KR102405795B1

KR102405795B1 - 진세노사이드 생물전환능을 갖는 균주 및 이를 포함하는 반추동물용 발효사료

Info

Publication number: KR102405795B1
Application number: KR1020190177357A
Authority: KR
Inventors: 최낙진; 이수윤; 조상균; 조은소리
Original assignee: 전북대학교 산학협력단; 전라북도 진안군
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2022-06-08
Also published as: KR20210084874A

Abstract

본 발명은 진세노사이드 생물전환능을 갖는 균주 및 이를 포함하는 반추동물용 발효사료에 관한 것으로, 본 발명에 따른 반추위 내에서 생성되는 메탄을 저감하고, 젖산, 초산, 프로피온산과 같은 유기산의 함량은 높으면서 기호성 저하의 원인이 될 수 있는 뷰틸산의 함량은 저감시키기 위해, 홍삼박에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주를 접종하여 발효시킴으로써, 휘발성 지방산 생성량에 큰 영향을 미치지 않으면서 메탄 생성은 감소시키고 젖산, 초산, 프로피온 함량은 효과적으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 반추동물의 육질 개선을 위한 홍삼박 발효물 및 이를 포함하는 사료 조성물을 제조할 수 있게 한다.

Description

진세노사이드 생물전환능을 갖는 균주 및 이를 포함하는 반추동물용 발효사료{Strain having ginsenoside bioconversion activity and Fermented total mixed ration feed using the same}

본 발명은 진세노사이드 생물전환능을 갖는 균주 및 이를 포함하는 반추동물용 발효사료에 관한 것이다.

과거 축산물 생산성 향상을 위해서 항생제 및 각종 성장 촉진제를 사용해 왔으나, 최근 항생물질 잔류 및 안전성 문제로 인해 세계적으로 금지하는 추세이다. 따라서 반추위 내 에너지 이용 효율 증진위해 사료 효율 향상과 산화적 스트레스 감소(항산화 효과)를 통해 육질을 개선하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다. 한우는 필요한 에너지의 70%를 반추위에서 생성되는 휘발성 지방산(VFA)으로 공급받는다. VFA는 초산(acetate), 프로피온산(propionate) 및 낙산(butyrate)를 포함하며, 조사료는 초산으로 분해되어 유지방생산과 피하지방 축적에 영향을 미치고, 당과 전분이 많은 농후사료는 미생물 분해 및 발효에 의해 프로피온산으로 생산되어 체내 포도당생성 및 지방생합성을 촉진함으로써 근내지방(마블링) 생성을 촉진한다. 또한, 초산과 프로피온산의 비가 최소한 2.2:1 이상이어야 정상적인 유지율을 유지할 수 있다. 낙산은 골격근 및 지방산 합성의 에너지원으로 사용된다. 하지만 반추위내 발효과정에서 생성되는 메탄 가스로 인해 최대 12%의 사료 에너지 손실이 일어난다. 반추위내 메탄 생성은 소장으로의 지방산 유입을 저해 시켜 비육우의 근내 지방 생성에 영향을 미칠 수 있다. 소의 발육 순서는 부위 마다 다르며, 특히 육성기 때의 성장은 출하 시 육량과 함께 육질에도 영향을 미친다. 따라서 한우의 성장시기에 따라 적절한 영양을 통해 한우 육량 증진 및 육질 향상을 위한 실험들이 많이 진행되고 있다.

사포닌(Saponin)은 인삼 및 홍삼에 많이 함유되고 있는 물질로서 다양한 형태의 진세노사이드(Ginsenoside)가 존재한다. 홍삼에 대한 효능 향상을 위하여 발효라는 생물학적 전환 기술이 다양한 산업 분야에서 적용되고 있다. 특히 이러한 기술은 식품 산업에서 활발히 연구되고 있다. 홍삼의 유효성분으로 protopanaxadiol type (Ra1, Ra2, Ra3, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, Rh2 그리고 Rs1)와 protopanaxatriol type (Re, Rf, Rg, Rg1, Rg2 그리고 Rh1) 등 30 종류 이상의 진세노사이드가 존재하기 때문에, 이들 각각에 대한 반추위 발효특성에 대한 효과를 주장하는 기술은 연구가 많이 부족한 실정이다.

이에, 본 발명은 버려지는 홍삼박을 이용하여 안전성을 확보하면서, 체내 흡수율 및 그 효능을 최대화하고, 다양한 생리작용의 상승 효과를 통하여 육량 증진 및 육질 향상에 기여할 수 있는 새로운 균주를 발견하고, 이의 활용가능성을 제시하고자 한 것이다.

특허문헌 1. 한국등록특허공보 제10-1380516호

본 발명의 목적은 반추동물 TMR 사료 발효능을 갖고, 홍삼박의 발효 시 진세노사이드 생물전환능을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주[기탁번호:KCTC 18797P]를 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 반추동물의 성장시기에 따라 섭취하는 사료의 영양학적 구성을 제어함으로써, 섭취시 초산, 프로피온산의 함량은 높으며, 기호성 저하의 원인이 될 수 있는 뷰틸산, 아미노산태 및 가스생성량은 낮추어, 한우 고급육을 생산할 수 있는 발효사료를 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 대용량으로 발효사료를 생산하기 위한 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 반추동물 TMR 사료 발효능을 갖고, 홍삼박의 발효 시 진세노사이드 생물전환능을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주[기탁번호:KCTC 18797P]를 제공한다.

상기 균주는 홍삼박이 처리된 TMR 사료로부터 분리된 것일 수 있다.

상기 균주는 홍삼박의 발효 시 진세노사이드 Rb1을 Rh2 및 Rg3로의 생물전환능을 가지는 것일 수 있다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 섬유질 완전배합사료(TMR)에 홍삼박을 혼합하고, 이를 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주[기탁번호:KCTC 18797P]로 발효시킨 반추동물용 발효사료를 제공한다.

상기 균주는 상기 섬유질 완전배합사료 100 중량부를 기준으로 0.01 내지 1 중량부 접종되는 것일 수 있다.

상기 홍삼박은 섬유질 완전배합사료 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 5 중량부 혼합된 것일 수 있다.

상기 발효사료는 균주를 접종한 후, 0~40 ℃에서, 1 내지 5일동안 발효시킨 것일 수 있다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 섬유질 완전배합사료(TMR)에 홍삼박을 혼합하고, 여기에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주[기탁번호:KCTC 18797P]를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 반추동물용 발효사료의 제조방법을 제공한다.

상기 발효는 0~40℃에서 1 내지 5일 동안 수행되는 것일 수 있다.

상기 반추동물용 발효사료는 육성기에는 초산 대 프로피온산의 비를 2.54이고, 비육전기에는 2.47이며, 비육후기에는 2.2를 유지하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 반추위 내에서 생성되는 메탄을 저감하고, 젖산, 초산, 프로피온산과 같은 유기산의 함량은 높으면서 기호성 저하의 원인이 될 수 있는 뷰틸산의 함량은 저감시키기 위해, 홍삼박에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주를 접종하여 발효시킴으로써, 휘발성 지방산 생성량에 큰 영향을 미치지 않으면서 메탄 생성은 감소시키고 젖산, 초산, 프로피온 함량은 효과적으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 반추동물의 육질 개선을 위한 홍삼박 발효물 및 이를 포함하는 사료 조성물을 제조할 수 있게 한다.

도 1은 홍삼박을 기질로 포함하는 3종류 TMR 사료별로부터 MRS 배지를 통해 분리한 1000여 개의 단일 콜로니들로 이루어진 라이브러리이다.
도 2는 순수분리한 1000여 개의 균에 대해 4-methylumbelliferyl β-D-glucoside(MUG) 실험을 수행하여 beta-glucosidase 활성을 측정한 결과이다.
도 3은 실험예 2를 통해 1차 선별된 30개의 균주(17, 19, 21, 24, 34, 35, 43, 50, 52, 54, 58, 59, 60, 61, 67, 70, 73, 79, 81, 86, 87, 88, 90, 92, 93, 94, 98)들 중에 대한 glucosidase 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 4종의 균주(,52, 61, 92, 94)에 대한 진세노사이드(ginsenoside) Rb1의 분해능을 TLC 분석을 통해 확인한 결과이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 발명의 일 측면은 반추동물 섬유질 완전배합사료(TMR) 발효능을 갖고, 홍삼박의 발효 시 진세노사이드 생물전환능을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주[기탁번호:KCTC 18797P]에 관한 것이다.

종래 홍삼액기스, 홍삼농축액을 첨가한 섬유질 완전배합사료(TMR)를 제조한 후, 3일간 발효시킨 후, 이들로부터 1000 종의 균을 순수분리하였다. 상기 1000 종의 균을 대상으로 홍삼박에 대한 β-glucosidase 활성을 확인한 결과, 총 30 종의 균주를 1차 선정하였다. 이들 중에서도 다른 방식의 β-glucosidase 활성을 측정하였고, 4종의 균주를 2차 선별하였다. 상기 균주들 중에서 실제 홍삼박에 대한 생물전환능을 갖는 균주들을 최종 선정하기 위하여, 사포닌 분해활성을 TLC로 분석하였고, 그 결과 락토바실러스 플란타룸 NJ28, 락토바실러스 플란타룸 NJ31 2종의 균주를 확인하였다.

실제, 상기 두 종의 균주로 홍삼박을 첨가한 발효사료를 제조하고, 반추위 내용물에 발효시켰을 때, 한우의 성장단계에 따라 필요한 영양성분을 제공하는 균주를 확인하였다. 그 결과 락토바실러스 플란타룸 NJ28 균주로 발효한 발효사료는 반추위 발효시 총가스 생성량을 감소시키고 초산 생성률이 유의적으로 증가하여 한우 육성우의 섬유소 이용성을 향상시키는데 현저히 우수할 것임을 확인하였다. 또한 비육전기에서도 총가스 생성량을 감소시킬 뿐 아니라 초산과 프로피온산의 비가 2.47로 근내지방 생성을 촉진함을 확인할 수 있었다. 비육후기에서는 프로피온산 생성 증가를 통해 근내지방도 증진에 현저한 효과를 나타냄을 알 수 있다. 즉, 본원발명의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주는 반추동물의 성장시기에 따라 적절한 영양성분을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 총가스생성량도 감소시킬 수 있음을 확인한 바, 한우 고급육 생산을 위한 사료에 사용될 수 있다.

상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주로부터 16S rRNA를 추출하여 염기서열을 분석한 결과, 이는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 속하는 것으로 확인되었다. 이와 같이 획득한 균주를 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였으며, KCTC 18797P의 기탁번호를 부여받았다. 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA를 갖는 것을 특징으로 한다.

홍삼은 지정된 인삼의 재배적지에서 생산된 6년근 수삼 중에서 좋은 품질의 수삼을 정선하고 특수가공기술로 증숙, 건조시켜 인체에 흡수가 잘 되도록 제조한 담황갈색의 인삼을 말한다, 홍삼은 가장 많은 사포닌을 함유하고 있다. 본원발명에서 이용되는 홍삼박은 홍삼 추출액 제조 후에 남는 고형성분으로 20~50% 정도의 홍삼 성분을 보유하는 것일 수 있다.

상기 균주는 홍삼박이 처리된 섬유질 완전배합사료(TMR)로부터 분리되었고, 구체적으로 홍삼박이 처리된 섬유질 완전배합사료(TMR)을 10 내지 50 ℃에서 1 내지 5일간 발효시킨 사료로부터 유래되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 균주는 홍삼박의 발효 시 진세노사이드 Rb1을 Rh2 및 Rg3로의 생물전환능을 가지며, 이를 이용하여 홍삼박의 진세노사이드 Rb1를 발효시킬 경우, 진세노사이드(ginsenoside) Rh2 그리고 진세노사이드(ginsenoside) Rg3를 얻을 수 있다.

본 발명의 균주는 섬유질 완전배합사료(TMR)의 발효능과 동시에 홍삼박에 대한 생물전환능도 갖고 있으면서, 이로 발효된 사료는 반추동물의 고급육 생산을 위해 적절한 영양성분을 반추동물의 성장시기에 따라 제공할 수 있도록 하는 장점을 갖는다.

본 발명의 다른 측면은 섬유질 완전배합사료(TMR)에 홍삼박을 혼합하고, 이를 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주[기탁번호:KCTC 18797P]로 발효시킨 반추동물용 발효사료에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 섬유질 완전배합사료(TMR)에 홍삼박을 혼합하고, 여기에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주[기탁번호:KCTC 18797P]를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 반추동물용 발효사료의 제조방법에 관한 것이다.

상기 균주는 상기 섬유질 완전배합사료 100 중량부를 기준으로 0.01 내지 1 중량부 접종되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.5 중량부일 수 있다.

상기 홍삼박은 섬유질 완전배합사료 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 5 중량부 혼합된 것일 수 있고, 바람직하게는 0.7 내지 2 중량부 혼합된 것일 수 있다.

상기 발효사료는 균주를 접종한 후, 0~40 ℃에서, 1 내지 5일동안 발효시키는 것이 바람직하다. 만일 상기 발효 조건을 벗어나는 경우에는 충분히 발효되지 못하거나, 과도하게 분해되어 본원발명의 효과를 얻을 수 없는 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 섬유질 완전배합사료(TMR)는 당업계에서 일반적으로 사용하는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로는 목초와 같은 식물과 곡류사료를 혼합하여 하나의 사료로 구성한 것을 의미한다. 상기 섬유질 완전배합사료는 건초, 옥수수, 사탕수수, 라이그라스 및 농후사료를 포함할 수 있다. 또한, 상기 섬유질 완전배합사료는 비타민 무기질 복합제나 지방 첨가제등을 포함할 수 있다. 상기 완전배합사료는 전체 중량 대비 건초 30~50중량%, 사탕수수 5~10중량%, 라이그라스 5~10중량%, 농후사료 40~60중량%를 포함하는 것일 수 있다.

보다 구체적으로 상기 섬유질 완전배합사료는 하기 표 1의 조성일 수 있다.

원료명	구성비, % 건물
맥주박	4.82
라이그라스 사일리지	6.04
알팔파건초	12.08
티모시건초	9.66
귀리건초	12.08
면실	5.18
압착옥수수	1.73
사탕수수펄프	5.18
농후사료	41.83
비타민무기물 복합제	0.4
지방첨가제	0.5
중탄산염	0.5
합계	100

본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주[기탁번호:KCTC 18797P]와 홍삼박을 상기 완전배합사료에 넣어주는 경우 반추위내에서 생산되는 초산, 프로피온산 등의 영양성분이 현저히 상승하였고, 총가스 생성량은 현저히 감소시킬 수 있다.

본 발명의 발효사료는 초산의 생성이 증가되어, 우수한 항진균활성을 가지며, 항진균 오염을 억제할 수 있다.

본 발명의 발효사료 제조시 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주 단독으로 사용하는 것이 바람직한데, 만약 다른 락토바실러스 플란타룸 균주와 혼합사용할 경우에는 오히려, 프로피온산만이 과도하게 생성되어, 반추동물의 기본적인 초산 대 프로피온산 2.2:1 조건을 만족하지 못할 뿐만 아니라, 아미노산태질소의 함량이 증가하여 총 가스 생성량이 과도하게 증가할 수 있다.

즉, 본 발명의 반추동물용 발효사료는 육성기에는 초산 대 프로피온산의 비를 2.54이고, 비육전기에는 2.47이며, 비육후기에는 2.2를 유지할 수 있다. 이는 반추동물의 육질개선에 있어 기본적인 조건 범위를 만족하면서도, 각 성장시기에 맞춘 가장 적절한 수치이다.

상기 반추동물은 한우, 육우, 젖소, 물소, 야크, 가얄 및 밴팅으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이상일 수 있고, 바람직하게는 한우 또는 육우일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실험예 1. 홍삼박을 기질로 포함하는 TMR 사료로부터 균주의 분리

CHO's buffer(증류수 1 L, potassium phosphate 0.1 g, magnesium sulfate 0.01 g, sodium acetate 1 g, sodium chloride 1 g) 250 ㎖와 홍삼박 2.5 g을 serum bottle에 넣어 멸균시켜 홍삼박 serum bottle을 제조하였다. 진안 TMR 사료(비육전기, 비육후기, 육성기) 30 g 과 멸균생리식염수 270 ㎖를 섞은 후 30 분간 상온에서 정치 후 상등액을 채취하였다. 앞서 준비한 홍삼박 serum bottle에 TMR 사료 상등액 2.5 ㎖을 접종하여 30 ℃에서 3 일간 발효하였다. 상기 발효액을 MRS 고체배지에서 순차적으로 희석(10^-4배 희석)하여 도말하였다. MRS 고체배지는 30 ℃에서 2 일간 배양하였고, 그 결과 300개 내외의 균이 분포된 고체배지들을 선정하여 새로운 MRS 고체배지를 이용해 총 1000여 개의 단일 균들을 분리하여 라이브러리를 구축하였다(도 1).

홍삼박을 기질로 포함하는 3종류 TMR 사료별로부터 MRS 배지를 통해 1000여 개의 단일 콜로니를 분리하였고, 이를 통해 라이브러리를 도 1과 같이 구축하였다.

실험예 2. β-glucosidase 활성을 갖는 균주의 1차 선별

순수분리한 1000여 개의 균들의 생리활성을 분석하여 1차 선별하고자, MUG test를 진행하였다. 구체적으로 4-methylumbelliferyl-b-D-glucopyranoside(MUG) 0.02 g과 0.7%의 acetate buffer(pH 5.5) 10 ㎖를 섞은 기질용액(substrate solution)을 제조하고, 상기 기질용액을 각각의 균들이 접종된 MRS 고체배지에 부어, 37 ℃에서 20 분간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, U.V 260 nm에서 형광(Fluorescence)을 측정하였으며, beta-glucosidase 활성을 보이는 균을 1차 선별하였다.

도 2는 순수분리한 1000여 개의 균에 대해 4-methylumbelliferyl β-D-glucoside(MUG) 실험을 수행하여 beta-glucosidase 활성을 측정한 결과이다.

도 2에 나타난 바와 같이, 실험예 1로부터 순수분리한 1000여 개의 균들에 대해, β-glucosidase 활성을 확인하기 위하여, MUG를 첨가 후 UV에서 시각화한 결과, 육성우 TMR과 비육전기 TMR 사료로부터 분리한 균주에서 β-glucosidase 활성을 확인하였다. 그러나 비육후기 TMR 사료로부터 분래된 균주에서는 β-glucosidase 활성을 보이는 균주가 관찰되지 않았다.

이를 통해 육성우 TMR 사료와 비육전기 TMR 사료로부터 분리한 균주들 중에서 세포 생장에 문제가 없으면서 β-glucosidase 활성을 보이는 균주 30개 균주(17, 19, 21, 24, 34, 35, 43, 50, 52, 54, 58, 59, 60, 61, 67, 70, 73, 79, 81, 86, 87, 88, 90, 92, 93, 94, 98)를 1차 선별하였다.

실험예 3. β-glucosidase 활성을 통한 2차 선별

1차 선별과정을 통해, MUG test에서 β-glucosidase 활성이 확인된 30개의 균주들을 얻었다. 이후, p-nitrophenyl-β-D-glucoside로 glucosidase 활성을 분석하여 2차 선별조건으로 하고자 하였다. 기질용액은 50 mM sodium acetate buffer(pH 5.5)에 p-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside(pNPG)를 혼합하여, 최종 농도 5 mM가 되도록 하여 제조하였다. 종료용액(stop solution)은 1 M의 sodium carbonate을 사용하였고, 이를 통해 반응을 종료시켰다. 1차 선별된 균들은 MRS 액체배지(MRS broth)에 24 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 1차 선별된 균의 배양액 100 ㎕와 기질용액 1 ㎖를 혼합하고, 37 ℃에서 40 분 동안 반응 시킨 후, 종료용액 2 ㎖를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음, 원심분리하여 상등액을 얻고, 이를 OD 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 3은 실험예 2를 통해 1차 선별된 30개의 균주(17, 19, 21, 24, 34, 35, 43, 50, 52, 54, 58, 59, 60, 61, 67, 70, 73, 79, 81, 86, 87, 88, 90, 92, 93, 94, 98)들 중에 대한 glucosidase 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3에 나타난 바와 같이, MUG 테스트를 통해 활성이 확인된 30종의 균주 들 중에서 p-nitrophenyl-β-D-glucoside을 이용한 glucosidase 활성을 나타내는 균주는 총 4종의 균주(52, 61, 92, 94)인 것으로 확인되었다.

실험예 4. 홍삼박 농도에 따른 생육 영향 분석

2차 선별된 균주(52, 61, 92, 94)가 각기 다른 농도의 홍삼액을 첨가했을 때 생장 수준과 적정 농도를 알아보고자 하였다.

서로 다른 조건 하에서, 각 균주의 생육실험(bacterial growth test)을 수행하기 위해, 우선 시중에서 구입한 홍삼농축액(홍삼정, 정관장) 또는 홍삼액기스(홍천웅, 정관장)를 사용하였다. 상기 홍삼농축액 또는 홍삼액기스 농도를 순차적으로 희석(원액, 10^-1배, 10^-2배, 10^-3 배, 10^-4배)하고, 같은 양의 MRS 액체배지와 혼합하여 홍삼배지를 제조하였다. 상기 홍삼배지에 선별된 균주를 각각 접종하여 30 ℃에서 24 시간 배양하였다. Bacterial growth는 OD 600 nm에서 측정하였다.

배지에 첨가된 홍삼농축액 희석배수	OD 수치 (평균±표준편차)
배지에 첨가된 홍삼농축액 희석배수	52번 균주	61번 균주	92번 균주	94번 균주
원액	1.36±0.05	1.47±0.01	1.28±0.08	1.20±0.01
10^-1	2.15±0.03	2.22±0.01	2.20±0.00	2.20±0.00
10^-2	2.13±0.01	2.20±0.00	2.15±0.00	2.15±0.00
10^-4	2.10±0.02	2.17±0.00	2.13±0.00	2.15±0.00
배지에 첨가된 홍삼액기스 희석배수	52 번 균주	61번 균주	92번 균주	94번 균주
10^-1	1.58±0.00	1.64±0.00	1.62±0.01	1.59±0.01
10^-2	2.05±0.02	2.11±0.00	2.08±0.00	2.08±0.00
10^-3	2.09±0.00	2.18±0.00	2.15±0.00	2.15±0.00
10^-4	2.11±0.01	2.19±0.00	2.16±0.00	2.15±0.00

표 2에 나타난 바와 같이, 홍삼농축액과 홍삼액기스 모두 2차 선별된 4종의 균주의 생육에 큰 영향을 미치지 않은 것으로 확인되었다. 즉 본원발명의 2차 선별된 4종의 균주들은 홍삼을 기질로하여 생육 가능한 균주들임을 알 수 있다.

실험예 4. 사포닌 분해활성 분석

TLC(Thin-layer chromatography) 분석을 통해, 2차 선별된 4종의 균(52, 61, 92, 94)이 전환시키는 진세노사이드(ginsenoside)의 종류를 확인하고자 하였다.

우선, 100배 희석한 홍삼농축액(홍삼정, 정관장) 100 ㎖를 혼합한 MRS 액체배지 100 ㎖(홍삼배지)를 준비하였다. 2차 선별된 4종의 균주를 각각 홍삼배지에 접종하였다(100 ㎖ 배지당 1 ㎖ 접종). 상기 배지를 30 ℃에서 24 시간동안 배양한 후, OD 600 nm에서 흡광도를 측정하고, 혼탁도를 1.0로 조정하였다. 균주의 각 배양액 샘플은 원심분리(15,000 ×g for 10 min at 4℃)한 후, 상등액을 회수하고, 상기 상등액과 에탄올을 1 : 4의 중량비로 혼합한 다음, 20 분 동안 얼음에 놓고 반응시켰다. 반응액을 다시 원심분리(10,000 ×g for 40 min at 4℃)하여 상등액은 버리고, 펠렛(pellet)을 수집하였다. 상기 펠렛에 20 mM sodium phosphate buffer(pH 6.0) 200 ㎕와 1 mM 진세노사이드 Rb1(ginsenoside Rb1) 200 ㎕을 넣어 재현탁(re-suspend)하였다. 혼합액을 30 ℃에서 72 시간 배양(190 rpm)한 후, 동일한 양의 watersaturated n-butanol을 첨가하여 추출하였고 이를 TLC 시료로 사용하였다. TLC 분석 플레이트로 Silica gel 60 F254 플레이트(60F254, Merck KGaA, Darmstadf, Germany)를 사용하였고, 전개 용매(Developing solvent)로는 Chloroform, Methanol, D.W를 각 65:35:10의 비율로 섞은 용액을 사용하였다. TLC 시료를 100 ㎕씩 분주하고 완전히 건조시킨 다음 전개용매를 통해 전개하였다. 전개가 완료된 후, 스팟의 확인을 위해 10% Sulfuric acid을 분무하고 110ㅀC에서 오븐에 넣어 15 분간 가열하였다.

도 4는 4종의 균주(52, 61, 92, 94)에 대한 진세노사이드(ginsenoside) Rb1의 분해능을 TLC 분석을 통해 확인한 결과이다. 이때, negative는 균을 첨가하지 않은 MRS 액체배지를 전개한 것이고, positive는 각각 1 mM의 compound C-K, ginsenoside Rh2, ginsenoside Rg3, ginsenoside Rd (Biopurify Phytochemicals Ltd., China)를 전개한 것이다.

도 4에 나타난 바와 같이 52번 균주는 component C-K와 진세노사이드(ginsenoside) Rh2로 분해하였으며, 61번 균주는 진세노사이드(ginsenoside) Rh2 그리고 진세노사이드(ginsenoside) Rg3으로 전환시키는 능력이 있음을 확인하였다. 92번 균주와 94번 균주에서는 분해능이 전혀 확인되지 않았다. 현단계를 통해 52번 균주와 61번 균주가 3차 선발되었다.

실험예 5. 2차 선발된 균의 동정

2차 선별된 4종의 균주는 DNA 동정(16S rRNA gene) 후 NCBI에서 BLAST한 결과, Lactobacillus species 와 Bacillus subtilis 그리고 2종의 Prevotella와의 유사성을 확인하였으며, 그 결과 Lactobacillus plantarum과 상당한 유사성을 보이는 것을 확인하였다.

이 중에서도 3차 선별된 sample number 52 균주는 Lactobacillus plantarum NJ31로 명명하였고, sample number 61 균주는 Lactobacillus plantarum NJ28로 명명하였다. 특히, 최종 선발된 Lactobacillus plantarum NJ28 균주는 생물자원센터 KCTC에 기탁하였다(기탁번호: KCTC18797P).

실험예 6. 생체 외( In vitro ) 반추위 발효실험

도축 반추위 내용물은 익산 소재의 ㈜축림 도축장에서 도축이 완료된 직후 채취하였다. 채취된 도축 반추위 내용물은 4겹의 cheese cloth를 이용하여 일차적으로 여과한 후, 보온 용기에 담아 혐기 조건을 유지하였다. 실험 전 CO₂를 주사하여 pH 6.5로 조정한 McDougall's buffer와 상기 반추위액을 4:1의 부피비로 혼합하여 이식편(inoculum)으로 사용하였다. McDougall's buffer의 조성은 표 3에서 나타내었다.

Ingredients	Amount (/L)
NaHCO₃	9.80 g
Na₂HPO₄·2H₂O	4.62 g
KCl	0.57 g
NaCl	0.47 g
MgSO₄·7H₂O	0.12 g
CaCl₂	0.00004 g

TMR 사료(육성기, 비육전기 또는 비육후기)(500 g)를 준비하였다. 여기에 진안홍삼한우협동조합으로부터 얻은 홍삼박을 혼합하였다. 상기 홍삼박은 TMR 사료 100 중량부를 기준으로 1 중량부 첨가하여 홍삼 TMR 사료를 제조하였다. 상기 홍삼 TMR 사료에 Lactobacillus plantarum NJ31(처리구 1), Lactobacillus plantarum NJ28(처리구 2) 또는 NJ31과 NJ28 균주를 1:1로 혼합한 혼합균주(처리구 3)를 접종하였다. 균주의 접종량은 상기 홍삼 TMR 사료 100 중량부를 기준으로 0.1 중량부(0.5g)을 접종하였다. 상술한 바와 같이 제조된 홍삼 TMR 사료를 30 ℃에서 3 일간 발효하여 발효 홍삼사료를 제조하였다.

상기 각각의 발효 홍삼사료 0.5 g을 serum bottle에 넣고 50 ml의 rumen inoculum을 분주하여 밀봉 후 24시간 발효시킨 다음, 발효가스 생성량, pH 등을 다음과 같이 측정하였고, 그 결과는 표 4에 나타내었다.

1-2. 발효가스 생성량(ml): 실험용 유리주사기를 이용하여 상기 발효물의 발효가스 양을 측정하였다.

1-3. pH: pH meter(S20 Seven Eazy^TM, Mettler-Toledo)를 이용하여 측정하였다.

1-4. 암모니아태 질소(mg/dL): 반추위액 내 암모니아태 질소(NH₃-N) 함량은 Gas chromatography로 측정하였다.

1-5. 총 휘발성 지방산(mM): 반추위액 내 휘발성지방산(VFA)은 Gas chromatography로 측정하였다.

구분	시험구				SEM¹	p-value
구분	대조군	처리구 1	처리구 2	처리구 3	SEM¹	p-value
육성기
총가스생성량, mL	101.00^b	103.33^a	96.33^d	99.67^c	0.773	<0.05
pH	6.42	6.37	6.44	6.41	0.015	0.510
암모니아태질소, mg/dL	7.79	13.41	10.63	6.10	1.227	0.148
총휘발성지방산, mM	75.20	79.40	76.34	75.78	0.897	0.394
초산, mM	38.90^b	44.57^a	44.12^a	43.37^a	0.842	<0.05
프로피온산, mM	16.00	17.75	17.34	17.22	0.258	0.061
뷰틸산, mM	12.54	11.34	10.28	10.45	0.352	0.056
발러릭산, mM	7.76^a	5.74^ab	4.60^b	4.74^b	0.463	<0.05
초산/프로피온산 비율	2.43	2.51	2.54	2.52	0.021	0.302
비육전기
총가스생성량, mL	116.33^a	112.00^b	114.67^a	110.00^c	0.770	<0.05
pH	6.32	6.34	6.33	6.35	0.005	0.226
암모니아태질소, mg/dL	8.11^ab	6.09^b	8.84^a	9.00^a	0.443	<0.05
총휘발성지방산, mM	89.98	96.93	97.42	92.01	1.450	0.183
초산, mM	48.58	52.68	53.22	49.56	0.809	0.085
프로피온산, mM	19.47	21.63	21.51	20.30	0.361	0.079
뷰틸산, mM	14.65	15.21	15.22	14.77	0.258	0.851
발러릭산, mM	7.28	7.41	7.48	7.38	0.224	0.994
초산/프로피온산 비율	2.50	2.44	2.47	2.44	0.016	0.492
비육후기
총가스생성량, mL	124.00^d	132.67^b	134.33^a	130.00^c	1.188	<0.05
pH	6.26	6.23	6.18	6.18	0.014	0.051
암모니아태질소, mg/dL	6.06	7.85	7.42	7.51	0.360	0.334
총휘발성지방산, mM	102.40	102.89	103.13	107.77	1.770	0.744
초산, mM	54.40	53.81	53.84	57.79	0.964	0.528
프로피온산, mM	22.62^b	23.19^b	24.91^ab	27.68^a	0.712	<0.05
뷰틸산, mM	17.44	17.84	16.31	16.04	0.386	0.311
발러릭산, mM	7.94	8.05	7.07	6.25	0.398	0.379
초산/프로피온산 비율	2.41^a	2.32^a	2.20^b	2.09^c	0.039	<0.05

¹은 'Standard error of mean'이다.

^abcd 같은 줄(column)에서 서로 다른 문자는 유의적으로 다름을 나타냄(P<0.05)

표 4에 나타난 바와 같이, 선별된 균주를 이용해 발효한 각각의 발효 홍삼사료가 반추위 발효에 미치는 영향을 in vitro 실험을 통해 확인하였다. 균주를 접종하지 않은 대조구와 비교했을 때, 처리구 2(NJ28로 발효한 발효 홈삼사료)의 총가스 생성량이 유의하게 줄어들었고, 처리구 2(NJ28로 발효한 발효 홈삼사료)의 초산 생성률이 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 반추위내 초산 생성은 반추위내 섬수소 분해도를 나타내는 지표이고, 한우 육성기는 섬유소 분해 및 이용이 매우 중요한 시기이므로, 본원발명의 NJ28 균주의 적용은 한우 육성우의 섬유소 이용성을 향상시키는데 효과가 유의적으로 우수하다 할 수 있다.

또한, 처리구 1(NJ31로 발효한 발효 홈삼사료) 암모니아태 질소, 총가스생성량이 유의적으로 높으며, 발러릭산의 함량도 높은 것으로 측정되었다.

비육전기에서도 처리구 2(NJ28로 발효한 발효 홈삼사료)에서 총가스 생성량이 유의적으로 감소하는 것을 볼 수 있다.

비육후기에서 처리구 1(NJ31로 발효한 발효 홈삼사료)와 처리구 3(NJ28 및 N31의 혼합균주로 발효한 발효 홈삼사료)는 프로피온산이 크게 증가하는 경향을 보인 반면, 비육후기에서는 처리구 2(NJ28로 발효한 발효 홈삼사료)는 총가스 생성량이 증가하였다. 처리구 3(혼합균주)는 프로피온산이 현저히 증가하였으나, 과도하게 증가하여 오히려 초산 대 프로피온산의 비가 2.2 밑으로 크게 저하하였음을 알 수 있다. 초산과 프로피온산의 비는 2.2:1 이상이여야 근내지방을 기본적으로 유지할 수 있고, 이는 필수적으로 만족해야하는 가장 기본적인 기준이다. 따라서, 처리구 3은 프로피온산은 증가하였지만 기본적인 기준을 만족하고 있지 못하므로 발효사료로써 사용될 수 없음을 알 수 있다.

비육후기 반추위 내에서 생성된 프로피온산은 근내지방도(마블링) 향상에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서 NJ28 균주로 발효시킨 홍삼사료는 한우 육질 향상에 현저한 도움을 줄 수 있다.

종합하면 처리구 2(NJ28로 발효한 발효 홈삼사료)는 in vitro 발효 실험을 통해 육성기 사료의 섬유소 이용성을 향상시키고 비육후기사료의 프로피온산 생성량이 증가하였다. 이를 통하여 섬유소가 많이 급여되는 육성기에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 사료된다. 즉, 처리구 2(NJ28로 발효한 발효 홈삼사료)는 모든 한우의 성장시기에 적용이 가능하며, 적용시 지방도(마블링) 증진에 효과가 있는 프로피온산 생성 증가 효과를 통해 한우 고급육 생산에 도움을 줄 것임을 알 수 있다.

<110> Jinan-gun INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Strain having ginsenoside bioconversion activity and Fermented total mixed ration feed using the same <130> HPC9147 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1255 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16 rRNA of Sample 61 (Lactobacillus plantarum NJ28) <400> 1 gctagatggt ggggtaacgg ctcaccatgg caatgatacg tagccgacct gagagggtaa 60 tcggccacat tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 120 ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct 180 cgtaaaactc tgttgttaaa gaagaacata tctgagagta actgttcagg tattgacggt 240 atttaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca 300 agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg 360 aaagccttcg gctcaaccga agaagtgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag 420 gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc 480 gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagtatgggt agcaaacagg 540 attagatacc ctggtagtcc ataccgtaaa cgatgaatgc taagtgttgg agggtttccg 600 cccttcagtg ctgcagctaa cgcattaagc attccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct 660 gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 720 gctacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atactatgca aatctaagag attagacgtt 780 cccttcgggg acatggatac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 840 tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tattatcagt tgccagcatt aagttgggca 900 ctctggtgag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg 960 ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggatgg tacaacgagt tgcgaactcg 1020 cgagagtaag ctaatctctt aaagccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct 1080 acatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg 1140 gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa cacccaaagt cggtggggta 1200 accttttagg aaccagccgc ctaaggtggg acagatgatt agggtgaagt cgtac 1255

Claims

삭제
삭제
삭제
섬유질 완전배합사료(TMR)에 홍삼박을 혼합하고, 여기에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주[기탁번호:KCTC 18797P를 접종하여 30 ℃에서, 1 내지 5일 동안 발효시켜 제조된 것을 특징으로 하는 반추동물용 발효사료로,
상기 균주는 홍삼박이 처리된 섬유질 완전배합사료(TMR)로부터 분리되고, 반추동물 섬유질 완전배합사료(TMR) 발효능과 홍삼박의 진세노사이드 Rb1을 Rh2 및 Rg3로 생물전환하는 활성을 동시에 갖는 것을 특징으로 하고,
상기 발효사료는 NJ28 균주에 의한 발효를 통해 반추동물의 성장시기별 적절한 영양학적 구성을 가져, 육성기 반추동물의 반추위내에서는 초산 생성량 대비 프로피온산의 생성량 비율을 2.54로 유지시키고, 비육전기 반추동물 반추위액에서는 2.47로 유지시키며, 비육후기 반추동물 반추위액에서는 2.2로 유지시키는 것을 특징으로 하는 반추동물용 발효사료.
제4항에 있어서,
상기 균주는 상기 섬유질 완전배합사료 100 중량부를 기준으로 0.01 내지 1 중량부 접종되는 것을 특징으로 하는 반추동물용 발효사료.
제4항에 있어서,
상기 홍삼박은 섬유질 완전배합사료 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 5 중량부 혼합된 것을 특징으로 하는 반추동물용 발효사료.
삭제
섬유질 완전배합사료(TMR)에 홍삼박을 혼합하고, 여기에 반추동물 섬유질 완전배합사료(TMR) 발효능과 홍삼박의 진세노사이드 Rb1을 Rh2 및 Rg3로 생물전환하는 활성을 동시에 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주[기탁번호:KCTC 18797P]를 접종하여 30 ℃에서 1 내지 5일 동안 발효시키는 단계를 포함하고
상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) NJ28 균주[기탁번호:KCTC 18797P]는 홍삼박이 처리된 섬유질 완전배합사료(TMR)로부터 분리되고, 반추동물 섬유질 완전배합사료(TMR) 발효능과 홍삼박의 진세노사이드 Rb1을 Rh2 및 Rg3로 생물전환하는 활성을 동시에 가지며, 반추동물 섬유질 완전배합사료에 적용하여 발효사료 제조시 성장시기별 반추동물의 반추위 발효에 영향을 미치며, 육성기 반추동물의 반추위내에서는 초산 생성량 대비 프로피온산의 생성량 비율을 2.54로 유지시키고, 비육전기 반추동물 반추위액에서는 2.47로 유지시키며, 비육후기 반추동물 반추위액에서는 2.2로 유지시키는 것을 특징으로 하는 반추동물용 발효사료의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 균주는 상기 섬유질 완전배합사료 100 중량부를 기준으로 0.01 내지 1 중량부 접종되는 것을 특징으로 하는 반추동물용 발효사료의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 홍삼박은 섬유질 완전배합사료 100 중량부를 기준으로 0.5 내지 5 중량부 혼합된 것을 특징으로 하는 반추동물용 발효사료의 제조방법.
삭제
삭제