KR102421772B1

KR102421772B1 - 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102421772B1
Application number: KR1020200060088A
Authority: KR
Inventors: 한설희; 권경자; 김령은; 신찬영
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2019-05-21
Filing date: 2020-05-20
Publication date: 2022-07-18
Also published as: KR20200134170A

Abstract

본 발명은 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 조성물은 C6 glioma 세포에서 NO, ROS 수준의 감소, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6. 및 IL-1β 등의 발현의 감소효과가 있고, 대뇌피질 신경세포에서 미세먼지에 의해 손상된 신경세포 사멸에 대한 보호효과가 있어, 신경세포의 사멸이 동반되는 신경 퇴행성 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 미세먼지에 의해 유발된 신경염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 유용할 수 있다.

Description

클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for preventing or treating neuroinflammatory diseases or neurodegenerative diseases caused by fine dusts, including chlorophyll and rosmarinic acid}

본 발명은 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

미세먼지(微細-, 영어: particulate matter, PM, suspended particulate matter, SPM, atmospheric aerosol particles, atmospheric particulate matter) 또는 분진(粉塵)은 눈에 보이지 않을 정도로 입자가 작은 먼지이다. 아황산가스, 질소 산화물, 납, 오존, 일산화 탄소 등을 포함하는 대기오염 물질로 자동차, 공장, 조리 과정 등에서 발생하여 대기 중 장기간 떠다니는 입경(입자의 지름) 10μm 이하의 미세한 먼지이며, PM10이라고도 한다. 입자가 2.5μm 이하인 경우는 PM 2.5라고 쓰며 '초미세먼지' 또는 '극미세먼지' 라고도 부른다. 학술적으로는 에어로졸(aerosol)이라고 부른다. 미세먼지(fine particles)는 부유분진(Suspended particles), 입자상물질(Particulate matter) 등으로도 불리며 명칭에 따라 약간씩 다른 의미를 가지고 있다. 입자상물질은 지름이 100μm에서 10나노미터 정도이며, 이보다 지름이 크면 중력으로 인해 대기중 체류시간이 아주 짧다.

미세먼지는 흙먼지, 꽃가루, 곰팡이의 포자, 해염 입자 등 자연적으로 형성된 요인도 포함하지만 더 많은 부분은 교통수단이나 산업활동에 의해 생성되는 인위적 물질이다. PM2.5의 경우 58.3%가 대기오염 물질이 공기 중에서 반응하여 형성된 황산염, 질산염 등이며 그 다음이 화석연료를 태우는 과정에서 발생하는 탄소류와 검댕(16.8%)이다. 특히 수도권의 경우 PM2.5의 약 2/3가 화학반응에 의해 2차 생성된 오염 물질로 추정된다.

오늘날 미세먼지는 건강에 대한 위해성으로 많은 주목을 받고 있다. 5~10 μg/m³ 이하의 먼지는 비점막을 통해 체내에 흡수가 가능하며 2~5 μg/m³ 이하의 먼지는 기도를 통과하고 0.1~1 μg/m³ 으로 매우 작은 크기의 먼지는 폐포 손상까지 유발이 가능하다. 세계보건기구(World Health Organization,WHO)에 의하면 PM10에 장기 노출될 경우 호흡기계 건강과 사망률이 증가하는데, PM2.5는 더 강한 위험 인자로 작용한다. 대기 중 PM10이 10 μg/m³ 증가할 때마다 일간 사망률은 0.2~0.6% 증가하며, PM2.5에 대한 장기 노출의 평균치가 10 μg/m³ 증가하면 심혈관계 질환으로 인한 사망률이 6~13% 가량 증가한다. 일상생활 중 노출되는 환경유해인자로 인한 건강피해가 급증하고 있으며, 특히 신경계 질환 관련 환경유해물질의 경우 뇌졸중을 비롯한 뇌혈관질환 뿐만 아니라 치매와 파킨슨병 등의 신경퇴행성질환을 유발, 악화시키는 것으로 보고되었다. 신경계 질환의 경우, 노인에게 자주 발생하고 이로 인한 질병 부담이 크므로 급속한 노령화가 진행되고 있는 우리나라에서는 의료 영역뿐 아니라 사회 경제적 파급 효과가 클 것으로 예상된다. 또한 환경오염에 따른 미세먼지 노출의 증가는 노인에게 매우 취약하여 혈뇌장벽 파괴 및 뇌염증 증가, 인지기능저하를 촉진하여 AD와 같은 치매 발병률을 증가시키므로 전 세계적으로 치매의 중요한 위험인자 중 하나이고 특히 초고령 사회인 대한민국에서는 경제 사회적 부담을 더 증가시키게 될 것이다. 미세먼지로 인해 기대수명보다 일찍 사망하는 사람이 700만명에 이른다고 하고, 2013년 10월에는 세계보건기구 산하의 국제암연구소 (International Agency for Research on Cancer, IARC)에서 미세먼지를 발암물질 1군으로 분류하였다.

최근 PM10/PM2.5와 같은 미세먼지의 심각성으로 인해 대한민국은 2019년 2월 15일부터 "미세먼지 저감 및 관리에 관한 특별법 (미세먼지법)"이 시행되었고 이를 바탕으로 국회에서는 미세먼지를 사회재난으로서 규정하고, "미세먼지 대책 법안" 총 8건을 2019년 3월 15일 대표 발의하였다.

공기오염에 따른 환경유해인자의 증가가 호흡기의 이상뿐만 아니라 중추신경계에 큰 영향을 준다. 공기오염에 의한 미세먼지, 초미세먼지에 노출 시 편두통, 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병 등이 야기될 수 있을 것임을 시사하고 있다. 최근 Pubmed에 보고된 1617건의 논문들과 CNKI에 보고된 28건에 대해 PM2.5와 뇌신경질환과의 연관성을 분석한 결과, PM2.5에 노출은 AD, PD, 뇌졸중의 발생을 촉진하고 특히 아이들과 노인들에게 더 위험인자로서 작용함을 알게 되었다.

초미세먼지가 인체에 해를 미칠 수 있는 경로로서 코를 통한 호흡기 계통의 염증, 눈을 통한 안점막의 염증 등에 대해 많은 연구가 되어 있다. 최근 초미세먼지가 뇌에 직접 유입될 수 있음에 대한 연구결과가 나오고 있다. 1) 코를 통해 후각신경구를 거처 뇌로 이동 (Olfactory bulb transmission), 2) 코를 통해 들어가 코에서 증가된 염증반응으로 뇌에 염증 유도 (Nasal epithelial transmission), 3) 허파로 들어간 초미세먼지가 alveolar inflammation을 유도해 사이토카인을 증가시켜 혈류 (Mechanical inhalation)를 타고 뇌로 들어가 염증 유도되는 것으로 설명하고 있다. 그러나, 이러한 미세먼지에 의한 뇌염증반응 및 뇌질환 발병, 기전연구와 이에 대한 대처방안에 관한 연구는 전무한 상태이다.

치매와 같은 퇴행성뇌신경계 질환에서 나타나는 문제는 신경세포사멸에 의한 인지기능저하이다. 따라서, 약물처치에 의한 신경세포보호작용을 통한 인지기능 향상은 매우 중요한 이슈이다. 이에 최근 연구된 결과들을 보면 치매와 같은 뇌신경질환에의 치료에 있어서 신경세포보호작용, 염증억제, 항산화 등의 효과를 갖는 신약의 개발뿐만 아니라 이미 알려진 약물들의 사용을 재해석하는 drug repositioning에 의한 치매치료제 사용가능성 등에 대한 연구들도 활발히 진행되고 있다 (Cho DH, Lee EJ, Kwon KJ, Shin CY, Song KH, Park JH, Jo I, Han SH.2013. Troglitazone, a thiazolidinedione, decreases tau phosphorylation through the inhibition of cyclin-dependent kinase 5 activity in SH-SY5Y neuroblastoma cells and primary neurons. Journal of neurochemistry 126(5):685-695). 또한, 물질들의 복합처치에 의한 신경세포 사멸의 보호 (Denny Joseph KM, Muralidhara. 2015. Combined Oral Supplementation of Fish Oil and Quercetin Enhances Neuroprotection in a Chronic Rotenone Rat Model: Relevance to Parkinson's Disease. Neurochemical research) 및 인지기능 향상 (An L, Fu J, Zhang T. 2015. Reversible effects of vitamins C and E combination on cognitive deficits and oxidative stress in the hippocampus of melamine-exposed rats. Pharmacology, biochemistry, and behavior)에 대한 연구들도 활발히 진행하고 있다.

현재까지 신경세포사멸의 억제를 위해 연구된 약물들은 글루타민산 수용체 길항제, 항산화제, 칼슘 혹은 나트륨, 등의 이온채널 차단제, 항염증제 등을 이용한 것이 대부분이며 효과적인 약물이 개발되지 못하고 있는 실정이다. 따라서 획기적인 아이디어 전환, 신개념의 치료제 타겟발굴 및 drug repositioning의 효과 및 약물의 복합사용에 대한 연구가 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 클로로필 및 로즈마린산을 혼합하여 사용하는 경우, 각각 단독으로 사용할 경우보다 미세먼지에 의해 손상된 신경세포 보호 효과가 현저히 향상되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 10-1666969호

본 발명의 목적은 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 또다른 목적은 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 미세먼지에 의해 손상된 신경세포 보호용 조성물을 제공한고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

나아가 본 발명은 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 미세먼지에 의해 손상된 신경세포 보호용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 조성물은 C6 glioma 세포에서 NO, ROS 수준의 감소, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6. 및 IL-1β 등의 발현의 감소효과가 있고, 대뇌피질 신경세포에서 미세먼지에 의해 손상된 신경세포 사멸에 대한 보호효과가 있어, 신경세포의 사멸이 동반되는 신경 퇴행성 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 미세먼지에 의해 유발된 신경염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 유용할 수 있다.

도 1은 C6 세포주를 이용하여 미세먼지를 처리하고 세포사멸에 대한 변화를 확인한 것으로, (a)는 미세먼지를 처리한 후 배양한 C6 세포에서 미세먼지에 의한 세포모양변화를 확인한 결과이고, (b)는 MTT 분석을 통해 세포사멸을 정량한 결과이다.
도 2는 C6 세포주에 미세먼지를 처리한 후 염증성 물질인 NO와 ROS를 측정한 것으로, (a)는 배양한 C6 glioma 세포주에 미세먼지를 처리 후 1 시간째에 분비된 NO(nitric oxide)의 양을 측정한 것이고, (b)는 세포내 ROS를 측정한 것이다.
도 3은 C6 세포주에 미세먼지를 처리한 후 염증성 사이토카인인 IL-6와 iNOS 유전자 발현변화를 확인한 것으로서 미세먼지 처리 후 1시간째 RNA를 추출하여 IL-6와 iNOS 유전자 발현변화를 RT-PCR을 통해 확인한 것이다.
도 4는 일차 배양한 흰쥐의 성상세포에 농도별 미세먼지를 처리한 후 염증성 매개물질인 PAI-1의 유전자 발현과 활성을 확인한 결과이다.
도 5는 C6 세포주에서 미세먼지 처리에 의한 염증성 사이토카인의 발현에 대해 클로로필의 영향을 확인한 것으로, 각종 염증성 사이토카인의 유전자 발현변화를 RT-PCR로 확인 후 정량한 결과이다.
도 6은 C6 세포주에서 미세먼지에 의해 증가한 NO 분비에 대한 클로로필의 효과를 정량한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 조성물을 대뇌피질 신경세포에 미세먼지를 처리한 후 세포사멸에 대한 영향을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 클로로필 : 로즈마린산을 20 내지 60 : 0.5 내지 7 의 중량비로 포함하여 사용할 수 있으며, 바람직하게 클로로필 : 로즈마린산을 25 내지 50 : 1 내지 5 의 중량비 포함하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환의 예로는 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 크로이츠펠트-야콥 질환(CJD), 할러포르텐-스파츠 질환, 헌팅톤 질환, 다체계 위축증, 치매, 프론템포랄 치매, 근위축성 측삭경화증, 척수성 근위축증, 척수소뇌 위축증(SCA), 수막뇌염, 세균성 수막뇌염, 바이러스성 수막뇌염, CNS 자가면역 장애, 다발성 경화증(MS), 급성 허혈성 상해와 같은 질환일 수 있다.

본 발명의 조성물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 조성물은 대뇌피질 신경세포에서 미세먼지에 의해 손상된 신경세포 사멸에 대한 보호 효과를 나타낸다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 조성물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

상기 클로로필 및 로즈마린산을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.

이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 Kg인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1-1000 mg/일이며, 바람직하게는 1-500 mg/일이며, 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 또는 건강기능식품 조성물

본 발명은 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 클로로필 : 로즈마린산을 0.5 내지 15 : 0.5 내지 7 의 중량비로 포함하여 사용할 수 있으며, 바람직하게 클로로필 : 로즈마린산을 1 내지 10 : 1 내지 5 의 중량비 포함하여 사용할 수 있다.

본 발명의 클로로필 및 로즈마린산을 건강기능식품 및 건강식품 조성물로 사용하는 경우, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 조성물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태일 수 있으며, 건강식품의 예로는 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품 및 건강식품 조성물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 클로로필 및 로즈마린산을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 조성물의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 및 건강식품 조성물 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 조성물은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 클로로필 및 로즈마린산을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<준비예 1> 미세먼지, 클로로필 및 로즈마린산 준비

본 발명에서 사용한 미세먼지 (Diesel Particulate matter)는 PM2.5에 해당하는 것으로 시그마 알드리치사로부터 수입한 NIST® SRM®1650b이고 100% DMSO에 녹여 100 mg/ml 용액으로 만들어 1시간 소니케이션 후 실험에 사용하였다. 클로로필은 상우식품으로부터 공급받아 사용하였다. 로즈마린산(rosemarinic acid)는 Sigma-Aldrich에서 공급받아 사용하였다.

<실험예 1> 성상세포주인 C6 신경교종(glioma)에서 미세먼지 처리에 의한 세포사멸 확인

배양한 흰쥐의 성상세포주인 C6 신경교종(glioma) 세포에 10 mg/ml 농도로 100% DMSO에 녹여 1시간 동안 sonication 한 PM2.5 용액을 5, 25, 50,100 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 24시간 후 세포를 관찰하였다. 24시간 후 이미지를 얻었고 20 ㎍/㎖ MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)용액을 각 세포의 웰에 20 ㎕씩 처리하고 1시간 배양하고 배지를 제거한 후 500 ㎕ 100% DMSO 용액을 넣어 5분간 배양 후 생성된 formazan을 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포사멸에 대한 PM2.5의 효과를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, PM 2.5는 농도의존적으로 세포에 축적되고 세포사멸을 유도함을 알 수 있었다.

<실험예 2> C6 세포에서 미세먼지에 의한 염증성 물질 NO와 ROS 분비 확인

배양한 C6 신경교종(glioma) 세포에 10 mg/ml 농도로 100% DMSO에 녹여 1시간 동안 sonication 한 PM2.5 용액을 5, 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 24시간째 배양액으로 분비된 NO를 측정하고 24시간째 세포내 ROS를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, PM 2.5는 농도의존적으로 세포에서부터 NO를 분비하고 세포내 ROS를 증가시킴을 알 수 있었다.

<실험예 3> C6 세포에서 미세먼지에 의한 염증성 사이토카인의 유전자발현 확인

배양한 C6 신경교종 세포에 50 ㎍/㎖ 미세먼지를 처리 후 1시간째 세포로부터 RNA를 추출하여 reverse transcriptase를 이용한 PCR을 통해 cDNA를 만들고 IL-6, iNOS 등의 염증성 사이토카인 유전자 프라이머셋을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 염증성 사이토카인 유전자 발현변화를 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 음성대조군에 비해 미세먼지 처리군은 시간이 지남에 따라 IL-6, iNOS 등의 염증성 사이토카인 및 염증성매개물질의 유전자발현을 증가시킴을 확인할 수 있었다.

<실험예 4> 성상세포에서 미세먼지 처리에 의한 PAI-1 유전자발현 및 활성에 대한 영향 확인

일차 배양한 흰쥐 성상 세포에 10, 20, 50 ㎍/㎖의 미세먼지를 처리하고 24시간 째 RNA를 추출하여 reverse transcriptase를 이용한 PCR을 통해 cDNA를 만들고 PAI-1, tPA 유전자 프라이머셋을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 유전자 발현변화를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 미세먼지 농도별로 일차배양 성상세포에서 PAI-1유전자발현과 활성이 증가하였고 tPA 유전자발현 및 활성은 감소됨을 확인할 수 있었다.

<실험예 5> C6 신경교종세포에서 미세먼지에 의해 증가된 염증성 사이토카인 및 NO분비에 대한 클로로필의 영향 확인

배양한 C6 세포에 1, 100 ㎍/㎖의 클로로필을 24시간 처리한 후 50 ㎍/㎖ 미세먼지를 처리하고 1시간 배양하여 미세먼지에 의해 증가된 염증성 사이토카인과 염증성 매개물질 및 anti-inflammatory mediator에 대한 클로로필의 효과를 RT-PCR을 통해 유전자 발현 변화로 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 클로로필을 처리하지 않은 대조군에서는 미세먼지에 의해 C6 세포에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β의 유전자 발현이 증가되었다. 이때, 클로로필을 전 처리한 후 미세먼지를 처리한 실험군에서는 클로로필 농도가 증가할수록 미세먼지에 의해 증가된 TNF-α, IL-6, IL-1β의 유전자발현이 감소됨을 확인하였다.

<실험예 6> 성상세포에서 미세먼지에 의해 증가된 NO분비에 대한 클로로필의 영향 확인

일차 배양한 성상세포에 25, 50, 100 ㎍/㎖의 클로로필을 24시간 처리한 후 50 ㎍/㎖ 미세먼지를 처리하고 24시간 배양하여 미세먼지에 의해 증가된 NO 양을 정량하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 클로로필을 처리하지 않은 음성대조군에서는 미세먼지에 의해 NO 분비가 증가되었고 클로로필을 전 처리한 후 미세먼지를 처리한 실험군에서는 클로로필 농도가 증가할수록 미세먼지에 의한 NO 분비가 감소됨을 확인하였다. 이는 양성대조군인 멜라토닌의 효과와 유사한 결과였다.

<실험예 7> 클로로필 및 로즈마린산의 신경세포 보호효과 확인

태어난 지 2일된 흰쥐의 뇌로부터 분리하여 14일 동안 배양한 대뇌피질 신경세포에 클로로필(25, 50 ㎍/㎖) 및 로즈마린산(1, 5 ㎍/㎖)을 각각 단독 또는 혼합하여 처리하여 24시간 후 50 ㎍/㎖ 농도의 미세먼지를 처리한 뒤, 24시간 배양하여 세포를 관찰하였다. 20 ㎍/㎖ MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)용액을 각 세포의 웰에 20 ㎕씩 처리하고 1시간 배양하고 배지를 제거한 후 500 ㎕ 100% DMSO 용액을 넣어 5분간 배양 후 생성된 formazan을 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포사멸을 확인하였다.

구분	미세먼지(PM2.5) 50㎍/㎖	클로로필 (㎍/㎖)	로즈마린산 (㎍/㎖)	생존율 (%)
무처리군	-	-	-	100
미세먼지처리군	○	-	-	81
비교예 1	○	25	-	84
비교예 2	○	50	-	91
비교예 3	○	-	1	81
비교예 4	○	-	5	87
실시예 1	○	25	1	90
실시예 2	○	25	5	102
실시예 3	○	50	1	108
실시예 4	○	50	5	110

그 결과, 도 7 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 미세먼지에 의해 신경세포가 사멸한 것을 확인하였으며, 클로로필 또는 로즈마린산을 각각 단독으로 처리하는 경우(비교예 1 내지 4) 보다, 클로로필 및 로즈마린산을 혼합사용(실시예 1 내지 4)하는 경우, 신경세포 사멸이 억제되는 것을 확인하였다.

	신경세포 생존 향상 백분율 (%)	콜비식 추정값 (%)
비교예 1	3.70	-
비교예 2	12.35	-
비교예 3	0	-
비교예 4	7.41	-
실시예 1	11.11	3.70
실시예 2	25.93	10.84
실시예 3	33.33	12.35
실시예 4	35.80	18.84

또한, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 미세먼지에 의해 손상된 신경세포의 생존율을 기준으로, 비교예 1 내지 4 및 실시예 1 내지 4를 처리하였을 때, 신경세포 생존 향상 백분율을 계산한 결과, 비교예 1은 3.70%, 비교예 2는 12.35%, 비교예 3은 0%, 비교예 4는 7.41%로 신경세포 생존율을 향상시켰으며, 실시예 1은 11.11%, 실시예 2 내지 4는 23.46%(MTT 분석 결과, 100% 초과할 경우, 100%로 계산함)의 신경세포 생존율을 향상시켰으며, 콜비식으로 계산한 추정값보다 신경세포 생존율을 현저히 향상시키는 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과는 본 발명의 클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 조성물이 미세먼지에 의해 손상된 신경세포 사멸에 대한 보호 활성을 가짐을 시사하는 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<제제예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

클로로필 및 로즈마린산 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

클로로필 및 로즈마린산 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

클로로필 및 로즈마린산 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 주사액제의 제조

클로로필 및 로즈마린산 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 클로로필 및 로즈마린산을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

<제제예 2> 건강기능식품 및 건강식품의 제조

<2-1> 건강기능식품의 제조

클로로필 및 로즈마린산 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 μg

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 μg

비타민 C 10 mg

비오틴 10 μg

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 μg

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능성 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능성 식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능성 식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<2-2> 건강 기능 음료의 제조

클로로필 및 로즈마린산 100 mg

구연산 100 mg

올리고당 100 mg

매실농축액 2 mg

타우린 100 mg

정제수를 가하여 전체 500 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

<2-3> 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 클로로필 및 로즈마린산 0.01-1 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-4> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 상기에서 제조한 곡물류 및 종실류의 건조분말과 본 발명의 클로로필 및 로즈마린산을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 34 중량부, 율무 19 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

클로로필 및 로즈마린산을 포함하는 조성물 (2 중량부),

영지(1.5 중량부), 및

지황(1.5 중량부).

Claims

클로로필 및 로즈마린산을 50 : 1-10 중량비로 포함하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 클로로필 : 로즈마린산을 50 : 4.9-5.1 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 크로이츠펠트-야콥 질환(CJD), 할러포르텐-스파츠 질환, 헌팅톤 질환, 다체계 위축증, 치매, 프론템포랄 치매, 근위축성 측삭경화증, 척수성 근위축증, 척수소뇌 위축증(SCA), 수막뇌염, 세균성 수막뇌염, 바이러스성 수막뇌염, CNS 자가면역 장애, 다발성 경화증(MS) 및 급성 허혈성 상해로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
클로로필 및 로즈마린산을 50 : 1-10 중량비로 포함하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제4항에 있어서,
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태의 식품인 것을 특징으로 하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
클로로필 및 로즈마린산을 50 : 1-10 중량비로 포함하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
제6항에 있어서,
상기 건강식품은 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미세먼지에 의해 유발된 신경염증 또는 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
클로로필 및 로즈마린산을 50 : 1-10 중량비로 포함하는 미세먼지에 의해 손상된 신경세포 보호용 조성물.