2:1 내지 1:2로 변하도록 상이할 수 있다.

상기 1일 투여량은 0.6 ㎎ HD5/㎏ 체중 + 0.6 ㎎ hBD-2/㎏ 체중에 상응할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 바람직한 실시태양의 약학 조성물들은 포유동물 알파 디펜신 및/또는 포유동물 베타 디펜신 및/또는 포유동물 카텔리시딘, 예를 들어 인간 알파 디펜신 및/또는 인간 베타 디펜신 및/또는 인간 카텔리시딘을 단위 투여형당 약 0.1 ㎎ 이하 내지 약 1500 ㎎ 이상, 예를 들어 단위 투여형당 0.5 ㎎ 이하 내지 약 1500 ㎎ 이상, 바람직하게는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 또는 0.9 ㎎ 내지 약 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 ㎎, 및 보다 바람직하게는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25 ㎎ 내지 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 ㎎의 양으로 포함할 수 있다. 그러나, 몇몇 실시태양에서, 상기 언급한 것들보다 더 낮거나 더 높은 투여량이 바람직할 수도 있다. 적합한 농도 및 투여량은 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 바람직한 실시태양의 약학 조성물은 포유동물 알파 디펜신, 예를 들어 인간 알파 디펜신을 포함한다. 다른 실시태양에서, 바람직한 실시태양의 약학 조성물은 포유동물 베타 디펜신, 예를 들어 인간 베타 디펜신을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 바람직한 실시태양의 약학 조성물은 포유동물 알파 디펜신 및 포유동물 베타 디펜신, 예를 들어 인간 알파 디펜신 및 인간 베타 디펜신을 포함하며, 여기에서 상기 알파 및 베타 디펜신은 몰농도 기준으로 또는 ㎎/㎖ 기준으로 동량으로 존재한다.

하나의 실시태양에서, 상기 포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘을 하루에 적어도 1회, 예를 들어 하루에 적어도 2회, 예를 들어 하루에 적어도 3회 투여한다. 하나의 실시태양에서, 상기 GLP-1 유사체를 하루에 적어도 1회, 예를 들어 하루에 적어도 2회, 예를 들어 하루에 적어도 3회 투여한다. 하나의 실시태양에서, 상기 GLP-1 유사체를 피하, 정맥내 또는 근육내 투여한다.

또 다른 실시태양에서, 상기 포유동물 알파 및/또는 베타 디펜신 및/또는 카텔리시딘을 식품 또는 음료 보충제로서 투여한다.

본 명세를 하기의 실시예들에 의해 추가로 기재하며, 이들 실시예를 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다.

실시예

실시예 1. 디펜신에 의한 체중 증가의 예방 및 근육/지방비의 개선뿐만 아니라 간 지방 축적의 예방

물질 및 방법

마우스: 마우스를 3개조로, 그룹당 4개의 케이지에 수용하였다. 사료 섭취를 빛이 차단되기 직전(6 pm)에 매일 기록하였다. 개별 마우스에게 그룹 및 케이지 모두의 방식에서 변경된 순서로 실험 과정을 가하였다. 마우스를 12-시간 명/암 주기하에 SPF 표준 조건으로 실온에서 유지시켰다.

식사: 투여를 위해서, 평균 체중을 마우스당 25 그램인 것으로 추정하였다. 마우스는 하루에 마우스당 대략 3 그램의 사료를 먹는다.

처리 섭생: 마우스에게 고지방 식사(HFD) 또는 저지방(LF) 대조용 식사를 공급하였다. 상기 HFD는 4개의 하위그룹; 1 hBD-2, 1 HD5, 1 hBD-2/HD5 및 디펜신 보충이 없는 하나의 표준 HFD를 함유한다. 디펜신 농도는 하루에 마우스 ㎏당 1,2 ㎎ hBD-2이다. HD5는 hBD-2에 동몰 농도로 제공된다. 조합 그룹은 50% hBD-2 + 50% HD5를 제공하며, 따라서 디펜신의 총량은 나머지 시험 그룹들에 동등하다.

시험: 인슐린 내성 시험(ITT), 글루코스-자극된 인슐린 분비(GSIS) 시험, 경구 글루코스 내성 시험(OGTT) 및 5시간 공복 인슐린 시험을 2일에 걸쳐, 하루에 그룹당 마우스의 50%를 사용하여 수행하였으며, 따라서 교락 인자로서 매일 행해지는 변화를 피한다.

미생물 분석을 수행하여 장내 미생물군을 연구한다. 종방향 16S 특성화를 60마리 마우스로부터의 4쌍 샘플, 총 240개 샘플상에서 수행한다. 각각의 마우스를 식사 변화전, 식사 변화 1주후, 식사변화 4주후, 및 종료시에 샘플링하여, 디펜신 처리의 결과로서 변 미생물군의 철저한 특성화를 보장한다. 추가로, 소장의 내용물을 종료시에 분석하여(16S 또는 심층 서열분석), 영양분 흡수의 핵심 부위에서 가능한 변경에 대한 귀중한 이해를 제공한다. 최종적으로, 맹장 내용물의 전체 대사체 프로파일을 수행하여 전신 대사로의 미생물 변경의 번역을 허용한다. 간, 십이지장, 공장, 회장 및 결장의 상세한 조직학 및 면역조직화학적 분석을 또한 수행한다.

실시예 2. 디펜신에 의한 체중 증가의 예방 및 근육/지방비의 개선뿐만 아니라 간 지방 축적의 예방

물질 및 방법

마우스: 마우스를 3개조로, 그룹당 4개의 케이지에 수용하였다. 사료 섭취를 빛이 차단되기 직전(6 pm)에 매일 기록하였다. 개별 마우스에게 그룹 및 케이지 모두의 방식에서 변경된 순서로 실험 과정을 가하였다. 마우스를 12-시간 명/암 주기하에 SPF 표준 조건으로 실온에서 유지시켰다.

식사: 투여를 위해서, 평균 체중을 마우스당 25 그램인 것으로 추정하였다. 마우스는 하루에 마우스당 대략 3 그램의 사료를 먹는다.

처리 섭생: 마우스에게 고지방 식사(HFD) 또는 저지방(LF) 대조용 식사를 공급하였다. 상기 HFD는 3개의 하위그룹; 1 hBD-2, 1 HD5 및 디펜신 보충이 없는 하나의 표준 HFD를 함유하였다. 디펜신 농도는 하루에 마우스 ㎏당 1,2 ㎎ hBD-2이었다. HD5는 hBD-2에 동몰 농도로 제공되었다. 시험: 인슐린 내성 시험(ITT), 글루코스-자극된 인슐린 분비(GSIS) 시험, 경구 글루코스 내성 시험(OGTT) 및 5시간 공복 인슐린 시험을 2일에 걸쳐, 하루에 그룹당 마우스의 50%를 사용하여 수행하였으며, 따라서 교락 인자로서 매일 행해지는 변화를 피한다.

결과(실시예 1 및 2)

상기 HFD 그룹들에서, 종료시에, 알파, 베타 및 알파 및 베타 디펜신으로 처리된 마우스는 처리되지 않은 마우스보다 적은 체중 증가, 높은 근육/지방비뿐만 아니라 적은 간 지방 축적을 나타낸다.

체중 변화. 사료 섭취는 3개의 실험 식사 그룹 모두에서 유사하였으며, 2개의 고지방 식사(HFD) 그룹은 모두 10주의 연구 기간에 걸쳐 저지방 식사(LFD) 참조 그룹보다 현저하게 더 많이 체중이 증가되었다(^*p<0.0001, 2-원 ANOVA, 터키 사후 검정). 그러나, HFD + hBD-2 그룹은 HFD 참조 그룹보다 현저하게 적게 체중이 증가되었다(^*p=0.0028)(도 7 및 10A).

제지방/지방 질량 발달. 제지방/지방 질량은 연구 개시시 3개의 실험 그룹들간에 균등하게 분포되었다. 상기 연구의 끝에서 2개의 HFD 그룹은 모두 동일한 양의 제지방 질량이 증가되었으며, 이는 추정상 증가된 체질량으로 인해 LFD 그룹보다 현저하게 더 높았다(^*p<0.0001, 1-원 ANOVA, 터키 사후 검정). 상기 연구의 끝에서, HFD + hBD-2 그룹은 LFD 그룹에 비해 증가되는 지방 질량쪽으로 향하는 경향이 있었다. 그러나, 이는 통계학적으로 유의수준이 아니었다(^*p=0.25). 상기 HFD 그룹은 상기 LFD 그룹에 비해 거의 4배의 지방 질량이 증가하였고 상기 HFD + hBD-2 그룹에 비해 2배의 지방 질량이 증가하였다(각각 ^*p<0.0001 및 ^*p=0.005)(도 8A).

인슐린 내성 시험. 상기 LFD 그룹 및 HFD + hBD-2 그룹은 모두 HFD 그룹보다 인슐린에 현저하게 더 민감하였다(p<0.05)(도 9A 및 13A).

글루코스 내성 시험. 상기 HFD 그룹은 15분째에 절정에서부터 120분째에 반-제거까지 연장된 글루코스 제거로 글루코스 내성이었다. 상기 LFD 그룹은 15분째에 절정으로부터 글루코스가 빠르게 제거되었다. 상기 HFD + hBD-2 그룹은 약간 연장된 글루코스 제거를 가졌지만 HFD 그룹보다 현저하게 더 낮은 글루코스 수준에 도달하였다(p<0.05)(도 9B 및 12A).

글루코스 자극된 인슐린 분비. 상기 HFD 그룹은 글루코스 투여에 이어서 현저하게 더 높고 지속적인 인슐린 농도와 함께 손상된 글루코스 항상성을 가졌다(p<0.05). 상기 LFD 그룹은 글루코스 자극에 이어서 인슐린 농도의 증가를 거의 갖지 않았다. 상기 HFD + hBD-2 그룹은 LFD 그룹보다 높지만 그다지 상이하지 않은 인슐린 농도를 가졌다(도 12B 및 9B).

5시간 공복 인슐린. 상기 HFD 그룹은 LFD보다 현저하게 더 높은 공복 인슐린 수준(^*p=0.0004) 및 HFD + hBD-2 그룹보다 현저하게 더 높은 경계선 공복 인슐린(^*p=0.057)과 함께 심하게 당뇨성이었다. 상기 LFD와 HFD + hBD-2 그룹간에 유의수준 차이는 없었다(^*p=0.17)(도 9D).

^*터키 사후 검정, 그렇지 않으면 듄네트 사후 검정.

β-세포 기능 및 인슐린 내성의 평가를 위한 항상성 모델 평가(HOMA-IR). 상기 HFD + hBD-2 그룹에 대한 HOMA-IR은 HFD 그룹보다 현저하게 더 낮았으며 이는 보존된 β-세포 기능 및 제한된 인슐린 내성을 가리킨다(도 13B).

간 대사. 간에서 페록시솜 증식인자 활성화된 수용체 감마(PPARγ2) 발현은 간 지방증을 유도하며 HFD 공급된 대조용 그룹에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다(^*p<0.001). 상기 HFD + hBD-2는 PPARγ2의 현저하게 더 낮은 발현을 생성시켰으며(^*p=0.03), 이는 감소된 지방 축적과 상관있고, 이에 의해 간 지방증을 잠재적으로 보호하는 것으로 예상된다(도 14A).

상기 HFD + hBD-2 그룹과 HFD 그룹간에 간 질량의 유의수준 차이는 없었으며; 상기 두 그룹 모두 LFD 마우스에 비해 간 질량이 현저하게 증가하였다(도 11B). 그러나, 상기 HFD + hBD-2 그룹에서 eWAT는 상기 HFD 그룹에서보다 현저하게 더 낮았다(도 11C).

고지방 식사가 공급된 마우스에서 체중 증가, 비만 및 간 지방 축적의 발달에 대한 예방으로서 hBD-2의 결론:

HFD-hBD-2 공급된 마우스의 50%는 60% HFD가 공급되었음에도 불구하고 LFD 참조 마우스를 닮은 체지방 퍼센트를 가졌다. 몇몇 마우스는 최저 LFD 참조 마우스보다 훨씬 더 낮은 지방%를 가졌다.

놀랍게도 가장 잘 보호된 hBD-2-공급된 마우스는 LFD 참조 마우스와 동일하거나 더 적은 내장 지방 질량을 가졌으며, 이는 60% HFD의 경우 매우 흔치않다.

개선된 인슐린 민감성. hBD-2 공급된 마우스는 LFD 참조 마우스와 그다지 상이하지 않았다. 인슐린 내성 시험 및 HOMA-IR 모두 개선된 인슐린 신호전달을 가리켰다.

글루코스 내성이 HFD 대조용 마우스에 비해 현저하게 개선되었다. 중요하게는, 글루코스 도전 중 글루코스 내성 및 글루코스 자극된 인슐린 응답이 모두 개선되었다. 따라서 상기 hBD-2-공급된 마우스는 HFD 대조용 마우스의 경우보다 글루코스 볼러스를 다루는데 적은 인슐린이 필요하였다.

정소상체 지방이 HFD 대조용 마우스에 비해 HFD + hBD-2 마우스에서 감소되었다. 상기 HFD + hBD-2는 PPARγ2의 현저하게 더 낮은 발현을 생성시켰으며, 이는 감소된 지방 축적을 가리킨다.

체중 증가의 예방, 및 근육/지방비의 개선뿐만 아니라 간 지방 축적의 예방을 위한 HD-5

체중 변화. 모든 HFD 공급된 그룹은 연구 기간 동안 동일한 사료 섭취 및 13주의 실행 기간 동안 동등한 체중 증가를 가졌다(도 20A).

글루코스 내성 시험. 상기 HFD+HD5 처리된 동물 및 HFD 마우스에 대한 글루코스 내성은 LFD 마우스의 경우보다 더 높았다(도 22A).

인슐린 내성 시험. 상기 LFD 그룹은 HFD 공급된 그룹보다 현저하게 더 인슐린 민감성이었다(도 23A).

글루코스 자극된 인슐린 분비. 상기 HFD 그룹은 글루코스 투여에 이어서 현저하게 더 높고 지속적인 인슐린 농도와 함께 손상된 글루코스 항상성을 가졌다(p<0.05). 상기 LFD 그룹은 글루코스 자극에 이어서 인슐린 농도가 거의 증가하지 않았다(도 22B).

β-세포 기능 및 인슐린 내성의 평가를 위한 항상성 모델 평가(HOMA-IR). 상기 HFD + HD-5 그룹에 대한 HMOA-IR은 HFD 그룹보다 그다지 낮지 않았다(도 23B).

간 대사. 간에서 페록시솜 증식인자 활성화된 수용체 감마 2(PPARγ2) 발현은 HFD에 대한 HD-5의 보호 효과 없이, LFD 대조용에 비해 HFD 공급된 그룹에서 증가한다(^*p<0.001)(도 24A). 간에서 페록시솜 아실-조효소 A 옥시다제 1(Acox1)의 발현은 LFD 대조용 그룹에 비해 HFD + HD-5 그룹에서 현저하게 증가하며(^*p=0.0009) HFD 대조용과 HFD + HD-5 그룹간의 경계선 유의수준 차이가 관찰되고(^*p=0.07, 1-원 Anova), 이는 HD-5에 의한 지방산 산화의 보다 높은 수준을 가리킨다(도 24B).

고지방 식사가 공급된 마우스에서 체중 증가, 비만 및 간 지방 축적의 발달에 대한 예방으로서 HD5의 결론:

HD5-공급된 마우스는 HFD-공급된 대조용 마우스보다 적은 경계선 내장 지방을 가졌다. 글루코스 내성의 개선은 없었으며, 이는 hBD-2와 HD5간의 작용 방식의 차이를 암시한다.

간 대사. hBD-2는 PPARγ2의 발현을 현저하게 낮추고, 따라서 간 지방증을 막는 반면, HD5는 Acox1의 발현 및 따라서 지방산 대사를 현저하게 증가시켰다. 간 효소 발현의 이러한 변화는 상이하며 상기 둘 다 간 지방 축적에 대해 잠재적으로 예방성이므로 잠재적으로 상승작용적이다.

실시예 3. 디펜신에 의한 간 지방간염에서 지방 축적의 치료.

물질 및 방법

마우스: 마우스를 3개조로, 그룹당 4개의 케이지에 수용한다. 사료 섭취를 주당 3회 기록한다. 개별 마우스에게 그룹 및 케이지 모두의 방식에서 변경된 순서로 실험 과정을 가한다. 마우스를 SPF 표준 조건으로 실온에서 유지시킨다.

식사: 투여를 위해서, 평균 체중을 마우스당 25 그램인 것으로 추정한다. 마우스는 하루에 마우스당 대략 3 그램의 사료를 먹는다.

처리 섭생: 마우스에게 12주간 고지방 식사(HFD)를 공급한다. 상기 마우스는 상기 12주에 걸쳐 체중이 대략 50 그램으로 2배가 된다. 상기 마우스를 4개의 하위그룹; 1 hBD-2, 1 HD5, 1 hBD-2/HD5 및 디펜신 보충이 없는 하나의 표준 HFD로 분류한다. 디펜신 농도는 하루에 마우스 ㎏당 1,2 ㎎ hBD-2이다. HD5는 hBD-2에 동몰 농도로 제공된다. 조합 그룹은 50% hBD-2 + 50% HD5를 제공하며, 따라서 디펜신의 총량은 나머지 시험 그룹들에 동등하다.

시험: 인슐린 내성 시험(ITT), 글루코스-자극된 인슐린 분비(GSIS) 시험, 및 경구 글루코스 내성 시험(OGTT)을 2일에 걸쳐, 하루에 그룹당 마우스의 50%를 사용하여 수행하였으며, 따라서 교락 인자로서 매일 행해지는 변화를 피한다. 미생물 분석을 수행하여 장내 미생물군을 연구한다. 종방향 16S 특성화를 60마리 마우스로부터의 4쌍 샘플, 총 240개 샘플상에서 수행한다. 각각의 마우스를 디펜신 처리전, 디펜신 처리 개시 1주일, 디펜신 처리 개시 4주후, 및 종료시에 샘플링하여, 디펜신 처리의 결과로서 변 미생물군의 철저한 특성화를 보장한다. 추가로, 소장의 내용물을 종료시에 분석하여(16S 또는 심층 서열분석을 통해), 영양분 흡수의 핵심 부위에서 가능한 변경에 대한 귀중한 이해를 제공한다. 최종적으로, 맹장 내용물의 전체 대사체 프로파일을 수행하여 전신 대사로의 미생물 변경의 번역을 허용한다. 간, 십이지장, 공장, 회장 및 결장의 상세한 조직학 및 면역조직화학적 분석을 또한 수행한다.

결과

상기 디펜신 처리된 그룹들에서, 종료시에, 알파, 베타, 및 알파 및 베타 디펜신으로 처리된 마우스는 처리되지 않은 마우스에 비해 간 지방 축적의 정상화, 체중 손실, 개선된 근육/지방비 및 정상화된 대사 매개변수, 예를 들어 인슐린 내성 시험(ITT), 글루코스-자극된 인슐린 분비(GSIS) 시험, 및 경구 글루코스 내성 시험(OGTT)을 나타낸다.

실시예 4. 디펜신에 의한 체중 증가, 비만 및 간 지방간염에서 지방 축적의 치료.

물질 및 방법

마우스: 마우스를 3개조로, 그룹당 4개의 케이지에 수용하였다. 사료 섭취를 주당 3회 기록하였다. 개별 마우스에게 그룹 및 케이지 모두의 방식에서 변경된 순서로 실험 과정을 가하였다. 마우스를 SPF 표준 조건으로 실온에서 유지시켰다.

식사: 투여를 위해서, 평균 체중을 마우스당 25 그램인 것으로 추정하였다. 마우스는 하루에 마우스당 대략 3 그램의 사료를 먹었다.

처리 섭생: 마우스에게 12주간 고지방 식사(HFD)를 공급하였다. 상기 마우스는 상기 12주에 걸쳐 체중이 대략 50 그램으로 2배가 되었다. 상기 마우스를 3개의 하위그룹; 1 hBD-2, 1 HD5 및 디펜신 보충이 없는 하나의 표준 HFD로 분류하였다. 디펜신 농도는 하루에 마우스 ㎏당 1,2 ㎎ hBD-2이었다. HD5는 hBD-2에 동몰 농도로 제공되었다.

시험: 인슐린 내성 시험(ITT), 글루코스-자극된 인슐린 분비(GSIS) 시험, 및 경구 글루코스 내성 시험(OGTT)을 2일에 걸쳐, 하루에 그룹당 마우스의 50%를 사용하여 수행하였으며, 따라서 교락 인자로서 매일 행해지는 변화를 피하였다.

결과

체중 변화. 표준 고지방 식사(HFD)를 공급한 그룹은 전체 연구 기간을 통해 균등한 사료 섭취를 하였고 처음 13주째에 균등한 지방 및 제지방 질량과 함께 동일한 체중 발달을 가졌으며, 따라서 식사 개입 전에 동일한 출발 점을 가졌다. 체중 증가는 저지방 식사 공급된(LFD) 그룹에서보다 현저하게 더 컸다(^*p<0.05 2-원 ANOVA)(도 15A). 상기 식사 개입 후에, HFD 그룹은 계속해서 체중이 증가하였으나, HFD + hBD-2 그룹은 식사 개입후 처음 4주째에 체중이 덜 증가하는 경향이 있었지만 유의수준은 아니었다(^*p=0.07 2-원 ANOVA). 4주에서부터 연구 기간의 끝까지 상기 HFD + hBD-2 그룹은 표준 HFD 그룹과 유사하게 체중이 증가하였다(^*p=0.82 2-원 ANOVA)(도 15B).

지방 백분율. 전체 체중의 지방 백분율은 연구 기간의 개시시에 3개의 실험 그룹들간에 유사하였다. 식사 개입 시점에서, 2개의 HFD 공급된 그룹의 지방 백분율은 동일하였으며 둘 다 LFD 공급된 그룹보다 현저하게 더 컸고, 이는 상기 식사 개입 후 10주 전체를 통해 일관되었다(^*p<0.05 2-원 ANOVA)(도 16A). 식사 개입 4주후에, 상기 HFD + hBD-2 그룹의 ∼75%는 상기 개입전보다 더 작은 지방 백분율을 가졌으며, 이는 모든 마우스가 증가된 지방 백분율을 갖는 표준 HFD 그룹과 극적으로 대비된다. (도 16B) 지방 백분율의 변화는 상기 시점에서 표준 HFD 그룹보다 HFD + hBD-2 그룹에서 현저하게 더 작았다(^*p=0.003 2-원 ANOVA). 종료시 간의 중량은 LFD 그룹에 비해 HFD 공급된 그룹에서 현저하게 더 컸다(^*p<0.05 일원 ANOVA)(도 17A). 종료시 내장지방(eWAT)의 양은 LFD 그룹에 비해 HFD 공급된 그룹에서 현저하게 더 컸다(^*p<0.05 일원 ANOVA). 상기 HFD 공급된 그룹들간에 내장 지방(eWAT)의 유의수준 차이는 없었다(도 17B).

글루코스 내성 시험. 글루코스 내성은 상기 HFD + hBD-2 그룹에서 식사 개입 시점으로부터 급속하게 개선되었으며, 혈당의 보다 작은 절정뿐만 아니라 2주후에 이미 보다 빠른 글루코스 제거를 보였다(도 18A). 상기 연구에서 가장 글루코스 내성인 마우스는 표준 HFD로부터 HFD + hBD-2로 전환 후 처음 2주째에 대단히 개선되는 것으로 관찰되었다(도 18B).

인슐린 내성 시험. 상기 LFD 그룹은 2개의 HFD 그룹 모두보다 인슐린에 대해 현저하게 더 민감하였다(^*p<0.05 2-원 ANOVA). 상기 HFD + hBD-2 그룹은 동시에 HFD 대조군에 비해 더 인슐린 민감하였으며, 이는 상기 식사 개입 이후 인슐린 내성의 개선을 암시한다(^*p<0.05 2-원 ANOVA)(도 18C).

간 대사. 간에서 페록시솜 아실-조효소 A 옥시다제 1(Acox1)의 발현이 LFD 대조군에 비해 HFD + hBD-2 그룹에서 현저하게 증가하였으며(^*p=0.0027) 이는 hBD-2의 식사 개입에 의한 지방산 산화의 보다 높은 수준을 가리킨다(도 19). 간 중량 및 eWAT 중량은 상기 대조용 HFD 그룹과 HFD + hBD-2 그룹간에 그다지 차이가 없었다(도 17).

고지방 식사 공급된 마우스에서 체중 증가, 비만 및 간 지방 축적의 치료로서 hBD-2의 결론:

- 전체적으로, hBD-2-공급된 마우스는 처음 4주의 개입에서 HFD 대조용 마우스의 경우보다 적게 체중이 증가되었다(도 15A).

- 7/8 비만 및 글루코스 내성 마우스는 단지 2주의 개입에 이어서 그의 글루코스 내성이 현저하게 개선되었다(도 18A). 단일의 마우스가 50 그램 체중 중 대략 20 그램의 지방 질량으로 기준선에서 가장 글루코스 불내성인 마우스였다. 이러한 심하게 건강하지 못한 표현형에도 불구하고, 상기 마우스는 2주의 개입에 의해 글루코스 내성에 관하여 완전하게 구제되었다(도 18B).

- 전신 수준에 대해서, hBD-2-공급된 마우스는 HFD 대조용 마우스보다 덜 인슐린 내성이었다(도 18C). 이는 중증 전신 인슐린 내성이 역전되기에 대단히 어렵고 인간 질병(다른 것들 중에서도 예를 들어 당뇨병, CVD, 몇몇 암)의 치료에서 주요 한계이기 때문에 핵심 포인트이다.

- hBD-2 공급된 마우스는 간에서 증가된 지방산 산화를 가졌다(도 19).

고지방 식사 공급된 마우스에서 체중 증가, 비만 및 간 지방 축적의 치료로서 HD-5

체중 변화. 모든 HFD 공급된 그룹은 연구 기간 동안 동일한 사료 섭취를 하였으며 13주의 실행 기간 동안 균등한 중량 증가를 가졌다(도 25A). 식사 개입후에 HFD + HD-5 공급된 그룹은 HFD 대조용보다 현저하게 적게 체중이 증가되었다(^*p<0.05 2-원 ANOVA)(도 25B). 또한, 상기 HFD + HD-5 그룹에서 지방 백분율이 감소하는 경향이 관찰되었으며(도 26A), 상기 HFD + HD-5에서 현저하게 더 낮은 지방 백분율이 HFD 대조용에 비해 식사 변화후 4주째에 측정되었다(^*p=0.009 2-원 ANOVA)(도 26B). 종료시 간의 중량은 HFD 대조용에 비해 HFD + HD-5 공급된 그룹에서 감소되는 경향이 있었다. 구체적으로, 표준 HFD 공급된 마우스의 ∼50%가 최고의 HFD + HD-5 공급된 마우스보다 더 많이 득점하였다(도 27A). 내장 지방의 중량은 LFD 공급된 그룹보다 HFD 공급된 그룹에서 더 컸다(^*p<0.05 일원 ANOVA)(도 27B).

글루코스 내성 시험. 대표적인 케이지, 케이지 2에서 HFD+HD5 처리된 동물에 대한 글루코스 내성은 상기 개입의 시작에서부터(13-0주) 13.8주까지 시간에 따라 개선되었다(도 28A).

인슐린 내성 시험. 상기 LFD 그룹은 HFD 공급된 그룹보다 현저하게 더 인슐린에 민감하였다(^*p<0.05 2-원 ANOVA). 상기 HFD + HD-5 그룹은 HFD 대조용보다 더 인슐린에 민감하였으며, 이는 상기 식사 개입 이후 인슐린 내성의 개선을 암시한다(^*p<0.05 2-원 ANOVA)(도 28B).

간 대사. 간에서 페록시솜 아실-조효소 A 옥시다제 1(Acox1)의 발현이 3개 그룹 모두에서 실질적으로 동일한 반면(도 29B), PPARγ2의 발현은 LFD 그룹에 비해 2개의 HFD 그룹 모두에서 현저하게 더 높았다(도 29A).

고지방 식사 공급된 마우스에서 체중 증가, 비만 및 간 지방 축적의 치료로서 HD5의 결론:

HD5-공급된 마우스는 HFD-공급된 대조용 마우스에 비해 체중 변화가 현저하게 감소하였다(도 25B).

- 비만 HFD-HD5-공급된 마우스의 지방 질량이 감소하는 일반적인 경향이 존재하였다(도 26A 및 B).

- 간 질량은 HFD-공급된 대조용 마우스에 비해 HD5-공급된 마우스에서 감소하는 경향이 있었다(도 27A). 내장 및 피하 저장소는 그다지 상이하지 않았기 때문에(도 27B), 상기 관찰은 HD5 마우스에서 보통으로 감소된 지방%는 간 지방분해/지질 산화에 국한됨을 암시한다.

- 글루코스 내성은 HD5 공급된 마우스에서 시간에 따라 개선되었다(도 28A).

- HD5 공급된 마우스는 HFD-공급된 대조용 마우스보다 덜 인슐린 내성이었다(도 28b).

중요하게, 식이성 지방의 흡수는 HFD 마우스, HFD + hBD-2 마우스 및 HFD + HD-5 마우스간에 그다지 차이가 없었으며(도 30A), 이는 변 지방 함량이 또한 3개의 그룹 모두에서 필수적으로 유사하였다는 관찰과 일치한다(도 30B).

실시예 5. 고지방 식사 공급된 마우스에서 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 유사체(리라글루티드)에 의한 체중 증가, 비만 및 간 지방 축적의 치료

물질 및 방법.

마우스: 4주 된 C57Bl/6J DIO 수컷 마우스에게 36주 동안 고지방 식사(HFD 60% 지방, SSNIFF(Diet #D12492)) 또는 퓨리나 사료를 공급하였다. 상기 HFD 공급된 그룹은 개입 시작에 의해 대략 55 그램의 평균 체중에 도달하였다. 상기 마우스는 -2주까지 케이지당 10마리를 수용한 그룹이었다. -2주부터 상기 마우스를 연구 전체를 통해 단독 수용하였다. 사료 섭취를 3 pm에 빛을 차단하기 직전에 매일 기록하였다. 개별 마우스에게 그룹 및 케이지 모두의 방식에서 변경된 순서로 실험 과정을 가한다. 마우스를 12-시간 명/암 주기하에 SPF 표준 조건으로 실온에서 유지시킨다.

처리 섭생: 마우스에게 고지방 식사(HFD) 또는 저지방(LF) 대조용 식사를 공급하였다. 상기 HFD는 2개의 하위그룹; 하나의 GLP-1 유사체 및 GLP-1 유사체가 보충되지 않은 하나의 표준 HFD를 함유하였다. 상기 GLP-1 유사체 리라글루티드를 PBS에 용해시키고 0.1% BSA를 가하였다. 상기 GLP-1 유사체를 0.2 ㎎/㎏ BID로 피하 투여하였다.

결과.

상기 GLP-1 유사체는, 상기 GLP-1 유사체로 처리된 마우스가 처리되지 않은 HFD 참조 마우스 그룹에 비해 25 내지 30% 또는 평균 15 그램의 체중을 상실하였기 때문에 체중 강하 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다(도 32).

상기 GLP-1 유사체는 또한 상기 GLP-1 유사체 처리된 마우스 그룹에서 종료시 간 중량(그램)이 사료가 공급된 마우스 그룹의 간 중량과 통계학적 유의수준으로 상이하지 않았기 때문에(p<0.001) 간 지방 축적을 감소시키는 듯하였다(도 33).

이러한 효과에 상응하게 혈장 콜레스테롤 수준은 상기 HFD 참조 마우스 그룹에 비해 상기 GPL-1 유사체 처리된 마우스 그룹에서 통계학적 유의수준으로 더 낮았다(p<0.01)(도 34).

실시예 6. NMRI 마우스에게 4 ㎎/㎏의 단일 경구 위관영양 투여에 따른 hBD-2의 경구 생물학적 이용효능을 측정하고 약동학적 프로파일을 확립시키기 위한 약동학 연구

물질 및 방법

처리 섭생: 21마리의 암컷 NMRI 마우스에게 위관영양 튜브 및 1 ㎖ 주사기를 사용하여 투여당일에 획득한 개별적인 체중에 따라 경구 위관영양에 의해 5 ㎖/㎏을 투여하였다. 무작위 시점에서 복부의 서혜부를 부드럽게 마사지함으로써 소변을 애써 샘플링하였다. 첫 번째 혈액 샘플을 턱밑 샘플링 방법을 사용하여 채혈하였다. 두 번째 혈액 샘플을 이소플루란 마취된 마우스로부터 수집하였다. 장 샘플을 안락사 후에 채취하였다. 각 마우스의 복부를 열어 장의 3개 섹션을 샘플링하였다.

결과

hBD-2는, hBD-2를 혈청 또는 소변 샘플 중 어느 하나에서 HPLC에 의해 검출할 수 없었으므로(모든 값은 <10 pg/㎖의 검출 수준 이하였으므로) 건강한 장으로부터 흡수되지 않는 듯하다. 이는 hBD-2를 마우스에서 4 ㎎/㎏의 경구 투여후 전신적으로 입수할 수 없음을 가리킨다(도 35).

실시예 7. NMRI 암컷 마우스에게 1 ㎎/㎏ hBD-2(분자량 66437 Da)에 상당한 몰의 피하 또는 정맥내 투여에 따른 인간 혈청 알부민의 C-말단(분자량 71.336 Da) 또는 N-말단(분자량 71.666 Da)에 융합된 hBD-2의 약동학적 프로파일

물질 및 방법

처리 섭생: 동물들에게 개별적인 체중에 따라 1.65 ㎎/㎖ 모액 농도의 10 ㎖/㎏(30 그램 마우스의 경우 300 ㎕)을 투여하였다. 첫 번째 혈액 샘플을 턱밑 샘플링 방법을 사용하여 채혈하고 두 번째는 이소플루란 마취 및 안락사에 이어서 채취하였다.

결과

hBD-2는 1시간의 반감기를 나타내었고 2개의 융합된 단백질은 12시간의 반감기를 나타내었다. AUC가 대단히 변하였다. 신장 제거가 또한 hBD-2의 경우 10 ㎖/분에서부터 상기 2개의 융합된 분자의 경우 0.5-2.2 ㎖/분으로 변하였다(도 36, 37 및 38).

본 실시예는 hBD-2의 반감기가 알부민에 대한 C- 또는 N-말단 접합에 의해 현저하게 연장될 수 있음을 입증한다.

실시예 8. 급성 10-일 덱스트란 나트륨 설페이트(DSS) 유발된 마우스 대장염 모델에서 "hBD-2-알부민 융합 N-말단"의 소염 효과.

물질 및 방법

처리 섭생: "hBD-2-알부민 N-말단"을 10 ㎖/㎏ 체중의 투여 부피로 멸균 25G 바늘을 사용하여 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 또는 피하로 투여하였다. 동물들은 10 연속일 동안 매일 1회 용량을 수용하였다. 활성 대조용 덱사메타손(DEX)을 10 ㎎/㎏ 체중 OD의 투여 부피로 1 ㎎/㎏의 용량으로 피하 제공하였다.

결과

"hBD-2-알부민 N-말단"에 의한 처리는 정맥내 경로를 통해 1.65 ㎎/㎏의 용량으로 매일 투여시 질병 활성 지수(DAI)의 현저한 억제를 생성시켰다(p<0.05). 추가로 10일째에 상기 DAI 점수의 현저한 억제가 또한, "hBD-2-알부민 N-말단"을 각각 1.65 ㎎/㎏의 용량 및 125 ㎎/㎏의 용량으로 매일 피하 투여시 관찰되었다(p<0.05).

덱스트란 나트륨 설페이트의 투여는 조직검사후 입증된 바와 같이 결장 조직의 상당한 염증 및 손상을 생성시켰다. "hBD-2-알부민 N-말단"에 의한 처리는 상기 조직학적 손상의 어떠한 통계학적 유의수준의 감소도 생성시키지 않았고, 유사하게 활성 대조용 DEX도 조직학적 손상을 현저하게 감소시키지 못했다.

상기 결과들은 2 및 3일째에 일시적인 체중 감소에도 불구하고 "hBD-2-알부민 N-말단"으로 처리된 동물에서 7일째에 현저한 체중 증가를 추가로 보였으며, 이는 "hBD-2-알부민 N-말단"이 쥐 DSS 모델(대개는 극적인 체중 손실과 관련된다)에서 확연한 체중 보존 효과를 가짐을 가리킨다. 대조적으로 상기 DEX 처리된 동물은 5일째부터 계속해서 매우 현저한 체중 감소를 나타내었다(p<0.01).

본 실시예는 hBD-2-알부민 융합 N-말단이 염증 상태의 동물 모델에서 생물학적으로 활성임을 입증한다(도 39).

실시예 9. 급성 10-일 덱스트란 나트륨 설페이트(DSS) 유발된 마우스 대장염 모델에서 "hBD-2-알부민 융합 C-말단"의 소염 효과.

물질 및 방법

처리 섭생: "hBD-2-알부민 C-말단"을 10 ㎖/㎏ 체중의 투여 부피로 멸균 25G 바늘을 사용하여 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 또는 피하로 투여하였다. 동물들은 10 연속일 동안 매일 1회 용량을 수용하였다. 활성 대조용 프레드니솔론(Pred)을 10 ㎎/㎏ 체중 OD의 투여 부피로 1 ㎎/㎏의 용량으로 위관영양에 의해 경구로 제공하였다.

결과

"hBD-2-알부민 C-말단"에 의한 처리는 정맥내 경로를 통해 1.6 ㎎/㎏의 용량으로 매일 투여시 DAI의 현저한 억제를 생성시켰다(p<0.05). 추가로 "hBD-2-알부민 C-말단"은 격일로 0, 2, 4, 6, 8 및 10일째에 정맥내 경로를 통해 1.6 ㎎/㎏의 용량으로 투여시 DAI의 현저한 억제를 생성시켰다(p<0.05). Pred에 의한 매일 처리는 9일째에 상기 DAI의 현저한 억제를 생성시켰다(p<0.05).

덱스트란 나트륨 설페이트의 투여는 조직검사후 입증된 바와 같이 결장 조직의 상당한 염증 및 손상을 생성시켰다. 1.6 ㎎/㎏ 용량의 "hBD-2-알부민 C-말단"에 의한 처리는 상기 조직학적 손상의 통계학적 유의수준의 감소를 생성시켰다(p<0.05). 유사하게, 0, 2, 4, 6, 8 및 10일째에 1.6 ㎎/㎏ 및 16.5 ㎎/㎏ 용량의 "hBD-2-알부민 C-말단"의 매일 처리는 결장에 대한 조직학적 손상의 현저한 감소를 생성시켰다(p<0.01). 활성 대조용 Pred에 의한 처리는 결장의 근위 부분에서 조직학적 손상을 현저하게 감소시키지 못했으나 원위 결장의 손상은 감소시켰다(p<0.01).

상기 결과들은 "hBD-2-알부민 C-말단"으로 처리된 동물에서 현저한 체중 증가를 추가로 보였으며(p<0.05), 이는 "hBD-2-알부민 C-말단"의 체중 보존 효과를 가리킨다.

본 실시예는 hBD-2-알부민 융합 C-말단이 염증 상태의 동물 모델에서 생물학적으로 활성임을 입증한다.

실시예 10. 서열

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및 하기의 특허 및 특허 출원:

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WO 92/06204

WO 95/17413

WO 95/22625

US 5,223,409

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Claims (42)

1. 인간 베타-디펜신 2(hBD-2), 절두된 인간 베타-디펜신 2(절두된 hBD-2), 인간 베타-디펜신 1(hBD-1), 인간 베타-디펜신 3(hBD-3) 및 인간 베타-디펜신 4(hBD-4)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 포유동물 β-디펜신을 포함하는, 간, 담관, 또는 췌장의 질병 또는 장애의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 간, 담관, 또는 췌장의 질병 또는 장애의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로서,
   상기 질병 또는 장애가 독성 간 질병, 알콜성 또는 비-알콜성 지방간 질병(NAFLD), 간경변증(liver cirrhosis), 간부전, 간섬유증, 간경화증(liver sclerosis), 간성 뇌병증, 비-알콜성 지방간염(NASH), 담관염, 원발성 경화성 담관염, 담낭염, 및 췌장염으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   포유동물 β-디펜신이 hBD-1(서열번호 4), hBD-2(서열번호 5), hBD-3(서열번호 6), hBD-4(서열번호 7), 및 절두된 hBD-2(서열번호 17)로 이루어진 그룹에서 선택되는 서열을 포함하는, 약학 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   포유동물 β-디펜신이 1주일에 적어도 1회, 2회 또는 3회 투여되는, 약학 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   포유동물 β-디펜신이 반감기 연장 펩티드를 추가로 포함하지 않는, 약학 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   디펜신이 이를 필요로 하는 대상체에게 0.1 ㎎ hBD-2/㎏ 내지 10 ㎎ hBD-2/㎏의 1일 투여량으로 투여되는, 약학 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   디펜신이 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합할 수 있는 분자, 트랜스페린, 알부민(HAS), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 호모-아미노산 중합체(HAP), 프롤린-알라닌-세린 중합체(PAS), 또는 엘라스틴-유사 펩티드(ELP), 히알루론산, 음으로 하전된 고도로 시알릴화된(sialylated) 펩티드, 인간 IgG, 및 CH3(CH2)nCO-(여기에서 n은 8 내지 22이다)로 이루어진 군으로부터 선택되는 반감기 연장 펩티드; 세포 침투 펩티드(CPP); 알부민 결합 모이어티(ABM); 및 검출성 모이어티(Z)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 추가 모이어티를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   질병 또는 장애가 독성 간 질병, 알콜성 또는 비-알콜성 지방간 질병(NAFLD), 간경변증, 간부전, 간섬유증, 간경화증, 간성 뇌병증 및 비-알콜성 지방간염(NASH) 중에서 선택된 간 장애인, 약학 조성물.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   질병 또는 장애가 NAFLD 및 NASH 중에서 선택된 간 질병인, 약학 조성물.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   질병 또는 장애가 담관염, 원발성 경화성 담관염, 및 담낭염 중에서 선택되는 담관 장애인, 약학 조성물.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    질병이 췌장염인, 약학 조성물.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    적어도 하나의 포유동물 α-디펜신 및 적어도 하나의 포유동물 β-디펜신을 포함하는, 약학 조성물.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    포유동물 β-디펜신을 단독으로, 또는 항생제 또는 인슐린/인슐린 유사체 또는 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1)/GLP-1 유사체 또는 글루카곤 유사 펩티드-2(GLP-2)/GLP-2 유사체 또는 디펩티딜 펩티다제 IV(DPP-IV) 억제제 또는 메트포르민 또는 나트륨 글루코스 운반체-2(SGLT-2) 억제제 또는 글루카곤 수용체 길항제 또는 일시적 수용체 전위 양이온 채널 서브패밀리 V 구성원 1(TRPV1) 길항제와 조합하여 포함하는, 약학 조성물.
13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    포유동물 디펜신이 hBD-2인, 약학 조성물.
14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    대상체가 하기의 증상 중 하나 이상을 갖는, 약학 조성물:
    · 25 이상의 BMI;
    · 적어도 42 mmol/mol Hb의 당화 헤모글로빈 수준;
    · 상승된 혈압: ≥ 140/90 mmHg;
    · 이상지질혈증: 트리글리세라이드(TG): ≥ 1.695　mmol/L 및 고-밀도 지단백질 콜레스테롤(HDL-C) ≤ 0.9　mmol/L(남성), ≤ 1.0　mmol/L(여성);
    · AST/ALT > 1;
    · 공복혈당 > 6.1 mmol/L;
    · 중심성 비만: 허리:엉덩이 비 > 0.90(남성); > 0.85(여성); 및
    · 미세알부민뇨: 뇨 알부민 분비 비 ≥ 20 ㎍/분 또는 알부민:크레아티닌 비 ≥ 30 ㎎/g.
15. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    식품 또는 음료 보충제로서 투여되는, 약학 조성물.
16. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    약학 조성물을 필요로 하는 대상체에 대한 약학 조성물의 투여가 경구 또는 피하인, 약학 조성물.
17. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 예방 또는 치료가 간 지방, 간 지방증, 또는 내장 지방 중 적어도 하나를 감소시키는, 약학 조성물.
18. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 예방 또는 치료가 간의 PPARγ2 발현을 감소시키거나, 간의 Acox1 발현을 증가시키는, 약학 조성물.
19. hBD-2, 절두된 hBD-2, hBD-1, hBD-3 및 hBD-4로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 포유동물 β-디펜신의 유효량을 포함하는, 대상체에서 간 지방, 간 지방증, 또는 내장 지방 중 적어도 하나를 감소시키기 위한 약학 조성물.
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