KR102456212B1 - 발광성 기질을 안정화시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

발광성 기질을 안정화시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

발광성 기질, 예컨대 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체를 안정화시키기 위한 조성물 및 방법이 본 명세서에 개시되어 있다. 작용성 유사체는 퓨리마진일 수 있다. 이 조성물은 발광성 기질, 티오뉴클레오사이드 및 유기 용매를 포함할 수 있고, 여기서 티오뉴클레오사이드는 분해에 대해 발광성 조성물을 안정화시키기에 효과적인 양으로 존재한다. 본 명세서에 제공된 방법은 발광성 기질을 유기 용매의 존재 하에 유효량의 티오뉴클레오사이드와 접촉시킴으로써 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킨다. 이 조성물을 수용하는 키트가 본 명세서에 또한 제공된다.

Description

발광성 기질을 안정화시키기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR STABILIZING LUMINOGENIC SUBSTRATES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2014년 5월 23일에 출원된 미국 가출원 제62/002,363호(이의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함됨)에 대한 우선권을 주장한다.
기술분야
본 발명은 발광성 기질을 안정화시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
발광은 리포터 분자의 활성의 측정치로서 생물학적 검정에서 대개 사용된다. 리포터 분자는 결국 발광성 측정을 관심 있는 생물학적 과정, 예컨대 전사(유전자 발현), 번역(단백질 발현), 단백질-단백질 상호작용, 및 기타 등등과 연결시키고, 이로써 생물학적 과정에서 발생하는 변화의 정량적 측정을 허용한다.
리포터 분자는 통상적으로, 발광성 기질이 제공될 때, 광을 생성하는, 즉 발광하는, 발광성 효소(예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제, 레닐라(Renilla) 루시퍼라제, 오플로포러스(Oplophorus) 루시퍼라제 등)이다. 그러나, 발광성 기질은 저장 동안 분해되어서 생물학적 검정에서 첨가 또는 사용 전에 기질을 소실할 수 있다. 이러한 분해는 온도 의존적 방식으로 시간이 지남에 따라 용액 중의 발광성 기질의 불안정성을 발생시킬 수 있다. 이 분해는 발광성 기질이 폐기되게 하고, 분해된 발광성 기질을 사용하는 생물학적 검정으로부터 유도된 발광성 측정의 감수성 및 재현가능성을 감소시킨다. 추가적으로, 이 분해로부터의 생성물은 대개 발광성 반응을 저해한다.
따라서, 발광성 반응에서의 사용 전에 발광성 기질을 안정화시키기 위한 새로운 조성물 및/또는 방법의 확인 및 개발에 대한 수요가 존재한다.
본 개시내용은 (a) 발광성 기질; (b) 유효량의 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체; 및 (c) 유기 용매를 포함하는 조성물을 제공한다:
Figure 112016116106321-pct00001
식 중,
R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 카복실산, 에스터, NRaRb, 이민, 하이드록실 또는 옥소(oxo)이고;
R2는 수소, NRaRb, 이민, 알킬 또는 아릴이며; 그리고
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이다.
본 개시내용은 또한 단일 용기 내에 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공하고, 여기서 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체는 발광성 기질을 안정화시킨다.
본 개시내용은 추가로 발광성 기질을 안정화시키는 방법으로서, 발광성 기질을 유기 용매의 존재 하에 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체와 접촉시킴으로써, 발광성 기질은 분해에 대해 안정화되는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 화학식 (I)의 화합물은 하기와 같다:
Figure 112016116106321-pct00002
식 중,
R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 카복실산, 에스터, NRaRb, 이민, 하이드록실 또는 옥소이고;
R2는 수소, NRaRb, 이민, 알킬 또는 아릴이며; 그리고
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이다.
도 1은 ATT의 존재(A) 및 부재(B) 하의 코엘렌테라진의 안정성을 보여준다.
도 2는 ATT의 존재(A) 및 부재(B) 하의 코엘렌테라진-h의 안정성을 보여준다.
도 3은 ATT의 존재(A) 및 부재(B) 하의 코엘렌테라진-h-h의 안정성을 보여준다.
도 4는 ATT의 존재(A) 및 부재(B) 하의 퓨리마진의 안정성을 보여준다.
도 5는 (A)에서 ATT의 존재 및 부재 하의 퓨리마진의 안정성을 보여주고; (B),(C) 및 (D)에서, ATT의 존재 및 부재 하의 분해 생성물의 형성을 보여준다.
도 6은 ATT의 존재 하의 퓨리마진에 대한 아레니우스 도면을 보여준다.
도 7은 ATT의 부재 하의 퓨리마진에 대한 아레니우스 도면을 보여준다.
도 8은 ATT의 존재 하의 코엘렌테라진에 대한 아레니우스 도면을 보여준다.
도 9는 ATT의 부재 하의 코엘렌테라진에 대한 아레니우스 도면을 보여준다.
도 10은 ATT의 존재 하의 코엘렌테라진-h에 대한 아레니우스 도면을 보여준다.
도 11은 ATT의 부재 하의 코엘렌테라진-h에 대한 아레니우스 도면을 보여준다.
도 12는 ATT의 존재 하의 코엘렌테라진-h-h에 대한 아레니우스 도면을 보여준다.
도 13은 ATT의 부재 하의 코엘렌테라진-h-h에 대한 아레니우스 도면을 보여준다.
도 14는 (A) 실온 및 (B) 40℃에서 광의 존재 및 ATT의 존재 또는 부재 하의 퓨리마진에 대한 아레니우스 도면을 보여준다.
도 15는 실온, 40℃ 및 60℃에서 ATT의 존재 또는 부재 하의 DMSO 중의 퓨리마진의 안정성을 보여준다.
도 16은 (A) 티오뉴클레오사이드의 존재 또는 부재 하의 퓨리마진에 대한 0일 시점(t=0)으로부터의 시간(일)에 따른 활성의 백분율 및 (B) 도 16a에서 각각의 샘플에 대한 일 단위의 37℃에서의 반감기를 보여준다.
도 17은, 0.25μM 퓨리마진(Fz)에 대해 시간(일)에 대해 작도된, 0일 시점(t=0)으로 정규화된, 정규화된 상대 광 단위(relative light unit: RLU)를 보여준다. 도 17에서, 퓨리마진은 ATT의 존재 및 부재 하에, 그리고 상이한 유기 용매(즉, 50% 폴리에틸렌 글라이콜(PG):50% 에탄올; 60% 폴리에틸렌 글라이콜(PG):40% 에탄올; 및 15% 글라이세롤:85% 에탄올)의 존재 하에 37℃에 있었다.
본 발명은 발광성 기질을 안정화시키기 위한 조성물에 관한 것이다. 발광성 기질은 코엘렌테라진, 코엘렌테라진-h, 코엘렌테라진-h-h, 퓨리마진, 이들의 유도체, 이들의 유사체, 또는 임의의 이들의 조합일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 조성물은 발광성 기질, 티오뉴클레오사이드 및 유기 용매를 포함할 수 있다. 이 조성물은 발광성 효소를 포함하거나 함유하지 않을 수 있다.
티오뉴클레오사이드는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00003
식 중,
R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 카복실산, 에스터, NRaRb, 이민, 하이드록실 또는 옥소이고;
R2는 수소, NRaRb, 이민, 알킬 또는 아릴이며; 그리고
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이다.
티오뉴클레오사이드는 광의 존재 하에, 광의 부재 하에, 및/또는 상이한 온도에서 시간에 따른 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 광의 존재 하에, 광의 부재 하에 및/또는 상이한 온도에서 시간에 따른 하나 이상의 분해 생성물로의 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다.
그러므로, 조성물 내의 티오뉴클레오사이드의 포함은, 티오뉴클레오사이드를 포함하지 않는 조성물과 비교하여, 하나 이상의 분해 생성물의 형성을 억제하거나 감소시킴으로써 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다. 이것은 결국 검정에서의 발광성 기질의 사용 전에 발광성 기질의 상당한 분해 없이 특정한 온도에서, 광의 존재 하에 및/또는 광의 부재 하에 일정한 시간 동안 발광성 기질을 저장하거나 항온처리하는 능력을 제공한다.
본 발명은 또한 발광성 기질을 안정화시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시키고/시키거나, 하나 이상의 분해 생성물의 형성을 억제하거나 감소시킬 수 있다. 이 방법은 발광성 기질을 유기 용매의 존재 하에 유효량의 티오뉴클레오사이드(예를 들어, 225mM)와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 접촉 단계는 상기 기재된 조성물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
1. 정의
달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당해 분야의 당업자가 보통 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 상충의 경우에, 정의를 포함하는 본 문헌이 우세할 것이다. 바람직한 방법 및 재료가 하기 기재되어 있지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 교시에서 사용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참조문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 본 명세서에 개시된 재료, 방법 및 실시예는 오직 예시적이고 제한으로 의도되지 않는다.
용어 "포함한다", "포함하는", "가지는", "갖는다", "수 있다", "함유한다" 및 이의 변형어는, 본 명세서에 사용된 바대로, 추가적인 행동 또는 구조의 가능성을 불가능하게 하지 않는 개방 말단 변환 구절, 용어 또는 단어인 것으로 의도된다. 단수 형태 "일", "및" 및 "이"는, 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한, 복수 지시어를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 명확히 기재되든 그렇지 않든, 본 명세서에 제시된 실시형태 또는 구성요소를 "포함하는", "이들로 이루어진" 및 "이들로 본질적으로 이루어진" 다른 실시형태 고려한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "알킬"은 1개 내지 30개의 탄소 원자, 1개 내지 10개의 탄소 원자, 1개 내지 6개의 탄소 원자 또는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 의미한다. 용어 "C1-C4-알킬"은 선형 또는 분지형 배열에서 1개, 2개, 3개 또는 4개의 탄소를 가지는 알킬기를 포함하는 것으로 정의된다. 예를 들어, "C1-C4-알킬"은 구체적으로 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-뷰틸, t-뷰틸 및 i-뷰틸을 포함한다. 용어 "C1-C6-알킬"은 선형 또는 분지형 배열에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 탄소를 가지는 알킬기를 포함하는 것으로 정의된다. 예를 들어, "C1-C6-알킬"은 구체적으로 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-뷰틸, t-뷰틸, i-뷰틸, 펜틸 및 헥실을 포함한다. 본 발명의 알킬기는 비치환되거나 본 명세서에 정의된 바와 같은 1개 이상의 적합한 치환기, 바람직하게는 1개 내지 3개의 적합한 치환기에 의해 치환될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "알킬-아릴"은 본 명세서에 정의된 바와 같은 알킬기를 통해 모 분자 모이어티에 부착된 본 명세서에 정의된 바와 같은 아릴기를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 알킬기는 C1-C4-알킬일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "알킬-헤테로아릴"은 본 명세서에 정의된 바와 같은 알킬기를 통해 모 분자 모이어티에 부착된 본 명세서에 정의된 바와 같은 헤테로아릴기를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 알킬기는 C1-C4-알킬일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "사이클로알킬"은 3개 내지 10개의 탄소 원자, 0개의 이종원자 및 0개의 이중 결합을 함유하는 탄소환식 고리계를 의미한다. 사이클로알킬의 대표적인 예는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐 및 사이클로데실을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "아릴"은 단환식, 이환식 또는 삼환식 방향족 라디칼을 의미한다. 아릴기의 대표적인 예는 페닐, 다이하이드로인데닐, 인데닐, 나프틸, 다이하이드로나프탈레닐 및 테트라하이드로나프탈레닐을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 아릴기는 본 명세서에 정의된 바와 같은 1개 이상의 적합한 치환기, 바람직하게는 1개 내지 5개의 적합한 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "카복실산"은 COOH를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "유효량"은 하나 이상의 분해 생성물 또는 분해물로의 분해에 대해 본 명세서에 기재된 바와 같은 발광성 기질의 원하는 안정화를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 본 명세서에 기재된 바와 같은 티오뉴클레오사이드의 양을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "에스터"는 CO2Rc(여기서, Rc는 알킬 또는 아릴임)를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "헤테로아릴"은 단환식 헤테로아릴 또는 이환식 헤테로아릴을 의미한다. 단환식 헤테로아릴은 5원 또는 6원 고리이다. 5원 고리는 2개의 이중 결합을 함유한다. 5원 고리는 O 또는 S로부터 선택된 1개의 이종원자; 또는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 질소 원자 및 임의로 1개의 산소 또는 황 원자를 함유할 수 있다. 6원 고리는 3개의 이중 결합 및 1개, 2개, 3개 또는 4개의 질소 원자를 함유한다. 단환식 헤테로아릴의 대표적인 예는 퓨라닐, 이미다졸릴, 아이속사졸릴, 아이소티아졸릴, 옥사다이아졸릴, 1,3-옥사졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피롤릴, 테트라졸릴, 티아다이아졸릴, 1,3-티아졸릴, 티에닐, 트라이아졸릴 및 트라이아지닐을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이환식 헤테로아릴은 페닐에 융합된 단환식 헤테로아릴, 또는 단환식 사이클로알킬에 융합된 단환식 헤테로아릴, 또는 단환식 사이클로알케닐에 융합된 단환식 헤테로아릴, 또는 단환식 헤테로아릴에 융합된 단환식 헤테로아릴, 또는 단환식 헤테로사이클에 융합된 단환식 헤테로아릴을 포함한다. 이환식 헤테로아릴기의 대표적인 예는 벤조퓨라닐, 벤조티에닐, 벤즈옥사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사다이아졸릴, 6,7-다이하이드로-1,3-벤조티아졸릴, 이미다조[1,2-a]피리디닐, 인다졸릴, 인돌릴, 아이소인돌릴, 아이소퀴놀리닐, 나프티리디닐, 피리도이미다졸릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 티아졸로[5,4-b]피리딘-2-일, 티아졸로[5,4-d]피리미딘-2-일 및 5,6,7,8-테트라하이드로퀴놀린-5-일을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 헤테로아릴기는 비치환되거나 본 명세서에 정의된 바대로 1개 이상의 적합한 치환기, 바람직하게는 1개 내지 5개의 적합한 치환기에 의해 치환될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "이민"은 -N=CRd(여기서, Rd는 본 명세서에 정의된 바와 같은 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬임)를 의미한다. Rd는 비치환되거나 본 명세서에 정의된 바와 같은 1개 이상의 적합한 치환기에 의해 치환될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "하이드록시"는 -OH 기를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "옥소"는 결합 파트너가 탄소 원자인 이중 결합된 산소(=O) 라디칼을 의미한다. 이러한 라디칼은 카보닐기로 또한 생각될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "적합한 치환기"는 화학적으로 허용되는 작용기, 예를 들어 본 발명의 화합물의 활성을 무효화하지 않는 모이어티를 의미하는 것으로 의도된다. 적합한 치환기의 예시적인 예는 할로기, 퍼플루오로알킬기, 퍼플루오로알콕시기, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 하이드록시기, 할로기, 옥소기, 머캅토기, 알킬티오기, 알콕시기, 나이트로기, 아자이드알킬기, 아릴 또는 헤테로아릴기, 아릴옥시 또는 헤테로아릴옥시기, 아르알킬 또는 헤테로아르알킬기, 아르알콕시 또는 헤테로아르알콕시기, HO-(C=O)-기, 헤테로사이클릭기, 사이클로알킬기, 아미노기, 알킬- 및 다이알킬아미노기, 카바모일기, 알킬카보닐기, 알킬카보닐옥시기, 알콕시카보닐기, 알킬아미노카보닐기, 다이알킬아미노 카보닐기, 아릴카보닐기, 아릴옥시카보닐기, 알킬설포닐기, 아릴설포닐 기 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 치환기는 추가적인 치환기에 의해 치환될 수 있다.
치환기가 기로부터 "독립적으로 선택된" 것으로 기재된 경우, 각각의 치환기는 서로 독립적으로 선택된다. 따라서, 각각의 치환기는 다른 치환기(들)와 동일하거나 상이할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "광"은 가시광선, 백색 광(3개의 주요 광, 적색 광, 청색 광 및 황색 광의 조합일 수 있음), 보라색 광, 청색 광, 청색-녹색 광, 녹색 광, 황색-녹색 광, 황색 광, 오렌지색 광, 적색 광, 또는 근자외선 광, 또는 임의의 이들의 조합을 의미할 수 있다. 용어 "광"은 전자기 스펙트럼, 예를 들어 가시광선(이것으로 제한되지는 않음)의 구역으로부터의 광을 의미할 수 있다. 용어 "광"은 약 380㎚ 내지 약 780㎚, 또는 약 400㎚ 내지 약 700㎚의 파장을 가지는 광을 또한 의미할 수 있다. 용어 "광"은 형광성 전구, 발광 다이오드(LED) 전구, 백열성 전구, 또는 임의의 이들의 조합으로부터의 광을 추가로 의미할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 암소는 광의 부재일 수 있다.
본 명세서에서 숫자 범위의 언급의 경우, 동일한 정도의 정확성을 가지는 이들 사이의 각각의 개재하는 숫자가 명확히 고려된다. 예를 들어, 6-9의 범위의 경우에, 숫자 7 및 8이 6 및 9 이외에 고려되고, 6.0-7.0의 범위의 경우에, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명확히 고려된다.
2. 조성물
본 발명은 발광성 기질, 티오뉴클레오사이드 및 유기 용매를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 발광성 효소를 함유하지 않는다. 이 조성물은 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다. 이 조성물은, 티오뉴클레오사이드를 함유하지 않는 조성물과 비교하여, 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 발광성 기질로부터의 하나 이상의 분해 생성물의 형성을 감소시키거나 억제할 수 있다. 예를 들어, 하기 더 자세히 기재된 것처럼, 티오뉴클레오사이드는 하나 이상의 분해 생성물, 예컨대 퓨리마마이드 및 아미노피라진으로의 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다.
이 조성물은 광의 부재 하에(즉, 암소에서) 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다. 이 조성물은, 티오뉴클레오사이드를 함유하지 않는 조성물과 비교하여, 광의 부재 하에 발광성 기질의 반감기를 증가시킬 수 있다.
이 조성물은 광의 존재 하에 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다. 이 조성물은, 티오뉴클레오사이드를 함유하지 않는 조성물과 비교하여, 광의 존재 하에 발광성 기질의 반감기를 증가시킬 수 있다. 이 조성물은, 티오뉴클레오사이드를 함유하지 않는 조성물과 비교하여, 광의 존재 하에 발광성 기질의 반감기를 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3.0배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4.0배, 4.1배, 4.2배, 4.3배, 4.4배, 4.5배, 4.6배, 4.7배, 4.8배, 4.9배 또는 5.0배 증가시킬 수 있다.
이 조성물은 약 -120℃ 내지 약 80℃, 약 -110℃ 내지 약 80℃, 약 -100℃ 내지 약 80℃, 약 -90℃ 내지 약 80℃, 약 -85℃ 내지 약 80℃, 약 -80℃ 내지 약 80℃, 약 -75℃ 내지 약 80℃, 약 -70℃ 내지 약 80℃, 약 -65℃ 내지 약 80℃, 약 -60℃ 내지 약 80℃, 약 -55℃ 내지 약 80℃, 약 -50℃ 내지 약 80℃, 약 -45℃ 내지 약 80℃, 약 -40℃ 내지 약 80℃, 약 -35℃ 내지 약 80℃, 약 -30℃ 내지 약 80℃, 약 -25℃ 내지 약 80℃, 약 -20℃ 내지 약 80℃, 약 -15℃ 내지 약 80℃, 약 -10℃ 내지 약 80℃, 약 -5℃ 내지 약 80℃, 약 0℃ 내지 약 80℃, 약 -120℃ 내지 약 75℃, 약 -120℃ 내지 약 70℃, 약 -120℃ 내지 약 65℃, 약 -120℃ 내지 약 60℃, 약 -120℃ 내지 약 55℃, 약 -120℃ 내지 약 50℃, 약 -120℃ 내지 약 45℃, 약 -120℃ 내지 약 40℃, 약 -120℃ 내지 약 35℃, 약 -120℃ 내지 약 30℃, 약 -120℃ 내지 약 25℃, 약 -120℃ 내지 약 20℃, 약 -100℃ 내지 약 70℃, 약 -80℃ 내지 약 60℃, 약 -80℃ 내지 약 55℃, 약 -80℃ 내지 약 50℃, 약 -80℃ 내지 약 45℃, 약 -80℃ 내지 약 40℃, 약 -80℃ 내지 약 35℃, 약 -80℃ 내지 약 30℃, 약 -80℃ 내지 약 25℃, 약 -20℃ 내지 약 60℃, 약 -20℃ 내지 약 55℃, 약 -20 내지 약 50℃, 약 -20℃ 내지 약 45℃, 약 -20℃ 내지 약 40℃, 약 -20℃ 내지 약 35℃, 약 -20℃ 내지 약 30℃, 또는 약 -20℃ 내지 약 25℃의 온도에서 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다.
이 조성물은 약 -120℃, -115℃, -110℃, -105℃, -100℃, -95℃, -90℃, -89℃, -88℃, -87℃, -86℃, -85℃, -84℃, -83℃, -82℃, -81℃, -80℃, -79℃, -78℃, -77℃, -76℃, -75℃, -74℃, -73℃, -72℃, -71℃, -70℃, -69℃, -68℃, -67℃, -66℃, -65℃, -64℃, -63℃, -62℃, -61℃, -60℃, -59℃, -58℃, -57℃, -56℃, -55℃, -54℃, -53℃, -52℃, -51℃, -50℃, -49℃, -48℃, -47℃, -46℃, -45℃, -44℃, -43℃, -42℃, -41℃, -40℃, -39℃, -38℃, -37℃, -36℃, -35℃, -34℃, -33℃, -32℃, -31℃, -30℃, -29℃, -28℃, -27℃, -26℃, -25℃, -24℃, -23℃, -22℃, -21℃, -20℃, -19℃, -18℃, -17℃, -16℃, -15℃, -14℃, -13℃, -12℃, -11℃, -10℃, -9 ℃, -8℃, -7℃, -6℃, -5℃, -4℃, -3℃, -2℃, -1℃, 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 75℃ 또는 80℃에서 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다. 이 조성물은 약 -80℃, 약 -20℃, 약 4℃ 또는 약 20℃에서 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다.
이 조성물은 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 35일, 40일, 45일, 50일, 55일, 60일, 65일, 70일, 75일, 80일, 85일, 90일, 100일, 110일, 120일, 130일, 140일, 150일, 160일, 170일, 180일, 190일, 200일, 210일, 220일, 230일, 240일, 250일, 260일, 270일, 280일, 290일, 300일, 310일, 320일, 330일, 340일, 350일, 360일, 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년 동안 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다.
이 조성물은, 티오뉴클레오사이드를 함유하지 않는 조성물과 비교하여, 발광성 기질의 반감기를 적어도 약 1.25배, 1.5배, 1.75배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배 또는 25배 증가시킬 수 있다.
a. 발광성 기질
이 조성물은 발광성 기질을 포함한다. 발광성 기질은 화학 반응을 통해 광을 생성할 수 있는 분자일 수 있다. 발광성 기질은 코엘렌테라진, 코엘렌테라진-h, 코엘렌테라진-h-h, 퓨리마진, 이들의 작용성 유사체(functional analog), 이들의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다. 발광성 기질은 미국 특허 제8,809,529호 및 미국 특허 출원 공보 제2015/0064731호(이들 둘 다의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함됨)에 개시된 하나 이상의 화합물일 수 있다.
상기 기재된 바대로, 이 조성물은 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킨다. 발광성 기질은 하기 더 자세히 기재된 티오뉴클레오사이드에 의한 분해에 대해 안정화될 수 있다. 발광성 기질은 티오뉴클레오사이드에 의한 하나 이상의 분해 생성물로의 분해에 대해 안정화될 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 상기 기재된 바대로 광의 존재 하에, 광의 부재 하에 및/또는 상이한 온도에서 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다.
발광성 기질은 약 0.5mM 내지 약 10mM, 약 0.75mM 내지 약 10mM, 약 1.0mM 내지 약 10mM, 약 0.5mM 내지 약 9mM, 약 0.5mM 내지 약 8mM, 약 0.5mM 내지 약 7mM, 약 0.5mM 내지 약 6mM, 약 0.5mM 내지 약 5mM, 약 0.5mM 내지 약 4mM, 약 0.5mM 내지 약 3mM, 또는 약 0.5mM 내지 약 2mM에서 조성물에 존재할 수 있다. 발광성 기질은 약 0.5mM, 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.25mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM, 5mM, 5.5mM, 6mM, 6.5mM, 7mM, 7.5mM, 8mM, 8.5mM, 9mM, 9.5mM, 또는 10mM에서 조성물에 존재할 수 있다.
(1) 코엘렌테라진
발광성 기질은 코엘렌테라진, 이의 작용성 유사체, 이의 유도체, 또는 임의의 이의 조합일 수 있다. 코엘렌테라진은 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00004
(a) 코엘렌테라진 분해 경로
코엘렌테라진은 하기 기재된 티오뉴클레오사이드에 의한 분해에 대해 안정화될 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 코엘렌테라진으로부터의 하나 이상의 분해 생성물의 형성을 감소시키거나 억제할 수 있다. 코엘렌테라진은 하기 경로(이것으로 제한되지는 않음)를 따라 진행되는 분해에 대해 안정화될 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00005
특히, 코엘렌테라진은 코엘렌테라마이드 및 아미노피라진과 같은 하나 이상의 분해 생성물로의 분해에 대해 안정화될 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 코엘렌테라마이드 및/또는 아미노피라진의 형성을 억제하거나 감소시킬 수 있다.
(2) 코엘렌테라진-h
발광성 기질은 코엘렌테라진-h, 이의 작용성 유사체, 이의 유도체, 또는 임의의 이의 조합일 수 있다. 코엘렌테라진-h는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00006
(a) 코엘렌테라진-h 분해 경로
코엘렌테라진-h는 하기 기재된 티오뉴클레오사이드에 의한 분해에 대해 안정화될 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 코엘렌테라진-h로부터의 하나 이상의 분해 생성물의 형성을 감소시키거나 억제할 수 있다. 코엘렌테라진-h는 하기 경로(이것으로 제한되지는 않음)를 따라 진행되는 분해에 대해 안정화될 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00007
특히, 코엘렌테라진-h는 코엘렌테라마이드-h 및 아미노피라진과 같은 하나 이상의 분해 생성물로의 분해에 대해 안정화될 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 코엘렌테라마이드-h 및/또는 아미노피라진의 형성을 억제하거나 감소시킬 수 있다.
(3) 코엘렌테라진-h-h
발광성 기질은 코엘렌테라진-h-h, 이의 작용성 유사체, 이의 유도체, 또는 임의의 이의 조합일 수 있다. 코엘렌테라진-h-h는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00008
(a) 코엘렌테라진-h-h 분해 경로
코엘렌테라진-h-h는 하기 기재된 티오뉴클레오사이드에 의한 분해에 대해 안정화될 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 코엘렌테라진-h-h로부터의 하나 이상의 분해 생성물의 형성을 감소시키거나 억제할 수 있다. 코엘렌테라진-h-h는 하기 경로(이것으로 제한되지는 않음)를 따라 진행되는 분해에 대해 안정화될 수 있다.
Figure 112016116106321-pct00009
특히, 코엘렌테라진-h-h는 코엘렌테라마이드-h-h 및 아미노피라진과 같은 하나 이상의 분해 생성물로의 분해에 대해 안정화될 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 코엘렌테라마이드-h-h 및/또는 아미노피라진의 형성을 억제하거나 감소시킬 수 있다.
(4) 퓨리마진
발광성 기질은 퓨리마진, 이의 작용성 유사체, 이의 유도체, 또는 임의의 이의 조합일 수 있다. 퓨리마진은 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00010
(a) 퓨리마진 분해 경로
퓨리마진은 하기 기재된 티오뉴클레오사이드에 의한 분해에 대해 안정화될 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 퓨리마진으로부터의 하나 이상의 분해 생성물의 형성을 감소시키거나 억제할 수 있다. 퓨리마진은 하기 경로(이것으로 제한되지는 않음)를 따라 진행되는 분해에 대해 안정화될 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00011
특히, 퓨리마진은 퓨리마마이드 및 아미노피라진과 같은 하나 이상의 분해 생성물로의 분해에 대해 안정화될 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 퓨리마마이드 및/또는 아미노피라진의 형성을 억제하거나 감소시킬 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 퓨리마마이드 및/또는 아미노피라진의 형성을 적어도 약 40%, 적어도 약 41%, 적어도 약 42%, 적어도 약 43%, 적어도 약 44%, 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59%, 또는 적어도 약 60% 감소시킬 수 있다.
b. 티오뉴클레오사이드
이 조성물은 티오뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 하나 이상의 분해 생성물로의 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다. 티오뉴클레오사이드는 하나 이상의 분해 생성물의 형성을 감소시키거나 억제할 수 있다. 이러한 안정화, 감소 또는 억제는 상기 기재된 바대로 광의 존재 하에, 광의 부재 하에, 및/또는 상이한 온도에 있을 수 있다.
티오뉴클레오사이드는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00012
식 중,
R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 카복실산, 에스터, NRaRb, 이민, 하이드록실 또는 옥소이고;
R2는 수소, NRaRb, 이민, 알킬 또는 아릴이며; 그리고
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이다.
소정의 실시형태에서, R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 카복실산, 에스터, NRaRb, 이민, 하이드록실 또는 옥소이고; Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이며; 상기 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴 및 이민은 각각의 경우에 독립적으로 비치환되거나, 할로겐, =O, =S, 사이아노, 사이아노알킬, 사이아노플루오로알킬, 나이트로, 플루오로알킬, 알콕시플루오로알킬, 플루오로알콕시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 할로알콕시, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 할로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 사이클로알킬알킬, 헤테로아릴알킬, 아릴알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 하이드록시플루오로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 알킬렌, 아릴옥시, 페녹시, 벤질옥시, 아미노, 알킬아미노, 아실아미노, 아미노알킬, 아릴아미노, 설포닐아미노, 설피닐아미노, 설포닐, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아미노설포닐, 설피닐, -COOH, 케톤, 아마이드, 카바메이트 및 아실로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 작용기에 의해 치환된다.
소정의 실시형태에서, R1은 알킬, 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴, 사이클로알킬, 카복실산, 에스터 또는 옥소이고; 상기 알킬, 사이클로알킬 및 알킬-아릴은 각각 경우에 독립적으로 비치환되거나, 할로겐, 나이트로, 하이드록시, 아미노, 알킬아미노 및 -COOH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개 또는 3개의 작용기에 의해 치환된다.
소정의 실시형태에서, R2는 수소, NRaRb, 이민, 알킬 또는 아릴이고; Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이며; 상기 알킬, 이민 및 아릴은 각각의 경우에 독립적으로 비치환되거나, 할로겐, =O, =S, 사이아노, 사이아노알킬, 사이아노플루오로알킬, 나이트로, 플루오로알킬, 알콕시플루오로알킬, 플루오로알콕시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로알킬, 할로알콕시, 헤테로알킬, 사이클로알킬, 할로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 사이클로알킬알킬, 헤테로아릴알킬, 아릴알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 하이드록시플루오로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 알킬렌, 아릴옥시, 페녹시, 벤질옥시, 아미노, 알킬아미노, 아실아미노, 아미노알킬, 아릴아미노, 설포닐아미노, 설피닐아미노, 설포닐, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아미노설포닐, 설피닐, -COOH, 케톤, 아마이드, 카바메이트 및 아실로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 작용기에 의해 치환된다.
소정의 실시형태에서, R2는 수소, NRaRb 또는 이민이고; Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이며; 상기 이민은 비치환되거나, 할로겐, 나이트로, 하이드록시, 아미노 및 알킬아미노로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 작용기에 의해 치환된다.
소정의 실시형태에서, R2는 이민이고; 이민은 -N=CRd이며; Rd는 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬이고; 상기 이민은 비치환되거나, 할로겐, 나이트로, 하이드록시, 아미노 및 알킬아미노로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 작용기에 의해 치환된다.
소정의 실시형태에서, R2는 이민이고; 이민은 -N=CRd이며; Rd는 아릴 또는 헤테로아릴이고; 상기 이민은 비치환되거나, 나이트로 및 알킬아미노로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 작용기에 의해 치환된다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 ATT(6-메틸-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온)일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00013
.
ATT는 또한 6-아자-2-티오타이민으로 공지될 수 있다. ATT는 예를 들어 시그마-알드리치(카탈로그 번호 275514)로부터 상업적으로 구입 가능하다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 ATCA(5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-카복실산)일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00014
.
ATCA는 예를 들어 시그마-알드리치(카탈로그 번호 S784028)로부터 상업적으로 구입 가능하다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 3-(4-아미노-5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-일)프로판산일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00015
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이 화합물은 예를 들어 시그마-알드리치(카탈로그 번호 OTV000379로부터 상업적으로 구입 가능하다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 테트라하이드로-2-메틸-3-티옥소-1,2,4-트라이아진-5,6-다이온일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00016
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이 화합물은 또한 티오트라이아지논으로 공지될 수 있고, 예를 들어 시그마 알드리치(카탈로그 번호 549756)로부터 상업적으로 구입 가능하다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 4-((2-퓨릴메틸렌)아미노)-3-머캅토-6-메틸-1,2,4-트라이아진-5(4H)-온일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00017
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이 화합물은 예를 들어 시그마 알드리치(카탈로그 번호 L125016)로부터 상업적으로 구입 가능하다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 6-벤질-3-설파닐-1,2,4-트라이아진-5-올일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00018
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이 화합물은 또한 b-ATT, 벤질-ATT 또는 TAK-0002로서 공지될 수 있다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 4-아미노-3-머캅토-6-메틸-1,2,4-트라이아진-5(4H)-온일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00019
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이 화합물은 예를 들어 시그마-알드리치(카탈로그 번호 PH125903)로부터 상업적으로 구입 가능하다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 3-(5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-일)프로판산일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00020
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이 화합물은 예를 들어 시그마-알드리치(카탈로그 번호 L151629)로부터 상업적으로 구입 가능하다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 (E)-6-메틸-4-((티오펜-2-일메틸렌)아미노)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00021
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이 화합물은 예를 들어 시그마 알드리치(카탈로그 번호 L150819)로부터 상업적으로 구입 가능하다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 (E)-6-메틸-4-((3-나이트로벤질리덴)아미노)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00022
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이 화합물은 예를 들어 시그마 알드리치(카탈로그 번호 L151238)로부터 상업적으로 구입 가능하다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 (E)-4-((4-(다이에틸아미노)벤질리덴)아미노)-6-메틸-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00023
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이 화합물은 예를 들어 시그마 알드리치(카탈로그 번호 L151211)로부터 상업적으로 구입 가능하다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 ATCA 에틸 에스터일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00024
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이 화합물은 예를 들어 시그마 알드리치(카탈로그 번호 PH008592)로부터 상업적으로 구입 가능하다.
화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 TAK-0021일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00025
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화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 TAK-0020일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00026
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화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 TAK-0018일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00027
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화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 TAK-0009일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00028
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화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 TAK-0014일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00029
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화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 TAK-0007일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00030
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화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 TAK-0008일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00031
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화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 TAK-0003일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00032
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화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 TAK-0004일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00033
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화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 3-티옥소-6-(트라이플루오로메틸)-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00034
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화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 6-사이클로프로필-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00035
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화학식 (I)의 화합물은 하기 구조를 가지는 6-(하이드록시메틸)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온일 수 있다:
Figure 112016116106321-pct00036
.
TAK-0014, TAK-0002, TAK-0021, TAK-0020, TAK-0018, TAK-0009, TAK-0007, TAK-0008, TAK-0003, TAK-0004, 3-티옥소-6-(트라이플루오로메틸)-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, 6-사이클로프로필-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온 및 6-(하이드록시메틸)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온을 문헌[S.J. Liu et al., ARKIVOC (2009) 333-348 및 S. J. Liu et al., Letters in Drug Design and Discovery (2010) 7:5-8](이들 둘 다의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함됨)에 기재된 바대로 합성한다.
티오뉴클레오사이드는 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시키기에 효과적인 양으로 조성물에 존재할 수 있다. 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시키기 위한 조성물에서의 티오뉴클레오사이드의 유효량은 약 0.1mM 내지 약 500mM, 약 0.5mM 내지 약 500mM, 약 1mM 내지 약 500mM, 약 5mM 내지 약 500mM, 약 10mM 내지 약 500mM, 약 15mM 내지 약 500mM, 약 20mM 내지 약 500mM, 약 30mM 내지 약 500mM, 약 50mM 내지 약 500 nM, 약 70mM 내지 약 500mM, 약 90mM 내지 약 500mM, 약 110mM 내지 약 500mM, 약 130mM 내지 약 500mM, 약 150mM 내지 약 500mM, 약 170mM 내지 약 500mM, 약 190mM 내지 약 500mM, 약 210mM 내지 약 500mM, 약 0.1mM 내지 약 475mM, 약 0.1mM 내지 약 450mM, 약 0.1mM 내지 약 425mM, 약 0.1mM 내지 약 400mM, 약 0.1mM 내지 약 375mM, 약 0.1mM 내지 약 350mM, 약 0.1mM 내지 약 325mM, 약 0.1mM 내지 약 300mM, 약 0.1mM 내지 약 275mM, 약 0.5mM 내지 약 450mM, 약 1mM 내지 약 400mM, 약 2mM 내지 약 350mM, 약 3mM 내지 약 300mM, 약 4mM 내지 약 300mM, 또는 약 5mM 내지 약 250mM일 수 있다.
분해에 대해 발광성 기질을 안정화시키기 위한 조성물에서의 티오뉴클레오사이드의 유효량은 약 0.1mM, 0.2mM, 0.3mM, 0.4mM, 0.5mM, 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.5mM, 2.0mM, 2.5mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 5.5mM, 6.0mM, 6.5mM, 7.0mM, 7.5mM, 8.0mM, 8.5mM, 9.0mM, 9.5mM, 10mM, 11mM, 12mM, 13mM, 14mM, 15mM, 16mM, 17mM, 18mM, 19mM, 20mM, 21mM, 22mM, 23mM, 24mM, 25mM, 26mM, 27mM, 28mM, 29mM, 30mM, 31mM, 32mM, 33mM, 34mM, 35mM, 36mM, 37mM, 38mM, 39mM, 40mM, 41mM, 42mM, 43mM, 44mM, 45mM, 46mM, 47mM, 48mM, 49mM, 50mM, 51mM, 52mM, 53mM, 54mM, 55mM, 56mM, 57mM, 58mM, 59mM, 60mM, 61mM, 62mM, 63mM, 64mM, 65mM, 66mM, 67mM, 68mM, 69mM, 70mM, 71mM, 72mM, 73mM, 74mM, 75mM, 76mM, 77mM, 78mM, 79mM, 80mM, 81mM, 82mM, 83mM, 84mM, 85mM, 86mM, 87mM, 88mM, 89mM, 90mM, 91mM, 92mM, 93mM, 94mM, 95mM, 96mM, 97mM, 98mM, 99mM, 100mM, 105mM, 110mM, 115mM, 120mM, 125mM, 130mM, 135mM, 140mM, 145mM, 150mM, 155mM, 160mM, 165mM, 170mM, 175mM, 180mM, 185mM, 190mM, 195mM, 200mM, 205mM, 210mM, 215mM, 220mM, 225mM, 230mM, 235mM, 240mM, 245mM, 250mM, 255mM, 260mM, 265mM, 270mM, 275mM, 280mM, 285mM, 290mM, 295mM, 300mM, 305mM, 310mM, 315mM, 320mM, 325mM, 330mM, 335mM, 340mM, 345mM, 350mM, 355mM, 360mM, 365mM, 370mM, 375mM, 380mM, 385mM, 390mM, 395mM, 400mM, 405mM, 410mM, 415mM, 420mM, 425mM, 430mM, 435mM, 440mM, 445mM, 450mM, 455mM, 460mM, 465mM, 470mM, 475mM, 480mM, 485mM, 490mM, 495mM, 또는 500mM일 수 있다.
분해에 대해 발광성 기질을 안정화시키기 위한 조성물에서의 티오뉴클레오사이드의 유효량은 0.1mM 초과, 0.5mM, 또는 1mM일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 티오뉴클레오사이드가 ATT일 때, 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시키기 위한 ATT의 유효량은 약 90mM 내지 약 500mM, 약 100mM 내지 약 500mM, 약 110mM 내지 약 500mM, 약 120mM 내지 약 500mM, 약 130mM 내지 약 500mM, 약 140mM 내지 약 500mM, 약 150mM 내지 약 500mM, 약 160mM 내지 약 500mM, 약 170mM 내지 약 500mM, 약 180mM 내지 약 500mM, 약 190mM 내지 약 500mM, 약 200mM 내지 약 500mM, 약 210mM 내지 약 500mM, 약 90mM 내지 약 475mM, 약 90mM 내지 약 450mM, 약 90mM 내지 약 425mM, 약 90mM 내지 약 400mM, 약 90mM 내지 약 375mM, 약 90mM 내지 약 350mM, 약 90mM 내지 약 325mM, 약 90mM 내지 약 300mM, 약 90mM 내지 약 275mM, 약 100mM 내지 약 450mM, 약 125mM 내지 약 400mM, 약 175mM 내지 약 350mM, 또는 약 200mM 내지 약 300mM일 수 있다.
다른 실시형태에서, 티오뉴클레오사이드가 ATT일 때, 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시키기 위한 ATT의 유효량은 약 90mM, 91mM, 92mM, 93mM, 94mM, 95mM, 96mM, 97mM, 98mM, 99mM, 100mM, 105mM, 110mM, 115mM, 120mM, 125mM, 130mM, 135mM, 140mM, 145mM, 150mM, 155mM, 160mM, 165mM, 170mM, 175mM, 180mM, 185mM, 190mM, 195mM, 200mM, 201mM, 202mM, 203mM, 204mM, 205mM, 206mM, 207mM, 208mM, 209mM, 210mM, 211mM, 212mM, 213mM, 214mM, 215mM, 216mM, 217mM, 218mM, 219mM, 220mM, 221mM, 222mM, 223mM, 224mM, 225mM, 226mM, 227mM, 228mM, 229mM, 230mM, 231mM, 232mM, 233mM, 234mM, 235mM, 236mM, 237mM, 238mM, 239mM, 240mM, 241mM, 242mM, 243mM, 244mM, 245mM, 246mM, 247mM, 248mM, 249mM, 250mM, 251mM, 252mM, 253mM, 245mM, 255mM, 256mM, 257mM, 258mM, 259mM, 260mM, 261mM, 262mM, 263mM, 264mM, 265mM, 266mM, 267mM, 268mM, 269mM, 270mM, 271mM, 272mM, 273mM, 274mM, 275mM, 276mM, 277mM, 278mM, 279mM, 280mM, 281mM, 282mM, 283mM, 284mM, 285mM, 286mM, 287mM, 288mM, 289mM, 290mM, 291mM, 292mM, 293mM, 294mM, 295mM, 296mM, 297mM, 298mM, 299mM, 300mM, 305mM, 310mM, 315mM, 320mM, 325mM, 330mM, 335mM, 340mM, 345mM, 350mM, 355mM, 360mM, 365mM, 370mM, 375mM, 380mM, 385mM, 390mM, 395mM, 400mM, 405mM, 410mM, 415mM, 420mM, 425mM, 430mM, 435mM, 440mM, 445mM, 450mM, 455mM, 460mM, 465mM, 470mM, 475mM, 480mM, 485mM, 490mM, 495mM, 또는 500mM일 수 있다.
훨씬 다른 실시형태에서, 티오뉴클레오사이드가 ATT일 때, 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시키기 위한 ATT의 유효량은 225mM일 수 있다. 다른 실시형태에서, 티오뉴클레오사이드가 ATT일 때, 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시키기 위한 ATT의 유효량은 약 32mM 초과, 약 50mM 초과, 또는 약 100mM 초과일 수 있다.
c. 유기 용매
이 조성물을 유기 용매를 포함할 수 있다. 유기 용매는 알콜, 프로필렌 글라이콜, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 아세토나이트릴, 글라이세롤, 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다. 알콜은 에탄올일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 유기 용매는 알콜 및 프로필렌 글라이콜의 조합일 수 있다. 다른 실시형태에서, 유기 용매는 에탄올 및 프로필렌 글라이콜의 조합일 수 있다. 훨씬 다른 실시형태에서, 유기 용매는 에탄올:프로필렌 글라이콜의 1:1의 비율(예를 들어, 50%(v/v) 에탄올:50%(v/v) 프로필렌 글라이콜)일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 유기 용매는 40%(v/v) 에탄올:60%(v/v) 프로필렌 글라이콜일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 유기 용매는 알콜 및 글라이세롤의 조합일 수 있다. 다른 실시형태에서, 유기 용매는 에탄올 및 글라이세롤의 조합일 수 있다. 훨씬 다른 실시형태에서, 유기 용매는 85%(v/v) 에탄올:15%(v/v) 글라이세롤일 수 있다.
d. 발광성 효소
상기 기재된 바대로, 이 조성물은 발광성 효소, 이의 변이체, 이의 돌연변이체, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하지 않을 수 있다. 발광성 효소는 천연 발생, 재조합 또는 돌연변이체일 수 있다. 발광성 효소는 광을 생성하거나 광의 생성을 발생시키는 반응을 촉매화하는 기질로서 상기 기재된 발광성 기질(이의 유도체 또는 유사체 포함)을 사용할 수 있다.
발광성 효소는 바르굴라 히겐도르플리(Vargula higendorfli), 생발광성 십각류(decapod), 예컨대 오플로포로이데아에(Oplophoroidea)로부터 유래한 루시퍼라제, 예를 들어 오플로포러스 유래 루시퍼라제, 생발광성 요각류(copepod), 예컨대 가우시아 프린셉스(Gaussia princeps) 및 메트리디아 롱가(Metridia longa), 해양 유기체, 예컨대 자포동물(cnidarian)(예를 들어, 레닐라 루시퍼라제), 아리스테이다에(Aristeidae), 솔레노세리다에(Solenoceridae), 루시페리다에(Luciferidae), 세르게스티다에(Sergestidae), 파시페이다에(Pasipheidae) 및 탈라소카리디다에 데카포다(Thalassocarididae decapoda) 패밀리로부터 유래한 루시퍼라제, 및 광단백질, 예컨대 아에쿠오린(Aequorin), 및 상기 루시퍼라제의 변이체 및 돌연변이체를 포함할 수 있다.
3. 안정화의 방법
발광성 기질을 안정화시키는 방법이 본 명세서에 또한 제공된다. 이 방법은 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다. 이 방법은 하나 이상의 분해 생성물에 대한 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시킬 수 있다.
이 방법은 유기 용매의 존재 하에 발광성 기질을 유효량의 티오뉴클레오사이드와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시키는 티오뉴클레오사이드의 유효량이 상기 기재되어 있다. 따라서, 접촉 단계는 상기 기재된 조성물을 형성하고, 이로써 분해에 대해 발광성 기질을 안정화시키는 단계를 포함할 수 있다.
4. 키트
상기 기재된 조성물을 포함하는 키트가 본 명세서에 또한 제공된다. 이 조성물은 단일 용기 내에 함유될 수 있다.
본 개시내용에 따른 키트는 바람직하게는 조성물을 저장하기 위한 설명서 및/또는 조성물을 수용하는 단일 용기를 포함한다. 본 개시내용의 키트에 함유된 설명서는 패키징 재료에 부착될 수 있거나, 패키지 인서트로서 포함될 수 있다. 설명서가 통상적으로 서면 또는 인쇄 자료이지만, 이것은 이렇게 제한되지는 않는다. 이러한 설명서를 저장하고 최종 사용자에게 이를 소통시킬 수 있는 임의의 매체가 본 개시내용에 의해 고려된다. 이러한 매체는 전자 저장 매체(예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예를 들어, CD ROM) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "설명서"는 설명서를 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 예시되는 다수의 양태를 가진다.
5. 실시예
실시예 1
코엘렌테라진의 안정성
ATT의 존재 및 부재 하의 코엘렌테라진의 안정성을 상이한 온도에서 시간에 따라 측정하였다. 구체적으로, 1.25mM 코엘렌테라진은 50% 에탄올 및 50% 프로필렌 글라이콜의 용액(즉, ATT가 없는 용액) 또는 225mM ATT를 가지는 50% 에탄올 및 50% 프로필렌 글라이콜의 용액(즉, ATT를 가지는 용액)에 존재하였다. 이들 2의 용액을 -20℃, 실온(RT), 40℃, 또는 60℃에서 항온처리하고, 0일, 1일, 3일, 7일, 15일 및 30일에 분석하였다.
항온처리 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 각각의 시점에서의 각각의 용액의 성분을 확인하였다. 구체적으로, 애질런트 1100 HPLC 기계가 사용되고, 4개 펌프, 온도조절 오토샘플러 및 컬럼 구획 및 G1311B 다이오드-어레이 검출기가 구비되었다. 사용된 컬럼은 Synergi-MAX-RP(Phenomenex(미국 캘리포니아주 토런스)) 100Å 50x4.6 2.5㎛였다. HPLC에서의 실행은 물 및 아세토나이트릴 중의 0.1% TFA에 의한 구배 실행이었다. 흡광도를 262나노미터(㎚)에서 측정하였다. 코엘렌테라진의 표준품 및 이의 공지된 분해물을 실행하여 보유 시간 및 흡광도 트레이스 둘 다를 확인하였다. 5㎕의 각각의 용액을 주입하고, 코엘렌테라진의 보유 시간은 실온에서 3.9분이었다.
HPLC 분석의 결과는 하기 표 1 및 표 2 및 도 1a 및 도 1b에 기재되어 있고, 여기서 값은 262㎚에서의 상대 피크 면적(%)(즉, 기질의 람다 맥스)으로서 기록된다. 도 1a는 (일 단위의) 시간에 따른 ATT를 가지는 용액의 상대 피크 면적(%)을 보여주는 반면, 도 1b는 (일 단위의) 시간에 따른 ATT가 없는 용액의 상대 피크 면적(%)을 보여준다. 도 1a 및 도 1b의 각각에서, 다이아몬드는 -20℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 코엘렌테라진이고, 삼각형은 실온(RT)에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 코엘렌테라진이고, 별은 40℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 코엘렌테라진이고, 십자는 60℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 코엘렌테라진이다.
Figure 112016116106321-pct00037
Figure 112016116106321-pct00038
HPLC 분석으로부터, 40℃ 및 60℃에서의 ATT의 존재 하의 코엘렌테라진의 반감기는 각각 23일 및 5일인 것으로 계산되지만, 40℃ 및 60℃에서의 ATT의 부재 하의 코엘렌테라진의 반감기는 각각 9.5일 및 2일인 것으로 계산되었다(하기 표 3 참조).
Figure 112016116106321-pct00039
추가적으로, 다양한 온도에서의 코엘렌테라진의 반감기를 계산하기 위해 아레니우스 도면을 ATT의 존재 및 부재 하에 코엘렌테라진에 대해 생성하였다. 아레니우스 방정식은 하기와 같다:
Figure 112016116106321-pct00040
변환된 방정식은 하기와 같다:
Figure 112016116106321-pct00041
ATT의 존재 하의 코엘렌테라진에 대한 아레니우스 도면은 도 8에 도시되어 있다. 도 8에서, 기울기는 -8636.59이고, 절편은 24.1199이고, R2는 0.9983이었다.
ATT의 부재 하의 코엘렌테라진에 대한 아레니우스 도면은 도 9에 도시되어 있다. 도 9에서, 기울기는 -7382.51이고, 절편은 21.2598이고, R2는 0.9570이었다.
추가적으로, 아레니우스 도면으로부터의 계산된 반감기는 ATT의 존재가, ATT의 부재 하에서와 비교하여, 각각 -75℃, -20℃, 20℃, 40℃ 및 60℃에서 분해에 대해 코엘렌테라진을 3.29배, 8.02배, 4.14배, 3.14배 및 2.53배 안정화시킨다는 것을 나타낸다(상기 표 3 참조).
요약하면, 이 데이터는 ATT가 상이한 온도에서 시간에 따라 분해에 대해 코엘렌테라진을 안정화시키고, 따라서 코엘렌테라진이 일정한 기간 동안 항온처리되거나 저장될 수 있는 용액 중의 ATT의 포함이 코엘렌테라진의 분해를 억제하거나 감소(즉, 코엘렌테라진을 안정화)시킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 2
코엘렌테라진-h의 안정성
ATT의 존재 및 부재 하의 코엘렌테라진-h의 안정성을 상이한 온도에서 시간에 따라 측정하였다. 구체적으로, 1.25mM 코엘렌테라진-h는 50% 에탄올 및 50% 프로필렌 글라이콜의 용액(즉, ATT가 없는 용액) 또는 225mM ATT를 가지는 50% 에탄올 및 50% 프로필렌 글라이콜의 용액(즉, ATT를 가지는 용액)에 존재하였다. 이들 2의 용액을 -20℃, 실온(RT), 40℃, 또는 60℃에서 항온처리하고, 0일, 1일, 3일, 7일, 15일 및 30일 동안 분석하였다.
항온처리 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 각각의 시점에서의 각각의 용액의 성분을 확인하였다. 구체적으로, 애질런트 1100 HPLC 기계가 사용되고, 4개 펌프, 온도조절 오토샘플러 및 컬럼 구획 및 G1311B 다이오드-어레이 검출기가 구비되었다. 사용된 컬럼은 Synergi-MAX-RP(Phenomenex(미국 캘리포니아주 토런스)) 100Å 50x4.6 2.5㎛였다. HPLC에서의 실행은 물 및 아세토나이트릴 중의 0.1% TFA에 의한 구배 실행이었다. 흡광도를 262나노미터(㎚)에서 측정하였다. 코엘렌테라진-h의 표준품 및 이의 공지된 분해물을 실행하여 보유 시간 및 흡광도 트레이스 둘 다를 확인하였다. 5㎕의 각각의 용액을 주입하고, 코엘렌테라진-h의 보유 시간은 실온에서 4.7분이었다.
HPLC 분석의 결과는 하기 표 4 및 표 5 및 도 2a 및 도 2b에 기재되어 있고, 여기서 값은 262㎚에서의 상대 피크 면적(%)(즉, 기질의 람다 맥스)으로서 기록된다. 도 2a는 (일 단위의) 시간에 따른 ATT를 가지는 용액의 상대 피크 면적(%)을 보여주는 반면, 도 2b는 (일 단위의) 시간에 따른 ATT가 없는 용액의 상대 피크 면적(%)을 보여준다. 도 2a 및 도 2b의 각각에서, 다이아몬드는 -20℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 코엘렌테라진-h이고, 삼각형은 실온(RT)에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 코엘렌테라진-h이고, 별은 40℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 코엘렌테라진-h이고, 십자는 60℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 코엘렌테라진-h이다.
Figure 112016116106321-pct00042
Figure 112016116106321-pct00043
HPLC 분석으로부터, 40℃ 및 60℃에서의 ATT의 존재 하의 코엘렌테라진-h의 반감기는 각각 20일 및 5일인 것으로 계산되지만, 20℃, 40℃ 및 60℃에서의 ATT의 부재 하의 코엘렌테라진-h의 반감기는 각각 24일, 7.5일 및 2일인 것으로 계산되었다(하기 표 6 참조).
Figure 112016116106321-pct00044
추가적으로, 다양한 온도에서의 코엘렌테라진-h의 반감기를 계산하기 위해 아레니우스 도면을 ATT의 존재 및 부재 하에 코엘렌테라진-h에 대해 생성하였다. 아레니우스 방정식은 하기와 같다:
Figure 112016116106321-pct00045
변환된 방정식은 하기와 같다:
Figure 112016116106321-pct00046
ATT의 존재 하의 코엘렌테라진-h에 대한 아레니우스 도면은 도 10에 도시되어 있다. 도 10에서, 기울기는 -8131.2이고, 절편은 22.6157이고, R2는 0.9994이었다.
ATT의 부재 하의 코엘렌테라진-h에 대한 아레니우스 도면은 도 11에 도시되어 있다. 도 11에서, 기울기는 -7310.53이고, 절편은 21.4386이고, R2는 0.9964이었다.
추가적으로, 아레니우스 도면으로부터의 계산된 반감기는 ATT의 존재가, ATT의 부재 하에서와 비교하여, 각각 -75℃, -20℃, 20℃, 40℃ 및 60℃에서 분해에 대해 코엘렌테라진을 20.00배, 2872.73배, 5.09배, 4.26배 및 3.50배 안정화시킨다는 것을 나타낸다(상기 표 6 참조).
요약하면, 이 데이터는 ATT가 상이한 온도에서 시간에 따라 분해에 대해 코엘렌테라진-h를 안정화시키고, 따라서 코엘렌테라진-h가 일정한 기간 동안 항온처리되거나 저장될 수 있는 용액 중의 ATT의 포함이 코엘렌테라진-h의 분해를 억제하거나 감소(즉, 코엘렌테라진-h를 안정화)시킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 3
코엘렌테라진-h-h의 안정성
ATT의 존재 및 부재 하의 코엘렌테라진-h-h의 안정성을 상이한 온도에서 시간에 따라 측정하였다. 구체적으로, 1.25mM 코엘렌테라진-h-h는 50% 에탄올 및 50% 프로필렌 글라이콜의 용액(즉, ATT가 없는 용액) 또는 225mM ATT를 가지는 50% 에탄올 및 50% 프로필렌 글라이콜의 용액(즉, ATT를 가지는 용액)에 존재하였다. 이들 2의 용액을 -20℃, 실온(RT), 40℃, 또는 60℃에서 항온처리하고, 0일, 1일, 3일, 7일, 15일 및 30일 동안 분석하였다.
항온처리 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 각각의 시점에서의 각각의 용액의 성분을 확인하였다. 구체적으로, 애질런트 1100 HPLC 기계가 사용되고, 4개 펌프, 온도조절 오토샘플러 및 컬럼 구획 및 G1311B 다이오드-어레이 검출기가 구비되었다. 사용된 컬럼은 Synergi-MAX-RP(Phenomenex(미국 캘리포니아주 토런스)) 100Å 50x4.6 2.5㎛였다. HPLC에서의 실행은 물 및 아세토나이트릴 중의 0.1% TFA에 의한 구배 실행이었다. 흡광도를 262나노미터(㎚)에서 측정하였다. 코엘렌테라진-h-h의 표준품 및 이의 공지된 분해물을 실행하여 보유 시간 및 흡광도 트레이스 둘 다를 확인하였다. 5㎕의 각각의 용액을 주입하고, 코엘렌테라진-h-h의 보유 시간은 실온에서 5.5분이었다.
HPLC 분석의 결과는 하기 표 7 및 표 8 및 도 3a 및 도 3b에 기재되어 있고, 여기서 값은 262㎚에서의 상대 피크 면적(%)(즉, 기질의 람다 맥스)으로서 기록된다. 도 3a는 (일 단위의) 시간에 따른 ATT를 가지는 용액의 상대 피크 면적(%)을 보여주는 반면, 도 3b는 (일 단위의) 시간에 따른 ATT가 없는 용액의 상대 피크 면적(%)을 보여준다. 도 3a 및 도 3b의 각각에서, 다이아몬드는 -20℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 코엘렌테라진-h-h이고, 삼각형은 실온(RT)에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 코엘렌테라진-h-h이고, 별은 40℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 코엘렌테라진-h-h이고, 십자는 60℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 코엘렌테라진-h-h이다.
Figure 112016116106321-pct00047
Figure 112016116106321-pct00048
HPLC 분석으로부터, 60℃에서의 ATT의 존재 하의 코엘렌테라진-h-h의 반감기는 10일인 것으로 계산되지만, 40℃ 및 60℃에서의 ATT의 부재 하의 코엘렌테라진-h-h의 반감기는 각각 27일 및 8일인 것으로 계산되었다(하기 표 9 참조).
Figure 112016116106321-pct00049
추가적으로, 다양한 온도에서의 코엘렌테라진-h-h의 반감기를 계산하기 위해 아레니우스 도면을 ATT의 존재 및 부재 하에 코엘렌테라진-h-h에 대해 생성하였다. 아레니우스 방정식은 하기와 같다:
Figure 112016116106321-pct00050
변환된 방정식은 하기와 같다:
Figure 112016116106321-pct00051
ATT의 존재 하의 코엘렌테라진-h-h에 대한 아레니우스 도면은 도 12에 도시되어 있다. 도 12에서, 기울기는 -10740.9이고, 절편은 30.0575이고, R2는 0.9967이었다.
ATT의 부재 하의 코엘렌테라진-h-h에 대한 아레니우스 도면은 도 13에 도시되어 있다. 도 13에서, 기울기는 30.8352이고, 절편은 -10650.1이고, R2는 0.9648이었다.
추가적으로, 아레니우스 도면으로부터의 계산된 반감기는 ATT의 존재가, ATT의 부재 하에서와 비교하여, 각각 -75℃, -20℃, 20℃, 40℃ 및 60℃에서 분해에 대해 코엘렌테라진을 3.59배, 3.12배, 2.97배, 2.90배 및 2.82배 안정화시킨다는 것을 나타낸다(상기 표 9 참조).
요약하면, 이 데이터는 ATT가 상이한 온도에서 시간에 따라 분해에 대해 코엘렌테라진-h-h를 안정화시키고, 따라서 코엘렌테라진-h-h가 일정한 기간 동안 항온처리되거나 저장될 수 있는 용액 중의 ATT의 포함이 코엘렌테라진-h-h의 분해를 억제하거나 감소(즉, 코엘렌테라진-h-h를 안정화)시킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 4
퓨리마진의 안정성
ATT의 존재 및 부재 하의 퓨리마진의 안정성을 상이한 온도에서 시간에 따라 측정하였다. 이 연구를 광의 존재 하에 수행하였다. 구체적으로, 1.25mM 퓨리마진은 50% 에탄올 및 50% 프로필렌 글라이콜의 용액(즉, ATT가 없는 용액) 또는 225mM ATT를 가지는 50% 에탄올 및 50% 프로필렌 글라이콜의 용액(즉, ATT를 가지는 용액)에 존재하였다. 이들 2의 용액을 -20℃, 실온(RT, 즉 20℃), 40℃, 또는 60℃에서 항온처리하고, 0일, 1일, 3일, 7일, 15일, 30일 및 90일에 분석하였다.
항온처리 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 각각의 시점에서의 각각의 용액의 성분을 확인하였다. 구체적으로, 애질런트 1100 HPLC 기계가 사용되고, 4개 펌프, 온도조절 오토샘플러 및 컬럼 구획 및 G1311B 다이오드-어레이 검출기가 구비되었다. 사용된 컬럼은 Synergi-MAX-RP(Phenomenex(미국 캘리포니아주 토런스)) 100Å 50x4.6 2.5㎛였다. HPLC에서의 실행은 물 및 아세토나이트릴 중의 0.1% TFA에 의한 구배 실행이었다. 흡광도를 262나노미터(㎚)에서 측정하였다. 퓨리마진의 표준품 및 이의 공지된 분해물을 실행하여 보유 시간 및 흡광도 트레이스 둘 다를 확인하였다. 5㎕의 각각의 용액을 주입하고, 퓨리마진의 보유 시간은 실온에서 5.1분이었다.
HPLC 분석의 결과는 하기 표 10 및 표 11 및 도 4a 및 도 4b에 기재되어 있고, 여기서 값은 262㎚에서의 상대 피크 면적(%)(즉, 기질의 람다 맥스)으로서 기록된다. 도 4a는 (일 단위의) 시간에 따른 ATT를 가지는 용액의 상대 피크 면적(%)을 보여주는 반면, 도 4b는 (일 단위의) 시간에 따른 ATT가 없는 용액의 상대 피크 면적(%)을 보여준다. 도 4a 및 도 4b의 각각에서, 다이아몬드는 -20℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 퓨리마진이고, 삼각형은 20℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 퓨리마진이고, 별은 40℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 퓨리마진이고, 십자는 60℃에서 각각 225mM ATT의 존재 또는 부재 하에 시간에 따른 배양된 1.25mM 퓨리마진이다.
Figure 112016116106321-pct00052
Figure 112016116106321-pct00053
HPLC 분석으로부터, 20℃, 40℃, 및 60℃에서의 ATT의 존재 하의 퓨리마진의 반감기는 각각 110일, 20일 및 5일인 것으로 계산되지만, 20℃, 40℃, 및 60℃에서의 ATT의 부재 하의 퓨리마진의 반감기는 각각 61일, 8일 및 2.5일인 것으로 계산되었다(하기 표 12 참조).
Figure 112016116106321-pct00054
추가적으로, 다양한 온도에서의 퓨리마진의 반감기를 계산하기 위해 아레니우스 도면을 ATT의 존재 및 부재 하에 퓨리마진에 대해 생성하였다. 아레니우스 방정식은 하기와 같다:
Figure 112016116106321-pct00055
변환된 방정식은 하기와 같다:
Figure 112016116106321-pct00056
ATT의 존재 하의 퓨리마진에 대한 아레니우스 도면은 도 6에 도시되어 있다. 도 6에서, 기울기는 -10831.4이고, 절편은 31.3561이고, R2는 0.9813이었다.
ATT의 부재 하의 퓨리마진에 대한 아레니우스 도면은 도 7에 도시되어 있다. 도 7에서, 기울기는 -10106.2이고, 절편은 30.1809이고, R2는 0.9984이었다.
추가적으로, 아레니우스 도면으로부터의 계산된 반감기는 ATT의 존재가, ATT의 부재 하에서와 비교하여, 각각 -75℃, -20℃, 20℃, 40℃ 및 60℃에서 분해에 대해 코엘렌테라진을 11.82배, 5.42배, 3.66배, 3.14배 및 2.44배 안정화시킨다는 것을 나타낸다(상기 표 12 참조).
요약하면, 이 데이터는 ATT가 상이한 온도에서 시간에 따라 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시키고, 따라서 퓨리마진이 일정한 기간 동안 항온처리되거나 저장될 수 있는 용액 중의 ATT의 포함이 퓨리마진의 분해를 억제하거나 감소(즉, 퓨리마진을 안정화)시킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 5
퓨리마진의 분해
상기 기재된 바대로, ATT는 상이한 온도에서 시간에 따라 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시켰다. 퓨리마진의 안정화를 추가로 조사하기 위해, 아미노피라진 및 퓨리마마이드인, 퓨리마진의 분해 생성물의 수준을 시간에 따라 측정하였다. 이 연구를 광의 존재 하에 수행하였다.
구체적으로, 1.25mM 퓨리마진은 50% 에탄올 및 50% 프로필렌 글라이콜의 용액(즉, ATT가 없는 용액) 또는 225mM ATT를 가지는 50% 에탄올 및 50% 프로필렌 글라이콜의 용액(즉, ATT를 가지는 용액)에 존재하였다. 이들 2의 용액을 실온(RT) 또는 40℃에서 항온처리하고, 8일, 15일 및 30일에 분석하였다.
항온처리 후, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 각각의 시점에서의 각각의 용액의 성분을 확인하였다. 구체적으로, 애질런트 1100 HPLC 기계가 사용되고, 4개 펌프, 온도조절 오토샘플러 및 컬럼 구획 및 G1311B 다이오드-어레이 검출기가 구비되었다. 사용된 컬럼은 Synergi-MAX-RP(Phenomenex(미국 캘리포니아주 토런스)) 100Å 50x4.6 2.5㎛였다. HPLC에서의 실행은 물 및 아세토나이트릴 중의 0.1% TFA에 의한 구배 실행이었다. 흡광도를 262나노미터(㎚)에서 측정하였다. 퓨리마진의 표준품 및 이의 공지된 분해물을 실행하여 보유 시간 및 흡광도 트레이스 둘 다를 확인하였다. 실온에서의 퓨리마진, 퓨리마마이드 및 아미노피라진에 대한 보유 시간은 각각 5.0분, 6.7분 및 5.4분이었다.
HPLC 분석의 결과는 하기 표 13 및 표 14 및 도 5a, 도 5b, 도 5c 및 도 5d에 기재되어 있고, 여기서 값은 262㎚에서의 상대 피크 면적(%)(즉, 기질의 람다 맥스)으로서 기록된다. 구체적으로, 도 5a는 ATT의 존재(회색 막대) 또는 부재(검정색 막대) 하의 8일, 15일 및 30일에서의 퓨리마진에 대한 상대 면적 백분율을 보여준다. 이 데이터는, 상기 실시예 4에 또한 기재된 바대로, 용액 중의 ATT의 포함이 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시킨다는 것을 입증한다.
도 5b는, 퓨리마진이 ATT의 존재(검정색 막대) 또는 부재(회색 막대) 하에 있을 때, 15일 후 실온에서의 분해물 아미노피라진 및 퓨리마마이드에 대한 상대 면적 백분율을 보여준다. 도 5c는, 퓨리마진이 ATT의 존재(검정색 막대) 또는 부재(회색 막대) 하에 있을 때, 8일 후 40℃에서의 분해물 아미노피라진 및 퓨리마마이드에 대한 상대 면적 백분율을 보여준다. 도 5d는, 퓨리마진이 ATT의 존재(검정색 막대) 또는 부재(회색 막대) 하에 있을 때, 30일 후 40℃에서의 분해물 아미노피라진 및 퓨리마마이드에 대한 상대 면적 백분율을 보여준다. 종합하면, 이 데이터는 ATT가 분해물 아미노피라진 및 퓨리마마이드의 형성을 감소시키고, 이로써 분해에 대해 퓨리마마이드를 안정화시킨다는 것을 추가로 입증한다.
Figure 112016116106321-pct00057
Figure 112016116106321-pct00058
요약하면, 이 데이터는 ATT가 상이한 온도에서 시간에 따라 분해물 아미노피라진 및 퓨리마마이드로의 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시킨다는 것을 추가로 입증한다. 따라서, 퓨리마진이 일정한 기간 동안 항온처리되거나 저장될 수 있는 용액 중의 ATT의 포함은 분해 생성물 아미노피라진 및 퓨리마마이드로의 퓨리마진의 분해를 억제하거나 감소시킬 수 있다(즉, 퓨리마진이 안정화됨).
실시예 6
퓨리마진의 광안정성
상기 기재된 바대로, ATT는 상이한 온도에서 시간에 따라 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시켰다. 따라서, 퓨리마진은 ATT의 부재 하에서보다 ATT의 존재 하에 열안정하였다. 여기서, ATT의 존재 및 부재 하의 퓨리마진의 광안정성을 실온 및 40℃에서 조사하였다.
구체적으로, 50% 프로필렌 글라이콜:50% 에탄올(v/v) 중의 ATT의 2x 스톡 용액을 제조하고, 여기서 ATT의 최종 농도는 64.4㎎/㎖이었다. 50% 프로필렌 글라이콜:50% 에탄올(v/v) 중의 퓨리마진의 2x 스톡 용액을 또한 제조하고, 여기서 퓨리마진의 최종 농도는 0.95㎎/㎖이었다. 하나의 바이알에서, 2x ATT 스톡 용액을 2x 퓨리마진 스톡 용액 중에 1:1 희석하여 225mM ATT 및 1.25mM 퓨리마진을 함유하는 용액을 생성하였다. 제2 바이알에서, 2x 퓨리마진 스톡 용액을 50% 프로필렌 글라이콜:50% 에탄올(v/v) 중에 1:1 희석하여 첨가제 ATT(즉, "첨가제 무 퓨리마진" 대조군)가 없고 1.25mM 퓨리마진을 함유하는 대조군 용액을 생성하였다.
각각의 바이알의 내용물을 인서트가 있는 별개의 투명한 HPLC 바이알로 분배하고, 이 HPLC 바이알을 광에서(즉, 오버헤드 형광성 광의 존재 하에) 실온(즉, 약 20℃)에서 그리고 광에서 40℃에서 위치시켰다. 각각의 온도에 대한 시점마다 하나의 HPLC 바이알이 있었다.
262㎚에서 5㎕의 주입 및 검출에 의해 HPLC에 의해 안정성을 측정하였다. 각각의 크로마토그램에서, 퓨리마진 피크의 면적을 결정하였다. 안정성 곡선은 시간(일)에 대해 면적(106)을 작도함으로써 생성되고, 각각 실온 및 40℃에 대해 도 14a 및 도 14b에 도시되어 있다. 안정화는 퓨리마진이 ATT의 존재 하에 10% 및 50% 분해되는 데 걸리는 시간(즉, 반감기)의 배수 증가로서 표현된다(표 15 및 표 16). 표 15는 광에서 실온에서 ATT의 존재 및 부재 하에 퓨리마진의 안정성을 보여준다. 표 16은 광에서 40℃에서 ATT의 존재 및 부재 하에 퓨리마진의 안정성을 보여준다.
Figure 112016116106321-pct00059
Figure 112016116106321-pct00060
종합하면, 이 데이터는 ATT가 상이한 온도(예를 들어, 실온 및 40℃)에서 광의 존재 하에 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시키고, 따라서 퓨리마진이 일정한 기간 동안 항온처리되거나 저장될 수 있는 용액 중의 ATT의 포함이 광 노출로 인한 퓨리마진의 분해(즉, 광분해)를 억제하거나 감소시킬 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, ATT는 광분해 및 열 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시켰다.
실시예 7
퓨리마진의 안정성
상기 기재된 바대로, ATT는 상이한 온도에서 및 광의 존재 하에 시간에 따라 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시켰다. ATT에 의한 퓨리마진의 안정화를 추가로 조사하기 위해, 퓨리마진의 안정성을 상이한 유기 용매, 즉 DMSO 중에 실온, 40℃ 및 60℃에서 측정하였다. 이 연구를 광의 존재 하에 수행하였다.
구체적으로, DMSO 중의 ATT의 2x 스톡 용액을 제조하고, 여기서 ATT의 최종 농도는 64.4㎎/㎖이었다. DMSO 중의 퓨리마진의 2x 스톡 용액을 또한 제조하고, 여기서 퓨리마진의 최종 농도는 0.95㎎/㎖이었다. 하나의 바이알에서, 2x ATT 스톡 용액을 2x 퓨리마진 스톡 용액 중에 1:1 희석하여 225mM ATT 및 1.25mM 퓨리마진을 함유하는 용액을 생성하였다. 제2 바이알에서, 퓨리마진을 DMSO 중에 1:1 희석하여 첨가제 ATT(즉, "첨가제 무 퓨리마진" 대조군)가 없고 1.25mM 퓨리마진을 함유하는 대조군 용액을 생성하였다.
각각의 바이알의 내용물을 인서트가 있는 별개의 투명한 HPLC 바이알로 분배하고, 이 HPLC 바이알을 실온(즉, 약 20℃), 40℃ 및 60℃에서 위치시켰다. 각각의 온도에 대한 시점마다 하나의 HPLC 바이알이 있었다.
262㎚에서 5㎕의 주입 및 검출에 의해 HPLC에 의해 안정성을 측정하였다. 각각의 크로마토그램에서, 퓨리마진의 면적 백분율을 결정하였다. 안정성 곡선은 시간(일)에 대해 면적 백분율을 작도함으로써 생성되고, 도 15에 도시되어 있다. 이 데이터는 ATT가 상이한 온도(예를 들어, 실온, 40℃ 및 60℃)에서 분해에 대해 DMSO 중의 퓨리마진을 안정화시킨다는 것을 입증한다.
실시예 8
37℃에서의 퓨리마진의 안정성
상기 기재된 바대로, ATT는 상이한 온도에서 및 광의 존재 하에 시간에 따라 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시켰다. 퓨리마진의 안정화를 추가로 조사하기 위해, ATT 및 ATT 유사체 TAK-0014 및 TAK-0002의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 발광성을 측정하였다.
구체적으로, 50% 프로필렌 글라이콜:50% 에탄올(v/v) 중의 퓨리마진의 스톡 용액을 제조하고, 여기서 흡광도에 의한 퓨리마진의 최종 농도는 4.6mM이었다. 이후, 퓨리마진 스톡 용액을 50% 프로필렌 글라이콜:50% 에탄올(v/v) 중에 1:1 희석하여 첨가제 ATT, TAK-0014, 및 TAK-0002(즉, "첨가제 무 퓨리마진" 대조군)가 없고 2.3mM 퓨리마진을 함유하는 대조군 용액을 생성하였다. ATT, TAK-0014 및 TAK-0002의 400mM 스톡 용액을 50% 프로필렌 글라이콜:50% 에탄올(v/v) 중에 제조하였다. 이후, ATT, TAK-0014 및 TAK-0002 스톡 용액의 각각을 4.6mM 퓨리마진 스톡 용액 중에 1:1 희석하여 200mM ATT, TAK-0014 또는 TAK-0002 및 2.3mM 퓨리마진을 함유하는 용액을 생성하였다.
각각의 샘플을 복수의 황색 관으로 분리하고, 어두운 항온처리기 내에서(즉, 광의 부재 하에) 37℃에서 항온처리하였다. 다양한 시점에서 각각의 샘플로부터 분취량을 취하고, 모든 시점이 수집될 때까지 암소에서(즉, 광의 부재 하에) -20℃에서 저장하였다.
분취량에서의 발광성을 측정하기 위해, 각각의 분취량을 완충제(NANOGLO 완충제, 프로메가 코포레이션(Promega Corporation)) 중에 1:50 희석하여 46μM 퓨리마진을 생성하였다. 이 희석된 분취량을 완충제(NANOGLO 완충제, 프로메가 코포레이션) 중에 추가로 1:10 희석하여 4.6μM 퓨리마진을 생성하였다. 50㎕의 각각의 희석액(즉, 2배 희석된 (0.1) 분취량)을 50㎕의 CO2 독립 매질 + 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 0.4ng/㎖의 발광성 효소(NANOLUC 효소, 프로메가 코포레이션)와 혼합하였다. 발광성을 발광장치(GLOMAX Multi Plus luminometer, 프로메가 코포레이션)에서 측정하였다. 상대 광 단위(RLU)를 0일 시점에서 RLU 값에 의해 각각의 시점에 대해 정규화하였다. 0일 시점(즉, t=0)으로부터의 활성(%)을 도 16a에 도시된 바대로 각각의 샘플에 대해 시간(일)에 대해 작도하였다. 도 16a에서, B-ATT는 TAK-0002를 나타내고, E-ATT는 TAK-0014를 나타낸다.
반감기는 1단계 감퇴(One Phase decay)로 설정된 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 이용하여 계산되고, 표 17 및 도 16b에 도시되어 있다. 표 17은 도 16a에 도시된 곡선으로부터 계산된 반감기를 보여준다(즉, 0.1, 표시된 2배 희석된 분취량의 반감기를 나타냄). 표 17에서의 오차는 회귀 계산으로부터의 표준 오차이고, Fz는 퓨리마진을 나타내고, B-ATT는 TAK-0002를 나타내고, E-ATT는 TAK-0014를 나타낸다.
도 16b는 샘플에 대한 일 단위의 37℃에서의 반감기를 작도한 그래프이고, 여기서 Fz는 퓨리마진을 나타내고, B-ATT는 TAK-0002를 나타내고, E-ATT는 TAK-0014를 나타낸다. 또한 도 16b에서, 0.1은 2배 희석된 분취량에 대한 반감기를 나타낸다.
Figure 112016116106321-pct00061
이전의 실시예에 입증된 바대로, ATT는 상이한 온도에서 및 광의 존재 하에 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시켰다. 이 실시예에서의 결과는, 티오뉴클레오사이드, 예컨대 ATT, TAK-0014 및 TAK-0002가 퓨리마진을 함유하는 유기 용매(예를 들어, 50% 프로필렌 글라이콜:50% 에탄올(v/v))에 첨가될 때, 퓨리마진으로부터의 발광성의 증가한 반감기를 입증한다. 이 실시예에서의 결과는 또한 티오뉴클레오사이드, 예컨대 ATT, TAK-0014 및 TAK-0002가 광의 부재 하에(즉, 암소에서) 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시킨다는 것을 입증한다. 종합하면, 이 결과는 티오뉴클레오사이드가 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시키고, 이로써 퓨리마진으로부터의 발광성의 증가한 반감기를 허용한다는 것을 나타낸다.
실시예 9
상이한 유기 용매 중의 37℃에서의 퓨리마진의 안정성
상기 기재된 바대로, 티오뉴클레오사이드, 예컨대 ATT, TAK-0014 및 TAK-0002는 광의 존재 하에 그리고 광의 부재 하에(즉, 암소에서) 상이한 온도에서 시간에 따른 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시켰다. 37℃에서의 퓨리마진의 안정화를 추가로 조사하기 위해, 퓨리마진을 상이한 유기 용매, 즉 50%(v/v) 프로필렌 글라이콜(PG):50%(v/v) 에탄올, 60%(v/v) 프로필렌 글라이콜(PG):40%(v/v) 에탄올, 및 15%(v/v) 글라이세롤:85%(v/v) 에탄올의 존재 하에 항온처리한 후 발광성을 측정하였다.
구체적으로, 이 연구에 사용된 재료는 표 18에 기재되어 있다.
Figure 112016116106321-pct00062
퓨리마진의 1.25mM 스톡을 하기 용액 중에 제조하였다: a) 50% 프로필렌 글라이콜:50% 에탄올, 1.25mM 퓨리마진, 250mM ATT; b) 60% 프로필렌 글라이콜:40% 에탄올, 1.25mM 퓨리마진, 300mM ATT; c) 15% 글라이세롤:85% 에탄올, 1.25mM 퓨리마진, 250mM ATT; 및 물품 퓨리마진(프로메가 코포레이션). 퓨리마진을 처음에 용해시키고 이후 ATT를 첨가하였다. 4㎖의 각각의 샘플을 만들기 위해, 2㎎의 퓨리마진 및 143㎎의 ATT(250mM ATT)를 첨가하였다. 300mM ATT의 경우, 171㎎의 ATT를 첨가하였다.
이 샘플의 일부를 O-링이 있는 황색 스타스테아드(Starstead) 관에 분취하고 이후 37℃에서 정치시켰다. 샘플을 제거하고 상이한 시점에서 -20℃에서 정치시키고 이후 모두 한번에 평가하였다. 남은 샘플을 15㎖ 관에서 -20℃에서 정치시키고, 침전물 형성에 대해 모니터링하였다.
샘플을 평가하기 전에, 이것을 실온(RT)으로 가열하고 와류시켜 용액으로부터 떨어진 임의의 물질이 재현탁되게 하였다. 각각의 시점에 대해 10㎕의 각각의 샘플을 490㎕의 완충제(NANOGLO 완충제, 프로메가 코포레이션)에 첨가하고 혼합하여 25μM 퓨리마진을 가지는 용액을 생성하였다. 물품 퓨리마진의 경우, 5㎕를 995㎕의 완충제(NANOGLO 완충제, 프로메가 코포레이션) 중에 희석하여 25μM 퓨리마진을 가지는 용액을 생성하였다. 이후, 25μM 용액을 1:100(495㎕ 중의 5㎕) 희석하여 0.25μM 퓨리마진을 가지는 용액(0.25μM 용액)을 생성하였다. 50㎕의 루시퍼라제 효소(NANOLUC 루시퍼라제, 프로메가 코포레이션)를 50㎕의 각각의 0.25μM 용액에 의해 CO2 독립 매질 + 10% FBS로 희석하였다. 남은 희석액을 RT에서 3분 동안 항온처리하고, 발광장치(GLOMAX Multi plus luminometer, 프로메가 코포레이션)에서 발광성을 검출하였다. 샘플에서의 자가발광을 평가하기 위해, 샘플을 CO2 독립 매질 + 10% FBS(물품 퓨리마진을 1:500 희석함)로 1:125 희석하고, 발광장치(GLOMAX Multi plus luminometer, 프로메가 코포레이션)에서 발광성을 검출하였다.
상대 광 단위(RLU)를 0일 시점(t=0)에서 RLU 값에 의해 각각의 시점에 대해 정규화하였다. 도 17(0.25μM 용액)에 도시된 바대로 각각의 샘플에 대해 시간(일)에 대해 정규화된 RLU를 작도하였다. 이 데이터는 퓨리마진이 각각의 유기 용매에 대해 ATT의 부재 하에서보다 ATT의 존재 하에 더 안정하다는 것을 입증한다. 퓨리마진은 ATT가 없는 유기 용매 15% 글라이세롤:85% 에탄올에서보다 ATT를 가지는 유기 용매 15% 글라이세롤:85% 에탄올 중에 더 안정하였다. 따라서, 이 결과는 상기 실시예에서의 결과와 함께 ATT가 상이한 온도에서, 광의 존재 하에, 광의 부재 하에 그리고 유기 용매, 예컨대 DMSO, 50%(v/v) 프로필렌 글라이콜:50%(v/v) 에탄올, 및 15% 글라이세롤(v/v):85%(v/v) 에탄올 중에 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시킨다는 것을 입증한다. 종합하면, 이 결과는 티오뉴클레오사이드(예를 들어, ATT)가 분해에 대해 퓨리마진을 안정화시키고, 이로써 퓨리마진으로부터의 증가한 활성(즉, 발광성)을 허용한다는 것을 나타낸다.
6. 조항
완전을 기하기 위하여, 본 발명의 다양한 양태가 하기 넘버링된 조항에 기재되어 있다:
조항 1. (a) 발광성 기질; (b) 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체; 및 (c) 유기 용매를 포함하는, 조성물.
Figure 112016116106321-pct00063
식 중,
R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 카복실산, 에스터, NRaRb, 이민, 하이드록실 또는 옥소이고;
R2는 수소, NRaRb, 이민, 알킬 또는 아릴이며; 그리고
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이다.
조항 2. 제1 조항에 있어서, 상기 조성물은 발광성 효소를 함유하지 않는, 조성물.
조항 3. 제1 조항에 있어서, 상기 발광성 기질은 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 4. 제3 조항에 있어서, 상기 발광성 기질은, 상기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체를 포함하지 않는 조성물과 비교할 때, 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 5. 제3 조항 또는 제4 조항에 있어서, 상기 발광성 기질은 광의 존재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 6. 제3 조항 또는 제4 조항에 있어서, 상기 발광성 기질은 광의 부재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 7. 제3 조항 또는 제4 조항에 있어서, 상기 발광성 기질은 -80℃ 내지 60℃의 온도에서 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 8. 제1 조항에 있어서, 상기 발광성 기질은 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체인, 조성물.
조항 9. 제8 조항에 있어서, 상기 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체는 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 10. 제9 조항에 있어서, 상기 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체는 광의 존재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 11. 제10 조항에 있어서, 상기 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체는, 상기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체를 포함하지 않는 조성물과 비교할 때, 광의 존재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 12. 제9 조항에 있어서, 상기 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체는 광의 부재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 13. 제12 조항에 있어서, 상기 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체는, 상기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체를 포함하지 않는 조성물과 비교할 때, 광의 부재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 14. 제9 조항에 있어서, 상기 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체는 -80℃ 내지 60℃의 온도에서 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 15. 제8 조항에 있어서, 상기 코엘렌테라진의 작용성 유사체는 퓨리마진인, 조성물.
조항 16. 제15 조항에 있어서, 퓨리마진은 광의 존재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 17. 제16 조항에 있어서, 퓨리마진은, 상기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체를 포함하지 않는 조성물과 비교할 때, 광의 존재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 18. 제15 조항에 있어서, 퓨리마진은 광의 부재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 19. 제18 조항에 있어서, 퓨리마진은, 상기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체를 포함하지 않는 조성물과 비교할 때, 광의 부재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
조항 20. 제1 조항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물의 유효량은 0.1mM 초과인, 조성물.
조항 21. 제20 조항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물의 유효량은 1mM 초과인, 조성물.
조항 22. 제1 조항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 ATT, ATCA, 3-(4-아미노-5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-일)프로판산, 테트라하이드로-2-메틸-3-티옥소-1,2,4-트라이아진-5,6-다이온, 4-((2-퓨릴메틸렌)아미노)-3-머캅토-6-메틸-1,2,4-트라이아진-5(4H)-온, 6-벤질-3-설파닐-1,2,4-트라이아진-5-올, 4-아미노-3-머캅토-6-메틸-1,2,4-트라이아진-5(4H)-온, 3-(5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-일)프로판산, (E)-6-메틸-4-((티오펜-2-일메틸렌)아미노)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, (E)-6-메틸-4-((3-나이트로벤질리덴)아미노)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, (E)-4-((4-(다이에틸아미노)벤질리덴)아미노)-6-메틸-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, ATCA 에틸 에스터, TAK-0014, TAK-0002, TAK-0021, TAK-0020, TAK-0018, TAK-0009, TAK-0007, TAK-0008, TAK-0003, TAK-0004, 3-티옥소-6-(트라이플루오로메틸)-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, 6-사이클로프로필-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, 및 6-(하이드록시메틸)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온으로 이루어진 군으로부터 선택된, 조성물.
조항 23. 제22 조항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 ATT이고, 상기 ATT의 유효량은 32mM 초과인, 조성물.
조항 24. 제23 조항에 있어서, 상기 ATT의 유효량은 225mM인, 조성물.
조항 25. 제1 조항에 있어서, 상기 유기 용매는 알콜, 프로필렌 글라이콜, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 아세토나이트릴, 글라이세롤, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 조성물.
조항 26. 제25 조항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올 및 프로필렌 글라이콜의 조합인, 조성물.
조항 27. 제25 조항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올 및 글라이세롤의 조합인, 조성물.
조항 28. 발광성 기질을 안정화시키는 방법으로서, 상기 발광성 기질을 유기 용매의 존재 하에 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체와 접촉시킴으로써, 상기 발광성 기질은 분해에 대해 안정화되는 단계를 포함하고, 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기와 같은, 발광성 기질을 안정화시키는 방법:
Figure 112016116106321-pct00064
식 중,
R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 카복실산, 에스터, NRaRb, 이민, 하이드록실 또는 옥소이고;
R2는 수소, NRaRb, 이민, 알킬 또는 아릴이며; 그리고
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이다.
조항 29. 제28 조항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물의 유효량은 0.1mM 초과인, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 30. 제29 조항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물의 유효량은 1mM 초과인, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 31. 제28 조항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 ATT, ATCA, 3-(4-아미노-5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-일)프로판산, 테트라하이드로-2-메틸-3-티옥소-1,2,4-트라이아진-5,6-다이온, 4-((2-퓨릴메틸렌)아미노)-3-머캅토-6-메틸-1,2,4-트라이아진-5(4H)-온, 6-벤질-3-설파닐-1,2,4-트라이아진-5-올, 4-아미노-3-머캅토-6-메틸-1,2,4-트라이아진-5(4H)-온, 3-(5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-일)프로판산, (E)-6-메틸-4-((티오펜-2-일메틸렌)아미노)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, (E)-6-메틸-4-((3-나이트로벤질리덴)아미노)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, (E)-4-((4-(다이에틸아미노)벤질리덴)아미노)-6-메틸-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, ATCA 에틸 에스터, TAK-0014, TAK-0002, TAK-0021, TAK-0020, TAK-0018, TAK-0009, TAK-0007, TAK-0008, TAK-0003, TAK-0004, 3-티옥소-6-(트라이플루오로메틸)-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, 6-사이클로프로필-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, 및 6-(하이드록시메틸)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온으로 이루어진 군으로부터 선택된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 32. 제31 조항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 ATT이고, 상기 ATT의 유효량은 32mM 초과인, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 33. 제32 조항에 있어서, 상기 ATT의 유효량은 225mM인, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 34. 제28 조항에 있어서, 상기 발광성 기질은 광의 존재 하에 분해에 대해 안정화된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 35. 제28 조항에 있어서, 상기 발광성 기질은 광의 부재 하에 분해에 대해 안정화된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 36. 제28 조항에 있어서, 상기 발광성 기질은 -80℃ 내지 60℃의 온도에서 분해에 대해 안정화된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 37. 제28 조항에 있어서, 상기 발광성 기질은 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체인, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 38. 제37 조항에 있어서, 상기 코엘렌테라진의 작용성 유사체는 퓨리마진인, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 39. 제38 조항에 있어서, 퓨리마진은 광의 존재 하에 분해에 대해 안정화된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 40. 제38 조항에 있어서, 퓨리마진은 광의 부재 하에 분해에 대해 안정화된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 41. 제28 조항에 있어서, 상기 유기 용매는 알콜, 프로필렌 글라이콜, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 아세토나이트릴, 글라이세롤, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 42. 제41 조항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올 및 프로필렌 글라이콜의 조합인, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 43. 제41 조항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올 및 글라이세롤의 조합인, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
조항 44. 단일 용기 내에 제1 조항의 조성물을 포함하는 키트로서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 상기 발광성 기질을 안정화시키는, 키트.
조항 45. 제44 조항에 있어서, 상기 발광성 기질은 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체인, 키트.
조항 46. 제45 조항에 있어서, 상기 코엘렌테라진의 작용성 유사체는 퓨리마진인, 키트.
조항 47. 제44 조항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물의 유효량은 0.1mM 초과인, 키트.
조항 48. 제47 조항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물의 유효량은 1mM 초과인, 키트.
조항 49. 제44 조항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 ATT, ATCA, 3-(4-아미노-5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-일)프로판산, 테트라하이드로-2-메틸-3-티옥소-1,2,4-트라이아진-5,6-다이온, 4-((2-퓨릴메틸렌)아미노)-3-머캅토-6-메틸-1,2,4-트라이아진-5(4H)-온, 6-벤질-3-설파닐-1,2,4-트라이아진-5-올, 4-아미노-3-머캅토-6-메틸-1,2,4-트라이아진-5(4H)-온, 3-(5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-일)프로판산, (E)-6-메틸-4-((티오펜-2-일메틸렌)아미노)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, (E)-6-메틸-4-((3-나이트로벤질리덴)아미노)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, (E)-4-((4-(다이에틸아미노)벤질리덴)아미노)-6-메틸-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, ATCA 에틸 에스터, TAK-0014, TAK-0002, TAK-0021, TAK-0020, TAK-0018, TAK-0009, TAK-0007, TAK-0008, TAK-0003, TAK-0004, 3-티옥소-6-(트라이플루오로메틸)-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, 6-사이클로프로필-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, 및 6-(하이드록시메틸)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온으로 이루어진 군으로부터 선택된, 키트.
조항 50. 제49 조항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 ATT이고, 상기 ATT의 유효량은 32mM 초과인, 키트.
조항 51. 제50 조항에 있어서, 상기 ATT의 유효량은 225mM인, 키트.
조항 52. 제44 조항에 있어서, 상기 유기 용매는 알콜, 프로필렌 글라이콜, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 아세토나이트릴, 글라이세롤, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 키트.
조항 53. 제52 조항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올 및 프로필렌 글라이콜의 조합인, 키트.
조항 54. 제53 조항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올 및 프로필렌 글라이콜의 조합인, 키트.
상기 상세한 설명 및 첨부된 실시예는 단지 예시적이고 본 발명의 범위에 대한 제한으로 취해지지 않아야 하는 것으로 이해되고, 이 범위는 오직 첨부된 청구항 및 이의 균등물에 의해 정의된다.
개시된 실시형태에 대한 다양한 변경 및 변경은 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 화학 구조, 치환기, 유도체, 중간체, 합성, 조성물, 제제 또는 본 발명의 사용 방법과 관련한 것을, 제한 없이, 포함하는 이러한 변경 및 변경은 이의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다.

Claims (54)

  1. 조성물로서,
    (a) 발광성 기질;
    (b) 유효량의 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체; 및
    (c) 유기 용매를 포함하는, 조성물:
    Figure 112022060719416-pct00065

    식 중,
    R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -COOH, -CO2Rc(여기서, Rc는 알킬 또는 아릴이다), NRaRb, -N=CRd(여기서, Rd는 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬이다), 하이드록실 또는 옥소(oxo)이고;
    R2는 수소, NRaRb, -N=CRd(여기서, Rd는 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬이다), 알킬 또는 아릴이며; 그리고
    Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 발광성 효소를 함유하지 않는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 발광성 기질은 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체(functional analog)인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체는 분해에 대해 안정화된, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체는 광의 존재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체는 광의 부재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체는, 상기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체를 포함하지 않는 조성물과 비교할 때, 분해에 대해 안정화된, 조성물.
  8. 제3항에 있어서, 상기 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체는 -80℃ 내지 60℃의 온도에서 분해에 대해 안정화된, 조성물.
  9. 제3항에 있어서, 상기 코엘렌테라진의 작용성 유사체는 퓨리마진인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 퓨리마진은 광의 존재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 퓨리마진은 광의 부재 하에 분해에 대해 안정화된, 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 퓨리마진은, 상기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체를 포함하지 않는 조성물과 비교할 때, 분해에 대해 안정화된, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물의 유효량은 0.1mM 초과인, 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 ATT, ATCA, 3-(4-아미노-5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-일)프로판산, 4-((2-퓨릴메틸렌)아미노)-3-머캅토-6-메틸-1,2,4-트라이아진-5(4H)-온, 6-벤질-3-설파닐-1,2,4-트라이아진-5-올, 4-아미노-3-머캅토-6-메틸-1,2,4-트라이아진-5(4H)-온, 3-(5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-일)프로판산,(E)-6-메틸-4-((티오펜-2-일메틸렌)아미노)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온,(E)-6-메틸-4-((3-나이트로벤질리덴)아미노)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온,(E)-4-((4-(다이에틸아미노)벤질리덴)아미노)-6-메틸-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, ATCA 에틸 에스터, TAK-0014, TAK-0002, TAK-0021, TAK-0020, TAK-0018, TAK-0009, TAK-0007, TAK-0008, TAK-0003, TAK-0004, 3-티옥소-6-(트라이플루오로메틸)-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, 6-사이클로프로필-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, 및 6-(하이드록시메틸)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온으로 이루어진 군으로부터 선택된, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 ATT이고, 상기 ATT의 유효량은 32mM 초과인, 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 유기 용매는 알콜, 프로필렌 글라이콜, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 아세토나이트릴, 글라이세롤, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 조성물.
  17. 발광성 기질을 안정화시키는 방법으로서, 상기 발광성 기질을 유기 용매의 존재 하에 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 호변이성질체와 접촉시킴으로써, 상기 발광성 기질은 분해에 대해 안정화되는 단계를 포함하되, 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기와 같은, 발광성 기질을 안정화시키는 방법:
    Figure 112022060719416-pct00066

    식 중,
    R1은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알킬-아릴, 알킬-헤테로아릴, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -COOH, -CO2Rc(여기서, Rc는 알킬 또는 아릴이다), NRaRb, -N=CRd(여기서, Rd는 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬이다), 하이드록실 또는 옥소이고;
    R2는 수소, NRaRb, -N=CRd(여기서, Rd는 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬이다), 알킬 또는 아릴이며; 그리고
    Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, 알킬 또는 아릴이다.
  18. 제17항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물의 유효량은 0.1mM 초과인, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 ATT, ATCA, 3-(4-아미노-5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-일)프로판산, 테트라하이드로-2-메틸-3-티옥소-1,2,4-트라이아진-5,6-다이온, 4-((2-퓨릴메틸렌)아미노)-3-머캅토-6-메틸-1,2,4-트라이아진-5(4H)-온, 6-벤질-3-설파닐-1,2,4-트라이아진-5-올, 4-아미노-3-머캅토-6-메틸-1,2,4-트라이아진-5(4H)-온, 3-(5-옥소-3-티옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-1,2,4-트라이아진-6-일)프로판산,(E)-6-메틸-4-((티오펜-2-일메틸렌)아미노)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온,(E)-6-메틸-4-((3-나이트로벤질리덴)아미노)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온,(E)-4-((4-(다이에틸아미노)벤질리덴)아미노)-6-메틸-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, ATCA 에틸 에스터, TAK-0014, TAK-0002, TAK-0021, TAK-0020, TAK-0018, TAK-0009, TAK-0007, TAK-0008, TAK-0003, TAK-0004, 3-티옥소-6-(트라이플루오로메틸)-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, 6-사이클로프로필-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온, 및 6-(하이드록시메틸)-3-티옥소-3,4-다이하이드로-1,2,4-트라이아진-5(2H)-온으로 이루어진 군으로부터 선택된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 ATT이고, 상기 ATT의 유효량은 32mM 초과인, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 발광성 기질은 광의 존재 하에 분해에 대해 안정화된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 발광성 기질은 광의 부재 하에 분해에 대해 안정화된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 발광성 기질은 -80℃ 내지 60℃의 온도에서 분해에 대해 안정화된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
  24. 제17항에 있어서, 상기 발광성 기질은 코엘렌테라진 또는 이의 작용성 유사체인, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 코엘렌테라진의 작용성 유사체는 퓨리마진인, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 퓨리마진은 광의 존재 하에 분해에 대해 안정화된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 퓨리마진은 광의 부재 하에 분해에 대해 안정화된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
  28. 제17항에 있어서, 상기 유기 용매는 알콜, 프로필렌 글라이콜, 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 아세토나이트릴, 글라이세롤, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 발광성 기질을 안정화시키는 방법.
  29. 단일 용기 내에 제1항, 제3항, 제9항 및 제13항 내지 제16항 중의 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트로서, 상기 화학식 (I)의 화합물은 상기 발광성 기질을 안정화시키는, 키트.
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