KR102451254B1

KR102451254B1 - 코로나바이러스 감염증의 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102451254B1
Application number: KR1020210160912A
Authority: KR
Inventors: 김성훈; 김미란; 김석형; 이영태
Original assignee: 한림제약(주)
Priority date: 2021-11-22
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2022-10-06

Abstract

본 발명은 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 천문동(Asparagi Tuber), 오미자(Schisandrae Fructus), 목단피(Moutan Radicis Cortex), 황금(Scutellariae Radix), 행인(Armeniacae Semen), 및 백부근(Stemonae Radix)을 포함하는 혼합 생약의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 코로나바이러스 감염증의 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

Description

코로나바이러스 감염증의 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical compositions for preventing, alleviating or treating coronavirus infection}

본 발명은 코로나바이러스 감염증의 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 특정 혼합 생약의 추출물, 즉 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 천문동(Asparagi Tuber), 오미자(Schisandrae Fructus), 목단피(Moutan Radicis Cortex), 황금(Scutellariae Radix), 행인(Armeniacae Semen), 및 백부근(Stemonae Radix)을 포함하는 혼합 생약의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 코로나바이러스 감염증의 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

코로나바이러스 감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)는 SARS-CoV-2로 인해 발생하는 감염 질환으로, 2019년 중국 후베이성의 우한시에서 처음 발생한 이후 중국 전역과 전 세계로 확산된 새로운 유형의 코로나바이러스(SARS-CoV-2; Coronaviridae에 속하는 RNA 바이러스)에 의한 호흡기 감염질환이다. 코로나바이러스는 포유류와 조류에서 호흡기질환, 소화기 질환, 간질환, 뇌질환 등을 일으킨다. 코로나바이러스는 숙주 범위가 넓은 RNA로 이루어진 바이러스로 크기가 약 26-32 킬로베이스(kb)로 현존하는 RNA 바이러스 중에서 가장 큰 것으로 알려져 있으며, 알파, 베타, 델타, 감마의 4군으로 세분화되어 있고, 이들 변이 바이러스들은 전염성과 병독성이 높다고 알려져 있다(Signal Transduct Target Ther. 2020;5:89105).

SARS-CoV-2는 바이러스 표면에 존재하는 스파이크 단백질이 숙주세포의 안지오텐신 변환 효소 2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)에 결합하면서 세포 내부로 침입한다. 바이러스가 세포내로 들어오면 게놈 RNA(genomic RNA)는 두 개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF1a와 ORF1b)으로부터 비구조적 단백질(nonstructural proteins, nsps)을 생산하기 위해 번역이 이루어진다. ORF1a는 11개의 nsp들을 생산하고, ORF1b는 15개의 nsp들을 생산한다. 바이러스 게놈은 바이러스 복제와 전사를 위해 사용되며, 이는 RNA 의존성 RNA 중합효소(RNA dependent-RNA polymerase, RdRp)에 의해서 이루어지게 된다. 음성 가닥 RNA(negative sense RNA)는 양성 가닥 RNA(positive-sense genomic RNA, gRNA)를 합성하거나 subgenomic RNA(sgRNA)를 생산하기 위해 사용된다. gRNA는 구조 단백질(structural proteins)들에 의해 둘러싸여 또다른 바이러스 입자를 생성한다. sgRNA는 스파이크 단백질(spike protein, S), 외피단백질(envelope protein, E), 막단백질(membrane protein, M), 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein, N), 다수의 악세서리 단백질(3a, 6, 7a, 7b, 8, 그리고 10)을 생산한다(Cell 2020; 181: 914-921).

SARS-CoV-2는 COVID-19 감염자가 내뿜는 비말을 통해 전파되어 호흡기 점막세포에 침입하여 호흡기 내부에 염증을 일으키고, 인후통, 고열, 기침, 호흡곤란 등의 증상을 거쳐 폐렴을 유발하게 된다. COVID-19가 전세계적으로 확산하자 세계보건기구(WHO)는 2020년 3월 11일에 이 질환에 대해 범유행(팬데믹)을 선언하였고, 2021년 10월 기준 전 세계적으로 COVID-19 환자수 약 243억명, 사망자수 약 494만명에 달하여 COVID-19의 확산세는 지속되고 있어, COVID-19를 치료 또는 예방할 수 있는 치료제 또는 백신의 개발이 시급한 실정이다.

대한민국 특허등록 제10-1018866호는 숙지황, 천문동, 오미자, 목단피, 황금, 행인, 백부근의 7종 복합 생약 분말을 용매로 추출하여 제조된 추출물을 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환 예방 및 치료용 조성물을 개시한 바 있다. 또한, 선행문헌은 숙지황 등을 포함한 7가지 생약 조성물이 기관지염 동물모델에서 기관지 폐포내 대식세포, 림프구, 그리고 호중구의 수를 감소시키고, 염증전구물질인 TNF-α, IL-6의 사이토카인을 감소시키며, 조직상에서의 폐기종을 감소시킴으로써 만성폐쇄성 폐질환 예방 효과가 있음을 개시한 바 있다(Evid Based Complement Alternat Med. 2012;2012:769830, BMC Complement Altern Med. 2013; 13: 219.). 또한, 대한민국 특허등록 제10-1809848호는 숙지황, 천문동, 오미자, 목단피, 황금, 행인, 및 백부근으로 이루어진 혼합 생약의 추출물을 포함하는 방사선 유도성 폐섬유화증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개시한 바 있다.

본 발명자들은 숙지황, 천문동, 오미자, 목단피, 황금, 행인, 및 백부근을 포함하는 혼합 생약의 추출물이 코로나바이러스에 의한 세포병변을 억제할 뿐만 아니라, 코로나바이러스 특히 SARS-CoV-2에 감염된 폐 조직에서 바이러스의 복제를 효과적으로 억제한다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 숙지황, 천문동, 오미자, 목단피, 황금, 행인, 및 백부근으로 이루어진 혼합 생약의 추출물을 유효성분으로 포함하는 코로나바이러스 감염증의 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 천문동(Asparagi Tuber), 오미자(Schisandrae Fructus), 목단피(Moutan Radicis Cortex), 황금(Scutellariae Radix), 행인(Armeniacae Semen), 및 백부근(Stemonae Radix)을 포함하는 혼합 생약의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 코로나바이러스 감염증의 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 코로나바이러스 감염증은 중증급성호흡기증후군 코로나-19 바이러스(SARS-CoV-2)의 감염에 의한 코로나바이러스 감염증(COVID-19)일 수 있다.

상기 혼합 생약은, 백부근(Stemonae Radix) 1 중량부에 대하여, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 3∼6 중량부, 천문동(Asparagi Tuber) 1.5∼2.5 중량부, 오미자(Schisandrae Fructus) 1.5∼2.5 중량부, 목단피(Moutan Radicis Cortex) 1.5∼2.5 중량부, 황금(Scutellariae Radix) 1∼2 중량부, 및 행인(Armeniacae Semen) 1∼2 중량부의 비율로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 백부근(Stemonae Radix) 1 중량부에 대하여, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 약 4 중량부, 천문동(Asparagi Tuber) 약 2 중량부, 오미자(Schisandrae Fructus) 약 2 중량부, 목단피(Moutan Radicis Cortex) 약 2 중량부, 황금(Scutellariae Radix) 약 1.5 중량부, 및 행인(Armeniacae Semen) 약 1.5 중량부의 비율로 포함할 수 있다.

상기 혼합 생약의 추출물은 상기 혼합 생약의 열수 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 상기 혼합 생약을 90∼100℃에서 3∼6시간 동안 물을 사용하여 추출하여 얻어질 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 경구 투여용 제형으로 제제화된 것일 수 있다.

숙지황, 천문동, 오미자, 목단피, 황금, 행인, 및 백부근을 포함하는 혼합 생약의 추출물이 코로나바이러스에 의한 세포병변을 억제할 뿐만 아니라, 코로나바이러스 특히 SARS-CoV-2에 감염된 폐 조직에서 바이러스의 복제를 효과적으로 억제한다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 코로나바이러스 감염증의 예방, 경감 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다. 특히, 본 발명의 약학 조성물은, 포유동물에서 호흡기 질환, 소화기 질환, 간질환, 뇌질환 등을 일으키는 코로나-19 바이러스 감염에 의한 질환의 예방, 경감 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 SARS-CoV-2에 감염된 햄스터에서 본 발명의 혼합 생약 추출물의 체중감소 억제 활성을 평가하여 얻어진 결과를 나타낸다.
도 2는 SARS-CoV-2에 감염된 햄스터의 폐 조직에서 본 발명의 혼합 생약 추출물의 바이러스 복제 억제 활성을 평가하여 얻어진 결과를 나타낸다.
도 3은 SARS-CoV-2에 감염된 햄스터의 폐 조직에서 본 발명의 혼합 생약 추출물의 조직병변 개선 활성을 평가하여 얻어진 결과를 나타낸다.
도 4는 SARS-CoV-2에 감염된 햄스터의 폐 조직에서 본 발명의 혼합 생약 추출물의 항염증 활성을 평가하여 얻어진 결과를 나타낸다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 포함되는 상기 혼합 생약의 추출물은 Vero 세포에서 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스 감염에 대한 세포병변을 유의성 있게 억제한다. 또한, 상기 혼합 생약의 추출물은 SARS-CoV-2 감염 햄스터 모델에서 SARS-CoV-2의 바이러스 복제 억제력 나타내며, 바이러스 감염동물의 체중 감소를 억제한다. 또한, 상기 혼합 생약의 추출물은 SARS-CoV-2에 감염된 햄스터의 폐 조직의 병변을 경감시키며, 염증성 사이토카인 IL-6의 양도 감소시킨다. 따라서, 상기 혼합 생약의 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 약학 조성물은 SARS-CoV-2 등의 코로나바이러스의 증식(복제)을 억제함으로써, SARS-CoV-2 등의 코로나바이러스 감염에 의한 감염증의 예방, 경감 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 코로나바이러스 감염증은 돼지 전염성 위장염 바이러스(TGEV, transmissble gastroenteritis virus), 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV, porcine epidemic diarrhea virus), 개 코로나바이러스(canine coronavirus), 소 코로나바이러스(bovine Coronavirus), 사스 코로나바이러스(SARS-CoV), 코로나-19 바이러스(SARS-CoV-2) 등의 다양한 코로나바이러스의 감염에 의한 감염증을 포함한다. 바람직하게는, 상기 코로나바이러스 감염증은 중증급성호흡기증후군 코로나-19 바이러스(SARS-CoV-2)의 감염에 의한 코로나바이러스 감염증(COVID-19)일 수 있다. 중증급성호흡기증후군 코로나-19 바이러스(SARS-CoV-2)는 다양한 변이 바이러스, 예를 들어 알파-, 베타-, 감마-, 델타-중증급성호흡기증후군 코로나-19 바이러스 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 혼합 생약에 포함되는 생약은 각각 다양한 기원의 식물로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata)은 지황(Rehmannia glutinosa Liboschitz ex Steudel) 등의 현삼과(Scrophulariaceae) 식물의 뿌리 부위일 수 있다. 상기 천문동(Asparagi Tuber)은 천문동(Asparagus cochinchinensis Merrill) 등의 백합과(Liliaceae) 식물의 덩이뿌리 부위일 수 있으며, 통상 뜨거운 물로 삶거나 찐 뒤에 겉껍질을 제거하고 말린 것일 수 있다. 상기 오미자(Schisandrae Fructus)는 오미자(Schisandra chinensis Baillon) 등의 오미자과(Schisandraceae)의 열매 부위일 수 있다. 상기 목단피(Moutan Radicis Cortex)는 목단(Paeonia suffruticosa Andrews) 등의 작약과(Paeoniaceae) 식물의 뿌리껍질 부위일 수 있다. 상기 황금(Scutellariae Radix)은 속썩은풀(Scutellaria baicalensis Georgi) 등의 꿀풀과(Labiatae) 식물의 뿌리 부위일 수 있다. 상기 행인(Armeniacae Semen)은 살구나무(Prunus armeniaca Linne var. ansu Maximowicz), 개살구나무(Prunus mandshurica Koehne var. glabra Nakai), 시베리아살구(Prunus sibirica Linne), 아르메니아살구(Prunus armeniaca Linne) 등의 장미과(Rosaceae) 식물의 씨 부위일 수 있다. 상기 백부근(Stemonae Radix)은 만생백부(Stemona japonica Miquel), 직립백부(Stemona sessilifolia (Miq.) Miq.), 대엽백부(Stemona tuberosa Lour.) 등의 백부과(Stemonaceae) 식물의 덩이뿌리 부위일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 혼합 생약은, 백부근(Stemonae Radix) 1 중량부에 대하여, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 3∼6 중량부, 천문동(Asparagi Tuber) 1.5∼2.5 중량부, 오미자(Schisandrae Fructus) 1.5∼2.5 중량부, 목단피(Moutan Radicis Cortex) 1.5∼2.5 중량부, 황금(Scutellariae Radix) 1∼2 중량부, 및 행인(Armeniacae Semen) 1∼2 중량부의 비율로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 혼합 생약은, 백부근(Stemonae Radix) 1 중량부에 대하여, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 약 4 중량부, 천문동(Asparagi Tuber) 약 2 중량부, 오미자(Schisandrae Fructus) 약 2 중량부, 목단피(Moutan Radicis Cortex) 약 2 중량부, 황금(Scutellariae Radix) 약 1.5 중량부, 및 행인(Armeniacae Semen) 약 1.5 중량부의 비율로 포함할 수 있다.

상기 혼합 생약의 추출물은 물 또는 에탄올 수용액(예를 들어, 50∼90%, 바람직하게는 약 70% 에탄올 수용액) 등을 추출용매로 사용하여 통상의 방법에 따라 추출함으로써 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 혼합 생약의 추출물은 상기 혼합 생약의 열수 추출물일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 열수 추출물은 상기 혼합 생약을 90∼100℃에서 3∼6시간 동안 물을 사용하여 추출하여 얻어질 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제 또는 시럽제와 같은 경구용 제제; 또는 외용 액제, 외용 현탁제, 외용 에멀젼, 겔제(연고제 등), 흡입제, 분무제, 주사제 등의 비경구 투여용 제제로 제제화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있으며, 단회 투여형 또는 수회 투여형 제형(dosage form)로 제제화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제; 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 등의 활택제; 유화제; 현탁화제; 안정화제; 및 등장화제 등의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 필요할 경우, 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서 유효성분으로 포함되는 상기 혼합 생약의 추출물은 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amounts)으로 투여될 수 있으며, 이는 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어, 환자의 연령, 체중, 감수성, 및 증상에 따라 변경될 수 있으나, 코로나바이러스 감염증을 앓고 있는 환자에게 1일당 약 600 mg 내지 약 3600 mg의 용량으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 단위 제제당 상기 혼합 생약의 추출물을 300 내지 600 mg의 양으로 함유하도록 제제화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 혼합 생약 추출물의 제조

숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 496 g, 천문동(Asparagi Tuber) 248 g, 오미자(Schisandrae Fructus) 248 g, 목단피(Moutan Radicis Cortex) 248 g, 황금(Scutellariae Radix) 186 g, 행인(Armeniacae Semen) 186 g, 및 백부근(Stemonae Radix) 124 g의 혼합물에 정제수 17360 g을 넣고, 약 90-100℃에서 열수 추출한 다음, 마이크로 필터(약 50 ㎛ sieve)를 이용하여 여과하였다. 얻어진 여액을 약 60℃에서 진공 농축한 후, 건조하여 혼합 생약 추출물을 제조하였다.

시험예 1. 혼합 생약 추출물의 세포병변 억제 활성 측정

실시예 1에서 제조한 혼합 생약 추출물(이하, '혼합 생약 추출물'이라 칭한다)의 농도에 따른 Vero 세포(CCL-81, ATCC, USA)의 생존율을 세포독성 확인시험을 통하여 평가하였다. 또한, 혼합 생약 추출물이 SARS-CoV-2에 미치는 영향을 평가하기 위하여 바이러스가 감염된 Vero 세포의 생존율 및 세포 병변 억제 효과(cytopathic effect, CPE)를 확인하였다.

(1) 세포독성 확인 시험

Vero 세포(CCL-81, ATCC, USA)를 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배양액에 부유한 후, 96-웰 플레이트(well-plate)에 8×10³ cells/well의 밀도로 분주하였다. 세포는 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하여 시험 당일 약 80% 정도 밀도에 도달하도록 하였다. 멸균 증류수에 용해한 혼합 생약 추출물을 배양액으로 최고농도 10000 μg/mL부터 최저농도 78 μg/mL까지 2배수로 희석하였다. 이때, 양성 대조물질로 SARS-CoV-2에 대해 치료 활성이 있다고 알려진 하이드록시클로로퀸 황산염(Hydrochloroquine sulfate)을 최고농도 20 μg/mL부터 2배수씩 배양액으로 희석하여 양성 대조군으로 하였다. Vero 세포가 배양된 96-웰 플레이트의 배양액을 제거한 후, 희석한 혼합 생약 추출물과 하이드록시클로로퀸 황산염을 각 희석 배수별로 웰 당 100 μL씩 첨가하고 12시간 동안 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이후 상등액을 제거하고, 모든 웰에 배양액 100μL와 CCK-8(Cell Counting Kit-8, Abcam) 용액 10 μL씩 첨가한 후 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 2시간 배양하고 450nm 파장에서 마이크로-플레이트기로 흡광도를 측정하였다. 위 시험은 3회 반복하여 세포독성이 없는 최대 농도를 확인하였다.

Vero 세포를 이용한 세포독성 시험에서 세포 생존율 90% 이상인 경우 세포독성이 없는 것으로 판단하였다. 표 1의 결과로부터, 혼합 생약 추출물은 625 μg/mL 이하의 농도 구간에서 90% 이상의 세포 생존율이 관찰되어 세포독성이 없음을 확인할 수 있다. 표 2의 결과로부터, 양성 대조물질 하이드록시클로로퀸 황산염은 5 μg/mL의 이하 농도 구간에서 90% 이상의 세포 생존율이 관찰되어 세포독성이 없음을 확인할 수 있다.

혼합 생약 추출물	세포 생존율 (%)
	처리 농도 (μg/mL)
	10000	5000	2500	1250	625	313	156	78
1	30.72	43.57	65.33	81.53	96.16	100.82	106.02	98.08
2	25.51	52.97	68.97	87.68	107.60	102.70	104.89	103.17
3	30.93	50.68	57.87	93.35	107.27	106.38	105.07	103.50
평균값	29.05	49.07	64.06	87.52	103.68	103.30	105.33	101.58
표준오차	1.77	2.83	3.27	3.41	3.76	1.63	0.35	1.75
시험 횟수	3	3	3	3	3	3	3	3

하이드록시클로로퀸 황산염	세포 생존율 (%)
	처리 농도 (μg/mL)
	20.00	10.00	5.00	2.50	1.25	0.63	0.31	0.16
1	66.01	80.88	88.70	86.26	94.50	101.53	102.15	99.65
2	72.56	82.53	99.85	92.29	109.15	102.45	102.68	108.92
3	60.23	84.31	91.26	92.44	93.64	103.73	104.99	100.66
평균값	66.27	82.57	93.27	90.33	99.10	102.57	103.27	103.08
표준오차	3.56	0.99	3.37	2.04	5.03	0.64	0.87	2.94
시험 횟수	3	3	3	3	3	3	3	3

(2) 세포 병변 억제 효과 확인

Vero 세포(CCL-81, ATCC, USA)를 10% FBS를 함유하는 DMEM 배양액에 부유한 후, 96-웰 플레이트(well-plate)에 8×10³ cells/well의 밀도로 분주하였다. 세포는 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하여 시험 당일 약 80% 정도 밀도에 도달하도록 하였다. 96-웰 플레이트에 혼합 생약 추출물 10000 μg/mL 및 양성 대조물질인 하이드록시클로로퀸 황산염 20 μg/mL을 2배수씩 희석하여 각 물질 당 총 8가지 농도로 웰 당 100 μL씩 첨가하고, SARS-CoV-2 희석액(NCCP43326, 2x10³ TCID₅₀/mL)을 100 μL씩 분주 후, 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 1시간 동안 정치시켰다. Vero 세포가 배양된 96-웰 플레이트의 배양액을 제거한 후, 1시간 동안 정치시킨 시험물질과 SARS-CoV-2 혼합액을 웰 당 100μL씩 첨가하고 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 3일간 배양 후 광학 현미경으로 세포병변효과를 확인하였다. 위 시험은 3회 반복하여 시험물질의 유효농도를 확인하였다.

표 3의 결과로부터 확인할 수 있는 같이, 혼합 생약 추출물은 1250 μg/mL 이상의 농도에서 세포독성이 나타나는 것으로 확인되었으며, 78, 156, 313, 625 μg/mL의 농도 구간에서 SARS-CoV-2 감염에 대한 세포병변 억제 활성을 나타내었다. 또한, 표 4의 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 양성 대조물질 하이드록시클로로퀸 황산염은 10 μg/mL 이상의 농도에서 세포독성이 확인되었으며, 1.25, 2.5, 5 μg/mL의 농도 구간에서 SARS-CoV-2 감염에 대한 세포병변 억제 활성을 나타내었다.

코로나-19 바이러스(SARS-CoV-2)에 대한 세포병변 억제 효과

시험번호 (수)	혼합생약 추출물 (μg/mL)
시험번호 (수)	10000	5000	2500	1250	625	313	156	78
1	CT	CT	CT	CT	O	O	O	O
2	CT	CT	CT	CT	O	O	O	O
3	CT	CT	CT	CT	O	O	O	O

CT: 세포독성, O: 효과있음, X: 효과없음

코로나-19 바이러스(SARS-CoV-2)에 대한 세포병변 억제 효과

시험번호 (수)	하이드록시클로로퀸 황산염 (μg/mL)
시험번호 (수)	20	10	5	2.5	1.25	0.63	0.31	0.16
1	CT	CT	O	O	O	X	X	X
2	CT	CT	O	O	O	O	X	X
3	CT	O	O	O	O	X	X	X

CT: 세포독성, O: 효과있음, X: 효과없음

시험예 2. 혼합 생약 추출물의 생체내 활성 평가

(1) 시험물질의 투여

7주령 시리아 햄스터(Syrian hamster)를 1주일 간 안정화시킨 후 평균 체중이 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 그룹을 설정하였다. 시리아 햄스터에 SARS-CoV-2(NCCP43330, 5x10⁴TCID₅₀/50μL/head)를 좌측 비강을 통하여 감염시켰으며, 바이러스 접종 직후부터 경구 투여를 개시하여 매일 1회 혼합 생약 추출물을 저농도(200 mg/kg)와 고농도(400 mg/kg)로 300μL씩 총 6일간 7회(0, 1, 2, 3, 4, 5, 6일) 경구투여하였다 (각각, n=12). 비감염 대조군('비감염 부형제' 대조군)은 무처리 시리아 햄스터에 멸균 증류수를 300μL씩 총 6일간 7회(0, 1, 2, 3, 4, 5, 6일) 경구투여하였다(n=9). 감염 대조군('감염 부형제' 대조군)은 SARS-CoV-2(NCCP43330, 5x10⁴TCID₅₀/50μL/head)를 좌측 비강을 통하여 감염시킨 시리아 햄스터에 멸균 증류수를 300μL씩 총 6일간 7회(0, 1, 2, 3, 4, 5, 6일) 경구투여하였다(n=12).

(2) 체중 감소 억제 활성

감염 0일차부터 7일차 되는 날까지 총 8회 햄스터 체중을 측정하여, 체중감소에 대한 혼합 생약 추출물의 억제 활성을 평가하였다. 그 결과는 도 1과 같다. 도 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 비감염 부형제 대조군에서는 체중이 서서히 증가하는 경향을 보였다. 감염 부형제 대조군의 경우, 1일째부터 7일째까지 체중이 감소하였다. SARS-CoV-2 감염 후 1 일째부터 7일까지 혼합 생약 추출물 저농도 시험군(200 mg/kg)은 감염 부형제 대조군 대비 체중감소가 유의성 있게(P<0.01, P<0.001) 억제되었다. SARS-CoV-2 감염 후 1일째부터 4일째까지 혼합 생약 추출물 고농도 시험군(400 mg/kg)은 감염 부형제 대조군 대비 체중감소가 유의성 있게(P<0.01, P<0.001) 억제되었으며, 감염 후 5일째부터 체중이 점차 회복되었다.

(3) 코로나바이러스 복제 억제 활성

SARS-CoV-2 접종 후 3일째, 5일째, 및 7일째 폐 조직에서 바이러스로 인한 병변 부위 일부를 채취하고, 채취된 폐 조직에 Wizol^TM(WizbioSolution, Korea) 시약 일정량을 넣고, 조직 분쇄용 비드를 이용하여 분쇄하여 상층액으로부터 총 RNA(total RNA)를 추출하였다. 추출된 총 RNA는 NanoDrop2000(Thermo scientific)을 이용하여 정량하였으며, 총 RNA 1 ㎍으로부터 WizScript^TM cDNA synthesis 키트(WizbioSolution)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 WizPure^TM qPCR Master-UDG(WizbioSolution)를 이용하여 실시간 PCT(real time-PCR)을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 10분간 초기 변성(denaturation) 시킨 뒤, 95 ℃에서 15초, 60 ℃에서 1분간 결합(annealing) 및 증폭(amplification)하는 사이클을 40회 진행하였다. 본 시험에서 사용한 프라이머는 하기 표 5 및 표 6과 같고, 타겟 유전자인 SARS-CoV-2의 RdRp 및 E 유전자의 검출은 형광물질인 HEX(Hexachloro-fluorescein) 및 FAM(fluorescein)을 통해 주기 역치(Ct) 값을 정량하여 비교하였다.

RdRp gene / nCoV_IP2

	서열번호	서열	길이
nCoV_IP2-12669Fw	1	ATGAGCTTAGTCCTGTTG	108 bp
nCoV_IP2-12759Rv	2	CTCCCTTTGTTGTGTTGT
nCoV_IP2-12696bProbe(+)	3	[HEX]AGATGTCTTGTGCTGCCGGTA[BHQ1]

E gene / E_Sarbeco

	서열번호	서열	길이
E_Sarbeco_F1	4	ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT	125 bp
E_Sarbeco_R2	5	ATATTGCAGCAGTACGCACACA
E_Sarbeco_P1	6	[FAM]ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG[BHQ1]

폐 조직 내 존재하는 바이러스의 RNA 양은 총 RNA ng 당 바이러스 유전자의 복제(copy) 수를 산출하여 표시하였다. 그 결과는 도 2와 같다. 도 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, SARS-CoV-2 감염 후 3일 차에서 혼합 생약 추출물 저농도(200 mg/kg) 및 고농도 시험군(400 mg/kg)에서 바이러스의 RdRp 및 E 유전자의 수준은 감염 부형제 대조군 대비 감소하는 경향을 보였다. SARS-CoV-2 감염 후 5일차 및 7일차에서 혼합 생약 추출물 저농도(200 mg/kg) 및 고농도 시험군(400 mg/kg)에서 RdRp 및 E 유전자의 수준은 감염 부형제 대조군에 비하여 현저하게 감소하였다.

(4) 폐조직 병변 경감 활성

SARS-CoV-2 감염 및 시험물질 투여 직후부터 지정된 일별(3일, 5일, 7일)로 부검을 실시하였다. 폐 조직은 10% 중화포르말린(neutral buffered formalin, NBF)에 넣어 폐 조직 안쪽을 고정한 후 떼어내어, 10% NBF 용액에 침지하여 고정한 후, 조직병리 검사용으로 사용하였다. 고정된 폐조직은 H&E(hematoxylin and eosin) 염색 후 조직병변을 관찰하고, 염증세포 침윤 정도에 따라 점수 평가(관찰되지 않음, 0; 미약, 1; 약함, 2; 중증도, 3; 심함, 4)를 진행하였다. 그 결과는 도 3과 같다. 도 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, SARS-CoV-2 감염 후 3일차 모든군에서 조직병리학적 염증이 관찰되었으며, 시험군과의 차이는 보이지 않았다. SARS-CoV-2 감염 후 5일차에서 혼합 생약 추출물 저농도 시험군(200 mg/kg)의 조직학적 염증 수준이 감염 부형제 대조군 대비 줄어들었으며, 혼합 생약 추출물 고농도 시험군(400 mg/kg)의 조직병리학적 염증 수준이 감염 부형제 대조군 대비 유의성 있게(P<0.05) 낮게 관찰되었다. SARS-CoV-2 감염 후 7일 차에서 혼합 생약 추출물 저농도(200 mg/kg) 및 고농도 시험군(400 mg/kg)의 조직병리학적 염증 수준이 감염 부형제 대조군 대비 유의성 있게(P<0.05) 낮게 관찰되었다.

(5) 혼합 생약 추출물의 항염증 활성

SARS-CoV-2 감염 및 시험물질 투여 직후부터 지정된 일별(3일, 5일, 7일)로 부검을 실시하여 회수된 폐 조직을 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 넣고 균질기를 사용하여 분쇄시킨 후 상층액 용액을 채취하여 IL-6 사이토카인의 양을 Hamster IL-6 ELISA 키트(cat No. CSB-E14304Ha, Cusabio Tech, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 정량하였고, 폐 조직 단백질 양을 Bradford 방법으로 정량한 후, 폐 조직 g 당 사이토카인 단백질 양을 환산하였다. 그 결과는 도 4와 같다. 도 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, SARS-CoV-2 감염 후 3일차 모든군에서 염증성 사이토카인 IL-6의 수준은 차이를 보이지 않았다. SARS-CoV-2 감염 후 5일차에서 혼합 생약 추출물 저농도(200 mg/kg) 및 고농도 시험군(400 mg/kg)에서 IL-6 수준은 감염 부형제 대조군 대비 유의성 있게(P<0.01) 감소하였다. 특히, SARS-CoV-2 감염 후 5일차에서 3일 및 7일과 비교하여 감염 부형제 대조군은 혼합 생약 추출물 저농도와 고농도 처리군과 비교하여 가장 높은 IL-6의 수준을 보여주었다. SARS-CoV-2 감염 후 7일차 모든군에서 IL-6의 수준이 감소하였으며, 군사이에 통계적 유의성은 관찰되지 않았다.

상기 시험결과로부터, 혼합 생약 추출물은 SARS-CoV-2의 게놈 RNA 복제 및 증식을 억제하여 폐에서 침윤 세포수를 줄이고 염증반응을 감소시키는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 혼합 생약 추출물은 치료 효과가 우수한 코로나바이러스 감염증 예방, 경감 및 치료용 조성물로 유용하게 적용될 수 있다.

<110> HANLIM PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Pharmaceutical compositions for preventing, alleviating or treating coronavirus infection <130> PN0975 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 atgagcttag tcctgttg 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ctccctttgt tgtgttgt 18 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 agatgtcttg tgctgccggt a 21 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 atattgcagc agtacgcaca ca 22 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 acactagcca tccttactgc gcttcg 26

Claims

숙지황(Rehmanniae Radix Preparata), 천문동(Asparagi Tuber), 오미자(Schisandrae Fructus), 목단피(Moutan Radicis Cortex), 황금(Scutellariae Radix), 행인(Armeniacae Semen), 및 백부근(Stemonae Radix)을 포함하는 혼합 생약의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 중증급성호흡기증후군 코로나-19 바이러스(SARS-CoV-2)에 감염된 폐 조직에서 바이러스 복제의 억제를 통한, 중증급성호흡기증후군 코로나-19 바이러스(SARS-CoV-2)에 의한 코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 혼합 생약이, 백부근(Stemonae Radix) 1 중량부에 대하여, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 3∼6 중량부, 천문동(Asparagi Tuber) 1.5∼2.5 중량부, 오미자(Schisandrae Fructus) 1.5∼2.5 중량부, 목단피(Moutan Radicis Cortex) 1.5∼2.5 중량부, 황금(Scutellariae Radix) 1∼2 중량부, 및 행인(Armeniacae Semen) 1∼2 중량부의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합 생약이, 백부근(Stemonae Radix) 1 중량부에 대하여, 숙지황(Rehmanniae Radix Preparata) 4 중량부, 천문동(Asparagi Tuber) 2 중량부, 오미자(Schisandrae Fructus) 2 중량부, 목단피(Moutan Radicis Cortex) 2 중량부, 황금(Scutellariae Radix) 1.5 중량부, 및 행인(Armeniacae Semen) 1.5 중량부의 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합 생약의 추출물이 상기 혼합 생약의 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제5항에 있어서, 상기 열수 추출물이 상기 혼합 생약을 90∼100℃에서 3∼6시간 동안 물을 사용하여 추출하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 경구 투여용 제형으로 제제화된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.