KR102389898B1 - Ｆｇｆ11 발현을 억제하는 제제를 포함하는 대사질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
Ｆｇｆ11 발현을 억제하는 제제를 포함하는 대사질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
FGF11를 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 대사질환 예방 또는 치료용, 식이량 감소용 또는 체중 감소용 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공한다. 이에 따르면, 당 내성을 개선하고 인슐린 내성을 개선시켜 대사질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 대사질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
최근 경제성장과 서구적인 생활방식의 변화에 따라 식습관에도 많은 변화가 있다. 특히, 바쁜 현대인들은 패스트푸드 등의 고열량 식이, 당 함량이 높은 디저트 섭취와 적은 운동량으로 인하여 대사 질환이 증가하고 있다. 대사 질환(Metabolic disease)는 생체 내에서의 물질대사 장애에 의해 발생하는 질환을 총칭한다. 그 예로는 비만, 당뇨병 등이 있다. 그 중에서도 비만은 에너지 발란스 조절기능의 이상 혹은 과영양 (hypernutrition)으로 지방조직이 과다하게 축적되어 각종질병의 이환율과 사망률을 높이는 만성 질환이다. 비만 및 이와 관련된 질병은 미국 및 전세계적으로 공통적이고 매우 심각한 공중 보건 문제이며 국제보건기구(World Health Organisation, WHO)에 따르면, 전세계적으로 10억 이상의 성인이 과체중이고, 그 중 적어도 300만 이상이 임상적으로 비만으로 보고 있다. 또한 당뇨는 당뇨병 (Diabetes)은 혈액 내에 존재하는 포도당이 소변을 통해 배출되는 질환으로서, 근본적인 치유가 되지 않는 만성퇴행성질환중의 하나이다. 현대에 들어와서 식생활의 변화와 운동 부족 등으로 인하여, 인체 고유의 에너지 대사과정에 커다란 변화가 발생하였으며, 이에 따라 당뇨병 등의 만성 퇴행성질환은 증가하는 현상을 보이고 있다. 국내에서는 당뇨 유병율이 5-10%에 달하는 것으로 알려져 있으며 지속적인 증가를 보이고 있다. 미국의 경우, 지난 40년간, 당뇨병은 6배가 증가 하였으며 이와 같은 수준의 증가에 의하여 2050년에 이르러서는 환자수가 2600 만 명에 이르게 될 것으로 전망되고 있다.
당뇨병의 95% 이상을 차지하는 제 2형 (인슐린 비의존형) 당뇨병의 병인은 두 가지 원인, 즉 인슐린 분비장애 및 인슐린 저항성의 복합 장애로 알려져 있다. 즉 당뇨병은 이 복합적인 장애로 인해 만성 고혈당 증상을 보이는 질환이다.
이와 같이, 대사 질환은 현대인들에게 흔한 질병으로서 치료제의 개발이 필요한 실정이며, 대사질환을 예방 또는 치료하기 위한 장기적 관점에서 식이요법, 운동과 병행하여 사용될 수 있는 효과적이고 안전한 의약품이 요구되고 있다.
FGF(Fibroblast growth factor)이란, 세포신호단백질을 코딩 하는 유전자로서. 발달 과정에 관여하는 세포 신호 전달 단백질이다. 종래 대사질환을 치료하는 FGF에 대한 연구는 주로 FGF19와 21에 집중되어 있었는데, 그 중에서도 FGF19는 체내 순환 시스템을 통해 호르몬의 역할을 하여 당 항상성과 식욕을 조절하는 것으로 알려져 있고, FGF21은 간에서 생성되어 지방세포의 당 대사 및 체내 에너지 대사 조절의 역할을 한다고 알려져 있다.
그러나 FGF 21의 경우 약동학적으로 취약하여 유전자 치료를 이용한 치료전략이 요구되나, 이러한 유전자 치료의 경우 바로 치료에 적용하기는 어려운 한계점이 있었다.
FGF11은 FGF family 중 FGH homologous factor(FHF)로 분류된다. FGF11에 대한 대사 조절 연구는 구체적으로 이루어진 바 없다. 이러한 배경 하에 본 발명자들은 FGF11이 대사질환에 미치는 영향을 연구하여, 대사질환 예방 또는 치료를 위한 조성물을 완성하였다.
일 양상은 FGF11의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 대사질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 FGF11의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 식이량 감소용 또는 체중 감소용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 FGF11의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 대사질환 예방 또는 개선용, 체중감소용 또는 식이량 감소용 건강기능식품을 제공한다.
또 다른 양상은 대사질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 섬유아세포 성장인자 11(Fibroblast growth factor 11: FGF11)의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 대사질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 FGF11의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 식이량 감소용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 FGF11의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 체중 감소용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 FGF11의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 체지방 감소용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "섬유아세포 성장인자 11(Fibroblast growth factor 11: FGF11)"는 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast growth factor)의 한 종류로서, FGF11은 FGF homologous factors(FHF)에 속하는 것일 수 있다. FHF는 세포내 과정에 관여하는 것일 수 있다. 상기 FGF11은 에너지 대사에 관여하는 것일 수 있다. 상기 FGF11은 포유동물에서 유래된 것일 수 있고, 예를 들어 인간, 원숭이 또는 설치류로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, FGF11가 에너지 대사, 당 대사에 관여한다는 연구는 미비한 실정이며, FGF11 유전자의 발현을 억제하는 물질 또는 FGF11 단백질의 활성을 억제하는 물질이 대사질환의 치료, 체중 및 식이량 감소에 효과적임을 개시하였다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 대사 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대사 질환 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
또한 "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "대사질환(Metabolic disease)"은 체내의 물질대사과정에 이상이 생김으로서 발생하는 각종 장애의 총칭으로서, 대사 장애(Metabolic disorder)라고도 한다. 일반적으로 당질, 지질, 단백질, 비타민, 전해질 및 수분 등의 불균형에 의해 발생하게 된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 대사질환은 1형 당뇨, 2형 당뇨, 내당능장애, 공복시 혈당장애, 이상지질혈증, 지질 대사 장애, 비만, 지방간, 인슐린 저항성 및 당 내성 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "식이량"은 일정한 시간에 24시간 동안 섭취한 음식의 양을 측정한 것일 수 있다. 식이량의 감소는 곧 식욕의 감퇴일 수 있다. 예를 들어, 측정 개체에게 충분한 음식이 있다는 전제하에, 자신의 의지나 욕구에 따라 섭취하게 되는 음식 양을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, FGF11 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제 시 그렇지 않은 대조군과 비교하여 식이량이 감소하는 것일 수 있다. 이는 식욕 감퇴 효과를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "체중(body weight)"은 개체의 몸의 무게를 의미한다. 보다 구체적으로, 피부, 근육, 내장등의 연조직과 뼈, 조직, 수분 등 인체를 구성하고 있는 모든 물질의 종합적 중량을 의미할 수 있다. 예를 들어, 체지방(fat mass)과 제지방(lean body mass)의 총합을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, FGF11 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제 시 그렇지 않은 대조군과 비교하여 체지방(fat mass)이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 FGF11 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제는 체중의 감소 효과를 보이는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "발현 또는 활성을 억제하는 제제"는 FGF11 유전자 또는 FGF11 단백질의 기능을 저해 또는 방해하는 물질을 의미한다. 이와 같은 저해 또는 방해는 FGF11 유전자의 전사를 방해하거나, 또는 FGF11 유전자의 mRNA 번역을 저해함으로서 이루어질 수 있다. 또는 FGF11 단백질의 활성 부위에 특이적으로 결합하거나, 단백질 구조 변형을 일으킴으로서, FGF11 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화 시킬 수 있다. FGF11 유전자의 발현 또는 FGF11 단백질의 화성을 감소 또는 방해하는 물질이라면, 화합물, 단백질, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 탄수화물, 지질, 핵산 등 제한 없이 사용 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 FGF11 유전자에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miRNA, dsRNA, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 FGF11 유전자의 발현을 억제하는 물질은 상기 mRNA의 번역을 억제하는 물질로서 저분자 화합물, 안티센스 핵산 서열의 제조나 RNAi 테크닉을 이용한 RNA, siRNA 또는 shRNA 등을 이용하는 것일 수 있다. 또한 상기 FGF11 유전자의 발현을 억제시키는 물질은 상기 FGF11 유전자의 전사를 조절한다고 알려져 있는 프로모터, 인핸서(enhancer), 또는 전사조절인자에 결합하는 단백질 또는 화합물을 이용하는 것일 수 있다.
구체적으로 상기 물질은 FGF11 유전자 또는 그의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 두 가닥 RNA (double strand RNA) 및 마이크로 RNA(miRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한, 구체적으로 FGF11 단백질을 코딩하는 핵산에 대해 안티센스인 뉴클레오티드 분자를 저해제로 사용할 수 있다. '안티센스' 핵산은 FGF11를 코딩하는 '센스' 핵산에 상보적인, 예를 들면 두 가닥 사슬 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 전체 FGF11 코딩 가닥 또는 단지 그들의 일부(예: 코딩영역)에 상보적일 수 있다. 또한 상기 물질은 구체적으로 FGF11 유전자의 mRNA를 타겟으로 하는 shRNA, miRNA 또는 siRNA일 수 있으며, 더욱 구체적으로 서열번호 1의 서열을 갖는 shRNA 또는 서열번호 2의 서열을 갖는 shRNA일 수 있다. 서열번호 1은 5'-AGCTCCTTCACCCACTTCA-3, 서열번호 2는 5'-CCGCGGTACCAAGTCACTT-3'을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 FGF11 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 앱타머를 포함하는 것일 수 있다
보다 구체적으로, FGF11 단백질의 활성을 억제하는 물질은 예를 들면 FGF11 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 그의 항원 결합 특성을 갖는 항체 단편 및 그의 결합 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한 상기 물질은 FGF11 단백질에 상보적으로 결합하는 앱타머, 화합물, 펩티드, 또는 펩티드 미메틱스를 포함할 수 있다.
상기 항체는 FGF11의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함할 수 있다. 다클론 항체는 상기 FGF11를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 또한 상기 단클론 항체 또는 에피토프와 결합할 수 있는 단편 모두 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 발현 또는 활성을 억제하는 제제는 개체에서 FGF11를 발현 또는 분비하거나 발현 또는 분비가 증가하도록 조작, 예를 들어, 유전적으로 조작된 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 FGF11를 발현 또는 분비하는 세포는 FGF11를 인위적으로 발현 또는 분비하거나 발현 또는 분비가 인위적으로 증가하도록 조작한 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, FGF11의 활성 저해는 FGF11의 shRNA를 분비하는 벡터에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 벡터는 렌티바이러스일 수 있다. shRNA를 발현하는 렌티바이러스를 시상하부에 투여할 경우, 렌티바이러스가 세포를 감염시켜 FGF11 유전자를 녹다운 시키는 방법에 의할 수 있다. 본 명세서에서 용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포, 세포 성분의 적어도 일부, 또는 세포 유래 분비 성분을 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 FGF11의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성의 억제는 시상하부 내에서 이루어지는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 알려진 것일 수 있다. 상기 담체 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물(예를 들면, 식염수 및 멸균수), 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 링거액, 완충제, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 덱스트란, 알부민, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제를 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 당업자에게 알려진 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 용매 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있고, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 수성 용매는 생리식염수 또는 PBS를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 형태, 바람직하게는 비경구 투여 형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상적으로 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물의 투여량(유효량)은 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 또는 정맥내), 국소 (경피 포함), 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
다른 양상은 FGF11의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 대사질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또 다른 양상은 FGF11의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 식이량 감소 또는 체중 감소용 건강기능식품을 제공한다.
상기 FGF11, 발현 또는 활성을 억제하는 제제, 대사질환, 예방, 식이량, 체중 감소는 서술한 바와 같다.
본 명세서에서 "개선"은 일 양상에 따른 조성물의 투여에 의해 개체의 대사 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 제제는 FGF11 유전자에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, FGF11 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 앱타머를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 정의되는 건강기능식품은 2008년 개정된 건강기능식품에 관한 법률을 통하여 새롭게 정의된 인체에 대한 기능성 및 안전성이 충분하게 확립되어 식품의약품안전청 식약청 고시 제2008-72호에 규정된 건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정에 수재된 건강기능식품일 수 있다.
본 발명의 조성물을 건강기능식품에 포함하여 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 조성물을 구성하는 유효 성분을 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.2 내지 10 중량%로 포함할 수 있으며, 음료로서 제조될 경우 100 mL를 기준으로 0.1 내지 30g, 바람직하게는 0.2 내지 5 g의 비율로 함유할 수도 있고, 음료 전체가 천연물 성분으로 구성될 수도 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품용 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강기능식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제, 껌, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 음료의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제로는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 목적 또는 기호에 따라 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 과한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다.
다른 양상은 인 비트로에서, FGF11을 발현하는 세포와 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 세포에서 FGF11 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 또는 활성이 상기 후보 물질을 첨가하기 이전보다 감소한 경우, 대사질환 치료제로 선택하는 단계를 포함하는, 대사질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 인 비트로에서, FGF11을 발현하는 세포와 후보 물질을 접촉시키는 단계; 상기 세포에서 FGF11 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 또는 활성이 상기 후보 물질을 첨가하기 이전보다 감소한 경우, 식이량 감소 또는 체중 감소용 약학적 조성물로 선택하는 단계를 포함하는, 식이량 감소 또는 체중 감소용 약학적 조성물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 조성물, 발현 또는 활성, 대사질환, 식이량, 체중 감소에 대해서는 상술한 바와 같다.
본 스크리닝 방법에 있어서, 상기 대사질환은 1형 당뇨, 2형 당뇨, 내당능장애, 공복시 혈당장애, 이상지질혈증, 지질 대사 장애, 비만, 지방간, 인슐린 저항성 및 당 내성 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 것 일 수 있다.
또한 본 스크리닝 방법에서 상기 세포는 FGF11를 발현하도록 형질전환된 세포를 이용할 수 있다. 상기 세포는 FGF11를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 것일 수 있다. 상기 발현 벡터는 예를 들면 바이러스 발현 벡터, 포유류 발현 벡터, 곤충 발현 벡터, 효모 발현 벡터 또는 박테리아 발현 벡터 등을 이용할 수 있다.
상기 후보 물질, 예를 들면, 피검 화합물 또는 피검 조성물은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 두 가닥 RNA (double strand RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 또는 이들을 운반하는 벡터를 포함할 수 있다.
본 스크리닝 방법에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 세포와 후보 물질을 접촉시켜 후보물질이 세포 내로 들어가 FGF11 유전자 또는 단백질의 활성을 억제하는 시간을 허용함으로써 수행될 수 있으며, 인큐베이션 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 접촉 및/또는 인큐베이션은 시험관 내(in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 FGF11 유전자의 발현 또는 활성 수준의 측정은 유전자의 mRNA의 양을 측정함으로서 수행되는 것일 수 있다. 상기의 측정은 예를 들면 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법(RPA), 노던 블롯팅 및 DNA 칩(Microarray) 혹은 RNA-seq.(RNA sequencing) 분석 등 기재된 방법 중 선택된 1개 이상에 의해 수행될 수 있다.
상기 FGF11 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군 등 기재된 방법 중 선택된 1개 이상에 의해 수행될 수 있다.
일 양상에 따른 대사질환 예방 또는 치료용 위한 약학적 조성물 및 건강기능식품에 의하면, 식이량을 감소, 체지방 감소, 당 내성 개선, 체중 감소 또는 인슐린 내성을 개선시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 명세서의 렌티바이러스 제작 도면 및 모식도를 나타낸 이미지이다.
도 2는 고지방식이 비만 마우스의 시상하부에서 FGF11의 발현을 억제할 경우 경과 일수에 따른 체중을 나타내는 그래프이다.
도 3은 고지방식이 비만 마우스의 시상하부에서 FGF11의 발현을 억제할 경우 경과 일수에 따른 식이섭취량 감소를 나타내는 그래프이다.
도 4는 고지방식이 비만 마우스의 시상하부에서 FGF11의 발현을 억제할 경우 체지방량(far mass) 및 제지방량(lean mass)를 정상 대조군과 비교한 그래프이다.
도 5는 고지방식이 비만 마우스의 시상하부에서 FGF11의 발현을 억제할 경우 공복 혈당량을 정상 대조군과 비교한 그래프이다(왼쪽).
도 6은 고지방식이 비만 마우스의 시상하부에서 FGF11의 발현을 억제할 경우 당 주입 후 경과 시간에 따른 혈당량 변화 그래프(왼쪽)와 상기 그래프 상의 점유 면적을 분석한 그래프(오른쪽)이다. 당 내성 테스트의 결과(오른쪽) 및 경과 시간에 따른 혈당량을 정상 대조군과 비교한 그래프이다(왼쪽).
도 7은 고지방식이 비만 마우스의 시상하부에서 FGF11의 발현을 억제할 경우 인슐린 주입 시 경과 시간에 따른 혈당량 변화 그래프(왼쪽)과 상기 그래프 상의 점유면적을 분석한 그래프(오른쪽)이다.
도 2는 고지방식이 비만 마우스의 시상하부에서 FGF11의 발현을 억제할 경우 경과 일수에 따른 체중을 나타내는 그래프이다.
도 3은 고지방식이 비만 마우스의 시상하부에서 FGF11의 발현을 억제할 경우 경과 일수에 따른 식이섭취량 감소를 나타내는 그래프이다.
도 4는 고지방식이 비만 마우스의 시상하부에서 FGF11의 발현을 억제할 경우 체지방량(far mass) 및 제지방량(lean mass)를 정상 대조군과 비교한 그래프이다.
도 5는 고지방식이 비만 마우스의 시상하부에서 FGF11의 발현을 억제할 경우 공복 혈당량을 정상 대조군과 비교한 그래프이다(왼쪽).
도 6은 고지방식이 비만 마우스의 시상하부에서 FGF11의 발현을 억제할 경우 당 주입 후 경과 시간에 따른 혈당량 변화 그래프(왼쪽)와 상기 그래프 상의 점유 면적을 분석한 그래프(오른쪽)이다. 당 내성 테스트의 결과(오른쪽) 및 경과 시간에 따른 혈당량을 정상 대조군과 비교한 그래프이다(왼쪽).
도 7은 고지방식이 비만 마우스의 시상하부에서 FGF11의 발현을 억제할 경우 인슐린 주입 시 경과 시간에 따른 혈당량 변화 그래프(왼쪽)과 상기 그래프 상의 점유면적을 분석한 그래프(오른쪽)이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험 재료 및 실험 준비
1.1 동물 모델의 준비
본 실험에 사용된 모든 마우스는 수컷 C57BL/6 실험쥐를 사용하였다. 8주령을 코아텍 (Koatech) 에서 구매하였고, 모든 마우스는 오후 19시부터 다음날 오전 7시까지 어두운 환경과 오전 7시부터 오후 19시까지 빛을 조사한 단일 케이지 환경에서 사육되었다. 음식과 음수는 임의로 섭취할 수 있게 하였다. 바이러스 주입 전까지는 일반사료 (PicoLab사 제품, 11.3% calories provided by fat) 를 섭취하였고, FGF11의 발현 억제 바이러스를 주입한 당일부터 고지방사료 (Envigo사 제품, 60% calories provided by fat) 로 전환하였다. 본 실험의 모든 동물실험은 대구경북과학기술원 동물실험윤리위원회의 법규에 따라 수행되었다.
1.2 FGF11 유전자 발현 억제 바이러스의 준비
FGF11 유전자의 발현을 억제하기 위해, shRNA를 도입하는 방법을 선택하였다. shRNA 도입을 위해, shRNA(short-hairpin RNA) 와 초록형광단백질(GFP)을 동시에 발현하는 렌티바이러스를 직접 제작·활용하였다. 도 1 에서 나타내는 바와 같이, 렌티바이러스 제작을 위해 psPAX2, pMD2. G, pGPIZ vector를 Turbofect와 함께 modified 293T cell 에 감염(transfection)시켰다. 다음으로 modified 293T cell 에서 생산된 바이러스가 포함된 배양액을 0.45 μm pore filter로 필터링하여 바이러스와 modified 293T cell을 분리 하였다. 그 후 초고속원심분리기를 20,000 rpm 강도로 4℃, 1시간 30분으로 4번 반복해 바이러스만을 농축하였다. 농축된 바이러스는 생리식염수로 현탁하여 수술 전까지 4℃에서 보관하였다. 대조군에는 non-silencing shRNA를 발현하는 렌티바이러스를 주입하였다. 실험군에는 FGF11 유전자로부터 전사된 mRNA에 특이적으로 결합하면서도 비표적 효과 (off target effect) 를 줄이기 위해, 서로 다른 서열의 shRNA를 각각 발현하는 렌티바이러스 두 종류를 제작하여 5:5로 혼합한 뒤 주입하였다. 두 종류의 서열은 서열번호 1(5'-AGCTCCTTCACCCACTTCA-3') 및 서열번호 2(5'-CCGCGGTACCAAGTCACTT-3')이었다. 렌티바이러스의 역가(titer)는 각각 7.82 x 1010 IU/ml(non-silencing shRNA), 8.13 x 1010 IU/ml(shFgf11 #1 shRNA), 8.60 x 1010 IU/ml(shFgf11 #6 shRNA) 이며, 유세포분석기를 활용하여 측정하였다.
1.3 마우스의 시상하부에 FGF11 억제 바이러스 입체 정위 시술 방법
상기 실시예 1.1로 제조된 마우스를 약 15분간 신경마취제(Zolietil), 근육이완제(Rompun), 및 생리식염수의 혼합액을 복강 주사하여 마취하였다. 농도는 10 ml/kg 1 IU/kg body weight이었다. 입체 정위 시술(stereotaxic surgery)을 통해 non-siliencing lentivirus 또는 shFgf11-표현형 렌티바이러스를 시상하부 궁상핵(hypothalamic arcuate nucleus; DV: - 6.0 mm, AP: - 1.4 mm, ML: ± 0.23 mm)에 0.72 μL 쌍방 주입(Bilateral injection) 하였다.
실시예 2. FGF11의 유전자 발현 억제 바이러스의 시상하부 궁상핵 주사에 따른 식이량과 체중 감소 효과 확인
2.1 식이량 및 체중 감소 확인
시상하부에서의 FGF11 발현 억제와 식이량과 체중 감소, 및 체지방 감소 사이의 관련성을 확인해보기 위해, 마우스 시상하부 궁상핵에 FGF11 억제 렌티바이러스를 상기 실시예 1.3과 같은 입체 정위 시술 방법을 이용하여 주사하였다.
매일 같은 시간에 마우스의 일일 식이량 및 체중을 측정하였으며, 시간은 어두운 환경(Dark cycle: 19시-다음 날 오전 7시)이 시작되기 전, 빛이 조사되는 시간대인 오후 5시로 통일하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 각각 나타낸 바와 같이, 마우스 시상하부 궁상핵에 FGF11 억제 렌티바이러스를 입체 정위 시술을 이용해 주사하여 FGF11의 발현을 유전적으로 억제한 마우스의 몸무게 및 식이량이 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 FGF11 유전자의 억제가 식이량 및 체중 감소에 효과가 있다는 것을 시사한다.
2.2 체지방량(fat mass) 및 제지방량(lean mass)의 변화 확인
상기 실시예 1.3의 입체 정위 시술(stereotaxic surgery) 방법을 이용하여 바이러스를 주입하였다. 다음으로, 고지방식이를 2주 동안 섭취한 비만 마우스의 체지방 및 제지방량을 in vivo에서 NMR (Nuclear Magnetic Resonance) 장비인 Minispec LF50 (Bruker사 장비)을 사용하여 3번 측정한 후 평균값을 사용하였다. 마취약은 투여되지 않았다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 shFgf11-expressing 렌티바이러스를 시상하부 궁상핵에 주입한 뒤 고지방 식이를 2주 동안 섭취한 쥐들의 체지방량(Fat mass)과 제지방량(Lean mass)을 측정하였을 때, 바이러스를 투여한 쥐의 체지방량이 투여하지 않은 쥐의 체지방량에 비해 유의성 있게 감소해 있음을 확인 할 수 있었다. 반면, 바이러스를 투여한 쥐와 투여하지 않은 쥐의 제지방량은 차이를 보이지 않았다. 이는 FGF11 유전자의 억제가 체지방량 감소와 체중 감소에 효과가 있다는 것을 시사한다.
실시예 3. FGF11 유전자 발현 억제에 따른 혈당 개선, 인슐린 민감도 개선 효과의 확인
FGF11 유전자 발현 억제에 따른 혈당 개선, 인슐린 민감도 개선 효과를 확인하기 위하여, 먼저 마우스의 공복 혈당을 측정하였다. 보다 구체적으로, 비만 마우스와 정상마우스 군 모두를 18시간 절식시킨 후, 꼬리정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈당측정기(glucometer)를 통해 혈당을 측정하였다. 측정시간은 오전 10시로 하였다.
다음으로, 당 내성 검사 및 인슐린 내성 검사를 실시하여 FGF11 유전자 발현 억제의 효과를 확인하고자 하였다. FGF11 유전자 억제는 실시예 2.1의 입체 정위 시술을 통한 렌티바이러스 주사 방법을 이용하였다. 보다 구체적으로, 당 및 인슐린 내성 검사 시 쥐의 보정 및 복강 주사로 인한 급격한 당 상승을 방지하기 위해, 내성 검사 3일 전부터 쥐에게 보정 및 생리식염수 복강 주사를 10 mL/kg of body weight 용량으로 하 후 1 회 주입하였다. 이후 당 내성 검사를 위해서는 16 시간, 인슐린 내성 검사를 위해서는 6 시간 이전부터 쥐를 절식 시켰다. 오전 10시에 보정하여 1.5 g/kg of body weight 의 농도 혹은 1 IU/kg of body weight 로 당 혹은 인슐린을 복강 주사 하였다. 복강 주사 후 0분, 15분, 30분, 60분, 90분, 120분에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당측정기를 이용하여 혈당을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이를 6주 동안 섭취한 쥐에 렌티바이러스 주입 시의 공복 혈당량은 대조군의 값에 비해 유의미하게 낮음을 확인하였다.
이와 더불어, 실시예 1.3의 방법을 이용하여 고지방 식이를 5주 동안 섭취한 마우스에서 시상하부 궁상핵 FGF11 발현을 억제할 경우의 당 내성 검사를 실시하였다. 실시방법은 상기의 당 내성 검사와 동일하다. 당 내성 검사(Glucose tolerance test: GTT)를 실시한 결과, 도 6에서 나타낸 바와 같이 FGF11 발현을 억제하지 않은 쥐보다 억제한 쥐에서 당 제거 비율이 유의성 있게 증가함을 확인하였다.
또한, 실시예 1.3의 방법을 이용하여 고지방 식이를 3주 동안 섭취한 마우스에서 시상하부 궁상핵 FGF11 발현을 억제할 경우의 인슐린 내성 검사(Insulin tolerance test: ITT)를 실시하였다. 실시방법은 상기의 당 내성 검사와 동일하다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, FGF11 발현을 억제하지 않은 쥐보다 억제한 쥐에서 인슐린에 대한 감수성이 유의성 있게 증가함을 확인하였다.
결과적으로 위의 결과들은 FGF11 유전자의 발현 억제 시 당 내성과 인슐린 내성이 개선되며, 공복 혈당 또한 낮아짐을 보여주었다. 이는 FGF11 유전자의 발현 억제가 항당뇨 등 대사 장애 질환의 치료에 효과가 있음을 시사한다.
<110> Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology
<120> A COMPOSITION COMPRISING MATERIALS OF INHIBITING FGF11 FOR
PREVENTING AND TREATING METABOLIC DISEASE
<130> PD20-D017-D1
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
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<211> 19
<212> DNA
<213> shFgf1 target mRNA_1
<400> 1
agctccttca cccacttca 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> shFgf11 target mRNA_2
<400> 2
ccgcggtacc aagtcactt 19
Claims (6)
- 섬유아세포 성장인자 11(Fibroblast growth factor 11: FGF11)의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 대사질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 제제는 FGF11 유전자에 상보적으로 결합하는 shRNA이고,
상기 shRNA는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열로 이루어진 유전자를 타겟으로 하고,
상기 조성물은 시상하부 궁상핵 영역으로 국소투여되고,
상기 대사질환은 1형 당뇨, 2형 당뇨, 내당능장애, 공복시 혈당장애, 인슐린 저항성 및 당 내성 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 약학적 조성물.
- 삭제
- FGF11의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 식이량 감소용 약학적 조성물로서,
상기 제제는 FGF11 유전자에 상보적으로 결합하는 shRNA이고,
상기 조성물은 시상하부 궁상핵 영역으로 국소투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 인 비트로에서, FGF11을 발현하는 세포와 후보 물질을 접촉시키는 단계;
상기 세포에서 FGF11 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 발현 또는 활성이 상기 후보 물질을 첨가하기 이전보다 감소한 경우, 식이량 감소 약학적 조성물로 선택하는 단계를 포함하는, 식이량 감소용 약학적 조성물을 스크리닝하는 방법으로서,
상기 세포는 시상하부 궁상핵 영역으로부터 유래한 세포인 것을 특징으로 하는, 식이량 감소용 약학적 조성물을 스크리닝하는 방법.
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| A107 | Divisional application of patent | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |