KR102399872B1 - 젖비단그물버섯 유래의 벤조퓨란계 화합물을 포함하는 암 전이 억제용 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

젖비단그물버섯 유래의 벤조퓨란계 화합물을 포함하는 암 전이 억제용 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 젖비단그물버섯 유래의 벤조퓨란계 화합물은 암 전이 억제 효과를 가지므로, 상기 화합물, 이의 용매화물, 입체 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 암 전이 억제에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

젖비단그물버섯 유래의 벤조퓨란계 화합물을 포함하는 암 전이 억제용 조성물 및 그의 용도{Composition for inhibiting metastasis of cancer comprising benzofuran-based compounds derived from Suillus granulatus and use thereof}

젖비단그물버섯 유래의 벤조퓨란계 화합물을 포함하는 암 전이 억제용 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

암(cancer)이란 다양한 원인에 의해 세포의 분열과 사멸 간의 균형이 파괴됨으로써 계속적인 분열과 증식에 의해 발생하는 비정상적인 세포의 집단을 의미하며, 악성종양이라고도 한다. 일반적으로 암은 장기, 백혈구, 뼈, 림프절 등을 포함한 100 가지 이상의 신체의 여러 부분에서 발병하며, 암은 국내에서 사망 원인 통계를 작성하기 시작한 1983년 이후 한 해도 빠지지 않고 사망 원인 1위를 기록하고 있다. 특히 암 중에서 폐암으로 사망하는 환자는 2017년 기준 가장 발생 빈도가 높으며, 그 다음으로 간암, 위암, 대장암 및 췌장암에 이른다. 주변 조직 및 다른 기관으로 전이를 통해 심각한 증상으로 발전하여 최종적으로 사망에 이르게 된다.

암 전이 과정은 암세포의 이동, 침윤, 혈관 내 이동, 전이 가능한 장기에 흡착 및 성장으로 구성된다. 특히 이러한 암 전이 과정에서 암세포의 이동과 침윤이 일어나기 위해서는 우선적으로 암세포는 상피-간엽전환(Epithelial to Mesenchymal Transition: EMT)이라는 현상을 겪게 된다. EMT 현상은 저산소 상황, 약물 저항성 획득, 다양한 사이토카인의 자극 등에 의해 일어나는 것으로 알려져 있다. 그 중 전환성장인자(Transforming growth factor-β1: TGF-β1), 상피성장인자(Epidermal growth factor: EGF), 및 섬유아세포 성장인자(Fibroblast growth factor: FGF) 및 간세포성장인자(hepatocyte growth factor: HGF)가 대표적인 암 전이 유도 사이토카인으로 알려져 있다.

현재 암을 치료하는 방법으로는 초기에 발견되는 암일 경우 수술, 항암제, 방사선 치료 등이 이용되고 있으나 사망의 주된 원인은 암세포의 전이에 의해 유발된다. 따라서 암세포의 이동이나 침윤을 억제하는 기전의 규명이나 효과적인 치료 약물 개발이 많은 연구자들의 주된 표적이 되고 있다. 이에 암 치료를 위한 새로운 접근방법으로 독성이 비교적 낮은 천연물로부터 부작용이 적고 암 종의 전이를 억제하거나 감소시키는 효능이 뛰어난 발암 억제제 및 암 치료제를 개발하기 위한 연구가 진행되고 있다.

대한민국 공개특허 제10-2019-0062149호.

일 양상은 젖비단그물버섯 유래의 벤조퓨란계 화합물, 이의 용매화물, 입체 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암 전이를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 젖비단그물버섯 유래의 신규한 벤조퓨란계 화합물, 이의 용매화물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.

일 양상은 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 입체 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 조성물을 제공한다:

[화학식 I]

.

상기 화학식 I에서, R은 H 또는 히드록시기이다.

상기 화학식 I로 표시되는 화합물은 화학식 I-a, I-b 또는 I-c로 표시되는 화합물을 포함할 수 있다:

[화학식 I-a]

;

[화학식 I-b]

; 및

[화학식 I-c]

.

상기 화학식 I-a로 표시되는 화합물은 메틸 (3aR,8bS)-3-(3,4-디히드록시페닐)-2,7-디히드록시-1-옥소-8bH-시클로펜타[b][1]벤조퓨란-3a-카르복실레이트로, 수일루신(suillusin)일 수 있다.

상기 화학식 I-b로 표시되는 화합물은 메틸 (3aR,8bR)-3-(3,4-디히드록시페닐)-2,7-디히드록시-1-옥소-8bH-시클로펜타[b][1]벤조퓨란-3a-카르복실레이트로, 이소-수일루신(iso-suillusin)으로 명명되는 화합물일 수 있다.

상기 화학식 I-c로 표시되는 화합물은 메틸 (3aS,8bR)-3-(3,4-디히드록시페닐)-2,7,8b-트리히드록시-1-옥소-시클로펜타[b][1]벤조퓨란-3a-카르복실레이트로, 8-히드록시수일루신(8-hydroxysuillusin)으로 명명되는 화합물일 수 있다.

상기 화학식 I로 표시되는 화합물은 합성한 것 또는 분리한 것일 수 있다. 예를 들어, 젖비단그물버섯(Suillus granulatus)으로부터 분리한 것일 수 있다.

상기 조성물은 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 입체 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 젖비단그물버섯 추출물을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "젖비단그물버섯(Suillus granulatus)"은 그물버섯목(Boletales), 비단그물버섯과(Suillaceae)에 속하는 버섯으로 균모의 지름은 4~10 cm로 반구형에서 둥근산 모양을 거쳐 거의 편평하게 이루어져있는 것일 수 있다. 표면은 밤갈색이며 습기가 있을 때는 심한 끈적임이 있으나 나중에 마르면 황색에서 황갈색으로 변하고 어릴 때는 백황색의 유액을 분비하고 자실층은 적갈색을 띄고 있는 것일 수 있다. 자루의 길이는 4~7 cm 정도로 위아래 굵기가 같거나 아래쪽으로 가늘어 지며, 초여름에서 가을까지 소나무, 스트로브잣나무와 같은 침엽수림 내 땅 위에 흩어져나거나 무리를 이루거나 단독으로 자생하며 전세계적으로 분포하는 것일 수 있다.

상기 젖비단그물버섯 추출물은 젖비단그물버섯을 용매에 의하여 추출한 것일 수 있다. 상기 용매는 물, 알콜, 예를 들면, C1-C6 알콜, 예를 들면, C1-C4 알코올, 헥산, 에틸아세테이트, 또는 이들의 혼합 용매일 수 있다. 상기 C1-C6 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 1,3-프로판디올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올 등일 수 있다. 상기 헥산은 n-헥산일 수 있다. 상기 용매는 예를 들면, 물과 알콜의 혼합물 즉 알콜 수용액일 수 있다. 상기 추출은 젖비단그물버섯에 대하여 상기 추출 용매를 1 내지 20 (부피/중량)배로 사용하여 추출하는 것일 수 있다. 상기 추출은 가열 추출, 냉침 추출, 환류냉각 추출, 또는 초음파 추출 등이 이용될 수 있다. 상기 추출은 실온 또는 가온 조건에서 수행될 수 있고, 예를 들어, 4℃ 내지 90℃의 온도에서 추출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출 시간은 추출 용매 또는 온도 등 조건에 따라 달라질 수 있는데, 1 시간 내지 1개월, 예를 들면, 1 시간 내지 15일, 1 시간 내지 10일, 1 시간 내지 5일, 1 시간 내지 3일, 1 시간 내지 2일, 1 시간 내지 1일, 1시간 내지 12 시간, 1 시간 내지 8 시간, 또는 1 시간 내지 6 시간 동안 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 추출은 상기 용매 중에 젖비단그물버섯을 혼합하고 일정 시간 동안 방치하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방치는 적당한 교반을 포함할 수 있다. 상기 추출은 1회 이상, 예를 들면, 1 내지 5회 반복될 수 있다. 상기 추출은 젖비단그물버섯 및 추출액을 여과 등의 알려진 방법에 의하여 분리하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출액으로부터 감압 농축과 같은 알려진 방법에 의하여 용매를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출물을 동결건조와 같은 건조에 의하여 건조 추출물을 제조하는 것을 포함할 수 있다.

상기 젖비단그물버섯 추출물은 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 입체 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 젖비단그물버섯 추출물의 분획물을 포함할 수 있다. 상기 젖비단그물버섯 추출물의 분획물은 젖비단그물버섯 추출물을 용매로 분획하여 제조한 것일 수 있다. 용매 분획은 당업계에 통상적으로 알려진 방법에 의해 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 분획물은 젖비단그물버섯 추출물을 n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 등을 용매로 사용하여 순차적으로 분획화하여 제조한 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 분획물은 젖비단그물버섯의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물일 수 있다.

상기 분획물은 크로마토그래피에 의하여 활성성분으로 더 분리 및 정제될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 역상 분취 고성능 액체크로마토그래피(reverse phase preparative high performance liquid chromatography, Prep-HPLC)일 수 있다. 역상 분취 HPLC에 의한 분리 조건은, 시료의 양과 사용되는 컬럼의 크기에 따라 달라질 수 있다.

본 명세서에서 용어, "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미할 수 있다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "입체 이성질체"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 광학적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미할 수 있고, 구체적으로, 부분입체이성질체, 거울상이성질체, 기하이성질체, 또는 형상이성질체일 수 있다.

또한, 상기 화합물은 무기산 또는 유기산으로부터 유도된 약학적으로 허용 가능한 염 형태로 사용될 수 있으며, 예를 들면 상기 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산, 아세트산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 만델산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 팔미트산, 말레산, 히드록시말레산, 벤조산, 히드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산 또는 톨루엔술폰산 등으로부터 유도된 염일 수 있다.

상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 화학식 I로 표시되는 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁 내막암, 자궁경부암, 방광암, 두경부암, 신세포 암종, 식도암, 췌장암, 뇌암, 위장관암, 간암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 다발성 골수종, 유윙 육종, 골육종, 결장직장암, 담관암, 융모막암종, 구강암, 신경모세포종, 피부암, 고환암, 기질종양, 생식세포종양, 또는 갑상선암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물에 있어서, 상기 조성물은 개체에서 암세포의 사멸을 유도하는 농도 미만의 농도로 투여하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 개체에서 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상의 암세포가 생존하는 농도로 투여하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 개체에서 암세포의 상피-간엽전환(Epithelial to Mesenchymal Transition: EMT)을 억제하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 개체에서 암세포의 사멸을 유도하지 않는 농도에서 EMT를 억제하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 개체에서 암세포의 사멸 유도 여부와 무관하게 암세포의 EMT를 억제하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 약학적으로 또는 식품학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 첨가제를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있으며, 정제, 환제, 산제, 캅셀제, 시럽, 에멀젼, 마이크로에멀젼 등의 다양한 경구 투여 형태 또는 근육내, 정맥내 또는 피하 투여와 같은 비경구 투여 형태로 제조될 수 있다.

상기 약학적 조성물이 경구 제형의 형태로 제조되는 경우, 사용되는 첨가제 또는 담체의 예로는 셀룰로오스, 규산칼슘, 옥수수전분, 락토오스, 수크로스, 덱스트로스, 인산칼슘, 스테아르산, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 젤라틴, 탈크, 계면활성제, 현탁제, 유화제, 희석제 등을 들 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물이 주사제의 형태로 제조되는 경우 상기 첨가제 또는 담체로는 물, 식염수, 포도당 수용액, 유사 당수용액, 알콜, 글리콜, 에테르(예: 폴리에틸렌글리콜 400), 오일, 지방산, 지방산에스테르, 글리세라이드, 계면활성제, 현탁제, 유화제 등을 들 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 개체 또는 환자의 암 전이 억제에 치료적으로 유효한 양으로서, 목적하는 바에 따라 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "치료적으로 유효한 양"은 개체에서 암의 전이를 억제하는데 효과적인 양일 수 있다. 예를 들어, 개체의 체중 kg 당 일당 0.01 mg 내지 10 g, 0.01 mg 내지 5 g, 0.1 mg 내지 10 g, 1.0 mg 내지 10 g, 10 mg 내지 10 g, 100 mg 내지 10 g, 또는 50 mg 내지 1000 mg의 양일 수 있다. 상기 투여는 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 개체 또는 환자에 대한 투여 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것이고 전문가에 의해 적절하게 가감될 수 있는 것으로 이해되어야 하며, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다. 관련 기술 분야의 통상의 기술을 갖는 의사 또는 수의사는 요구되는 제약 조성물의 유효량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물에 사용되는 본 발명의 조성물의 용량을 목적하는 치료효과를 달성하는데 요구되는 것보다 낮은 수준에서 출발하여, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다.

다른 양상은 치료적으로 유효한 양의 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암 전이를 억제하는 방법을 제공한다.

상기 투여는 경구 또는 비경구 투여일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "개체"는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 개체는 포유동물일 수 있고, 사람이 아닌 포유동물일 수 있다. 예를 들어, 상기 개체는 생쥐(mouse), 개, 고양이, 돼지, 말, 소, 양 등을 포함할 수 있다.

다른 양상은 화학식 I-b 또는 I-c로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

[화학식 I-b]

; 및

[화학식 I-c]

.

일 양상에 따른 젖비단그물버섯 유래의 벤조퓨란계 화합물은 암 전이 억제 효과를 가지므로, 상기 화합물, 이의 용매화물, 입체 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 암 전이 억제에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 젖비단그물버섯으로부터 수일루신, 이소-수일루신 및 8-히드록시수일루신을 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 젖비단그물버섯의 추출물의 UPLC 크로마토그램이다.
도 3은 젖비단그물버섯 추출물의 헥산 분획물에 대한 UPLC 크로마토그램이다.
도 4는 젖비단그물버섯 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 대한 UPLC 크로마토그램이다.
도 5는 젖비단그물버섯 추출물의 부탄올 분획물에 대한 UPLC 크로마토그램이다.
도 6은 젖비단그물버섯 추출물의 물 분획물에 대한 UPLC 크로마토그램이다.
도 7은 수일루신의 UPLC 크로마토그램이다.
도 8은 이소-수일루신의 UPLC 크로마토그램이다.
도 9는 8-히드록시수일루신의 UPLC 크로마토그램이다.
도 10a 내지 10f는 폐암세포에 수일루신, 이소-수일루신 또는 8-히드록시수일루신 처리 후 세포 생존율을 측정한 결과 그래프이다.
도 11a 내지 11c는 폐암세포에서 수일루신, 이소-수일루신 또는 8-히드록시수일루신의 TGF-β1에 의한 상피-간엽전환(Epithelial to Mesenchymal Transition: EMT) 억제 효과를 나타내는 세포 사진이다.
도 12a 내지 12c는 폐암세포에서 수일루신, 이소-수일루신 또는 8-히드록시수일루신의 TGF-β1에 의한 상피-간엽전환(Epithelial to Mesenchymal Transition: EMT) 억제 효과를 나타내는 웨스턴 블롯 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 젖비단그물버섯으로부터 유효 화합물의 분리 및 정제

실시예 1-1. 젖비단그물버섯 추출물 및 분획물의 제조

젖비단그물버섯(Suillus granulatus)을 강릉시 사천면 일대 야산에서 채집하였다. 이후, 젖비단그물버섯 4 kg을 100% 에탄올 4.5 L에 상온 냉침하여 72시간 동안 추출하였다. 추출물을 거름종이로 여과하여 얻어진 여과액(filtrate)을 감압 증류하여 에탄올 추출물 140 g을 수득하였다. 상기 추출물에 증류수 1.5 L, 헥산 1.2 L, 에틸아세테이트 1.2 L 및 부탄올 1.2 L를 순차적으로 가하여 분획하고, 각 용매 분획물로 헥산층 10 g, 에틸아세테이트층 3.6 g, 부탄올층 3 g, 및 수층 116 g을 수득하였다. 수득한 젖비단그물버섯 추출물, 이의 헥산 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획, 및 물 분획에 대하여 초고성능 액체 크로마토그램(Ultra-Performance Liquid Chromatography: UPLC) 분석을 수행하였다. UPLC 분석은 Nexera X2(Shimadzu, 일본) 기기를 UV 350 nm에서 Phenomenex 사 Luna C18(2) 컬럼, 입자 크기 1.6 μm, 컬럼 크기 150 x 2.1 mm를 사용하고, 용리액은 물 중 초기 10%부터 100% 아세토니트릴의 구배를 29분 동안 유속 0.3 mL/분으로 흘려주는 조건으로 수행하였다. 상기 UPLC 분석으로 수득된 각 크로마토그램을 도 2 내지 6에 나타내었다.

실시예 1-2. 젖비단그물버섯 에틸아세테이트 분획물의 세부 분획물 제조

상기 실시예 1-1에서 수득한 젖비단그물버섯 에틸아세테이트 분획물 3.6 g을 대상으로 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 분석을 수행하였다. 유리관 컬럼(700 x 20 mm)에 Sephadex LH20을 고정상으로 120 g 충진하고 100% 메탄올을 이동상으로 유속은 3 mL/분으로 전개하여 Waters Fraction Collector 3분/튜브의 속도로 용출되어 나오는 용매를 수집하고 4개의 M1, M2, M3, 및 M4 분획물로 나누어 각 1.7 g, 280 mg, 178 mg, 및 50 mg을 수득하였다.

실시예 1-3. 유효 화합물의 분리 및 정제

상기 실시예 1-2에서 수득한 유효 분획물 M2를 대상으로 역상 분취 UPLC 분석을 수행하였다. 구체적으로, Nexera X2(Shimadzu, 일본) 기기를 Phenomenex 사 Luna C18(2) 컬럼, 입자 크기 1.6 μm, 컬럼 크기 150 x 2.1 mm를 사용하여 분석한 결과, 도 7 내지 9에 나타낸 바와 같이, 화합물 3종의 피크를 확인하였다.

이후, 상기 M2 분획물 280 mg을 대상으로 Phenomenex 사 Luna C18(2) 컬럼, 입자 크기 10 μm, 컬럼 크기 250 x 21.20 mm를 이용하여 역상 분취 HPLC 분석을 수행하였다. 용리액은 물 중 초기 5%부터 35% 아세토니트릴의 구배를 1 내지 60 분 동안 유속 4 mL/분으로 흘려주었다. 그 결과, 얻어진 크로마토그램에서 머무름시간 43분에 화합물 1, 23분에 화합물 2, 및 37분에 화합물 3을 각각 12 mg, 18 mg, 및 5 mg 수득하였다.

상기 수득한 화합물 1 내지 3을 대상으로 핵자기공명분광(nuclear magnetic resonance spectrometer: NMR) 분석 및 질량 분석(mass spectroscopy)을 수행하여 구조를 확인하였다. NMR 분석은 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 분석을 브루커 사(Bruker, 독일) 기기(Bruker AVANCE III 400 MHz spectrometer)를 사용하였으며, 분석 데이터는 하기와 같다.

(1) 화합물 1: 수일루신

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 7.65 (d, 1H, J = 1.7 Hz), 7.42 (dd, 1H, J = 8.4, 1.7), 6.82 (d, 1H, J = 2.2), 6.80 (d, 1H, J = 8.4), 6.68 (d, 1H, J = 8.6), 6.64 (dd, 1H, J = 8.6, 2.2), 4.15 (s, 1H), 3.72 (s, 3H).

¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD): δ 198.6, 173.5, 153.7, 153.4, 151.4, 148.2, 146.1, 137.1, 125.4, 123.9, 122.7, 117.3, 117.0, 116.1, 112.1, 111.7, 91.9, 56.8, 53.7.

ESI-MS : m/z 371.2 [M+H]⁺

(2) 화합물 2: 이소-수일루신

¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.62 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.42 (dd, 1H, J = 8.4, 2.0), 6.75 (d, 1H, J = 8.4), 6.65 (d, 1H, J = 8.8), 6.59 (dd, 1H, J = 8.8, 2.8), 6.44 (d, 1H, J = 2.8), 4.34 (s, 1H), 3.71 (s, 3H).

¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 202.1, 176.4, 150.9, 150.8, 150.5, 147.7, 145.9, 138.3, 125.9, 122.9, 122.6, 119.5, 117.1, 116.4, 116.3, 115.9, 80.3, 56.3, 53.4.

ESI-MS : m/z 371.2 [M+H]⁺

(3) 화합물 3: 8-히드록시수일루신

¹H NMR (400 MHz CD₃OD) δ 7.65 (d, 1H, J =1.7 Hz), 7.44 (dd, 1H, J =8.4, 2.4), 6.87 (d, 1H, J =2.2), 6.78 (d, 1H, J =8.4), 6.75 (d, 1H, J =8.8), 6.73 (dd, 1H, J =8.8, 2.6), 4.15 (s, 1H), 3.73 (s, 3H).

¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD) δ 196.4, 171.0, 153.6, 150.8, 148.3, 146.1, 134.9, 133.0, 126.7, 125.4, 123.0, 119.8, 117.2, 116.1, 112.5, 111.7, 96.4, 85.4, 53.8.

ESI-MS : m/z 385.0 [M-H]^-

상기 구조분석을 통하여 화합물 1은 수일루신임을 확인하였고, 신규한 화합물 2 및 3은 각각 이소-수일루신 및 8-히드록시수일루신으로 명명하였다.

실시예 2. 수일루신, 이소-수일루신 및 8-히드록시수일루신의 폐암 전이 억제 효능 확인

실시예 2-1. 각 화합물의 폐암 세포 사멸에 영향을 주지 않는 농도 범위 확인

시험물질이 폐암 세포 사멸 효과와는 별개로 폐암 전이 억제 효과를 갖는지 여부를 확인하기 위하여, 폐암세포 A549에 대해 세포 사멸에 영향을 주지 않는 농도 범위를 확인하였다.

구체적으로, 폐암세포 A549를 인산염 완충액 식염수(phosphate-buffered saline: PBS)로 세척하고, 0.5% 트립신으로 처리한 후, 깨끗한 배지로 세척하였다. 5 X 10³ 개의 세포를 멀티파이펫을 이용하여 96-웰 플레이트에 웰당 100 μL씩 분주하고 24 시간 정도 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양기 조건은 온도 37℃ 공기 95%/이산화탄소 5%로 하였다. 수일루신, 이소-수일루신, 및 8-히드록시수일루신을 깨끗한 배지에 농도별로 희석하여 제조하였다. 구체적으로, 수일루신은 최종 농도 20 μM, 40 μM, 60 μM, 80 μM 및 100 μM이 되도록, 이소-수일루신 및 8-히드록시수일루신은 최종 농도 40 μM, 80 μM, 120 μM, 160 μM 및 200 μM이 되도록 제조하였다. 각 웰에 있는 배지를 흡입 제거한 후 상기 화합물이 포함된 각 배지를 100 ㎕씩 첨가하고, 24 시간 또는 48 시간 동안 배양하였다. EZ-Cytox(Daeil Lab Service, 한국) 10 ㎕를 각 웰에 첨가해 준 후, 2 시간 동안 배양기에서 배양 후 플레이트 리더(plate reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하고, 세포의 생존율을 계산하여 도 10a 내지 10f에 나타내었고, 48 시간 동안 배양 후의 세포 생존율을 하기 표 1에 나타내었다.

구분	농도 (μM)	세포 생존율(%)
수일루신	0	100
	20	109.5
	40	107.4
	60	102.9
	80	90.2
	100	66.2
이소-수일루신	0	100
	40	96.1
	80	93.4
	120	90.5
	160	90.1
	200	76.1
8-히드록시수일루신	0	100
	40	86.0
	80	91.7
	120	89.8
	160	87.9
	200	70.03

그 결과, 48 시간 동안 배양 후, 65% 이상의 세포가 생존한 최대 농도는 수일루신이 100 μM, 이소-수일루신이 200 μM, 8-히드록시수일루신이 200 μM로 나타났다. 따라서, 상기 농도 이하에서는 각 화합물이 세포 생존에 영향을 주지 않는 것으로 결정하였다.

실시예 2-2. 각 화합물의 폐암 전이 억제 효능 확인

폐암세포 A549에서 전환성장인자(Transforming growth factor-β1: TGF-β1)로 유도한 상피-간엽전환(Epithelial to Mesenchymal Transition: EMT)에 대한 각 화합물의 억제 효과를 세포 형태 관찰 및 웨스턴 블롯(Western blot) 분석으로 확인하였다.

구체적으로, 폐암세포 A549를 PBS로 세척하고, 0.5 % 트립신으로 처리한 후, 깨끗한 배지로 세척하였다. 1.5 x 10⁵ 개의 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 2 mL 씩 분주한 후 24 시간 동안 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 수일루신, 이소-수일루신, 및 8-히드록시수일루신을 TGF-β1 5 ng/mL가 포함된 배지를 이용하여 농도별로 제조하였다. 구체적으로, 수일루신은 최종 농도 80 μM 및 100 μM이 되도록, 이소-수일루신 및 8-히드록시수일루신은 최종 농도 160 μM 및 200 μM이 되도록 제조하였다. 각 웰에 있는 배지를 흡입 제거한 후 상기 화합물이 포함된 각 배지를 1.5 mL 씩 첨가하고, 48 시간 동안 배양하였다. 이후, 현미경 카메라를 이용하여 세포의 사진을 찍어 이를 도 11a 내지 11c에 나타내었다.

사진을 찍은 세포를 PBS로 세척한 다음, 세포 스크레이퍼(cell scraper)를 이용하여 세포를 걷어내고 이를 10,000 rpm에서 1 분 동안 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 방사면역침전분석완충액(Radio-immunoprecipitation assay buffer: RIPA 버퍼)을 이용하여 세포를 용해시키고 10 분 뒤 10,000 rpm에서 20 분 동안 원심분리한 후, 상등액만을 새로운 튜브로 옮긴 후 얼음에 보관하였다. 각 세포 파쇄물(lysate)의 단백질 농도를 브래드포드 정량법(Bradford assay)으로 측정한 후, 분자량 마커와 함께 동등한 양의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 로딩하여 전기영동하였다. 전개된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼한 후, 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹하고, E-카드헤린(E-cadherin), N-카드헤린(N-cadherin) 또는 액틴(actin)에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 이후, 트리스완충식염수(Tris Buffered Saline with Tween 20: TBST)로 세척 후, HRP (horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체와 1시간 동안 반응시킨 후, TBST로 세척하고, ECL(Enhanced chemiluminescence) 버퍼와 반응시킨 후, Fusion solo를 이용하여 웨스턴 블롯 밴드 이미지를 얻어 이를 도 12a 내지 12c에 나타내었다. 또한, 상기 웨스턴 블롯 밴드 이미지에서 밴드의 강도(intensity)를 정량하여 TGF-β1을 처리한 대조군 대비 각 화합물 처리군의 EMT 억제율을 백분율로 계산하여 표 2에 나타내었다.

그 결과, 도 11a 내지 11c에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군 폐암세포는 상피세포의 특징인 동그란 형태를 나타내는 반면, TGF-β1로 EMT를 유도한 폐암세포는 길쭉한 모양의 간엽성 세포 형태를 나타내었고, 수일루신, 이소-수일루신 또는 8-히드록시수일루신에 의해 상기 EMT가 억제됨을 확인하였다.

구분	농도 (μM)	EMT 억제율(%)
수일루신	80	49
	100	58
이소-수일루신	160	71
	200	77
8-히드록시수일루신	160	50
	200	55

또한, 도 12a 내지 12c, 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군과 달리 TGF-β1로 EMT를 유도한 폐암세포에서는 상피세포의 세포-세포 결합 단백질인 E-카드헤린의 발현이 감소하고, 간엽성 세포 마커인 N-카드헤린의 발현이 증가한 반면, 수일루신, 이소-수일루신 또는 8-히드록시수일루신에 의해 E-카드헤린 발현 감소 및 N-카드헤린 발현 증가가 억제됨을 확인하였다.

상기 결과를 통하여, 수일루신, 이소-수일루신 및 8-히드록시수일루신은 폐암세포에서 암 전이 과정에 중요한 현상인 EMT 현상을 억제하므로 암 전이를 억제할 수 있음을 확인하였다.

Claims (12)

1. 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 입체 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용 조성물:
   [화학식 I]
   

   

   
   상기 화학식 I에서, R은 H 또는 히드록시기이다.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 용매화물, 입체 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염은 젖비단그물버섯(Suillus granulatus) 추출물로부터 단리된 것인 조성물.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 젖비단그물버섯 추출물은 물, C1-C6의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 또는 이들의 혼합 용매를 용매로 하여 추출된 것인 조성물.
4. 청구항 2에 있어서, 상기 젖비단그물버섯 추출물은 젖비단그물버섯 추출물의 분획물인 것인 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 폐암인 것인 조성물.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 개체에서 암세포의 사멸을 유도하는 농도 미만의 농도로 투여하는 것인 조성물.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 암세포의 상피-간엽전환(Epithelial to Mesenchymal Transition: EMT)을 억제하는 것인 조성물.
8. 청구항 1 내지 7 중 어느 하나의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암 전이를 억제하는 방법으로, 상기 개체는 사람이 아닌 포유동물인 것인 방법.
9. 삭제
10. 청구항 8에 있어서, 상기 암은 폐암인 것인 방법.
11. 청구항 8에 있어서, 상기 조성물은 개체에서 암세포의 사멸을 유도하는 농도 미만으로 투여하는 것인 방법.
12. 삭제

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