KR102321353B1 - 압축된 골 조성물 및 이의 이용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 압축된 골 조성물, 골 임플란트, 및 이의 변형체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 압축된 골 조성물, 골 임플란트, 및 이의 변형체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 골 조성물, 골 임플란트 및 이의 변형체를 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

압축된 골 조성물 및 이의 이용 방법{COMPRESSED BONE COMPOSITION AND METHODS OF USE THEREOF}

발명의 배경

본 발명은 압축된 골 조성물, 골 임플란트, 및 이의 변형체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 골 임플란트 및 이의 변형체를 이용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 압축된 골 조성물, 입자, 섬유, 임플란트, 및 이의 변형체, 및 이를 준비하고 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 골 조성물, 입자, 섬유, 임플란트, 및 이의 변형체를 이용하는 방법에 관한 것이다.

광물제거된 피질 및 해면 골 조성물은 다양한 임상 병리학의 치료를 위한 새로운 골 형성의 유도에 광범하게 이용되어 왔다. 전형적으로, 골 재료는 인간 또는 동물 소스로부터 수득되고, 가공되고, 광물제거되고, 골 임플란트로 제조된다. 그러한 골 임플란트는 예를 들어 압축된 골 섬유 및/또는 골 섬유를 포함할 수 있는 골 조성물을 포함할 수 있다. 골 임플란트는 또한 성장 인자, 단백질, 세포, 및 골유도 및 골 치유를 촉진시킬 수 있는 다른 생물활성 재료를 포함할 수 있다. 일반적으로, 가공을 위한 양호한 습윤 및 건조 처리 특성을 갖는 신규한 골 재료를 개발하고, 생물활성 분자의 부착 및 기능을 위한 환경을 제공하는 것이 바람직하다.

US 6440444 B2

개요

본 발명은 골 입자 및/또는 섬유를 소정의 형상을 지닌 몰드에 부하시키고, 입자 및/또는 섬유에 압력을 가하고, 압축된 골 입자 및/또는 섬유를 동결 건조시키는 것을 포함하는 압축된 골 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 압력은 0.1 내지 30 MPa일 수 있다. 또 다른 양태에서, 소정의 형상은 홈을 포함한다. 또 다른 양태에서, 압축된 골 조성물은 액체에 도입된 후 적어도 5-30분 동안 액체에서 이들의 완전성을 유지한다. 또 다른 양태에서, 압력은 실온에서 골 입자 및/또는 섬유에 가해진다. 또 다른 양태에서, 압축된 골 조성물은 결합제 또는 화학적 가교제를 포함하지 않는다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 골 임플란트에 관한 것이다. 한 양태에서, 골 임플란트는 홈을 포함한다.

본 발명은 골 섬유를 포함하는 골 조성물에 관한 것이고, 골 섬유는 약 5 μm 미만의 평균 폭 (W) 및 약 2 초과의 평균 길이 (L) : W 비를 갖는 마이크로화이버를 포함한다.

본 발명은 또한, 골 조성물을 임플란트 또는 보철물을 위해 개체의 골 구조로부터 취해진 3차원 (3D) 의료 영상 측정에 기반한 몰드에 부하시키고 (이 때 골 조성물은 약 2 초과의 평균 길이 (L) : 평균 폭 (W) 비를 갖는 마이크로화이버를 포함한다); 골 조성물에 0.1 내지 30 MPa의 압력을 가하여 몰드에 맞추고; 압축된 골 조성물을 동결 건조시켜 골 임플란트를 제조하는 것을 포함하는, 개별화 골 임플란트를 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 측정은 골 섬유를 압축시키기 위한 맞춤 몰드를 생성하기 위해 컴퓨터 지원 설계로 전환된다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 골 임플란트 및 그러한 골 임플란트를 이용하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 동결건조 후 압축된 골 섬유의 미러드 웨이브(mirrored wave) (A, D) 및 단일 웨이브 (B) 구조를 도시한다. 동결건조되기 전 -80℃에서 동결된 2축 웨이브 구조가 또한 도시된다 (C). 압축된 골 섬유의 고유의 가요성이 또한 도시된다 (D). 증가된 가요성을 위한 버블-기반 이식에 대한 설계가 또한 도시된다 (E).
도 2는 본 발명의 일부 구체예에 따라 30분 동안 염수에서의 수화에 의해 습윤되고 이에 의해 확장된 주사 전자 현미경 (SEM)에 의한 골 섬유의 샘플을 예시한다.
도 3A 및 3B는 본 발명의 일부 구체예에 따라 각각의 공여체 간의 컴퓨터 수치 제어 (CNC)에 의해 절단된 골 섬유의 평균 길이 및 폭을 도시한다.
도 4는 본 발명의 일부 구체예에 따라 수은 다공성 측정을 통해 CNC에 의해 절단된 골 섬유로부터 제조된 습윤된 골 섬유 샘플의 공극 분포를 도시한다.
도 5는 본 발명의 일부 구체예에 따라 건조 골 섬유 샘플의 SEM 이미지를 도시하며, 이는 골 섬유 본체 및 마이크로화이버를 예시한다.
도 6은 본 발명의 일부 구체예에 따라 상이한 배율 (mag.)의 건조 골 섬유의 샘플의 SEM 이미지를 예시한다.
도 7은 CNC 0.003 및 0.009에 의해 제조된 골 조성물 샘플에서 BMP-2 성장 인자의 양을 도시한다.
도 8은 본 발명의 일부 구체예에 따라 광물제거된 골 기질 (DBM) 섬유로부터 골 임플란트 상에서 성장하는 골수-유래 중간엽 줄기 세포 (BMSC)의 샘플 SEM 이미지를 도시한다.
도 9는 본 발명의 일부 구체예에 따라 골 섬유로부터 임플란트 상의 BMSC 성장을 예시한다.
도 10은 본 발명의 일부 구체예에 따라 골 조성물 임플란트에 대한 생체내 골 섬유 간격, 세포충실성, 및 골모세포원성 분화를 예시한다.
도 11은 본 발명의 일부 구체예에 따라 골 임플란트에 대한 생체내 임플란트 통과 골유도성 (OI) 검정의 백분율 및 섬유 패킹 밀도 (느슨 대 가압)와의 관련성을 입증한다.
도 12는 본 발명의 일부 구체예에 따라 골 임플란트를 설계하고 몰딩하는 공정을 도시한다.
도 13A는 3점 휨 기계적 시험 데이터를 도시하고, 도 13B는 10 mm 볼 파열 기계적 시험 데이터를 도시한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 골 입자 및/또는 섬유룰 소정의 형상을 지닌 몰드에 부하시키고, 골 입자 및/또는 섬유에 압력을 가하고, 압축된 골 입자 및/또는 섬유를 동결 건조시키는 것을 포함하는, 압축된 골 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 골 섬유를 포함하는 압축된 골 조성물에 관한 것이고, 골 섬유는 약 5 μm 미만의 평균 폭 (W) 및 약 2 초과의 평균 길이 (L) : W 비를 갖는 마이크로화이버를 포함한다.

본원에 기재된 골 입자는 비제한적으로 골 섬유 및/또는 분말을 포함한다. 본원에 기재된 골 섬유는 비제한적으로 골 섬유 및/또는 분말을 포함한다. 골 입자 및/또는 섬유는 동결-건조, 분쇄/파쇄, 및 골 입자 및/또는 섬유로 절단되거나 되지 않은 세정되고 소독된 골 단편으로부터 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유는 습윤되고 동결전 건조된다. 골 입자 및/또는 섬유는 요망되는 크기 범위 내의 입자 및/또는 섬유를 수득하기 위해, 예를 들어 시판되는 체질 장치 (예컨대, 메시체)를 이용하여 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 섬유는 요망되는 크기 범위 내의 섬유를 수득함에 있어서 체질되거나 분류되지 않는다.

일부 구체예에서, 골 입자는, 예를 들어, 약 125 마이크론 내지 약 4 mm; 약 710 마이크론 내지 약 2 mm; 약 125 마이크론 내지 약 500 마이크론; 약 125 마이크론 내지 약 850 마이크론; 또는 약 250 마이크론 내지 약 710 마이크론의 평균 직경을 지닐 수 있다. 일부 구체예에서, 골 입자는 약 10 내지 1,000 마이크론의 중간 직경, 약 0.5 내지 100 mm의 중간 길이, 및 약 10 내지 1000 마이크론의 중간 두께를 지닌다. 본 발명의 특정 구체예는 시판되는 골 분말을 포함할 수 있다. 예를 들어, 광범하고 안정적으로 이용가능한 적합한 골 분말은 LifeNet Health, Virginia Beach, VA에 의해 생성된다 (예컨대, 분쇄된 광물제거 골 분말, 및 광물제거 골 섬유). 일부 구체예에서, 골 입자는 골 조직의 분쇄, 스카이빙(skiving), 또는 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 기계가공에 의해 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 골 입자는 본원에 참조로서 포함되는 미국특허 7,744,597호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다.

일부 구체예에서, 골 섬유는 연장된 본체를 지닐 수 있다. 본 출원에서, 본체의 치수는 골 섬유의 치수로서 언급된다. 예를 들어, 골 섬유의 길이는 약 100 마이크론 내지 약 50 mm; 약 200 마이크론 내지 약 20 mm; 약 500 마이크론 내지 약 15 mm; 약 600 마이크론 내지 약 12 mm; 약 700 마이크론 내지 약 11 mm; 약 700 마이크론 내지 약 10 mm; 약 700 마이크론 내지 약 9 mm; 약 700 마이크론 내지 약 8 mm; 약 700 마이크론 내지 약 7 mm; 약 700 마이크론 내지 약 6 mm; 약 900 마이크론 내지 약 15 mm; 약 900 마이크론 내지 약 10 mm; 또는 약 900 마이크론 내지 약 9 mm일 수 있다. 추가로, 예를 들어, 골 섬유의 폭은 약 5 마이크론 내지 약 5 mm; 약 10 마이크론 내지 약 4 mm; 약 20 마이크론 내지 약 3 mm; 약 20 마이크론 내지 약 2 mm; 약 20 마이크론 내지 약 1.5 mm; 약 20 마이크론 내지 약 1 mm; 약 20 마이크론 내지 약 800 마이크론; 약 20 마이크론 내지 약 700 마이크론; 약 20 마이크론 내지 약 600 마이크론; 약 70 마이크론 내지 약 2 mm; 약 70 마이크론 내지 약 1.5 mm; 약 70 마이크론 내지 약 1.4 mm; 또는 약 70 마이크론 내지 약 1.3 mm일 수 있다.

일부 구체예에서, 골 조성물 중 골 섬유는 평균 길이 및 평균 폭을 지닐 수 있고. 예를 들어, 골 섬유의 평균 길이는 약 1 mm 내지 약 10 mm; 약 1.5 mm 내지 약 5 mm; 약 2 mm 내지 약 4 mm; 약 2.5 mm 내지 약 3 mm; 약 3 mm 내지 약 5 mm; 약 3 mm 내지 약 4 mm; 또는 약 3.5 mm 내지 약 4 mm일 수 있다. 골 섬유의 평균 폭은 약 50 마이크론 내지 약 1 mm, 약 100 마이크론 내지 약 800 마이크론, 약 150 마이크론 내지 약 700 마이크론, 약 200 마이크론 내지 약 500 마이크론, 약 200 마이크론 내지 약 400 마이크론, 약 200 마이크론 내지 약 300 마이크론, 약 200 마이크론 내지 약 250 마이크론, 약 300 마이크론 내지 약 500 마이크론, 약 300 마이크론 내지 약 400 마이크론, 약 400 마이크론 내지 약 500 마이크론, 또는 약 400 마이크론 내지 약 450 마이크론일 수 있다. 골 섬유의 평균 길이는 20 mm, 10 mm, 9 mm, 8 mm, 7 mm, 6 mm, 5 mm, 4 mm, 또는 3 mm 미만일 수 있다. 골 섬유의 평균 길이는 500 마이크론, 1 mm, 1.5 mm, 2 mm, 2.5 mm, 3 mm, 3.5 mm, 4 mm, 4.5 mm, 또는 5 mm 초과일 수 있다. 골 섬유의 평균 폭은 1 mm, 900 마이크론, 800 마이크론, 700 마이크론, 600 마이크론, 500 마이크론, 400 마이크론, 300 마이크론, 또는 250 마이크론 미만일 수 있다. 골 섬유의 평균 폭은 10 마이크론, 20 마이크론, 30 마이크론, 40 마이크론, 50 마이크론, 75 마이크론, 100 마이크론, 150 마이크론, 200 마이크론, 300 마이크론, 400 마이크론, 또는 500 마이크론 초과일 수 있다.

본 발명의 특정 구체예는 시판되는 골 분말을 포함할 수 있다. 예를 들어, 광범하고 안정적으로 이용가능한 적합한 골 분말은 LifeNet Health Inc., Virginia Beach, VA에 의해 생성된다 (예컨대, 광물제거 골 섬유). 일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유는 골 조직의 분쇄, 스카이빙, 또는 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 기계가공에 의해 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유는 본원에 참조로서 포함되는 미국특허 7,744,597호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다.

일부 구체예에서, 골 섬유는 마이크로화이버를 포함할 수 있다. 마이크로화이버는 골 섬유의 본체로부터 연장되는 돌기 또는 스파이크를 포함할 수 있지만, 골 섬유의 주요 직경에 비해 현저하게 짧은 폭 또는 직경을 갖는다. 마이크로화이버는 마이크로화이버가 골 섬유의 본체에 연결되는 마이크로화이버의 끝을 측정한 길이를 지닐 수 있다. 마이크로화이버의 평균 길이 (L)는 샘플로부터 대표적인 수의 마이크로화이버에 대한 길이의 평균을 나타낸다. 마이크로화이버는 마이크로화이버의 직경의 평균 측정치인 폭을 지닐 수 있다. 마이크로화이버의 평균 폭 (W)은 샘플로부터 대표적인 수의 마이크로화이버에 대한 폭의 평균을 나타낸다.

일부 구체예에서, 마이크로화이버의 폭은 약 0.5 내지 약 100 마이크론의 범위일 수 있다; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 폭은 약 0.1 내지 약 30 마이크론의 범위일 수 있다; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 폭은 약 0.2 내지 약 20 마이크론의 범위일 수 있다; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 폭은 약 0.2 내지 약 10 마이크론의 범위일 수 있다; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 폭은 약 0.2 내지 약 3 마이크론의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 폭 (W)은 약 0.5 내지 약 20 마이크론의 범위일 수 있고, 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 폭 (W)은 약 0.8 내지 약 10 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 폭 (W)은 약 0.8 내지 약 6 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 폭 (W)은 약 0.8 내지 약 3 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 폭 (W)은 약 0.8 내지 약 2 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 폭 (W)은 약 0.8 내지 약 1.5 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 폭 (W)은 약 0.8 내지 약 1.4 마이크론의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 평균 폭 (W)은 약 6 마이크론, 5 마이크론, 4 마이크론, 3 마이크론, 2 마이크론, 1.6 마이크론, 1.5 마이크론, 1.4 마이크론, 1.3 마이크론, 1.2 마이크론, 1.1 마이크론, 1 마이크론, 또는 0.9 마이크론 미만일 수 있다. 일부 구체예에서, 평균 폭 (W)은 약 0.2 마이크론, 0.3 마이크론, 0.4 마이크론, 0.5 마이크론, 0.6 마이크론, 0.7 마이크론, 0.8 마이크론, 0.9 마이크론, 1 마이크론, 1.1 마이크론, 1.2 마이크론, 1.3 마이크론, 또는 1.35 마이크론 초과일 수 있다.

일부 구체예에서, 마이크로화이버의 길이는 약 0.5 내지 약 100 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 길이는 약 1 내지 약 50 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 길이는 약 2 내지 약 50 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 길이는 약 3 내지 약 20 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 길이는 약 3 내지 약 16 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 길이는 약 3 내지 약 11 마이크론의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 길이 (L)는 약 3 내지 약 20 마이크론의 범위일 수 있고, 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 길이 (L)는 약 4 내지 약 15 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 길이 (L)는 약 5 내지 약 13 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 길이 (L)는 약 6 내지 약 10 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 길이 (L)는 약 6 내지 약 8 마이크론의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 길이 (L)는 약 6 내지 약 7 마이크론의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 길이 (L)는 약 20 마이크론, 15 마이크론, 12 마이크론, 10 마이크론, 9 마이크론, 8 마이크론, 7 마이크론, 또는 6.5 마이크론 미만일 수 있다. 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 길이 (L)는 약 0.5 마이크론, 0.6 마이크론, 0.7 마이크론, 0.8 마이크론, 0.9 마이크론, 1 마이크론, 2 마이크론, 3 마이크론, 4 마이크론, 5 마이크론, 6 마이크론, 7 마이크론, 8 마이크론, 9 마이크론, 또는 10 마이크론 초과일 수 있다.

일부 구체예에서, 마이크로화이버의 평균 길이 (L): 평균 폭 (W) 비는 약 0.5 내지 50의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 0.8 내지 20의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 1 내지 10의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 2 내지 8의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 2 내지 6의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 2 내지 5의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 3 내지 20의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 3 내지 10의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 3 내지 8의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 3 내지 6의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 4 내지 20의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 4 내지 10의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 4 내지 8의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 4 내지 6의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 5 내지 20의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 5 내지 10의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 5 내지 8의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 6 내지 20의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 6 내지 10의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 7 내지 20의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 7 내지 10의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 8 내지 20의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 9 내지 20의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 마이크로화이버의 L:W 비는 약 10 내지 20의 범위일 수 있다.

일부 구체예에서, 마이크로화이버는 약 0.5, 0.8, 1, 1.5, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 또는 7.5 초과의 L:W 비를 지닐 수 있다. 일부 구체예에서, 마이크로화이버는 약 20.0, 15.0, 14.0, 13.0, 12.0, 11.0, 10.0, 9.5, 9.0, 8.5, 8.0, 7.5, 7.0, 6.5, 6.0, 5.5 또는 5.0 미만의 L:W 비를 지닐 수 있다.

일부 구체예에서, 건조 골 조성물의 공극 크기에 대한 모드(mode)는 5 내지 30 마이크론, 5 내지 20 마이크론, 10 내지 500 마이크론, 10 내지 300 마이크론, 10 내지 100 마이크론, 10 내지 50 마이크론, 10 내지 30 마이크론, 10 내지 25 마이크론, 15 내지 25 마이크론, 15 내지 400 마이크론, 20 내지 300 마이크론, 30 내지 200 마이크론, 30 내지 100 마이크론, 35 내지 100 마이크론, 40 내지 100 마이크론, 40 내지 80 마이크론, 40 내지 70 마이크론, 40 내지 60 마이크론, 50 내지 100 마이크론, 50 내지 80 마이크론, 50 내지 70 마이크론, 50 내지 60 마이크론, 또는 54 내지 57 마이크론의 범위일 수 있다. 건조 골 조성물의 공극 크기에 대한 모드는 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 마이크론 초과일 수 있다. 건조 골 조성물의 공극 크기에 대한 모드는 약 500, 400, 300, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 또는 18 마이크론 미만일 수 있다.

일부 구체예에서, 건조 골 조성물의 공극 크기에 대한 평균은 0.05 내지 25 마이크론, 0.05 내지 20 마이크론, 10 내지 500 마이크론, 15 내지 400 마이크론, 20 내지 300 마이크론, 30 내지 200 마이크론, 30 내지 100 마이크론, 35 내지 100 마이크론, 35 내지 80 마이크론, 35 내지 70 마이크론, 35 내지 60 마이크론, 35 내지 50 마이크론, 35 내지 45 마이크론, 40 내지 100 마이크론, 40 내지 90 마이크론, 40 내지 80 마이크론, 40 내지 70 마이크론, 40 내지 60 마이크론, 또는 40 내지 50 마이크론의 범위일 수 있다. 건조 골 조성물의 공극 크기에 대한 평균은 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 마이크론 초과일 수 있다. 건조 골 조성물의 공극 크기에 대한 평균은 약 500, 400, 300, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 또는 30 마이크론 미만일 수 있다.

골 조성물이 용액에 침지되고 (예컨대, 염수 용액 또는 혈액 또는 세포 현탁액) 더 이상의 액체의 수용을 거부할 때 습윤 골 조성물은 평형 상태에 도달한다. 골 조성물의 평형 모델은 생체내 골 조성물의 상태를 모방할 수 있다. 일부 구체예에서, 골 조성물이 용액, 액체 또는 유체에 침지될 때, 골 조성물이 팽창하여 하이드로겔 또는 성형 퍼티(moldable putty)를 발생시킨다. 추가적인 구체예에서, 골 조성물이 적어도 5분, 15분, 20분, 30분, 40분, 또는 50분 동안 용액에 침지될 때 이는 평형에 도달한다.

일부 구체예에서, 평형에서 습윤 골 조성물의 공극 크기에 대한 모드는 10 내지 500 마이크론, 15 내지 400 마이크론, 20 내지 300 마이크론, 20 내지 250 마이크론, 20 내지 210 마이크론, 25 내지 250 마이크론, 25 내지 225 마이크론, 25 내지 210 마이크론, 25 내지 200 마이크론, 25 내지 190 마이크론, 25 내지 180 마이크론, 25 내지 170 마이크론, 25 내지 160 마이크론, 25 내지 100 마이크론, 25 내지 50 마이크론, 25 내지 45 마이크론, 25 내지 40 마이크론, 25 내지 35 마이크론, 50 내지 500 마이크론, 50 내지 250 마이크론, 50 내지 200 마이크론, 50 내지 150 마이크론, 50 내지 130 마이크론, 50 내지 120 마이크론, 50 내지 115 마이크론, 50 내지 110 마이크론, 50 내지 1005마이크론, 250 내지 500 마이크론, 250 내지 400 마이크론, 250 내지 350 마이크론, 250 내지 300 마이크론, 150 내지 500 마이크론, 150 내지 400 마이크론, 150 내지 350 마이크론, 150 내지 300 마이크론, 150 내지 250 마이크론, 150 내지 240 마이크론, 150 내지 230 마이크론, 150 내지 220 마이크론, 또는 150 내지 210 마이크론의 범위일 수 있다. 평형에서 습윤 골 조성물의 공극 크기에 대한 모드는 5, 10, 15, 20, 30, 40, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200 마이크론 초과일 수 있다. 평형에서 습윤 골 조성물의 공극 크기에 대한 모드는 500, 400, 300, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 또는 20 마이크론 미만일 수 있다.

일부 구체예에서, 평형에서 습윤 골 조성물의 공극 크기에 대한 평균은 0.1 내지 10 마이크론, 0.1 내지 5 마이크론, 0.1 내지 3 마이크론, 10 내지 300 마이크론, 15 내지 200 마이크론, 20 내지 100 마이크론, 20 내지 90 마이크론, 20 내지 80 마이크론, 20 내지 75 마이크론, 20 내지 70 마이크론, 25 내지 100 마이크론, 25 내지 90 마이크론, 25 내지 80 마이크론, 25 내지 75 마이크론, 25 내지 70 마이크론, 25 내지 65 마이크론, 25 내지 60 마이크론, 25 내지 55 마이크론, 25 내지 51 마이크론, 25 내지 50 마이크론, 50 내지 100 마이크론, 50 내지 90 마이크론, 50 내지 80 마이크론, 50 내지 75 마이크론, 또는 50 내지 70 마이크론의 범위일 수 있다. 평형에서 습윤 골 조성물의 공극 크기에 대한 평균은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.7, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 마이크론 초과일 수 있다. 평형에서 공극 크기에 대한 평균은 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0.1 마이크론 미만일 수 있다.

일부 구체예에서, 평형에서 습윤 골 조성물의 공극 크기는 단봉 분포를 지닌다. 일부 구체예에서, 평형에서 습윤 골 조성물의 공극 크기는 뚜렷한 이봉 분포를 갖지 않는다. 이봉 분포는 2개의 다른 피크를 갖는 공극 크기 분포로서 정의될 수 있다. 뚜렷한 이봉 분포는 0.99 내지 1.01, 0.95 내지 1.05, 0.9 내지 1.1, 0.85 내지 1.18, 0.8 내지 1.25, 0.7 내지 1.43, 0.6 내지 1.67, 0.5 내지 2, 0.4 내지 2.5, 0.3 내지 3.33, 0.2 내지 5, 0.15 내지 6.67, 0.05 내지 20, 0.04 내지 25, 0.03 내지 33, 0.02 내지 50, 0.01 내지 100, 또는 0.005 내지 200의 범위 내의 이봉 비 (한 피크 대 다른 피크의 비)를 갖는 이봉 분포로서 정의될 수 있다.

본원에서 사용되는, 예를 들어 조성물 중 성분의 길이, 폭, 거리, 양, 농도, 부피, 공정 온도, 공정 시간, 수율, 유량, 압력, 및 유사 값, 및 이의 범위를 변형시키는 용어 "약"은, 예를 들어, 화합물, 조성물, 농축물 또는 사용 제형을 제조하는데 이용되는 전형적인 측정 및 처리 절차를 통해; 이러한 절차에서의 우연한 변동을 통해; 상기 방법을 수행하는데 이용되는 출발 물질 또는 성분의 제조, 소스, 또는 순도에서의 차이를 통해; 및 유사 고려사항에 의해 발생할 수 있는 수치적 양에서의 변동을 의미한다. 용어 "약"은 또한, 예를 들어, 특정 초기 농도 또는 혼합물을 지닌 조성물, 제형, 또는 세포 배양액의 에이징으로 인해 달라진 양, 및 특정 초기 농도 또는 혼합물을 지닌 조성물 또는 제형의 혼합 또는 가공으로 인해 달라진 양을 포함한다. 용어 "약"은 언급된 참조 값과 유사한 값의 범위를 추가로 의미할 수 있다. 특정 구체예에서, 용어 "약"은 언급된 참조 값의 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 퍼센트 또는 그 미만 이내의 값의 범위를 의미한다.

한 양태에서, 압축된 골 조성물은 결합제 또는 화학적 가교제를 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, 결합제 및/또는 화학적 가교제는 압축된 골 조성물에 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 그러한 결합제는 비제한적으로 글리세롤/Preservon®, 산성 용액 (예컨대, 락트산 및 트리플루오로아시트산), 완충 용액 (예컨대, 포스페이트), 및 점착성 결합제 (예컨대, 피브린 글루, 골 시멘트, 또는 액화된 골)를 포함한다. 또 다른 양태에서, 가교는 임의의 통상적인 화학적 가교 방법 (예컨대, 화학적 시약-촉진, 화학적으로 반응성인 링커-촉진 및/또는 효소-척진) 및/또는 탈수열(dehydrothermal) 가교 방법 (예컨대, 열-촉진 응축)에 의해 압력을 가하기 전 또는 후에 골 입자 및/또는 섬유에 대해 수행되어, 공유적으로 가교된 골 기질을 형성할 수 있다. 추가적인 구체예에서, 가교는 가교제를 골 기질 용액에 적용시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 가교제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC), EDC/히알루론산, 게니핀(genipin), 및 글루타르알데하이드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

골 입자 및/또는 섬유가 유래되는 골은 비제한적으로 자가이식 골, 동종이식 골, 및 이종이식 골을 포함한다. 그러한 골은, 비제한적으로, 살아있는 인간 공여체로부터의 골, 인간 사체 공여체로부터의 골, 및 살아있거나 살아있지 않은 동물로부터의 골을 포함하는 임의의 소스로부터의 어떤 골을 포함한다. 섬유가 유래되는 골은 피질 골 및/또는 해면 골 및/또는 피질-해면 골을 포함할 수 있다. 섬유가 유래되는 골은 비제한적으로 인간, 소, 돼지, 개, 고양이, 비-인간 영장류, 설치류, 예컨대 래트 또는 마우스, 말, 염소, 양, 또는 사슴을 포함하는 임의의 포유동물로부터 수득될 수 있다.

골 입자 및/또는 섬유가 유래되는 골은 광물제거 골, 부분적 광물제거 골 또는 비-광물제거 골일 수 있다. 한 양태에서, 골 입자 및/또는 섬유는 본 발명의 방법에 따라 압력을 가하기 전에 광물제거될 수 있다. 본원에서 사용되는 "광물제거 골"은 약 8 wt% 미만의 잔류 칼슘을 갖는 골을 의미한다. 일부 구체예에서, 광물제거 골은 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 wt% 미만의 평균 잔류 칼슘 함량을 갖는다. 일부 구체예에서, 광물제거 골은 0 내지 4, 0.5 내지 4, 1 내지 4, 2 내지 4, 3 내지 4, 0 내지 3, 0.5 내지 3, 1 내지 3, 2 내지 3, 0 내지 2, 1 내지 2, 또는 0 내지 1 wt%의 평균 잔류 칼슘 함량을 갖는다. 광물제거는 골 조직을 처리하여 이의 무기 광물 하이드록시아파타이트 물질을 제거하는 것을 포함한다. 골 조직의 광물제거의 수준은 광물제거 골에서 발견되는 잔류 칼슘의 양 (wt%)에 의해 정의된다. 일부 구체예에서, 광물제거 골은 광물제거 처리 후에도 초기 골로부터 남은 생리적 활성 수준의 성장 및 분화 인자 (예컨대, 골형성 성장 인자, 예컨대 골 형태형성 단백질 (BMP) 및 인슐린 유사 성장 인자 (IGF))를 여전히 함유할 수 있다. 추가의 구체예에서, 광물제거 골은 콜라겐, 오스테오칼신, 오스테오넥틴, 골 시알로 단백질, 오스테오폰틴, 및 이의 혼합물을 함유할 수 있다. 한 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유는 광물제거 골로부터 제조된다. 다른 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유는 비-광물제거 골 조직으로부터 제조되고 섬유는 골 섬유 형성 후에 광물제거된다. 본 출원에서 사용되는 "비-광물제거 골"은 예를 들어, 하이드록시아파타이트와 같은 존재하는 광물을 제거하도록 처리되지 않은 골을 의미한다.

본 발명의 골 입자 및/또는 섬유는 광물제거되거나 광물제거되지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유는 광물제거되거나 광물제거되지 않거나 합성일 수 있는 다른 골 재료, 예컨대 골 분말 및/또는 골 미립자와 조합될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 골 조성물 및/또는 골 임플란트는 광물제거되거나 광물제거되지 않거나 합성일 수 있는 골 입자 및/또는 섬유 및/또는 다른 골 재료, 예컨대 골 분말 및 골 미립자를 포함할 수 있다. 추가적인 구체예에서, 골 임플란트는 접착으로 또는 접착 없이 보철물과 결합할 수 있다.

일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유, 골 조성물, 및/또는 골 임플란트는 압력을 가한 후 또는 전에 세정될 수 있다. 일부 구체예에서, 세정은 골 입자 및/또는 섬유를 항생제, 세척제, 알콜, 및/또는 H₂O₂와 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 세정은 ALLOWASH® 공정을 포함한다. 일부 구체예에서, 세정은 각각이 본원에 참조로서 포함되는 미국특허 5,556,379호, 5,797,871호, 5,820,581호, 5,977,034호, 및 5,977,432호에 기재된 방법을 포함한다. 추가적인 구체예에서, 세정은 알콜의 사용을 배제한다.

한 양태에서, 골 입자 및/또는 섬유, 골 조성물, 및/또는 골 임플란트는 압력을 가한 후 또는 전에 멸균될 수 있다. 일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유, 압축된 골 조성물, 및/또는 골 임플란트는 감마 또는 e-빔 조사, 에틸렌 옥사이드, 또는 임계 CO₂에 의해 멸균될 수 있다.

한 양태에서, 골 입자 및/또는 섬유, 골 조성물, 및/또는 골 임플란트는 가소제 조성물로 처리될 수 있다. 일부 구체예에서, 가소제 조성물은 글리세롤, 아도니톨, 소르비톨, 리비톨, 갈락티톨, D-갈락토스, 1,3-디하이드록시프로판올, 에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 자일리톨, 메소-에리트리톨, 아디프산, 프롤린, 하이드록시프롤린, 폴리올, 및 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 가소제를 포함한다. 예를 들어, 가소제 조성물은 각각이 본원에 참조로서 포함되는 미국특허 6,293,970호 및 7,063,726호, 및 미국특허공개 2010/0030340호 및 2010/0185284호에 기재된 것들을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유, 골 조성물, 및/또는 골 임플란트는 멸균되기 전 또는 후, 압력을 가하기 전 또는 후, 및 가소제 조성물로 처리되기 전 또는 후에 세정될 수 있다. 일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유, 골 조성물, 및/또는 골 임플란트는 세정되기 전 또는 후, 압력을 가하기 전 또는 후, 및 가소제 조성물로 처리되기 전 또는 후에 멸균될 수 있다. 일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유, 골 조성물, 및/또는 골 임플란트는 세정되기 전 또는 후, 멸균되기 전 또는 후, 및 가소제 조성물로 처리되기 전 또는 후에 가압될 수 있다. 일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유, 골 조성물, 및/또는 골 임플란트는 세정되기 전 또는 후, 멸균되기 전 또는 후, 및 압력을 가하기 전 또는 후에 가소제 조성물로 처리될 수 있다.

본 발명은 골 입자 및/또는 섬유를 소정의 형상을 지닌 몰드에 부하시키고, 골 입자 및/또는 섬유에 압력을 가하고, 압축된 골 입자 및/또는 섬유를 동결 건조시키는 것을 포함하는 압축된 골 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유에 가해진 압력은 약 1 Pa 내지 약 300 MPa의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유에 가해진 압력은 약 100 Pa 내지 약 100 MPa, 약 1 KPa 내지 약 100 MPa, 약 10 KPa 내지 약 100 MPa, 약 100 KPa 내지 약 100 MPa, 약 1 MPa 내지 약 100 MPa, 약 100 KPa 내지 약 1 MPa, 약 100 KPa 내지 약 2 MPa, 약 100 KPa 내지 약 3 MPa, 100 KPa 내지 약 4 MPa, 100 KPa 내지 약 5 MPa, 100 KPa 내지 약 6 MPa, 약 1 MPa 내지 약 2 MPa, 약 1 MPa 내지 약 3 MPa, 약 1 MPa 내지 약 4 MPa, 약 1 MPa 내지 약 5 MPa, 약 1 MPa 내지 약 6 MPa, 약 1 MPa 내지 약 7 MPa, 약 2 MPa 내지 약 3 MPa, 또는 약 2 MPa 내지 약 6 MPa의 범위일 수 있고; 일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유에 가해진 압력은 100 psi 내지 5000 psi, 100 psi 내지 4000 psi, 100 psi 내지 3000 psi, 100 psi 내지 2000 psi, 100 psi 내지 1000 psi, 100 psi 내지 990 psi, 100 psi 내지 950 psi, 100 psi 내지 905 psi, 200 psi 내지 5000 psi, 200 psi 내지 4000 psi, 200 psi 내지 3000 psi, 200 psi 내지 2000 psi, 200 psi 내지 1000 psi, 200 psi 내지 990 psi, 200 psi 내지 950 psi, 또는 200 psi 내지 905 psi (말단 값을 포함하지 않음)의 범위일 수 있다.

일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유에 가해진 압력은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 40 MPa 또는 그 미만일 수 있다. 다른 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유에 가해진 압력은 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 35 MPa 또는 그 초과일 수 있다. 일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유에 가해진 압력은 약 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 또는 200 psi 또는 그 미만일 수 있다. 다른 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유에 가해진 압력은 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 900 psi 또는 그 초과일 수 있다. 한 양태에서, 상기 압력은 필요한 압력을 생성하는 스크류 타입 프레스 또는 공기 프레스를 이용하여 가해질 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 압력은 일정한 압력 또는 가변 압력 장치로서, 유압 프레스, 무거운 중량의 적용, 또는 스프링 로드 장치, 분말-작동, 클램핑되거나 전기 모터-기반의 가압을 이용하여 가해질 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 압력은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 120, 180, 240, 300, 또는 360분 동안 가해질 수 있다.

압력은 임의의 종류의 기계적 힘을 이용하고 어떤 장치를 이용하거나 이용하지 않고 적용될 수 있다. 일부 구체예에서, 압력은 인간에 의해, 예컨대 손 및/또는 손가락으로 눌러서 적용될 수 있다. 일부 구체예에서, 압력은 압축된 골 조성물을 생성하도록 맞춤화된 장치에 의해 적용될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명은 또한 임플란트 또는 보철물을 위해 개인의 골 구조로부터 취해진 3차원 (3D) 의료 영상 측정에 기반한 몰드에 골 조성물을 부하시키고 (이 때 골 조성물은 약 2 초과의 평균 길이 (L) : 평균 폭 (W) 비를 갖는 마이크로화이버를 포함한다); 골 조성물에 0.1 내지 30 MPa의 압력을 가하여 몰드에 맞추고; 압축된 골 조성물을 동결 건조시켜 골 임플란트를 제조하는 것을 포함하는, 개별화 골 임플란트를 제조하는 방법에 관한 것이다. 추가적인 구체예에서, 상기 방법은 접착을 이용하거나 이용하지 않고 보철물을 골 임플란트에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 보철물은 자연적으로 골에서 발생하지 않는 물질(들)을 포함하는 합성 임플란트이다. 보철물은, 예를 들어, 금속(들) 및 중합체(들), 예컨대 티타늄, 금, 백금 및 테플론이 있거나 없는 강철을 포함할 수 있다.

몰드 및 생성된 압축된 골 조성물의 소정의 형상은 피검체의 골 구조의 3D 측정에 의해 반영될 수 있는 다양한 크기 및 구조를 포함한다. 3D 측정은 골 구조의 크기 및 형상 및 골 구조의 다양한 구성요소의, 또는 환자 골 구조 및 맞춤 캐스트 섬유가 맞추어져 통합되도록 또한 설계된 임의의 동시에 이식된 보철 장치 사이의 아마도 상대적인 위치지정 및 상호작용을 나타내는 치수 및 값의 세트이다. 소정의 형상의 몰드는 3D 의료 영상 측정에 기반한 몰드의 3D 프린팅에 의해 구성될 수 있다. 맞춤 형상화된 몰드는 또한 CNC 및 절삭 가공에 의한 다른 일반적인 방식의 기계가공에 의해 구성될 수 있다. 임의의 적합한 3D 프린팅 기법 및 장치 또는 임의의 추가적인 제작 기법 및 장치가 현행 방법에 이용될 수 있다.

본원에 기재된 골 구조는 인간 또는 동물의 골격의 임의의 부분으로부터, 하나 이상의 구소요소를 포함하는 임의의 골 구조일 수 있다. 예를 들어, 골 구조는 부하 지지(load bearing) 없는 임의의 분절 결함일 수 있다. 일부 구체예에서, 골 구조는 척추동물 또는 이의 일부, 넙다리뼈 머리 또는 넙다리 큰돌기, 위팔뼈로부터의 위팔뼈 머리, 또는 비골, 위팔뼈 몸통, 넙다리 몸통, 골반, 머리뼈, 얼굴뼈, 고관절, 두개골 피판, 아래턱뼈 또는 정강뼈의 분절 또는 일부일 수 있다.

"임플란트"는 예컨대 조직 증대, 윤곽형성, 생리적 기능 복구, 질병 또는 외상에 의해 손상된 조직의 복원 또는 복구, 및/또는 정상, 손상되거나 병든 기관 및 조직에 치료제를 전달하는 하나 이상의 치료적 또는 예방적 목적으로 피검체의 체내에 부분적으로 또는 전체적으로 배치되도록 설계된 임의의 대상체를 의미한다. 한 양태에서, 골 임플란트는 본원에 기재된 대로 홈을 포함한다. 피검체는 골 임플란트를 필요로 하는 임의의 인간 또는 개, 말, 또는 영장류와 같은 비-인간 포유동물일 수 있다. "개별화 임플란트"는 개개 피검체의 3D 측정 또는 다수의 개개 피검체의 평균에 기반하여 특수하게 설계되고 생성된 임플란트를 의미한다. 개별화 임플란트는 복구 또는 복원되어야 하는 피검체의 골에 대해 더 나은 구조적 맞춤(fit)을 제공할 수 있다.

한 양태에서, 소정의 형상의 몰드 및 생성된 압축된 골 조성물은 홈 및/또는 파동(undulation)을 포함하며, 조성물 또는 임플란트는 각각 조성물 또는 임플란트의 다른 부분보다 몇몇 부분에서 더 얇다. "홈"은 주위 영역의 두께보다 얇은 두께를 갖도록 설계되어 굽힘, 회전, 및/또는 형상화의 지점, 라인, 또는 영역을 허용하는 영역이다. 한 구체예에서, 조성물 및 임플란트의 두께에서의 이러한 변동은 조성물 및 임플란트가 균일한 두께의 조성물 및 임플란트보다 더욱 가요성이 되게 하여, 조성물 및 임플란트가 굴곡, 회전, 형상화 또는 휘어질 수 있게 한다. 선택된 구체예에서, 압축된 골 조성물 및/또는 골 임플란트의 홈 또는 파동은 적어도 0.5, 2, 5 또는 10 홈/cm²의 주기성을 가질 수 있다. 추가적인 구체예에서, 압축된 골 조성물 및/또는 골 임플란트의 홈(들)은 최대 2, 5, 10 또는 15 홈/cm²의 주기성을 갖는다. 추가적인 구체예에서, 소정의 형상의 압축된 골 조성물은 스크류, 봉합, 또는 다른 유형의 견인에 의한 고정을 허용하는 기존의 구멍을 포함할 수 있다. 그러한 구멍은 몰드 및/또는 섬유 제품 설계의 일부로서 형성될 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 조성물 및 임플란트는 적어도 약 5, 15, 30, 100, 또는 200분 동안 액체에서 그 완전성을 유지한다. 따라서, 본원에 기재된 압축된 골 조성물은 재수화 후 외과적 이식 전 그리고 외과적 이식 동안 구조적 완전성을 보유할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 임플란트와 함께 사용될 때 본원에서 사용되는 구 "완전성을 유지하다"는 조성물 및 임플란트의 섬유의 전부 또는 일부가 서로에게서 분리되지 않고, 조성물 및 임플란트가 완충제 및 체액과 같은 액체의 존재하에 그 전반적인 형상을 유지하는 것을 나타내기 위해 이용된다. 예를 들어, 조성물의 원래 섬유의 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 또는 98 wt%는 0.1, 1, 10, 100, 150, 200, 또는 300 시간 후에 임플란트에 남아있다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 골 입자 및/또는 섬유 및 생성된 압축된 골 섬유 스트립의 습윤성을 변경시키기 위해 다양한 방법이 이용될 수 있다. 일부 예는 표면 화학 변형 (예컨대 플라스마 또는 정전하를 변화시킴에 의해, 또는 진입하는 물에 대한 큰 통로 또는 채널을 제조함에 의해), 화학 에칭 (예컨대 산 에칭), 및 친수성 분자의 첨가 (예컨대 Preservon)를 포함하는, 물리적 및 화학적 수단 둘 모두를 포함한다.

일부 구체예에서, 소정의 형상의 몰드 또는 생성된 압축된 골 조성물의 홈(들)에서의 평균 두께는 전체 소정의 형상 또는 압축된 골 조성물의 평균 두께에 비해, 예를 들어, 약 1%, 2%, 3%, 5 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 만큼 얇을 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 압축된 골 조성물은 구조물의 나머지에 비해, 예를 들어, 약 1%, 2%, 3%, 5 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 만큼 더 높은 밀도를 홈 영역(들)에 지닌다.

또 다른 양태에서, 소정의 형상의 몰드 및 생성된 압축된 골 조성물은 스트립, 디스크, 오목면, 볼록면, 평면 피처, 계단, 또는 비제한적으로 웨이브를 포함하는 곡선, 버블, 또는 버블-랩 패턴을 포함하는 형상을 갖는다. 일부 구체예에서, 비제한적으로, 실린더, 튜브 (예컨대 BMA, 자가이식, PRP, 및 다른 생물활성제로 충전하기 위한), 자가이식에서 롤링을 위한 얇은 시트 또는 결함 주위의 랩핑, 합성 임플란트와 메이팅 (예컨대 추간 융합 장치 공동, 스크류 또는 다른 장치, 예컨대 가시 돌기 융합 플레이트에 맞추기 위한 중공 부분을 위한 플러그 등), 고리형 설계 (예컨대 분절 결함을 위한), 비구 컵, 공 또는 구 형상 (예컨대 공 및 소켓 교정본 및 재포장(resurfacing), 및 등뼈 및 다른 부위의 공 형상의 임플란트), 경구/두개골/위턱얼굴 적용, 예컨대 스트립 또는 치조 능선 재건, 및 쐐기 (예컨대 Evans, Cotton, 고위경골 전골술을 위한), 및 잠재적으로 컴퓨터 단층촬영 (CT) 또는 X-선 스캔에 기반한, 환자 결함 특이적인 불규칙한 형상 및 맞춤 형상을 포함하는 다른 형상이 이용될 수 있다. 압축된 골 입자 및/또는 섬유는 비-유도성 이식에서 골유도성 및/또는 골전도성 섬유의 소스를 공급하기 위해 부하 지지 물질 (예컨대 광물질화 피질 또는 피질(conrico)해면 골, 금속, PEEK, 합성 중합체, 및 케이지)을 채우는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 형상은 수술용 스크류 구멍과 같은 구멍을 채우기 위해 원뿔 또는 절두체 모양의 다월(dowel)을 포함할 수 있다. 압축된 골 입자 및/또는 섬유는 또한 비-부하 지지성일 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 압축된 골 조성물을 이용하여 합성 또는 금속 구조물과의 조합 생성물, 예컨대 프레임워크를 제조할 수 있고, 압축된 골 조성물 및 합성 또는 금속 구조는 함께 테더링되거나 결합된다. 일부 구체예에서, 합성 또는 금속 구조는 결함 부위에 조합 생성물의 수술적 고정 또는 안정화를 촉진시킬 수 있는 반면, 새로운 조직이 압축된 골 조성물 상에 및 내에 형성되어, 조성물을 부분적으로 또는 완전히 리모델링할 수 있다. 외과의는 그 후 합성 또는 금속 구조는 제거할 수 있다. 전통적인 조성물은 이러한 접근법에 이용될 수 없는데, 그 이유는 이것이 치유 및 조직 형성 과정 동안 숨을(dissemble) 수 있기 때문이다.

또 다른 양태에서, 소정의 형상의 몰드 및 생성된 압축된 골 조성물은 약 0.5 mm, 1 mm, 5 mm, 10 mm, 20 mm, 30 mm, 40 mm, 50 mm, 60 mm, 70 mm, 80 mm, 90 mm, 100 mm, 200 mm, 300 mm의 적어도 한 치수를 지닌다. 또 다른 양태에서, 소정의 형상의 몰드 및 생성된 압축된 골 조성물은 약 1 × 1 × 1 mm 내지 약 100 × 100 × 10 mm, 또는 1 내지 8 mm 두께로 약 100 mm × 25 mm의 가변적인 크기를 지닌다.

한 양태에서, 골 입자 및/또는 섬유는 추가적인 몰드를 이용하거나 이용하지 않고, 부하 지지 물질 (예컨대 광물질화 피질 골, 비제한적으로 중공 디스크로 구분된 넙다리뼈 포함) 또는 다른 경질 재료 (예컨대 세라믹, 금속)로 또는 그 위에 직접 압축될 수 있다.

골 입자 및/또는 섬유는 동결-건조되어 압축된 골 조성물을 생성할 수 있다. 추가적인 구체예에서, 압축된 골 입자 및/또는 섬유는 진공 건조, 가열 (예컨대 37 내지 41℃의 온도에서), 및/또는 탈수열 처리될 수 있다. 일부 구체예에서, 골 입자 및/또는 섬유, 골 조성물, 및/또는 골 임플란트는 압력을 가하기 전 또는 후에 동결-건조될 수 있다.

한 양태에서, 압력은 약 25℃로 정의된 실온에서 골 입자 및/또는 섬유에 가해진다. 또 다른 양태에서, 압력은, 비제한적으로, 적어도 약 100℃, 90℃, 80℃, 70℃, 60℃, 50℃, 45℃, 40℃, 35℃, 34℃, 33℃, 32℃, 31℃, 30℃, 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 19℃, 18℃, 17℃, 16℃, 15℃, 14℃, 13℃, 12℃, 11℃, 10℃, 5℃ 또는 그 초과를 포함하는 다른 온도에서 골 입자 및/또는 섬유에 가해진다. 또 다른 양태에서, 압력은, 비제한적으로, 약 100℃, 90℃, 80℃, 70℃, 60℃, 50℃, 45℃, 40℃, 35℃, 34℃, 33℃, 32℃, 31℃, 30℃, 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 19℃, 18℃, 17℃, 16℃, 15℃, 14℃, 13℃, 12℃, 11℃, 10℃, 또는 5℃ 미만을 포함하는 다른 온도에서 골 입자 및/또는 섬유에 가해진다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 골 임플란트에 관한 것이다. 한 양태에서, 골 임플란트는 부하 지지 임플란트가 아닐 수 있다. 본원에 기재된 골 임플란트는 3 MPa, 2 MPa, 1 MPa, 0.5 MPa, 또는 0.1 MPa 미만의 습윤 압축 강도를 지닐 수 있다.

한 양태에서, 골 임플란트를 포함하는 골 조성물 및/또는 골 임플란트는 적어도 하나의 세포 및/또는 적어도 하나의 생물활성 인자를 추가로 포함한다. 용어 "생물활성 인자"는 단백질, 탄수화물, 또는 세포 활성에 어떤 효과를 갖는 광물을 의미한다. 생물활성 인자의 예는 비제한적으로 특히 골형성 성장 인자, 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 오스테오넥틴, 골 시알로 단백질, 골유도성 인자, 연골발생 인자, 사이토카인, 분열촉진 인자, 화학주성 인자, 형질전환 성장 인자(TGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 혈관형성 인자, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 신경 성장 인자 (NGF), 뉴로트로핀, 골 형태형성 단백질 (BMP), 오스테오게닌, 오스테오폰틴, 오스테오칼신, 시멘트질 부착 단백질, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론, 집락 자극 인자 (CSF), 또는 인터루킨을 포함한다. 생물활성 인자는 특히 BMP, PDGF, FGF, VEGF, TGF, 인슐린일 수 있다. BMP의 예는 비제한적으로 BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, 또는 BMP-15의 임의의 트렁케이션되거나 변형된 형태, 및 이의 혼합물을 포함한다.

일부 구체예에서, 생물활성 인자는 케모카인을 포함할 수 있다. 케모카인은 주변 세포의 이동 또는 주화성을 촉진하는 세포로부터 분비된 소 단백질의 패밀리를 의미한다. 몇몇 케모카인은 전-염증성인 것으로 고려되고 면역 반응 동안 유도될 수 있는 반면 다른 것들은 항상성으로 고려된다. 전형적으로, 케모카인은 하나 이상의 케모카인 수용체에 결합함에 의해 이들의 화학주성 기능 및 다른 기능을 발휘한다. 케모카인은 천연 소스로부터 분리된 단백질 뿐만 아니라, 합성에 의해, 재조합 수단에 의해 또는 화학적 합성에 의해 제조된 것들을 포함한다. 예시적인 케모카인은 비제한적으로 MCP-1, 에오탁신, SDF-1β, GRO-α, MIP-1β, IL-8, IP-10, MCP-3, MIP-3α, MDC, MIP-1α, BCA-1, GCP-2, ENA-78, PBP, MIG, PF-4, PF-4-var1, SDF-2, MCP-2, MCP-4, MIP-4, MIP-3β, MIP-2α, MIP-2β, MIP-5, HCC-1, RANTES, 에오탁신-2, TARC, I-309, 림포탁틴, 렁카인(Lungkine), C10, MIP-1γ, MCP-5, LEC, 엑소두스(Exodus)-2, MIP-3, TECK, 에오탁신-3, CTACK, MEC, SCM-1β, I-TAC, BRAK, SR-PSOX, 프렉탈카인(Fractalkine), LD78-β, MIP-1b2, 및 당업자에게 공지된 다른 것들을 포함한다. 케모카인에 대한 언급은 전형적으로 그러한 케모카인의 단량체 형태를 포함한다. 케모카인은 또한 이합체 또는 다합체 형태를 포함한다.

추가적인 구체예에서, 생물활성 인자는 또한 소 분자를 포함할 수 있다. 소 분자는 천연-발생 또는 인공적으로 생성되든지 간에 (예컨대, 화학적 합성을 통해) 비교적 낮은 분자량을 갖고, 단백질, 핵산, 또는 탄수화물이 아닌 분자를 포함한다. 한 양태에서, 소 분자는 해당 정부 기관 또는 부처에 의해 이미 사용하기에 안전하고 효과적인 것으로 간주된 것이다. 예를 들어, 본원에 참조로서 포함된 21 C.F.R. §§ 330.5, 331 내지 361 및 440 내지 460 하에 FDA에 의해 열거된 인간용 약물; 21 C.F.R. §§ 500 내지 589 하에 FDA에 의해 열거된 수의용 약물은 모두 본 발명의 소 분자로서의 사용에 허용가능한 것으로 간주된다. 또 다른 양태에서, 소 분자는 스핑고신-1-포스페이트 (SlP) 효능제, 예컨대 FTY720P로 포스포릴화될 때 SlPl, S1P3, S1P4, 및 S1P5 수용체의 효능제로서 작용하는 합성 화합물인 핑골리모드(fingolimod) (FTY720)의 효능제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 소 분자 약물은 하기 분자를 포함할 수 있다:

FTY720 (핑골리모드)

2-아미노-2-(4-옥틸페네틸)프로판-l,3-디올,

(5')-2-아미노-2-메틸-4-(4-옥틸페닐)부탄-1-올,

(1-아미노-3-(4-옥틸페닐)사이클로부틸)메탄올,

(1-아미노-3-(4-옥틸페닐)사이클로펜틸)메탄올,

(1-아미노-2-(4-옥틸벤질)사이클로펜틸)메탄올,

2-아미노-2-(6-옥틸-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-2-일)프로판-1,3-디올,

2-아미노-2-메틸-3-(5-옥틸-2,3-디하이드로-을리/-인덴-1-일)프로판-1-올, 및

2-아미노-2-(4-(4-옥틸페닐)-lH-이미다졸-2-일)프로판-l-올.

한 양태에서, 골 조성물 및/또는 골 임플란트는 부속 중합체를 추가로 포함한다. "부속 중합체"는 본원에 기재된 압축된 골 조성물 및/또는 골 임플란트에 첨가되어 이의 물리적, 화학적, 및/또는 생물학적 특성 (예컨대 인장 강도, 친수성, 생체적합성)에 임의의 효과를 가질 수 있는 중합체를 의미한다. 예를 들어, 부속 중합체는 폴리카프로락톤, 폴리(글리콜산), 폴리(락트산), 폴리디옥산, 폴리(락티드-코-글리콜리드) 공중합체, 폴리에스테르 다당류, 폴리하이드록시알카노에이트, 전분, 폴리락트산, 셀룰로스, 단백질, 아가, 실크, 알기네이트, 콜라겐/젤라틴, 카라기난, 엘라스틴, 펙틴, 레실린(resilin), 곤약, 접착제, 검, 폴리아미노산, 다당류, 소이(soy), 제인(zein), 밀 글루텐, 카세인, 키틴/키토산, 혈청 알부민, 히알루론산, 지질/계면활성제, 크산탄, 아세토글리세라이드, 왁스, 게면활성제, 덱스트란, 에멀산, 겔리안(gelian), 폴리페놀, 레반(levan), 리그닌(lignin), 커드(curd), 이안(ian), 탄닌(tannin), 폴리갈락토사민, 휴민산(humic acid), 셸락(shellac), 풀루란(pullulan), 폴리-감마-글루탐산, 엘시난(elsinan), 천연 고무, 효모 글루칸, 및 천연 지방 및 오일로부터의 합성 중합체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 양태에서, 골 조성물 및/또는 골 임플란트는 하나 이상의 생체적합성 충전제를 추가로 포함한다. 생체적합성 충전제는 비제한적으로 트리칼슘 포스페이트, 하이드록실 아파타이트, 및 다른 생체세라믹, 및 형상화 DBM 섬유로 혼합된 다양한 크기의 골 조각 (예컨대 미립자 또는 다른 크기조정된 섬유 또는 다른 기하학, 및 피질 및/또는 해면으로서)을 포함할 수 있다. 생체적합성 충전제는 골유도성 또는 골전도성 기질로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 충전제는 가압 동안 CNC 섬유에 첨가되어 혼합된 물질을 지닌 스트립 (또는 다른 모양)을 발생시킬 수 있다.

또 다른 양태에서, 골 조성물 및/또는 골 임플란트는 하나 이상의 생분해성, 생체적합성 중합체를 추가로 포함한다. 생분해성, 생체적합성 중합체는 비제한적으로 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리클(polyanhydricles), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산을 포함할 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체는 지속적인 방출 특성을 갖는 골전도성 또는 연골유도성 생체적합성 기질로서 작용할 수 있는 다수의 합성 생분해성 중합체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 중합체의 설명은 전문이 본원에서 참조로서 포함되는 문헌[Behravesh (1999) Clinical Orthopaedics 367, S118 and Lu (2000) Polymeric Delivery Vehicles for Bone Growth Factors in Controlled Drug Delivery: Designing Technologies for the Future, Park and Mrsny eds., American Chemical Society]에서 찾아볼 수 있다. 이러한 중합체의 예는 폴리α-하이드록시 에스테르, 예컨대 폴리락트산/폴리글리콜산 동종중합체 및 공중합체, 폴리포스파젠 (PPHOS), 폴리안하이드라이드 및 폴리(프로필렌 푸마레이트)를 포함한다.

폴리락트산/폴리글리콜산 (PLGA) 동종 및 공중합체는 지속적인 방출 비히클로 당업게에 널리 알려져 있다. 본원에 기재된 생물활성 인자의 방출 속도는 폴리락트산 대 폴리글리콜산 비 및 중합체의 분자량의 변동에 의해 당업자에 의해 조정될 수 있다 (문헌[Anderson (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 28:5]을 참조하라). 미세입자 기질을 형성하기 위한 블렌드로서 중합체에 PEG의 혼입은 활성 성분의 방출 프로파일의 추가 변동을 허용한다 (문헌[Cleek (1997) J. Control Release 48, 259]을 참조하라). 칼슘 포스페이트 및 하이드록시아파타이트와 같은 세라믹이 또한 지속적인 방출 비히클에 혼입되어 기계적 품질을 개선시킬 수 있다.

또 다른 양태에서, 골 조성물 및/또는 골 임플란트는 세포외 기질 구성요소를 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포외 기질 구성요소는 비제한적으로 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 오스테오칼신, 오스테오넥틴, 골 시알로 단백질, 오스테오폰틴, 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.

한 양태에서, 골 임플란트 및/또는 골 조성물의 밀도는 약 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.28, 0.30, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.40, 0.50, 0.60 또는 0.70 g/cm³ 또는 그보다 작다. 또 다른 양태에서, 골 임플란트 및/또는 골 조성물의 밀도는 약 0.22, 0.23, 0.24, 0.26, 0.28, 0.30, 0.32, 0.33, 0.34, 또는 0.35 g/cm³ 또는 그 초과이다. 또 다른 양태에서, 골 임플란트 및/또는 골 조성물의 밀도는 약 0.1 내지 약 0.7, 약 0.1 내지 약 0.6, 약 0.2 내지 약 0.7, 약 0.2 내지 약 0.6, 약 0.2 내지 약 0.5, 약 0.2 내지 약 0.4, 약 0.2 내지 약 0.3 g/cm³이다.

본 발명은 또한 골유도성을 촉진시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 골 조성물 상에서 세포를 배양시키는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로 골전도성을 촉진시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 골 조성물 상에서 세포를 배양시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 "골유도성"은 세포가 더 많은 골모세포-유사한 (예컨대 표현형에 있어서 또는 유전자 및 단백질 발현에 있어서) 세포로 분화하도록 하는 것을 의미할 수 있거나, 상기 용어는 골모세포의 증식을 증가시키는 것을 의미할 수 있거나, 둘 모두일 수 있다. "골전도성"은 새로운 골의 침착 또는 골 성장 속도를 가속시키는 것을 의미할 수 있다. 세포는, 본 발명의 골 조성물 및/또는 골 임플란트 상에서의 배양 이전에, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양액 또는 조직, 기관 또는 이의 일부 또는 유기체에 존재할 수 있다. 본원에 기재된 마이크로화이버의 치수 및 L:W 비와 같은 특성이 없는 다른 조성물에 비해, 향상된 활성을 비제한적으로 포함하는 골 조성물의 골유도 활성 및/또는 골전도 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있다.

본 발명은 또한 연골유도성을 촉진시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 골 조성물 상에서 세포를 배양시키는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로 연골전도성을 촉진시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 골 조성물 상에서 세포를 배양시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 "연골유도성"은 세포가 더 많은 연골세포-유사한 (예컨대 표현형에 있어서 또는 유전자 및 단백질 발현에 있어서) 세포로 분화하도록 하는 것을 의미할 수 있거나, 상기 용어는 연골세포의 증식을 증가시키는 것을 의미할 수 있거나, 둘 모두일 수 있다. "연골전도성"은 새로운 연골의 침착 또는 연골 성장 속도를 가속시키는 것을 의미할 수 있다. 세포는, 본 발명의 골 조성물 상에서의 배양 이전에, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양액 또는 조직, 기관 또는 이의 일부 또는 유기체에 존재할 수 있다. 본원에 기재된 마이크로화이버의 치수 및 L:W 비와 같은 특성이 없는 다른 조성물에 비해, 향상된 활성을 비제한적으로 포함하는 골 조성물의 연골유도 활성 및/또는 연골전도 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있다.

따라서, 본 발명의 골 조성물의 골전도 또는 연골전도 활성은 다른 골 조성물에 비해 향상될 수 있다. 물론, 골 조성물은 생체적합성 기질 내의 세포가 각각 더욱 골모세포-유사성 또는 연골세포-유사성을 나타내거나 그러한 기능성 세포로 분화하기 시작할 때 골전도 또는 연골전도성으로 간주된다.

본 발명은 또한 인대/힘줄 분화 및/또는 성장을 촉진시키는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 기재된 골 조성물 상에서 세포를 배양시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 "인대/힘줄 분화"는 세포가 더 많은 인대 및/또는 힘줄-유사한 (예컨대 표현형에 있어서 또는 유전자 및 단백질 발현에 있어서) 세포로 분화하도록 하는 것을 의미할 수 있거나, 상기 용어는 인대 및/또는 힘줄의 증식을 증가시키는 것을 의미할 수 있거나, 둘 모두일 수 있다. "인대/힘줄 분화 성장"은 새로운 인대/힘줄의 침착 또는 인대/힘줄 성장 속도를 가속시키는 것을 의미할 수 있다. 세포는, 본 발명의 골 조성물 상에서의 배양 이전에, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양액 또는 조직, 기관 또는 이의 일부 또는 유기체에 존재할 수 있다. 본원에 기재된 마이크로화이버의 치수 및 L:W 비와 같은 특성이 없는 다른 조성물에 비해, 향상된 활성을 비제한적으로 포함하는 골 조성물의 인대/힘줄 분화 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있다.

골유도성, 연골유도성, 또는 인대/힘줄 분화를 각각 평가하기 위해 측정될 수 있는 다양한 골모세포, 연골세포, 인대/힘줄 분화 마커가 있다. 예를 들어, 세포는 골모세포 계통으로의 분화의 조기 단계 동안 알칼리 포스파타제를 발현시킨다. 따라서, 시험관내 알칼리 포스파타제 검정은 본원에 기재된 골 조성물 상에서 배양된 세포에서 골유도성을 평가하는데 이용될 수 있다. 달리 비-골 형성 세포, 예컨대 근모세포 (C₂C1₂ 세포)에서 알칼리 포스파타제 발현을 자극하거나 유도하는 본 발명의 골 조성물의 능력은 본 발명의 골 조성물이 골유도 활성을 지님을 나타낼 것이다. 이러한 검정에서, 본원에 기재된 특성이 없는 다른 골 조성물 상에서 배양된 세포는 비-골 형성 세포에 대한 기준선 알칼리 포스파타제 발현을 나타내는 음성 대조군으로서 이용된다. 음성 대조군에서 골모세포성 마커의 기준선은 0일 필요는 없으며, 이는 음성 대조군의 세포가 적어도 일부 수준의 표현형 마커(들)를 지닐 수 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 "골유도성" 골 조성물은 단순히 다른 조성물 상에서 성장한 대조군에 비해 실험 세포에서 골모세포성 마커의 증가를 야기시킬 것이다. 유사하게, 몇 개를 예로 들자면, 비제한적으로 타입 X 콜라겐, 타입 II 콜라겐, Sox 9, 아그레칸(Aggrecan). 마트릴린(Matrilin)-1 및 CEP-68을 포함하는 연골세포 마커는 연골유도 가능성을 평가하는데 이용될 수 있다. 더욱이, 비제한적으로 스클레락시스(scleraxis)를 포함하는 인대/힘줄 마커는 인대/힘줄 분화 가능성을 평가하는데 이용될 수 있다.

더욱이, 골유도성, 연골유도성, 및 인대/힘줄 분화는 일차 세포, 세포주, 또는 체외이식편과 같은 배양된 세포에서 분화하거나 골모세포 표현형, 연골세포 표현형, 인대/힘줄 세포 표현형을 유도하는 본 발명의 골 조성물의 능력을 조사함에 의해 조직 배양액에서 결정될 수 있다. 예를 들어, 세포는 알칼리 포스파타제 등과 같은 골모세포 및/또는 연골세포의 마커 특성의 증가된 생성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 골 조성물의 골유도, 연골유도, 인대/힘줄 분화 가능성은 대조 조성물 및/또는 임플란트 보다 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배를 초과하는 만큼 더 클 수 있다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 조성물 및/또는 임플란트 상에서 배양액의 골유도, 연골유도, 인대/힘줄 분화 가능성은 대조 조성물 및/또는 임플란트 보다 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 또는 심지어 1000배를 초과하는 만큼 더 클 수 있다.

근육과 같은 위치에서 본 발명의 골 조성물 및/또는 임플란트에 의해 유도되는 골, 연골, 인대 또는 힘줄 형성 가능성을 평가하기 위해, 골유도성, 연골유도성, 인대/힘줄 분화는 또한 적합한 동물 모델을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 설치류 넙다리 두갈래근으로의 근내 이식은 생물활성 인자의 골유도 활성을 평가하기 위한 모델로서 이용되어 왔다.

본 발명은 또한 세포 부착, 증식을 촉진하거나 분화된 상태를 유지하거나 골모세포, 연골세포, 인대 세포, 힘줄 세포 및/또는 본원에 기재된 임의의 세포 유형의 탈-분화를 억제하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 세포를 본원에 기재된 골 조성물 상에서 배양시키는 것을 포함한다. 본원에 기재된 마이크로화이버의 치수 및 L:W 비와 같은 특성이 없는 다른 조성물에 비해, 향상된 활성을 비제한적으로 포함하는 골 조성물의 증식 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있다.

미토겐성은 대사 활성을 측정하는 다양한 시험관내 검정, 예컨대 MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드] 검정, alamarBlue® 검정 등을 이용하여 본 발명의 골 조성물 및/또는 임플란트에 의해 유도된 세포 증식을 조사함에 의해 평가될 수 있다. alamarBlue® 검정은 세포 대사 활성을 측정하기 위해 비-세포독성 환원-산화 지표를 이용하며, 이는 상기 검정이 본원에 기재된 골 조성물 및/또는 임플란트의 미토겐 활성을 평가하기 위한 비파괴 검정이 되게 한다. 증식은 또한, PicoGreen™ DNA 검정, DNA 합성의 방사성 표지, 예컨대 [3H]티미딘 표지 또는 BrdU 혼입을 이용하는 것과 같은, DNA 정량을 측정함에 의해 평가될 수 있다. 증식은 또한 수동 세포 계수를 통해, 예컨대 트립판 블루 혈구계를 이용하여 평가될 수 있다.

본 발명은 또한 세포에서 골형성, 연골형성, 또는 인대/힘줄 형성을 증가 또는 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본원에 기재된 골 조성물 상에서 세포를 배양시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "골형성"은 새로운 골 재료의 침착 또는 새로운 골의 형성이며, 비제한적으로 막내(intramembranous) 골형성 및 연골내 골형성을 포함한다. 본원에서 사용되는 "연골형성"은 새로운 연골 재료의 침착 또는 새로운 연골의 형성이다. 본원에서 사용되는 "인대/힘줄 형성"은 새로운 인대 및/또는 힘줄 재료의 침착 또는 새로운 인대 및/또는 힘줄의 형성이다. 본원에 기재된 마이크로화이버의 치수 및 L:W 비와 같은 특성이 없는 다른 조성물에 비해, 향상된 활성을 비제한적으로 포함하는 골 조성물의 골형성, 연골발생, 인대, 또는 힘줄 유도 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있다. 세포는 골, 연골, 인대, 또는 힘줄 형성이 요망되는 임의의 조직, 예컨대 비제한적으로 골, 연골, 인대, 근육, 힘줄 등에서의 세포를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 (1) 본원에 기재된 골 조성물 상에서 배양된 세포 및/또는 (2) 본원에 기재된 골 임플란트를 조직 또는 기관 결함 부위 (예컨대 골 결함, 연골, 인대, 힘줄, 척추 디스크, 및 골로의 힘줄 삽입 부위에서의 결함)에 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 조직 또는 기관 결함 또는 손상, 예를 들어, 근골격, 치아 또는 연조직 결함 또는 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 본원에 기재된 골 조성물 및/또는 임플란트를 결함에 적용함에 의해, 동물에서 조직 또는 기관 결함 또는 손상, 예를 들어 근골격, 치아 또는 연조직 결함을 치료하는 방법에 관한 것이고, 결함으로의 적용은 골 조성물 및/또는 임플란트을 결함에 주입하거나, 조성물 및/또는 임플란트를 조직 또는 기관 사이에 삽입하거나, 골 조성물 및/또는 임플란트를 결함의 상부에 배치시킴에 의해 수행될 수 있다. 본 발명은 또한 골 조성물 및/또는 임플란트를 결함에 적용시킴에 의해 기관에서 결함 또는 손상을 치료하는 것에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 본원에 기재된 세포는 전구 세포 또는 성체 (또는 체(somatic)) 줄기 세포이다. 추가적인 구체예에서, 전구 세포 또는 성체 줄기 세포는 태반, 골수, 지방 조직, 혈관, 양수, 활액, 활막, 심낭막, 골막, 경막, 말초혈, 탯줄혈, 생리혈, 유치, 속질핵, 뇌, 피부, 모공, 창자움, 신경 조직, 또는 근육으로부터 유래되거나, 다능성 세포 유형 (배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포)으로부터 상기 언급된 소스로부터의 것들과 같은 체 줄기 세포 타입으로, 또는 교차분화되거나 직접 분화된 세포로부터 비롯된 세포에 의해, 예컨대 섬유모세포를 직접 중간엽 줄기 세포 또는 골모세포와 같은 체세포로 전환시킴에 의해 분화된다.

실시예

실시예 1

세정된(debrided) 피질 골을 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 기계가공을 이용하여 1.5 cm x 2 mm x 1 mm 치수의 섬유로 절단하였다. 세포 구성요소, 지방, 오일, 및 다른 연조직을 제거하기 위해 섬유를 Allowash®에 의해 제조사의 제안된 프로토콜에 따라 처리하였다. 그 후, 섬유를 Lifenet Health, Inc., Virginia Beach, VA로부터의 PAD™ 가공에 의해 처리하였고, 일련의 박동 염산 처리를 이용하여 뒤에 콜라겐 기질 및 내인성 단백질을 남기며, 피질 골 섬유로부터 광물을 제거한다. 섬유를 완충제 및 물에서 세정하여 잔류하는 산을 제거하고, 중성 pH 범위 (약 pH 7)로 완충시켰다. 섬유를 소정 형상의 몰드에 부하시켰다. 6.227MPa (약 903 psi)의 압력을 30분 동안 몰드의 섬유에 가하였다. 가압된 섬유를 동결시키고, 동결 가압된 섬유를 동결건조시키고 동결건조 후 소정 형상으로 유지시켰다. 유체에서 30분 인큐베이션 후 치수, 중량 및 부피에서의 변화를 하기 표 1에 제시한다. 가압된 섬유를 또한 37℃ 염수에서 인큐베이션시키고, 팽창 및 분리를 5분 후에 관찰하였다. 18시간 후, 37℃ 염수에서 가압된 섬유는 완전히 분리되었고 기계적 완전성은 관찰할 수 없었다.

표 1

실시예 2

광물제거 골 섬유의 샘플을 두 상이한 절단 프로그램 (0.003" 및 0.009" 칩로드)으로부터 CNC 절단 및 골 셰이버 기계 ("셰이버")로부터 제조하였다. 이러한 섬유를 5 또는 20분의 가압 동안 25 mm × 100 mm "버블랩" 몰드로의 압축된 섬유에 대한 반 압력 (약 10톤, 약 37 MPa)에 이용되는 1.75톤 프레스 (약 6.5 MPa, 전 압력(full pressure)에서 작동함, 또는 25mm x 100mm 표면에 대한 약 900 psi), 또는 20톤 프레스에 배치시켜 제시된 형상을 생성하였다. 다양한 섬유 크기 및 다양한 압력 투입을 이용하여 생성된 샘플을 최대 30분 동안 PBS 또는 응고 소 혈액에 배치시켜 팽창의 양 (길이 및 폭 변화) 및 샘플의 중량 변화를 결정함으로써 흡수된 액체의 부피를 결정하였다. 팽창의 양 및 중량 변화를 이용하여 샘플의 공극 부피를 추론하였다 (다공성 또는 공극 크기). 증가된 PBS 대 혈액 흡수의 경향이 낮은 압력 (예컨대 약 900 psi) 샘플에서 보여진 반면, 고압 (예컨대 약 5160 psi) 샘플에서는 반대로 나타났다. 고압에서 생성된 샘플은 이들이 혈액 또는 염수에 유지될 때 생성물이 많은 위치에서 너무 얇게 가압되어 부서지기 쉽고 또한 건조하며 이들이 습윤될 때 더 그렇기 때문에 처리될 수 없었다 (트위져를 이용하여 고체 조각으로 픽업됨). 그럼에도 불구하고, 낮은 압력 (예컨대 약 900 psi) 샘플은 혈액으로 습윤될 때 용이하게 처리될 수 있었고, 염수 샘플에서 주의하여 처리될 수 있었다. 모든 샘플은 출발 샘플 중량에 필적하였다.

상이한 압력, 약 900 psi, 450 psi, 및 225 psi로 제조된 샘플에 대한 혈액 습윤을 비교하였다. 더욱이, 900 psi에서 제조되고 스트립에서 각각 "돔/버블"을 통해 뚫린 1/16" 구멍을 갖는 이식편을 몰드를 충전하면서 첨가된 preservon (1ml/g 조직)로 제조된 이식편과 비교하였다. 상이한 압력으로 제조된 샘플에 대해 혈액 습윤에 대한 가시적인 차이는 관찰되지 않았으나, 구멍이 뚫린 이식편 및 preservon 이식편은 25 × 25mm 가압된 섬유 스트립 섹션에 배치될 때 적용된 혈액 (즉, 약 2cc)에 대해 개선된 (즉, 감소된) 접촉 각을 나타내었다. 더욱이, preservon으로 제조된 스트립은 건조 상태에서 명백히 높은 가요성을 지녔다.

3점 휨 기계적 시험 (ASTM D790)을 임의의 유체에서의 인큐베이션 전에 건조 상태에서 1.75톤 프레스로 가압된 상기 버블랩-형상 0.009" 샘플에 대해 수행하였다. 이러한 시험의 결과를 하기 표 2 및 도 13A에 제시한다.

표 2

10mm 볼 파열 기계적 시험을 임의의 유체에서의 인큐베이션 전에 건조 상태에서 그리고 혈액에서 인큐베이션 후에 습윤 상태에서 1.75톤 프레스로 가압된 상기 버블랩-형상 0.009" 샘플에 대해 수행하였다. 245 mm 공 대신 10 mm 공을 이용하도록 변형된 ASTM D3787에 따른 실험 프로토콜을 이용하였다 (astm.org/Standards/D3787.htm). 이러한 시험의 결과를 하기 표 3 및 4 및 도 13B에 제시한다.

표 3: 건조 샘플의 볼 파열 기계적 시험

표 4: 습윤 샘플의 볼 파열 기계적 시험

실시예 3

무-결합제 모양으로 가압된 CNC 및 셰이버 절단체로부터의 골 섬유를 사체의 요추골에 배치시키고 10분 동안 염수로 수화시켰다. 주변 연조직을 교체하고, 조직을 마사지하여 정상 폐쇄를 시뮬레이션하였다. 결과는 섬유 모양이 이러한 이식 모델에서 그 일반적인 모양 및 표면 토폴로지를 유지하였음을 나타내었다. 섬유는 결함 공간에 순응하여 골 융합을 향상시키기 위해 천연 골-대-임플란트 접촉을 증가시키는 척추간 공간으로 이동하는 것이 추가로 발견되었다.

실시예 4

중합체 (폴리카프로락톤 또는 폴리디옥사논)를 0.1 mg/ml로 클로로포름 또는 헥사플루오로이소프로판올에 용해시키고 1:1 비 (건조 골 중량 : 건조 중합체 중량)로 실시예 1로부터의 골 섬유에 첨가하였다. 휘발성 용매가 흄 후드에서 증발하도록 하여 골 섬유 상에 중합체 코팅을 남겼다. 그 후 중합체 코팅된 골 섬유를 30분 내지 1시간의 기간 동안 6.5 MPa에서 압축시켰다.

실시예 5

주사 전자 현미경 (SEM)은 골 조성물의 연구 및 특성화를 위한 도구를 제공한다. 도 5는 본 발명의 CNC (커터 상에 각각 0.003" 및 0.009" 칩로드를 갖는 CNC 0.003 및 CNC 0.009)로 절단된 샘플 골 섬유의 SEM 이미지를 예시한다. 이미지는 건조 골 섬유가 30분 동안 염수에서 습윤된 후에 수득되었다. 상이한 배율의 SEM 이미지를 골 섬유 치수, 예컨대 폭 및 길이의 측정에 이용할 수 있다.

도 3A 및 3B는 본 발명의 일부 구체예에 따라 ImageJ64 (NIH Shareware)를 이용하여 참조 스케일 바를 지닌 SEM에 의해 측정된 대로 3 상이한 공여체로부터 CNC에 의해 절단된 골 섬유의 평균 길이 및 폭을 도시한다.

CNC 절단 (커터 상에 0.003" 및 0.009" 칩로드 지님)에 의해 제조된 DBM 섬유를 Allowash 및 광물제거 (PAD processing)에 의해 처리하고 동결건조시켰다. 섬유를 플라스마 침착에 의해 금으로 코팅된 탄소 테입 및 스퍼터(sputter) 상에 건조 장착하였다. 코팅된 섬유를 주사 전자 현미경에 의해 Jefferson Labs (Newport News, VA)에서 JOEL JSM-6060LV를 이용하여 이미지로 만들었다. 참조를 위한 스케일 바를 이용하여 섬유 이미지를 ImageJ64 (NIH shareware)에 의해 측정하여 30개의 독특한 섬유를 이용하여 섬유의 평균 길이 및 폭을 결정하고 ImageJ64에서 통계적으로 평균내었다.

표 5는 측정된 섬유 및 ImageJ64에 의해 평균낸 치수에 의해 SEM 이미지로부터 유래된 CNC에 의해 절단된 골 섬유의 치수 (평균 길이, 평균 폭, 길이 범위, 및 폭 범위)를 제시한다. 골 섬유는 3 (3) 공여체로부터 얻었고 골 섬유 샘플에 대한 각각의 공여체로부터 n=30이었다.

표 5

실시예 6

상기 실시예 2에 따라 PBS에서 인큐베이션 후 습윤 상태에서 1.75톤 프레스로 가압된 버블랩-모양 0.009" 샘플을 제조하고 샘플의 공극 크기 분포를 측정하였다. 도 4는 이식편이 습윤 후 평형 상태로 나타나고 30분 동안 팽창된 경우, 본 발명의 일부 구체예에 따른 수은 다공성 측정을 통한 습윤 CNC 0.009 골 섬유 샘플의 공극 크기 분포를 나타낸다.

압축된 골 섬유 (CNC 및 셰이버 둘 모두)는 allowash 처리되고, 광물제거 (PAD에 의해)되고 버블랩 몰드로 압축되었다. 몰드의 압축된 섬유를 동결건조시켜 DBM 모양 섬유 스트립을 생성하였다. 스트립을 1 cm x 1cm 섹션으로 절단하고 수은 함입 및 압출 다공성 측정에 의해 각 그룹에 대해 3중으로 분석하여 공극 부피 및 크기 분포, 총 표면적, 평균 미디어 및 모달 공극 크기, 누적 및 차등 공극 부피 및 영역 분포를 결정하였다.

표 6은 버블랩-모양 샘플에서 건조 및 습윤 골 조성물에 대한 공극 크기의 개요를 도시한다.

표 6

*: 주목할 만한 이봉 분포.

표 7은 상이한 압력으로 제조된 버블랩-모양 0.009" 샘플에서 추가적인 건조 골 조성물에 대한 공극 크기의 개요를 도시한다.

표 7

본 발명의 일부 구체예에 따라 CNC에 의해 절단된 골 섬유로부터 제조된 골 조성물은 셰이버 섬유에 비해 공극 크기에 대해 상이한 평균 모드를 지닌다. 특히, CNC에 의해 절단된 골 섬유는 건조 섬유가 30분 동안 습윤된 후 공극 크기에 대한 주목할 만한 이봉 분포의 모드를 나타내지 않는다.

압력 225 psi 내지 14,000 psi (즉, 225, 450, 900, 1800, 3600 및 14000 psi)를 가함에 의해 10 mm 직경을 갖는 광물제거 골 섬유 (CNC 0.009" 칩로드에 의해 제조됨)의 편평한 디스크를 제조하고, 건조 디스크의 공극 크기를 수은 다공성 측정에 의해 측정하였다. 측정된 다공성을 하기 표 8에 제시한다.

표 8

압력 225 psi 내지 14,000 psi (즉, 225, 450, 900, 1800, 3600 및 14000 psi)를 가함에 의해 제조된 10 mm 직경을 갖는 광물제거 골 섬유 (CNC 0.009" 칩로드에 의해 제조됨)의 편평한 디스크를 PBS에 30분 동안 유지시키고, 동결시키고, 동결건조시켰다. 디스크의 형상은 900 psi 또는 그 미만의 압력에서 제조된 디스크에 대해 유지되었고, 공극 크기는 하기 표 9에 제시된 대로 측정되었다. 반면, 1800 또는 그 초과의 압력에서 제조된 디스크는 습윤 후 기계적 완전성을 잃었고 습윤 압축 강도 또는 수은 다공성 측정에 의한 다공성에 대해 시험될 수 없었다.

표 9

실시예 7

도 5는 골 섬유 본체 및 마이크로화이버를 예시하는, 건조 골 섬유 샘플의 SEM 이미지를 도시한다. 샘플 마이크로화이버의 길이 및 폭이 확인된다.

도 6에 도시된 대로, 건조 골 섬유의 샘플을 가시화하고 상이한 배율 (mag.)에서 SEM에 의해 기록하였다.

압축된 DBM 섬유 (0.003" 및 0.009" 칩로드에서 둘 모두 CNC 및 골 셰이버에 의해 절단)를 allowash 처리하고, 광물제거 (PAD)하고, 버블랩 몰드로 압축시켰다. 압축된 섬유를 동결건조시켜 DBM 모양 섬유 스트립을 생성하였다. 압축된 DBM 섬유 스트립 (~1cm x 1cm)을 플라스마 침착에 의해 금으로 코팅된 스터브 및 스퍼터 상에서 탄소 테입에 의해 건조 장착하였다. 코팅된 섬유를 상이한 배율의 JOEL JSM-6060LV를 이용하여 Jefferson Labs (Newport News, VA)에서 SEM에 의해 이미지로 만들었다.

마이크로화이버는 3000배 배율을 이용한 도 5에서 입증된 대로, 1,000 및 3,000배 배율을 이용한 이미지에서 더 식별될 수 있었다.

대표적인 주사 전자 현미경 이미지를 이용하여, CNC 절단 (CNC 0.003 및 CNC 0.009) 및 골 셰이버 절단된 광물제거 골 섬유 (셰이버) 상의 근사한 주요 섬유 본체에서 돌출된 것으로 보이는 마이크로화이버의 평균 길이 (L) 및 폭 (W)을 ImageJ64 (NIH shareware)에 의해 측정하였다 (n=20 포인트). 평균 길이 (L), 폭 (W) 및 개개 범위가 제시되며, 길이-대-폭 (L : W) 비가 산출되었다. 얻어진 평균 마이크로화이버 치수를 표 10에 제시한다.

표 10

BMP-2에 대한 R&D systems Quantakine 키트를 이용하여 골 조성물 샘플 중 BMP의 양을 측정하였다. 3 공여체로부터의 0.003" 및 0.009" 절단된 섬유의 샘플 및 비교 DBM 미립자를 제조사의 지시에 따라 콜라게나제에서 밤새 분해시키고 플레이트에 첨가하였다. 도 7에 도시된 결과는 광물제거 공정 후에 0.009" 절단된 섬유가 0.003" 절단된 섬유에 비해 더 많은 BMP-2를 보존함을 입증하였다.

실시예 8

도 8은 하루 또는 1주일 배양 후 DBM 섬유 (CNC 0.009)로부터의 골 임플란트에 대한 골수 줄기 세포 (BMSC)의 샘플 SEM 이미지를 도시한다.

200,000개 골수 유래된 중간엽 줄기 세포를 제노-프리(xeno-free), 무혈청 StemPro (Invitrogen)에서 최대 7일 동안 압축된 골 섬유 (CNC 0.009) 상에서 배양시켰다. 세포를 지닌 섬유를 1일차에 고정시키고 카코딜레이트 완충제 중 글루타르알데하이드에서 7 동안 유지(say seven)시킨 후 오스뮴 테트라옥사이드로 탈수화시켰다. DBM 섬유 스트립 (~1 cm x 1 cm)을 플라스마 침착에 의해 금으로 코팅된 스터브 및 스퍼터 상에서 탄소 테입 상에 건조 장착시켰다. 코팅된 섬유를 JOEL JSM-6060LV를 이용하여 Jefferson Labs (Newport News, VA)에서 SEM에 의해 이미지로 만들었다. 배양 7일 후 배양 샘플의 이미지는 세포가 DBM 섬유를 가로질러 확산 (및 명백히 유사분열 진행)되었음을 나타낸다.

도 9는 골 섬유 상의 BMSC 성장을 예시하고, 이 때 성장은 AlamarBlue 검정에 의한 상대적 형광 단위 (RFU)로 제시된다. 100,000개 골수 유래된 중간엽 줄기 세포 (BMSC)를 3 상이한 공여체로부터의 중량-일치 DBM 섬유 (0.003" 또는 0.009" CNC 칩로드를 이용하여 제조됨)로 바닥이 코팅된 48웰 조직 배양 플레이트 상에 시딩하고 조직 배양 플라스틱 상에서 골 섬유 없이 성장한 세포 (단지 BMSC 그룹)와 비교하였다. AlamarBlue 염료 시약을 매일 배지에 첨가하고 배지를 수집하고 형광 플레이트 판독기 상에서 측정하여 매일 각 웰로부터의 상대적 형광 단위를 결정하였고, 이는 1 내지 8일의 배양 동안 각각의 세포-기질에 대한 세포 대사 활성에 상응한다.

도 9에 도시된 대로, BMSC의 대사 활성은 DBM 섬유 상에서 매일 증가하는 것으로 관찰되었는데, 이는 섬유로부터의 세포독성의 결여를 제안한다. CNC에 의해 절단된 골 섬유 상에서 성장하는 BMSC는 향상된 세포 성장을 나타낸다.

실시예 9

도 10은 생체내 골 섬유 간격 및 세포충실성을 나타내는, 예시적인 골 조성물 임플란트의 이미지를 예시한다. 3 독특한 공여체로부터의 압축된 섬유를 0.003" 또는 0.009" CNC 칩로드를 이용하여 DBM 섬유로 처리하였다. 스트립으로 가압된 두 섬유 그룹을 25mg 샘플로 절단하고, 정기적으로 멸균한 다음, 무흉선 마우스에 이식하고 (CNC 그룹 당 총 12개 임플란트의 경우 공여체 당 n=4 임플란트), 상이한 CNC 절단된 섬유 기하학으로부터의 비가압된 섬유와 비교하였다. 임플란트를 4주 생활 후에 체외이식하고 임플란트에 의해 유도된 새로운 골 요소 형성을 평가하기 위해 H&E 조직학을 준비하였다. 모든 섬유 주위에서 보여진 세포충실성은 섬유 간격이 세포 침윤에 적합함을 제안하였다. 상기 이미지는 새로운 골 요소 형성을 도시하는 각각의 그룹의 백분율을 제공하는 섬유 그룹 당 조직병리학 매트릭스에 의해 점수를 매긴 12개 분리된 섹션을 이용하여, DBM 섬유 스트립에 대한 임플란트 및 느슨한 섬유 임플란트를 통틀어 보여진 이식편-유도된 새로운 골 요소와 함께, 체외이식된 형상화된 DBM 섬유의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색의 결과를 도시한다.

도 11은 골 임플란트에 대한 골유도성 (OI)의 백분율 통과율(percentage pass rate) 및 섬유 패킹 밀도와의 관련성을 입증한다. 도 11에 도시된 대로, CNC 0.003 섬유를 가압하는 것은 OI 통과율을 현저하게 향상시킨다.

실시예 10

도 12는 본 발명의 일부 구체예에 따른 골 임플란트 (골 섬유 이식편)의 설계 및 몰딩 과정을 도시한다.

몰드는 오목면을 갖는 3D 프린팅된 기재 플레이트 및 볼록면을 갖는 코어 블록(core block)을 포함한다. 몰드는 관골구에 근접한 개인의 골 구조의 3D 컴퓨터 이미징 (컴퓨터 단층촬영) 측정에 기반한 3D 프린팅에 의해 생성된다. 임플란트의 컴퓨터 이용 설계 (CAD) 드로잉은 환자 골에 해부학적으로 일치하여 맞춤 캐스트 형상 DBM 섬유 임플란트를 생성하는데 필요한 몰드를 생성한다. 이러한 접근은 비특이적 압축된 섬유 스트립과 대조적이다. 본 발명의 공정은 임의의 환자-특이적 경조직이 3D 의료 영상 스캔으로부터 컴퓨터 렌더링으로 전환되게 하고, 이에 의해 렌더링 주위의 소극적 공간 (negative space)을 이용하여, 그 후 수술 시간을 줄이기 위해 환자-매칭된 DBM 섬유 임플란트를 신속하게 생성하도록 제작될 수 있는 (추가 또는 삭감 수단) 몰드를 설계한다. 이러한 접근은 또한 인공 고관절 임플란트와 같이, 보철학과 결합된 섬유 형상을 생성하는 것이 또한 입증된다.

Claims (58)

1. 골 입자를 소정의 형상을 지닌 몰드에 부하시키고,
   100 내지 1000 psi의 압력(말단 값을 포함하지 않음)을 부하된 골 입자에 가하고,
   압축된 골 입자를 동결 건조시켜 압축된 골 조성물을 제공하는 것을 포함하며,
   압축된 골 조성물이 결합제 또는 화학적 가교제를 포함하지 않는, 압축된 골 조성물을 제조하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 압력이 200 psi 내지 1000 psi 미만인 방법.
3. 제 1항에 있어서, 압력이 200 psi 내지 950 psi인 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 압축된 골 조성물의 소정의 형상이 홈을 포함하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 압축된 골 조성물이 액체에서 적어도 5-30분 동안 이의 완전성을 유지하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 실온에서 압력이 가해지는 방법.
7. 삭제
8. 제 1항에 있어서, 상기 골 입자가 골 섬유, 골 분말, 또는 골 섬유와 골 분말의 혼합물을 포함하는 방법.
9. 제 1항에 있어서, 상기 골 입자가 피질 골, 해면 골, 피질 해면 골, 또는 피질 및 해면 골의 혼합물에서 비롯되는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 압력을 가하기 전에 골 입자를 광물제거시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
11. 제 1항에 있어서, 압력을 가하기 전에 골 입자를 세정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 세정이 골 입자를 항생제, 세척제, 알콜 및 H₂O₂로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상과 함께 인큐베이션시키는 것을 포함하는 방법.
13. 제 11항에 있어서, 상기 세정이 항생제, 세척제, 및 알콜을 이용하는 것을 포함하는 방법.
14. 제 1항에 있어서, 압축된 골 조성물을 멸균시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
15. 제 14항에 있어서, 골 입자가 감마 또는 e-빔 조사, 에틸렌 옥사이드, 또는 임계 CO₂에 의해 멸균되는 방법.
16. 제 1항에 있어서, 압축된 골 조성물을 가소제 조성물로 처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 가소제 조성물이 글리세롤, 아도니톨, 소르비톨, 리비톨, 갈락티톨, D-갈락토스, 1,3-디하이드록시프로판올, 에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 자일리톨, 메소-에리트리톨, 아디프산, 프롤린, 하이드록시프롤린, 폴리올, 및 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 가소제를 포함하는 방법.
18. 제 1항에 있어서, 상기 골 입자가 인간, 소, 돼지, 개, 말, 염소, 또는 양으로부터 수득되는 방법.
19. 제 1항 내지 제6항, 및 제8항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 골 임플란트로서, 압축된 골 조성물이 홈, 파동, 버블 또는 버블-랩을 가지는 웨이브를 포함하며,
    압축된 골 조성물이 결합제 또는 화학적 가교제를 포함하지 않는, 골 임플란트.
20. 제 19항에 있어서, 상기 골 입자가 인간, 소, 돼지, 개, 말, 염소, 또는 양으로부터 수득되는 골 임플란트.
21. 제 19항에 있어서, 상기 골 입자가 골 섬유, 골 분말, 또는 골 섬유와 골 분말의 혼합물을 포함하는 골 임플란트.
22. 제 19항에 있어서, 상기 골 입자가 광물제거된 것인 골 임플란트.
23. 제 19항에 있어서, 상기 골 입자가 0.01-8 wt%의 평균 잔류 칼슘 함량을 갖는 골 임플란트.
24. 제 19항에 있어서, 상기 골 입자가 0.01-4 wt%의 평균 잔류 칼슘 함량을 갖는 골 임플란트.
25. 제 19항에 있어서, 상기 골 입자가 피질 골, 해면 골, 피질 해면 골, 또는 피질 및 해면 골의 혼합물에서 비롯되는 골 임플란트.
26. 제 19항에 있어서, 상기 골 임플란트가 적어도 하나의 세포, 적어도 하나의 생물활성 인자, 또는 적어도 하나의 세포 및 적어도 하나의 생물활성 인자를 추가로 포함하는 골 임플란트.
27. 제 19항에 있어서, 상기 골 임플란트가 구조의 나머지에 비해 홈 영역에서 더 높은 밀도를 갖는 골 임플란트.
28. 제 19항에 있어서, 골 임플란트의 밀도가 0.24 내지 0.35 g/cm³인 골 임플란트.
29. 제 19항에 있어서, 상기 골 입자가 10-1,000 마이크론의 중간 직경, 0.5-100 mm의 중간 길이, 및 10-1000 마이크론의 중간 두께를 갖는 골 임플란트.
30. 삭제
31. 골 섬유를 포함하는 골 조성물로서, 골 섬유가 5 μm 미만의 평균 폭 (W); 및 2 초과의 평균 길이 (L) : 평균 W 비를 갖는 마이크로화이버를 포함하며, 골 조성물이 결합제 또는 화학적 가교제를 포함하지 않는, 골 조성물.
32. 제 31항에 있어서, 평균 L: 평균 W 비가 5 초과인 골 조성물.
33. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 평균 L: 평균 W 비가 7 초과인 골 조성물.
34. 제 31항에 있어서, 평균 L: 평균 W 비가 2 내지 30의 범위인 골 조성물.
35. 제 31항에 있어서, 평균 L: 평균 W 비가 5 내지 8의 범위인 골 조성물.
36. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 마이크로화이버의 W가 2 μm 미만인 골 조성물.
37. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 마이크로화이버의 W가 1 μm 미만인 골 조성물.
38. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 마이크로화이버의 L이 12 μm 미만인 골 조성물.
39. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 마이크로화이버의 L이 7 μm 미만인 골 조성물.
40. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 골 조성물이 골 섬유에 압력을 가함에 의해 제조되는 골 조성물.
41. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 골 조성물이 습윤되고 습윤된 골 조성물의 공극 크기의 모드가 25 내지 250 μm의 범위인 골 조성물.
42. 제 41항에 있어서, 평형을 이룬 습윤된 골 조성물의 공극 크기의 모드가 이봉 분포를 갖지 않는 골 조성물.
43. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 골 조성물이 습윤되고 습윤된 골 조성물의 공극 크기의 평균이 20 내지 100 μm의 범위인 골 조성물.
44. 제 43항에 있어서, 평형을 이룬 습윤된 골 조성물의 공극 크기의 평균이 30 μm 미만 또는 65 μm 초과인 골 조성물.
45. 골 조성물을 임플란트를 위해 개체의 골 구조로부터 취해진 3차원 (3D) 측정에 기반한 몰드에 부하시키고, 이 때 골 조성물은 2 초과의 평균 길이 (L) : 평균 폭 (W) 비를 갖는 마이크로화이버를 포함하며;
    부하된 골 조성물에 100 내지 1000 psi의 압력(말단 값을 포함하지 않음)을 가하여 몰드에 맞추고;
    골 조성물을 동결 건조시켜 골 임플란트를 제공하는 것을 포함하며, 골 임플란트가 결합제 또는 화학적 가교제를 포함하지 않는, 개체용 골 임플란트를 제조하는 방법.
46. 제 45항에 있어서, 몰드가 3-D 프린팅에 의해 구성되는 방법.
47. 제 45항 또는 제 46항에 있어서, 개체가 인간, 개, 돼지, 소, 고양이 또는 말인 방법.
48. 제 45항 또는 제 46항에 있어서, 개체가 인간인 방법.
49. 제 45항 또는 제 46항에 있어서, 골 구조가 부하 지지 없는 분절 결함인 방법.
50. 제 45항 또는 제 46항에 있어서, 골 구조가 넙다리뼈 머리, 넙다리 큰돌기, 두개골 피판, 및 아래턱뼈로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
51. 제 45항 또는 제 46항에 있어서, 몰드가 홈을 포함하는 방법.
52. 세포를 골 섬유를 포함하는 골 조성물과 접촉시키는 것을 포함하고, 골 섬유가 5 μm 미만의 평균 폭 (W); 및 2 초과의 평균 길이 (L) : 평균 W 비를 갖는 마이크로화이버를 포함하며, 골 조성물이 결합제 또는 화학적 가교제를 포함하지 않는, 세포의 골유도성, 골전도성, 연골유도성, 연골전도성, 또는 인대/힘줄 분화 또는 성장을 촉진시키는 방법.
53. 제 52항에 있어서, 세포가 전구 세포 또는 성체 줄기 세포인 방법.
54. 제 53항에 있어서, 전구 세포 또는 성체 줄기 세포가 태반, 골수, 지방 조직, 혈관, 양수, 활액, 활막, 심낭막, 골막, 경막, 말초혈, 탯줄혈, 생리혈, 유치, 속질핵, 뇌, 피부, 모공, 창자움, 신경 조직, 또는 근육으로부터 유래되는 방법.
55. 제 45항에 있어서, 골 임플란트를 보철물에 적용시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
56. 제 55항에 있어서, 보철물이 금속 또는 합성 재료를 포함하는 방법.
57. 제 1항에 있어서, 압축된 골 조성물이 구멍을 포함하는 방법.
58. 제 19항에 있어서, 압축된 골 조성물이 구멍을 포함하는 골 임플란트.

Images