KR101947352B1

KR101947352B1 - 인지 건강 및 기능을 향상시키는 식물 추출물

Info

Publication number: KR101947352B1
Application number: KR1020157006128A
Authority: KR
Inventors: 미셀 세디아; 켈리 헤어링거; 브랜든 루이스; 해리 펭
Original assignee: 케민 인더스트리즈, 인코포레이티드
Priority date: 2012-08-09
Filing date: 2013-08-09
Publication date: 2019-02-12
Also published as: CN111358832A; KR20150041654A; AU2013299491B2; EP2882443B1; CN104684562A; JP2023027232A; BR112015002739A2; JP2015524484A; JP2021066735A; CA2880708C; EP2882443A1; AU2013299491A1; CA2880708A1; WO2014026081A1; EP2882443A4; ES2715005T3; US20140044813A1; PL2882443T3

Abstract

꿀풀과(Lamiaceae family) 식물의 추출물이 인지 건강 및 기능을 향상시킴을 나타낸다.

Description

인지 건강 및 기능을 향상시키는 식물 추출물 {PLANT EXTRACTS FOR IMPROVING COGNITIVE HEALTH AND FUNCTION}

본 발명은 일반적으로 인지 건강 및 기능을 증진, 향상 또는 유지시키는 식물 추출물, 더욱 구체적으로 학습, 기억, 주의력, 조심성, 실행 능력, 언어 유창성, 처리 속도, 및/또는 인지 융통성 및 관련 행동을 향상시키기 위한 카르노스산 및/또는 로즈마린산의 투여에 관한 것이다.

인지 건강 또는 기능을 향상시킬 수 있는 제품에 대한 강력한 요구가 있으며, 불리한 경제적 압박에도 불구하고 이들 제품에 대한 시장이 최근 지속적으로 성장해 왔다. 이러한 성장 중 일부는 노인 인구의 증가에 기인할 수 있으며, 이는 특히 아시아 및 미국에서 그러하다. 세계적 인지 건강 성분 판매는 대략 4억 5천 5백만 달러이다. 프로스트(Frost) 및 설리반(Sullivan)은 2016년에서 2019년까지 상기 지역에서의 연간 성장률이 12%에 이를 것으로 예상하였다.

최근 인지 건강에 대한 주 성분들로는 포스파티딜세린 (PS), CoQ10, 오메가-3(어유/조류 오일(algae oil)), 시티콜린(citicoline), 은행잎, 및 인삼을 포함한다. 최다 인지 건강 성분 중, 포스파티딜세린이 유일하게 FDA 승인 효능 표시(FDA approved qualified claim)를 지닌 것이다. 그러한 효능 표시를 지지하기 위한 과학적 증거가 증가함에 따라, 상기 성분은 판매가 두 자릿 수 성장을 누리고 있다. 2010년에, 뇌 기능, 심장 건강 및 시력에 대한 DHA 및 EPA 헬쓰 클레임(health claim)은 유럽의 EFSA로부터 긍정적인 견해를 얻었다. 시티콜린은 신경세포 퇴행을 예방하고, 기억을 향상시키는 성분으로서 조성되었다.

카르노스산(CA)은 로즈마리누스 오피시날리스(Rosmarinus officinalis)(로즈마리) 및 살비아 오피시날리스(Salvia officinalis)(세이지) 중에 존재하는 가장 풍부한 폴리페놀 화합물 중 하나이다. 최근에, CA는 이미 구성성분으로서 또는 완제 식이 보충제로서 시장에서 입수가능하다. 이들 생성물의 순도는 25% 내지 60%에서 달라지며, 어느 한 HPLC 등급 생성물은 98%로서 기재되어 있다. 또한, 분말형으로 입수가능한 CA로 표준화된 (5-30% CA로 표준화됨), 또는 식이 보충제 (일일 캡슐 3알의 권장 투여량으로 6% CA로 표준화된 300 mg 캡슐)로서 로즈마리 추출물이 존재한다. 이들 로즈마리 추출물에서 CA의 백분율은 5 내지 60%에서 달라진다. 로즈마리는 페놀성 디테르펜(카르노스산 및 카르노졸), 페놀산 (카페인산 및 로즈마린산), 및 플라보노이드의 조합을 지닌다. 디테르펜은 4개의 이소프렌 단위가 조합된 것이고, 항균성 및 항염증성인 것으로 공지되어 있다(Bisio et al. Antimicrobial activity of the ornamental species Salvia corrugata, a potential new crop for extractive purposes. J Agric Food Chem 56: 10468-10472, 2008; Sato et al. Antibacterial novel phenolic diterpenes from Podocarpus macrophyllus D. Don. Chem Pharm Bull (Tokyo) 56: 1691-1697, 2008; Su et al. Anti-inflammatory activities of furanoditerpenoids and other constituents from Fibraurea tinctoria. Bioorg Med Chem 16: 9603-9609, 2008; Wang et al. Triptolide inhibits the differentiation of Th17 cells and suppresses collagen-induced arthritis. Scand J Immunol 68: 383-390, 2008). 이들 이소프렌 단위는 선형 사슬로서 함께 연결되거나 고리를 형성하도록 배열될 수 있다. CA는 이의 유도체, 카르노졸과 함께 로즈마리누스 오피시날리스 중 주요 활성 성분인 것으로 간주된다.

카르노스산 (CA)

대부분의 입수가능한 시험관내 연구는 항산화제 보호에 대해 CA를 평가하였다. 사실상, 로즈마리의 항산화제 활성은 주로 CA에 기인하였다(Aruoma et al. An evaluation of the antioxidant and antiviral action of extracts of rosemary and provencal herbs. Food and Chemical Toxicology 34: 449-456, 1996; Perez-Fons et al. Rosemary (Rosmarinus officinalis) diterpenes affect lipid polymorphism and fluidity in phospholipid membranes. Archives of Biochemistry and Biophysics 453: 224-236, 2006; Wang et al. Augmentation by Carnosic Acid of Apoptosis in Human Leukaemia Cells Induced by Arsenic Trioxide via Upregulation of the Tumour Suppressor PTEN. The Journal of International Medical Research 36: 682-690, 2008). CA의 신경 보호 효과가 산화적 스트레스의 글루타메이트 모델을 사용하여 평가되었다. 이 연구에서는 CA가 심각한 글루타메이트 손상에 대해 생체내 및 시험관내 둘 모두에 신경세포를 보호함을 입증하였다(Sato et al. Carnosic acid, a electrophilic compound, protects neurons both in vitro and in vivo through activation of the Keap1/Nrf2 pathway via alkylation of targeted cysteines on Keap1. Journal of Neurochemistry 104: 1116-1131, 2008). CA에 관한 보다 최근의 문헌에서는 그것의 잠재적 항-염증 성질에 대해 논의하였다. CA가 NF-κB 전사 인자의 하향-조절로 인한 항-염증 활성을 지님을 보여준 논문 이외에도, 그 밖의 연구에서는 CA의 항염증 성질에 대한 추가의 메커니즘을 평가하였다(Laughton et al. Inhibition of mammalian 5-lipoxygenase and cyclo-oxygenase by flavonoids and phenolic dietary additives: Relationship to antioxidant activity and to iron ion-reducing ability. Biochemical Pharmacology 42: 1673-1681, 1991; Poeckel et al. Carnosic acid and Carnosol, Phenolic potently inhibit human 5-lipoxygenase and suppress pro-inflammatory responses of stimulated human polymorphonuclear leukocytes. Biochem Pharmacol 76: 91-97, 2008; Rau et al. Carnosic acid and Carnosol, Phenolic Diterpene Compounds of the Labiate Herbs Rosemary and Sage, are Activators of the Human Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma. Planta Med 72: 881-887, 2006).

상기 시험관내 데이타는 CA의 항산화 능력에 대한 생체내 데이터에 의해 뒷받침된다. 최근의 생체내 문헌은 항-비만 및 항-당화(anti-glycative) 효과를 나타낸다(Alarcon-Aguilar et al. Investigation on the hypoglycaemic effects of extracts of four Mexican medicinal plants in normal and alloxan-diabetic mice. Phytother Res 16: 383-386, 2002; Hsieh et al. Low-density lipoprotein, collagen, and thrombin models reveal that Rosemarinus officinalis L. exhibits potent antiglycative effects. J Agric Food Chem 55: 2884-2891, 2007; Ninomiya et al. Carnosic acid, a new class of lipid absorption inhibitor from sage. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14: 1943-1946, 2004; Takahashi et al. Carnosic acid and carnosol inhibit adipocyte differentiation in mouse 3T3-L1 cells through induction of phase 2 enzymes and activation of glutathione metabolism. Biochem Biophys Res Commun 382: 549-554, 2009).

로즈마린산(RA)은 스피어민트에서 발견되는 주 성분 중 하나이고, 항산화 능력에 대해 중요한 기여물질이다(Fletcher et al. Heat stress reduces the accumulation of rosmarinic acid and the total antioxidant capacity in spearmint(Mentha spicata L). Journal of the Science of Food and Agriculture 85: 2429-2436, 2005). 천연 페놀성 화합물인 RA는 카페인산의 3,4-디하이드로페닐락트산 및 카페인산의 에스테르이다. 그것의 구조는 카르보닐기, 불포화 이중 결합 및 두 페놀성 고리 사이의 카르복실산으로 구성된다. RA는 여러 생물학적 활성, 예컨대, 항-염증, 항-돌연변이, 항균, 항우울, HIV-1 억제, 항산화, 및 항바이러스 성질을 나타냈다. 이들 성질은 RA를 약제 및 화장품 산업이 주목하는 성분이 되게 하였다. RA는 유럽에서는 비-스테로이드성 항염증 약물로서 국소적으로 사용되었다(Ritschel et al. Percutaneous absorption of rosmarinic acid in the rat. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 11: 345-352, 1989). 식품 산업에서 착향료 및 보존제로서의 광범위한 용도로 인해, RA는 매일-소비되는 안전한 성분으로서 간주된다(Alkam et al. A natural scavenger of peroxynitrites, rosmarinic acid, protects against impairment of memory induced by Aβ25-35. Behavioural Brain Research 180: 139-145, 2007).

로즈마린산

RA의 비특이적 보호 성질의 증거는 뇌 내에서 밝혀졌다. 뇌의 향상된 항 산화 활성이 노화 마우스에게 RA 투여한 후, 말로디알데하이드(MDA)가 감소하면서 뇌에서 수퍼옥사이드 디스무타제(SOD) 및 카탈라제(CAT)의 활성을 증가시킨 것으로 나타났다(Shou et al. Rosmarinic acid attenuates D-galactose induced behavior impairment in mice and its mechanism. 2010, p. 1723-1726). 이들 데이터는 항산화제로서 RA의 비특이적 보호 성질을 입증하고 있으나, 특정 영역에서 또는 특정 임상 결과에 대해 RA가 뇌에 영향을 미칠 수 있음을 입증하는 이전의 데이터는 존재하지 않는다.

생체 내, 세 개의 연구가 RA의 투여를 평가하였다. 이들 연구는 특이적 인지 질병 상태를 나타내는데 사용된 두개내 손상 모델 또는 스트레스 모델에 RA를 경구적으로 또는 IP로 투여하였다(Alkam et al. A natural scavenger of peroxynitrites, rosmarinic acid, protects against impairment of memory induced by Aβ25-35. Behavioural Brain Research 180: 139-145, 2007; Park et al. Subchronic administration of rosmarinic acid, a natural prolyl oligopeptidase inhibitor, enhances cognitive performances. Fitoterapia 81:644-648, 2010; Zhou et al. rosmarinic acid attenuates D-galactose induced behavior impairment in mice and its mechanism. Intl Conf BMEI 4:1723-1726, 2010). RA가 이들 모델에서 이점을 나타냈지만, 이들은 정상적인 노화 인지 변화를 평가하기 위한 검증된 모델(SAMP8에서와 같이)은 아니다. 또한, 항산화 효과로 인해 작용 메커니즘이 특이적인지 비특이적인지 알 수 없다. RA 단독 보충 또는 스피어민트 추출물의 사용을 통해서 평가하는 공개된 인간 연구는 현재 존재하지 않는다.

학습 및 기억은 두 개의 주요 분류, 서술적 및 절차적으로 나뉠 수 있다. 서술적은 시간, 공간, 및 연상 기억 요소를 지닌다. 이는 주의력 및 조심성을 요하는 의식 요소를 갖는 학습 및 기억과 관련된다. 인간에게서, 이는 별개의 사건, 장소, 사람 및 사실의 습득, 인지(recognition), 및 기억과 관련된다. 서술적 학습 및 기억은 최근 기술된 T형 미로 습득, T형 미로 체류, 및 사물 인지를 통한 동물 연구에서 조사되었다. 절차적 학습 및 기억은 서술적 기억 태스크(task)가 관례적이 되거나 습관적이게 되는 경우에 형성될 수 있으며, 레버 프레스를 통한 최근 동물 연구에서 조사되었다. 이는 인간에게서 취미나 기술, 예컨대 자전거 타기인 의식적 요소를 갖지 않은 학습 및 기억과 관련된다. 서술적 태스크는 해마 개시로서 여겨지는 반면, 절차적 태스크는 주로 뇌의 미상핵 영역과 연관된다.

노화로 인한 인지 영향을 평가함에 있어서, 노화 촉진 마우스(senescence accelerated mouse-prone 8)(SAMP8)는 8개월령에 의해 학습 및 기억에서의 결핍이 일어나는 입증된 노화 촉진 모델이다(Yagi H, Katoh S, Akiguchi I, Takeda T (1988) Age-related deterioration of ability of acquisition in memory and learning in senescence accelerated mouse: SAM-P/8 as an animal model of disturbances in recent memory. Neurosci Biobehav Rev. 474, 86-93; Flood JF, Morley JE (1998) learning and memory in the SAMP8 mouse. Neurosci Biobehav Rev. 22, 1-20). SAMP8 마우스는 뇌에서 아밀로이드 전구체 단백질(AβPP) 및 아밀로이드 베타(Aβ)의 연령 관련 증가, 및 중추신경계에서 자유 라디칼 생성을 유도하는 자연 돌연변이를 지녀서 학습 및 기억 결핍을 초래한다(Butterfield DA, Howard BJ, Yatin S, Akkeb KL, Carney JM (1997) Free radical oxidation of brain proteins in accelerated senescence and its modulation by N-tert-butyl-α-phenylnitrone. Prac Natl Acad Sci USA. 94, 674-678; Sato E, Kurokawa T, Oda N, Ishibashi S (1996) Early appearance of abnormality of microperoxisomal enzymes in the cerebral cortex of senescence-accelerated mouse. Mech Ageing Dev. 92, 175-184). SAMP8 모델은 문헌에서 여러 영양 성분, 보충제 및 약물의 인지 이점을 평가하기 위해 사용되었다. 몇몇 예로는 알파-리오인산, n-아세틸시스테인(Farr SA, Poon HF, Dogrukol-Ak D, Drake J, Banks WA, Eyerman E, Butterfield DA, Morley JE (2003) The antioxidants α-lipoic acid and N-acetylcysteine reverse memory impairment and brain oxidative stress in aged SAMP8 mice. J Neurochemistry. 84, 1173-1183), 다중불포화 지방산(Petursdottir AL, Farr SA, Morley JE, Banks WA, Skuladottir GV (2008) Effect of dietary n-3 polyunsaturated fatty acid on brain lipid fatty acid composition, learning ability, and memory of senescence-accelerated mouse. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 63, 1153-1160) 및 메만틴(memantine)(Zhou, M., Wang, M. -., & Wang, X. -.(2010). Effects of memantine combined with enriched environment therapy on learning and memory abilities and the mental behavior in senescence accelerated mouse. Journal of Clinical Neurology, 23(6), 438-441))이 있으며, 이들 모두는 후속 인간 임상 실험에서 긍정적인 인지 이점이 입증되었다(Volchegorskii, I. A., Rassokhina, L. M., Kolyadich, M. I., & Alekseev, M. N. (2011). Comparative study of alpha-lipoic acid and mexidol effects on affective status, cognitive functions and quality of life in diabetes mellitus patients. Eksperimental'Naya i Klinicheskaya Farmakologiya, 74(11), 17-23; Chan, A., Remington, R., Kotyla, E., Lepore, A., Zemianek, J., & Shea, T. B. (2010). A Vitamin/nutriceutical formulation improves memory and cognitive performance in community-dwelling adults without dementia. Journal of Nutrition, Health and Aging, 14(3), 224-230; Small, G. W., Silverman, D. H. S., Siddarth, P., Ercoli, L. M., Miller, K. J., Lavretsky, H., Phelps, M. E. (2006). Effects of a 14-day healthy longevity lifestyle program on cognition and brain function. American Journal of Geriatric Psychiatry, 14(6), 538-545; Litvinenko, I. V., Odinak, M. M., Mogil'Naya, V. I., & Perstnev, S. V. (2010). Use of memantine (akatinol) for the correction of cognitive impairments in Parkinson's disease complicated by dementia. Neuroscience and Behavioral Physiology, 40(2), 149-155). 인지 성분 및/또는 약물을 평가하는 신경과학자들은 SAMP8가 후속 인간 임상 실험에서 이들의 효능을 예측하는데 성공적으로 이용된 유효 동물 모델임을 인지하였다.

발명의 개요

본 발명은 식물로부터 추출된 카르노스산 및/또는 로즈마린산을 투여하여 학습, 기억, 실행 능력(즉, 작업 기억, 태스크 전환, 계획, 융통성, 시각 주의력, 수학 실력 및 새롭고 변화하는 상태, 환경 및 상황을 인지하고 적응하는 능력) 및 인지 관련 행동(즉, 집중력, 주의력, 조심성, 탐구심, 동기부여 등)을 향상시키는 것으로 이루어진다. 카르노스산을 지닌 로즈마리 추출물은 향상된 서술적 기억 및 절차적 학습 및 기억을 나타낸다. 포유동물에서, 이것이 별개의 사건, 장소, 사람 및 사실의 증진되거나, 향상되거나, 유지된 기억으로서 관찰될 수 있다. 또한, 습관적 정보 또는 기술을 학습하고 보유하는 능력이 아마도 개선된 연상 능력의 결과로서 향상하는 것으로 관찰될 수 있다. 로즈마린산을 지닌 스피어민트 추출물은 서술적 학습 및 기억에서의 향상을 나타낸다. 포유 동물에서, 이는 별개의 사건, 장소, 사람 및 사실의 증진되거나 향상된 학습으로서, 이러한 것들의 증진되고 보유된 기억과 함께 관찰될 수 있다.

산화적 손상은 노과 과정의 특징 중 하나인 것으로 간주된다. 노화와 연관된 인지 손상에 존재하는 신경 기능장애는 대체적으로 산화적 스트레스에 기인하는 것으로 여겨진다. 미토콘드리아에 대한 구조적 및 기능적 손상 둘 모두가 인지 장애, 예컨대 알츠하이머병에 존재하며, 이는 세포 및 미토콘드리아 둘 모두를 침투하여 항산화제가 산화적 스트레스로부터 가장 잘 보호할 것임을 시사한다. 본 연구는 두 가지 신규의 독점 항산화제 기반 성분, 즉, 카르노스산 및 로즈마린산으로 표준화된 로즈마리 추출물 및 스피어민트 추출물이 각각 노화 촉진된 SAMP8 마우스 모델에서 학습 및 기억을 향상시킬 수 있는 지를 시험하기 위해 구성되었다. 본 발명자들은 이미 SAMP8 마우스에서의 학습 및 기억 결핍을 향상시키는 항산화제의 능력 및 산화적 손상의 반대 표시를 보여주었으며; 이에 따라 SAMP8 마우스는 이들 항산화제 화합물을 시험하기 위한 우수한 모델이다. SAMP8 마우스를 세 가지 추출물 중 하나에 배치한다. 두 개의 로즈마리 추출물이 카르노스산(60% 카르노스산 및 10% 카르노스산)을 함유하였고, 하나의 스피어민트 추출물이 5% 로즈마린산을 함유하였다. 각 추출물의 세 가지 투여량을 시험하였다: 32 mg/kg, 16 mg/kg, 1.6 mg/kg의 활성물질(각각 로즈마리 및 스피어민트 추출물에 대한 CA 또는 RA) 및 비히클 대조군. 50% SAMP8 여교배(backcross) 균주가 또한 비히클을 수용한 대조군으로서 역할을 하였다. 처리 90일 후, 마우스를 3가지 행동 시험, 즉, T형 미로 풋 쇼크 회피(foot shock avoidance), 사물 인지 및 레버 프레스로 시험하였다. 60% 카르노스산을 함유하는 로즈마리 추출물은 T형 미로 풋 쇼크 회피에서 32 mg/kg CA에서 습득을 향상시키고, 활성 물질의 세 가지 투여량 모두에서 체류를 향상시켰으며, 16 및 32 mg/kg CA에서 사물 인지 및 레버 프레스를 향상시킬 수 있었다. 10% 카르노스산을 지닌 로즈마리 추출물은 T형 미로 풋 쇼크 회피 (16 mg/kg CA)에서 체류를, 그리고, 16 및 32 mg/kg CA에서 레버 프레스를 향상시켰다. 5% 로즈마린산을 지닌 스피어민트는 T형 미로에서 습득(16 및 32 mg/kg RA), 및 체류(RA의 모든 투여량에서)를 향상시켰다. 또한, 5% 로즈마린산을 지닌 스피어민트는 16 및 32 mg/kg RA에서 사물 인지를 향상시켰다. 4-하이드록시노네날(HNE)이 비히클 처리된 SAMP8과 비교하여 세가지 모든 추출물로의 처리 후에 대뇌 피질에서 감소되었다. 단백질 카르보닐은 10% 카르노스산을 지닌 로즈마리 및 5% 로즈마린산을 함유하는 스피어민트의 투여 후 해마에서 감소되었다. 이러한 결과는 스피어민트(로즈마린산) 및 로즈마리 (카르노스산)으로부터의 추출물이 학습 및 기억, 그리고 SAMP8 마우스의 연령에 따라 발생하는 산화에 대한 뇌 조직 마아커(marker)에 대해 유리한 영향을 미침을 나타낸다.

도 1은 T형 미로 습득, T형 미로 체류, 사물 인지 및 레버 프레스에 대한 60% 카르노스산의 영향에 대한 챠트를 제공한 것이다.
도 2는 60% 카르노스산을 함유하는 로즈마리 추출물의 투여 후 뇌의 피질에서의 산화적 스트레스 마아커에 대한 챠트를 제공한 것이다; 이 결과는 SAMP8 비히클 대조군으로부터의 변화율로 표현된다; *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01를 나타낸다.
도 3은 60% 카르노스산을 함유하는 로즈마리 추출물의 투여 후 뇌의 선조체에서의 산화적 스트레스 마아커에 대한 챠트를 제공한 것이다; 이 결과는 SAMP8 비히클 대조군으로부터의 변화율로 표현된다; *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01를 나타낸다.
도 4는 60% 카르노스산을 함유하는 로즈마리 추출물의 투여 후 뇌의 해마에서의 산화적 스트레스 마아커에 대한 챠트를 제공한 것이다; 이 결과는 SAMP8 비히클 대조군으로부터의 변화율로 표현된다; *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01를 나타낸다.
도 5는 T형 미로 습득, T형 미로 체류, 사물 인지 및 레버 프레스에 대한 10% 카르노스산 영향에 대한 챠트를 제공한 것이다.
도 6은 10% 카르노스산을 함유하는 로즈마리 추출물의 투여 후 뇌의 피질에서의 산화적 스트레스 마아커에 대한 챠트를 제공한 것이다; 이 결과는 SAMP8 비히클 대조군으로부터의 변화율로 표현된다; *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01를 나타낸다.
도 7은 10% 카르노스산을 함유하는 로즈마리 추출물의 투여 후 뇌의 선조체에서의 산화적 스트레스 마아커에 대한 챠트를 제공한 것이다; 이 결과는 SAMP8 비히클 대조군으로부터의 변화율로 표현된다; *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01를 나타낸다.
도 8은 10% 카르노스산을 함유하는 로즈마리 추출물의 투여 후 뇌의 해마에서의 산화적 스트레스 마아커에 대한 챠트를 제공한 것이다; 이 결과는 SAMP8 비히클 대조군으로부터의 변화율로 표현된다; *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01를 나타낸다.
도 9는 T형 미로 습득, T형 미로 체류, 사물 인지 및 레버 프레스에 대한 5% 로즈마린산 영향에 대한 챠트를 제공한 것이다.
도 10은 5% 로즈마린산을 함유하는 로즈마리 추출물의 투여 후 뇌의 피질에서의 산화적 스트레스 마아커에 대한 챠트를 제공한 것이다; 이 결과는 SAMP8 비히클 대조군으로부터의 변화율로 표현된다; *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01를 나타낸다.
도 11은 5% 로즈마린산을 함유하는 로즈마리 추출물의 투여 후 뇌의 선조체에서의 산화적 스트레스 마아커에 대한 챠트를 제공한 것이다; 이 결과는 SAMP8 비히클 대조군으로부터의 변화율로 표현된다; *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01를 나타낸다.
도 12은 5% 로즈마린산을 함유하는 로즈마리 추출물의 투여 후 뇌의 해마에서의 산화적 스트레스 마아커에 대한 챠트를 제공한 것이다; 이 결과는 SAMP8 비히클 대조군으로부터의 변화율로 표현된다; *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 연구는 로즈마리 추출물(CA를 지님) 및 스피어민트 추출물(RA을 지님)이 주의력, 조심성, 인지, 회상, 반응 시간, 집중력, 동기부여, 행동, 실행 능력, 학습 및 기억을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아닌 인지 건강 및/또는 인지 기능의 모든 측면을 향상시킬 수 있는 지를 시험하기 위해 구성되었다. CA 및 RA 분자는 다음과 같은 이들의 독특한 성질로 인해 특별히 선택되었다: 1) 이들 분자의 혈뇌 장벽을 가로지르는 능력; 2) 상이한 용해도(오일 대 물); 및 3) 증진된 항산화능력. 두 추출물을 SAMP8 마우스 균주(노화 촉진 마우스 모델)에서 시험하였다. SAMP8 마우스 균주는 베타 아밀로이드 플라크 발생 및 산화적 스트레스로 비롯된 치매로 인한 조기 발생 학습 및 기억 결핍을 나타낸다. 50% SAM 마우스는 대조군으로서 역할을 하였다.

정의

본 출원에서 사용되는 하기의 용어는 다음에서 언급된 의미를 지닌다.

조심성: 면밀하고, 지속적인 주의를 기울이고, 위험 또는 비상사태를 대처하는 것이 조심스럽고 신속하고, 인지하고 행동하는 것이 빠른 상태.

인지 건강: 인지 건강은 전체 뇌, 조직, 및 혈액 공급의 건강 뿐만 아니라 여러 조건 하에서 적절히 기능하는 그 능력을 나타낸다. 양호한 인지 건강은 학습, 직관력, 판단력, 언어, 주의력, 조심성, 집중력 및 기억(장기 및 단기)을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아닌 모든 정신적 과정을 뇌가 종합적으로 최상의 성능으로 수행하는데 중요하다. 노화, 질병 및/또는 그 밖의 인지 손상으로 인한 저하된 인지 건강은 적절하게 기능하는 뇌의 능력을 저하시켜 인지 기능 및 성능을 상당히 감퇴시킨다.

인지 기능: 소통, 인지, 이해, 추리, 기억, 사고, 의식, 집중, 주의력, 조심성, 동기부여, 결론 도출(drawing conclusion), 실행 능력, 이미지 구축 및 판단 능력을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아닌 신경적 또는 상징적 작업과 관련된 어떠한 정신적 또는 지적 과정. 동물 모델 시스템에서, 인지 기능은 수중 미로(Morris Water Maze)(MWM), 반즈 원형 미로(Barnes circular maze), 고가식 방사형 미로(elevated radial arm maze), T형 미로, 또는 동물이 공간 정보를 이용하는 어떠한 그 밖의 미로를 포함하여 당해 공지되어 있는 여러 통상적인 방법으로 측정될 수 있다. 당해 공지되어 있는 그 밖의 실험은 또한 인지 기능, 예컨대 새로운 사물 인지 및 냄새 인지 태스크를 평가하는데 사용될 수 있다.

실행 능력: 계획, 작업 기억, 주의력, 문제 해결, 언어 추리, 수학 능력, 억제력, 정신적 융통성, 태스크 전환, 개시, 융통성, 시각 주의력, 수학 실력, 새롭고 변화하는 환경에 대한 적응력 및 행동 감시와 같은 그 밖의 인지 과정을 조절하고, 제어하고, 대처하는 인지 과정.

학습: 지식 또는 기술을 얻는 활동, 과정 또는 경험; 특히 경험 또는 컨디셔닝(conditioning)을 통한 심리 또는 행동 수정.

기억: 사람의 마음 속에 저장된 지난 학습 또는 경험으로부터 얻은 정보의 집합. 기억 속에 저장된 경험의 심상(mental image)과 같은 한 가지 정보. 학습, 체류, 회상, 및 인식과 같은 고급 정신 과정을 포함하고, 해마를 포함하는 뇌의 여러 상이한 영역에서의 신경 세포 간의 화학적 변화로부터 비롯되는 지난 경험 또는 학습된 정보를 기억하는 능력. (1) 사실 및 지식과 같은 의식적으로 회상될 수 있는 것을 나타내는 서술적 학습 또는 기억, (2) 여러 가지 순간적 정보들이 조종될 수 있는 마음 속에 그러한 정보들을 적극적으로 잡아두는 것을 나타내는 작업 기억, (3) 최근이거나 오래 전인 이전의 경험으로부터 얻은 정보를 나타내는 참조 기억, (4) 이전의 접한 사건, 사물, 또는 사람들을 인지하는 능력인 인지 기억 및 (5) 비관련 사항들 간의 관련성을 알고 기억하는 능력인 연상 기억이 포함된다. 이들 각각은 즉시, 단기 및 장기 요소를 지닌다. 즉시 기억은 단지 수초 동안 지속한다. 단기 기억은 최소 처리된 정보를 저장하고, 전화 번호를 단지 그것을 사용하는 기간 정도로 기억하는 것과 같이 단지 수분 동안만 이용가능하다. 단기 기억은 정보의 반복된 사용이 그 정보가 보유되도록 하는 신경화학적 변화를 촉진시키는 경우에만, 수년 동안 지속할 수 있는 장기 기억으로 넘어간다.

치료 유효량: 본 발명의 화합물 또는 조성물 또는 이들의 유도체의 양은 피검체에 투여되는 경우, 의도된 치료 효과를 지니게 될 양이다. 어느 하나의 투여량의 투여에 의해 완전한 치료 효과가 반드시 일어나는 것은 아니며, 일련의 투여량의 투여 후에만 일어날 수 있다. 따라서, 치료 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 피검체에 필요한 정확한 유효량은 예를 들어, 피검체의 치수, 건강 및 나이, 인지 손상의 특성 및 정도, 및 투여를 위해 선택된 치료제 또는 치료제의 조합, 및 투여 방식에 의거할 것이다. 숙련가들은 통상의 실험에 의해 제시된 상황에 대해 효과적인 양을 용이하게 결정할 수 있다. 일 구체예에서, 본원에서 기술되는 식물 꿀풀과(Lamiaceae family)의 적어도 하나의 추출물, 예를 들어, CA, RA 또는 이들의 여러 조합물은 일일 빈도, 또는 일일 1회 초과, 예를 들어, 일일 2회, 3회 또는 4회로 투여된다.

치료: 치료받는 개인, 동물 또는 세포의 자연스러운 과정을 변경하려는 시도에서의 임상 중재이며, 예방을 위해 또는 임상병리 과정 중에 수행될 수 있다. 바람직한 효과는 질병의 발병 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질병의 어떠한 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 약화, 질병 진행 속도를 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 차도(remission) 또는 개선된 예후를 포함한다. 상태 또는 피검체가 임상 결과를 포함하는 유리한 또는 요망하는 결과를 얻기 위한 단계를 취하는 것과 관련이 있다. 유리한 또는 요망하는 임상 결과는 인지 건강 및/또는 기능 증진, 향상 또는 유지, 경도 인지 손상, 또는 연령 관련 인지 손상과 관련된 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 그러한 손상의 지연 또는 늦춤, 그러한 손상의 개선, 경감 또는 안정화, 및 그 밖의 유리한 결과, 예컨대 인지 기능 향상 또는 연령 관련 인지 손상 또는 이의 위험에 처한 피검체에서의 인지 기능 감퇴의 감소된 속도를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직한 구체예에서, 이들 용어는 인지 장애, 예컨대 난독증(dyslexia), 실행증, 주의력 결핍 과잉 장애, 주의력 결핍 장애 자폐증, 알츠하이머, 파킨슨병 또는 뇌졸중, 또는 그 밖의 실행 능력 장애의 예방 또는 치료를 포함한다.

실시예 1

산화적 손상은 노화 과정의 특징 중 하나인 것으로 간주된다[Harman D (2002) Alzheimer's disease: role of aging in pathogenesis. Ann N Y Acad Sci . 959, 384-395]. 알츠하이머병과 같은 노화 관련 질병에 존재하는 신경세포 기능장애는 대체적으로 산화적 스트레스에 기인하는 것으로 여겨진다[Markesbery WR (1997) Oxidative stress hypothesis in Alzheimer's disease. Free Radic Biol Med. 23, 134-147; Polidori MC, Griffiths HR, Mariani E, Mecocci P (2007) Hallmarks of protein oxidative damage in neurodegenerative diseases: focus on Alzheimer's disease. Amino Acids. 32, 553-559]. 미토콘드리아에 대한 구조적 및 기능적 손상 둘 모두가 인지 장애, 예컨대 알츠하이머병에 존재하며, 이는 세포 및 미토콘드리아 둘 모두를 용이하게 침투하여 항산화제가 산화적 스트레스로부터 가장 잘 보호할 것임을 시사한다[Skulachev VP, Anisimov VN, Antonenko YN, Bakeeva LE, Chernyak BV, Erichev VP, Filendo OF, Kalinia NI, Kapelko VI, Kolosova NG, Kopin BP, Korshunova GA, Lichinitser MR, Obukhova LA, Pasyukova EG, Pisarenko OI, Roginsky VA, Ruuge EK, Senin II, Severina II, Skulachev MV, Spivak IM, Tashlitsky VN, Tkachuk VA, Vyssokikh MY, Yaguzhinsky LS, Zorov DB (2009) An attempt to prevent senescence: a mitochondrial approach. Biochim Biophys Acta. 1787, 437-461; Suh JH, Shigeno ET, Morrow JD, Cox B, Rocha AE, Frei B, Hagen TM (2001) Oxidative stress in the aging rat heart is reversed by dietary supplementation with (R)-(alpha)-lipoic acid. FASEB J. 15, 700-706]. 노화 촉진 마우스(SAMP8)는 8개월령에 의한 학습 및 기억에서의 결핍이 일어난 노화 촉진 모델이다[Yagi, et al., 1988; Flood, et al., 1998]. SAMP8 마우스는 뇌에서 아밀로이드 전구체 단백질(AβPP) 및 아밀로이드 베타(Aβ)의 연령 관련 증가, 학습 및 기억 결핍 및 산화적 스트레스를 유도하는 자연 돌연변이를 지닌다. 또한, AβPP에 대한 안티센스는 이들 마우스에서 기억 및 학습을 증진시킨다[Morley JE, Farr SA, Flood JF (2002) Antibody to amyloid beta protein alleviates impaired acquisition, retention, and memory processing in SAMP8 mice. Neurobiol Learn Mem . 78, 125-38; Kumar VB, Farr SA, Flood JF, Kamelesh V, Franko M, Banks WA, Morley JE (2000) Site-directed antisense oligonucleotide decreases the expression of amyloid precursor protein and reverses deficits in learning and memory in aged SAMP8 mice. Peptides. 21, 1769-1775]. 또한, SAMP8 마우스는 미토콘드리아 기능장애[Fujibayashi Y, Yamamoto S, Waki A, Jibusgu Hm Yonekura Y (1998) Increased mitochondrial DNA deletion in the brain of SAMP8, a mouse model for spontaneous oxidative stress brain. Neurosci Lett . 254, 109-112]와 관련된 중추 신경계에서 증가된 자유 라디칼 생성을 지닌다[Butterfield, et al., 1997; Sato, et al., 1996].

항산화제는 SAMP8 마우스에서 학습 및 기억 결핍을 반전시키는 것으로 밝혀졌다. 알파-리포산 및 n-아세틸 시스테인은 이들 마우스에서 기억을 증진시키고, 산화적 스트레스의 지표를 반전시킨다[Farr, et al., 2003]. 알파-리포산은 락테이트 탈수소효소 B, 디하이드로 피리민다제-유사 단백질 및 알파 에놀라제의 카르보닐 수준을 현저히 감소시켰다[Poon HF, Farr SA, Thongboonkerd V, Lynn BC, Banks WA, Morley JE, Klein JB, Butterfield DA (2005) Proteomic analysis of specific brain proteins in aged SAMP8 mice treated with alpha-lipoic acid: implications for aging and age-related neurodegenerative disorders. Neurochem Int. 45, 159-68]. 폴리페놀 항산화제는 또한 SAMP8 마우스에서 학습 및 기억을 향상시키고, 산화적 스트레스의 지표를 반전시키는 것으로 밝혀졌다[Farr SA, Price TO, Domnguez LJ, Motisi A, Saiano F, Niehoff ML, Morley JE, Banks WA, Ercal N, Barbagallo M (2012) Extra virgin olive oil improves learning and memory in SAMP8 mice. J Alzheimer's Dis 28, 81-92].

카르노스산(CA) 및 로즈마린산(RA)은 산화적 스트레스에 대해 신경보호적 및 예방적인 것으로 밝혀졌다[Fadel O, El Kirat K, Morandat S (2011) The natural antioxidant rosmarinic acid spontaneously penetrates membranes to inhibit lipid peroxidantion in situ. Biochim Biophys Acta 1808, 2973-2980; Fallarini S, Miglio G, Paoletti T, Minassi A, Amoruso A, Bardelli C, Brunelleschi S, Lombardi G (2009) Clovamide and rosmarinic acid induce neuroprotective effects in invitro models of neuronal death. Br J Pharmacol 157, 1072-1084; Hou CW, Lin YT, Chen YL, Wang YH, Chou JL, Ping LY, Jeng KC (2012) Neuroprotective effects of carnosic acid on neuronal cells under ischemic and hypoxic stress. Nutr Neurosci [Epub]]. 카르노스산은 또한 LPS 투여 후 항염증 효과를 지닌다[19]. 산화적 스트레스 및 염증에 대한 보호는 노화 질병에서 향상된 기억과 관련된다[Farr, et al., 2012]. 로즈마린산은 모리스 수중 미로 공간 태스크에서 기억을 향상시켰다[Park DH, Park SJ, Kim JM, Jung WY, Ryu JH (2010) Subchronic administration of rosmarinic acid, a natural prolyl oligopeptidase inhibitor, enhances cognitive performance. Fitoterapia 81, 644-648].

기억은 크게 두 카테고리, 즉, 서술적(또는 명시적 기억) 및 절차적(또는 암묵적 기억)으로 나뉜다. 서술적 기억은 추가로 의미적(사실 또는 의미) 및 일화적(특정 경험)으로 세분된다. 의미적 기억은 일반적으로 일화적 기억으로부터 유래된다. 서술적 기억은 해마에 의해 암호화되는 것으로 여기지는 반면, 절차적 기억은 선조체내 구조물인 미상핵에 의해 암호화되는 것으로 여겨진다. 절차적 또는 암묵적 기억은 응답과 보상 간의 연관을 학습하는 것으로부터 나온다. 절차적 기억은 종종 그것들이 몸에 배거나 습관이 될 때까지 서술적 기억으로서 출발한다.

T형 미로 풋 쇼크 회피 태스크는 서술적 일화적 기억을 나타낸다. 그것은 시간, 공간, 및 연상 기억 요소를 지닌다. 마우스는 쇼크의 시작으로 문 개방 및 버저(buzzer)를 연관시키는 것을 배워야 한다[Farr SA, Banks WA, La Scola ME, Flood JF, Morley JE (2000) Permanent and temporary inactivation of the hippocampus impairs T-maze footshock avoidance acquisition and retention. Brain Res. 872, 242-249]. 마우스는 또한 쇼크를 탈출하거나 피하기 위해 좌측으로 돌지 아니면 우측으로 돌지를 배워야 한다. 끝으로, 그것은 마우스가 물 열림과 동시에 버저 시작시, 쇼크를 피하기 위해 골 박스(goal box)(통로 끝에서 좌측 또는 우측 상)로 달려가는데 5초가 걸림을 학습한다는 점에서 시간적 요소를 지닌다.

사물 인지 기억은 서술적 또는 명시적 기억의 형태이다. 그것은 이전에 접한 사건, 사물 또는 사람을 알아보는 능력이다[Medina JH, Bekinschtein P, Commarota M, Izquierdo I (2008) Do memories consolidate to persist or do they persist to consolidate? Behav Br Res 192:61-69]. 이러한 태스크에서, 마우스가 보았던 이전의 사물을 기억하는 마우스는 체류 시험에서 신규 또는 새로운 사물을 탐험하는 시간의 양을 보다 많이 소비할 것이다. 이 시험은 또한 해마 시험이다. 연구에서 해마 내 병변이 첫번째 노출 후 24시간 후 기억 결핍을 초래함을 나타내었다[Hammond RS, Tull LE, Stachman RW (2004) On the delay-dependent involvement of the hippocampus in object recognition. Neurbiol Learn Mem 82, 26-34]. 인지를 평가하는 사람 시험은 주제 단어 목록 또는 사물을 보여준 후, 체류 시험을 하자 마자 일부 단어 또는 사물을 바꾸고, 그들이 이전에 접하였던 것들을 확인하도록 피검체에 질문한다.

레버 프레스는 조작 태스크이다. 마우스는 레버 누름을 음식 보상과 연관짓는 것을 배운다. 초기에, 이 시험은 연관을 짓도록 서술적 기억을 이용하지만, 연관이 지어지면, 주로 뇌의 미상핵 영역과 관련된 절차적 태스크가 된다[Beninger RJ, Ranaldi R (1993) Microinjectiosn of flupenthixol into the caudate-putamen but not the nucleus accumbens, amygdala or frontal cortex of rats produce intra-session declines in food-rewarded operant responding Behav Brain Res 55, 203-212]. 때때로, 레버 프레스는 그 발명자의 이름 다음에 스키너 박스(Skinner box)로서 언급된다.

본 연구는 로즈마리 추출물 및 스피어민트 추출물에서 존재하는 이들 두 가지 신규한 항산화제, 즉, 카르노스산 및 로즈마린산이 각각 노화 촉진된 SAMP8 마우스 모델에서 학습 및 기억을 향상시킬 수 있는 지를 시험하기 위해 구성되었다. 본 발명자들은 이미 SAMP8 마우스에서의 학습 및 기억 결핍을 향상시키는 항산화제의 능력 및 산화적 손상의 반대 표시를 보여주었으며[Farr, et al., 2003; Morley JE, Armbrecht HJ, Farr SA, Kumar VB (2012) The senescence accelerated mouse (SAMP8) as a model for oxidative stress and Alzheimer's disease. Biochim Biophy Acta 1822]; 이에 따라 SAMP8 마우스는 이들 항산화제 화합물을 시험하기 위한 우수한 모델이다[Farr SA, Yamada KA, Butterfield DA, Abdul HM, Xu L, Miller NE, Banks WA, Morley JE (2008) Obesity and hypertriglyceridemia produce cognitive impairment. Endocrinology 149, 2628-2636].

재료 및 방법

마우스.

치료의 시작에서, 실험용 피검체는 9개월령의 SAMP8 마우스였다. 대조군은 수컷 SAMP8와 학습 및 기억에서 연령 관련 손상을 나타내지 않는 암컷 CD-1 마우스 간 교배된, 9개월령 50% SAM 마우스였다. 이들 연구는 동물운영위원회(Animal Care and Use Committee, VA Medical Center, St. Louis, MO)의 승인을 얻어 수행되었다.

치료.

9개월령 SAMP8 마우스에 60% 또는 10% CA 함유 로즈마리 추출물(해바라기 오일 중의) 또는 5% RA 함유 스피어민트 추출물(수중)을 12주 동안 경구 섭식을 통해 일일 1회 주입하였다.

마우스를 7개의 군으로 준비하였다:

1. SAMP8에 60% CA (CA60)를 함유하는 로즈마리 추출물을 투여함;

2. SAMP8에 10% CA (CA10)를 함유하는 로즈마리 추출물을 투여함;

3. SAMP8에 5% RA (RA5)를 함유하는 스피어민트 추출물이 투여함;

4. SAMP8에 군 1 및 2에 대한 네가티브 대조군으로서 해바라기오일을 투여함;

5. SAMP8에 군 3에 대한 네가티브 대조군으로서 물을 투여함;

6. SAMP 50% 여교배에 군 1 및 2에 대한 포지티브 대조군으로서 해바라기오일을 투여함; 및

7. SAMP 50% 여교배에 군 3에 대한 포지티브 대조군으로서 물을 투여함.

투여량-반응 곡선이 각각의 시험된 추출물에 대해 작성되었다. 평가된 투여량은 활성 물질(각각 로즈마리 및 스피어민트로부터의 CA 또는 RA) 및 상기 열거된 세 가지 추출물 각각에 대한 비히클군 1.6 mg/kg, 16 mg/kg, 32 mg/kg이었다. 체중을 연구 전반에 걸쳐 매주 기록하였고, 행동 시험을 먹이 주기 12주째에 시작하였다.

행동 시험.

행동 시험은 치료 한지 12주째에 시작하였다. 마우스를 먼저 12주 동안 T형 미로 풋 쇼크 회피로 훈련시키고(T형 미로 습득), 이 태스크의 T형 미로 체류를 13주에 시험한 후, 13주에 사물 인지를 시험하였다. 레버 프레스를 14 주 및 15주에 수행하였다.

T형 미로 훈련 및 시험 절차

T형 미로는 작업-기억을 토대로 하는 학습 태스크 및 서술적 참고-기억 태스크 둘 모두이다. T형 미로는 T자-형상의 아암의 한 단부에 있는 출발 박스와, 다른 단부에 있는 두 개의 골 박스를 지닌 검정 플라스틱 통로로 구성되었다. 출발 박스는 그것이 훈련 착수시에 올려질 때까지 통로 아래쪽으로 이동하는 것을 방지하는 플라스틱 길로틴(guillotine) 문에 의해 통로로부터 분리되어 있다. 스테인레스강 막대로 된 전기가 통할 수 있는 바닥이 미로 전체에 걸쳐 형성되어 있다.

마우스는 훈련 전에 미로를 탐험하도록 허용되지 않았다. 훈련 시도는 마우스가 출발 박스에 배치되면 시작하였고, 길로틴 문이 올려지고, 큐 버저(cue buzzer)가 동시에 울리고; 5초 후에 풋-쇼크가 가해졌다. 최초 시도에 대해 마우스에 의해 진입된 미로의 아암을 "부정확(incorrect)" 박스로 표시하였으며, 마우스가 다른 골 박스에 들어갈 때까지 경도의 풋-쇼크를 지속하였다. 이 골 박스를 이후 모든 시도에서 특정 마우스에 대해 "정확"으로서 표시하였다. 각 시도의 종료시에, 마우스를 다음 시도 때까지 그것의 홈케이지(home cage)에 되돌려 보냈다.

마우스를 어느 한 회피를 할 때까지 훈련시켰다(T형 미로 습득). 시도 간 35초 간격으로 훈련을 수행하였고, 도어-벨 타입(door-bell type)의 버저가 55 dB로 울렸으며, 쇼크는 0.35 mA로 설정되었다(Coulbourn Instruments scrambled grid floor shocker model E13-08). T형 미로 체류는 훈련을 계속함으로써 일주일 후에 시험하였다. 결과는 체류 시험 기준에 대한 시도 횟수로서 기록하였다. 기준은 6회 연속 시도에서 경도의 풋-쇼크 5회를 회피하는 것으로서 규정된다.

사물- 장소 인지

사물-장소 인지는 여기서 수행되는 바와 같이, 초기 사물 노출 후 체류 노출 간격이 24시간인 경우 해마와 관련된 서술적 기억 태스크이다[Farr, et al., 2012]. 마우스를 사물의 도입 전에 3일 동안 하루에 5분간 빈 장치에 길들어지게 하였다. 훈련 기간 동안, 마우스를 5분간 조사하도록 허용된 두 개의 유사한 사물(플라스틱 개구리)에 노출시켰다. 장치 및 사물이 각각의 마우스 간에 제거되었다. 24시간 후, 마우스를 원래의 사물 중 하나 및 새로운 위치에 있는 새로운 사물에 노출시켰다. 사물을 조사하는데 소비된 시간 %를 기록하였다. 새로운 사물을 원래의 사물과 동일한 물질, 그리고 동일한 크기로, 그러나 다른 모양으로 만들었다. 이것은 혼동 요소인 특정 사물과 관련된 냄새가 날 가능성을 제거하였다. 태스크의 근본적인 개념은 익숙한 사물이 아닌 새롭고 신규한 사물을 탐험하는데 더욱 많은 시간을 보내는 마우스의 경향을 토대로 한다. 따라서, 24시간에서의 체류/기억이 클수록, 새로운 사물에 대해 소비된 시간이 더욱 길다.

우유 보강에 대한 레버 프레스

레버 프레스는 절차적(조작적) 연상 학습 및 기억 태스크이다. 마우스를 완전 자동화 레버 프레스 챔버에 배치하였다. 구획의 한 벽 상에 레버를 누름으로써 마주하는 벽 상에 100㎕ 의 우유가 담긴 가벼운 액체 디퍼(dipper)가 나타나게 하였다. 1일째에, 마우스는 보상을 받는데 11초 걸렸고; 이후 모든 날에, 마우스는 보상을 받는데 6초 걸렸다. 마우스에게 2주 동안 M, W, F 상에서 40분 훈련 기간이 주어졌다. 마우스는 태스크를 수행하는 동기부여를 제공하는 시험의 시작 전에 16시간 먹이가 박탈되었다. 먹이는 기간이 종결되는 즉시 돌려 주었다. 습득은 보상된 레버 프레스의 수로서 측정되었다[Farr SA, Yamada KA, Butterfield DA, Abdul HM, Xu L, Miller NE, Banks WA, Morley JE (2008) Obesity and hypertriglyceridemia produce cognitive impairment. Endocrinology 149, 2628-2636].

뇌 산화적 스트레스

샘플 제조

뇌 샘플을 320 mM 수크로즈, 1% mM 트리스-HCl (pH 8.8), 0.098 mM MgCl₂, 0.076 mM EDTA, 및 프로테나제 억제제 류펩틴(0.5 mg/mL), 펩스타틴(0.7 ㎍/ml), 아프로티닌(0.5 mg/ml) 및 PMSF (40 ㎍/ml)을 함유하는 빙냉된 용해 완충제(ice-cold lysis buffer)(pH 7.4) 및 포스파타제 억제제 칵테일(cocktail) 중에 Wheaton 조직 균질화기를 이용하여 잠시 균질화시켰다. 이후, 균질화된 샘플을 용해 완충제로 2배 희석하였다. 균질화 후, 적은 분취량의 균질화된 샘플을 Fisher 550 Sonic Dismembrator(Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 20% 파워(power)에서 10초 동안 초음파 처리하고, 동결시켰다. 잔류하는 균질화물을 5분 동안 3000 g에서 균질화시키고, 상청액의 사이토솔릭(cytosolic) 및 막성 분획을 또 다른 세트의 튜브로 옮겼다. 400 ㎕의 용해 완충제를 첨가한 후, 잔류하는 펠릿 핵 분획을 5분 동안 3,000 g에서 원심분리시키고, 상청액을 제거하였다. 펠릿을 20 ㎕의 용해 완충제 및 억제제 중에 현탁시켰다. 상청액의 사이토솔릭 및 막성 분획을 10분 동안 10,000 g에서 원심분리시키고, 형성되는 상청액의 사이토솔릭 분획을 또 다른 세트의 튜브에 옮기자 펠릿 막성 분획이 남았다. 모든 초음파 처리된 샘플 및 분획을 추가의 실험에 사용될 때까지 -70℃에서 저장하였다. 피어스 비신코닌산(Pierce Bicinchoninic Acid)(BCA)을 통해 단백질 농도를 측정하였다.

슬롯 블롯 검정

단백질 카르보닐

단백질 카르보닐 검출을 위해, 카르보닐의 2,4-디니트로페닐 하이드라존(DNP) 시프(schiff)-염기 부가물의 슬롯 블롯 분석을 이용하였다. 5 ㎕의 샘플 분취물을 실온에서 5 ㎕의 12% 소듐 도데실 설페이트 및 10 ㎕의 2,4-디니트로페닐하이드라진(OxyBlottm Protein 산화 키트로부터, Chemicon-millipore, Billerica, MA, USA)과 함께 20분 동안 인큐베이팅한 후, 7.5 ㎕의 30% 글리세롤 중 Tris (2 M)를 함유하는 중화 용액을 각 샘플에 첨가하였다. 유도체화시킨 후, 샘플을 염화나트륨, 모노, 및 이염기성 소듐 포스페이트를 함유하는 1x 포스페이트 완충액(PBS)을 사용하여 1 ㎍/mL로 희석하였다. 상응하는 샘플 용액(250 ㎕)을 물 진공 압력을 통해 니트로셀룰로즈 멤브레인 상에 신속하게 이중으로 로딩하였다. 이후, 형성되는 단백질-결합된 니트로셀룰로즈 멤브레인을 35.2 g 염화나트륨, 1.77 g 일염기성 소듐 포스페이트, 9.61 g 이염기성 소듐 포스페이트 및 1.6 mL TWEEN을 함유하는 25ml 워시 블롯(wash blot) 중 750mg의 우혈청 알부민(BSA)을 함유하는 프레시(fresh) 블로킹 용액으로 블로킹하고, 90분 동안 탈이온수를 사용하여 4 L로 희석하였다. 이후, 멤브레인을 폴리클로날 RbxDNP(OxyBlottm Protein 산화 키트로부터, Chemicon-millipore, Billerica, MA, USA, dilution 1:100)과 함께 2시간 동안 워시 블롯 중에서 인큐베이팅하였다. 프레시 워시 블롯으로 3회 5분간 세척한 후, 멤브레인을 이어서 폴리클로날 항-토끼 IgG 알칼리 포스파타제 (Chemicon, Temecula, CA, USA, dilution 1:8000)과 함께 1시간 동안 인큐베이팅하고, 5, 10 및 10분의 세개의 증분으로 프레시 워시 블롯을 사용하여 세척하였다. 세척 후, 멤브레인을 알칼리 포스파타제 2차 항체에 대한 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트/니트로블루 테트라졸륨 시약 용액을 사용하여 비색적으로 디벨로핑(developing)하였다. 디벨로핑 후, 블롯을 건조시키고, Adobe Photoshop 사용하여 CanoScan8800F(Canon) 스캐너(scanner) 상에서 스캐닝하고, Scion Image 소프트웨어(Scion Corporation)를 사용하여 분석하였다.

4- 하이드록시 -2-트랜스- 노네알 ( noneal )( HNE )

단백질-결합된 HNE의 수준을 지질 과산화의 마아커로서 사용하고, 앞서 기술된 바와 같이 측정하였다[29]. 단백질-결합된 HNE 검출의 슬롯 블롯 분석을 위해, 5 ㎕의 샘플 분취물을 실온에서 20분 동안 5 ㎕의 12% 소듐 도데실 설페이트 및 10 ㎕의 Laemmli 완충제와 함께 인큐베이팅한 후, 염화나트륨, 모노 및 이염기성 소듐 포스페이트를 함유하는 1x 포스페이트 완충액 (PBS)을 사용하여 1 ㎍/ml로 희석하였다. 해당 샘플 용액(250 ㎕)을 물 진공 압력을 통해 니트로셀룰로즈 멤브레인 상에 신속하게 이중으로 로딩하였다. 이후, 형성되는 단백질-결합된 니트로셀룰로즈 멤브레인을 90분 동안 프레시 블로킹 용액으로 블로킹하였다. 이후, 멤브레인을 2시간 동안 워시 블롯 중에서 폴리클로날 안티-HNE (Alpha diagnostic, San Antonio, TX, USA, dilution 1:5000)과 함께 인큐베이팅하였다. 프레시 워시 블롯으로 3회 5분간 세척한 후, 멤브레인을 이어서 폴리클로날 항-토끼 IgG 알칼리 포스파타제 (Chemicon, Temecula, CA, USA, dilution 1:8000)과 함께 1시간 동안 인큐베이팅하고, 5, 10 및 10분의 세개의 증분으로 프레시 워시 블롯을 사용하여 세척하였다. 세척 후, 멤브레인을 알칼리 포스파타제 2차 항체에 대한 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트/니트로블루 테트라졸륨 시약 용액을 사용하여 비색적으로 디벨로핑하였다. 디벨로핑 후, 블롯을 건조시키고, Adobe Photoshop 사용하여 CanoScan8800F(Canon) 스캐너 상에서 스캐닝하고, Scion Image 소프트웨어(Scion Corporation)를 사용하여 분석하였다.

3- 니트로티로신 (3-NT)

3-NT 수준을 단백질 산화적 손상의 부가적 마아커로서 사용하였다[Suh, et al., 2001; Butterfield DA, Stadtman ER (1997) Protein oxidation processes in aging brain. Adv Cell Aging Gerontol 2, 161-191]. 샘플(5 ㎕)을 실온에서 20분 동안 5 ㎕의 12% SDS 및 10 ㎕의 Laemmli 완충제(0.125 M Trizma 염기, 4% SDS, 20% 글리세롤) 중에서 인큐베이팅하였다. 슬롯 당 샘플(250 ng의 단백질)을 니트로셀룰로즈 멤브레인 상으로 블로팅하였다. 3-NT에 특이적인 1차 토끼 항체 (Sigma-Aldrich)(1:1000)를 사용하였다. 이후, 동일한 2차 염소 항-토끼(Sigma-Aldrich) 항체를 각각의 1차 항체를 검출하는데 사용하였다. 블롯을 단백질 카르보닐에 대해 상기 기술된 바와 같이 디벨로핑하고, 정량화하였다. 디벨로핑 및 검출을 단백질 카르보닐에 대해 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.

트리글리세라이드

혈청 트리글리세라이드를 선형 종점 색 반응(linear, endpoint color reaction)을 포함하는 Pointe Scientific, Inc.(Canton, MI)로부터의 효소 검정 시스템을 사용하여 정량화하였다. 샘플 중 트리글리세라이드를 리파제에 의해 글리세롤로 가수분해시켰다. 이후, 글리세롤은 글리세롤 키나제 및 ATP에 의해 글리세롤-3-포스페이트 (G₃P) 및 ADP로 포스포릴화된다. G₃P는 디하이드록시아세톤 포스페이트 (DAP) 및 과산화수소로 전환된다. 과산화수소는 퍼옥시다제가 촉매작용하는 반응으로 4-아미노안티피린 (4-AAP) 및 3-하이드록시-2,4,6-트리브로모벤조산 (TBHB)과 반응하여 적색의 퀴논이민 염료를 생성한다. 생성된 색 농도는 Bio-Rad 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Hercules, CA)를 사용하여 540nm에서 측정되었다.

통계

군들 간의 차이를 조사하기 위해 분산 분석(analysis of variance)(ANOVA)을 이용하여 결과를 분석하였다. T형 미로에서의 습득 및 체류의 척도는 기준에 도달하는 시도의 횟수였다. 사물 인지에 대한 결과는 총 탐험 시간으로부터 신규 사물을 탐험하는데 소비된 시간 %로 제시된다. 레버 프레스는 반복 측정 이원 ANOVA에 의해 분석하였다. 결과는 평균 플러스/마이너스 표준 오차로서 표현된다. 투키(Tukey) 또는 본페로니(Bonferroni)의 사후 분석(post hoc analysis)을 사용하여 군들 간의 평균을 비교하였다. 듀넷(Dunnett)법을 사용하여 SAMP8 비히클 대조군과 비교하였다. 뇌 조직 산화적 스트레스 파라미터를 Mann-Whitney U 시험을 이용하여 분석하였다.

결과

60% CA(CA60)을 함유하는 로즈마리 추출물 : 하기에서 논의되는 결과가 도 1에 도시된다.

행동 시험

T형 미로: T형 미로 습득 시험에서 기준으로의 시도에 대한 일원 ANOVA는 상당한 치료 효과를 나타내었다( F(4, 48) 8.98, p<0.001). 본페로니 사후 시험은 32 mg/kg CA가 주입된 SAMP8 마우스가 비히클이 주입된 마우스보다 기준에 도달하는데 상당히 더 적은 시도를 하였음을 나타냈다. 또한, 32 mg/kg CA가 주입된 마우스는 50% SAM 대조군 마우스와 크게 다르지 않았다. T형 미로 체류 시험에서 기준으로의 시도를 위한 일원 ANOVA는 상당한 치료 효과를 나타냈다( F(4,47) = 7.25, p<0.001). 본페로니 사후 분석은 32, 16 및 1.6 mg/kg CA가 주입된 SAMP8 마우스가 비히클 주입된 SAMP8 마우스보다 기준에 도달하는데 상당히 더 적은 시도를 하였음을 나타냈다. 32, 16 및 1.6 mg/kg CA가 주입된 마우스는 50% SAM 마우스와 크게 다르지 않았다.

사물 인지: 24시간 체류 시험에 대해 신규 사물을 탐험하는데 소비된 시간에 대한 일원 ANOVA는 상당한 치료 효과를 나타냈다(F(4,46) = 4.88, p<0.003). 본페로니 사후 시험은 32 및 16 mg/kg CA가 주입된 SAMP8 마우스가 비히클 주입된 SAMP8 마우스보다 신규 사물을 탐험하는데 상당히 더 많은 양의 시간을 소비하였음을 나타냈다. 32 및 16 mg/kg CA가 주입된 SAMP8 마우스는 50% SAM 대조군과 크게 다르지 않았다.

레버 프레스: 보상 레버 프레스 수의 평가인, 치료 및 일(day)에 대한 반복 실험 이원 ANOVA는 치료에 대해 상당한 효과를 나타냈다(F(4,257) = 17.27, P<0.001 및 일 F(5,257) = 15.31, P<0.001). 상호작용 치료 x 일은 유의하지 않았다(F(20,257) = 3.78, NS). 투키 사후 분석은 3, 4, 5 및 6일 째에, 32 mg/kg CA가 주입된 SAMP8 마우스가 비히클 대조군이 주입된 SAMP8 마우스보다 현저히 더 보상 받았음을 나타냈다. 16 mg/kg CA가 주입된 SAMP8 마우스는 비히클 대조군이 주입된 SAMP8 마우스와 비교하여 4, 5 및 6일째에 현저히 더 보상받았다.

트리글리세라이드 수준

트리글리세라이드 수준에 대한 일원 ANOVA는 CA60 투여된 마우스에 대해 유의하지 않았다(F(4,50) = 2.42).

뇌 산화적 스트레스

Mann-Whitney U 시험은 CA60가 비히클 대조군으로서 해바라기 오일이 투여된 SAMP8과 비교하여 1.6 및 32 mg/kg CA에서 피질 내 4-하이드록시노네날(HNE)를 크게 감소시켰음을 나타냈다. 피질 내 3-니트로티로신(3-NT) 또는 단백질 카르보닐에 대해서는 CA60의 유의한 영향을 미치지 않았다(도 2 참조). CA60은 16 mg/kg CA에서 선조체 내 단백질 카르보닐을 크게 증가시켰지만, HNE 또는 3-NT에 대해서는 영향을 미치지 않았다(도 3 참조). CA60는 16 mg/kg CA에서 해마 내 단백질 카르보닐을 크게 증가시켰다. CA60은 해마 내 3-NT에 대해서는 영향을 미치지 않았다(도 4 참조).

10% CA(CA10)을 함유하는 로즈마리 추출물 : 하기에서 논의되는 결과가 도 2에 도시된다.

행동 시험

T형 미로: T형 미로 습득 시험에서 기준으로의 시도에 대한 일원 ANOVA는 군에 대해 상당한 치료 효과를 나타냈다(F(4, 44) F=5.914, p<0.001). 본페로니 사후 시험은 비히클이 주입된 50% SAM 마우스가 32, 1.6 mg/kg CA 또는 비히클이 주입된 SAMP8 마우스보다 기준에 도달하는데 상당히 더 적은 시도를 하였음을 나타냈다. 16 mg/kg CA가 주입된 마우스는 비히클이 주입된 50% SAM 또는 비히클이 주입된 SAMP8 마우스와 크게 다르지 않았다. T형 미로 체류 시험에서 기준으로의 시도를 위한 ANOVA는 상당한 치료 효과를 나타냈다(F(4,44) = 4.04, p<0.007). 듀넷 사후 시험은 16 mg/kg CA가 주입된 마우스가 비히클 주입된 SAMP8 마우스보다 기준에 도달하는데 상당히 더 적은 시도를 하였음을 나타냈다.

사물 인지: 신규 사물을 탐험하는데 소비된 시간에 대한 일원 ANOVA는 유의하지 않았다(F(4,44) = 2.249; p<0.08).

레버 프레스: 보상 레버 프레스 수의 평가인, 치료 및 일에 대한 이원 반복 실험 ANOVA는 치료에 상당한 효과를 나타냈다(F(4,253) = 6.74, P<0.001 및 일 F(5,253) = 7.53, P<0.001). 상호작용 치료 x 일은 유의하지 않았다(F(20,253) = 1.83). 투키 사후 분석은 3, 4, 5 및 6일 째에, 32 mg/kg CA 및 16 mg/kg가 주입된 마우스가 비히클 주입된 마우스보다 현저히 더 보상 받았음을 나타냈다.

트리글리세라이드 수준

트리글리세라이드 수준에 대한 일원 ANOVA는 CA10 투여 후 상당한 효과를 나타냈다(F(4,47) = 3.11, P<0.02). 투키 사후 시험은 50% SAM 마우스가 1.6mg/kg CA가 주입된 SAMP8 마우스보다 현저히 높은 트리글리세라이드 수준을 지녔음을 나타냈다. 어떠한 다른 군들 간에 다른 유의한 차이는 없었다.

뇌 산화적 스트레스

Mann-Whitney U 시험은 CA10이 비히클 대조군인 SAMP8과 비교하여 32 mg/kg CA에서 피닐 HNE를, 16 mg/kg CA에서 피질 내 3-NT를 현저히 감소시키고, 16 및 32 mg/kg CA에서 단백질 카르보닐을 크게 증가시킴을 나타냈다(도 6 참조). 또한, CA10은 선조체에서 HNE, 3-NT, 또는 단백질 카르보닐에 대해 영향을 미치지 않았다(도 7 참조). 끝으로, CA10는 비히클 처리된 SAMP8 대조군과 비교하여 16 mg/kg CA에서 해마 내 3-NT 및 단백질 카르보닐을 크게 감소시켰다(도 8 참조).

5% RA(RA5)를 함유하는 스피어민트 추출물 : 하기에서 논의되는 결과가 도 3에 도시된다.

행동 시험

T형 미로: T형 미로 습득 시험에서 기준으로의 시도에 대한 일원 ANOVA는 군에 대해 상당한 치료 효과를 나타냈다(F(4, 52) 6.38, p<0.001). 본페로니 사후 시험은 32 및 16 mg/kg RA가 주입된 SAMP8 마우스가 비히클 주입된 마우스보다 기준에 도달하는데 상당히 더 적은 시도를 하였음을 나타냈다. T형 미로 체류 시험에서 기준으로의 시도를 위한 일원 ANOVA는 상당한 치료 효과를 나타냈다(F(4,50) = 12.77, p<0.001). 본페로니 사후 분석은 32, 16 및 1.6 mg/kg RA가 주입된 SAMP8 마우스가 비히클 주입된 SAMP8 마우스보다 기준에 도달하는데 상당히 더 적은 시도를 하였음을 나타냈다. 32, 16 및 1.6 mg/kg RA가 주입된 마우스는 50% SAM 대조군 마우스와 크게 다르지 않았다.

사물 인지: 신규 사물을 탐험하는데 소비된 시간에 대한 일원 ANOVA는 상당한 치료 효과를 나타냈다(F(4,47) = 2.79, p<0.03). 듀넷 사후 시험은 32 및 16 mg/kg RA가 주입된 마우스가 비히클 주입된 SAMP8 마우스보다 신규 사물을 탐험하는데 상당히 더 많은 양의 시간을 소비하였음을 나타냈다.

레버 프레스: 보상 레버 프레스 수의 평가를 위한, 치료 및 일에 대한 이원 반복 실험 ANOVA는 치료에 상당한 효과를 나타냈다(F(4,257) = 6.18, P<0.001 및 일 F(5,257) = 40.98, P<0.001). 상호작용 치료 x 일은 유의하지 않았다(F(20,257) = 2.44). 투키 사후 분석은 RA5가 주입된 SAMP8 마우스와 비히클 주입된 SAMP8 마우스 간에 큰 차이가 없음을 나타냈다.

트리글리세라이드 수준

치료 후 트리글리세라이드 수준에 대한 일원 ANOVA는 상당한 효과를 나타냈다(F(4,44) = 4.06, P<0.006). 투키 사후 분석은 50% SAM 대조군 마우스가 비히클 주입된 SAMP8 마우스 및 1.6mg/kg RA가 주입된 SAMP8 마우스와 비교하여 현저히 높은 트리글리세라이드 수준을 지녔음을 나타냈다. 군들 간에 다른 차이는 없었다.

뇌 산화적 스트레스

Mann-Whitney U 시험은 RA5가 16 및 32mg/kg RA 주입된 마우스의 피질에서 HNE를 크게 감소시키고, 32 mg/kg RA에서 3-NT를 감소시킴을 나타냈다. RA5는 피질에서 단백질 카르보닐에 대해서는 영향을 미치지 않았다(도 10 참조). 또한, RA5는 선조체 내 HNE 또는 3-NT에 대해서는 영향을 미치지 않았다. RA5가 주입된 마우스는 비히클 처리된 SAMP8 대조군 마우스(도 11 참조)와 비교하여 선조체 내 1.6 및 16 mg/kg RA에서 현저히 더 높은 단백질 카르보닐 수준을 지녔다. RA5는 16 mg/kg RA에서 해마 내 3-NT 및 단백질 카르보닐의 수준을 크게 감소시켰다(도 12 참조).

논의:

본 연구에서, CA 또는 RA를 함유하는 추출물을 학습 및 기억을 향상시켰다. 전체적으로, CA는 서술적 기억 및 절차적 기억 둘 모두에 대해 영향을 미친다. T형 미로 및 사물 인지 둘 모두가 서술적 기억을 시험한 반면, 작동 레버 프레스는 절차적 학습 및 기억을 시험하였다. 본 발명자들은 60% CA를 함유하는 로즈마리 추출물이 서술적 및 절차적 학습 및 기억 둘 모두를 향상시켰음을 발견하였다. 10% CA를 지닌 로즈마리 추출물은 레버 프레스 작동 태스크에서 평가된 바와 같이 서술적 기억 및 절차적 학습 및 기억 둘 모두를 향상시켰다. 5% RA를 지닌 스피어민트 추출물은 서술적 학습 및 기억 둘 모두를 향상시켰다. 어느 화합물도 체중에 대해서는 영향을 미치지 않았다.

CA 및 RA 둘 모두는 투여량-반응 형태로 작용하였다. 이는 대부분의 기억 증진 화합물이 그 미만에서 화합물이 효과적이지 않고, 그 초과에서 화합물이 손상을 일으켜서, 이에 따라 "역 U자 형상의 투여량-반응 곡선으로서 알려진 것을 만드는, 기억 증진에 대해 최적의 투여량이 존재하는 현상인, 호르메시스(hormesis)를 나타내므로 놀랍지 않다. 이는 이미 로즈마린산으로의 수중 미로 시험에서, 그리고 고가식 십자 미로에서 시험된 바와 같은 그것의 항불안 능력에서 보고되었다 [Park, et al., 2010; Butterfield, et al., 1997]. 이러한 이전의 연구는 정상적인 건강한 노화되지 않은 마우스 모델에서 "스트레스" 상태를 이용하였고, 인지-증진 능력을 발견하였다. 로즈마린산은 Aβ가 주입된 마우스에서 Aβ 독성에 대해 보호하였다[Pereira P, Tysca D, Oliveria P, da Silva Brum LF, Picada JN, Ardenghi P (2005) Neurobehavioral and genotoxic aspects of rosmarinic acid. Pharmacol Res 52, 199-203]. 본 연구에서, 본 발명자들은 로즈마린산이 자연적으로 Aβ를 과생성하는 마우스 모델에서 기억을 예방함을 발견하였다.

본 연구에서의 발견은 SAMP8 마우스에서 항산화제 보충 후의 이전의 발견과 유사하다. 알파 리포산은 12 개월령의 SAMP8 마우스에서 단지 1주일의 치료 이후, 그리고, 18개월령 SAMP8 마우스에서 단지 2주 후에 학습 및 기억을 향상시켰다[Farr, et al., 2003; Pereira, et al., 2005]. 어유에서 발견되는 항산화제인 도코사헥사엔산은 또한 SAMP8 마우스에서 학습 및 기억을 향상시켰다[Alkam, et al., 2007]. 항산화제 안토시아닌이 풍부한 뽕나무 추출물의 보충은 SAMP8 마우스에서 향상된 회피 학습 및 기억, 감소된 콜레스테롤, 및 감소된 산화적 스트레스 지수를 유도하였다[Farr SA, Price TO, Banks WA, Ercal N, Morley JE (2012) Effect of Alpha-Lipoic Acid on Memory, Oxidation and Lifespan in SAMP8 Mice. J Alzheimer's Dis (In Press)]. 또한, 이들 발견은 다수의 상기 언급된 분자/추출물이 인지에 대한 후속 사람 임상 실험에서 긍정적인 효과를 입증하였으므로 고무적이며, 이는 설치류에서 사람으로의 상기 모델의 예측성 및 변환성을 나타낸다 [Petursdottir, et al., 2008; Shih PH, Chan YC, Liao JW, Wang MF, Yen GC (2010) Antioxidant and cognitive promotion effects of anthocyanin-rich mulberry (Morus atropurpurea L.) on senescence-accelerated mice and prevention of Alzheimer's disease. J Nutr Biochem 21, 598-605].

단백질 및 지질 산화는 나이 먹은 SAMP8 마우스 뇌에서 일어난다[Butterfield, et al., 1997; Poon, et al., 2005; Pereira, et al., 2005]. 단백질 및 지질은 세포의 정상 구조 및 기능에 중요한 역할을 한다[Butterfield DA, Reed T, Sultana R (2011) Roles of 3-nitrotyrosine- and 4-hydroxynonenal-modified brain proteins in the progression and pathogensis of Alzheimer's disease. Free Radic Res 45, 59-72]. 비정상 세포 기능 및 궁극적인 세포 치사는 세포내 단백질의 산화적 개질과 함께 일어날 수 있다[Lee HC, Wei YH (2012) Mitochondria and aging. Adv Exp Med Biol 942, 311-327]. 본 연구에서, 항산화제로의 치료가 단백질 카르보닐 수준에 어떠한 영향을 미치는 지를 알아보기 위해 감응 면역화학 방법이 이용되었다. 본 결과는 (10% CA를 지닌 로즈마리 추출물 또는 5% RA를 지닌 스피어민트 추출물을 투여한 후) 해마 내 단백질 산화 및 (모든 추출물의 투여 후) 피질 내 지질 산화가 감소하였음을 나타낸다. 해마 및 피질은 T형 미로 학습 및 기억에 대해 중요한 영역인 것으로 밝혀졌다[Farr SA, Banks WA, La Scola ME, Flood JF, Morley JE (2000) Permanent and temporary inactivation of the hippocampus impairs T-maze footshock avoidance acquisition and retention. Brain Res 872, 242-249; Farr SA, Uezu K, Creonte TA, Flood JF, Morley JE (2000) Modulation of memory processing in the cingulate cortex of mice. Pharmacol Biochem Behav 65, 363-368]. 또한, 연구에서는 해마가 24시간 체류 지연을 이용하는 경우 사물 인지에서 기억에 대해 중요한 것으로 밝혀졌다[Hammond, et al., 2004]. 본 데이터는 카르노스산을 지닌 로즈마리 추출물 및 로즈마린산을 지닌 스피어민트 추출물 둘 모두 SAMP8 마우스의 노화 및 인지 감퇴와 함께 일어나는 산화적 변화를 역전시킴에 있어서 도움을 줄 수 있음을 보여준다.

본 연구에서, 항산화제인, 카르노스산을 지닌 로즈마리 추출물 및 로즈마린산을 지닌 스피어민트 추출물이 이들이 인지 기능장애의 SAMP8 마우스 모델에서 학습 및 기억에 유리한 영향을 미치는지를 알아보기 위해 경구적으로 보충되었다. 추출물은 대부분의 기억 증진 화합물에 의해 입증된 바와 같은 역 U자 형상 투여량-반응 곡선이 되게 하였고, 두 추출물의 효능있는 투여량이 확인되었다. 시험된 추출물은 서술적 기억 및 절차적 기억 둘 모두에서 유리한 효과를 입증하였으며, 둘 모두는 노화 및 질병에 의해 영향을 받는 것으로 보고되어 있다. 본 발명자들이 아는 바로는, 이것이 가속화된 노화로 인한 인지 감퇴의 마우스 모델에 카르노스산을 지닌 로즈마리 추출물 또는 로즈마린산을 지닌 스피어민트 추출물을 투여한 후 인지 감퇴의 방지를 나타내는 첫번째 연구이다. 이들 발견은 카르노스산을 지닌 로즈마리 추출물 또는 로즈마린산을 지닌 스피어민트 추출물이 연령-관련 인지 감퇴에 대해 효능있는 치료제임을 시사하는 것이다.

세 가지 모든 추출물이 세개의 태스크 중 적어도 두개에서 학습 및 기억을 향상시켰다. 로즈마리 추출물(CA를 지님)은 서술적 및 절차적 기억 둘 모두에 영향을 미쳤다. T형 미로 및 사물 인지 둘 모두는 서술적 기억을 시험하였다. 작동 레버 프레스는 절차적 학습 및 기억을 시험하였다. 스피어민트 추출물(RA을 지님)은 시험된 모든 서술적 기억 태스크(T형 미로 습득 및 학습 및 사물 인지)를 향상시켰지만, 절차적 작동 학습 및 기억에는 영향을 미치지 않았다. 어느 화합물도 체중에 대해서는 영향을 미치지 않았다. 이제 CA 및/또는 RA의 사용은 인지에 대한 결과 측정과 직접적으로 관련된다. 에너지 및 인지를 논하는 로즈마리 보충제가 있기는 하지만, 그 어느 것도 과학적 연구에 의해 뒷받침되어 있지 않으며, 그 어느 것도 그 원인을 카르노스산과 직접적으로 연관시키고 있지 않다. 이는 카르노스산 함량의 증가가 추출물의 효능을 증대시킨다는 본 연구에서 보여진다.

학습 또는 기억과 관련된 인지 행동 결과 측정은 CA와 연관되어 있지 않았고, 또한, 학습 결과 측정도 RA에 연관되어 있지 않았다.

이들 결과는 상이한 화학 구조 및 극성을 지닌 완전히 상이한 두 분자가 어떻게 혈뇌 장벽을 거쳐 상이한 뇌 영역에 침투할 수 있는 지의 특성으로 인해 놀랍다. 이들 화합물이 뇌의 여러 영역을 침투하면, 이들 화합물은 인지 성능에 상당한 성능 변화를 초래한다. 이러한 연구 전에는, 이들 분자는 뇌에서 일반적인 비특이적 항산화 효과 만을 지니는 것으로 여기었다. 이전에, 이들 분자는 뇌의 상이한 영역으로부터 초래되는 특이적 인지 기능 효과와 연관되지 않았다. 본 연구는 처음으로 이들이 행동 인지 성능 결과에 영향을 미칠 수 있음을 입증하였다. 또한, 두 개의 화합물이 그러한 인지 결과를 담당하는 특정 뇌 영역과 매우 특이적인 상호작용을 상이하게 나타내는 상이한 성능 결과에 영향을 준다. 이들 결과는 다른 분자에 기인한 일반적인 비특이적 항산화 효과와 무관하게 작용하는 이들 분자의 특이성을 나타냈다.

실시예 2

카르노스산의 90-일 독성 연구

본 연구의 목적은 적어도 90일 동안 래트에게 경구 섭식을 통해 일일 1회 또는 2회 투여한 경우, 시험 품목인 약 10% 카르노스산(활성 성분)을 함유하는 로즈마리 추출물의 현탁액(해바라기 오일 중의)의 독성을 평가하기 위한 것이었다.

수컷 및 암컷 Hsd:Sprague Dawley SD 래트를 군으로 할당하고, 하기 표에 나타난 바와 같이 투여량을 투여하였다. 동물들은 경구 섭식을 통해 투여받았다.

CA = 카르노스산; 시험 품목 중의 활성 성분

BID = 일일 2회; 일일 투여량은 대략 6시간 간격으로 투여되었다(투여된 최종 동물/성별/군을 토대로).

SID = 일일 1회.

a 동물에게 10 mL/kg/일로 투여하였고; BID 투여 동물의 투여량은 5 mL/kg/투여량으로 투여되었다.

b 농도가 로트(lot) 특이적 CA 함량에 대해 보정되었다.

c 군 1은 비히클 대조군 품목(해바라기) 만 주입되었다.

독성 평가는 사망률, 임상 징후, 체중, 체중 변화, 먹이 소비, 안과용 검사, 기능관찰종합평가(functional observation battery)(FOB), 및 임상 및 해부병리학에 기초하였다.

해바라기 오일 중 약 10% 카르노스산을 함유하는 로즈마리 추출물의 Sprague Dawley 래트로의 경구 투여는 <180 mg/kg/일의 투여량 수준에서 양호하게 허용되었다. 130 mg/kg/일이 주어진 동물에게서 투여 빈도(SID 또는 BID)는 특성 또는 효과의 크기에 대해 어떠한 실질적인 차이를 갖지 않는 것으로 나타났다. >65 mg/kg/일의 투여량은 혈액학 및 임상 화학 파라미터; 장기 중량 변화; 및 간, 신장, 전위(nonglandular stomach), 결장 및 맹장에서의 현미경 소견에 대해 무독성 시험 품목-관련 효과를 초래하였다. 이러한 패턴의 소견을 토대로 하면, 180 mg 카르노스산/kg/일은 90일 연속으로 경구적으로 투여되는 경우 관찰되는 무영향관찰수준(no observed adverse effect level)(NOAEL)으로 간주된다. 정확히 11.55%의 추출물 내 180 mg/kg/일의 카르노스산 및 CA 농도의 NOAEL로 인해, NOAEL은 1,558 mg/kd/일의 로즈마리 추출물에 해당할 것이다. 100-배 안전 인자를 사용하면, 이는 15.58 mg/kg/일의 사람 등가 투여량, 또는 70 kg 사람에 대해 1091 mg에 해당할 것이다.

실시예 3

로즈마린산의 90-일 독성 연구

본 연구의 목적은 적어도 90일 동안 래트에게 경구 섭식을 통해 일일 1회 투여한 경우, 시험 품목인 증류수에 용해된 약 15%(w/w) 로즈마린산(활성 성분)을 함유하는 로즈마리의 건조 추출물의 독성을 평가하기 위한 것이었다.

RA = 로즈마린산; 시험 품목 중의 활성 성분

a 동물에게 10 mL/kg/일로 투여하였다.

b 군 1은 비히클 대조군 품목(증류수) 만 주입되었다.

독성 평가는 사망률, 임상 징후, 체중, 체중 변화, 먹이 소비, 안과용 검사, 기능관찰종합평가(FOB), 및 임상 및 해부병리학에 기초하였다.

90일 동안 300 mg RA/kg/b.wt/일 이하로의 건조 스피어민트 추물물(활성 성분으로서 약 15% RA 함유)의 수컷 및 암컷 Sprague Dawley 래트로의 경구 투여는 양호하게 허용되었다. 체중, 먹이 소비, 신경학적 파라미터, 혈액학, 임상 화학, 육안 및 조직병리학을 포함하는 조사된 파라미터 중 어느 것에서도 치료 관련 임상 징후 또는 부작용이 관찰되지 않았다. 뇌하수체 및 갑상선에서의 중량 증가가 관찰되었지만, 연령 및 스트레인(strain)에 대한 이력적 규정량 내에 있었고, 상응하는 조직병리학적 변화는 없었다. 따라서, 사용된 시험 조건 및 투여량 하에서 시험 항목에 대해 "무영향관찰수준(No Observed Adverse Effect Level)(NOAEL)"은 300 mg RA/kg b.wt/일(1948.2 mg/kg b.wt/일의 건조 스피어민트 추출물에 해당함)인 것으로 나타났다. 100-배 안전 인자를 사용하면, 이는 사람 등가 투여량에 대해 19.48 mg/kg/일의 건조 스피어민트 추출물의 NOAEL에 해당할 것이고, 이는 70kg 사람에 대해 1363.74 mg/일에 해당할 것이다.

상기 설명 및 도면은 본 발명의 예시적 구체예를 포함한다. 본원에 기술된 상기 구체예 및 방법은 당업자의 능력, 경험 및 선호를 기초로 하여 변화될 수 있다. 방법의 단계의 특정 순서로의 단순한 기록은 방법의 단계 순서에 어떠한 제한을 두는 것이 아니다. 상기 설명 및 도면은 단지 본 발명을 설명하고 예시하는 것이며, 본 발명은 여기에 제한되지 않으며, 단지 청구범위로 제한된다. 본 발명을 숙지한 당업자는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원에서 변형 및 변화를 가능하게 할 수 있을 것이다.

Claims

비유기 용매 추출을 통해 얻어진 로즈마린산을 함유하는 0.01 내지 50mg/kg/일의 스피어민트 식물의 추출물을 포함하는, 정상적인 노화 인지 변화를 겪는 포유 동물의 인지 건강 또는 기능을 증진시키거나, 향상시키거나, 유지시키기 위한 경구 투여용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 포유 동물이 사람 및 반려 동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 추출물이 4 중량% 이상의 로즈마린산을 포함하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 인지 건강 또는 인지 기능이 집중력, 주의력, 및 조심성의 향상을 통한 절차적 학습을 나타내는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 인지 건강 또는 인지 기능이 서술적 기억, 단기 기억 및 장기 기억 둘 모두를 나타내는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 인지 건강 또는 인지 기능이 실행 능력을 나타내는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물이 10 중량% 이상의 카르노스산을 추가로 포함하는 조성물.
제 7항에 있어서, 인지 건강 또는 기능이 학습이고, 학습이 서술적 학습 및 절차적 학습으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 7항에 있어서, 인지 건강 또는 기능이 기억이고, 기억이 참조 기억, 재인 기억, 단기 기억, 장기 기억, 및 서술적 요소 및 절차적 요소 둘 모두를 지닌 연상 기억으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물이 난독증(dyslexia), 실행증, 주의력 결핍 과잉 장애, 주의력 결핍 장애, 자폐증, 알츠하이머, 파킨슨병 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택된 인지 장애의 증상을 경감시키는 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 조성물이 난독증, 실행증, 주의력 결핍 과잉 장애, 주의력 결핍 장애, 자폐증, 알츠하이머, 파킨슨병 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택된 인지 장애의 증상을 경감시키는 조성물.
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제 1항 또는 제 2항에 있어서, 비행 시차, 시차 변화, 임신, 투약, 일상적 업무 및 교대 업무에서의 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 상황에서 일어나는 것과 같은 일주기적 리듬(circadian rhythm)의 중단과 같은 스트레스성 상황 하에서 정상적인 인지 기능을 유지하기 위한 조성물.
제 7항에 있어서, 시차 변화, 임신, 투약, 일상적 업무 및 교대 업무에서의 변화로 이루어진 군으로부터 선택된 상황에서 일어나는 것과 같은 일주기적 리듬의 중단과 같은 스트레스성 상황 하에서 정상적인 인지 기능을 유지하기 위한 조성물.
비유기 용매 추출을 통해 얻어진 로즈마린산을 함유하는 0.01 내지 50mg/kg/일의 스피어민트 식물의 추출물을 포함하는, 정상적인 노화 인지 변화를 겪는 포유 동물의 인지 건강 또는 기능의 감퇴를 치료하거나 예방하기 위한 경구 투여용 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 포유 동물이 사람 및 반려 동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 16항 또는 제 17항에 있어서, 상기 추출물이 4 중량% 이상의 로즈마린산을 포함하는 약학적 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 증상이 (a) 집중력, 주의력 또는 조심성을 유지하는 능력에서의 손상, 및 (b) 단기 기억 또는 장기 기억을 불문한 기억, 또는 실행 능력에서의 감퇴로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 증상이 (a) 집중력, 주의력 또는 조심성을 유지하는 능력에서의 손상, 및 (b) 단기 기억 또는 장기 기억을 불문한 기억, 또는 실행 능력에서의 감퇴로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
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