KR20070105685A - 메트포르민을 포함하는 비만치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새로운 비만 치료용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 메트포르민을 포함하는 비만 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 메트포르민은 렙틴감수성을 개선하여 식욕억제와 지방감소효과를 증가시킬수 있다. 메트포르민의 식욕억제효과는 렙틴의 작용과 관련되어 있는 것으로 나타난다. 게다가, 메트포르민은 정상식이 쥐에서 렙틴의 식욕억제효과와 지방감소효과를 증가시키고 렙틴저항성을 가진 고지방식이 쥐에서 렙틴 감수성을 회복시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 비만인 사람들에게 임상적으로 사용 가능한 메트포르민을 포함하는 새로운 비만 치료용 조성물로서의 사용이 기대된다.

Description

메트포르민을 포함하는 비만치료용 조성물 {Composition for treating obesity comprising metformin}

도 1은 정상식이쥐와 고지방식이쥐에서 체중 (A)과 일일 칼로리 섭취량 (B)을 나타낸다. 메트포르민 처치 (300 ㎎/㎏)는 고지방식이와 정상식이한 지 14주후에 시작되었다. 데이터는 각 군 8마리 쥐의 평균± 표준오차 (mean± SE)이다.

도 2는 메트포르민 처치 또는 비처치 정상식이군에서 체중 (A), 누적 칼로리 섭취 (B), 그리고 복막후 백색지방조직(RT-WAT)량 (C)에 대한 렙틴의 서로다른 투여량의 효과 (L)를 나타내었다. 렙틴의 서로다른 투여량 (일일 0, 0.6, 3, 또는 15 ㎍)은 7일동안 주입되었다. 데이터는 각 군 8마리 쥐의 평균± 표준오차 (mean± SE)이다. □, 비처치된/0 ㎍ 렙틴투여 ; ■, 비처치된/0.6 ㎍ 렙틴투여; ◆, 비처치된/15 ㎍ 렙틴투여; ○, 처치된/0 ㎍ 렙틴투여, ●, 처치된/0.6 ㎍ 렙틴투여; △, 처치된/3 ㎍ 렙틴투여; ▲, 처치된/15 ㎍ 렙틴투여. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. BW, 체중; Lep, 렙틴; Veh, 대조물질.

도 3은 정상식이 (SC)와 고지방식이 (HFO)쥐에서 체중 (A와 B), 누적 칼로리 섭취(B와 E), 그리고 복막후 백색지방조직(RT-WAT)량 (C와 F)에 대한 메트포르민 (뇌실내 렙틴주입에 의한)의 효과를 비교한 것이다. 렙틴 (일일 15 ㎍) 또는 대조물질 (인공 CSF)을 7일간 주입하였다. 데이터는 데이터는 각 군 8마리 쥐의 평균± 표준오차 (mean± SE)이다. □, 비처치된 대조물질투여 ; ■, 비처치된 렙틴투여; ○, 처치된 대조물질투여; ●, 처치된 렙틴투여; △, 대조군 대조물질투여; ▲, 대조군 렙틴투여. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. BW, 체중; Lep, 렙틴; Veh, 대조물질.

도 4는 정상식이 (SC)와 고지방식이 (HFO)쥐에서 CSF 농도 (A), 혈청 농도(B), 그리고 이들의 비율 (C)을 나타낸 것이다. 데이터는 각 군 8마리 쥐의 평균± 표준오차 (mean± SE)이다. *P<0.05와 **P<0.01 vs. 비처치된 정상식이쥐; *P<0.05와 **P<0.01 vs. 비처치된 고지방식이쥐. □, 비처치; ■, 처치.

도 5는 메트포르민 처치 또는 비처치된 정상식이 (SC)와 고지방식이 (HFO)쥐에서 렙틴 또는 대조물질 주입한 후 시상하부에서 POMC (A)발현과 pAMPK (B)및 pACC (C)의 농도를 나타낸 것이다. 대표적인 블럿 (blots)은 각각의 그래프에 나타내었다. 데이터는 각 군 8마리 쥐의 평균± 표준오차 (mean± SE)이다. *P<0.05 vs. 그들의 대조물질 투여군. Lep, 렙틴; Veh, 대조물질.

도 6은 억제되지 않은 쥐에 렙틴을 뇌실내 (i.c.v)로 주사한 후 24시간 동안 누적 음식물 섭취량을 나타내고 (A), 렙틴 주사한지 1시간 후 시상하부에서 pSTAT3 농도를 나타낸다 (B). 데이터는 각 군 5마리 쥐의 평균± 표준오차 (mean± SE)이다. *P<0.05 와 **P<0.01 vs. 처치군 대조물질투여. Met, 메트포르민; SC 와 s.c., 피하주사.

도 7은 OLETF와 LETO 쥐에서 체중 (BW)(A), 일일 음식물 섭취량 (B), 그리고 복막후 백색지방조직량 (C)에 대한 메트포르민 처치 (일일 300 ㎎/㎏)의 효과를 나 타낸다. 혈청 렙틴 농도와 음식물 섭취 비율감소사이에 현저한 개선이 나타났다 (D). 데이터는 각 군 7-8마리 쥐의 평균± 표준오차 (mean± SE)이다. *P<0.05 와 **P<0.01 vs. 그들의 비처리군.

본 발명은 새로운 비만치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 비만치료용 조성물에 관한 것이다.

현대사회에서 비만은 급격히 늘어나고 있는 사회문제이며 고혈압, 당뇨병, 동맥경화 등의 여러 가지 합병증과 관련이 있기 때문에 최근에는 비만을 질병으로 규정하고 있다. 비만의 발병원인이 다양하듯이 여러 가지 치료방법이 사용되고 있지만 완전한 치료에까지 이르지는 못하고 있는 실정이다. 특히 경등도 비만보다 중등도 비만의 치료는 더욱 어려웠던 것이 사실이었다. 본 발명의 결과는 중등도 이상의 비만에도 복강내 지방을 줄일 수 있는 새로운 비만 치료 조성물로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

지방세포에서 유래된 호르몬인 렙틴은 음식물 섭취와 에너지 소비를 조절함으로써 체중 유지에 기여한다 (Halaas JL, et al.: Proc Natl Acad Sci 94:8878-8883, 1997). 그러나, 비만은 혈중 렙틴 농도가 이미 증가하여 있으며 약리학적인 농도의 렙틴을 주사하여도 그 효과는 미미하기 때문에 렙틴은 임상에서 널리 사용되지 못하고 있다. 대개 야윈 사람들에 있어 렙틴 주사는 체지방감소와 체중감소를 강력하게 유도하는데 반하여(Widdowson PS, et al.: Diabetes 46:1782-1785, 1997) 나타나는 비만인 사람들에서의 이러한 미미한 반응(poor response)은 렙틴저항성의 특성이다. 따라서, 비만인 사람들에 있어 렙틴이 비만치료를 위해 사용되도록 하려면 렙틴저항성의 개선이 필수적이다.

경구투여 비구아니드 인슐린 감수성 약제 (oral biguanide insulin-sensitizing agent)인 메트포르민은 골격근(skeletal muscles)과 지방세포에서 당 유입(glucose uptake)에 대해 인슐린의 효능을 증가시키고, 장의 당흡수를 감소시킨다 (Hundal HG, et al.: Endocrinology 131:1165-1173, 1992). 또한 메트포르민은 병적으로 비만한 사람들(Kay JP, et al: Metabolism 50:1457-1461, 2001)과 정상체중의 건강한 사람들(Fruehwald-Schultes B, et al.: Metabolism 51:531-536, 2002)에게서 렙틴의 농도를 감소시킨다. 비록 렙틴의 농도가 체지방량과 매우 관련이 있다고 하더라도, 메트포르민의 렙틴감소효과는 체중감소에 의해 충분히 설명될 수는 없다. 왜냐하면 정상체중의 건강한 사람들에서 체중을 변화시키지 않고도 메트포르민은 렙틴의 농도를 감소시키기 때문이다. 그러나, 메트포르민이 체중과 렙틴농도를 감소시키는 기전은 아직 잘 모르고 있다. 게다가, 메트포르민이 역시 렙틴에 의해 활성화되는 AMPK (AMP-activated protein kinase)를 타겟으로 한다고 최근에 보고되고 있다 (Zhou G, et al.: J Clin Invest 108:1167-1174, 2001). 상기 연구는 좀 더 복잡한 상호작용이 메트포르민과 렙틴사이에 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명자는 메트포르민이 렙틴감수성을 증가시키고, 메트포르민의 식욕감소와 렙틴감소효과는 증가된 렙틴감수성의 결과라고 가정하였다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 비만 치료용 조성물의 경우, 렙틴감수성을 회복시켜 렙틴의 식욕억제와 지방감소효과를 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 렙틴감수성을 회복시키는 것을 특징으로 하는 메트포르민을 포함하는 비만 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명에서는 메트포르민(Metformin)의 식욕억제 메카니즘이 렙틴의 작용을 증가시키는 것과 관련이 있다는 사실을 실험적으로 규명하였으며, 렙틴저항성이 발생한 실험동물에서 렙틴 저항성을 개선하여 렙틴 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 즉, 메트포르민 단독투여시 나타난 미미한 체중 감소와 렙틴 농도 감소를 렙틴감수성의 개선 때문으로 설명할 수 있다. 즉, 렙틴 감수성이 증가하니 렙틴의 농도를 높게 유지할 필요가 없어져서 렙틴 농도가 낮아지게 되며, 새로운 평형(equilibrium)상태에 맞추어져, 이로서 렙틴의 효과는 상대적으로 감소하게 된다. 이때 렙틴을 함께 투여하면 렙틴의 감수성, 즉 효과가 증가해 있고, 렙틴 농도도 높아져 있으니 렙틴의 식욕억제와 체중 감소효과가 잘 나타나게 된다는 것이다. 특히 비만이 심할수록 렙틴 농도가 증가하기 때문에 메트포르민 투여시 렙틴양(leptin-like) 효과가 더 잘 나타나게 되며 렙틴 추가투여시 체중 감소를 효과적으로 유도할 수 있겠다. 또한 다른 비만 치료제들이 합성물질들인데 비하여 렙틴은 체내에서 만들어지는 endogenous product 이므로 그 메카니즘이 생리적이라는 점과 메트포르민이 이미 수십년동안 당뇨병 치료 영역에서 임상적으로 상용되어 온 약이라는 점에서 임상 적용이 매우 용이할 것으로 생각된다.

본 발명에서는 메트포르민(metformin)이 렙틴(leptin) 감수성을 증가시키는지를 규명하기 위해, 본 발명자는 정상식이 쥐와 고지방식이 쥐에 메트포르민 처치 (일일 300 ㎎/㎏)한지 4주후 렙틴 감수성을 측정하였다. 정상식이 쥐에 7일동안 뇌실내(intracerebrobentricular)에 렙틴 주입한 후 식욕억제반응과 지방손실반응은 메트포르민 처치에 의해 증가하였고, 렙틴에 대한 이러한 반응은 비슷한 나이의 정상식이 쥐와 비교할 때 고지방식이 쥐에서 감소하였다. 그러나, 렙틴에 대한 이러한 반응은 고지방식이 쥐에 메트포르민 처치를 함으로써 개선되었다. 더욱이, 렙틴과 인슐린의 혈청 농도는 메트포르민 처치된 정상식이 쥐와 고지방식이 쥐에서 렙틴에 의해 유의하게 감소되었다. 시상하부의 인산화된 AMPK (AMP-activated protein kinase) 농도는 메트포르민 처치되지 않은 쥐보다 처치된 쥐에서 더 낮은 렙틴 농도에 의해 감소되었다. 본 발명에서, 메트포르민 처치는 렙틴 (5㎍)의 식욕억제효과를 역시 증가시켰고, 이는 시상하부에서 증가된 농도의 pSTAT3 (phsphorylated signal transducer and activator of transcription 3) 에 의해 일어났다. 이러한 결과는 메트포르민이 고지방식이 쥐에서 렙틴 감수성을 증가시키고 렙틴 저항성을 개선시키며 메트포르민과 렙틴을 포함하는 복합적인 처방은 비만의 치료에 도움이 될 것임을 나타낸다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 메트포르민(Metformin)을 유효성분 으로 포함하는 비만 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에서는 종래 경구용 혈당강하제로만 알려진 메트포르민의 새로운 용도인 비만치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 비만 치료용 조성물에 있어서, 통상적으로 사용되는 상기 메트포르민의 약제학적 기능을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 상기 메트포르민은 렙틴 저항성(Leptin resistance)을 개선시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서는 상기 메트포르민이 렙틴 저항성을 개선시켜, 즉 렙틴감수성을 회복시켜 식욕억제, 지방감소 및 체중감소 효과를 발휘함을 입증하였다.

본 발명의 비만 치료용 조성물에 있어서, 메트포르민만을 포함하는 조성물이 될 수 있으나, 상기 비만 치료용 조성물은 메트포르민외에 렙틴을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하다. 종래에는 비만이 높아진 혈청 렙틴을 동반하고 약리학적인 농도의 렙틴 투여에 대해 미미하게 반응하기 때문에 렙틴은 임상적으로 널리 사용되지 못하였으나, 본 발명이 이러한 문제점을 해결하였다.

본 발명의 조성물은 치료용 약제로 이용되기 위해서 약제학적 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제, 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

본 발명의 비만 치료용 조성물의 투여량은 대상자의 연령, 성별, 상태, 비만도에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준으로 메트포르민은 1일 1mg 내지 20g, 렙틴은 1㎍ 내지 1000㎍ 이 투여될 수 있다.

본 발명은 뇌실내 렙틴의 식욕억제와 지방감소효과가 더 현저함을 증명하고 메트포르민 비처치군보다 처치군에서 이러한 효과를 일으키기 위해 렙틴의 더 낮은 투여량이 요구됨을 증명한다. 메트포르민과 렙틴으로 병용치료한 후 렙틴과 인슐린의 혈청 농도에서 관찰된 유의한 감소는 본 발명을 뒷받침한다. 더욱이, 메트포르민은 식이 유도된 비만 쥐에서 렙틴저항성을 개선하였다.

메트포르민은 식욕억제효과의 기본적인 메카니즘은 분명하지 않다. 비록 장기간에 걸친 인슐린의 뇌실 주입은 식욕억제를 유도하고(Brief DJ, et al.: Brain Res Bull 12:571-575, 1984) 인슐린이 시상하부에서 식욕억제 signaling과 상관관계가 있더라도(Kaiyala KJ, et al.: Am J Clin Nutr 62 (5 Suppl.):1123S-1134S, 1995), 본 발명은 아래와 같은 이유로 인슐린보다는 렙틴이 메트포르민의 식욕억제효과에 대하여 더 잘 반응한다는 것을 제안한다. 첫째, 렙틴 단독처치 후보다 메트포르민과 렙틴을 병용처치한 후 인슐린 농도가 더 잘 감소하였고, 동시에 병용치료한 군에서 식욕이 더 강력하게 억제되었다. 둘째, 식욕 억제비율(percentage reductions)이 혈청 인슐린 농도와 큰 상관관계가 없는 것으로 나타났지만(미도시), OLETF 와 LETO 쥐에서 혈청 렙틴 농도와는 명백하게 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 셋째, 메트포르민 처치는 비처치군과 비교할 때 정상식이 쥐와 고지방식이 쥐 모두에서 뇌척수액(CSF) leptin 농도를 증가시켰다. 왜냐하면 혈액뇌장벽(blood-brain barrier)를 통한 불완전한 렙틴 수송은 렙틴저항성이 생길 수 있는 메카니즘이기 때문이며 (Caro JF, et al.: Lancet 348:159 -161, 1996), 이것은 역시 본 발명에 의해서 나타내었고, CSF 렙틴 농도의 증가는 메트포르민의 식욕억제효과를 매개할 것이다.

렙틴 signal transduction은 시상하부에서 STAT3의 인산화와 관련이 있고 (Vaisse C, et al.: Nat Genet 14:95-97, 1996), 이는 식욕억제 펩타이드(anorexigenic peptide)인 POMC의 증가된 발현과 관련이 있다. 게다가, 손상된 STAT signaling은 렙틴저항성의 비만 쥐(leptin-resistant aged obese rats)와 당뇨를 유발한 쥐(db/db mice)에서 증명되어 왔다 (Ghilardi N, et al.: Proc Natl Acad Sci U S A 93:6231- 6235, 1996). 메트포르민 처치된 쥐에서 렙틴의 증가된 효과의 기본적인 메카니즘을 규명하기 위해서, 본 발명자는 메트포르민 및/또는 렙틴 주사로 단기간의 처치후 시상하부에서 pSTAT3 농도를 측정하였다. 시상하부의 pSTAT3 농도는 메트포르민 단독처치에 의해 증가되었고 렙틴처치를 추가함으로써 증가되었다. 또한 인산화된 STAT3 농도는 측뇌실에 메트포르민을 직접주사함으로써 증가되었다. 이와 일치하게, 24시간동안 뇌실내 렙틴의 식욕억제효과는 메트포르민 비처치쥐보다 처치된 쥐에서 더 현저하였다. 비록 문헌(the literature)에서는 뇌에 작용하는 메트포르민의 효과에 대한 유용한 정보가 거의 없지만, 본 발명자는 메트포르민의 식욕억제효과가 STAT3 signaling pathway에 의해 매개되는 것이라고 제안한다. 본 발명자가 CSF로부터 렙틴을 제거할 수 있었기 때문에 최소한 부분적으로는, 시상하부에서 메트포르민에 의해 증가된 pSTAT3는 렙틴의 증가된 효과에 때문일 것이다. 본 발명자는 OLETF 쥐에서 메트포르민량 (일일 300 ㎎/㎏)을 투여한 후 현저한 식욕억제효과를 관찰하였다. 종합해서 볼때, 본 발명자는 메트포르민과 렙틴이 공통의 energy balance signaling pathway를 공유할 것이라고 확신한다.

본 발명자는 또한 시상하부의 pAMPK 농도에서 감소는 비처치된 쥐보다 처치 된 쥐에서 더 낮은 렙틴 투여량에 의해 유도된다는 것을 관찰하였고, 반면 메트포르민 단독은 시상하부에서 pAMPK 농도를 변화시키지는 않았다. pAMPK는 시상하부에서 fuel-sensing 메카니즘과 관련이 있고, 렙틴에 의해 감소되기 때문에 (Andersson U, et al.: J Biol Chem 279:12005-12008, 2004), 본 발명에서 관찰된 시상하부에서의 pAMPK의 감소된 농도는 증가된 렙틴 감수성과 관련이 일을 것이다. 게다가, 메트포르민은 고지방식이 쥐에서 렙틴 처치에 의해 시상하부의 POMC 발현을 증가시킨 반면, 이는 비처치된 고지방식이 쥐에서는 관찰되지 않았다. 왜냐하면 렙틴의 효과는 POMC의 활성화와 관련이 있기 때문이며 (Kim YW, et al.: Regul Pept 127:63-70, 2005), 본 발명의 비처치된 고지방식이 쥐에서 나타난 바와 같이 렙틴에 의해서 POMC 발현을 활성화하는데 실패하는 것은 렙틴저항성의 증거이다. 더욱이 렙틴이 POMC를 활성시키는 효과의 회복은 렙틴저항성의 개선을 암시한다.

고지방식이 쥐에서, 메트포르민 처치는 체중과 식욕을 정상식이 쥐에서 보다 더 현저하게 감소시켰다. 게다가, 비록 메트포르민 단옥처치가 내장지방 또는 혈청 렙틴 농도를 완전히 정상화시키지는 않지만, 메트포르민과 내실내 렙틴주입의 병용처지는 이러한 변수들(parameters)를 정상화시켰다. 식이조절과 관련있는 시상하부 호르몬 (Masaki T, et al.: Endocrinology 144:3547-3554, 2003)인 높아진 혈청 CRF 농도는 고지방식이 쥐에서 메트포르민 단독처치에 의해 감소되었고, 이는 메트포르민과 렙틴 병용치료에 의해 추가적으로 감소되었으며, 메트포르민/렙틴 병용처치를 제안함으로써 비만의 치료에서 유용할 것이다.

본 발명자는 메트로르민에 의해 유도된 식욕억제효과를 규명하기 위하여 본 발명에 대조식이군을 추가하였다. 렙틴의 식욕억제와 내장지방-감소(shedding)효과는 고지방식이 대조군에서 약간 증가하였다. 그러나, 이러한 증가정도는 메트포르민 처치된 고지방식이군에는 미치치 못하였다. 더욱이, 생화학적 변수들(parameters)의 유의한 감소는 메트포르민 처치된 고지방식이군에서 관찰되었다.

요약해서 말하면, 메트포르민의 식욕억제효과는 렙틴의 작용과 관련되어 있는 것으로 나타난다. 게다가, 메트포르민은 정상식이 쥐에서 렙틴의 식욕억제효과와 지방감소효과를 증가시키고 렙틴저항성을 가진 고지방식이 쥐에서 렙틴 감수성을 회복시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명은 메트포르민과 렙틴의 병용치료가 비만치료에 대해 유용할 것임을 나타낸다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

통계학적 분석.

데이터는 평균±표준오차(means±SE)이다. 군(groups)사이의 차이는 ANOVA로 분석하였고, 군별 비교를 위해 post hoc test를 실시하였다. P<0.05는 통계학적인 의미가 있는 것으로 생각된다.

실험군 구성

Sprague-Dawley 수컷쥐를 대한 실험동물센터에서 이유직후 구입하였다. 1주간의 적응기간 후에 고지방식이 쥐와 정상식이 쥐로 구성된 2개의 군으로 나누었 고, 영남대학교 의과대학 동물사육실의 사육기준에 따라 사육하였다. 그 쥐들은 12시간 낮/밤 (lignt/dark) 주기 조건(07:00~19:00)하에 개별적으로 사육되었다.

실시예 1. 메트포르민의 렙틴감수성 효과 실험.

메트포르민의 렙틴감수성 효과를 규명하기 위해, 정상식이 쥐를 생후 4개월에서 3개의 군으로 나누었다 : 메트포르민 처치군, 비처치 임의식이군, 그리고 대조식이(pair-fed)군. 대조식이군은 처치군보다 1주일 뒤에 실험을 시작했으며, 그때 처치군에 의해 소비되는 먹이량을 아침에 식이대조군에 제공하였다. 이러한 3개의 군을 2개의 실험군으로 각각 추가적으로 나누었다 : 인공 CSF 주입한 군(artificial cerebrospinal fluid (CSF)-infused group) (대조물질, vehicle) 과 렙틴 주입한 군(leptin-infused group), 2개의 군은 체중과 일일 칼로리 섭취 (n=8 각각의 군)를 비슷하게 맞추었다. 상기 6개의 실험군에 추가적으로, 렙틴 투여량에 따른 반응정도를 시험하기 위해 렙틴의 서로 다른 투여량 (처치군에 일일 0, 0.6, 3, 15㎍ 을 투여, 비처지군에 일일 0, 0.6, 15㎍ 을 투여)을 정상식이군에 주입하였다. 본 발명자는 또한 렙틴의 식욕억제효과에 대한 단기간 메트포르민 처치(2일동안 매일 300 ㎎/㎏ s.c) 효과를 측정하였다. 메트포르민 처치의 둘째날에 억제되지 않는(unrestrained) 군에 임상적으로 삽입된 카테터(catheter)를 통해서 렙틴(5㎍)을 외측뇌실(lateral ventricle)에 주사하였다. 렙틴 주사한지 6, 12, 24시간 후 음식물 섭취를 측정하였다. 메트포르민 처치군과 비처치군의 렙틴 주사전 체중은 각각 383±7.7g 과 392±8.2g 이었다. 렙틴 signaling을 규명하기 위해, 메트포 르민 (2일간 아침 같은 시간에 300㎎/㎏ s.c) 또는 살린(saline)으로 처치한 군에 렙틴 뇌실주사 1시간 후 시상하부에서 pSTAT3 (phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3) 농도를 측정하였다. 렙틴은 두번째 메트포르민 처치 2시간 후에 주사하였다.

실시예 2. 메트포르민의 렙틴저항성 개선효과 실험.

메트포르민이 렙틴저항성이 있는 쥐 모델에서 렙틴저항성을 개선할 수 있는지 규명하기 위해, 고지방식이 쥐 모델을 4주동안 메트포르민으로 처치하였다. 렙틴 저항성이 있는 비만 쥐를 4개월간 고지방식이를 하여 만들었다. 고지방 식이는 버터, 옥수수 기름, 당분(sucrose) 및 비타민(0.8%), 미네랄(1.9%), 메티오닌(0.15%)을 보충하는 카제인(casein)으로 구성 (전체 칼로리중 각각 38%, 21%, 23% 및 17%)하였다. 메트포르민 처치를 시작하기 전 렙틴저항성을 확인하기 위하여, 본 발명자는 고지방식이와 정상식이 상태에서 12주후 혈청 렙틴 농도를 측정하기 위해 ethrane 마취하여 꼬리 정맥으로부터 혈액(~400㎕)을 채취하였다. 혈청 렙틴 농도는 정상식이 쥐와 비교해서 고지방식이 쥐에서 현저히 증가되었다 (각각 10.54 ± 0.735 vs 2.86 ± 0.519 ng/㎖ ; P<0.01). 그리고 나서, 고지방식이 쥐를 정상식이 쥐에 대하여 상기 설명한 것처럼 3개의 군으로 나누었다 (즉, 비처치군, 처치군, 대조식이군). 그리고 이러한 3개의 군을 대조물질군과 렙틴군으로 유사하게 다시 나누었다 (각 군마다 n=8).

실시예 3. 메트포르민의 비만치료효과 실험.

메트포르민이 유전학적으로 비만 동물 모델에서 같은 효과를 가지는지를 규명하기 위해서 생후 7개월된 OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) 쥐와 그들의 wild-type LETO 쥐를 3주동안 메트포르민을 투여하였다. 음식물 섭취, 체중, 렙틴 농도의 변화를 기록하였다. OLETF 쥐에서 병원성 결핍은 시상하부에서 cholecystokinin A receptor의 결핍이며, 이러한 쥐는 내장 부위에서 심각한 지방축적을 보여준다.

실시예 4. 메트포르민 처치.

메트포르민 (일일 300 ㎎/㎏)을 물에 녹여서 4주간 경구투여하였다. 일일 식음량을 측정한 후 물에서의 메트포르민 농도는 일주일에 두 번 교정하였다. 비처치군과 대조식이군은 임의의 메트포르민 없는 물을 주었다.

실시예 5. 렙틴 또는 대조물질( vehicle ) 투여.

7일동안 쥐의 외측뇌실에 삼투펌프(osmotic minipump)를 사용하여 대조물질 또는 렙틴 (일일 15㎍)을 주입하였다. 실험하는 아침에, 쥐를 xylazine hydrochloride (8 ㎎/㎏ s.c.)와 ketamine (90 ㎎/㎏ i.p.)으로 마취시켰다. 뇌주입 캐뉼러(brain infusion cannula)(Alzet, Cupertino, CA)는 아래의 좌표(coordinates)를 사용하여 외측내실에 정위방법으로(stereotaxically) 놓아두었다 : bregma를 기준으로 뒤쪽으로 1.3mm, 시상봉합중간부위(midsagittal suture)를 기 준으로 옆으로 1.9mm, 그리고 4.0mm 깊이. 등표면(dorsal surface)에 무디게 절개(blunt dissection)하여 피하 주머니(subcutaneous pocket)를 만들어 삼투펌프를 꽂았다. 카테터 튜브(catheter tube)는 뇌주입 캐뉼라와 삼투펌프 사이에 연결하였고, 뇌주입 캐뉼라는 jeweler's screw와 치과용 아크릴 접합제(acrylic dental cement)를 사용하여 두개골 표면에 고정하였다. 절개부위를 봉합실로 꿰메고, 쥐가 완전히 회복될때까지 상태를 살폈다. 사용된 주입속도는 1㎕/h 였다.

실시예 6. 조직 배양과 제조.

쥐를 펜토바비탈(pentobarbital)로 마취시켰다(85 ㎎/㎏ i.p.). CSF는 정위고정상태(stereotaxic fixation)에서 4번째 뇌실에 구멍을 뚫어 얻었고, 혈액 샘플은 심장에 구멍을 뚫어 수집하고, 혈청은 혈청 분리기 튜브(serum separator tubes)에서 10분간 원심분리하여 얻었다. 50ml 차가운 생리식염수를 순환계(circulatory system)에 흐르게 하고, 복막후 백색지방조직(retroperitoneal white adipose tissue)과 시상하부를 잘라냈다. 조직들과 혈청을 액체질소로 급속동결시키고 -70℃에서 보관하였다.

실시예 7. RT - PCR .

Chomczynski and Sacchi법(Chomczynski P, Sacchi N: Anal Biochem 162: 156-159, 1987)의 변형된 방법을 사용하여 시상하부로부터 total RNA를 추출하였다. 그리고 나서, Qiagen one-step RT-PCR kit (Hilden, Germany)를 사용하여 1㎍ 의 total RNA를 cDNA로 역전사하였다. POMC(Proopiomelanocortin) sense 프라이머 서열은 CCCGAGAAACAGCAGCAGTG이고, 그것의 antisense 프라이머 서열은 AGGGGGCCTTGGAGTGAGAA이다. 50℃에서 30분간 증폭을 시작한 후, 94℃에서 1분간 denaturation, 적당한 프라이머쌍 결합온도에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 포함하는 30 cycles를 하고, 마지막 단계로 72℃에서 10분간 extension하였다. β-엑틴(β-Actin)(sense: TCTACAATGAGCTGCGTGTG, 와 antisense: GGTCAGGATCTTCATGAGGT)을 internal standard로 사용하였다. RT-PCR 결과물을 11.5% 아가로즈겔에서 전기영동하여 ethidium bromide 염색하여 시각화하였다.

실시예 8. Western blot analysis .

시상하부 용해물 (lysate)에서 얻은 단백질(30㎍)을 10% 폴리아크릴아마이드겔 상에서 분리하고 nitrocellulose membranes 위에 옮겼다. 인산화된 AMPK (pAMPK), 인산화된 acetyl-CoA carboxylase (pACC), 그리고 pSTAT3 농도는 그것들의 특이적 항체(Cell Signaling, Danvers, MA)로 blotting하여 분석하였고, AMPK, ACC 및 STAT3의 전체농도는 별도의 blots에서 계산하였다. 각각의 경우에서, horseradish peroxidase와 연결된 anti-rabbit 항체를 2차 항체로서 사용하였다. Blots는 강화된 chemiluminescence (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, U.K.)에 의해 현상시켰고, 정량(quantification)은 Scion Image software를 사용하여 수행하였다.

실시예 9. 렙틴 , 인슐린 및 corticotrophin releasing factor ( CRF )의 측정.

혈청 렙틴 농도는 rat leptin radioimmunoassay kit를 사용하여 측정하였고, CSF 렙틴은 leptin immunoassay kit (Quankine M; R&D Systems, Minneapolis, MN), 혈청 인슐린은 rat insulin enzyme immunosorbent assay kit(SPI-BIO, Massy, France), 혈청 corticotrophin releasing factor (CRF) 농도는 rat CRF enzyme immunosorbent assay kit (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA)를 사용하여 측정하였다.

실험결과 1. 고지방식이 쥐의 특징.

고지방식이는 4주 이후부터 실험이 끝나는 시점까지 정상식이 쥐와 비교할 때 체중을 현저히 증가시켰다 (P<0.05). 고지방식이 쥐에서 4개월간 누적 칼로리 섭취는 정상식이 쥐의 칼로리 섭취의 134%이다. 고지방식이 쥐의 복막후 백색지방조직량(retroperitoneal white adipose tissue mass)은 정상식이 쥐의 2.5배까지 증가되었다 (P<0.001). 또한 혈청 렙틴과 인슐린의 농도는 고지방식이 쥐에서 현저하게 높았다 (P<0.01)(표 1).

데이터는 각 군 8마리의 평균 ± 표준오차이다. *P<0.05 VS. 비처치된 대조물질투여 정상식이쥐; †P<0.01 vs. 비처치된 대조물질투여 정상식이쥐; ‡P<0.01 vs. 그들의 대조물질군; §P<0.05 vs. 그들의 대조물질군; ∥P<0.05 vs. 그들의 처치된 렙틴투여군; ¶P<0.05 vs. 비처치 대조물질 고지방식이군.

실험결과 2. 렙틴 주입쥐에서 메트포르민의 효과.

비록 메트포르민의 단독처치 효과가 고지방식이 쥐에서 더 현저했지만, 메트포르민 단독처치는 정상식이 쥐와 고지방식이 쥐의 칼로리 섭취와 체중을 감소시켰다 (도 1). 정상식이 쥐에 렙틴 처치는 vehicle 투여된 쥐와 비교할 때 7일째 날까지 일일 칼로리 섭취을 현저하게 감소시켰다. 더욱이, 5일째부터 메트포르민 비처 치하고 렙틴 처치한 쥐에서 속성내성(tachyphylaxis)이 발생하였다. 비록 이러한 식욕억제가 정상식이 쥐에서 보이는 것보다 작기는 하지만, 고지방식이 쥐에서 렙틴은 일일 칼로리 섭취 역시 억제하였다. 렙틴 처치는 정상식이 쥐에서 10%, 고지방식이 쥐에서 5% 까지 체중을 감소시켰다 (도 3). 메트포르민 처치는 정상식이 쥐에서 렙틴의 식욕억제와 체중감소 효과를 높이는 것으로 관찰되었고, 속성내성의 발생을 억제하는 것으로 관찰되었다. 또한 메트포르민 처치는 고지방식이 쥐에서 렙틴의 식욕억제와 체중감소 효과를 증가시켰다. 대조식이군에 뇌실내로 렙틴을 주입한 후 렙틴 효과에 대한 사료제한 효과를 배제하면서 칼로리 섭취와 체중을 측정하였다. 체중은 메트포르민 처치한 정상식이군보다 대조식이군에서 더 천천히 감소하였다. 그러나, 대조식이군에서 렙틴 처치로 인한 식욕억제는 메트포르민 처치한 군에서 관찰된 것보다는 미미한 수준이었다. 렙틴 처치는 정상식이군에서 복막후 백색지방조직량을 감소시켰다; 그러나, 그것은 고지방식이군에서 이 양을 감소시키지는 않았으며, 이것이 렙틴저항성의 특징이다. 메트포르민 처치는 고지방식이군과 정상식이군에서 복막후 백색지방조직량을 감소시켰다. 주목할 것은, 복막후 백색지방조직량은 메트포르민으로 처치한 정상식이군과 고지방식이군 모두에서 렙틴 처치에 의하여, 그들의 비처치된 다른 한쪽 군 및 대조식이군과 비교할 때 현저하게 감소하였다. 메트포르민의 렙틴 감수성 효과를 밝히기 위해, 본 발명자는 렙틴의 투여량-반응도를 측정하였다. 그에 따라서, 서로 다른 렙틴 투여량을 메트포르민 처치군과 비처치군에 주입하였다. 처치군에서, 렙틴의 식욕억제와 체중감소 효과는 일일 0.6 ㎍에서부터 식별할 수 있었고, 이러한 효과는 투여량을 늘리면 증가하였 다. 그러나, 비처치군에서는 일일 0.6㎍ 투여는 일일 칼로리 섭취뿐만 아니라 체중을 감소시키는데 실패하였다. 더욱이, 내장비만량은 메트포르민 처치된 정상식이군에서 일일 0.6㎍에서조차 렙틴 처치에 의해 유의하게 감소하였다; 그러나, 이러한 투여량은 비처치된 정상식이군에는 효과가 미미하다. 누적 칼로리 섭취와 체중은 메트포르민 처치된 정상식이군에서 렙틴 투여량-의존적(dose-dependent manner)으로 감소하였다 (도 2).

실험결과 3. 렙틴 , 인슐린, CRF 의 혈청농도와 CSF 렙틴 농도.

렙틴과 인슐린의 혈청농도는 고지방식이군에서 증가되었고, 이러한 군은 렙틴 처치에 대해서는 반응하지 않았다. 메트포르민 처치는 고지방식이군에서 그 자체로 렙틴과 인슐린의 혈청농도를 감소시켰고, 이러한 농도는 렙틴의 처치에 의해 추가적으로 감소하였다. 메트포르민과 렙틴의 병용처치(combined treatment)는 정상식이군에서 렙틴과 인슐린의 혈청농도를 유의하게 감소시켰다. 혈청 CRF농도는 정상식이군보다 고지방식이군에서 더 높았고, 이는 고지방식이군에서 렙틴 처치에 의해 변화되지는 않았다. 그러나 혈청 CRF농도는 정상식이군에서 렙틴에 의해 감소되었다. 메트포르민이 정상식이군에서 CRF농도를 변화시키지는 않았지만 고지방식이군에서는 CRF 농도를 감소시켰다. 렙틴 처치는 고지방식이 대조군에서 혈청 렙틴농도를 감소시켰지만, 이러한 군에서 CRF 농도변화는 미미하였다 (표 1). 고지방식이군에서 고렙틴혈증 (hyperleptinemia)에도 불구하고 정상식이군과 고지방식이군에서 CSF 렙틴농도 사이에 미미한 차이만 관찰되었다. 메트포르민 처치는 정상식이 군과 고지방식이군 모두에서 CSF 렙틴농도를 증가시켰고 (P<0.05), CSF-혈청의 렙틴농도비(CSF-to-serum leptin ratio)는 처치군에서 증가되었다 (도 4).

실험결과 4. Proopiomelanocortin mRNA 발현과 시상하부에서 pAMPK 와 pACC 의 농도.

Proopiomelanocortin (POMC) 발현은 정상식이군과 비교할 때 고지방식이군의 시상하부에서 현저하게 감소되었고, 뇌실내로 렙틴을 고지방식이군에 투여했을 때 POMC 발현에서 미미한 증가를 관찰하였다. 반면, 렙틴은 정상식이군에서 시상하부의 POMC 발현을 증가시켰다. 이것은 시상하부에서 렙틴저항성 개선의 추가적인 증거를 제공한다. 시상하부에서 neuropeptide Y와 agouti-related protein의 발현은 실험군들 사이에서 미미한 변화를 보였다 (데이타 미도시). 시상하부의 pAMPK 농도는 정상식이 쥐에서 메트포르민 처치가 아닌 렙틴 처치에 의해 감소하였다. 그러나, 메트포르민 비처치군보다 처치군에서 시상하부의 pAMPK의 농도를 감소시키기 위해서는 렙틴의 더 낮은 투여량이 요구된다. 고지방식이는 시상하부에서 pAMPK 농도에 영향을 주지 않았다 (데이타 미도시). AMPK의 downstream target인 시상하부 pACC 농도 변화는 pAMPK에 대하여 설명한 것과 같은 경향으로 밝혀졌다 (도 5).

실험결과 5. 렙틴의 식욕억제효과와 렙틴 signaling 에 대한 단기간의 메트포르민 처치의 효과.

2일간 메트포르민 처치는 비처치군에 비하여 뇌실내 렙틴 주사의 식욕억제효과를 증가시켰다. 더욱이, 렙틴의 식욕억제효과는 메트포르민 처치군에서 24시간까 지 지속되었다. 반면 렙틴의 식욕억제효과는 비처치군에서 렙틴 주사한지 6시간 후부터 둔화되었다. 본 발명자는 뇌실내 렙틴 주사 (0, 0.1 또는 1μg)한지 1시간 후 시상하부에서 pSTAT3 농도를 측정하였다. 0 또는 0.1μg 렙틴 주사한 후 pSTAT3 농도는 비처치군보다 처치군에서 더 증가되는 것이 밝혀졌다. 그러나, 최대 pSTAT3 농도 (렙틴 1μg에서)는 메트포르민 처치군과 비처치군에서 차이가 없었다 (도 6).

실험결과 6. OLETF 와 LETO 쥐에서 메트포르민의 효과.

3주간 투여된 메트포르민은 OLETF 쥐에서 평균의 누적 칼로리 섭취, 체중 및 내장지방량을 각각 46.9%, 19.4% 및 41.4%까지 감소시켰다. 이는 LETO 쥐에서 관찰되는 유사한 반응들과 비교할 때 메트포르민에 대한 증가된 반응들을 나타낸다. 이러한 쥐에서 평균의 누적 칼로리 섭취, 체중 및 내장지방량이 비처치된 LETO 쥐와 비교하여 각각 24.5%, 12.5% 및 29.4% 까지 감소되었다. 메트포르민 처치는 OLETF 와 LETO 쥐 모두에서 그들의 비처치 대조군의 한쪽과 비교할 때 혈청 렙틴 농도를 감소시켰다 (18.1 ± 1.23 vs. 37 ± 4.91, P<0.01; 및 7.1 ± 0.84 vs. 17.6 ± 2.08 ng/㎖, P<0.01; 각각). 더욱이, 메트포르민 처치된 OLETF 와 LETO 쥐에서 혈청 렙틴 농도는 식욕억제비율과 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났다 (도 7).

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 메트포르민(Metformin)의 식욕억제 메카니즘이 렙틴의 작용을 증가시키는 것과 관련이 있다는 사실을 실험적으로 규명하였으며, 렙틴저항성이 발생한 실험동물에서 렙틴 저항성을 개선하여 렙틴 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 따라서, 메트포르민이 비만으로 인해 렙틴저항성이 생긴 사람들에게서 렙틴감수성을 개선시키는 효능을 가진 비만치료제로서의 사용이 기대된다.

Claims (3)

1. 메트포르민(Metformin)을 유효성분으로 포함하는 비만 치료용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 메트포르민은 렙틴 저항성(Leptin resistance)을 개선시키는 것을 특징으로 하는 비만 치료용 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 비만 치료용 조성물은 메트포르민외에 렙틴을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 치료용 조성물.

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