KR102416251B1 - Gaba를 생산하는 락토바실러스 브레비스 hbt 균주 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GABA(Gamma-aminobutyric acid)를 생산하는 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) HBT 균주에 관한 것이다.
본 발명의 신규한 락토바실러스 브레비스 HBT 균주는 GABA를 고농도로 생산할 수 있으며, 배양조건을 최적화시킴으로써 GABA의 생산량을 더욱 증가시킬 수 있다.

Description

GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주 및 이를 포함하는 조성물{NOVEL GABA PRODUCING LACTOBACILLUS BREVIS HBT STRAIN AND COMPOSITION COMPRISING A CULTURE BROTH OF THE STRAIN}

본 발명은 GABA(Gamma-aminobutyric acid)를 생산하는 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) HBT 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

감마-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid; GABA)은 자연계에 널리 분포하는 비단백질 아미노산의 일종으로 glutamate decarboxylase(GAD)의 탈탄산 작용에 의해 glutamic acid로부터 전환되어 만들어진다.

GABA는 포유동물 중추 신경계에서 억제성 신경전달물질로 혈압상승, 콜레스테롤 억제, 항비만 및 항불안 등 다양한 생리학적 특성을 가지고 있어 식품 및 제약 산업의 소재로 많이 사용되고 있다.

일반 곡류식품에 존재하는 GABA 함량은 일반미 10-40 ppm, 현미 40-80 ppm, 발아현미 10-1,000 ppm, 녹차 350-2050 ppm, 뽕잎 560 ppm 이며 (Kwon and Lee 2018) 한약재에는 원지 700 ppm, 천궁 3,100 ppm, 하수오 5,400 ppm, 백복신 200 ppm, 오미자 14,800 ppm, 측백엽 1,600 ppm, 가시오가피 900 ppm, 석창포 1,000 ppm, 헛개나무 900 ppm의 GABA를 함유하고 있다.

최근 의약품 및 식품산업 등에 GABA의 수요가 증가하고 있으며 미생물을 사용해 GABA 생물전환에 많은 관심이 기울여졌다.

유산균은 일반적으로 generally recognized as safe ogarnisms(GRAS)로 젖산 및 박테리오신 등을 생산하는 프로바이오틱스(probiotics)로 전통발효주, 김치 및 요구르트 등의 발효식품에 존재하며 건강기능식품 및 사료첨가제 등 산업적으로 활용이 증가하고 있는 추세이며, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)과 같은 유산균이 GABA를 합성할 수 있으며, 이중 일부 균주는 잠재적인 산업성을 가지고 있다.

따라서 본 발명에서는 전통주 유래의 유산균을 기반으로 GABA 합성 균주를 분리 동정 후 생물전환 최적화를 통해 GABA 합성능을 증대시킴으로써, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0087518호

이에, 본 발명은 GABA 생산하는 미생물을 발효식품에서 분리하고자 다양한 발효식품에서 유산균을 분리하였고, 이 중 GABA 생산량이 가장 높은 신규한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HBT 균주를 선발하였다. 또한, 상기 균주의 생장 조건을 최적화하여 GABA 생산량을 증대시키는 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 GABA(γ-aminobutyric acid)를 생산하는 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) HBT 균주(KCTC 13970BP)를 제공한다.

상기 균주는 김치, 막걸리, 소곡주의 혼합물로부터 균을 분리하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 균주는 MSG, 글루탐산 또는 이들의 조합을 더 추가하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 균주는 10-80시간 및 pH 4-7의 조건으로 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명은 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 균주는 277 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate), 3 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract), 2.10 mM 무수 염화마그네슘(MgCl₂), 43.06 mM 이인산칼륨(K₂HPO₄), 51.67 mM 일인산칼륨(KH₂PO₄) 및 0.1 %(w/v) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethyelene Sorbitan Monooleate)의 구성을 갖는 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주를 제공한다.

상기 배지에는 MSG, 글루탐산 또는 이들의 조합을 더 추가하여 배양하는 것을 특징으로 한다.

상기 균주는 상기 배지에 배양액 대비 5~ 30 %(w/v) 글루탐산을 첨가하여 배양되는 것을 특징으로 한다.

상기 균주는 MRS 배지에서 12시간 배양한 1차 배양액을, 277 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate), 3 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract), 2.10 mM 무수 염화마그네슘(MgCl₂), 43.06 mM 이인산칼륨(K₂HPO₄), 51.67 mM 일인산칼륨(KH₂PO₄) 및 0.1 %(w/v) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethyelene Sorbitan Monooleate)에 2.8 %(w/v) MSG를 첨가한 배지에 첨가하되, 상기 1차 배양액을 상기 배지에 100분의 1 부피비로 첨가하여 24시간 전배양하는 단계를 더 포함하고, 상기 전배양하는 단계에서 얻은 전배양액을, 277 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate), 3 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract), 2.10 mM 무수 염화마그네슘(MgCl₂), 43.06 mM 이인산칼륨(K₂HPO₄), 51.67 mM 일인산칼륨(KH₂PO₄) 및 0.1 %(w/v) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethyelene Sorbitan Monooleate)에 30 %(w/v) 글루탐산(glutamic acid)을 더 첨가하여 이루어지는 2차 배지에 첨가하되, 상기 전배양액을 상기 2차 배지에 10 %(w/v)첨가하여 2차 배양되는 것을 특징으로 한다.

상기 전배양에서의 배지는 pH 5인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 신규한 락토바실러스 브레비스 HBT 균주는 GABA를 고농도로 생산할 수 있으며, 배양조건을 최적화시킴으로써 GABA의 생산량을 더욱 증가시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서 발효식품에서 분리한 10종의 균의 GABA 생산량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서 L. brevis HBT 균주(HBT-P131)의 계통수 (Phylogenetic tree)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 있어서 배지 조성에 따른 L. brevis HBT 균주의 GABA 생산량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서 배지 조성 및 첨가물질에 따른 L. brevis HBT 균주의 GABA 생산량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 있어서 첨가물질의 농도에 따른 L. brevis HBT 균주의 GABA 생산량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서 배양기 형태에 따른 L. brevis HBT의 균주의 GABA 생산량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 GABA(Gamma-aminobutyric acid)를 생산하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) HBT 균주에 관한 것이다.

상기 균주의 배양에 사용되는 배지는 본 분야에서 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

상기 균주 또는 배양물의 GABA 생산능을 개선시키기 위해 배지의 구성을 최적화하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 최적화된 배지는, 139 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate), 1 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract), 2.10 mM 무수 염화마그네슘(MgCl₂, Magnesium chloride anhydrous), 51.67 mM 일인산칼륨(KH₂PO₄, potassium biphosphate), 0.16 mM 황산마그네슘(MgSO₄, Magnesium sulfate), 0.06 mM 황산망간1수화물(MnSO₄·H₂O, Manganese sulphate Monohydrate) 및 24 mM 아세트산 나트륨(Sodium acetate)의 구성을 갖는 BT-medium-LAB-01 배지를 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 최적화된 다른 배지는, 277 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate), 3 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract), 2.10 mM 무수 염화마그네슘(MgCl₂, Magnesium chloride anhydrous), 43.06 mM 이인산칼륨(K₂HPO₄, Dipotassium phosphate), 51.67 mM 일인산칼륨(KH₂PO₄, potassium biphosphate) 및 0.1 %(w/v) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethyelene Sorbitan Monooleate)의 구성을 갖는 BT-medium-LAB-02 배지를 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 최적화된 또 다른 배지는, 277 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate), 3 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract), 0.83 mM 황산마그네슘(MgSO₄, Magnesium sulfate), 0.30 mM 황산망간1수화물(MnSO₄·H₂O, Manganese sulphate Monohydrate) 및 11.48 mM 이인산칼륨(K₂HPO₄, Dipotassium phosphate)의 구성을 갖는 BT-medium-LAB-03 배지를 사용할 수 있다.

상기 균주는 MSG, 글루탐산 또는 이들의 조합을 더 추가하여 배양할 수 있다. 상기 MSG, 글루탐산 또는 이들의 조합은 배양액 대비 5~ 30 %(w/v)로 추가될 수 있다. 상기 MSG, 글루탐산 또는 이들의 조합을 추가하여 배양할 경우 GABA의 생산량이 증가한다. 30% 초과하여 첨가하는 경우 삼투압에 의한 생균수 감소 등이 발생하여 GABA 생산량이 저하되고, 5%미만으로 첨가하는 경우 GABA 생산량이 낮아진다.

상기 균주는 10-80시간 및 pH 4-7의 조건으로 배양할 수 있다. 보다 바람직하게는 40-75시간 및 pH 5-6의 조건으로 배양한다. 더욱 바람직하게는 pH 5 의 조건으로 배양한다.

한편, 균주는 25-40℃의 온도에서 배양한다. 보다 바람직하게는 30℃에서 배양한다.

배지의 각 성분은 그 첨가량에 따라 세포 성장에 영향을 미치게 되어 생산되는 대사산물량이 달라진다. 상기 배지의 조성은 GABA를 생산하기 위한 최적의 배지 구성이며, 그 첨가 성분비를 벗어나는 경우 세포 성장에 영향을 미쳐 GABA생산량이 떨어진다.

또한 본 발명은 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 유효성분을 포함하는 조성물은 피부 탄력 개선, 안티 에이징 등의 기능성을 나타내고 있어 다양한 화장품에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 추출물로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료 좃어물에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다. 유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산 부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산 에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산 트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산 이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴, 카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜 틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인 산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르 계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산 및 메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산 및 메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈 및 에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈 및 헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들수 있다. 에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산 콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린 지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE(폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POE 및 POP(폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌) 공중합체, POE 및 POP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산업, 알킬아미드 인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산 디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아 미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다. 양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드 술포 베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트 수지, 디비닐벤젠 및 스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠 및 스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐,살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모 노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시 계피산 이소프로필, 디이소프로필 및 디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 밀크 로션, 아스트린젠트, 로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 헤어로션, 헤어토닉, 헤어에센스, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

또한 본 발명은 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강기능성 식품으로 사용될 수 있으며, 사용하고자 하는 목적에 따라, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

또한 본 발명은 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 유효성분 이외의 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로서 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 유효성분을 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예 사료를 본 발명에 따른 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70 % 로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식 발효 사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30 % 내지 40 % 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 종래 사료에 첨가되는 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 사료에 첨가되는 성분의 일 예로서 곡류 분말, 고기 분말, 및 두류 등을 포함할 수 있다. 상기에서 곡류 분말은 쌀가루, 밀가루, 보리가루, 및 옥수수가루 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기에서 고기 분말은 닭고기, 소고기, 돼지고기, 및 타조 고기 중에서 선택된 어느 하나 이상을 분말화한 고기분말을 사용할 수 있다. 상기에서 두류는 대두, 강낭콩, 완두콩, 및 검정콩 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 상기에서 언급한 종래 사료에 첨가되는 성분인 곡류분말, 고기분말, 및 두류 이외에도 사료의 영양성을 증대시키기 위해 영양제, 및 무기물 중에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가할 수 있으며, 사료 품질의 저하를 막기 위해 항곰팡이제, 항산화제, 항응고제, 유화제, 및 결착제 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명은 락토바실러스 브레비스 HBT 균주를 배양하는 단계를 포함하는 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주을 제공한다.

상기 균주 또는 배양물은 통상의 배지를 사용하여 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 균주 또는 배양물의 GABA 생산능을 개선시키기 위해 배지의 구성을 최적화하여 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 최적화된 배지는, 139 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate), 1 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract), 2.10 mM 무수 염화마그네슘(MgCl₂, Magnesium chloride anhydrous), 51.67 mM 일인산칼륨(KH₂PO₄, potassium biphosphate), 0.16 mM 황산마그네슘(MgSO₄, Magnesium sulfate), 0.06 mM 황산망간1수화물(MnSO₄·H₂O, Manganese sulphate Monohydrate) 및 24 mM 아세트산 나트륨(Sodium acetate)의 구성을 갖는 BT-medium-LAB-01 배지를 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 최적화된 다른 배지는, 277 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate), 3 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract), 2.10 mM 무수 염화마그네슘(MgCl₂, Magnesium chloride anhydrous), 43.06 mM 이인산칼륨(K₂HPO₄, Dipotassium phosphate), 51.67 mM 일인산칼륨(KH₂PO₄, potassium biphosphate) 및 0.1 %(w/v) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethyelene Sorbitan Monooleate)의 구성을 갖는 BT-medium-LAB-02 배지를 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 최적화된 또 다른 배지는, 277 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate), 3 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract), 0.83 mM 황산마그네슘(MgSO₄, Magnesium sulfate), 0.30 mM 황산망간1수화물(MnSO₄·H₂O, Manganese sulphate Monohydrate) 및 11.48 mM 이인산칼륨(K₂HPO₄, Dipotassium phosphate)의 구성을 갖는 BT-medium-LAB-03 배지를 사용할 수 있다.

상기 균주는 MSG, 글루탐산 또는 이들의 조합을 더 추가하여 배양할 수 있다. 상기 MSG, 글루탐산 또는 이들의 조합은 배양액 대비 5~ 30 %(w/v)로 추가될 수 있다. 상기 MSG, 글루탐산 또는 이들의 조합을 추가하여 배양할 경우 GABA의 생산량이 증가한다.

상기 균주는 10-80시간 및 pH 4-7의 조건으로 배양할 수 있다. 보다 바람직하게는 40-75시간 및 pH 5-6의 조건으로 배양한다. 더욱 바람직하게는 pH 5의 조건으로 배양한다.

한편, 균주는 25-40℃의 온도에서 배양한다. 보다 바람직하게는 30℃에서 배양한다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> GABA 생산 균주 선별

GABA 생산능이 우수한 균을 분리하고자 김치 5 g, 막걸리 5 ml, 소곡주 5 ml을 0.85% 생리식염수(NaCl) 45 ml에 현탁하였다. 이를 유산균 선택 배지인 MRS (difco, 조성) 평판배지에 상기 현탁액을 도말하여 37℃에서 2일간 배양하였다. 그 결과 형성된 콜로니를 다시 0.002% 브로모페놀 블루(bromophenol blue)가 첨가된 MRS 배지(MRS-BPB)에 도말 후 37℃에서 2일간 배양하여 낙산에 의한 색변화가 일어난 균주 10종을 선별하였다. 선별된 10종 균주는 HBT-P108, HBT-P113, HBT-P121, HBT-P124, HBT-P127, HBT-P131, HBT-P139, HBT-P142, HBT-P144 및 HBT-P155 로 명명하였다.

상기 선별된 10종의 유산균들에서 GABA 생산능을 확인하고자 각각의 단일 콜로니를 분리하여 MRS 액상 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 이상 전배양한 후 상기 전배양액을 100분의 1 부피비로 다시 MRS 액상 배지 및 5 %(w/v) MSG가 첨가된 MRS 액상 배지에 접종하여, 30℃에서 2일간 배양한 뒤 10,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 그 다음 0.2 um 필터에 여과한 뒤 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 GABA를 분석하였다(Ishikawa et al., 2009). 표준품으로는 99%이상인 GABA(gama-aminobutyric acid, cat: A2129, sigma)를 사용하였으며, 분석 컬럼으로 Tosoh사의 C18 칼럼으로 약 5 ㎛의 입자 크기, 약 25 cm의 칼럼 길이 및 약 4.6mm의 칼럼 직경을 사용하였다. 컬럼 온도는 35℃ 검출기 파장 360 nm에서 시료 10 ul를 주입하고 1.0 ml/min의 속도로 30분간 흘려주었다.

이동상은 다음과 같다:

용매 A: 50% Acetonitrile

용매 B: 물에 Sodium acetate를 첨가하여 0.41%가 되도록 함.

용출 구배는 다음과 같다.

T=0분: %B=84; T=7분: %B=66; T=25분: %B=45

그 결과 도 1에 나타난 바와 같이, HBT-P131 균주가 다른 균주들과 비교하여 가장 높은 GABA 생산량을 나타내는 것을 확인하였다.

<실시예 2> GABA 생산능이 우수한 신규한 균주 동정

상기 실시예 1에서 확인한 GABA 생산능이 가장 높은 HBT-P131 균주의 16s rRNA 염기서열을 분석하였다 (솔젠트, 대전, 대한민국). Phylogenetic tree (계통수)를 분석한 결과 도 2와 같았으며, Lactobacillus brevis ATCC14869와 16s rRNA 염기서열 비교 결과 1449/1455(99%)의 상동성을 확인하였다. 따라서 HBT-P131 균주를 락토바실러스 브레비스 HBT(Lactobacillus brevis HBT)라 명명하였다.

<실시예 3> L. brevis HBT 균주의 GABA 생산량 증대 확인

3-1. 배지의 조성에 따른 L. brevis HBT 균주의 GABA 생산량 증대 확인

본 발명의 L. brevis HBT-P131 균주를 배지 조성에 따른 GABA 합성량을 확인하였다.

우선, MRS, BT-medium-LAB-01 {139mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate, DAESANG), 1 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract) (Bacto^TM, Difco), 2.10 mM MgCl₂ (Magnesium chloride anhydrous DAESANG), 51.67 mM KH₂PO₄ (potassium biphosphate, 일인산칼륨, DAESANG), 0.16 mM MgSO₄ (Magnesium sulfate, 황산마그네슘, DAESANG), 0.06 mM MnSO_4·H₂O (Manganese sulphate, 황산망간1수화물, SIGMA), 24 mM Sodium acetate (아세트산 나트륨, DAESANG), BT-medium-LAB-02 {277mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate, DAESANG), 3 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract) (Bacto^TM, Difco), 2.10 mM MgCl₂ (Magnesium chloride anhydrous DAESANG), 43.06 mM K₂HPO₄ (Dipotassium phosphate, 이인산칼륨, DAESANG), 51.67 mM KH₂PO₄ (potassium biphosphate, 일인산칼륨, DAESANG), 0.1 %(w/v) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethyelene Sorbitan Monooleate) (DAESANG), 29.97 mM)} 및 BT-medium-LAB-03 {277 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate, DAESANG), 3 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract) (Bacto^TM, Difco), 0.83 mM MgSO₄ (Magnesium sulfate, 황산마그네슘, DAESANG), 0.30 mM MnSO_4·H₂O (Manganese sulphate, 황산망간1수화물, SIGMA), 11.48 mM K₂HPO₄ (Dipotassium phosphate, 이인산칼륨, DAESANG)}의 에 실시예 1과 같이 37℃에서 12시간 이상 전배양한 배양액을 100분의 1 부피비로 각각의 배지에 첨가 후 30℃ 150 rpm 조건으로 48시간 배양 후 GABA 합성량을 비교하였다.

그 결과 도 3과 같이 MRS에서 배양 시 522 ppm의 GABA가 합성된 반면 최적화 배지 BT-medium-LAB-01, BT-medium-LAB-02, BT-medium-LAB-03에서 각각 GABA 합성량이 934와 1,563, 그리고 1278 ppm으로 GABA 합성량이 증가되었다.

한편, GABA 합성량이 높게 나타난 BT-medium-LAB-02, BT-medium-LAB-03 배지에, 배양액 대비 10 %(w/v) 글루탐산모노나트륨(monosodium L-glutamate, MSG, 99 %(w/v), Yakuri)를 첨가한 뒤 72시간 배양 후 GABA 합성량을 비교하여, 도 4에 나타내었다. 도 4에서와 같이, BT-medium-LAB-02, BT-medium-LAB-03 배지에서 각각 4.14%, 3.59%의 GABA가 합성되었으며, 10 %(w/v) 글루탐산(L-glutamic acid 99%, DAEJUNG)를 첨가한 BT-medium-LAB-02, BT-medium-LAB-03 배지에서 각각 5.38%, 4.92%의 GABA가 합성되는 것을 확인하였다. 이를 통해 MSG, 글루탐산 또는 이들의 조합을 더 추가하여 배양하는 것이 GABA의 생산량을 증대시키는 것이 확인되었다.

3-2. 배지의 조성 및 중간대사산물 첨가에 따른 L. brevis HBT 균주의 GABA 생산량 증대 확인

상기 3-1의 실시예에서 확인된 배양 조건을 바탕으로 배지의 조성 및 중간대사산물 (L-glutamic acid) 첨가량에 따른 GABA 생산량을 확인하였다.

BT-medium-LAB-02배지에 글루탐산(L-glutamic acid)를 배양액 대비 5 %(w/v), 10 %(w/v), 15 %(w/v), 20 %(w/v) 각각 첨가 후 30℃ 150 rpm 조건으로 48시간 배양하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서와 같이, BT-medium-LAB-02배지에 글루탐산(L-glutamic acid)를 5 %(w/v)첨가하였을 때 3.14%의 GABA 합성을, 10 %(w/v)첨가하였을 때 5.39%, 15 %(w/v)첨가하였을 때 8.28%, 20 %(w/v)첨가하였을 때 10.66%의 GABA가 합성되는 것을 확인하였다.

<실시예 4> 배양기를 통한 L. brevis HBT의 GABA 생산량 확인

상기 실시예 3을 통하여 구축된 배양 조건을 바탕으로, 배양기 사용 및 특정 조건에 의한 GABA 생산량을 확인하였다.

MRS 배지에서 12시간 배양한 1차 배양액을 pH 5로 조정된 BT-medium-LAB-02에 2.8 %(w/v) MSG 첨가한 배지에 100분의 1 부피비로 첨가한 뒤 24시간 전배양을

진행하였다. 상기 전배양액을 30 %(w/v) 글루탐산(glutamic acid)가 첨가된 BT-medium-LAB-02 배지에 10 %(w/v) 첨가한 뒤 30℃ 150 rpm 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 그 결과 도 6과 같이 최적화된 배양조건에서 18.86% GABA가 합성되는 관찰할 수 있었다.

생물자원센터 KCTC13970BP 20191008

Claims (12)

1. GABA(γ-aminobutyric acid)를 생산하는 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) HBT 균주(KCTC 13970BP).
2. 제1항에 있어서,
   상기 균주는
   김치, 막걸리, 소곡주의 혼합물로부터 균을 분리하여 배양하는 것인 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주.
3. 제1항에 있어서,
   상기 균주는
   MSG, 글루탐산 또는 이들의 조합을 더 추가하여 배양하는 것인 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주.
4. 제1항에 있어서,
   상기 균주는
   10-80시간 및 pH 4-7의 조건으로 배양하는 것인 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주.
5. 제1항의 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
6. 제1항의 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
7. 제1항의 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물.
8. 제1항에 있어서,
   상기 균주는
   277 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate), 3 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract), 2.10 mM 무수 염화마그네슘(MgCl₂), 43.06 mM 이인산칼륨(K₂HPO₄), 51.67 mM 일인산칼륨(KH₂PO₄) 및 0.1 %(w/v) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethyelene Sorbitan Monooleate)의 구성을 갖는 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주.
9. 제8항에 있어서,
   상기 배지에는 MSG, 글루탐산 또는 이들의 조합을 더 추가하여 배양하는 것인 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주.
10. 제1항에 있어서,
    상기 균주는
    상기 배지에 배양액 대비 5~ 30 %(w/v) 글루탐산을 첨가하여 배양되는 것을 특징으로 하는 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주.
11. 제1항에 있어서,
    상기 균주는
    MRS 배지에서 12시간 배양한 1차 배양액을,
    277 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate), 3 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract), 2.10 mM 무수 염화마그네슘(MgCl₂), 43.06 mM 이인산칼륨(K₂HPO₄), 51.67 mM 일인산칼륨(KH₂PO₄) 및 0.1 %(w/v) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethyelene Sorbitan Monooleate)에 2.8 %(w/v) MSG를 첨가한 배지에 첨가하되,
    상기 1차 배양액을 상기 배지에 100분의 1 부피비로 첨가하여 24시간 전배양하는 단계를 더 포함하고,
    상기 전배양하는 단계에서 얻은 전배양액을,
    277 mM 함수결정포도당(Dextrose Monohydrate), 3 %(w/v) 효모 추출물(Yeast extract), 2.10 mM 무수 염화마그네슘(MgCl₂), 43.06 mM 이인산칼륨(K₂HPO₄), 51.67 mM 일인산칼륨(KH₂PO₄) 및 0.1 %(w/v) 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethyelene Sorbitan Monooleate)에 30 %(w/v) 글루탐산(glutamic acid)을 더 첨가하여 이루어지는 2차 배지에 첨가하되,
    상기 전배양액을 상기 2차 배지에 10 %(w/v)첨가하여 2차 배양되는 것을 특징으로 하는 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주.
12. 제11항에 있어서,
    상기 전배양에서의 배지는 pH 5인 것을 특징으로 하는 GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주.

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