KR102346125B1 - 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 원유나 난류 등의 검체가 잔류허용량 이상의 이버멕틴을 함유하고 있는 지의 여부를 간이 정성 키트로 판정하여 다수의 검체를 검사할 수 있도록 하고, 잔류허용량 이상의 이버멕틴이 함유된 검체의 경우에 한하여 공인시험법을 적용하여 분석하도록 한 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트를 개시한다.
이러한 본 발명은 컨쥬게이션패드에는 마우스유래 항 이버멕틴 항체-콜로이드 금 결합체를 부착시키고, 테스트라인에는 이버멕틴을 부착시키며 대조라인에는 염소 유래 항 마우스 항체를 부착하여서 된 것이다.
이와 같이 하여 본 발명은 다수의 검체를 다수의 래피드 키트에 적하시키고 테스트라인에 색상이 발현되지 않는 경우에 한하여 해당 검체 관련 물량을 공인시험법으로 검사하도록 함으로써 대량의 이버멕틴 잔류허용량 검사가 가능하게 되어 검사에 소요되는 시간과 소요비용을 최소화하며, 원유와 난류, 식육등 축산물의 신속한 유통에 기여할 수 있게 되는 유용한 효과가 있다.

Description

이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트{Rapid Kit for Ivermectin Quantitative Test}

본 발명은 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트에 관한 것으로 특히, 원유와 난류, 육즙 등의 검체에 이버멕틴 잔류량이 허용 기준치 이상 존재하는지의 여부를 빠르고 간편하게 검사 판정하기 위한 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트에 관한 것이다.

주지하는 바와 같이, 이버멕틴은 동물들에 기생하는 기생충을 제거하는데 쓰이는 광범위 구충제이며, 동물의 내,외부 구충이 동시에 구현되는 강력한 구충 효과를 가지고 있어 소, 닭 등에 주로 사용되고 있다.

이러한 이버멕틴은 염증성 병변 치료에도 사용되고 있고, 그 예를 대한민국 등록특허 10-1863085(발명의 명칭: 이버멕틴을 사용한 주사의 염증성 병변 치료)에서 살펴볼 수 있다.

그러나 이와 같이 널리 사용되고 있는 이버멕틴은 강력한 구충, 소염 효과에 수반하여 독성 또한 강하므로 축산물 내 이버멕틴 잔류허용량은 아래의 <표 1>로 도시한 바와 같이 엄격하게 통제되고 있는 것이다.

축산물 내 이버멕틴 잔류허용량 (단위: mg/kg)
소		말		돼지		양		염소		가금
간	0.8	간	0.8	간	0.015	간	0.015	간	0.8	근육	0.01
지방	0.4	지방	0.4	지방	0.02	지방	0.02	지방	0.4	알	0.01
근육	0.03	근육	0.03			유	0.01	근육	0.03
신장	0.1	신장	0.1					신장	0.1
유	0.01							유	0.01

특히, 이버멕틴이 잔류허용량 이상 함유된 동물의 고기나 우유, 달걀을 임산부나 수유 중인 사람이 섭취하는 경우 이버멕틴이 모유로 이행되어 태아나 유아에게 급성 독성의 부작용이 발생할 가능성이 있으므로 특히, 원유와 난류에 대한 이버멕틴의 잔류허용량 검사가 엄격하게 시행되고 있다.

이러한 이버멕틴 잔류허용량 검사를 위하여 종래에는 식품공전에 의한 잔류동물용의약품시험법에 따라 고가인 액체크로마토그래프-질량분석기 ( LC-MS/MS )를 사용하여 분석을 하도록 되어 있으나, 이는 검사소요시간 ( trunaround time )이 10분 이상 소요되므로 신선 상태의 유통을 위하여 다량의 식품 검사를 단시간 내에 완료하기 위하여 고가인 액체크로마토그래프-질량분석기를 다수 구매, 설치하여야 할 뿐만 아니라 장비와 시약을 다룰 수 있는 다수의 전문 인력을 배치하여야 하므로 이버멕틴의 잔류허용량 검사를 위한 경제적 부담이 매우 큰 실정이다.

대한민국 등록특허 10-1863085

본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 원유나 난류, 육즙 등의 검체가 잔류허용량 이상의 이버멕틴을 함유하고 있는지의 여부를 다수의 간이 정성 키트로 판정하여 다수의 검체를 동시에 검사할 수 있도록 하고, 잔류허용량 이상의 이버멕틴이 함유된 검체가 있는 경우에 한하여 해당 검체를 액체크로마토그래프-질량분석기를 활용한 공인 시험법을 적용하여 분석하도록 함으로써 다량의 검체를 최소 인원으로 단시간에 검사할 수 있도록 한 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트를 제공함을 목적으로 하는 것이다.

본 발명은 이러한 목적을 달성하기 위하여 점적공 및 투시공을 갖는 상부 케이스와 지지부를 갖는 하부 케이스에 수용되는 서브스트레이트 위에 샘플패드와 컨쥬게이션패드 그리고 테스트라인과 대조라인을 위한 염소유래 항 마우스 항체가 배치된 멤브레인과 흡수패드를 순차 배열하여서 된 공지의 것에 있어서,

상기 컨쥬게이션패드에는 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-금 결합체를 부착시키고, 테스트라인에는 이버멕틴을 부착시키며 대조라인에는 염소 유래 항 마우스 항체를 부착하여서 된 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트를 제안한다.

이와 같이 하여 본 발명은 다수의 검체를 다수의 래피드 키트에 적하시켜 테스트라인에 색상이 발현되지 않는 경우에 한하여 해당 검체를 액체크로마토그래프-질량분석기에 의한 공인시험법으로 재검사하도록 한다. 이와 같이 본 발명은 이버멕틴 잔류허용량을 초과하는 일부 물량에 한정하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 의한 정밀 분석을 시행하도록 함으로써 대량의 검체에 대한 이버멕틴 잔류허용량 검사가 신속하게 수행될 수 있는 것일 뿐만 아니라, 저가로 제작 가능한 본 발명에 의한 래피드 키트을 활용하여 소요비용을 최소화하고, 원유와 난류, 육류 등의 신속한 유통에 기여할 수 있게 되며, 검사 관련 소요 비용을 크게 절감할 수 있게 되는 유용한 효과가 있다.

도1은 본 발명이 적용되는 정성 검사용 래피드 키트의 사시도.
도2는 본 발명이 적용되는 정성 검사용 래피드 키트의 절개 사시도.
도3은 본 발명에 의한 정성 검사용 래피드 키트의 구성을 보인 종단면도.

이러한 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예를 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 편의상 본 발명에 의한 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트(100)의 구성에 따른 작용을 살펴보면 다음과 같다.

본 발명에 의한 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트(100)는 점적공(101) 및 투시공(102)을 갖는 상부케이스(200)와 지지부를 갖는 하부케이스(300)에 수용되는 서브스트레이트(500) 위에 샘플패드(501)와 컨쥬게이션패드(502) 그리고 테스트라인(503)과 대조라인(504)을 위한 염소유래 항 마우스 항체가 배치된 멤브레인(506)과 흡수패드(505)를 순차 배열하여서 된 공지의 것에 있어서,

상기 컨쥬게이션패드(502)에는 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-금 콜로이드 결합체를 부착시키고, 테스트라인(503)에는 이버멕틴을 부착하여서 된 것이다.

이러한 본 발명은 먼저 원유나 난류 또는 육즙 등의 검체를 준비한다.

이러한 검체가 난류의 경우와 같이 점도가 높은 경우도 있을 수 있으며, 이러한 상태에서는 바로 적하(滴下)시킬 수 없으므로 구연산염과 EDTA(에틸렌디아민사아세트산)을 검체와 섞어서 점적에 적합한 점도가 되도록 하여 사용할 수 있다.

이와 같이 준비된 검체가 이버멕틴이 없거나 희박한 경우에는 검체 100㎕ 정도를 점적공(101)에 떨어뜨렸을 때 서브스트레이트(500) 위의 샘플패드(501)에 흡수되고, 샘플패드(501)에서 모세관 현상에 의해서 컨쥬케이션패드에 도달한다. 이러한 컨쥬케이션패드에는 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-금 콜로이드 결합체가 부착되어 있다. 그러므로, 검체는 상기 금 콜로이드가 부착된 마우스유래 항 이버멕틴 단일 클론 항체와 함께 멤브레인(506)을 경유하여 이동하게 된다.

이러한 멤브레인(506)을 통과한 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-금 콜로이드 결합체는 테스트라인(503)의 이버멕틴에 도달하게 되는데, 항원인 이버멕틴이 상기 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체와 결합하므로 테스트라인(503)에서 금 콜로이드에 의한 발색이 이루어지게 된다. 이러한 과정으로 테스트라인(503)을 통과한 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-금 콜로이드 결합체 잔여량은 멤브레인(506)을 따라 계속 이동하여 대조라인(504)의 염소 유래 항 마우스 항체와 재차 결합하여 대조라인(504)의 염소유래 항 마우스 항체는 금 콜로이드와의 결합에 의한 발색을 하게 되는 것이다.

아울러, 상기한 대조라인(504)을 통과한 잔여 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-금 콜로이드 결합체는 흡수패드(505)에 흡수되는 것임은 물론이다.

이와 같이 검체에 이버멕틴이 없거나 희박한 0.01 mg/kg 미만의 미량 이버멕틴이 함유된 검체를 점적공(101)에 떨어뜨린 경우에는 테스트라인(503)과 대조라인(504)에서 발색 반응을 보여 검체가 잔류허용량 미만의 이버멕틴을 함유하고 있는 것으로 판정할 수 있게 되는 것이고, 본 발명에 의한 다른 래피드 키트(100)를 사용한 검체의 정성 분석 직업을 반복 실시하게 되는 것이다.

이와 같이 하여 다수의 검체에 대하여 반복적 정성 검사를 실시하다보면 이버멕틴이 0.01 mg/kg 이상 함유된 검체가 있을 수 있다.

이러한 잔류허용량을 초과하는 검체를 점적공(101)에 떨어뜨리면, 서브스트레이트(500) 위의 샘플패드(501)에 흡수되고, 샘플패드(501)모세관 현상에 의해서 컨쥬케이션패드에 도달한다. 이러한 컨쥬케이션패드에는 상기한 바와 같이 금 콜로이드와 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체가 결합된 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-금 콜로이드 결합체가 부착되어 있다. 그러므로, 검체의 이버멕틴은 상기 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체와 결합되는 것이며, 이러한 결합 상태로 멤브레인(506)을 경유하여 이동하게 된다.

이와 같이 이버멕틴이 상기 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-금 콜로이드 결합체와 결합된 상태로 멤브레인(506)을 통하여 상기 테스트라인(503)의 이버멕틴에 도달하게 되며, 이때 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체는 이미 충분한 양의 이버멕틴과 결합된 상태이므로 테스트라인(503)의 이버멕틴과 더 이상 반응하지 않고 그대로 통과하게 되는 것이다.

이에 따라, 테스트라인(503)에는 아무런 발색 반응이 없게 되고 이러한 과정으로 테스트라인(503)을 통과한 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-금 콜로이드 결합체 잔여량은 대조라인(504)의 염소 유래 항 마우스 항체와 결합되어 대조라인(504)의 염소유래 항 마우스 항체가 금 콜로이드에 의한 발색을 하게 된다.

아울러, 이러한 경우에도 대조라인(504)을 통과한 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-금 콜로이드 결합체 잔여량이 흡수패드(505)에 흡수되는 것임은 물론이다.

이와 같이 하여 결국 이버멕틴이 0.01 mg/kg 이상 함유된 검체를 점적공(101)에 떨어뜨린 경우에는 테스트라인(503)에 아무런 색상 반응이 없고 대조라인(504)에 한하여 발색 반응을 보이므로 검체가 잔류허용량 이상의 이버멕틴을 함유하고 있는 것으로 판정하고, 해당 검체 관련 물량의 원유나 난류, 육즙을 채취한 식육에 한하여 액체크로마토그래프-질량분석기를 활용한 공인시험법을 적용하여 정밀한 확인 분석을 실시하게 되는 것이다.

아울러, 식약처에서 제시하는 잔류 허용 기준은 1kg 당 닭고기, 알, 원유의 경우 0.01mg 이나, 소고기의 경우 부위에 따라 0.1~0.8mg 까지 잔류 허용 기준이 다르므로 우선적으로 컷오프 농도를 0.01mg/kg으로 하는 제작하는 것이 바람직하다.

이와 같이 하여 본 발명은 다수의 검체를 정성 분석하여 이버멕틴 잔류허용량 이상의 검체를 선별하고, 이러한 발생빈도가 높지 않은 선별된 검체에 국한하여 공인시험법을 적용함으로써 최소의 시간에 다량의 검체를 검사할 수 있게 되는 것이다.

이러한 본 발명에서는 상기한 금 콜로이드와 결합시키는 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체를 생산하기 위하여 다음과 같은 공정을 활용할 수 있다.

즉, 본 발명에서는 상기 컨쥬게이션패드(502)에 부착되는 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체를 생산하기 위하여;

마우스에 이버멕틴 항원을 1차 내지 3차 주사하는 접종단계와,

접종 완료된 마우스에서 이버멕틴 인식 항체 생성 림프구를 적출하는 이버멕틴 인식 항체 분비 림프구 추출단계와,

하이브리도마 암세포와 상기 이버멕틴 인식 항체 분리 림프구 세포를 PEG를 이용하여 융합시키는 세포 융합단계와,

세포 융합단계에서 얻은 융합세포는 항체배양제가 함유된 1종 이상의 배지에서 증식시키는 세포 증식단계와,

증식된 세포를 ELISA ASSAY를 이용하여 선별하고 한계 희석법으로 역가 높은 세포주만을 선발하고, 배양액에서 대량 배양하는 고역가 세포주선발 및 배양단계와,

비면역화된 마우스 복강에 상기 배양된 고역가 세포주를 주사하여 복수를 얻고 이들로부터 Protein G 컬럼을 이용하여 IgG(면역글로불린)을 정제하는 항체정제단계를 구비할 수 있다.

이를 좀 더 상세히 살펴보면, 상기 접종단계에서 4주령 Balb/c 마우스를 이용하여 다리의 림프절에 사균(死菌)을 가하지 않은 프로인드 인컴플리트 보조액( Freunds Imcomplete Adjuvant )과 이버멕틴을 복합하여서 된 복합체를 혼합하여 얻은 이버멕틴 항원을 주사하여 1차 접종한다. 이어서 14일 경과 후 인산염버퍼와 이버멕틴 항원을 혼합하여 2차 접종을 실시하게 된다.

필요에 따라 3차 접종을 실시할 수도 있음은 물론이다.

이어서, 본 발명은 이버멕틴 인식 항체 분비 림프구 추출 단계를 실시하게 되며 이를 위하여 2차 접종 완료 후 1주일이 경과한 3주일 후 마우스의 양쪽 하지를 절개하여 림프절을 적출한다.

아울러, 본 발명은 세포 융합단계를 실시하게 되며, 이를 위하여 림프절 내의 모든 림프구 세포와 분양받은 하이브리도마 암세포인 FO cell(CRL-1646)를 혼합한 후, PEG( 폴리에틸렌글리콜 )을 점적하고, 이후 소혈청알부민과 HT 배지 첨가를 통하여 세포 융합 단계를 마무리한다. 2차례 이상 세척 단계를 거친 후, 최종적으로 HAT 배지로 희석 배양하여 FO cell과 융합된 융합세포만 남게 되며, 나머지는 세포는 사멸되도록 배양을 한다.

이어서, 상기 융합세포를 증식시켜야 하므로 융합세포만을 HT supplement가 함유된 배지에서 1차 증식시키고, 일반 배지로 2차 증식시키게 된다.

또한, 본 발명에서는 고역가 세포주 선발 및 배양단계를 실시하게 되며, 이를 위하여 ELISA ASSAY를 통하여 이버멕틴 항체 반응을 하는 웰만을 선발하고 이들 중 한계희석법( Limit Dilution Assay )으로 역가 높은 세포주만을 선발하며, 배양액에서 대량배양함으로써 고역가 세포주를 선발하고 대량으로 배양하는 단계를 완료하게 된다.

이어서, 항체정제단계를 실시하게 되며 이를 위하여 선발된 고역가 세포주를 비면역화된 마우스 복강에 주사하여 복강에서 ascites(복수)를 얻어 낸 후 이들로부터 Protein G 컬럼을 이용하여 IgG(면역글로불린)를 정제하여 항체정제 단계를 완료한다. 필요에 따라 이버멕틴-단백질 결합체가 결합된 레진을 이용하여 친화컬럼을 통한 정제도 가능하다.

이와 같이 하여 본 발명은 마우스 유래 항 이버멕틴 단일 클론 항체를 생산할 수 있게 되는 것이며, 이외에도 기술적 특징을 동일하게 유지하면서 수정되거나 보완된 방법으로도 마우스 유래 항 이버멕틴 단일 클론 항체를 생산할 수 있음은 물론이다.

아울러, 본 발명에서는 컨쥬게이션패드(502)에 부착시키는 표지물질로 나노크기의 금 콜로이드를 사용한 예를 언급하였으나 필요에 따라 형광비드( Fluorescence bead )콜로이드를 사용할 수도 있음은 물론이다.

이상에서, 본 발명은 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체를 생산하기 위한 공정을 예시하고, 컨쥬게이션패드(502)에 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-금 콜로이드 결합체를 부착하며, 테스트라인(503)에 항원인 이버멕틴을 부착하여서 된 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트(100)에 대한 기술적 특징을 서술하였지만, 이는 본 발명의 가장 양호한 실시예를 예시적으로 설명한 것이지 본 발명을 한정하는 것이 아니고, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 본 발명의 기술사상의 범위를 이탈하지 않는 범위 내에서 다양한 변형 및 모방할 수 있음은 명백한 사실이며 이러한 변형 및 모방은 본 발명의 기술 사상의 범위에 포함된다.

100 : 정성 검사용 래피드 키트 200 : 상부케이스
300 : 하부케이스 500 : 서브스트레이트
501 : 샘플패트 502 : 컨쥬게이션패드
503 : 테스트라인 504 : 대조라인
505 : 흡수패드 506 : 멤브레인

Claims (5)

1. 점적공 및 투시공을 갖는 상부 케이스와, 지지부를 갖는 하부 케이스에 수용되는 서브스트레이트 위에 샘플패드와 컨쥬게이션패드 그리고 테스트라인과 대조라인을 위한 염소유래 항 마우스 항체가 배치된 멤브레인과 흡수패드를 순차 배열하여서 된 래피드 키트에 있어서,
   상기 컨쥬게이션패드에는 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-표지물질 콜로이드 결합체를 부착시키고, 테스트라인에는 이버멕틴을 부착시켜서 되며,
   상기 컨쥬게이션패드에 부착되는 마우스유래 항 이버멕틴 단일클론 항체-표지물질 콜로이드 결합체는 ;
   마우스에 이버멕틴 항원을 1차 내지 3차 주사하는 접종단계와,
   접종 완료된 마우스에서 이버멕틴 인식 항체 생성 림프구를 적출하는 이버멕틴 인식 항체 분비 림프구 추출단계와,
   하이브리도마 암세포와 상기 이버멕틴 인식 항체 분리 림프구 세포를 PEG를 이용하여 융합시키는 세포 융합단계와,
   세포 융합단계에서 얻은 융합세포는 항체배양제가 함유된 1종 이상의 배지에서 증식시키는 세포 증식단계와,
   증식된 세포를 ELISA ASSAY를 이용하여 선별하고 한계희석법으로 역가높은 세포주만을 선발하고, 배양액에서 대량 배양하는 고역가 세포주선발 및 배양단계와,
   비면역화된 마우스 복강에 상기 배양된 고역가 세포주를 주사하여 복수를 얻고 이들로부터 Protein G 컬럼을 이용하여 IgG(면역글로불린)을 정제하는 항체정제단계를 구비하여서 된 것임을 특징으로 하는 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 접종단계는;
   4주령 Balb/c 마우스를 이용하여 다리의 림프절에 사균(死菌)을 가하지 않은 프로인드 인컴플리트 보조액( Freunds Imcomplete Adjuvant )과 이버멕틴을 복합하여서 된 복합체를 혼합하여 얻은 이버멕틴 항원을 주사하여 1차 접종하고 14일 경과 후 동일한 상기 이버멕틴 항원으로 2차 접종을 실시하여서 됨을 특징으로 하는 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 융합단계는;
   마우스에서 적출된 이버멕틴 인식 항체 생성 림프구 세포와 Fo cell 과 함께 PEG( 폴리에틸렌글리콜 ) 용액를 이용하여 상기 이버멕틴 인식 항체 생성 림프구와 FO cell이 융합된 세포를 획득하여서 됨을 특징으로 하는 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 컨쥬게이션패드에 부착시키는 표지물질 콜로이드가 나노크기의 골드를 이용한 금 콜로이드임을 특징으로 하는 이버멕틴 정성 검사용 래피드 키트.
   

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