CN106661028B - 用于稳定化发光底物的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于稳定化发光底物诸如腔肠素或其功能性类似物的组合物和方法。所述功能性类似物可为furimazine。所述组合物可包含发光底物、硫代核苷和有机溶剂，其中所述硫代核苷以有效于稳定化所述发光底物以防止分解的量存在。本文所提供的方法通过使发光底物在有机溶剂存在下与有效量的硫代核苷接触来稳定化所述发光底物以防止分解。本文还提供了一种包含所述组合物的试剂盒。

Description

用于稳定化发光底物的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年5月23日提交的美国临时专利申请号62/002,363的优先权，所述申请的完整内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及用于稳定化发光底物的组合物和方法。
背景
发光常常在生物测定中用作报道分子活性的量度。所述报道分子因而将发光测量值与感兴趣的生物过程诸如转录(基因表达)、翻译(蛋白质表达)、蛋白质-蛋白质相互作用等等相连接，从而允许定量测定生物过程中发生的变化。
报道分子通常是一种发光酶(萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、Oplophorus荧光素酶等)，所述酶当提供有其发光底物时引起光的产生，即发光。然而，发光底物可在保存期间分解，从而使得底物在加入或用于生物测定中之前有所损失。此分解可为发光底物在溶液中随着时间推移以温度依赖性方式不稳定的结果。此分解导致发光底物的浪费并且减少源自采用分解发光底物的生物测定的发光测量值的灵敏度和再现性。另外，来自此分解的产物常常抑制发光反应。
因此，需要鉴别并发展用于在发光底物用于发光反应之前使其稳定的新组合物和/或方法。
发明概要
本公开提供一种组合物，所述组合物包含：(a)发光底物；(b)有效量的式(I)化合物或其互变异构体，
Figure BDA0001160026210000021
其中
R1为氢、烷基、取代的烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、环烷基、芳基、杂芳基、羧酸、酯、NRaRb、亚胺、羟基或氧基；
R2为氢、NRaRb、亚胺、烷基或芳基；
Ra和Rb各自独立地为氢、烷基或芳基；以及
(c)有机溶剂。
本公开还提供了一种在单一容器中包含以上组合物的试剂盒，其中所述式(I)化合物或其互变异构体稳定化所述发光底物。
本公开还提供了一种稳定化发光底物的方法，所述方法包括使所述发光底物在有机溶剂存在下与有效量的式(I)化合物或其互变异构体接触，从而使所述发光底物稳定以防止分解，其中所述式(I)化合物为
Figure BDA0001160026210000031
其中
R1为氢、烷基、取代的烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、环烷基、芳基、杂芳基、羧酸、酯、NRaRb、亚胺、羟基或氧基；
R2为氢、NRaRb、亚胺、烷基或芳基；并且
Ra和Rb各自独立地为氢、烷基或芳基。
附图简述
图1示出腔肠素在ATT存在(A)和不存在(B)下的稳定性。
图2示出腔肠素-h在ATT存在(A)和不存在(B)下的稳定性。
图3示出腔肠素-h-h在ATT存在(A)和不存在(B)下的稳定性。
图4示出furimazine在ATT存在(A)和不存在(B)下的稳定性。
图5在(A)中示出furimazine在ATT存在和不存在下的稳定性；并且在(B)、(C)和(D)中示出分解产物在ATT存在和不存在下的形成。
图6示出furimazine在ATT存在下的阿累乌尼斯图。
图7示出furimazine在ATT不存在下的阿累乌尼斯图。
图8示出腔肠素在ATT存在下的阿累乌尼斯图。
图9示出腔肠素在ATT不存在下的阿累乌尼斯图。
图10示出腔肠素-h在ATT存在下的阿累乌尼斯图。
图11示出腔肠素-h在ATT不存在下的阿累乌尼斯图。
图12示出腔肠素-h-h在ATT存在下的阿累乌尼斯图。
图13示出腔肠素-h-h在ATT不存在下的阿累乌尼斯图。
图14示出furimazine在光存在下和在ATT存在或不存在下在(A)室温和(B)40℃下的稳定性。
图15示出DMSO中的furimazine在ATT存在或不存在下在室温、40℃和60℃下的稳定性。
图16在(A)中示出furimazine在硫代核苷存在或不存在下从时间点0天(t＝0)随着时间(天)变化的活性百分比并且(B)示出图16A中的每种样品中37℃下在数天内的半衰期。
图17示出0.25μM furimazine(Fz)针对时间(天)作图的归一化相对光单位(RLU)，其被归一化为时间点0天(t＝0)。在图17中，furimazine是在37℃下在ATT存在和不存在下并且在不同有机溶剂存在下(即，50％聚乙二醇(PG):50％乙醇；60％聚乙二醇(PG):40％乙醇；以及15％甘油:85％乙醇)。
详细描述
本发明涉及一种用于稳定化发光底物的组合物。所述发光底物可以是但不限于是腔肠素、腔肠素-h、腔肠素-h-h、furimazine、其衍生物、其类似物、或其任何组合。所述组合物可包含发光底物、硫代核苷，以及有机溶剂。所述组合物可不包含或含有发光酶。
硫代核苷可为式(I)化合物或其互变异构体，
Figure BDA0001160026210000051
其中
R1为氢、烷基、取代的烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、环烷基、芳基、杂芳基、羧酸、酯、NRaRb、亚胺、羟基或氧基；
R2为氢、NRaRb、亚胺、烷基或芳基；并且
Ra和Rb各自独立地为氢、烷基或芳基。
所述硫代核苷可稳定化所述发光底物使其在光存在下、在光不存在下和/或在不同温度下不会随着时间推移而分解。所述硫代核苷可稳定化所述发光底物使其在光存在下、在光不存在下和/或在不同温度下不会随着时间推移而分解成一种或多种分解产物。
这样，与不包含硫代核苷的组合物相比，在组合物中包含硫代核苷可通过抑制或减少一种或多种分解产物的形成来稳定化发光底物以防止分解。这进而提供了在特定温度下、在光存在下和/或光不存在下持续一定时间段保存或孵育发光底物而在发光底物用于测定中之前没有发光底物的显著分解的能力。
本发明还涉及一种用于稳定化发光底物的方法。这种方法可稳定化发光底物以防止分解并且/或者抑制或减少一种或多种分解产物的形成。所述方法可包括使发光底物在有机溶剂存在下与有效量的硫代核苷(例如，225mM)接触。此接触步骤可包括形成上述组合物。
1.定义
除非另外限定，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，以包括定义在内的本文件为准。以下描述了优选的方法和材料，尽管在本发明的实践或测试中可使用类似于或等同于本文所述的那些的方法和材料。本文提及的所有公开、专利申请、专利，以及其他参考文献均以引用的方式整体并入本文。这些材料、方法和实施例仅具有说明性并且不意图具有限制性。
如本文所用的术语“包括”、“包含”、“具有的”、“具有”、“能够”、“含有”以及其变体均意图是开放性的翻译短语、术语或词语，它们并不排除另外的作用或结构的可能性。除非上下文中另外明确指明，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。本公开还包括其他实施方式“包括的”、“由...组成”和“基本上由...组成”、本文提供的实施方案或元件，无论是否明确陈述。
如本文所用的，术语“烷基”是指线性或分支烃基，优选地具有1至30个碳原子、1至10个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子。术语“C1-C4-烷基”被定义为包括在线性或分支排列中具有1、2、3或4个碳的烷基。例如，“C1-C4-烷基”特别包括甲基、乙基、正丙基、间丙基、正丁基、叔丁基，以及间丁基。术语“C1-C6-烷基”被定义为包括在线性或分支排列中具有1、2、3、4、5或6个碳的烷基。例如，“C1-C6-烷基”特别包括甲基、乙基、正丙基、间丙基、正丁基、叔丁基、间丁基、戊基以及己基。本发明的烷基可为未取代的或者可被一个或多个如本文所定义的适合取代基、优选地1至3个适合取代基取代。
如本文所用的，术语“烷基-芳基”是指如本文所定义的芳基通过如本文所定义的烷基附接至母体分子部分。在一些实施方案中，烷基可为C1-C4-烷基。
如本文所用的，术语“烷基-杂芳基”是指如本文所定义的杂芳基通过如本文所定义的烷基附接至母体分子部分。在一些实施方案中，烷基可为C1-C4-烷基。
如本文所用的，术语“环烷基”是指含有三至十个碳原子、零个杂原子和零个双键的碳环系统。环烷基的代表性实例包括但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基以及环癸基。
如本文所用的，术语“芳基”是指单环、双环或三环芳基。芳基的代表性实例包括但不限于，苯基、二氢茚基、茚基、萘基、二氢萘基，以及四氢萘基。本发明的芳基可任选地被一个或多个如本文所定义的适合取代基、优选地1至5个适合取代基取代。
如本文所使用，术语“羧酸”是指COOH。
如本文所用的，术语“有效量”是指如本文所述的硫代核苷持续所需时间段实现希望的如本文所述的发光底物的稳定化以防止分解成一种或多种分解产物或降解物的量。
如本文所用的，术语“酯”是指CO2Rc，其中Rc为烷基或芳基。
如本文所用的，术语“杂芳基”是指单环杂芳基或双环杂芳基。单环杂芳基为五元环或六元环。五元环含有两个双键。五元环可含有一个选自O或S的杂原子；或者一个、两个、三个或四个氮原子以及任选地一个氧或硫原子。六元环含有三个双键和一个、两个、三个或四个氮原子。单环杂芳基的代表性实例包括但不限于呋喃基、咪唑基、异
Figure BDA0001160026210000071
唑基、异噻唑基、
Figure BDA0001160026210000072
二唑基、1,3-
Figure BDA0001160026210000073
唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、吡咯基、四唑基、噻二唑、1,3-噻唑、噻吩、三唑，以及三嗪基。双环杂芳基包括融合至苯基的单环杂芳基、或融合至单环环烷基的单环杂芳基、或融合至单环环烷烯基的单环杂芳基、或融合至单环杂芳基的单环杂芳基、或融合至单环杂环的单环杂芳基。双环杂芳基的代表性实例包括但不限于，苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并
Figure BDA0001160026210000081
唑基、苯并咪唑基、苯并
Figure BDA0001160026210000082
二唑基、6,7-二氢-1,3-苯并噻唑、咪唑并[1,2-a]吡啶基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、二氮杂萘基、吡啶并咪唑基、喹唑啉基、喹啉基、噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基、噻唑并[5,4-d]嘧啶-2-基，以及5,6,7,8-四氢喹啉-5-基。本发明的杂芳基可为未取代的或者可被一个或多个如本文所定义的适合取代基、优选地1至5个适合取代基取代。
如本文所用的，术语“亚胺”是指-N＝CRd，其中Rd为如本文所定义的烷基、芳基、杂芳基或环烷基。Rd可为未取代的或被一个或多个如本文所定义的适合取代基取代的。
如本文所用的，术语“羟基”是指-OH基团。
如本文所用的，术语“氧基”是指双键氧(═O)基，其中键配对物为碳原子。此基团还可被视为羰基。
如本文所用的，术语“适合取代基”旨在意指化学上可接受的官能基团，例如并不抵消发明性化合物的活性的部分。适合取代基的说明性实例包括但不限于，卤代基、全氟烷基、全氟烷氧基、烷基、烯基、炔基、羟基、卤代基、氧基、巯基、烷基硫基、烷氧基、硝基、叠氮烷基、芳基或杂芳基、芳基氧基或杂芳基氧基、芳烷基或杂芳烷基、芳烷基氧基或杂芳烷基氧基、HO—(C═O)—基、杂环基、环烷基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基、氨甲酰基、烷基羰基、烷基羰基氧基、烷氧基羰基、、烷基氨基羰基、儿烷基羰基、芳基羰基、芳基氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基等。取代基可被另外的取代基取代。
如果取代基被描述为“独立地选自”一个组，则每个取代基独立于另一个取代基而选择。因此，每个取代基可与其他取代基相同或不同。
如本文所用的，术语“光”可以是指可见光、白光(可为三原色红光、蓝光和黄光的组合)、紫外光、蓝光、蓝绿光、绿光、黄绿光、黄光、橙光、红光、或仅紫外光、或其任何组合。术语“光”可以是指来自一个电磁光谱区，例如但不限于可见光区的光。术语“光”还可以是指具有约380nm至约780nm、或约400nm至约700nm波长的光。术语“光”还可以是指来自荧光灯泡、发光二极管(LED)灯泡、白炽灯灯泡或其任何组合的光。在一些实施方案中，黑暗可以是指不存在光。
对于本文提及的数值范围，明确涵盖它们之间具有相同精确度的每个插入数值。例如，对于6-9的范围，除6和9之外还包括数值7和8，并且对于范围6.0-7.0，还明确包括数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9，以及7.0。
2.组合物
本发明涉及一种组合物，所述组合物包含发光底物、硫代核苷和有机溶剂。所述组合物并不包含发光酶。所述组合物可稳定化发光底物以防止分解。与不包含硫代核苷的组合物相比，所述组合物可稳定化发光底物以防止分解。硫代核苷可减少或抑制从发光底物形成一种或多种分解产物。例如，并且如以下更详细描述的，硫代核苷可稳定化发光底物furimazine使其防止分解成一种或多种分解产物诸如furimamide和氨基吡嗪。
组合物可稳定化发光底物以防止在光不存在下(即，在黑暗中)的分解。与不包含硫代核苷的组合物相比，所述组合物可增加发光底物在光不存在下的半衰期。
组合物可稳定化发光底物以防止在光存在下的分解。与不包含硫代核苷的组合物相比，所述组合物可增加发光底物在光存在下的半衰期。与不包含硫代核苷的组合物相比，所述组合物可使发光底物在光存在下的半衰期增加约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4.0倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、或5.0倍。
所述组合物可稳定化发光底物以防止在以下稳定下的分解：约-120℃至约80℃、约-110℃至约80℃、约-100℃至约80℃、约-90℃至约80℃、约-85℃至约80℃、约-80℃至约80℃、约-75℃至约80℃、约-70℃至约80℃、约-65℃至约80℃、约-60℃至约80℃、约-55℃至约80℃、约-50℃至约80℃、约-45℃至约80℃、约-40℃至约80℃、约-35℃至约80℃、约-30℃至约80℃、约-25℃至约80℃、约-20℃至约80℃、约-15℃至约80℃、约-10℃至约80℃、约-5℃至约80℃、约0℃至约80℃、约-120℃至约75℃、约-120℃至约70℃、约-120℃至约65℃、约-120℃至约60℃、约-120℃至约55℃、约-120℃至约50℃、约-120℃至约45℃、约-120℃至约40℃、约-120℃至约35℃、约-120℃至约30℃、约-120℃至约25℃、约-120℃至约20℃、约-100℃至约70℃、约-80℃至约60℃、约-80℃至约55℃、约-80℃至约50℃、约-80℃至约45℃、约-80℃至约40℃、约-80℃至约35℃、约-80℃至约30℃、约-80℃至约25℃、约-20℃至约60℃、约-20℃至约55℃、约-20℃至约50℃、约-20℃至约45℃、约-20℃至约40℃、约-20℃至约35℃、约-20℃至约30℃、或约-20℃至约25℃。
所述组合物可稳定化发光底物以防止在以下温度下的分解：约-120℃、-115℃、-110℃、-105℃、-100℃、-95℃、-90℃、-89℃、-88℃、-87℃、-86℃、-85℃、-84℃、-83℃、-82℃、-81℃、-80℃、-79℃、-78℃、-77℃、-76℃、-75℃、-74℃、-73℃、-72℃、-71℃、-70℃、-69℃、-68℃、-67℃、-66℃、-65℃、-64℃、-63℃、-62℃、-61℃、-60℃、-59℃、-58℃、-57℃、-56℃、-55℃、-54℃、-53℃、-52℃、-51℃、-50℃、-49℃、-48℃、-47℃、-46℃、-45℃、-44℃、-43℃、-42℃、-41℃、-40℃、-39℃、-38℃、-37℃、-36℃、-35℃、-34℃、-33℃、-32℃、-31℃、-30℃、-29℃、-28℃、-27℃、-26℃、-25℃、-24℃、-23℃、-22℃、-21℃、-20℃、-19℃、-18℃、-17℃、-16℃、-15℃、-14℃、-13℃、-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、75℃、或80℃。所述组合物可稳定化发光底物以防止在约-80℃、-20℃、4℃、或约20℃下的分解。
所述组合物可稳定化发光底物以防止分解，持续至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、200天、210天、220天、230天、240天、250天、260天、270天、280天、290天、300天、310天、320天、330天、340天、350天、360天、1年、2年、3年、4年、或5年。
与不包含硫代核苷的组合物相比，所述组合物可使发光底物的半衰期增加至少约1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、或25倍。
a.发光底物
组合物包含发光底物。发光底物可为通过化学反应能够产生光的分子。所述发光底物可为腔肠素、腔肠素-h、腔肠素-h-h、furimazine、其功能性类似物、其衍生物、或其任何组合。发光底物可为美国专利号8,809,529和美国专利申请公布号2015/0064731中公开的一种或多种化合物，所述专利各自的内容以引用的方式并入本文。
如上所述的，组合物稳定化发光底物以防止分解。发光底物可通过在下文中详细描述的硫代核苷进行稳定以防止分解。发光底物可通过硫代核苷进行稳定以防止分解成一种或多种分解产物。所述硫代核苷可稳定化所述发光底物以防止在光存在下、在光不存在下和/或在如上所述的不同温度下的分解。
发光底物可以以下浓度存在于组合物中：约0.5mM至约10mM、约0.75mM至约10mM、约1.0mM至约10mM、约0.5mM至约9mM、约0.5mM至约8mM、约0.5mM至约7mM、约0.5mM至约6mM、约0.5mM至约5mM、约0.5mM至约4mM、约0.5mM至约3mM、或约0.5mM至约2mM。发光底物可以以下浓度存在于组合物中：约0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.25mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM、或10mM。
(1)腔肠素
所述发光底物可为腔肠素、其功能性类似物、其衍生物、或其任何组合。腔肠素可具有以下结构：
Figure BDA0001160026210000131
腔肠素可通过以下所述的硫代核苷来稳定以防止分解。硫代核苷可减少或抑制由腔肠素形成一种或多种分解产物。腔肠素可被稳定化来防止沿着(但不限于)以下路径进行的分解：
Figure BDA0001160026210000141
具体地说，腔肠素可被稳定化以防止分解成一种或多种分解产物诸如腔肠酰胺(coelenteramide)和氨基吡嗪。硫代核苷可抑制或减少腔肠酰胺和/或氨基吡嗪的形成。
(2)腔肠素-h
所述发光底物可为腔肠素-h、其功能性类似物、其衍生物、或其任何组合。腔肠素-h可具有以下结构：
Figure BDA0001160026210000151
腔肠素-h可通过以下所述的硫代核苷来稳定以防止分解。硫代核苷可减少或抑制由腔肠素-h形成一种或多种分解产物。腔肠素-h可被稳定化来防止沿着(但不限于)以下路径进行的分解：
Figure BDA0001160026210000161
具体地说，腔肠素-h可被稳定化以防止分解成一种或多种分解产物诸如腔肠酰胺-h和氨基吡嗪。硫代核苷可抑制或减少腔肠酰胺-h和/或氨基吡嗪的形成。
(3)腔肠素-h-h
所述发光底物可为腔肠素-h-h、其功能性类似物、其衍生物、或其任何组合。腔肠素-h-h可具有以下结构：
Figure BDA0001160026210000171
腔肠素-h-h可通过以下所述的硫代核苷来稳定以防止分解。硫代核苷可减少或抑制由腔肠素-h-h形成一种或多种分解产物。腔肠素-h-h可被稳定化来防止沿着(但不限于)以下路径进行的分解：
Figure BDA0001160026210000181
具体地说，腔肠素-h-h可被稳定化以防止分解成一种或多种分解产物诸如腔肠酰胺-h-h和氨基吡嗪。硫代核苷可抑制或减少腔肠酰胺-h-h和/或氨基吡嗪的形成。
(4)Furimazine
所述发光底物可为furimazine、其功能性类似物、其衍生物、或其任何组合。Furimazine可具有以下结构：
Figure BDA0001160026210000191
Furimazine可通过以下所述的硫代核苷来稳定以防止分解。硫代核苷可减少或抑制由furimazine形成一种或多种分解产物。Furimazine可被稳定化来防止沿着(但不限于)以下路径进行的分解：
Figure BDA0001160026210000201
具体地说，furimazine可被稳定化以防止分解成一种或多种分解产物诸如furimamide和氨基吡嗪。硫代核苷可抑制或减少furimamide和/或氨基吡嗪的形成。硫代核苷可使得furimamide和/或氨基吡嗪的形成减少至少约40％、至少约41％、至少约42％、至少约43％、至少约44％、至少约45％、至少约46％、至少约47％、至少约48％、至少约49％、至少约50％、至少约51％、至少约52％、至少约53％、至少约54％、至少约55％、至少约56％、至少约57％、至少约58％、至少约59％、或至少约60％。
b.硫代核苷
所述组合物可包含硫代核苷。硫代核苷可稳定化发光底物以防止分解成一种或多种分解产物。硫代核苷可减少或抑制一种或多种分解产物的形成。此类稳定化、减少或抑制可以是在光存在下、在光不存在下和/或在如上所述的不同温度下。
硫代核苷可为式(I)化合物或其互变异构体，
Figure BDA0001160026210000211
其中
R1为氢、烷基、取代的烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、环烷基、芳基、杂芳基、羧酸、酯、NRaRb、亚胺、羟基或氧基；
R2为氢、NRaRb、亚胺、烷基或芳基；并且
Ra和Rb各自独立地为氢、烷基或芳基。
在某些实施方案中，R1为氢、烷基、取代的烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、环烷基、芳基、杂芳基、羧酸、酯、NRaRb、亚胺、羟基、或氧基；其中Ra和Rb各自独立地为氢、烷基或芳基；并且其中所述烷基、芳基、杂芳基、环烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基，以及亚胺在每次出现时独立地为未取代的或被独立地选自由以下组成的组的1、2、3、4、5、6、或7个官能基取代的：卤素、＝O、＝S、氰基、氰基烷基、氰基氟代烷基、硝基、氟代烷基、烷氧基氟代烷基、氟烷氧基、烷基、烷烯基、烷炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、杂烷基、环烷基、卤代环烷基、环烷烯基、芳基、杂芳基、杂环、环烷基烷基、杂芳基烷基、芳基烷基、羟基、羟基烷基、羟基氟代烷基、烷氧基、烷氧基烷基、亚烃基、芳基氧基、苯氧基、苄基氧基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、氨基烷基、芳基氨基、磺酰基氨基、亚磺酰基氨基、磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、亚磺酰基、-COOH、酮、酰胺、氨基甲酸酯，以及酰基。
在某些实施方案中，R1为烷基、取代的烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、环烷基、羧酸、酯、或氧基；其中所述烷基、环烷基和烷基-芳基在每次出现时均独立地为未取代的或者被独立地选自由以下组成的组的1、2或3个官能基取代的：卤素、硝基、羟基、氨基、烷基氨基，以及-COOH。
在某些实施方案中，R2为氢、NRaRb、亚胺、烷基、或芳基；其中Ra和Rb各自独立地为氢、烷基或芳基；并且其中所述烷基、亚胺和芳基在每次出现时独立地为未取代的或被独立地选自由以下组成的组的1、2、3、4、5、6、或7个官能基取代的：卤素、＝O、＝S、氰基、氰基烷基、氰基氟代烷基、硝基、氟代烷基、烷氧基氟代烷基、氟烷氧基、烷基、烷烯基、烷炔基、卤代烷基、卤代烷氧基、杂烷基、环烷基、卤代环烷基、环烷烯基、芳基、杂芳基、杂环、环烷基烷基、杂芳基烷基、芳基烷基、羟基、羟基烷基、羟基氟代烷基、烷氧基、烷氧基烷基、亚烃基、芳基氧基、苯氧基、苄基氧基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、氨基烷基、芳基氨基、磺酰基氨基、亚磺酰基氨基、磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、亚磺酰基、-COOH、酮、酰胺、氨基甲酸酯，以及酰基。
在某些实施方案中，R2为氢、NRaRb或亚胺；其中Ra和Rb各自独立地为氢或烷基；其中所述亚胺为未取代的或者被独立地选自由卤素、硝基、羟基、氨基以及烷基氨基组成的组的官能基取代的。
在某些实施方案中，R2为亚胺；其中亚胺为-N＝CRd；其中Rd为烷基、芳基、杂芳基或环烷基；其中所述亚胺为未取代的或者被独立地选自由卤素、硝基、羟基、氨基以及烷基氨基组成的组的官能基取代的。
在某些实施方案中，R2为亚胺；其中亚胺为-N＝CRd；其中Rd为芳基或杂芳基；其中所述亚胺为未取代的或者被独立地选自由硝基和烷基氨基组成的组的官能基取代的。
式(I)化合物可为具有以下结构的ATT(6-甲基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮)：
Figure BDA0001160026210000231
ATT也可称为6-氮杂Aza-2-硫代胸腺嘧啶。ATT可商购自例如Sigma-Aldrich(目录号275514)。
式(I)化合物可为具有以下结构的ATCA(5-氧基-3-硫代氧基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-羧酸)：
Figure BDA0001160026210000241
ATCA可商购自例如Sigma-Aldrich(目录号S784028)。
式(I)化合物可为具有以下结构的3-(4-氨基-5-氧基-3-硫代氧基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-基)：
Figure BDA0001160026210000242
此化合物可商购自例如Sigma-Aldrich(目录号OTV000379。
式(I)化合物可为具有以下结构的四氢-2-甲基-3-硫代氧基-1,2,4-三嗪-5,6-二酮：
Figure BDA0001160026210000251
此化合物也称为硫代三嗪酮并且可商购自例如Sigma Aldrich(目录号549756)。
式(I)化合物可为具有以下结构的4-((2-呋喃基亚甲基)氨基)-3-巯基-6-甲基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮：
Figure BDA0001160026210000252
此化合物可商购自例如Sigma Aldrich(目录号L125016)。
式(I)化合物可为具有以下结构的6-苄基-3-硫烷基-1,2,4-三嗪-5-醇：
Figure BDA0001160026210000253
此化合物也称为b-ATT、苄基-ATT或TAK-0002。
式(I)化合物可为具有以下结构的4-氨基-3-巯基-6-甲基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮：
Figure BDA0001160026210000261
此化合物可商购自例如Sigma-Aldrich(目录号PH125903)。
式(I)化合物可为具有以下结构的3-(5-氧基-3-硫代氧基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-基)丙酸：
Figure BDA0001160026210000262
此化合物可商购自例如Sigma-Aldrich(目录号L151629)。
式(I)化合物可为具有以下结构的(E)-6-甲基-4-((苯硫-2-基亚甲基)氨基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮：
Figure BDA0001160026210000263
此化合物可商购自例如Sigma Aldrich(目录号L150819)。
式(I)化合物可为具有以下结构的(E)-6-甲基-4-((3-硝基苯亚甲基)氨基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮：
Figure BDA0001160026210000271
此化合物可商购自例如Sigma Aldrich(目录号L151238)。
式(I)化合物可为具有以下结构的(E)-4-((4-(二乙基氨基)苯亚甲基)氨基)-6-甲基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮：
Figure BDA0001160026210000272
此化合物可商购自例如Sigma Aldrich(目录号L151211)。
式(I)化合物可为具有以下结构的ATCA乙酯：
Figure BDA0001160026210000273
此化合物可商购自例如Sigma Aldrich(目录号PH008592)。
式(I)化合物可为具有以下结构的TAK-0021：
Figure BDA0001160026210000281
式(I)化合物可为具有以下结构的TAK-0020：
Figure BDA0001160026210000282
式(I)化合物可为具有以下结构的TAK-0018：
Figure BDA0001160026210000283
式(I)化合物可为具有以下结构的TAK-0009：
Figure BDA0001160026210000291
式(I)化合物可为具有以下结构的TAK-0014：
Figure BDA0001160026210000292
式(I)化合物可为具有以下结构的TAK-0007：
Figure BDA0001160026210000293
式(I)化合物可为具有以下结构的TAK-0008：
Figure BDA0001160026210000294
式(I)化合物可为具有以下结构的TAK-0003：
Figure BDA0001160026210000301
式(I)化合物可为具有以下结构的TAK-0004：
Figure BDA0001160026210000302
式(I)化合物可为具有以下结构的3-硫代氧基-6-(三氟甲基)-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮：
Figure BDA0001160026210000303
式(I)化合物可为具有以下结构的6-环丙基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮：
Figure BDA0001160026210000311
式(I)化合物可为具有以下结构的6-(羟基甲基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮：
Figure BDA0001160026210000312
如下所述地制备TAK-0014、TAK-0002、TAK-0021、TAK-0020、TAK-0018、TAK-0009、TAK-0007、TAK-0008、TAK-0003、TAK-0004、3-硫代氧基-6-(三氟甲基)-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、6-环丙基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮，以及6-(羟基甲基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮：S.J.Liu等，ARKIVOC(2009)333-348和S.J.Liu等，Letters in Drug Design and Discovery(2010)7:5-8，所述文献的完整内容以引用的方式并入本文。
硫代核苷可以有效于稳定化发光底物以防止分解的量存在于组合物中。硫代核苷在组合物中稳定化发光底物以防止分解的有效量可为约0.1mM至约500mM、约0.5mM至约500mM、约1mM至约500mM、约5mM至约500mM、约10mM至约500mM、约15mM至约500mM、约20mM至约500mM、约30mM至约500mM、约50mM至约500nM、约70mM至约500mM、约90mM至约500mM、约110mM至约500mM、约130mM至约500mM、约150mM至约500mM、约170mM至约500mM、约190mM至约500mM、约210mM至约500mM、约0.1mM至约475mM、约0.1mM至约450mM、约0.1mM至约425mM、约0.1mM至约400mM、约0.1mM至约375mM、约0.1mM至约350mM、约0.1mM至约325mM、约0.1mM至约300mM、约0.1mM至约275mM、约0.5mM至约450mM、约1mM至约400mM、约2mM至约350mM、约3mM至约300mM、约4mM至约300mM、或约5mM至约250mM。
硫代核苷在组合物中稳定化发光底物以防止分解的有效量可为约0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、5.5mM、6.0mM、6.5mM、7.0mM、7.5mM、8.0mM、8.5mM、9.0mM、9.5mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM、56mM、57mM、58mM、59mM、60mM、61mM、62mM、63mM、64mM、65mM、66mM、67mM、68mM、69mM、70mM、71mM、72mM、73mM、74mM、75mM、76mM、77mM、78mM、79mM、80mM、81mM、82mM、83mM、84mM、85mM、86mM、87mM、88mM、89mM、90mM、91mM、92mM、93mM、94mM、95mM、96mM、97mM、98mM、99mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM、200mM、205mM、210mM、215mM、220mM、225mM、230mM、235mM、240mM、245mM、250mM、255mM、260mM、265mM、270mM、275mM、280mM、285mM、290mM、295mM、300mM、305mM、310mM、315mM、320mM、325mM、330mM、335mM、340mM、345mM、350mM、355mM、360mM、365mM、370mM、375mM、380mM、385mM、390mM、395mM、400mM、405mM、410mM、415mM、420mM、425mM、430mM、435mM、440mM、445mM、450mM、455mM、460mM、465mM、470mM、475mM、480mM、485mM、490mM、495mM、或500mM。
硫代核苷在组合物中稳定化发光底物以防止分解的有效量可大于0.1mM、0.5mM或1mM。
在一些实施方案中，当硫代核苷为ATT时，ATT稳定化发光底物以防止分解的有效量可为约约90mM至约500mM、约100mM至约500mM、约110mM至约500mM、约120mM至约500mM、约130mM至约500mM、约140mM至约500mM、约150mM至约500mM、约160mM至约500mM、约170mM至约500mM、约180mM至约500mM、约190mM至约500mM、约200mM至约500mM、约210mM至约500mM、约90mM至约475mM、约90mM至约450mM、约90mM至约425mM、约90mM至约400mM、约90mM至约375mM、约90mM至约350mM、约90mM至约325mM、约90mM至约300mM、约90mM至约275mM、约100mM至约450mM、约125mM至约400mM、约175mM至约350mM、或约200mM至约300mM。
在其他实施方案中，当硫代核苷为ATT时，ATT稳定化发光底物以防止分解的有效量可为约90mM、91mM、92mM、93mM、94mM、95mM、96mM、97mM、98mM、99mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM、200mM、201mM、202mM、203mM、204mM、205mM、206mM、207mM、208mM、209mM、210mM、211mM、212mM、213mM、214mM、215mM、216mM、217mM、218mM、219mM、220mM、221mM、222mM、223mM、224mM、225mM、226mM、227mM、228mM、229mM、230mM、231mM、232mM、233mM、234mM、235mM、236mM、237mM、238mM、239mM、240mM、241mM、242mM、243mM、244mM、245mM、246mM、247mM、248mM、249mM、250mM、251mM、252mM、253mM、245mM、255mM、256mM、257mM、258mM、259mM、260mM、261mM、262mM、263mM、264mM、265mM、266mM、267mM、268mM、269mM、270mM、271mM、272mM、273mM、274mM、275mM、276mM、277mM、278mM、279mM、280mM、281mM、282mM、283mM、284mM、285mM、286mM、287mM、288mM、289mM、290mM、291mM、292mM、293mM、294mM、295mM、296mM、297mM、298mM、299mM、300mM、305mM、310mM、315mM、320mM、325mM、330mM、335mM、340mM、345mM、350mM、355mM、360mM、365mM、370mM、375mM、380mM、385mM、390mM、395mM、400mM、405mM、410mM、415mM、420mM、425mM、430mM、435mM、440mM、445mM、450mM、455mM、460mM、465mM、470mM、475mM、480mM、485mM、490mM、495mM、或500mM。
在其他实施方案中，当硫代核苷为ATT时，ATT稳定化发光底物以防止分解的有效量可为225mM。在其他实施方案中，当硫代核苷为ATT时，ATT稳定化发光底物以防止分解的有效量可大于约32mM、大于约50mM或大于约100mM。
c.有机溶剂
所述组合物可包含有机溶剂。有机溶剂可为醇、丙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、甘油或其任何组合。所述醇可为乙醇。
在一些实施方案中，有机溶剂可为醇和丙二醇的组合。在其他实施方案中，有机溶剂可为乙醇和丙二醇的组合。在其他实施方案中，有机溶剂可为1:1比率的乙醇:丙二醇(例如，50％(v/v)乙醇:50％(v/v)丙二醇)。在另一个实施方案中，有机溶剂可为40％(v/v)乙醇:60％(v/v)丙二醇。
在一些实施方案中，有机溶剂可为醇和甘油的组合。在其他实施方案中，有机溶剂可为乙醇和甘油的组合。仍在其他实施方案中，有机溶剂可为85％(v/v)乙醇:15％(v/v)甘油。
d.发光酶
如上所述的，所述组合物可不包含发光酶、其变体、其突变体或其任何组合。发光酶可为天然存在的、重组的或突变体的。发光酶可使用上述发光底物(包括其衍生物或类似物)作为底物，以催化产生光或引起光产生的反应。
发光酶可包括源自以下各项的的荧光素酶：Vargula higendorfli、生物发光十足类，诸如刺虾总科，例如刺虾来源的荧光素酶，生物发光桡足类诸如Gaussia princeps和Metridia longa，海洋生物体诸如刺胞动物(cnidarian)(例如，海肾萤光素酶)、须虾科、管鞭虾科、萤虾科、樱虾科、Pasipheidae，以及海真虾科十足目科；以及发光蛋白诸如水母素，以及所述荧光素酶的变体和突变体。
3.稳定化方法
本文还提供了一种稳定化发光底物的方法。所述方法可稳定化发光底物以防止分解。所述方法可稳定化发光底物以防止分解成一种或多种分解产物。
所述方法可包括使发光底物在有机溶剂存在下与有效量的硫代核苷接触。上文描述了稳定化发光底物以防止分解的有效量的硫代核苷。因此，所述接触步骤可包括形成上述组合物，从而稳定化所述发光底物以防止分解。
4.试剂盒
本文还提供了一种包括上述组合物的试剂盒。所述组合物可被包含在单一容器中。
根据本公开的试剂盒优选地包括用于保存所述组合物的说明书和/或含有所述组合物的单一容器。包括在本公开的试剂盒中的说明书可固定到包装材料或者可作为包装插入物包括在内。虽然说明书通常是书写或印刷形式的材料，但是它们不限于此。本公开涵盖了能够保存此类说明书并将它们传送至最终使用者的任何介质。此类介质包括但不限于，电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。如本文所用的，术语“说明书”可包括提供说明的互联网网站地址。
本发明具有由以下非限制性实施例说明的多个方面。
5.实施例
实施例1
腔肠素的稳定性
在不同温度下测量腔肠素在ATT存在和不存在下随着时间变化的稳定性。确切地说，1.25mM腔肠素存在于50％乙醇和50％丙二醇的溶液(即，无ATT的溶液)或具有225mMATT的50％乙醇和50％丙二醇的溶液(即，具有ATT的溶液)。将这两种溶液在-20℃、室温(RT)、40℃或60℃下孵育并且在0天、1天、3天、7天、15天，以及30天进行分析。
在孵育后，采用高效液相色谱法(HPLC)鉴别对应溶液中每个时间点的组分。确切地说，使用Agilent 1100HPLC仪器并且将其装备有四元泵、恒温自动进样器和柱温箱，以及G1311B二极管阵列检测器。所使用的柱是Synergi-MAX-RP(Phenomenex,Torrance,California)
Figure BDA0001160026210000361
50x4.6 2.5μm。在HPLC上运行的梯度具有0.1％TFA水溶液和乙腈。在262纳米(nm)处测量吸光度。运行腔肠素的标准物及其已知降解物，以确认保留时间和吸光度痕量。进样5μl每种溶液并且腔肠素在室温下的保留时间为3.9分钟。
在以下表1和表2以及图1A和图1B中示出了HPLC分析的结果，其中这些值被报道为在262nm处的相对峰面积百分比(即，底物的λ最大值)。图1A示出了具有ATT的溶液随着时间(以天数计)变化的相对峰面积百分比，而图1B示出无ATT的溶液随着时间(以天数计)变化的相对峰面积百分比。在图1A和图1B的各图中，菱形分别是在-20℃下使用或未使用225mMATT孵育的随着时间变化的1.25mM腔肠素，三角形分别是在室温下(RT)使用或未使用225mMATT孵育的随着时间变化的1.25mM腔肠素，星形分别是在40℃下使用或未使用225mM ATT孵育的随着时间变化的1.25mM腔肠素，并且十字形分别是在60℃下使用或未使用225mM ATT孵育的随着时间变化的1.25mM腔肠素。
Figure BDA0001160026210000381
Figure BDA0001160026210000391
由HPLC分析，计算得到的腔肠素在ATT存在下在40℃和60℃下的半衰期分别是23天和5天，而计算得到的腔肠素在ATT不存在下在40℃和60℃下的半衰期分别是9.5天和2天(参见以下表3)。
表3
Figure BDA0001160026210000401
另外，生成腔肠素在ATT存在和不存在下的阿累乌尼斯图，以计算腔肠素在不同温度下的半衰期。阿累乌尼斯等式如下：
Figure BDA0001160026210000402
转换的等式如下：
Figure BDA0001160026210000403
在图8中示出了腔肠素在ATT存在下的阿累乌尼斯图。在图8中，斜率为-8636.59，截距为24.1199，并且R2为0.9983。
在图9中示出了腔肠素在ATT不存在下的阿累乌尼斯图。在图9中，斜率为-7382.51，截距为21.2598，并且R2为0.9570。
另外，由阿累乌尼斯图计算的半衰期指示与ATT不存在相比，ATT的存在使得腔肠素在-75℃、-20℃、20℃、40℃，以及60℃下分别稳定3.29倍、8.02倍、4.14倍、3.14倍，以及2.53倍以防止分解(参见以上表3)。
总之，这些数据表明ATT稳定腔肠素以防止在不同温度下随着时间变化的分解，并且因此在溶液中包含ATT(其中腔肠素可孵育或保存一段时间)可抑制或减少腔肠素的分解(即，稳定腔肠素)。
实施例2
腔肠素-h的稳定性
在不同温度下测量腔肠素-h在ATT存在和不存在下随着时间变化的稳定性。确切地说，1.25mM腔肠素-h存在于50％乙醇和50％丙二醇的溶液(即，无ATT的溶液)或具有225mM ATT的50％乙醇和50％丙二醇的溶液(即，具有ATT的溶液)。将这两种溶液在-20℃、室温(RT)、40℃或60℃下孵育并且在0天、1天、3天、7天、15天，以及30天进行分析。
在孵育后，采用高效液相色谱法(HPLC)鉴别对应溶液中每个时间点的组分。确切地说，使用Agilent 1100HPLC仪器并且将其装备有四元泵、恒温自动进样器和柱温箱，以及G1311B二极管阵列检测器。所使用的柱是Synergi-MAX-RP(Phenomenex,Torrance,California)
Figure BDA0001160026210000411
50x4.6 2.5μm。在HPLC上运行的梯度具有0.1％TFA水溶液和乙腈。在262纳米(nm)处测量吸光度。运行腔肠素-h的标准物及其已知降解物，以确认保留时间和吸光度痕量。进样5μl每种溶液并且腔肠素-h在室温下的保留时间为4.7分钟。
在以下表4和表5以及图2A和图2B中示出了HPLC分析的结果，其中这些值被报道为在262nm处的相对峰面积百分比(即，底物的λ最大值)。图2A示出了具有ATT的溶液随着时间(以天数计)变化的相对峰面积百分比，而图2B示出无ATT的溶液随着时间(以天数计)变化的相对峰面积百分比。在图2A和图2B的各图中，菱形分别是在-20℃下使用或未使用225mMATT孵育的随着时间变化的1.25mM腔肠素-h，三角形分别是在室温下(RT)使用或未使用225mM ATT孵育的随着时间变化的1.25mM腔肠素-h，星形分别是在40℃下使用或未使用225mM ATT孵育的随着时间变化的1.25mM腔肠素-h，并且十字形分别是在60℃下使用或未使用225mM ATT孵育的随着时间变化的1.25mM腔肠素-h。
Figure BDA0001160026210000431
Figure BDA0001160026210000441
由HPLC分析，计算得到的腔肠素-h在ATT存在下在40℃和60℃下的半衰期分别是20天和5天，而计算得到的腔肠素-h在ATT不存在下在20℃、40℃和60℃下的半衰期分别是24天、7.5天和2天(参见以下表6)。
表6
Figure BDA0001160026210000451
另外，生成腔肠素-h在ATT存在和不存在下的阿累乌尼斯图，以计算腔肠素-h在不同温度下的半衰期。阿累乌尼斯等式如下：
Figure BDA0001160026210000452
转换的等式如下：
Figure BDA0001160026210000453
在图10中示出了腔肠素-h在ATT存在下的阿累乌尼斯图。在图10中，斜率为-8131.2，截距为22.6157，并且R2为0.9994。
在图11中示出了腔肠素-h在ATT不存在下的阿累乌尼斯图。在图11中，斜率为-7310.53，截距为21.4386，并且R2为0.9964。
另外，由阿累乌尼斯图计算的半衰期指示与ATT不存在相比，ATT的存在使得腔肠素在-75℃、-20℃、20℃、40℃，以及60℃下分别稳定20.00倍、2872.73倍、5.09倍、4.26倍，以及3.50倍以防止分解(参见以上表6)。
总之，这些数据表明ATT稳定腔肠素-h以防止在不同温度下随着时间变化的分解，并且因此在溶液中包含ATT(其中腔肠素-h可孵育或保存一段时间)可抑制或减少腔肠素-h的分解(即，稳定腔肠素-h)。
实施例3
腔肠素-h-h的稳定性
在不同温度下测量腔肠素-h-h在ATT存在和不存在下随着时间变化的稳定性。确切地说，1.25mM腔肠素-h-h存在于50％乙醇和50％丙二醇的溶液(即，无ATT的溶液)或具有225mM ATT的50％乙醇和50％丙二醇的溶液(即，具有ATT的溶液)。将这两种溶液在-20℃、室温(RT)、40℃或60℃下孵育并且在0天、1天、3天、7天、15天，以及30天进行分析。
在孵育后，采用高效液相色谱法(HPLC)鉴别对应溶液中每个时间点的组分。确切地说，使用Agilent 1100HPLC仪器并且将其装备有四元泵、恒温自动进样器和柱温箱，以及G1311B二极管阵列检测器。所使用的柱是Synergi-MAX-RP(Phenomenex,Torrance,California)
Figure BDA0001160026210000461
50x4.6 2.5μm。在HPLC上运行的梯度具有0.1％TFA水溶液和乙腈。在262纳米(nm)处测量吸光度。运行腔肠素-h-h的标准物及其已知降解物，以确认保留时间和吸光度痕量。进样5μl每种溶液并且腔肠素-h-h在室温下的保留时间为5.5分钟。
在以下表7和表8以及图3A和图3B中示出了HPLC分析的结果，其中这些值被报道为在262nm处的相对峰面积百分比(即，底物的λ最大值)。图3A示出了具有ATT的溶液随着时间(以天数计)变化的相对峰面积百分比，而图3B示出无ATT的溶液随着时间(以天数计)变化的相对峰面积百分比。在图3A和图3B的各图中，菱形分别是在-20℃下使用或未使用225mMATT孵育的随着时间变化的1.25mM腔肠素-h-h，三角形分别是在室温下(RT)使用或未使用225mMATT孵育的随着时间变化的1.25mM腔肠素-h-h，星形分别是在40℃下使用或未使用225mM ATT孵育的随着时间变化的1.25mM腔肠素-h-h，并且十字形分别是在60℃下使用或未使用225mM ATT孵育的随着时间变化的1.25mM腔肠素-h-h。
Figure BDA0001160026210000481
Figure BDA0001160026210000491
由HPLC分析，计算得到的腔肠素-h-h在ATT存在下在60℃下的半衰期分别是10天，而计算得到的腔肠素-h-h在ATT不存在下在40℃和60℃下的半衰期分别是27天和8天(参见以下表9)。
表9
Figure BDA0001160026210000501
另外，生成腔肠素-h-h在ATT存在和不存在下的阿累乌尼斯图，以计算腔肠素-h-h在不同温度下的半衰期。阿累乌尼斯等式如下：
Figure BDA0001160026210000502
转换的等式如下：
Figure BDA0001160026210000503
在图12中示出了腔肠素-h-h在ATT存在下的阿累乌尼斯图。在图12中，斜率为-10740.9，截距为30.0575，并且R2为0.9967。
在图13中示出了腔肠素-h-h在ATT不存在下的阿累乌尼斯图。在图13中，斜率为30.8352，截距为-10650.1，并且R2为0.9648。
另外，由阿累乌尼斯图计算的半衰期指示与ATT不存在相比，ATT的存在使得腔肠素在-75℃、-20℃、20℃、40℃，以及60℃下分别稳定3.59倍、3.12倍、2.97倍、2.90倍，以及2.82倍以防止分解(参见以上表9)。
总之，这些数据表明ATT稳定腔肠素-h-h以防止在不同温度下随着时间变化的分解，并且因此在溶液中包含ATT(其中腔肠素-h-h可孵育或保存一段时间)可抑制或减少腔肠素-h-h的分解(即，稳定腔肠素-h-h)。
实施例4
Furimazine的稳定化
在不同温度下测量furimazine在ATT存在和不存在下随着时间变化的稳定化。此研究在光存在下进行。确切地说，1.25mM furimazine存在于50％乙醇和50％丙二醇的溶液(即，无ATT的溶液)或具有225mM ATT的50％乙醇和50％丙二醇的溶液(即，具有ATT的溶液)。将这两种溶液在-20℃、室温(RT，即20℃)、40℃或60℃下孵育并且在0天、1天、3天、7天、15天、30天以及90天进行分析。
在孵育后，采用高效液相色谱法(HPLC)鉴别对应溶液中每个时间点的组分。确切地说，使用Agilent 1100HPLC仪器并且将其装备有四元泵、恒温自动进样器和柱温箱，以及G1311B二极管阵列检测器。所使用的柱是Synergi-MAX-RP(Phenomenex,Torrance,California)
Figure BDA0001160026210000511
50x4.6 2.5μm。在HPLC上运行的梯度具有0.1％TFA水溶液和乙腈。在262纳米(nm)处测量吸光度。运行furimazine的标准物及其已知降解物，以确认保留时间和吸光度痕量。进样5μl每种溶液并且furimazine在室温下的保留时间为5.1分钟。
在以下表10和表11以及图4A和图4B中示出了HPLC分析的结果，其中这些值被报道为在262nm处的相对峰面积百分比(即，底物的λ最大值)。图4A示出了具有ATT的溶液随着时间(以天数计)变化的相对峰面积百分比，而图4B示出无ATT的溶液随着时间(以天数计)变化的相对峰面积百分比。在图4A和图4B的各图中，菱形分别是在-20℃下使用或未使用225mM ATT孵育的随着时间变化的1.25mM furimazine，三角形分别是在20℃下使用或未使用225mMATT孵育的随着时间变化的1.25mM furimazine，星形分别是在40℃下使用或未使用225mM ATT孵育的随着时间变化的1.25mMfurimazine，并且十字形分别是在60℃下使用或未使用225mM ATT孵育的随着时间变化的1.25mM furimazine。
Figure BDA0001160026210000531
Figure BDA0001160026210000541
由HPLC分析，计算得到的furimazine在ATT存在下在20℃、40℃和60℃下的半衰期分别是110天、20天和5天，而计算得到的furimazine在ATT不存在下在20℃、40℃和60℃下的半衰期分别是61天、8天和2.5天(参见以下表12)。
表12
Figure BDA0001160026210000551
另外，生成furimazine在ATT存在和不存在下的阿累乌尼斯图，以计算furimazine在不同温度下的半衰期。阿累乌尼斯等式如下：
Figure BDA0001160026210000552
转换的等式如下：
Figure BDA0001160026210000553
在图6中示出了furimazine在ATT存在下的阿累乌尼斯图。在图6中，斜率为-10831.4，截距为31.3561，并且R2为0.9813。
在图7中示出了furimazine在ATT不存在下的阿累乌尼斯图。在图7中，斜率为-10106.2，截距为30.1809，并且R2为0.9984。
另外，由阿累乌尼斯图计算的半衰期指示与ATT不存在相比，ATT的存在使得腔肠素在-75℃、-20℃、20℃、40℃，以及60℃下分别稳定11.82倍、5.42倍、3.66倍、3.14倍，以及2.44倍以防止分解(参见以上表12)。
总之，这些数据表明ATT稳定化furimazine以防止在不同温度下随着时间变化的分解，并且因此在溶液中包含ATT(其中furimazine可孵育或保存一段时间)可抑制或减少furimazine的分解(即，稳定化furimazine)。
实施例5
Furimazine的分解
如上所述的，ATT稳定化furimazine以防止在不同温度下随着时间的分解。为进一步评定furimazine的稳定化，在测定furimazine的以下分解产物在不同温度下随着时间变化的水平：氨基吡嗪和furimamide。此研究在光存在下进行。
确切地说，1.25mM furimazine存在于50％乙醇和50％丙二醇的溶液(即，无ATT的溶液)或具有225mM ATT的50％乙醇和50％丙二醇的溶液(即，具有ATT的溶液)。将这两种溶液在室温(RT)或40℃下孵育并且在8天、15天，以及30天进行分析。
在孵育后，采用高效液相色谱法(HPLC)鉴别对应溶液中每个时间点的组分。确切地说，使用Agilent 1100HPLC仪器并且将其装备有四元泵、恒温自动进样器和柱温箱，以及G1311B二极管阵列检测器。所使用的柱是Synergi-MAX-RP(Phenomenex,Torrance,California)
Figure BDA0001160026210000561
50x4.6 2.5μm。在HPLC上运行的梯度具有0.1％TFA水溶液和乙腈。在262纳米(nm)处测量吸光度。运行furimazine的标准物及其已知降解物，以确认保留时间和吸光度痕量。furimazine、furimamide和氨基吡嗪在室温下的保留时间分别为5.0分钟、6.7分钟和5.4分钟。
在以下表13和表14以及图5A、图5B、图5C，以及图5D中示出了HPLC分析的结果，其中这些值被报道为在262nm处的相对峰面积百分比(即，底物的λ最大值)。确切地说，图5A示出furimazine在ATT存在(灰色竖条)或不存在(黑色竖条)下在8天、15天和30天的相对面积百分比。也如以上实施例4所述的，这些数据表明在溶液中包含ATT稳定化的furimazine以防止分解。
图5B示出当furimazine处于ATT存在(黑色竖条)或不存在(灰色竖条)下时在室温下在15天后降解物氨基吡嗪和furiamide的相对面积百分比。图5C示出当furimazine处于ATT存在(黑色竖条)或不存在(灰色竖条)下时在40℃下在8天后降解物氨基吡嗪和furiamide的相对面积百分比。图5D示出当furimazine处于ATT存在(黑色竖条)或不存在(灰色竖条)下时在40℃下在30天后降解物氨基吡嗪和furiamide的相对面积百分比。总之，这些数据进一步证实ATT减少了降解物氨基吡嗪和furimamide的形成，从而稳定化furimamide以防止分解。
表13
Figure BDA0001160026210000571
表14
Figure BDA0001160026210000572
总之，这些数据进一步证实ATT稳定化furimazine以防止在不同温度下随着时间分解成降解物氨基吡嗪和furimamide。因此，在溶液中包含ATT(其中furimazine可孵育或保存一段时间)可抑制或减少furimazine分解成分解产物氨基吡嗪和furimamide(即，furimazine被稳定化)。
实施例6
Furimazine的光稳定化
如上所述的，ATT稳定化furimazine以防止在不同温度下随着时间的分解。因此，与ATT不存在相比，furimazine在ATT存在下具有更大热稳定性。在此，在室温和40℃下评估furimazine在ATT存在和不存在下的光稳定性。
确切地说，制备ATT于50％丙二醇:50％乙醇(v/v)的2x储备溶液，其中ATT的最终浓度为64.4mg/mL。还制备furimazine于50％丙二醇:50％乙醇(v/v)的2x储备溶液，其中furimazine的最终浓度为0.95mg/mL。在一个小瓶中，以2x furimazine储备溶液1:1稀释2xATT储备溶液，以形成含有225mM ATT和1.25mM furimazine的溶液中。在第二小瓶中，以50％丙二醇:50％乙醇(v/v)1:1稀释2x furimazine储备溶液，以形成无添加物ATT(即，“无添加物的furimazine”对照)且含有1.25mM furimazine的对照溶液。
将每个小瓶的内容物分配到单独的具有插入件的透明HPLC小瓶中并且将这些HPLC小瓶置于光存在(即，在顶置式荧光灯存在下)的室温下(即，约20℃)和在光中的40℃下。每个温度的每个时间点有一个HPLC小瓶。
通过用5μL进样进行HPLC并且在262nm下检测来测量稳定性。在每张色谱图中，确定furimazine峰面积。通过对面积(106)相对于时间(天)作图来生成稳定性曲线并且在图14A和图14B中分别示出室温和40℃的稳定性曲线。稳定化被表示为furimazine在ATT存在下降解10％和50％所用的时间(即，半衰期)的增加倍数(表15和表16)。图15示出furimazine在室温下在光中并且在ATT存在和不存在下的稳定性。图16示出furimazine在40℃下在光中并且在ATT存在和不存在下的稳定性。
表15
Figure BDA0001160026210000591
表16
Figure BDA0001160026210000592
总之，这些数据表明ATT稳定化的furimazine以防止在光存在下在不同温度下(例如，室温和40℃)的分解，并且因此在溶液中包含ATT(其中furimazine可孵育或保存一段时间)可抑制或减少furimazine由于光暴露而产生的分解(即，光降解)。因此，ATT稳定化furimazine以防止光降解和热降解。
实施例7
Furimazine的稳定性
如上所述的，ATT稳定化furimazine以防止在不同温度下且在光存在下随着时间的分解。为了进一步评估ATT对furimazine的稳定化，在一种不同溶剂即DMSO中测量furimazine在室温、40℃和60℃下的稳定性。此研究在光存在下进行。
确切地说，制备ATT于DMSO中的2x储备溶液，其中ATT的最终浓度为64.4mg/mL。还制备furimazine于DMSO中的2x储备溶液，其中furimazine的最终浓度为0.95mg/mL。在一个小瓶中，以2x furimazine储备溶液1:1稀释2x ATT储备溶液，以形成含有225mMATT和1.25mM furimazine的溶液中。在第二小瓶中，以DMSO 1:1稀释furimazine，以形成无添加物ATT(即，“无添加物的furimazine”对照)且含有1.25mM furimazine的对照溶液。
将每个小瓶的内容物分配到单独的具有插入件的透明HPLC小瓶中并且将这些HPLC小瓶置于室温(即，约20℃)、40℃和60℃下。每个温度的每个时间点有一个HPLC小瓶。
通过用5μL进样进行HPLC并且在262nm下检测来测量稳定性。在每张色谱图中，确定furimazine面积百分比。通过对面积百分比相对于时间(天)作图来生成稳定性曲线并且将这些稳定性曲线示出在图15中。这些数据表明ATT稳定化在DMSO中的furimazine以防止在不同温度(例如，室温、40℃和60℃)下的分解。
实施例8
Furimazine在37℃下的稳定性
如上所述的，ATT稳定化furimazine以防止在不同温度下且在光存在下随着时间的分解。为了进一步评估furimazine的稳定化，测量在37℃下在ATT和ATT类似物TAK-0014和TAK-0002存在或不存在下的荧光。
确切地说，制备furimazine于50％丙二醇:50％乙醇(v/v)中的储备溶液，其中通过吸光度获得的furimazine最终浓度为4.6mM。然后以50％丙二醇:50％乙醇(v/v)1:1稀释furimazine储备溶液，以形成无添加物ATT、TAK-0014和TAK-0002(即，“无添加物的furimazine”对照)且含有2.3mM furimazine的对照溶液。以50％丙二醇:50％乙醇(v/v)制备ATT、TAK-0014和TAK-0002的400mM储备溶液。然后以4.6mM furimazine储备溶液1:1稀释ATT、TAK-0014和TAK-0002各储备溶液，以产生含有200mM ATT、TAK-0014或TAK-0002，以及2.3mM furimazine的溶液。
将每种样品分到多个琥珀色管中并且在37℃下在黑暗孵育器中(即，在光不存在下)孵育。在不同时间点从每种样品中取出等分试样并且在-20℃下在黑暗(即，在光不存在下)中保存直到收集所有时间点为止。
为了测量等分试样中的荧光，以缓冲液(NANOGLO缓冲液，Promega Corporation)1:50稀释每个等分试样，以获得46μM furimazine。以缓冲液(NANOGLO缓冲液，PromegaCorporation)进一步1:10稀释这些稀释的等分试样，以获得4.6μM furimazine。将50μL各稀释液(即，两次稀释的(0.1)等分试样)与50μL CO2-独立性介质+10％牛胎儿血清(FBS)和0.4ng/mL发光酶(NANOLUC酶，Promega Corporation)混合。在光度计(GLOMAX Multi Plus光度计，Promega Corporation)上测量荧光。通过在0天时间点的相对光单位(RLU)值对每个时间点的RLU进行归一化。对于每种样品，将相对于0天时间点(即t＝0)的活性百分比相对于时间(天)作图，如图16A所示的。在图16A中，B-ATT表示TAK-0002并且E-ATT表示TAK-0014。
使用设置成一阶衰减函数的GraphPad Prism软件计算半衰期并且将其示出在表17和图16B中。表17示出由图16A所描绘的曲线计算的半衰期(即，0.1，它表示指定的两次稀释的等分试样的半衰期)。图17中的误差为通过回归计算获得的标准误差并且Fz表示furimazine，B-ATT表示TAK-0002，并且E-ATT表示TAK-0014。
图16B为针对样品中37℃下在数天内的半衰期作图的图，其中Fz表示furimazine，B-ATT表示TAK-0002，并且E-ATT表示TAK-0014。同样在图16B中，0.1表示两次稀释的等分试样的半衰期。
Figure BDA0001160026210000621
如先前的实施例所说明的，ATT稳定化furimazine以防止在不同温度下且在光存在下的分解。此实施例中的结果表明，当硫代核苷诸如ATT、TAK-0014和TAK-0002加入到含有furimazine的有机溶剂(例如，50％丙二醇:50％乙醇(v/v)时来自furimazine的荧光半衰期有所增加。此实施例中的结果还表明硫代核苷诸如ATT、TAK-0014和TAK-0002稳定化furimazine以防止在光不存在(即，在黑暗)下的分解。总之，这些结果表明硫代核苷稳定化furimazine以防止分解，从而允许来自furimazine的荧光半衰期增加。
实施例9
Furimazine在37℃下在不同有机溶剂中的稳定性
如上所述的，硫代核苷诸如ATT、TAK-0014和TAK-0002稳定化furimazine以防止在不同温度下、在光存在下和在光不存在下(即，在黑暗中)随着时间的分解。为了进一步评估furimazine在37℃下的稳定化，在furimazine于不同溶剂存在下孵育之后测量荧光，所述溶剂即50％(v/v)丙二醇(PG):50％(v/v)乙醇、60％(v/v)丙二(PG):40％(v/v)乙醇，以及15％(v/v)甘油:85％(v/v)乙醇。
确切地说，此研究所采用的材料示出在表18中。
表18
Figure BDA0001160026210000631
以以下溶液制备1.25mM furimazine储备液：a)50％丙二醇:50％乙醇、1.25mMfurimazine、250mM ATT；b)60％丙二醇:40％乙醇、1.25mM furimazine、300mM ATT；c)15％甘油:85％乙醇、1.25mM furimazine、250mM ATT；以及发明性furimazine(PromegaCorporation)。首先溶解Furimazine并且然后加入ATT。为制备4mL各样品，加入2mgfurimazine和143mg ATT(250mM ATT)。对于300mM ATT，加入171mg ATT。
将这些样品的一部分等分到具有O形环的琥珀色Starstead管中并且然后将这些管置于37℃下。在不同时间点取出样品并置于-20℃下并且然后同时测定。将其余样品置于-20℃的15mL管中并且监测沉淀形成。
在测定样品之前，将它们加热至室温(RT)并且涡旋以确保从溶液中析出的任何物质重新悬浮。将每个时间点的10μL每种样品加入490μL缓冲液(NANOGLO缓冲液，PromegaCorporation)中并且混合，以获得具有25μM furimazine的溶液。对于发明性furimazine，将5μl以995μl缓冲液(NANOGLO缓冲液，Promega Corporation)稀释，以获得具有25μMfurimazine的溶液。然后1:100稀释25μM溶液(5μl于495μl中)，以获得具有0.25μMfurimazine的溶液(0.25μM溶液)。将50μl荧光素酶(NANOLUC荧光素酶，PromegaCorporation)稀释到CO2-独立性介质+10％FBS和50μL每种0.25μM溶液中。将所得稀释液在RT下孵育3分钟，并且在光度计(GLOMAX Multi plus光度计，Promega Corporation)上检测荧光。为了评定样品中的自动荧光，将样品1:125稀释到CO2-独立性介质+10％FBS(1:500稀释发明性furimazine)，并且在光度计(GLOMAX Multi plus光度计，Promega Corporation)上检测荧光。
通过在0天时间点(t＝0)的相对光单位(RLU)值对每个时间点的RLU进行归一化。对于每种样品，将归一化的RLU相对于时间(天)作图，如图17所示的(0.25μM溶液。这些数据表明，对于每种有机溶剂，furimazin在ATT存在下比在ATT不存在下更稳定。Furmazine在具有ATT的有机溶剂15％甘油:85％乙醇中比在没有ATT的有机溶剂15％甘油:85％乙醇中更稳定。因此，这些结果连同以上实施例中的结果表明ATT稳定化furimazine以防止在不同稳定下、在光存在下，以及在有机溶剂诸如DMSO、50％(v/v)丙二醇:50％(v/v)乙醇，以及15％甘油(v/v):85％(v/v)乙醇中的分解。总之，这些结果表明硫代核苷(例如，ATT)稳定化furimazine以防止分解，从而允许来自furimazine的活性(即，荧光)增加。
6.条款
出于完成的原因，本发明的不同方面陈述在以下编号的条款中：
条款1.一种组合物，所述组合物包含(a)发光底物；(b)有效量的式(I)化合物或其互变异构体，
Figure BDA0001160026210000651
其中
R1为氢、烷基、取代的烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、环烷基、芳基、杂芳基、羧酸、酯、NRaRb、亚胺、羟基或氧基；
R2为氢、NRaRb、亚胺、烷基或芳基；
Ra和Rb各自独立地为氢、烷基或芳基；以及
(c)有机溶剂。
条款2.如条款1所述的组合物，其中所述组合物不包含发光酶。
条款3.如条款1所述的组合物，其中所述发光底物被稳定化来防止分解。
条款4.如条款3所述的组合物，其中与不包含所述式(I)化合物或其互变异构体的组合物相比，所述发光底物被稳定化来防止分解。
条款5.如条款3或4所述的组合物，其中所述发光底物被稳定化来防止在光存在下的分解。
条款6.如条款3或4所述的组合物，其中所述发光底物被稳定化来防止在光不存在下的分解。
条款7.如条款3或4所述的组合物，其中所述发光底物被稳定化来防止在-80℃至60℃温度下的分解。
条款8.如条款1所述的组合物，其中所述发光底物为腔肠素或其功能性类似物。
条款9.如条款8所述的组合物，其中所述腔肠素或其功能性类似物被稳定化来防止分解。
条款10.如条款9所述的组合物，其中所述腔肠素或其功能性类似物被稳定化来防止在光存在下的分解。
条款11.如条款10所述的组合物，其中与不包含所述式(I)化合物或其互变异构体的组合物相比，所述腔肠素或其功能性类似物被稳定化来防止在光存在下的分解。
条款12.如条款9所述的组合物，其中所述腔肠素或其功能性类似物被稳定化来防止在光不存在下的分解。
条款13.如条款12所述的组合物，其中与不包含所述式(I)化合物或其互变异构体的组合物相比，所述腔肠素或其功能性类似物被稳定化来防止在光不存在下的分解。
条款14.如条款9所述的组合物，其中所述腔肠素或其功能性类似物被稳定化来防止在-80℃至60℃温度下的分解。
条款15.如条款8所述的组合物，其中腔肠素的所述功能性类似物为furimazine。
条款16.如条款15所述的组合物，其中furimazine被稳定化来防止在光存在下的分解。
条款17.如条款16所述的组合物，其中与不包含所述式(I)化合物或其互变异构体的组合物相比，furimazine被稳定化来防止在光存在下的分解。
条款18.如条款15所述的组合物，其中furimazine被稳定化来防止在光不存在下的分解。
条款19.如条款18所述的组合物，其中与不包含所述式(I)化合物或其互变异构体的组合物相比，furimazine被稳定化来防止在光不存在下的分解。
条款20.如条款1所述的组合物，其中所述式(I)化合物的所述有效量大于0.1mM。
条款21.如条款20所述的组合物，其中所述式(I)化合物的所述有效量大于1mM。
条款22.如条款1所述的组合物，其中所述式(I)化合物选自由以下组成的组：ATT、ATCA、3-(4-氨基-5-氧基-3-硫代氧基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-基)丙酸、四氢-2-甲基-3-硫代氧基-1,2,4-三嗪-5,6-二酮、4-((2-呋喃基亚甲基)氨基)-3-巯基-6-甲基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮、6-苯甲基-3-磺酰基-1,2,4-三嗪-5-醇、4-氨基-3-巯基-6-甲基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮、3-(5-氧基-3-硫代氧基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-基)丙酸、(E)-6-甲基-4-((噻吩-2-基亚甲基)氨基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、(E)-6-甲基-4-((3-硝基苯亚甲基)氨基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、(E)-4-((4-(二乙基氨基)苯亚甲基)氨基)-6-甲基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、ATCA乙酯、TAK-0014、TAK-0002、TAK-0021、TAK-0020、TAK-0018、TAK-0009、TAK-0007、TAK-0008、TAK-0003、TAK-0004、3-硫代氧基-6-(三氟甲基)-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、6-环丙基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮，以及6-(羟基甲基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮。
条款23.如条款22所述的组合物，其中所述式(I)化合物为ATT并且ATT的所述有效量大于32mM。
条款24.如条款23所述的组合物，其中ATT的所述有效量为225mM。
条款25.如条款1所述的组合物，其中所述有机溶剂选自由以下组成的组：醇、丙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、甘油，以及其任何组合。
条款26.如条款25所述的组合物，其中所述有机溶剂为乙醇和丙二醇的组合。
条款27.如条款25所述的组合物，其中所述有机溶剂为乙醇和甘油的组合。
条款28.一种用于稳定化发光底物的方法，所述方法包括使所述发光底物在有机溶剂存在下与有效量的式(I)化合物或其互变异构体接触，从而使所述发光底物稳定以防止分解，
其中所述式(I)化合物为
Figure BDA0001160026210000691
其中
R1为氢、烷基、取代的烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、环烷基、芳基、杂芳基、羧酸、酯、NRaRb、亚胺、羟基或氧基；
R2为氢、NRaRb、亚胺、烷基或芳基；并且
Ra和Rb各自独立地为氢、烷基或芳基。
条款29.如条款28所述的方法，其中所述式(I)化合物的所述有效量大于0.1mM。
条款30.如条款29所述的方法，其中所述式(I)化合物的所述有效量大于1mM。
条款31.如条款28所述的方法，其中所述式(I)化合物选自由以下组成的组：ATT、ATCA、3-(4-氨基-5-氧基-3-硫代氧基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-基)丙酸、四氢-2-甲基-3-硫代氧基-1,2,4-三嗪-5,6-二酮、4-((2-呋喃基亚甲基)氨基)-3-巯基-6-甲基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮、6-苯甲基-3-磺酰基-1,2,4-三嗪-5-醇、4-氨基-3-巯基-6-甲基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮、3-(5-氧基-3-硫代氧基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-基)丙酸、(E)-6-甲基-4-((噻吩-2-基亚甲基)氨基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、(E)-6-甲基-4-((3-硝基苯亚甲基)氨基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、(E)-4-((4-(二乙基氨基)苯亚甲基)氨基)-6-甲基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、ATCA乙酯、TAK-0014、TAK-0002、TAK-0021、TAK-0020、TAK-0018、TAK-0009、TAK-0007、TAK-0008、TAK-0003、TAK-0004、3-硫代氧基-6-(三氟甲基)-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、6-环丙基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮，以及6-(羟基甲基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮。
条款32.如条款31所述的方法，其中所述式(I)化合物为ATT并且所述ATT的所述有效量大于32mM。
条款33.如条款32所述的方法，其中所述ATT的所述有效量为225mM。
条款34.如条款28所述的方法，其中所述发光底物被稳定化来防止在光存在下的分解。
条款35.如条款28所述的方法，其中所述发光底物被稳定化来防止在光不存在下的分解。
条款36.如条款28所述的方法，其中所述发光底物被稳定化来防止在-80℃至60℃温度下的分解。
条款37.如条款28所述的方法，其中所述发光底物为腔肠素或其功能性类似物。
条款38.如条款37所述的方法，其中腔肠素的所述功能性类似物为furimazine。
条款39.如条款38所述的方法，其中furimazine被稳定化来防止在光存在下的分解。
条款40.如条款38所述的方法，其中furimazine被稳定化来防止在光不存在下的分解。
条款41.如条款28所述的方法，其中所述有机溶剂选自由以下组成的组：醇、丙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、甘油，以及其任何组合。
条款42.如条款41所述的方法，其中所述有机溶剂为乙醇和丙二醇的组合。
条款43.如条款41所述的方法，其中所述有机溶剂为乙醇和甘油的组合。
条款44.一种包含在单一容器中的如条款1所述的组合物的试剂盒，其中所述式(I)化合物稳定化所述发光底物。
条款45.如条款44所述的试剂盒，其中所述发光底物为腔肠素或其功能性类似物。
条款46.如条款45所述的试剂盒，其中腔肠素的所述功能性类似物为furimazine。
条款47.如条款44所述的试剂盒，其中所述式(I)化合物的所述有效量大于0.1mM。
条款48.如条款47所述的试剂盒，其中所述式(I)化合物的所述有效量大于1mM。
条款49.如条款44所述的试剂盒，其中所述式(I)化合物选自由以下组成的组：ATT、ATCA、3-(4-氨基-5-氧基-3-硫代氧基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-基)丙酸、四氢-2-甲基-3-硫代氧基-1,2,4-三嗪-5,6-二酮、4-((2-呋喃基亚甲基)氨基)-3-巯基-6-甲基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮、6-苯甲基-3-磺酰基-1,2,4-三嗪-5-醇、4-氨基-3-巯基-6-甲基-1,2,4-三嗪-5(4H)-酮、3-(5-氧基-3-硫代氧基-2,3,4,5-四氢-1,2,4-三嗪-6-基)丙酸、(E)-6-甲基-4-((噻吩-2-基亚甲基)氨基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、(E)-6-甲基-4-((3-硝基苯亚甲基)氨基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、(E)-4-((4-(二乙基氨基)苯亚甲基)氨基)-6-甲基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、ATCA乙酯、TAK-0014、TAK-0002、TAK-0021、TAK-0020、TAK-0018、TAK-0009、TAK-0007、TAK-0008、TAK-0003、TAK-0004、3-硫代氧基-6-(三氟甲基)-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮、6-环丙基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮，以及6-(羟基甲基)-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮。
条款50.如条款49所述的试剂盒，其中所述式(I)化合物为ATT并且ATT的所述有效量大于32mM。
条款51.如条款50所述的试剂盒，其中ATT的所述有效量为225mM。
条款52.如条款44所述的试剂盒，其中所述有机溶剂选自由以下组成的组：醇、丙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、甘油，以及其任何组合。
条款53.如条款52所述的试剂盒，其中所述有机溶剂为乙醇和丙二醇的组合。
条款54.如条款53所述的试剂盒，其中所述有机溶剂为乙醇和丙二醇的组合。
应理解，上述详细说明和所附实施例仅为说明性并且不应被理解为对本发明的范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求书及其等效物所限定。
对于所公开实施方案的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。可对本发明此进行类改变和修改而不背离本发明的精神和范围，所述改变和修改包括但不限于与化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂、或使用方法。

Claims (45)

1.一种组合物，其包含
(a)发光底物；
(b)有效量的式(I)化合物或其互变异构体，
Figure FDA0003066296800000011
其中，
R1为C1-C4烷基、C1-C4烷基-芳基或C3-C10环烷基；
R2为氢；
其中，在每种情况下，芳基是苯基；以及
(c)有机溶剂；
所述发光底物为腔肠素、腔肠素-h、腔肠素-h-h或furimazine；
其中，
腔肠素-h-h具有以下结构：
Figure FDA0003066296800000021
furimazine具有以下结构：
Figure FDA0003066296800000022
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物不包含发光酶。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述发光底物被稳定化来防止分解。
4.如权利要求3所述的组合物，其中与不包含所述式(I)化合物或其互变异构体的组合物相比，所述发光底物被稳定化来防止分解。
5.如权利要求3或4所述的组合物，其中所述发光底物被稳定化来防止在光存在下的分解。
6.如权利要求3或4所述的组合物，其中所述发光底物被稳定化来防止在光不存在下的分解。
7.如权利要求3或4所述的组合物，其中所述发光底物被稳定化来防止在-80℃至60℃温度下的分解。
8.如权利要求1所述的组合物，其中所述发光底物为furimazine。
9.如权利要求8所述的组合物，其中furimazine被稳定化来防止在光存在下的分解。
10.如权利要求9所述的组合物，其中与不包含所述式(I)化合物或其互变异构体的组合物相比，furimazine被稳定化来防止在光存在下的分解。
11.如权利要求8所述的组合物，其中furimazine被稳定化来防止在光不存在下的分解。
12.如权利要求11所述的组合物，其中与不包含所述式(I)化合物或其互变异构体的组合物相比，furimazine被稳定化来防止在光不存在下的分解。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述式(I)化合物的所述有效量大于0.1mM。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述式(I)化合物的所述有效量大于1mM。
15.如权利要求1所述的组合物，其中所述式(I)化合物选自由以下组成的组：ATT、TAK-0014、TAK-0002、TAK-0021、TAK-0020、TAK-0018、TAK-0009、TAK-0007和6-环丙基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮；
其中，
ATT具有以下结构：
Figure FDA0003066296800000041
TAK-0014具有以下结构：
Figure 52716DEST_PATH_IMAGE001
TAK-0002具有以下结构：
Figure FDA0003066296800000043
TAK-0021具有以下结构：
Figure 867088DEST_PATH_IMAGE002
TAK-0020具有以下结构：
Figure 689550DEST_PATH_IMAGE003
TAK-0018具有以下结构：
Figure 346797DEST_PATH_IMAGE004
TAK-0009具有以下结构：
Figure 545697DEST_PATH_IMAGE005
TAK-0007具有以下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述式(I)化合物为ATT并且其中ATT的所述有效量大于32mM。
17.如权利要求16所述的组合物，其中ATT的所述有效量为225mM。
18.如权利要求1所述的组合物，其中所述有机溶剂选自由以下组成的组：醇、丙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、甘油，以及其任何组合。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述有机溶剂为乙醇和丙二醇的组合。
20.如权利要求18所述的组合物，其中所述有机溶剂为乙醇和甘油的组合。
21.一种用于稳定化发光底物的方法，所述方法包括使所述发光底物在有机溶剂存在下与有效量的式(I)化合物或其互变异构体接触，从而使所述发光底物稳定以防止分解，
其中所述式(I)化合物为
Figure FDA0003066296800000061
其中，
R1为C1-C4烷基、C1-C4烷基-芳基或C3-C10环烷基；
R2为氢；
其中，在每种情况下，芳基是苯基；
所述发光底物为腔肠素、腔肠素-h、腔肠素-h-h或furimazine；
其中，
腔肠素-h-h具有以下结构：
Figure FDA0003066296800000071
furimazine具有以下结构：
Figure FDA0003066296800000072
22.如权利要求21所述的方法，其中所述式(I)化合物的所述有效量大于0.1mM。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述式(I)化合物的所述有效量大于1mM。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述式(I)化合物选自由以下组成的组：ATT、TAK-0014、TAK-0002、TAK-0021、TAK-0020、TAK-0018、TAK-0009、TAK-0007和6-环丙基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮；
其中，
ATT具有以下结构：
Figure FDA0003066296800000081
TAK-0014具有以下结构：
Figure 214575DEST_PATH_IMAGE006
TAK-0002具有以下结构：
Figure FDA0003066296800000091
TAK-0021具有以下结构：
Figure 207939DEST_PATH_IMAGE007
TAK-0020具有以下结构：
Figure 962269DEST_PATH_IMAGE008
TAK-0018具有以下结构：
Figure 433701DEST_PATH_IMAGE009
TAK-0009具有以下结构：
Figure 957087DEST_PATH_IMAGE010
TAK-0007具有以下结构：
Figure 386931DEST_PATH_IMAGE011
25.如权利要求24所述的方法，其中所述式(I)化合物为ATT并且所述ATT的所述有效量大于32mM。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述ATT的所述有效量为225mM。
27.如权利要求21所述的方法，其中所述发光底物被稳定化来防止在光存在下的分解。
28.如权利要求21所述的方法，其中所述发光底物被稳定化来防止在光不存在下的分解。
29.如权利要求21所述的方法，其中所述发光底物被稳定化来防止在-80℃至60℃温度下的分解。
30.如权利要求21所述的方法，其中所述发光底物为furimazine。
31.如权利要求30所述的方法，其中furimazine被稳定化来防止在光存在下的分解。
32.如权利要求30所述的方法，其中furimazine被稳定化来防止在光不存在下的分解。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述有机溶剂选自由以下组成的组：醇、丙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、甘油，以及其任何组合。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述有机溶剂为乙醇和丙二醇的组合。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述有机溶剂为乙醇和甘油的组合。
36.一种包含在单一容器中的如权利要求1所述的组合物的试剂盒，其中所述式(I)化合物稳定化所述发光底物。
37.如权利要求36所述的试剂盒，其中所述发光底物为furimazine。
38.如权利要求36所述的试剂盒，其中所述式(I)化合物的所述有效量大于0.1mM。
39.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述式(I)化合物的所述有效量大于1mM。
40.如权利要求36所述的试剂盒，其中所述式(I)化合物选自由以下组成的组：ATT、TAK-0014、TAK-0002、TAK-0021、TAK-0020、TAK-0018、TAK-0009、TAK-0007和6-环丙基-3-硫代氧基-3,4-二氢-1,2,4-三嗪-5(2H)-酮；
其中，
ATT具有以下结构：
Figure FDA0003066296800000121
TAK-0014具有以下结构：
Figure 628556DEST_PATH_IMAGE001
TAK-0002具有以下结构：
Figure FDA0003066296800000123
TAK-0021具有以下结构：
Figure 903680DEST_PATH_IMAGE012
TAK-0020具有以下结构：
Figure 235566DEST_PATH_IMAGE013
TAK-0018具有以下结构：
Figure 570733DEST_PATH_IMAGE004
TAK-0009具有以下结构：
Figure 299654DEST_PATH_IMAGE014
TAK-0007具有以下结构：
Figure 378469DEST_PATH_IMAGE015
41.如权利要求40所述的试剂盒，其中所述式(I)化合物为ATT并且ATT的所述有效量大于32mM。
42.如权利要求41所述的试剂盒，其中ATT的所述有效量为225mM。
43.如权利要求36所述的试剂盒，其中所述有机溶剂选自由以下组成的组：醇、丙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、甘油，以及其任何组合。
44.如权利要求43所述的试剂盒，其中所述有机溶剂为乙醇和丙二醇的组合。
45.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述有机溶剂为乙醇和丙二醇的组合。
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