KR102321043B1 - 클루이베로마이세스 막시아누스 균주에서 유도 발현이 가능한 프로모터 및 이를 이용한 유전자 발현 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효모 균주에서 이용할 수 있는 유전자 발현카세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로 KmGAL10, KmINU, KmGAPDH, KmPGK1, ScADH1, 또는 ScGAL10 프로모터 서열을 포함하는 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체, 및 상기 형질전환체를 이용한 유전자발현물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환체를 이용하여 저비용으로 고순도 유전자발현물을 제조할 수 있다.

Description

클루이베로마이세스 막시아누스 균주에서 유도 발현이 가능한 프로모터 및 이를 이용한 유전자 발현 시스템 {A promoter being expressed in Kluyveromyces marxianus strain and the gene expression system using thereof}

본 발명은 클루이베로마이세스 막시아누스 균주에서의 유전자 발현 시스템에 관한 것이다. 구체적으로 클루이베로마이세스 막시아누스 균주에서 유도 발현이 가능한 프로모터, 이를 포함하는 발현 카세트, 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 유전자발현 시스템에 관한 것이다.

클루이베로마이세스 막시아누스 (Kluyveromyces marxianus)는 내열성 효모 균주의 일종으로서 알코올 또는 젖산 발효, 산업용 효소 자원 및 프로바이오틱 효과 등 다양한 생명공학적 용도를 가지고 있으며 GRAS (Generally Regarded as Safe) 미생물로서 재조합 단백질 생산의 숙주세포로도 유용하다. 예를 들어, 한국특허출원 제10-2015-0087784호는 클루이베로마이세스 막시아누스 변이주를 이용하여 젖산을 생산하는 방법을 기술하고 있다. 클루이베로마이세스 막시아누스에서 효과적인 유전자 발현을 위해서는 고효율 유도발현이 바람직하나 현재까지는 K. marxianus 및 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 소수의 프로모터만 사용되고 있다. 본 발명에서는 S. cerevisiae 균주에서 강력한 활성을 가지며 갈락토오스 (galactose)에 의한 정밀한 유도발현이 가능한 GAL10 프로모터를 K. marxianus 균주에서도 유도 발현이 가능한 프로모터로서 사용할 수 있는 가능성을 조사한 결과 현재 사용되고 있는 다른 프로모터에 비하여 프로모터 활성도 높고 고가의 탄소원인 갈락토오스에 의한 유도발현 뿐만 아니라 값싼 탄소원 락토오스에 의한 효율적인 유도발현이 가능함을 확인하고 이를 활용하여 고효율 유전자 발현 시스템을 구축하였다.

한국특허출원 제10-2015-0087784호

본 발명의 하나의 목적은 효모 균주에서 유도 발현이 가능한 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 발현 카세트를 포함하는, 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 유전자발현시스템을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호: 2 및 서열번호: 3의 프라이머세트에 의해 증폭된 KmGAL10; 서열번호: 4 및 서열번호: 5의 프라이머세트에 의해 증폭된 KmINU; 서열번호: 6 및 서열번호: 7의 프라이머세트에 의해 증폭된 KmGAPDH; 서열번호: 8 및 서열번호: 9의 프라이머세트에 의해 증폭된 KmPGK1; 서열번호: 10 및 서열번호: 11의 프라이머세트에 의해 증폭된 ScADH1; 및 ScGAL10 프로모터 (pYEGa-HIR525 vector 유래, 입수처: 한국생명공학연구원, Sohn 등, Process Biochem. 7: 653-660 (1995))로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 프로모터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 효모 균주용 발현 카세트를 제공한다. 이와 관련된 본 발명의 일 실시예에서 상기 발현 카세트는 효모신호서열인 MFa와 리포터 유전자인 CalB14의 서열과 작동가능하게 연결될 수 있으며, 상기 효모신호서열인 MFa와 리포터 유전자인 CalB14의 서열은 서열번호: 1로 구성될 수 있다. 이와 관련된 본 발명의 다른 일 실시 예에서, 선택 마커 유전자로서 G418 내성 유전자인 KanMX의 서열이 작동가능하게 연결될 수 있으며, 상기 KanMX는 서열번호: 12 및 서열번호: 13의 프라이머세트에 의해 증폭된 것일 수 있다. 이와 관련된 또 다른 일 실시예에서, 상기 효모 균주는, 바람직하게는 클루이베로마이세스 막시아누스 (Kluyveromyces marxianus) 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 클루이베로마이세스 막시아누스 (K. marxianus) NCYC 2887 또는 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) Y2805일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에서, 본 발명은 상기 발현 카세트를 포함하는, 효모 균주용 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다. 이와 관련된 본 발명의 일 실시예에서, 상기 형질 전환체는 바람직하게는 클루이베로마이세스 막시아누스 (Kluyveromyces marxianus) 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 클루이베로마이세스 막시아누스 (K. marxianus) NCYC 2887 또는 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) Y2805 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 (i) 상기 형질전환체를 배양하고; 및 (ii) 상기 배양된 형질전환체로부터 유전자 발현물을 수득하는 것을 포함하는 유전자 발현 방법을 제공한다. 이와 관련된 일 실시예에서, 상기 형질전환체는 클루이베로마이세스 막시아누스 (K. marxianus) NCYC 2887항이고 락토오스가 유도원 (inducer)으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 염기서열은, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 여기서, “실질적인 동일성”은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열로서 70% 이상의 상동성, 구체적으로 80% 이상의 상동성, 보다 더 구체적으로 90% 이상의 상동성을 갖는 서열이며, 이들 상동성 범위에 있는 염기서열도 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명에서 용어 “작동가능하게 연결된”은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결된 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터와 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명에서 발현 벡터와 작동가능하게 연결하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 상기 발현 카세트는, 전사 증강인자, 종결인자, 개시인자 및 다른 유전적 조절 인자들 또는 재조합 목적 단백질 또는 펩타이드의 항원성 또는 결합 친화력을 높이기 위한 구성요소들을 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "발현 벡터"는 숙주세포에 DNA를 도입하여 목적 유전자의 발현을 효율적으로 유도하기 위한 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "형질전환체"는 외래의 유전물질을 포함하여 유전형질이 변화된 것을 의미한다. 본 발명에 따른 형질전환체는 유전자조작이 용이하며 다양한 발현시스템에 적용될 수 있으며, 대량배양에 이용될 수 있다.

본 발명에서 상기 형질전환체의 배양물로부터 유전자 발현물을 분리 정제하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해, 크로마토그래피 등의 방법을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 발현 카세트, 발현 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체를 이용하면, 효모로부터 목적하는 유전자 발현산물을 저비용으로 고순도로 제조할 수 있을 것이다.

도 1은 ScGAL10 프로모터를 포함하는 효모발현벡터인 pYEGa-HIR525의 모식도이다.
도 2는 pFA6-kanMX4 벡터의 모식도이다.
도 3 내지 8은 본 발명에 따른 프로모터 KmGAL10, KmINU, KmGAPDH, KmPGK1, ScADH1, 또는 ScGAL10를 포함하는 벡터 모식도이다.
도 9는 본 발명에 따른 프로모터를 사용한 유전자 발현시스템에서 리파아제 어세이를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 ScGal10 프로모터를 사용하여 리파아제 리포터 (lipase reporter)의 활성을 S. cerevisiae Y2805 형질전환체와 K. marxianus NCYC 2887 형질전환체 균주에서 비교한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 프로모터의 확보 및 유전자 발현 시스템

ScGAL10 프로모터를 포함하는 효모발현벡터인 pYEGa-HIR525 (입수처: 한국생명공학연구원, Sohn 등, J. Microbiol. 1: 266-273 (1991), 도 1 참조)를 EcoRI/SalI으로 제한하여 효모신호서열인 MFa와 리포터 유전자인 CalB14를 함께 발현하여 리포터 유전자가 분비되도록 하였다. 또한 NdeI/NarI으로 제한하여 G418 (Geneticin) 내성 유전자인 KanMX 카세트를 넣어 G418 항생제에서 선별가능 하도록 바꾸었다. 다음, SmaI/EcoRI로 제한하여 KmGAL10, KmPGK1, KmINU, KmGAPDH, ScGAL10 및 ScADH1 프로모터를 각각 발현벡터에 클로닝 하였다. ScGAL10 및 ScADH1 (alcohol dehydrogenase)는 S. cerevisiae 유래의 프로모터이고, KmGAL10, KmPGK1 (phosphoglycerate kinase), KmINU (inulinase), 및 KmGAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) K. marxianus 유래의 프로모터이다.

리포터 유전자인 CalB14 (bold)와 효모신호서열인 MFa (blue)는 DNA2.0에서 효모코돈으로 최적화하여 합성하였으며, 그 서열은 서열번호: 1 (리포터 유전자인 CalB14 (bold)와 효모신호서열인 MFa (blue)를 DNA2.0 (DNA2.0 (Newark, USA)에서 효모코돈으로 최적화하여 합성된 서열로 나타냈다.

실시예 2: 발현 벡터 제작 및 발현 벡터가 도입된 효모의 배양

G418 내성 유전자인 KanMX 카세트는 pFA6-kanMX4 벡터 (도 2)에서 증폭하였으며 각각의 프로모터는 K. marxianus NCYC 2887의 유전체 (genomic) DNA 및 S. cerevisiae Y2805 유전체 DNA를 주형으로 하여 증폭하였다. 각각의 증폭에 사용된 프라이머 서열은 아래 표 1와 같으며 도 3 내지 도 8에 구축된 벡터의 모식도를 나타낸다.

	primer 이름	primer 염기서열	서열번호
pKmGal	pKmGal-F	ttcgagctcggtacccggggatccccgtgcgcacccg	2
	pKmGal-R	GAATCTCATcgtttcggaattcttcttgattgttcttgatgttttttttg	3
pKmINU	pKmINU-F	ttcgagctcggtacccggggatccgaattctcaaaccgaaatggggc	4
	pKmINU-R	GAATCTCATcgtttcggaattcatctaacaaaaaaaaaattaaatgtgtcacttatg	5
pKmGAPDH	pKmGAPDH-F	GAATCTCATcgtttcggaattctgtgatgtgtaaaagtgtgtgtgtac	6
	pKmGAPDH-R	ttcgagctcggtacccgggggagcacgatatcttggtc	7
pKmPGK	pKmPGK-F	GAATCTCATcgtttcggaattcttttgtatctttatataggtagtgtg	8
	pKmPGK-R	ttcgagctcggtacccggggatccatccttttgttgtttccgg	9
pScADH1	pScADH-F	GAATCTCATcgtttcggaattctgtatatgagatagttgattgtatg	10
	pScADH-R	gcctgaatggcgaatggcgccgtcacccggccagc	11
KanMX	KanMX-NarI-F	gcctgaatggcgaatggcgccgtcacccggccagc	12
	KanMX-NdeI-R	ttggtatatatacgcatatgcagtatagcgaccagcattc	13

제조된 벡터를 BamHI으로 제한처리하여 선형화 (linearlized) 시킨 후, LiAc/PEG 방법으로 K. marxianus NCYC 2887 (입수처: National Collection of Yeast Cultures)에 형질전환 하였다. 이를 위해, 먼저 K. marxianus NCYC 2887 단일 집락을 2 ㎖ YPD에 접종하고 30℃에서 하룻밤 (O/N) 액체배양 시킨 후, 1 ㎖의 배양액을 8,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 다음, 회수한 균체를 멸균된 증류수 (DW)를 이용하여 한번 씻어 준 후, 100 ㎕의 멸균된 DW를 이용하여 풀어 주었다. 이어서, 50 ㎕ K. marxianus 균주에 57% PEG 115 ㎕, 4 M LiAc 5 ㎕, 10 ㎕ 연어 정자 (salmon sperm) DNA (10 ㎎/㎖) 그리고 선형화된 DNA 20 ㎕를 넣은 후, 1분간 볼택서 (vortexer)로 잘 섞어 준 후, 42℃에서 40 분간 열처리를 하였다. 후속하여, 8,000 rpm에서 1분간 원심분리 하여 형질전환 시에 사용한 완충액 (buffer) 성분을 제거 한 다음, 1 ㎖ YPD를 첨가한 후, 30℃에서 2시간 배양하여 200 μg/㎖ G418을 포함하는 YPD 고체배지에 도말하였다. 30℃에서 2 ~ 3일간 배양하여 형질전환체를 얻었다.

200 μg/㎖ G418을 포함하는 YPD 고체배지에서 얻은 형질전환체를 GAL 프로모터의 것은 YPDG (glucose 1%, galactose 1%) - Tributyrin 고체배지 (Yeast extracts, peptone, agar: BD difco. glucose, galactose, glyceryl tributyrate: Sigma-Aldrich)에, 다른 프로모터는 YPD (glucose 2%) - Tributyrin 고체배지 (Yeast extracts, peptone, agar: BD difco. glucose, glyceryl tributyrate: Sigma-Aldrich)에 옮겨 30℃에서 24시간 배양시킨 후 가장 큰 헤일로 (halo)를 보인 콜로니를 각각 선별하였다.

본 발명에서 사용된 각각의 프로모터 및 KanMX 카세트의 서열번호는 각각 다음과 같다: KmGAL10 (서열번호: 14), KmPGK1 (서열번호: 15), KmINU (서열번호: 16), KmGAPDH (서열번호: 17), ScGAL10 (서열번호: 18), ScADH1 (서열번호: 19); KanMX 카세트 (서열번호: 20).

실시예 3: 리파아제 어세이 (lipase assay)

선별된 우수 균주를 YPD G418 액체배지에 3 ㎖ 접종하여 30℃에서 하룻밤 배양 한 후 250 ㎖ baffled flask의 액체배지 25 ㎖ 에 1 (v/v)%가 되도록 접종하였다. 각 균주의 사용배지로서, pScADH1, pKmGAPDH 및 pKmPGK1는 YPD (glucose 2%) (Yeast extracts, peptone: BD difco. glucose: Sigma-Aldrich); pKmINU는 YPD, YPL (lactose 2%) (Yeast extracts, peptone, lactose: BD difco. glucose: Sigma-Aldrich), YPS (sucrose 2%) (Yeast extracts, peptone: BD difco. sucrose: Sigma-Aldrich) 및 YPF (fructose 2%) (Yeast extracts, peptone: BD difco. fructose: Sigma-Aldrich); pScGAL10과 pKmGAL10은 YPD, YPDG (glusose 1%, galactose 1%), YPL, 및 YPG (galactose 2%) 배지를 각각 사용하였다. 30℃에서 48시간 동안 배양하여 CalB14 유전자의 발현을 유도하였다.

각각의 배양액으로부터 얻은 상등액의 분비 발현된 단백질을 이용하여 pNPP (p-nitrophenyl palmitate) (Sigma-Aldrich)를 기질로 하여 반응시킨 후 리파아제 활성을 측정하였다. 배양상등액을 적당한 배율로 희석하여 준비하고, 50 mM pNPP (in acetonitrile)와 에탄올 그리고 50 mM Tris/HCl(pH8.0)를 1 : 19 : 38 의 비율로 섞은 것을 기질혼합액으로 사용하였다. 96웰 l- 마이크로플레이트 (microplate)에 희석한 배양상등액 10 ㎕을 각 웰에 넣은 후, 200 ㎕의 기질 혼합액을 첨가하여 기질의 변화를 측정하였다. 반응은 30초 간격으로 3분간 진행하였으며 기질인 pNPP에서 유리되는 pNP를 415 ㎚ 흡광도에서 측정하여 1분간 유리된 1 μmol의 pNP를 유리시키는 효소의 양을 1 unit으로 정의하였다. 측정된 흡광도 값을 계산하여 각각의 활성을 U/L로 환산하여 도 9의 그래프로 나타내었다.

그 결과 도 9에서 보듯이, GAL 프로모터가 다른 프로모터에 비해 높은 발현을 유도하는 것으로 확인되었다. 또한 S. cerevisiae 유래의 ScGAL10 프로모터가 K. marxianus 균주에서 락토오스 및 갈락토오스를 발현 유도물질 (inducer)로 사용하여 유도적 발현 (inducible expression)이 가능함을 확인하였다. 이러한 특성은 S. cerevisiae 균주가 갈락토오스는 잘 이용하는 반면 락토오스를 이용하는 능력이 결여되어 있는 점을 감안하면 K. marxianus 균주에서 ScGAL10 프로모터를 사용함으로써 S. cerevisiae 균주에서와 달리 저가의 탄소원인 락토오스를 유도원 (inducer)으로 사용할 수 있는 추가적 장점을 제공할 수 있다.

또한, 탄소원으로서 글루코오스 (glucose) + 갈락토오스 (galactose)를 함유하는 배지와 글루코오스 + 락토오스 함유 배지를 사용하여 S. cerevisiae 유래 GAL 프로모터의 K. marxianus 균주에서의 유도적 발현 가능성을 조사하였다. 본 발명의 ScGAL10 프로모터를 포함하는 벡터 (pScGal-MFaCalB14opt)를 형질전환한 K. marxianus NCYC 2887 형질전환체를 YPDG (glucose 1%, galactose 1%), YPDL (glucose 1%, lactose 1%) 액체배지를 사용하여 배양하였다. 30℃, 200 rpm에서 72시간 동안 배양하였으며, 초기에는 4시간 간격, 이후 8시간 및 12시간 간격으로 시료를 샘플링 하였다. 수득한 시료의 흡광도를 측정하여 두 균주의 성장곡선을 확인하였고, pNPP (p-nitrophenyl palmitate)를 기질로 하여 리파아제 분석을 실시하여 발현된 리파아제의 활성을 측정하였다. 또한 RI 검출기가 장착된 HPLC (Agilent technologies)를 이용하여 배양 중 남아있는 글루코오스, 갈락토오스 또는 락토오스의 양을 분석하였다. 분석에는 HPX87H 컬럼 (Bio-Rad)을 사용하였으며, 컬럼온도를 60℃로 유지하도록 하였다. 이동상으로서 0.1% 포름산 (formic acid)을 사용하고 0.6 ㎖/min 유속 (flow rate)으로 하여 측정된 RID 값을 분석하였다. 그 결과 글루코오스 (glucose)에 의한 억제 (repression)와 갈락토오스/락토오스에 의한 유도가 가능함을 확인하였다.

실시예 4: S. cerevisiae 와의 비교

ScGal10 프로모터를 사용하여 리파아제 리포터 (lipase reporter)의 활성을 S. cerevisiae 균주에서와 비교하였다. 먼저, 본 발명의 발현벡터 pScGal-MFaCalB14opt를 형질전환한 S. cerevisiae Y2805 (입수처: 한국생명공학연구원) 형질전환체와 K. marxianus NCYC 2887 형질전환체를 각각 YPDG (glucose 1%, galactose 1%)와 YPL (lactose 2%) 액체 배지를 사용하여 배양하였다. 30℃, 200 rpm에서 72시간 동안 배양하였으며, 12시간 간격으로 시료를 샘플링 하였다. 12시간 간격으로 얻어진 시료의 흡광도를 측정하여 두 균주의 성장곡선을 확인하였고, pNPP (p-nitrophenyl palmitate)를 기질로 하여 리파아제 어세이를 실시하여 발현된 리파아제의 활성을 측정하였다. 그 결과 도 10에 표시한 바와 같이 K. marxianus 균주가 S. cerevisiae 균주에 비해서 성장속도도 빠르고 리파아제 활성도 훨씬 높은 것을 확인하였다.

<110> Choong Ang Vaccine Lab. Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A promoter being expressed in Kluyveromyces marxianus strain and the gene expression system using thereof <130> CVA18P05KR <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1250 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CalB14 and MFa <400> 1 gaattccgaa acgatgagat tcccatctat tttcaccgct gtcttgttcg ctgcctcctc 60 tgcattggct gcccctgtta acactaccac tgaagacgag actgctcaaa ttccagctga 120 agcagttatc ggttactctg accttgaggg tgatttcgac gtcgctgttt tgcctttctc 180 taactccact aacaacggtt tgttgttcat taacaccact atcgcttcca ttgctgctaa 240 ggaagagggt gtctctctcg agaaaagaga ggccgaagct ctgccatcag gatctgatcc 300 tgcattctcc caaccgaaat ctgtattgga tgctggttta acatgtcaag gcgcttctcc 360 atcctccgtg tccaaaccta ttctccttgt gcctggtact ggtactaccg gtcctcagtc 420 tttcgactcg aattggatac cattgtcggc tcaattgggt tatacaccct gctggatctc 480 tcccccacca ttcatgctga atgatacaca ggttaataca gagtacatgg tcaatgcaat 540 cacgacttta tacgctggat ctggaaacaa caaattgcct gttttgacat ggagccaggg 600 tggactggtc gctcaatggg gtcttacctt ctttccaagc attagatcaa aagttgacag 660 actaatggca tttgccccag actataaggg tacggttttg gcaggcccat tagacgcctt 720 ggctgtgtca gctccttcag tctggcaaca aactactggc tcagcattaa ccactgctct 780 gcgtaatgca ggtggactga cacaaattgt gccaacaact aatctgtact ccgctactga 840 tgaaattgtg caaccacagg tttctaatag cccacttgat tcctcatact tgtttaacgg 900 taaaaacgta caggctcagg ctgtttgtgg tcctcaattt gttatcgacc atgctggtag 960 tcttactagt caattctcct atgtcgttgg tagatccgct ctaaggtcca ctacaggaca 1020 agctcgttcg gcagattacg gaatcacgga ctgcaacccc ttgccagcta atgacttgac 1080 cccagaacag aaggtagcag cagcagcttt gcctgcccct gctgccgctg ccattgttgc 1140 aggacccaag caaaactgtg agccggattt gatgccttat gccagacctt ttgcagtcgg 1200 taagagaact tgtagtggta tcgtgacacc ataatagcgg ccgcgtcgac 1250 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKmGal-F <400> 2 ttcgagctcg gtacccgggg atccccgtgc gcacccg 37 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKmGal-R <400> 3 gaatctcatc gtttcggaat tcttcttgat tgttcttgat gttttttttg 50 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKmINU-F <400> 4 ttcgagctcg gtacccgggg atccgaattc tcaaaccgaa atggggc 47 <210> 5 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKmINU-R <400> 5 gaatctcatc gtttcggaat tcatctaaca aaaaaaaaat taaatgtgtc acttatg 57 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKmGAPDH-F <400> 6 gaatctcatc gtttcggaat tctgtgatgt gtaaaagtgt gtgtgtac 48 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKmGAPDH-R <400> 7 ttcgagctcg gtacccgggg gagcacgata tcttggtc 38 <210> 8 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKmPGK-F <400> 8 gaatctcatc gtttcggaat tcttttgtat ctttatatag gtagtgtg 48 <210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pKmPGK-R <400> 9 ttcgagctcg gtacccgggg atccatcctt ttgttgtttc cgg 43 <210> 10 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pScADH-F <400> 10 gaatctcatc gtttcggaat tctgtatatg agatagttga ttgtatg 47 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pScADH-R <400> 11 gcctgaatgg cgaatggcgc cgtcacccgg ccagc 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KanMX-NarI-F <400> 12 gcctgaatgg cgaatggcgc cgtcacccgg ccagc 35 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KanMX-NdeI-R <400> 13 ttggtatata tacgcatatg cagtatagcg accagcattc 40 <210> 14 <211> 804 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KmGal10 promotor <400> 14 ccgtgcgcac ccggtgcact ccaccccgcg cgcggcccac tgccttccgg aaaaccaaac 60 caaaaaccaa aaccaaaacc aaaaacaaag aaaccaaaac acatacctaa accacccaga 120 aaagcccgcg caagaaaccg tttctccccc cctctctctg ccccgggttt ccaggtattc 180 tcactcaagg catcccaatt ccaggcttcg cttctagcag cacctgtggt gctgcttgct 240 ggtgtggtac cagcgtttct ttacgcctgg ccactgggca ctgtgcgccg aaacgcgcaa 300 gaacagtagt agtagtggca cattagcaag cttttctgtt gtgaatgtga ttgatggatg 360 gatgattggc actccatccg ttccttgctt acgcaagctg gcatatggca atgtgtatgt 420 gtgtgccccg aagtataggc agctaagcat atgatagttg gctcgctctg cctttgcagt 480 gtcagatata cacagtatat aaggagttgc ctgaatcttg tcagccggtt cttagaagtc 540 ttcagaaaca ctttcgattc gggcacgttg tataaataag tgtgttgtgt ttcagtttgg 600 agagagtgtt gttattacta ttattattat tcgtgtgtat gtccatttga aagtgtatat 660 atatatatat atgtatatat gtctggttag tttgtttgtc tataacaacc aaaaggtaaa 720 atagtaatag tctggagacc ctaaaagtat aggattccaa gcaaactaga aaaaaccaaa 780 aaaaacatca agaacaatca agaa 804 <210> 15 <211> 1052 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KmPGK1 promotor <400> 15 ggagcacgat atcttggtca ttgctagggc cagggccaat gccttggcct tggccttggt 60 caatgccctt attctcttgt ttccattgcc tgtcgatata cgacttcaag gccatgtacc 120 tgagatcctc atctggggcc tgaagatcca ttggtgagtg ccactggctg ctgtgccgtt 180 gtgaaaaggc cctgtgtagc agagagggag gtgtatatag gtatatatat gtatatatat 240 gtatataagt gtggatttaa ctcactctct cttctttccc atgccatgcc agtcacgtgt 300 tccacacgtg actgtactta ccctcacatt accctcactc tttcacatta ccctccccac 360 catatcttcc cccccccagc ttcctgtctt ccactatccc tgcaaccacc accaccacac 420 aacaaacatc ccccagcagc ccggaaaaat ccacgcctcc ccccgaacac acgaagcccg 480 ccccggcttc cactccaaca ctgccaacac tggaaccccg caccacgtaa ccacccgctt 540 tagtggaacc ccgcccctcc tgcgcttccc ttgcgcttcc cttaggcttc cctggggctt 600 ccctggggct tcccttgcga ccacactccg gtggcatggc cctcgcttgc tacatgctac 660 cttttttttg cccttttctg gccttttctg gcttttctgg cctcaccaca gtgtagtggt 720 gtaccacagt gtaatggtgt aacattgtcg aatggtattg tagcctgttg tagcctgttg 780 tagcctgttg tagcctggtg taatgtctgg catagtctgg tgtctggtgt ctggtgtctt 840 ttggaaactg aacagtggaa agtggaagtg aaaaactgta taaatatagg tgtcccattc 900 gtggtttggt ggatgtgtcc ttgacattgc aggtctctct ctgtttcatt gtgttaagac 960 ttgttaagac ttgataagta tttccctagt aataccccac caaccatcgg ttgatacatt 1020 ttaatacaca ctacctatat aaagatacaa aa 1052 <210> 16 <211> 739 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KmINU promotor <400> 16 gaattctcaa accgaaatgg ggcgttgttt taccccaggt atccggttgt agttggcact 60 ggggatggaa aaaaatgatg ttgatgttga gttagttggg ttgagtcaat tagtgcgtga 120 aagtatcacc acttttgtca tccggcgttt ctgtgcgaat cacacacaca cacacacaca 180 gtttattgga gcgcttgttt ctggcgtatt cgtaattgtt ctgcggtgcg gttctgtgtg 240 catttttcct ggggtgtctg ccgcacctac tcatcaccca cgccgtgggt ttgagccatg 300 gcggaggtac gactgactgg ctgcctgcct gcctgactga ctgcctgact gcaggaaaag 360 agggtttcga aggaaaaact tttcctgtgt taatccggcc gtgcgccgct gctccaaaat 420 ccatcttcat gagaaggagt ttgaaaaaac aaaaaaattc acatataaaa agcgtatctc 480 gagatctcaa agtctccctt gaatcgtgtt tgccagttgt aactcatcct ttattcttct 540 attctatctc tctctttcct tcccctaatc agcaattaaa tccggggtaa ggaagaatta 600 ctactgtgtg taacggttat atttcgtttt ttattttttt ttccattgcc atagagaaag 660 aaaaaaaaaa aaagagagtt tgtgaagatc ttccattcga atcccataag tgacacattt 720 aatttttttt ttgttagat 739 <210> 17 <211> 1061 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KmGAPDH promotor <400> 17 gcatgcccat tacccggaat atattcggtt acccgcggca ttgggaggga agcagagcag 60 agacctcggc actgggaagg agaagcagag cagagacctc ggcactatct gcgcccgaca 120 tttccggcag cctccggcag cctccggccg ccaccgcctc ctcctccaaa attgcctcgc 180 tccctttccc cccagcttca ctcttcctcc cctcccggcc ccacttgcgc gaaaaaaaca 240 aaacagaaca aaaccaaaac caaaaaaaaa aaggacagca cacccgagtg ccacagcttc 300 cacttctcct agcacccact atttcaggcc tccacttctt ccaggcctcc actattccag 360 cctccactat ttgggccccc actatttcag gtttttccga ccacttattc cgatccggca 420 gggttcatcc tctcacctcc ccccgctgcg cacccgtcta gccaccctcg gcatggacga 480 attcactcga gaggccctca tccacacaac atatggctaa agtggtgaaa cttgggccat 540 gacaaaggcc atggaaaatg gtagtaccat ggtagtacca tggtactact agtggtggtg 600 gcattagtgg taccagaacc acctgttgat tgatgctggg actcctgtat tttggttagg 660 gcctgtctgt tggggcctgt caaacaacca acaacactct tccatattct gttctatcca 720 gctagctagc tagctagctg tctttctctc tcgtatgaca tggcctaagg ccatgtcatg 780 tcacacatac acactgtttc ccactgcttc ccactgtttc cactggttta ccgtttcagt 840 aaatatccaa catgcgatca tgccaatatt ctgccaatat tctgccaaat gttctttctg 900 ccattctgcc atatataaag accacatttg atatccaatt tcccaattcc aaatgtatta 960 gaatagaata gtctatatta tactctatac aattttatag tccctcccaa accaagtctt 1020 ttagatttaa caacagtaca cacacacttt tacacatcac a 1061 <210> 18 <211> 503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScGAL10 promotor <400> 18 gatccatcgc ttcgctgatt aattacccca gaaataaggc taaaaaacta atcgcattat 60 catcctatgg ttgttaattt gattcgttca tttgaaggtt tgtggggcca ggttactgcc 120 aatttttcct cttcataacc ataaaagcta gtattgtaga atctttattg ttcggaccag 180 tgcggcgcga ggcacatctg cgtttcagga acgcgaccgg tgaagacgag gacgcacgga 240 ggagagtctt ccttcggagg gctgtcaccc gctcggcggc ttctaatccg tacttcaata 300 tagcaatgag cagttaagcg tattactgaa agttccaaag agaaggtttt tttaggctaa 360 gataatgggg ctctttacat ttccacaaca tataagtaag attagatatg gatatgtata 420 tggatatgta tatggtggta atgccatgta atatgattat taaacttctt tgcgtccatc 480 caaaaaaaaa gtaagaattt ttg 503 <210> 19 <211> 704 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ScADH1 promotor <400> 19 atccttttgt tgtttccggg tgtacaatat ggacttcctc ttttctggca accaaaccca 60 tacatcggga ttcctataat accttcgttg gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga 120 gatatacaat agaacagata ccagacaaga cataatgggc taaacaagac tacaccattt 180 acactgcctc attgatggtg gtacataacg aactaatact gtagccctag acttgatagc 240 catcatcata tcgaagtttc actacccttt ttccatttgc catctattga agtaataata 300 ggcgcatgca acttcttttc tttttttttt ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca 360 tatccgcaat gacaaaaaaa tgatggaaga cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca 420 gcaccaacag atgtcgttgt tccagagctg atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt 480 tttccttcct tcattcacgc acactactct ctaatgagca acggtatacg gccttccttc 540 cagttacttg aatttgaaat aaaaaaagtt tgctgtcttg ctatcaagta taaatagacc 600 tgcaattatt aatcttttgt ttcctcgtca ttgttctcgt tccctttctt ccttgtttct 660 ttttctgcac aatatttcaa gctataccaa gcatacaatc aact 704 <210> 20 <211> 1357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KanMX cassette <400> 20 gacatggagg cccagaatac cctccttgac agtcttgacg tgcgcagctc aggggcatga 60 tgtgactgtc gcccgtacat ttagcccata catccccatg tataatcatt tgcatccata 120 cattttgatg gccgcacggc gcgaagcaaa aattacggct cctcgctgca gacctgcgag 180 cagggaaacg ctcccctcac agacgcgttg aattgtcccc acgccgcgcc cctgtagaga 240 aatataaaag gttaggattt gccactgagg ttcttctttc atatacttcc ttttaaaatc 300 ttgctaggat acagttctca catcacatcc gaacataaac aaccatgggt aaggaaaaga 360 ctcacgtttc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat 420 gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg 480 atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg 540 agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta 600 tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccggcaaa acagcattcc 660 aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc 720 tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc 780 gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg 840 acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag cttttgccat 900 tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg 960 aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg 1020 atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt 1080 ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg 1140 atgagttttt ctaatcagta ctgacaataa aaagattctt gttttcaaga acttgtcatt 1200 tgtatagttt ttttatattg tagttgttct attttaatca aatgttagcg tgatttatat 1260 tttttttcgc ctcgacatca tctgcccaga tgcgaagtta agtgcgcaga aagtaatatc 1320 atgcgtcaat cgtatgtgaa tgctggtcgc tatactg 1357

Claims (12)

1. 서열번호: 2 및 서열번호: 3의 프라이머세트에 의해 증폭된 서열번호: 14를 갖는 프로모터 KmGAL10; 및 서열번호: 1로 구성된 효모신호서열인 MFa와 리포터 유전자인 CalB14의 서열이 작동가능하게 연결된, 효모 균주용 발현 카세트로서,
   상기 효모 균주가 클루이베로마이세스 막시아누스 (K. marxianus) NCYC 2887인 것인,
   효모 균주용 발현 카세트.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 서열번호: 12 및 서열번호: 13의 프라이머세트에 의해 증폭된 G418 내성 유전자인 서열번호: 20을 갖는 KanMX의 서열이 작동가능하게 연결되어 있는 것인,
   효모 균주용 발현 카세트.
   
6. 삭제
7. 제1항의 발현 카세트를 포함하는, 효모 균주용 발현 벡터.
8. 제7항의 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.
9. 삭제
10. 삭제
11. (i) 제8항의 형질전환체를 배양하고; 및
    (ii) 상기 배양된 형질전환체로부터 유전자 발현물을 수득하는 것을 포함하는,
    유전자 발현 방법.
12. 제11항에 있어서, 락토오스가 유도원 (inducer)으로 사용되는 것인,
    유전자 발현 방법.

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