KR102303519B1

KR102303519B1 - 스위트형 효모의 배양방법 및 이를 분말화 하는 방법

Info

Publication number: KR102303519B1
Application number: KR1020190167224A
Authority: KR
Inventors: 정석태; 여수환; 최한석; 강지은; 김찬우; 전진아; 권예슬
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2021-09-24
Also published as: KR20210076303A

Abstract

스위트형 효모의 배양방법 및 이를 분말화 하는 방법에 관한 것으로, 글루코스(glucose) 함량이 3%(3000 mg/100 mL)이상인 스위트형 발효주를 제조하기 위하여 가장 적합한 효모를 선발하고, 상기 효모를 배양하기에 최적의 조건을 가진 천연배지를 당도 조절 및 누룩추출물을 첨가하여 제조하였다. 또한, 상기 스위트형 효모를 배양하기 위해 최적의 조건을 설정한 천연배지를 이용하여 효모를 배양한 후, 배양한 효모를 동결보호제를 이용하여 분말화 또는 제형화하는 방법을 제공한다.

Description

스위트형 효모의 배양방법 및 이를 분말화 하는 방법{Method for culturing sweet type yeast and powdering thereof}

스위트형 효모의 배양방법 및 이를 분말화 하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 알코올을 함유하고 있는 모든 음료를 술이라고 하는데, 정확한 정의로는 알코올을 1% 이상 함유하고 있는 모든 음료들을 일컫는다. 술을 알코올의 함유량뿐만 아니라 제조방법에 따라 크게 양조주, 혼성주, 증류주로 나뉜다. 양조주는 곡물이나 과실 또는 당분을 포함한 원료를 발효시켜서 약한 주정분을 얻는 술이며, 효모의 성질이나 당분의 함유량에 따라 구분된다. 주류를 제조함에 있어서 첨가물의 종류, 발효 조건 등을 확립하기 위한 노력은 아주 중요한 것인데, 그 이유는 술의 풍미는 시각, 청각, 후각, 촉각, 미각의 오감에 의해 정해지기 때문이다. 술은 원료와 미생물 등에 의해 크게 좌우되고 더군다나 같은 조건이라면 효모에 의해 많은 영향을 받을 수 있다.

양조주 중에서도 당도가 3% 이상인 것을 스위트형 술이라고도 부른다. 대한민국특허 10-2017-0108161은 액상 형태의 주류용 효모 배양배지 및 이의 제조방법에 관해 개시하면서 효모의 생존율, 장기 저장 가능성에 대해 말하고 있으나, 본 발명에서 제시하는 당도가 높은 스위트형 발효주의 제조에 적합한지에 대해서는 전혀 개시하고 있지 않다.

본 발명의 발명자들은 당도가 3% 이상인 즉 스위트형 발효주를 제조하기 위하여 효모, 배지 그리고 사용하기에 편리하고 생산하기에 유용한 제형화 방법까지 다양하게 연구하였다. 그 결과, 스위트형 발효주 제조에 가장 적합한 효모를 선정하고, 상기 효모 배양의 최적 배지, 및 상기 효모의 제형화 방법을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 목적은 스위트형 효모의 배양방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 목적은 상기 스위트형 효모를 분말화하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 목적은 상기 스위트형 효모를 분말화하는 방법을 통해 제조한 스위트형 분말 효모를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 목적은 상기 스위트형 분말 효모로 제조한 스위트형 발효주를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 당밀에 물을 가하여 당밀배지의 당도를 5 내지 20 브릭스로 조절하는 단계;

누룩을 40℃ 내지 60℃ 온도에서 4시간 내지 10시간 추출하여 누룩추출물을 제조하는 단계;

상기 누룩추출물을 상기 당도가 조절된 당밀배지에 첨가하는 단계;

상기 누룩추출물이 첨가된 당밀배지에 효모를 접종하는 단계; 및

상기 효모를 30시간 내지 60시간 동안 배양하는 단계; 를 포함하는 스위트형 효모의 배양방법을 제공한다.

본 발명은 상기 스위트형 효모의 배양방법으로 스위트형 효모를 제조하는 단계;

상기 효모에 동결보호제로서 스킴밀크(skim milk) 및 트렐할로즈(trehalose)를 첨가하는 단계; 및

상기 동결보호제를 첨가한 후 급속동결 또는 동결건조하는 단계; 를 포함하는 스위트형 효모를 분말화하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 스위트형 효모의 배양방법으로 스위트형 효모를 배양하는 단계;

상기 동결보호제를 첨가한 후 급속동결 또는 동결건조하는 단계; 를 포함하는 스위트형 효모를 분말화하는 방법을 통해 제조한 스위트형 분말 효모를 제공한다.

본 발명은 상기 스위트형 효모로 제조한 발효주로서 다음 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 발효주를 제공한다.

가용성 고형물: 13.0 ^oBrix 내지 17.0 ^oBrix;

효모수: 4.0x10⁷ cells/mL 내지 6.0 cells/mL;

pH: 3.5 내지 4.0;

총산: 0.45% 내지 0.53%;

아미노산도: 4.50 내지 5.00; 및

환원당: 45.0 mg/mL 내지 60.0 mg/mL.

본 발명은 스위트형 발효주 제조에 가장 적합한 효모를 제공함을 물론이고, 상기 효모를 배양하기 위한 최적의 천연배지 조건을 제공한다. 또한, 상기 배지를 통해 배양된 효모를 분말화 또는 제형화하는 방법을 통해 발효주를 제조할 때 편리하고 실용적으로 사용할 수 있게 하며, 높은 효모 생존률을 유지할 수 있으므로 스위트형 발효주를 생산하기에 효과적이다.

도 1은 실시예 1.3에서 제조한 발효주의 제조방법(표준제조공정)을 나타낸 것이며, 국세청 주류제조공정도이다.
도 2는 효모별로 발효주의 발효 경과를 중량감소량을 통해 나타낸 것이다.
도 3은 당밀 배지의 당도별로 48시간 동안 효모를 배양하였을 때 생균수를 측정하여 나타낸 것이다.
도 4는 시간에 따른 당도별 당밀 배지의 사균수를 측정하여 나타낸 것이다.
도 5는 시간에 따른 당도별 당밀 배지의 총균수를 측정하여 나타낸 것이다.
도 6은 누룩의 추출 온도에 따른 누룩추출물의 특성을 분석하기 위한 누룩추출물 시료의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 7은 상기 도 6의 누룩추출물 시료 제조과정을 사진으로 찍어서 나타낸 것이다.
도 8은 누룩의 추출 온도 및 시간에 따른 누룩추출물의 아미노산도를 측정하여 나타낸 것이다.
도 9는 누룩의 추출 온도 및 시간에 따른 누룩추출물의 pH를 측정하여 나타낸 것이다.
도 10은 누룩의 추출 온도 및 시간에 따른 누룩추출물의 산도를 측정하여 나타낸 것이다.
도 11은 스위트형 효모의 제형화 방법에서 동결보호제 첨가 농도에 따른 효모 생존율을 측정하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 스위트형 효모의 배양방법을 제공한다.

이때, 상기 스위트형 효모는, 스위트형 효모를 이용하여 발효주를 제조하였을 때, 제조한 발효주의 글루코스(glucose) 함량이 3%(3000 mg/100 mL) 이상이 되는 것으로 정의한다. 이때, 글루코스 함량은 4%(4000 mg/100 mL) 이상일 수도 있고, 바람직하게는 5%(5000 mg/100 mL) 이상일 수도 있고, 가장 바람직하게는 5.5%(5500 mg/100 mL) 이상일 수도 있다.

이하, 스위트형 효모의 배양방법을 구체적으로 설명한다.

먼저, 당밀에 물을 가하여 당밀배지의 당도를 5 내지 20 브릭스로 조절한다.

이때, 당밀배지의 당도는 8 내지 17 브릭스로 조절할수도 있고, 5 내지 15 브릭스로 조절할 수도 있고, 8 내지 12 브릭스로 조절할 수도 있고, 바람직하게는 10 브릭스로 조절할 수도 있다.

다음으로, 스위트형 발효주 제조용 효모에 적합한 효모를 대량생산하기 위한 천연 배지의 탄소원으로 사용할 누축추출물을 제조하기 위해, 누룩을 40℃ 내지 60℃ 온도에서 4시간 내지 10시간 추출하여 누룩추출물을 제조한다.

다음으로, 상기 누룩추출물을 상기 당도가 조절된 당밀배지에 첨가하고; 및 상기 누룩추출물이 첨가된 당밀배지에 효모를 접종한다.

이때, 상기 누룩추출물을 당밀배지에 첨가한 후 멸균기를 이용하여 100℃ 내지 140℃에서 10분 내지 20분 동안 멸균하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 멸균하는 단계 후에는 당밀배지의 온도를 20℃ 내지 40℃로 낮추는 단계를 포함할 수도 있다. 이때 온도는 30℃로 낮추는 것이 가장 바람직하다. 상기 당밀배지에 효모를 접종하는 단계는 미리 전배양한 효모를 총 중량의 0.5% 내지 1.5%로 접종하는 단계이다.

다음으로, 상기 효모를 30시간 내지 60시간 동안 배양하는 단계이다.

상기 효모의 배양 시간은 35시간 내지 55시간일 수 있고, 40시간 내지 50시간일 수 있고, 42시간 내지 55시간 일 수 있고, 45시간 내지 50시간일 수도 있고, 바람직하게는 48시간 동안 배양한다.

상기 효모는 발효주 제조시 사용하는 공지된 효모를 모두 사용할 수는 있으나, 바람직하게는 라빠리장(프랑스)(RP), Saccharomyces cerevisiae YM 29(S. cerevisiae YM 29, YM29), Saccharomyces cerevisiae YM 42(S. cerevisiae YM 42, YM42), Saccharomyces cerevisiae Y 263(S. cerevisiae Y 263, Y263), Pichia kluyveri(P. kluyveri, FT), Pichia kudriavzevii N77-4(P. kudriavzevii N77-4, N77-4), Hanseniaspora uvarum(H. uvarum N56-10, N56-10)를 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 Saccharomyces cerevisiae Y 263 또는 Saccharomyces cerevisiae YM 29를 사용할 수 있다.

상기 스위트형 효모의 제조에 사용하는 누룩추출물은 그 농도가 높을수록 배지의 생균수가 증가하므로 농도에 큰 제한은 없으나 농도를 5w/v% 내지 30w/v%로 설정하는 것이 적절하고, 15w/v% 내지 30w/v%일 수도 있고, 20w/v% 내지 30일수도 있다. 누룩추출물의 농도는 20w/v%만 첨가하여도 충분한 효모수를 나타낼 수 있다.

상기 누룩추출물의 아미노산도(mL)는 2.0 내지 4.0일 수 있고, 2.5 내지 3.5일 수 있고, 2.75 내지 3.25일 수 있다.

본 발명은 스위트형 효모를 분말화하는 방법을 제공한다.

이하, 스위트형 효모를 분말화하는 방법을 구체적으로 설명한다.

먼저, 상기와 같은 방법으로 스위트형 효모를 제조한다.

다음으로, 상기 스위트형 효모에 동결보호제로서 스킴밀크(skim milk) 및 트렐할로즈(trehalose)를 첨가한다.

이때, 상기 스킴밀크는 2w/v% 내지 10w/v%로 첨가할 수 있고, 3w/v% 내지 9w/v%로 첨가할 수도 있고, 4w/v% 내지 8w/v%로 첨가할 수도 있고, 4w/v% 내지 6w/v%으로 첨가할 수도 있고, 바람직하게는 5w/v%로 첨가할 수도 있다.

상기 트렐할로즈는 3w/v% 내지 10w/v%로 첨가할 수 있고, 4w/v% 내지 10w/v%로 첨가할 수도 있고, 5w/v% 내지 10w/v%로 첨가할 수도 있다. 트레할로즈 첨가량이 증가할수록 효모의 생존율이 높아지는데 5w/v%만 첨가하여도 충분한 생존율이 나타난다.

다음으로, 상기 동결보호제를 첨가한 후 급속동결 또는 동결건조한다.

상기 동결건조는 48시간 내지 80시간 동안 할 수 있고, 50시간 내지 78시간 동안 할 수도 있고, 55시간 내지 75시간 동안 할 수도 있고, 60시간 내지 75시간 동안 할 수도 있고, 65시간 내지 78시간 동안 할 수도 있고, 70시간 내지 75시간 동안 할 수도 있고, 72시간 동안 할 수도 있다.

이때 상기 동결건조 하기 전에 비교하여, 동결건조를 한 후의 효모 생존율이 80%인데, 바람직하게는 85% 이상일 수도 있고, 가장 88% 이상일 수도 있다.

본 발명은 상기 스위트형 효모의 배양방법에 따라 스위트형 효모를 제조하는 단계;

가용성 고형물: 13.0 ^oBrix 내지 17.0 ^oBrix;

효모수: 4.0x10⁷ cells/mL 내지 6.0 cells/mL;

pH: 3.5 내지 4.0;

총산: 0.45% 내지 0.53%;

아미노산도: 4.50 내지 5.00; 및

환원당: 45.0 mg/mL 내지 60.0 mg/mL.

이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 하기에 구체적으로 예시하여 설명한다. 다만, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명의 일부를 예시하는 것일 뿐, 본 발명에 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 스위트형 발효주 제조에 적합한 효모 선발

스위트형 발효주를 제조하기 위해 적합한 효모를 선발하기 위해 잔당 함량이 3% 이상의 발효력을 가진 효모를 선발하였다. 효모 선발은 하기 실시예 1.1 내지 1.4를 통해 실시하였다.

1.1. 전배양

분석에 앞서 효모를 전배양 하기 위하여 YPD 액체 배지 5 mL에 효모를 1 백금이(platinum loop) 접종하고, 30℃에서 배양하였다. 배양 시 shaking 조건(배양 20시간 내지 24시간 후에 2x10⁸ cells/mL 내지 4x10⁸ cells/mL)에서는 1일 동안 배양하고, standing 조건(배양 36시간 내지 48시간 후에 1x10⁸ cells/mL 내지 2x10⁸ cells/mL)에서는 2일 동안 배양하였다.

1.2. 1차 스크리닝

스위트형 발효주 제조에 적정한 효모를 선발하기 위하여 1차 스크리닝을 하였다. 1차스트리닝은 황국(Aspergillus oryzae) 발효주를 제조하여 발효 경과, 알코올 및 잔당(환원당)을 평가하였다. 황국 발효주는 황국에 물(150%)과 상기 실시예 1.1에서 전배양한 스크리닝 대상 효모를 첨가하여 발효시켜 제조하였다.

제조한 황국 발효주의 발효 경과, 알코올 및 잔당(환원당)을 평가하여 스위트형 발효주 제조에 적정한 효모 7종을 선발하였다. 선발된 효모 7종은 하기 표 1에 나타낸 국립농업과학원 발효자원실에서 분리한 효모 5종(S. cerevisiae YM 29, S. cerevisiae YM 42, S. cerevisiae Y 263, P. kudriavzevii N77-4, H. uvarum N56-10)과 시판 효모 2종(라빠리장(프랑스), Frootzen(프랑스) P. kluyveri)이다.

균주	균명 또는 상품명	약자
*S. cerevisiae*	라빠리장(프랑스)	RP
	S. cerevisiae YM 29	YM29
	S. cerevisiae YM 42	YM42
	S. cerevisiae Y 263	Y263
Non-S. cerevisiae	Frootzen(프랑스) P. kluyveri	FT
	P. kudriavzevii N77-4	N77-4
	H. uvarum N56-10	N56-10

1.3. 본 발효를 통한 발효주 제조

상기 실시예 1.2에서 선발된 효모를 이용하여 발효주 제조에 가장 적합한 효모 1종을 선발하기 위하여 하기와 같은 방법으로 발효주를 제조하였다. 발효주 제조는 표준 제조 공정(도 1)을 통해 제조하였으며, 제조된 발효주의 잔당(glucose) 및 관능 평가를 통해 스위트형 발효주 제조에 가장 적합한 효모 1종을 선발하였다. 발효주의 표준제조 공정은 도 1에 나타낸 바와 같으며 국세청에서 제공하는 주류 제조 공정도와 같다(쌀 수분함량 12.5%).

1.4. 스위트형 발효주 제조에 가장 적합한 효모의 선발

1.4.1. 발효 경과

상기 실시예 1.3.을 통해 제조한 발효주를 효모별로 중량감소량을 측정하여 발효 경과를 분석하였다. 구체적으로 효모의 중량감소량은 매일 1회 유사한 시간에 잘 저어주며 총 무게 편차가 2 g 미만일때까지 측정하여 무게 누적 감소율을 효모의 CO₂ 발생량으로 유추하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 효모별로 발효주의 중량감소량을 평가한 결과 중량감소량이 N56-10 > FT > YM42 > N77-4> RP > YM29 > Y263 순으로 나타났다. 즉 YM29 효모와 Y263 효모는 다른 효모들 보다 낮은 발효력을 보였으며, 상업용 효모인 RP보다 중량감소량이 낮게 나타났다. 이를 통해 낮은 발효력으로 당분을 남길 수 있는 효모는 YM29 및 Y263인 것으로 확인하였다.

1.4.2. 술덧의 일반 분석

효모별로 제조한 발효주 술덧의 당도(가용성 고형물), pH, 총산(%), 아미노산도(mL), 휘발산(ppm), 알코올(%), 환원당(mL/mL)을 측정하여 하기 표 2에 나타내었다.

균주	가용성 고형물 ( ^o Brix)	pH	총산(%)	아미노산도 (mL)	휘발산 (ppm)	알코올 (%)	환원당 (mg/mL)
RP	15.1	4.02	0.56	5.03	57.5	15.8	42.7
YM29	15.6	3.98	0.55	5.27	55.1	15.2	55.5
YM42	13.6	3.95	0.61	4.69	143.3	17.5	17.0
Y263	16.7	3.98	0.54	5.04	80.1	14.3	51.2
N77-4	14.9	3.91	0.68	6.76	105.6	10.3	42.0
N56-10	15.8	4.04	0.55	5.02	200.9	12.5	45.6
FT	15.4	3.87	0.81	6.84	231.0	14.3	46.9

그 결과, Y263의 당도(^oBrix)가 가장 높았고(16.7 ^oBrix), YM29(55.5 mg/mL) 및 Y263(51.2 mg/mL)의 환원당 함량이 다른 효모들보다 우세하게 높았으며 시판용 효모인 RP(42.7 mg/mL) 및 FT(46.9 mg/mL)보다 높았다. 또한, YM29 및 Y263이 휘발산 함량이 다른 효모들보다 낮았다.

1.4.3. 술덧의 효모수 분석

효모별로 제조한 발효주 술덧의 총균, 생균, 사균의 수 및 생존률을 측정하여 하기 표 3에 나타내었다. 이때 총균, 생균, 사균의 수 및 생존률은 Automated yeast cell counter(LUNA-2 YF, Logosbio, Anyang, Korea)로 측정하였다.

균주	총균	생균	사균	생존률(%)
RP	2.9	2.4	1.4	83.1
YM29	4.3	2.5	1.7	59.5
YM42	1.5	2.3	1.2	66.6
Y263	5.4	3.4	2.0	63.2
N77-4	2.6	2.4	0.3	88.6
N56-10	1.5	1.4	0.2	87.8
FT	2.1	1.9	0.2	88.5

(효모수: x10⁷ cells/mL)

그 결과, 시판용 효모인 RP의 효모 생존율은 83.1%로 매우 높은 반면, YM42, YM29, Y263은 59.5% 내지 66.6%의 낮은 생존율을 보였다. 효모는 주류 내 당을 영양원으로 하여 알코올 발효를 진행하는데, 효모의 생존율이 높으면 술덧 내 당분을 모두 사용하여 단맛이 적은 드라이한 맛을 내게된다. 따라서, 효모 생존율이 낮을 수록 술덧 내 당분이 잔존하여 스위트한 주류를 제조할 수 있다. 그러므로 YM42, YM29, Y263가 스위트형 발효주 제조시 단맛을 내기에 적절한 것을 알 수 있다.

1.4.4. 13% 알코올 조정 후 분석

발효주를 증류수로 알코올 13%가 되도록 희석한 후 pH를 측정하여 하기 표 4에 나타내었다. pH는 pH meter(orion 3 star, Thermo scientific Co.)로 실온에서 측정하였다. 총 산도는 일정량의 시료를 취하여 여과지로 검체 10 mL를 100 mL 삼각플라스크에 취한 다음, 0.5% 페놀프탈레인(phenolpthalein) 지시약을 2 내지 3 방울 떨어뜨리고 0.1 N NaOH로 적색이 될 때까지 중화 적정하였으며 소비된 용액의 양을 젖산(lactic acid, %)으로 환산하였다. 아미노산도는 여과지로 검체 10 mL에 0.5% 페놀프탈레인 지시약을 2 내지 3 방울 떨어뜨린다음, 0.1 N NaOH로 담홍색이 될 때까지 중화한 후, 여기에 중성 포르말린 용액 5 mL를 가하여 유리된 산을 0.1 N NaOH로 적정하여 담홍색이 될 때까지 소요된 0.1 N NaOH의 mL수로 표시하였다.

균주	가용성 고형물 ( ^o Brix)	pH	총산(%)	아미노산도 (mL)
RP	11.8	3.95	0.45	4.29
YM29	13.4	3.97	0.48	4.72
YM42	10.2	3.91	0.46	3.82
Y263	15.0	3.95	0.50	4.81
N77-4	14.9	3.88	0.68	5.71
N56-10	15.8	3.96	0.55	4.07
FT	10.2	3.79	0.61	5.43

그 결과, pH는 모든 효모에서 큰 차이를 보이지 않았다. 이때 알코올 함량이 높을수록 첨가되는 물의 함량이 많아지기 때문에 가용성 고형물, 총산, 아미노산도 함량이 낮아지는 것으로 판단된다. 가용성 고형물의 함량은 YM29 및 Y263에서 비교적 높은 것으로 확인되었다.

1.4.5. 유리당 분석

효모별로 제조한 발효주의 유리당으로 글리세롤(Glycerol), 프럭토스(Fructose), 글루코스(Glucose), 수크로스(Sucrose), 말토오스(Maltose)) 함량을 분석하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 유리당 분석을 위해서 HPLC(Waters e2695, Massachusetts, USA)를 이용하였으며 post column 방법을 사용하여 분석하였다. 유리당 분석용 컬럼은 supelco sil LC-NH₂(25 cm×4.6 mm, Pennsylvania, USA)를 사용하였으며 RID로 검출하였다. 이동상은 80% acetonitrile(Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, USA)을 이용하였으며, flow rate는 1mL/min, 컬럼 오븐의 온도는 25℃, injection volume 10 μL로 하였다. 시료는 여과(0.2 μm, Millipore Co., Cork, Ireland)후 사용하였다.

구분	효모별 발효주의 유리당 함량 (mg/100 mL)
구분	RP	YM29	YM42	Y263	N77-4	N56-10	FT
글리세롤	2111.29	3042.44	1299.50	3411.90	910.17	1685.99	955.69
프럭토스	42.51	49.89	17.00	46.39	25.70	0.00	12.03
글루코스	3169.24	5115.66	1315.10	5589.02	2080.54	140.91	969.72
수크로스	12.87	20.09	13.65	16.31	17.53	11.75	16.49
말토오스	0.00	89.33	0.00	59.00	100.56	0.00	43.75

그 결과, 글리세롤 함량이 상업용 효모인 RP(2111.29 mg/100 mL) 및 FT(955.69 mg/100 mL)에 비해 YM29 및 Y263가 각각 3042.44 mg/100 mL 및 3411.90 mg/100 mL으로 매우 높게 나왔다. 글루코스 함량은 상업용 효모인 RP(3169.24 mg/100 mL) 및 FT(969.72 mg/100 mL)에 비해 YM29 및 Y263가 각각 5155.66 mg/100 mL 및 5589.02 mg/100 mL으로 매우 높게 나왔다. 스위트형 발효주 제조를 위한 효모로 적합하기 위해서는 글루코스 함량이 3% (3000 mg/100 mL)이상이어야 하는데, YM29 및 Y263가 각각 5155.66 mg/100 mL 및 5589.02 mg/100 mL으로 3% 이상이므로 본 발명에 따른 스위트형 발효주 제조에 적합한 것으로 확인되었다.

1.4.6. 관능평가

효모별로 제조한 발효주의 관능평가를 위해 강도 평가 및 기호성 검사를 실시하였다. 관능평가는 총 15명의 패널(남자 6명, 여자 9명)이 한 시료당 5분씩, 총 35분 동안 조사를 진행하였으며, 통계프로그램을 이용하여 평균 비교 분석을 하였다. 먼저 강도평가를 위해 황색 강도, 향의 강도, 단맛, 신맛, 쓴맛, 감칠맛, 알코을 평가하였으며 7점이 척도이다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

구분	황색 강도	향의 강도	단맛	신맛	쓴맛	감칠맛	알코올
RP	4.4	5.0	4.1	4.0	4.4	4.5	5.1
YM29	4.1	4.1	4.9	4.3	4.3	3.8	4.1
TM42	3.5	3.5	3.4	5.0	4.6	3.7	4.6
Y263	5.1	4.3	5.2	4.5	4.7	4.7	4.7
N77-4	2.7	3.9	3.5	5.7	4.7	3.7	4.6
N56-10	2.6	3.3	2.8	4.7	5.3	3.5	4.4
FT	2.6	4.5	3.1	5.9	4.1	4.1	4.6

(척도: 7점)

그 결과, 특히 단맛에 대한 평가 있어서 YM29 및 Y263이 각각 4.9 및 5.2로 가장 높았고 시판용 효모 RP(4.1)보다 매우 높은 결과로 평가되었다. 또한 시료 효모 중 Y263은 신맛은 약하면서 감칠맛은 높은 것으로 평가된 것을 확인하였다.

다음으로, 기호성 검사를 위해 황색 기호도, 향의 기호성, 단맛, 신맛, 쓴맛, 감칠맛, 알코올, 바디감, 후미 및 전체 평가 결과를 하기 표 7에 나태내었으며, 평가 척도는 마찬가지로 7점이다.

구분	황색 기호도	향의 기호도	단맛	신맛	쓴맛	감칠맛	알코올	바디감	후미	전체 평가
RP	4.5	4.3	4.6	4.5	4.2	4.2	4.1	4.1	4.4	4.2
YM29	4.5	4.2	4.7	3.8	4.0	4.2	4.5	3.7	4.0	3.9
YM42	4.5	4.2	3.6	3.7	3.7	3.5	3.5	3.6	3.5	3.1
Y263	4.9	4.4	4.7	4.2	4.0	4.6	4.3	4.6	4.6	4.5
N77-4	3.9	3.4	3.3	3.2	3.4	3.7	3.6	3.6	3.9	3.2
N56-10	3.9	3.4	3.0	3.1	2.7	3.3	3.5	3.3	3.2	2.7
FT	4.1	3.9	3.6	3.0	3.8	4.1	4.1	3.3	4.1	3.3

그 결과, 마찬가지로 단맛 기호도 평가에서 YM29 및 Y263이 모두 4.7로 관능평가 대상 시료 중 가장 높은 점수를 기록하였다. 전체 평가에서는 YM29 및 Y263이 각각 3.9 및 4.5로 높은 점수를 기록하였는데, 특히 Y263은 4.5점을 기록하여 시판용 효모인 RP로 제조한 발효주주보다 높은 점수를 받았다.

상기 실시예 1을 통해 스위트형 발효주에 적합한 효모를 선발하기 위해 여러가지 분석을 실시한 결과 유기산, 유리아미노산, 향기 성분 등의 분석에서는 각 효모별로 큰 차이가 관찰되지 않았으므로, 알코올 생산성 및 글루코스 함량이 효모 선택에 중요한 요소임을 알 수 있었다. 따라서 스위트형 발효주 제조에 적합한 균주는 글루코스 함량이 3% (3000 mg/100 mL) 이상이고 관능평가에서 단맛 강도 및 단맛 기호성에서 매우 우수한 결과를 보인 효모 YM29 및 Y263이 가장 적절한 것으로 판단하였다. 또한, YM29 및 Y263 중에서는 글루코스 함량이 더 높고 관능평가 점수가 더 우수한 Y263가 더욱 적합할 것이다.

<실시예 2> 스위트형 효모의 최적 배지 선정

스위트형 효모의 생장에 최적화된 배지 조건을 설정하기 위하여 배지의 당도 및 배양 시간과 온도 조건에 따른 특성을 분석하였다. 실시예 2에서는 스위트형 효모로 사용할 수 있는 효모 중에서 상기 실시예 1를 통해 가장 적합한 효모로 확인된 Y263(S. cerevisiae Y 263)을 사용하였다. 또한 배지는 천연배지로서 탄소원으로 당밀과 효모의 영양분을 첨가할 수 있는 누룩추출물을 사용하여 제조하였다.

2.1. 당밀 첨가별 배지 조건 및 효모 Y263의 증식 특성 분석

2.1.1. 전배양

분석에 앞서 효모 Y263을 전배양 하기 위하여 YPD 액체 배지 50 mL에 효모를 2 내지 3 백금이(platinum loop) 접종하고, 30℃에서 액체 배양하였다. 배양 시 shaking 조건(배양 20시간 내지 24시간 후에 2x10⁸ cells/mL 내지 4x10⁸ cells/mL)에서는 1일 동안 배양하고, standing 조건(배양 36시간 내지 48시간 후에 1x10⁸ cells/mL 내지 2x10⁸ cells/mL)에서는 2일 동안 배양하였다.

2.1.2. 당밀 배지 제조

당밀 배지는 당밀에 물을 가하여 당도가 2, 5, 10, 20, 30 ^oBrix가 되도록 제조한 후 고압증기 멸균기를 이용하여 121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 그 다음 당밀배지의 온도를 30℃로 낮춘 후 효모를 배지 중량의 1%를 접종하여 30℃에서 5일 동안 배양하였다.

2.1.3. 당밀 배지의 조건별 일반 분석

상기 실시예 2.1.2.에서 제조한 각각 당도가 2, 5, 10, 20, 30 ^oBrix인 당밀 배지의 배양 시간별(12시간 내지 96시간) pH, 가용성고형물 함량(^oBrix), 환원당 함량(mg/mL)을 측정하여 하기 표 8 내지 표 10에 나타내었다.

하기 pH, 가용성고형물 함량, 환원당 함량은 주류분석규정(National Tax Service 2017)에 의하여 측정하였는데, pH는 pH 미터기 (Metrohm 691, Metrohm, Herisau, Switzerland)로 상온에서 측정을 하고, 굴절당도계(Atago Co., Tokyo, Japan)를 사용하였다. 환원당은 somogii 변법으로 분석하였는데, Somogyi A액 10 mL와 시료와 증류수를 더해 20 mL가 되도록 첨가한 다음 3분간 끓인 후 즉시 냉각한 다음 B액 10 mL, C액 10 mL를 가하여 잘 혼합한 다음 즉시 D액으로 적정하였다. 갈색이 없어지고 녹색이 될 때 1% 전분용액 (지시약)을 넣어 코발트색이 될 때를 종말점으로 하였다(채수규 외, 표준식품분석. 2000).

당밀배지 조건	시간별 당밀배지 pH
당밀배지 조건	12h	24h	36h	48h	72h	96h
2 ^o Brix	4.95	5.08	4.88	4.83	4.86	4.75
5 ^o Brix	5.21	5.15	5.02	5.02	4.99	5.07
10 ^o Brix	5.22	5.14	5.13	5.15	5.11	5.11
20 ^o Brix	5.15	5.15	5.17	5.18	5.20	5.21
30 ^o Brix	5.20	5.20	5.15	5.17	5.14	5.16

당밀배지 조건	시간별 당밀배지 가용성 고형물 함량 ( ^o Brix)
당밀배지 조건	12h	24h	36h	48h	72h	96h
2 ^o Brix	2.0	2.2	1.8	1.6	1.6	1.5
5 ^o Brix	5.2	5.3	4.4	3.7	3.5	3.0
10 ^o Brix	11.2	11.1	8.6	6.2	6.5	6.0
20 ^o Brix	23.8	22.1	21.7	20.6	18.2	16.6
30 ^o Brix	36.1	32.1	35.9	34.4	33.0	31.0

당밀배지 조건	시간별 당밀배지 환원당 (mg/mL)
당밀배지 조건	12h	24h	36h	48h	72h	96h
2 ^o Brix	3.71	4.17	2.70	2.04	1.52	1.10
5 ^o Brix	9.22	8.63	7.28	3.90	2.94	2.66
10 ^o Brix	18.39	13.66	10.73	5.06	6.59	4.78
20 ^o Brix	26.36	32.85	24.34	19.05	17.02	13.03
30 ^o Brix	63.92	54.92	59.20	52.47	32.91	15.52

상기 표 8 내지 표 10을 통해 시간이 지남에 따라 효모 증식으로 인해 가용성고형물 및 환원당 함량이 낮아지는 것을 확인하였다.

2.1.4. 당밀 배지의 조건별 효모수 분석

상기 실시예 2.1.2.에서 제조한 각각 당도가 2, 5, 10, 20, 30 ^oBrix인 당밀 배지의 배양 시간별(12시간 내지 96시간) 효모의 생균수, 사균수 및 총균수를 측정하여 도 3 내지 도 5에 나타내었다. 효모의 생균수, 사균수, 총균수는 Automated yeast cell counter(LUNA-2 YF, Logosbio, Anyang, Korea)로 측정하였다.

그 결과, 효모의 생균수는 2 ^oBrix에서 6.22 logCFU/mL, 5 ^oBrix에서 6.92 logCFU/mL, 10 ^oBrix에서 8.68 logCFU/mL, 20 ^oBrix에서 7.16 logCFU/mL, 30 ^oBrix에서 6.44 logCFU/mL로 확인되어 생균수가 10 ^oBrix에서 가장 높았고, 다음으로 20 ^oBrix, 10 ^oBrix, 30 ^oBrix, 5 ^oBrix 순으로 생균수가 많았다. 효모의 총균수는 10 ^oBrix 당밀배지에서 48시간 배양하였을 때 가장 많은 것으로 나타났고, 다음으로는 10 ^oBrix 당밀배지에서 12시간 배양하였을 때 총균수가 많은 것으로 나타냈다.

이를 통해, 스위트형 발효주를 제조하기 위한 효모 Y263의 최적 배지는 10 ^oBrix이고, 배양 시간은 약 48시간동안 배양하는 것이 가장 효과적인 것을 확인하였다.

2.2. 추출 온도 및 시간에 따른 누룩추출물의 특성 분석

2.2.1. 누룩추출물의 제조

본 발명에 따른 배지의 제조에 사용한 누룩추출물은 누룩(송학곡자) 300 g에 정제수 1500 g으로 5배 가수하여 제조하였다. 누룩추출물은 온도 및 시간이 증가할수록 전분으로 인해 걸쭉해지는 경향이 있기 때문에 가수량을 5배를 넣어 가수한 것이다. 그 다음 항온수조의 온도를 각각 20℃, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃로 설정하고 2시간 마다 샘플을 채취하여 분석하였다. 상기 분석과정을 도 6 및 도 7에 나타내었다.

2.2.2. 온도 및 시간에 따른 누룩추출물의 아미노산도, pH 및 산도 분석

온도 및 시간에 따른 누룩추출물의 당도 및 환원당 함량을 분석하기 위하여 상기 실시예 2.2.1에서 제조한 누룩추출물의 아미노산도, pH 및 산도를 분석하여 그 결과를 도 8 내지 도 10에 나타내었다.

추출 온도 및 시간에 따른 누룩추출물의 아미노산도 함량을 분석한 결과, 50℃ > 40℃ > 60℃ > 30℃ > 70℃ > 20℃ > 80℃ > 90℃ 순서대로 높았다(도 8). 구체적으로 50℃에서 단백질 효소 활성이 활발하여 아미노산도 함량이 가장 높았고, 80℃ 이상에서는 효소 불활성화로 인해 아미노산도 함량이 낮게 확인되었다. 추출 온도 및 시간에 따른 누룩추출물의 pH 및 산도를 분석한 결과, 추출 시간이 10시간 이상에서는 pH가 낮아지고, 산도가 증가하는 경향이 나타났다(도 9 및 도 10). 10시간 이상 누룩을 추출할 경우 미생물의 생육이 증가하는 것으로 판단되므로 장시간 추출하는 것은 배지 조건으로 좋지 않다. 따라서, 누룩을 추출하기 위한 최적 온도 및 시간은 pH 변화가 적고, 아미노산도가 가장 높은 8시간 동안 온도 50℃에서 추출하는 것으로 확인되었다.

2.3. 스위트형 효모의 최적 배지 선정

상기 실시예 2.1 및 실시예 2.2를 통해 효모 Y263를 이용하여 스위트형 발효주를 제조하기 위해서는 당밀 배지의 당도는 10 ^oBrix이고, 누룩추출물을 제조하기 위해서는 누룩을 50℃에서 8시간 추출하는 것이 가장 최적의 조건임을 확인하였다. 이에, 상기 조건을 적용하여 Y263을 배양하고, 그 효모수를 측정하였다. 또한, 누룩추출물의 농도에 따른 효모를 확인하기 위하여 누룩추출물의 농도를 각각 0w/v%, 5w/v%, 10w/v%, 20w/v%, 30w/v%로 하여 배양하고 그 결과를 도 11에 나타내었다. 누룩추출물을 포함하는 천연배지 제조는 Y263을 당밀 10 ^oBrix에 50℃, 8시간 추출한 누룩추출물을 농도가 0%, 5%, 10%, 20%, 30%로 첨가하여 제조한 후 고압증기멸균기를 이용하여 121℃에서 15분 동안 멸균하였다. 그 다음 천연배지의 온도를 30℃로 낮춘 후 전배양한 Y263을 배지 중량의 1%로 접종하여 30℃에서 2일 동안 shaking하여 배양하였다. 효모의 생균수 측정은 Automated yeast cell counter(LUNA-2 YF, Logosbio, Anyang, Korea)로 측정하였다.

상기 누룩추출물의 농도에 따른 천연배지에서 Y263을 배양하여 생균수를 측한 결과, 누룩추출물의 농도가 30% > 20% > 10% > 5% > 0% 순으로 생균수가 높게 나타났다. 즉, 누룩추출물의 농도가 높을수록 생균수가 높게 나타났는데, 누룩추출물을 20% 농도로만 첨가하여도 충분한 효모수가 확보되는 것으로 확인하였다.

<실시예 3> 스위트형 효모의 제형화

상기 실시예 1를 통해 선발된 스위트형 효모를 고체형으로 제형화하여 발효주를 제조할 때 사용에 편리하도록 하기 위해 스위트형 효모를 제형화 방법을 확립하기 위한 실시를 하였다. 시험에는 상기 실시예 1에서 선발된 효모 Y263을 사용하였으며, 동결건조에 따른 액체 종균의 건조 방식을 비교 검토함으로써 산업용 대량생산을 위한 건조 최적조건을 확립하고자 하였다.

3.1. 동결보호제 종류 및 농도에 따른 효모 생존율 분석

먼저, Y263을 상기 실시예 2에서 선정한 스위트용 발효주에 최적화된 천연배지에서 액체 배양하여 액체종균을 제조하였다. 그 다음, 동결보호제(안정제)로서 80℃ 내지 90℃의 5w/v% 스킴밀크(탈지분유, skim milk)와 0w/v%, 3w/v%, 5w/v%, 7w/v%, 10w/v%의 트레할로스(trehalose)를 물에 용해한 후 살균하여 1시간 동안 평형화시킨 후 -80℃에서 30시간 급속동결 후 동결건조 장치를 사용하여 48시간 동안 동결건조 하였다. 동결건조는 -40℃에 도달하면 약 3시간 유지한 후 -58℃ 이하, 진공 50 mTorr 이하에서 트랩냉동하였다. 이때, 배양하여 얻은 효모수를 측정하고, 동결건조 후의 효모 수를 측정하여 효모의 생존율을 분석하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 효모의 생균수는 Automated yeast cell counter(LUNA-2 YF, Logosbio, Anyang, Korea)로 측정하였다.

그 결과, 스킴밀크는 5%만 첨가하여도 생존율이 83.6%로 높았다. 트레할로스는 첨가한 농도가 높아질수록 효모 생존율이 높은 것으로 나타났다. 구체적으로 스킴밀트의 농도가 5%이고, 트레할로스의 농도가 5%, 7%, 10%일 때 효모 생존율이 모두 88.3%로 나타났으므로 트레할로스의 농도는 5%만 되어도 충분한 생존율이 나타나는 것을 알 수 있다. 따라서, 스위트형 발효주에 제조에 적합한 천연배지에서 배양한 효모를 동결건조하여 제형화하기 위해서는 동결보호제(안정제)로서 스킴밀크 5%와 트레할로스 5%를 첨가할 때 생존율이 높은 것으로 확인하였다.

이상, 본 발명을 바람직한 제조예, 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특성 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다.

Claims

1) 당밀에 물을 가하여 당밀배지의 당도를 8 내지 20 브릭스로 조절하는 단계;
2) 누룩을 40℃내지 60℃온도에서 4시간 내지 10시간 추출하여 누룩추출물을 제조하는 단계;
3) 상기 누룩추출물을 5%(w/v) 내지 30%(w/v)의 농도로, 상기 당도가 조절된 당밀배지에 첨가하고, 100 내지 140 ℃에서 10 내지 20분 동안 멸균하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)에서 얻어진 상기 누룩추출물이 첨가된 당밀배지에 효모를 배지 총중량의 0.5 내지 1.5%로 접종하여 45 내지 50 시간 동안 배양하여 액상 형태의 효모를 제조하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는, 스위트형 효모의 배양방법.

제1항에 있어서,
상기 효모는 사카로마이세스 속 (Saccharomyces sp.), 파키아 Pichia sp.) 및 한세니아스포라 속(Hanseniaspora sp.)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 스위트형 효모의 배양방법.

제2항에 있어서,
상기 효모는 Saccharomyces cerevisiae Y 263인 것을 특징으로 하는, 스위트형 효모의 배양방법.

제1항에 있어서,
상기 누룩추출물의 아미노산도 (mL)는 2.0 내지 4.0인 것을 특징으로 하는, 스위트형 효모의 배양방법.

1) 당밀에 물을 가하여 당밀배지의 당도를 8 내지 20 브릭스로 조절하는 단계;
2) 누룩을 40℃내지 60℃온도에서 4시간 내지 10시간 추출하여 누룩추출물을 제조하는 단계;
3) 상기 누룩추출물을 5%(w/v) 내지 30%(w/v)의 농도로, 상기 당도가 조절된 당밀배지에 첨가하고, 100 내지 140 ℃에서 10 내지 20분 동안 멸균하는 단계;
4) 상기 단계 3)에서 얻어진 상기 누룩추출물이 첨가된 당밀배지에 효모를 배지 총중량의 0.5 내지 1.5%로 접종하여 45 내지 50 시간 동안 배양하여 액상 형태의 효모를 제조하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 액상 형태의 효모에 동결보호제로서 스킴 밀크 및 트레할로즈를 첨가하고 동결건조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 스위트형 효모를 분말화하는 방법.

제5항에 있어서,
상기 스킴밀크는 2%(w/v) 내지 10%(w/v) 첨가하고, 상기 트레할로즈는 3%(w/v) 내지 10%(w/v) 첨가하는 것인, 스위트형 효모를 분말화하는 방법.

제5항에 있어서,
상기 동결건조는 48시간 내지 80시간 동안 하는 것인, 스위트형 효모를 분말화하는 방법.

제5항에 있어서,
상기 동결건조 하기 전 대비 한 후의 효모 생존율이 80% 이상인 것인, 스위트형 효모를 분말화하는 방법.

제5항의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는, 스위트형 분말 효모.

제9항에 스위트형 분말 효모를 이용하여 제조된 발효주로, 상기 발효주는,
가용성 고형물: 13.0 ^oBrix 내지 17.0 ^oBrix;
효모수: 4.0x10⁷ cells/mL 내지 6.0 cells/mL;
pH: 3.5 내지 4.0;
총산: 0.45% 내지 0.53%;
아미노산도: 4.50 내지 5.00; 및
환원당: 45.0 mg/mL 내지 60.0 mg/mL 인 것을 특징으로 하는, 스위트형 발효주.