KR102288736B1

KR102288736B1 - 카바페넴 내성 박테리아 검출용 프로브 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102288736B1
Application number: KR1020190061630A
Authority: KR
Inventors: 민선준; 박연준; 김주현
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단; 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2021-08-12
Also published as: KR20200015365A; US20210277246A1

Abstract

본 발명은 화학식1로 표시되는 화합물, 상기 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 프로브, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물을 포함하는 키트 및 항생제 내성 박테리아를 검출하는 방법에 관한 것으로, 카바페넴의 구조를 포함하고 링커 및 형광체로 구성된 화합물 프로브에 의하면 베타-락타마제 또는 카바페넴아제를 높은 민감도로 검출할 수 있어, 다양한 생화학적 연구들에 적용시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 카바페넴아제를 생성하는 항생제 내성 박테리아의 임상적 검출이 가능하고, 항생제 내성 박테리아 감염 질환의 분자적 진단과 목적 시료로부터 항생제 내성 박테리아를 높은 민감도로 분석할 수 있어, 체외 진단과 같은 의약 용도로 효과적으로 적용할 수 있다.

Description

카바페넴 내성 박테리아 검출용 프로브 및 이의 용도 {Probes for Detecting Carbapenem-Resistance Bacteria in a Sample and Uses Thereof}

본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 상기 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 프로브, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 상기 화합물을 포함하는 키트 및 항생제 내성 박테리아를 검출하는 방법에 관한 것이다.

항생제 내성 박테리아의 출현은 공중 위생에 대한 위협을 초래하였다. 내성의 가장 일반적인 기작들 중 하나가 항생제의 β-락탐 고리를 절단할 수 있는 특정 효소의 발현으로, 이는 상기 약물의 활성 손실을 일으킨다.

카바페넴 항생제는 β-락탐 고리를 가진 항생제로, 광범위한 항균 활성을 가지고 있으며, 베타락탐 분해효소에 안정성을 보여 1980년대 이후부터 심각한 박테리아 감염의 치료제로 사용해왔다.

그러나 카바페넴 항생제가 널리 사용됨에 따라, 최근에는 카바페넴 항생제 내성 박테리아의 출현이 증가되고 있으며, 이는 카바페넴 항생제에 내성을 보이는 그람 음성 박테리아가 생체 내에서 카바페넴 항생제 β-락탐 분해효소인 카바페넴아제 (carbapenemase)를 발현하기 때문인 것으로 밝혀졌다.

이러한 카바페넴아제는 Ambler 분류의 Class A에 속하는 가장 흔한 KPC를 비롯하여, Class B의 NDM,과 VIM, 그리고 상대적으로 희소한 클래스 D에 속하는 OXA-48등을 포함하여 각각 9종류, 6종류, 2종류가 알려져 있다.

상기 약물 내성 세균이 보유한 카바페넴아제의 종류의 따라 내성 정도가 다양하여 현재 카바페넴아제 생성 박테리아의 검출에 많은 어려움이 있다. 따라서 시간-소모적이고 비용이 많이 드는 상기 약물 내성 박테리아를 치료하는 차세대 항생제를 개발하기에 앞서, 카바페넴아제의 확산을 효과적으로 제어하고 적절히 대처하기 위해 항생제 내성 박테리아를 감별 할 수 있는 초기 검출 및 민감성 검출 방법의 개발이 필수적이다.

현재 카바페넴아제 발현 박테리아를 빠르고 효율적으로 검출하는 두 개의 접근방법들이 있다: (1) 표현형 분석 (2) 유전자 분석.

표현형 분석법은 검사하고자 하는 세균의 집락의 접종 방향으로, 시험세균에서 분비되는 카바페넴에 의해 지시세균인 E-Coli가 성장하는지를 관찰하는 개선된 호지 테스트 (modified Hodge Test) 방법과 특정 카바페넴아제 억제제를 추가하여 카바페넴아제 활성을 억제하는 원리를 이용한 이중 디스크 시너지 테스트 (double-disk synergy test)를 포함한다.

그러나 이 상기 방법은 특이성과 민감성이 부족하고, 균이 자라는 시간 (24-48시간)이 걸리기 때문에 패혈증과 같이 빠른 치료를 요구하는 환자의 항생제를 선택하는데 필요한 정보를 적시에 제공하기 어렵다.

유전자 분석 방법은 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 검출된다. 카바페넴아제의 유전자에 특이적인 primer를 사용하여 유전자의 양성 유무를 확인하는 이 방법은, 높은 정확도와 감도를 가지고 있지만, 비용이 높고, 미리 밝혀진 유전자형만 검출하는 제한성을 가지며, 숙련된 기술자를 필요로 하는 단점이 있다.

상기 단점들을 극복하기 위해 카바페넴아제를 발현하는 항생제 내성 박테리아의 존재를 보다 정확하고 효율적으로 검출할 수 있는 방법이 당업계에서 시급히 요구되고 있다.

최근, 세파로스포린 계열의 세포탁심을 골격 구조로 하고 BODIPY를 형광체로 사용하여 형광 기질을 세포탁심(cefotaxime) 내성 박테리아를 검출할 수 있는 프로브가 개발되었다(대한민국등록특허 제10-1829453호(2017.01.25.)). 또한, 카바페넴의 베타락탐 골격 구조와 하이드록시쿠마린 형광 물질을 결합한 CPC-1(중국공개특허 제106279178A호(2017.01.04))은 카바페넴아제 중에서 metallo beta-lactamase (VIM-1, NDM-1, IMP-1 등)을 검출할 수 있다. 하지만, CPC-1의 경우 카바페넴 부분과 형광물질이 직접적으로 연결되어 있는 구조를 가지며, 합성의 중요한 중간체 화합물을 합성하기 위하여 탄소의 수를 줄이는 반응을 포함함으로서 경제적이지 못하고, 메탈로-베타락탐아제만을 선택적으로 검출할 수 있기 때문에 높은 예민도와 신뢰도를 갖고 초기 단계의 카바페넴 내성 박테리아 검출에는 활용될 수 없다는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 카바페넴아제를 높은 민감도로 검출할 수 있어, 다양한 생화학적 연구들에 적용시킬 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 pH 지시인자-기반된 방법에서 가능하지 않은 항생제 내성 박테리아의 임상적 검출이 가능하고, 항생제 내성 박테리아 감염 질환의 분자적 진단과 목적 시료로부터 항생제 내성 박테리아를 높은 민감도로 분석할 수 있는 프로브를 개발하고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 카바페넴-링커-형광체의 라이브러리를 이용하여 카바페넴아제의 기질을 접촉시키면, 넓은 범위의 카바페넴 내성 박테리아를 높은 민감도로 검출할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 넓은 범위의 카바페넴 내성 박테리아를 높은 민감도로 검출할 수 있는 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 프로브를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 시약 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 감염 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 이용한 항생제 내성 박테리아를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 일 구현예로서, 상기 화학식 1에서 R은 수소원자 또는 C₁-C₂ 알킬기(alkyl)일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 화학식 1에서 L은 카베페넴 구조와 형광염료를 연결하는 링커(linker)의 기능을 수행하는 것으로서 치환 알릴기(allyl), 치환 아릴기(aryl), 치환 또는 비치환 카바메이트(carbamate), 치환 또는 비치환 싸이오카바메이트(thiocarbamate), 치환 또는 비치환 아민기(amine), 또는 치환 또는 비치환 피리디늄(pyridinium)일 수 있고, 보다 바람직하게는 -(CH=CH)_nCH₂-, -(C≡C)_nCH₂-, -(CH=CH)_nCH₂-O-Ar-CH₂-, -(C≡C)_nCH₂-O-Ar-CH₂-, -(CH=CH)_nCH₂-S-Ar-CH₂-, -(C≡C)_nCH₂-S-Ar-CH₂-, -(CH=CH)_nCH₂-NH-Ar-CH₂-, -(C≡C)_nCH₂-NH-Ar-CH₂-, -(CH=CH)_nCH₂-OCON-, -(C≡C)_nCH₂-OCON-, -(CH=CH)_nCH₂-OCSN-, -(C≡C)_nCH₂-OCSN-,

, 및

로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 이때 상기 n은 0, 1, 2, 3, 또는 4일 수 있고, 상기 Ar은

,

, 및

로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 상기

,

, 및

에서 Y는 O, NH, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 형광염료는 쿠마린 (coumarin), 움벨리페론 (umbeliferone), 아미노쿠마린 (aminocoumarin), 플루오레세인 (fluorescene), 레소루핀 (resorufin), 카복시로다민(carboxyrodamin), 로다민 (rhodamin), 나프탈이미드 (naphthal), 시아닌 (cyanine), 루시페린 (luciferin), CR110, EvoBlue, Alexa Fluor, Flamma, Indocyanine green, 2-((E)-2-((E)-2-(4-(2-carboxyethyl)phenoxy)-3-((E)-2-(3,3-dimethyl5-sulfonato-1-(3-(tri-methylammonio)-propyl)indolin-2-ylidene)ethylidene) cyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3dimethyl-1-(3-(trimethylammonio)-propyl)-3 H -indolium-5-sulfonate disodium bromide, 및 BODIPY로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 EvoBlue는 EvoBlue 10 또는 EvoBlue 30일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 Alexa Fluor는 Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, 및 Alexa Fluor 750, Alexa Fluor 790로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 Flamma는 Flamma496, Flamma507, Flamma 530, Flamma 552, Flamma 560, Flamma 575, Flamma 581, Flamma 648, Flamma 675, Flamma 749, Flamma 774, 및 Flamma 775로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 BODIPY는 피리딜 BODIPY, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY 581/591,BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 화학식 1의 Z(형광염료) 및 L(링커)는 β-락타마제(β-lactamases) 또는 카바페넴아제(carbapenemase)에 의해 카바페넴 구조체(β-락탐 고리)에서 분리되어 형광을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물는 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물일 수 있다:

[화합물 OMCL01202]

;

[화합물 OMCL01203]

;

[화합물 OMCL01204]

;

[화합물 OMCL01205]

;

[화합물 OMCL01206]

;

[화합물 OMCL01207]

;

[화합물 OMCL01208]

; 및

[화합물 OMCL01209]

상기에서 TBS는 t-Butyldimethylsilyl이고, PNB는 PNB : p-nitrobenzyl 이다.

또한, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 프로브를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 시약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 감염 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 항생제 내성 박테리아는 카바페넴(carbapenem)계 항생제에 저항력을 가진 것일 수 있으며, 상기 저항력은 박테리아의 β-락타마제(β-lactamases) 또는 카바페넴아제(carbapenemase) 발현능에 의해 획득되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 카바페넴계 항생제는 β-락탐 고리 구조를 가진 것이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 엘르타페넴(ertapenem), 및 도리페넴(doripenem)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항생제일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출 방법을 제공한다:

(a) 상기 화합물을 시료와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 시료에서 발생하는 형광의 세기를 검출하는 단계.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 방법이 검출하고자 하는 것은 항생제 중에서도 카바페넴계 항생제에 저항력을 가진 박테리아의 존부(存否)인 것으로서, 상기 시료는 카바페넴 내성 박테리아 감염으로 의심되는 환자의 생물학적 시료일 수 있으며, 상기 생물학적 시료는 세포, 세포 배양액, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액, 소변, 대변, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 카바페넴 내성 박테리아 감염으로 의심되는 환자는 피부 및 연조직 감염, 발열성 호중구감소증, 기도관 감염, 상기도관 감염, 세기관지염, 폐렴(병원성), 폐혈증, 뇌수막염, 수술 중 감염, 이질, 전염성 부비동염, 복막염, 탄저병, 라임병, 골수염, 레지오넬라증, 브루셀라병(Brucellosis), 급성 장염, 공동체-획득성 호흡 감염, 트라코마, 신생아의 봉입체결막염, 보눌리눔 식중독, 급성식중독, 설사, 출혈성 대장염, 기관지염, 위궤양, 심장 내막염, 살모넬라증, 위장염, 적리, 기회 감염, 중이염, 부비동염, 인두염, 여드름, 모공성 각화증(keratosis pilaris), 주사비, 할리퀸 어린선, 색소성 건피증, 각화증, 습진, 및 뇌사성 근막염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 질병으로 진단받은 환자일 수 있다.

또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다:

i) 하기 화학식 2로 표시되는 화합물로부터 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

ii) 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물에 형광 염료를 혼합하여 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

iii) 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 N-메틸-2-피롤리디논과 다이메틸 폼아마이드의 혼합 용액에 녹인 후 불화수소 암모늄을 첨가하고 상온에서 교반한 다음 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결하여 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 수득하는 단계; 및

iv) 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 테트라하이드로퓨란 수용액에 녹인 후 교반하여 혼합물을 여과시킨 후 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 수득하는 단계.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

상기 식에서 X는 -(CH=CH)_nCH₂OH (n = 0 ~ 4), 또는 프로파질 알콜이고,

TBS는 t-Butyldimethylsilyl이고, PNB는 PNB : p-nitrobenzyl 이고,

R; L 및 Z는 앞서 기재한 바와 같음.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 i) 단계의 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기 화합물 2이고, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 하기 화합물 2 및 화합물 3을 반응시켜 제조되는 하기 화합물 6 이거나; 또는

하기 화합물 2 및 화합물 5를 반응시켜 제조되는 하기 화합물 7일 수 있다:

[화합물 2]

;

[화합물 3]

;

[화합물 5]

;

[화합물 6]

;

[화합물 7]

상기에서 TBS는 t-Butyldimethylsilyl이고, PNB는 PNB : p-nitrobenzyl 임.

더욱 구체적인 제조방법은 실시예에 자세하게 기재되어 있다.

본 발명에 따른 화합물 및 상기 화합물을 포함하는 프로브는 카바페넴아제를 높은 민감도로 검출할 수 있어, 다양한 생화학적 연구들에 적용시킬 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 표현형 분석 방법에서 가능하지 않은 항생제 내성 박테리아의 임상적 검출이 가능하고, 항생제 내성 박테리아 감염 질환의 분자적 진단과 목적 시료로부터 항생제 내성 박테리아를 높은 민감도로 분석할 수 있어, 체외 진단과 같은 의약 용도로 효과적으로 적용할 수 있는 효과가 있다.

본 발명에서는 화학식 1로 표시되는 카바페넴-링커-형광체의 라이브러리를 이용하여 카바페넴아제의 기질을 접촉시키면, 넓은 범위의 카바페넴 내성 박테리아를 높은 민감도로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 식에서,

R은 수소원자; 또는 C₁-C₂ 알킬기(alkyl)이고;

L은 치환 알릴기(allyl); 치환 아릴기(aryl);또는 치환 또는 비치환 카바메이트(carbamate); 또는 치환 또는 비치환 싸이오카바메이트(thiocarbamate); 치환 또는 비치환 아민기(amine); 치환 또는 비치환 피리디늄(pyridinium)이고;

Z는 형광염료이다.

본 발명에 있어서, 상기 L은 -(CH=CH)_nCH₂-, -(C≡C)_nCH₂-, -(CH=CH)_nCH₂-O-Ar-CH₂-, -(C≡C)_nCH₂-O-Ar-CH₂-, -(CH=CH)_nCH₂-S-Ar-CH₂-, -(C≡C)_nCH₂-S-Ar-CH₂-, -(CH=CH)_nCH₂-NH-Ar-CH₂-, -(C≡C)_nCH₂-NH-Ar-CH₂-, ,-(CH=CH)_nCH₂-OCON-, -(C≡C)_nCH₂-OCON-, -(CH=CH)_nCH₂-OCSN-, -(C≡C)_nCH₂-OCSN-,

, 및

(Ar =

, n=0 ~4) 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, 상기 L은 링커(linker)로서, 화학식 I의 코어구조(core-structure)와 Z부위를 결합 또는 연결시켜준다.

본 발명에 있어서, 상기 형광염료는 쿠마린 (coumarin), 움벨리페론 (umbeliferone), 아미노쿠마린 (aminocoumarin), 플루오레세인 (fluorescene), 레소루핀 (resorufin), 카복시로다민(carboxyrodamin), 로다민 (rhodamin), 나프탈이미드 (naphthal), 시아닌 (cyanine), 루시페린 (luciferin), CR110, EvoBlue, Alexa Fluor, Flamma, Indocyanine green, 2-(( E )-2-(( E )-2-(4-(2-carboxyethyl)phenoxy)-3-(( E )-2-(3,3-dimethyl5-sulfonato-1-(3-(tri-methyl ammonio)-propyl)indolin-2-ylidene)ethylidene)cyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3dimethyl-1-(3-(trimethyl ammonio)-propyl)-3 H -indolium-5-sulfonate disodium bromide, 및 BODIPY로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 상기 형광염료는 β-락탐 고리 구조와 분리되는 경우 방출파장이 형광의 영역을 갖는 것이라면 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 EvoBlue는 EvoBlue 10 또는 EvoBlue 30일 수 있으며, 상기 Alexa Fluor는 Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, 및 Alexa Fluor 750, Alexa Fluor 790로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나일 수 있고, 상기 Flamma는 Flamma496, Flamma507, Flamma 530, Flamma 552, Flamma 560, Flamma 575, Flamma 581, Flamma 648, Flamma 675, Flamma 749, Flamma 774, 및 Flamma 775로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 상기 BODIPY는 피리딜 BODIPY, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY 581/591,BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서, "형광염료"란 형광성 모이어티(fluorescent moiety)를 의미하며, 상기 형광성 모이어티는 화학식 1로부터 분리됨에 따라 특정 주파수의 광(예컨대, UV 광)을 흡수하여 형광 시그널을 발생시키는 형광 분자, 이의 유도체, 또는 그 접합체(conjugate)를 의미할 수 있다. 예를 들면, 상기 형광성 모이어티는 퀀칭 염료(quencher dye)일 수 있다. 형광성 모이어티의 비제한적인 예로는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인 및 레소루핀 같은 페놀성 염료(dyes); 방향성 아민, 및 로다민 같은 다른 화합물들 등이 있다. 또한, 예를 들면, 상기 형광성 모이어티는 쿠마린 및 이와 관련된 염료; 플루오레세인, 로돌, 및 로다민 같은 크산텐(xanthene) 염료; 레소루핀; 시아닌 염료; 바이메인 염료(bimanes); 아크리딘; 이소인돌; 단실(dansyl) 염료; 루미놀 및 이소루미놀 유도체 같은 아미노프탈성 히드라지드(aminophthalic hydrazides); 아미노프탈 이미드; 아미노나프탈이미드; 아미노벤조퓨란; 아미노퀴놀린; 디시아노히드로퀴논; BODIPY; 및 유로퓸 및 터븀 복합체 및 이와 관련된 화합물을 포함할 수 있다.

또한, 상기 형광성 모이어티는 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있으며, 또한 스트렙타비딘, 바이오틴, 팔로이딘, 아민, 아자이드, 또는 이오도아세트아미드 컨쥬게이트를 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 형광성 모이어티는 상기 링커를 통해 카바페넴계 화합물에 결합된 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 형광성 모이어티는 링커(L)와 함께 β-락타마제(β-lactamases) 또는 카바페넴아제(carbapenemase)에 의해 상기 화학식 1로부터 분리되어 형광을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 Z는 L과 함께 β-락타마제 또는 카바페넴아제에 의해 상기 화학식 1로부터 분리되어 형광을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 하기 카바페넴-링커(붉은 사각형 부분)-형광체의 라이브러리를 이용한 카바페넴아제의 기질을 이용하여 넓은 범위의 카바페넴 내성 박테리아 검출을 가능하게 할 수 있다.

삭제

본 발명은 다른 관점에서, 상기 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 프로브에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 항생제는 카바페넴(carbapenem)계 항생제인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 항생제 내성 박테리아는 카바페넴아제(carbapenemase)를 발현하는 박테리아인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 카바페넴계 항생제는 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 엘르타페넴(ertapenem), 및 도리페넴(doripenem)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

하기 화학식은 이미페넴, 메로페넴, 도리페넴 및 엘르타페넴의 화학구조식을 나타낸 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 시약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 감염 진단용 키트에 관한 것이다.

일 양상에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물로부터 발생되는 형광은 시료 내 ESBL, 자세히는 카바페넴아제 및/또는 이를 발현하는 박테리아의 존재에 대한 지표가 될 수 있으며, 이를 통해 상기 박테리아에 의해 유발되는 감염 질환의 진단에 이용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 박테리아 감염은 카바페넴아제(carbapenemase)를 발현하는 박테리아 감염인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 카바페넴아제를 발현하는 박테리아 감염에 의한 질환은 피부 및 연조직 감염, 발열성 호중구감소증, 기도관 감염, 상기도관 감염, 세기관지염, 폐렴(병원성), 폐혈증, 뇌수막염, 수술 중 감염, 이질, 전염성 부비동염, 복막염, 탄저병, 라임병, 골수염, 레지오넬라증, 브루셀라병(Brucellosis), 급성 장염, 공동체-획득성 호흡 감염, 트라코마, 신생아의 봉입체결막염, 보눌리눔 식중독, 급성식중독, 설사, 출혈성 대장염, 기관지염, 위궤양, 심장 내막염, 살모넬라증, 위장염, 적리, 기회 감염, 중이염, 부비동염, 인두염, 여드름, 모공성 각화증(keratosis pilaris), 주사비, 할리퀸 어린선, 색소성 건피증, 각화증, 습진 및 뇌사성 근막염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, "감염 질환(infectious disease)"은 대상자(subject) 또는 환자 내에 또는 이와 접촉하는 생물체(감염성 제제)의 존재와 관계되는 질환 또는 상태, 특히 "박테리아 감염 질환(bacterial infectious disease)"을 의미할 수 있다. 예를 들어, "카바페넴계 항생제 내성 박테리아 감염 질환"은 카바페넴계 항생제들에 의해 효과적으로 치료되지 않는 항생제 내성 박테리아 감염 질환을 의미할 수 있다.

본 발명에서, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)(예컨대, 감염 질환 또는 상태의 동정, 상기 질환의 치료에 대한 반응성 및 이의 효과 판단)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함할 수 있다. 상기 개체는 박테리아 감염 질환이 의심되는 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 화합물을 목적 시료와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 목적 시료에서 상기 화합물로부터 발생된 형광을 검출하는 단계를 포함하는 항생제 내성 박테리아를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 시료는 세포 배양액, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액, 소변 대변, 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 접촉시키는 단계는 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물에 전처리된 상기 생물학적 시료 또는 목적 시료를 첨가하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 시료의 전처리는 통상의 당업자가 목적하는 용도에 맞게 적절하게 수행할 수 있다.

목적 시료와 접촉(반응)시켜 상기 화학식 1의 화합물의 가수분해에 따른 형광 방출을 측정함으로써 최종적으로 발광의 세기를 분석하여 항생제 내성 박테리아에 의한 감염 질환을 진단하거나 항생제 내성 박테리아를 검출할 수 있다. 상기 형광 시그널 분석은 당 업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시될 수 있으며, 당 업계에서 이용 가능한 적합한 장치(apparatus)에 의해 판독되고 프로세싱 된다. 예를 들어, 형광 분석기, 마이크로플레이트 판독기, 로봇 장치들을 이용한 자동화 프로세싱, 레이저 스캐닝 시스템을 포함하는 당업계에 알려진 프로토콜 및 과정들이 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 항생제 내성 박테리아 검출을 위한 프로브의 제조

1.1. 4-나이트로벤질 (R)-4-((2R,3S)-3-((R)-1-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)에틸)-4-옥소아제티딘-2-일)-2-다이아조-3-옥소펜타노에이트(1) 제조

[화합물 1]

반응물질인 1-하이드록시에틸 아제티딘-2-온 화합물(5.00 g, 10.8 mmol)을 질소 기체하에서 무수 다이메틸폼아마이드(42.0 mL)에 녹이고, 이미다졸(4.42 g, 64.8 mmol)과 tert-부틸다이메틸실릴 클로라이드(7.72 g, 51.2 mmol)를 0 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물은 상온에서 12시간 교반 시켰다. 상기 반응은 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 그 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 1:2(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 1(6.16 g, 95%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.26 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.89 (s, 1H), 5.37 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 5.33 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 4.21-4.16 (m, 1H), 3.90-3.89 (m, 2H), 2.96 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 1.19 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 1.17 (d, J = 5.9 Hz, 3H), 0.85 (s, 9H), 0.05 (d, J = 4.9 Hz, 6H).

1.2. 4-나이트로벤질 (4R,5R,6S)-6-((R)-1-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)에틸)-4-메틸-7-옥소??3-(((트리플루오로메틸)설포닐)옥시)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵탄-2-카복실레이트carboxylate(2) 제조

[화합물 2]

밀봉관에 다이아조메탄(100 mg, 0.198 mmol)을 다이클로로메탄(0.600 mL)에 녹인 후 로듐 아세테이트 이합체(1 mg, 0.002 mmol)와 염화 아연(1mg, 0.006 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 60 ℃로 가온시킨 후 1시간 동안 교반하였다. 케톤 중간체의 혼합물을 ??78 ℃ 까지 서서히 냉각시킨 후, 2,2,6,6-테트라메틸 피페리딘(40 μL, 0.238 mmol)과 N,N-다이아이소프로필에틸아민(17 μL, 0.100 mmol)을 첨가하고 트라이플루오로메탄설포닉 무수물(37 μL, 1.68 mmol)을 5분간 한 방울씩 첨가하였다. 1시간 동안 교반 후, 혼합물을 상온까지 가온시킨 후, 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(다이클로로메탄)으로 정제하여 흰색 분말의 화합물 2(117 mg, 97%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.42 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 5.35 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 4.34 (dd, J = 3.4, 11.0 Hz, 1H), 4.30-4.26 (m, 1H), 3.41-3.29 (m, 2H), 1.29 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 1.22 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 0.87 (s, 9H), 0.07 (d, J = 3.5 Hz, 6H).

<케톤 중간체>

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.23 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.31 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 4.71 (s, 1H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.24 (dd, J = 2.4, 7.9 Hz, 1H), 3.22 (dd, J = 2.4, 5.4 Hz, 1H), 2.82-2.74 (m, 1H), 1.26 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.20 (d, J = 7.8 Hz, 3H), 0.87 (s, 9H), 0.08 (d, J = 5.7 Hz, 6H).

1.3. (트라이부틸스탄닐)메탄올(3) 제조

[화합물 3]

다이아이소프로필아민(2.9 mL, 20.6 mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란(86 mL)에 녹인 후 n-부틸리튬(1.6M in hexane, 12.9 mL, 20.6 mmol)을 ??78 ℃에서 천천히 첨가하였다. 5분간 반응 후, 트라이부틸틴 하이드라이드(5 g, 17.2 mmol)을 30분간 한 방울씩 첨가하였다. 혼합물은 20분간 교반 후, 파라폼알데하이드(722 mg, 24.1 mmol)을 첨가하고, 상온까지 가온시킨 후 12시간 교반하였다. 상기 반응은 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후, 다이에틸 에터와 수용액으로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4로 건조 시킨 후 여과하였고, 그 여과물을 진공하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(다이에틸 에터/n-헥산, 1:3(v/v))로 정제하여 무색의 오일 화합물 3(3.05 g, 55%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.01 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 4.00 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 1.55-1.47 (m, 6H), 1.35-1.25 (m, 6H), 0.93-0.67 (m, 15H).

1.4. tert-부틸다이메틸(프로프-2-아인-1-일옥시)실레인(4) 제조

[화합물 4]

프로파질 알코올(1.00 g, 17.8 mmol)을 다이클로로메탄(42.0 mL)에 녹인 후 이미다졸(1.82 g, 26.8 mmol)과 tert-부틸다이메틸실릴 클로라이드(4.03 g, 26.8 mmol)를 0 ℃에서 첨가하였다. 상기 반응은 상온으로 가온시킨 후 12시간 교반하였다. 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후 다이에틸 에터와 수용액으로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 사용하여 건조 시킨 후 여과하였고, 그 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(다이에틸 에터/n-헥산, 1:30(v/v))로 정제하여 무색의 오일 화합물 4(2.10 g, 69%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.30 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 2.38 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.12 (s, 6H).

1.5. (E)-3-(트라이부틸스탄닐)프로프-2-엔-1-올(5) 제조

[화합물 5]

실릴 에터 화합물 4(1.00 g, 5.87 mmol)에 아조비스아이소부티로나이트릴(289 mg, 1.76 mmol)과 트라이부틸틴 하이드라이드(1.9 mL, 7.05 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응은 80 ℃ 까지 가온시킨 후 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응물을 0 ℃ 까지 냉각시킨 후, 무수 테트라하이드로퓨란(11.7 mL)에 녹인 후, 테트라하이드로퓨란에 녹아있는, 1.0 M 테트라부틸 암모늄 플루오르화 용액(11.7 mL, 11.7 mmol)을 첨가한 후 2시간 동안 교반하였다. 반응물은 염화암모늄 수용액을 이용하여 종결시킨 후 다이에틸 에터와 수용액으로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 사용하여 건조 시킨 후 여과하였고, 그 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(다이에틸에터/n-헥산, 1:10(v/v))로 정제하여 무색의 오일 화합물 5(1.34 g, 66%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.25-6.08 (m, 2H), 4.15 (bs, 2H), 1.50-1.44 (m, 6H), 1.32-1.26 (m, 6H), 0.90-0.85 (m, 15H).

1.6. 4-나이트로벤질 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)에틸)-3- (하이드록시메틸-4-메틸-7-옥소-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵탄-2-카복실레이트(6) 제조

[화합물 6]

트라이(2-퓨릴)포스핀(11.4 mg, 0.049 mmol)과 트리스(다이벤질리덴아세톤)다이팔라듐-클로로폼 착물(25.4 mg, 0.025 mmol), 염화 아연(22.4 mg, 0.164 mmol)을 무수 헥사메틸포스포릭 트리아마이드(0.5 mL)에 녹인 후, 혼합물에 헥사메틸포스포릭 트리아마이드(0.1 mL)에 녹인 트리플레이트 화합물 2(100 mg, 0.164 mmol)와 스테네인 화합물 3(211 mg, 0.656 mmol)을 70 ℃에서 천천히 첨가하였다. 2시간 교반 후 5 ℃ 까지 냉각시키고, 염화 암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시켰다. 혼합물은 에틸 아세테이트와 수용액을 이용하여 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 사용하여 건조 시킨 후 여과하였고, 그 여과물은 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 1:8 to 1:2(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 6(42.0 mg, 52%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.46 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 4.54 (dd, J = 6.5, 14.8 Hz, 1H), 4.39 (dd, J = 5.6, 14.8 Hz, 1H), 4.27-4.22 (m, 2H), 3.28-3.22 (m, 2H), 3.08-3.05 (m, 1H), 1.24 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.21 (d, J = 7.4 Hz, 3H), 0.86 (s, 9H), 0.07 (d, J = 4.4 Hz, 6H).

1.7. 4-나이트로벤질 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)에틸)-3-((E)- 3-하이드록시프로프-1-엔-1-일)-4-메틸-7-옥소-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵탄-2-카복실레이트(7) 제조

[화합물 7]

트라이(2-퓨릴)포스핀(19.1 mg, 0.082 mmol)과 트리스(다이벤질리덴아세톤)다이팔라듐-클로로폼 착물(42.5 mg, 0.041 mmol), 염화 아연(10.9 mg, 0.182 mmol)을 무수 N-메틸-2-피롤리디논(10.3 mL)에 녹인 후, 트리플레이트 화합물 2(500 mg, 0.821 mmol)와 스테네인 화합물 5(428 mg, 1.232 mmol)을 첨가하고 상온에서 12시간 교반했다. 교반 후 5 ℃ 까지 냉각시키고, 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시켰다. 혼합물은 에틸 아세테이트와 수용액을 이용하여 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 사용하여 건조 시킨 후 여과하였고, 그 여과물의 용매를 진공 하에서 제거하였다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 1:4 to 1:2(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 7(315 mg, 74%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 16.3 Hz, 1H), 6.20 (dt, J = 5.5, 16.2 Hz, 1H), 5.44 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 4.32 (bs, 2H), 4.29-4.23 (m, 1H), 4.20 (dd, J = 2.7, 9.4 Hz, 1H), 3.41-3.33 (m, 1H), 3.23 (dd, J = 2.7, 5.6 Hz, 1H), 1.27 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.22 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 0.86 (s, 9H), 0.08 (d, J = 4. 9 Hz, 6H).

1.8. 4-나이트로벤질 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)에틸)-4-메틸- 7-옥소-3-((E)-3-((2-옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)프로프-1-엔-1-일)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (8) 제조

[화합물 8]

알코올 화합물 7(100 mg, 0.194 mmol)을 톨루엔(3.9 mL)에 녹인 후 움벨리페론(34.6 mg, 0.213 mmol)과 트라이페닐포스핀(68.0 mg, 0.233 mmol)을 0 ℃에서 첨가하였다. 2분간 교반 후 혼합물에 다이아이소프로필 아조다이카복실레이트(49 μL, 0.290 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응을 상온까지 가온시킨 후 30분간 교반하였다. 상기 반응은 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 그 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 1:2(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 8(119 mg, 91%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.85 (dd, J = 2.3, 8.6 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.28-6.17 (m, 2H), 5.45 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 4.27-4.21 (m, 2H), 3.42-3.37 (m, 1H), 3.25 (dd, J = 2.6, 5.4 Hz, 1H), 1.26 (d, J = 6.2 Hz, 6H), 0.85 (s, 9H), 0.07 (d, J = 5.1 Hz, 6H).

1.9. 4-나이트로벤질 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((E)-3-((2- 옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)프로프-1-엔-1-일)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (9) 제조

[화합물 9]

실릴 에터 화합물 8(40.1 mg, 0.059 mmol)을 1:3 비율의 N-메틸-2-피롤리디논과 다이메틸 폼아마이드(1.2 mL)에 녹인 후 불화수소 암모늄(13.6 mg, 0.238 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 상온에서 30시간 동안 교반하였다. 혼합물은 탄산 수소 나트륨 수용액으로 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 그 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 3:1(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 9(24.0 mg, 75%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.21 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 16.3 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.83 (dd, J = 2.4, 8.6 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 6.20 (dt, J = 5.7, 16.3 Hz, 1H), 5.49 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 4.26-4.23 (m, 2H), 3.47-3.43 (m, 1H), 3.28 (dd, J = 2.6, 6.9 Hz, 1H), 1.37 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.25 (d, J = 7.2 Hz, 3H).

1.10. (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((E)-3-((2-옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)프로프-1-엔-1-일)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실산 (OMCL01202) 제조

[화합물 OMCL01202]

0 ℃에서 화합물 9(36.0 mg, 0.066 mmol)과 and 5% Rh/C (4.2 mg)을 2:1 비율의 테트라하이드로퓨란과 수용액에(2.1 mL)의 녹인 후 상온으로 가온시켰다. 수소 기체하에서 2시간동안 교반 후, 혼합물을 PTFE 실린지 필터를 이용하여 여과시켰다. 여과물은 Preparative RP-HPLC(아세토나이트릴/수용액, 2:8 to 100:0(v/v))로 정제한 후 감압하에 동결 건조하여 흰색 분말의 화합물 OMCL01202(12.0 mg, 44%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.87 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.46 (d, J = 16.3 Hz, 1H), 6.97 (dd, J = 2.4, 8.6 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 6.03 (dt, J = 6.1, 16.2 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.10-4.05 (m, 2H), 3.37-3.26 (m, 1H), 3.15 (dd, J = 2.4, 7.5 Hz, 1H), 1.28 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.27 (d, J = 7.2 Hz, 3H).

1.11. tert-부틸(4-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)벤질)옥시)다이메틸실레인 (11) 제조

[화합물 11]

하이드록시 벤질 알코올(500 mg, 4.03 mmol)을 무수 다이메틸 폼아마이드(20.2 mL)에 녹인 후 이미다졸(2.02 g, 16.1 mmol)과 tert-부틸다이메틸실릴 클로라이드(2.42 g, 16.1 mmol)를 0 ℃에서 첨가하였다. 상기 반응은 상온으로 가온시킨 후 12시간 교반하였다. 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후 에틸 아세테이트와 수용액으로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 사용하여 건조시킨 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 1:8 to 1:4 (v/v))로 정제하여 무색 오일 화합물 11(1.40 g, 99%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.17 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.67 (s, 2H), 0.98 (s, 9H), 0.93 (s, 9H), 0.18 (s, 6H), 0.08 (s, 6H).

1.12. (4-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)페닐)메탄올 (12) 제조

[화합물 12]

상온에서 실릴 에터 화합물 11(35.3 mg, 0.10 mmol)을 메탄올(0.3 mL)에 녹인 후 N-아이오도석신이미드(1.1 mg, 0.005 mmol)를 첨가하였다. 12시간동안 교반 후 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후 에틸 아세테이트와 수용액으로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 사용하여 건조 시킨 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 1:4 (v/v))로 정제하여 무색의 오일 화합물 12(21.0 mg, 88%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.22 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.82 (dt, J = 2.3, 9.0 Hz, 2H), 4.60 (s, 2H), 0.98 (s, 9H), 0.19 (s, 6H).

1.13. 7-((4-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)벤질)옥시)-2H-크로멘-2-온 (13) 제조

[화합물 13]

벤질 알코올 화합물 12(1.5 g, 5.34 mmol)을 톨루엔(108 mL)에 녹인 후, 움벨리페론(961 mg, 5.927 mmol)과 트라이페닐포스핀(1.89 g, 6.47 mmol)을 0 ℃에서 첨가하였다. 2분간 교반 후 혼합물에 다이아이소프로필 아조다이카복실레이트(1.37 mL, 8.08 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응을 상온까지 가온시킨 후 30분간 교반하였다. 상기 반응은 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 1:8(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 13(2.02 g, 98%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.63 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.25 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 5.03 (s, 2H), 0.98 (s, 9H), 0.20 (s, 6H).

1.14. 7-((4-하이드록시벤질)옥시)-2H-크로멘-2-온 (14) 제조

[화합물 14]

아르곤 기체 하에서 화합물 13(1.00 g, 2.61 mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란 (26.1 mL)에 녹인 후 0℃에서 아세트산(1.05 mL, 18.3 mmol)와 테트라부틸암모늄 플루오르화물(1M 용액 in THF, 13 mL, 13 mmol)을 순차적으로 천천히 첨가하였다. 상기 반응은 상온으로 가온 후, 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 진공 하에서 농축시킨 후, 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(아세톤/n-헥산, 1:2 (v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 14(635 mg, 91%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, Acetone) δ 7.89 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.98-6.96 (m, 2H), 6.87 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.21 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H).

1.15. 4-나이트로벤질 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-((tert-부틸메틸실릴)옥시)에틸)-4-메틸-7 ??옥소-3-((4-(((2-옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (15) 제조

[화합물 15]

알코올 화합물 6(129 mg, 0.263 mmol)을 톨루엔(5.3 mL)에 녹인 후 페놀 화합물 14(77.6 mg, 0.289 mmol)과 트라이페닐포스핀(92.2 mg, 0.316 mmol)을 0 ℃에서 첨가하였다. 2분간 교반 후 혼합물에 다이아이소프로필 아조다이카복실레이트(67 μL, 0.394 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응을 상온까지 가온시킨 후 30분간 교반하였다. 상기 반응은 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산/클로로폼, 2:5:4(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 15(76 mg, 46%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.21 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.91-6.87 (m, 2H), 6.25 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 14.6 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.72 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 4.29-4.25 (m, 2H), 3.50-3.42 (m, 1H), 3.30 (dd, J = 3.2, 5.2 Hz, 1H), 1.24 (d, J = 6.2 Hz, 6H), 0.86 (s, 9H), 0.08 (d, J = 2.1 Hz, 6H).

1.16. 4-나이트로벤질 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((4-(((2-옥소- 2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (16) 제조

[화합물 16]

실릴 에터 화합물 15(95.0 mg, 0.128 mmol)을 1:3 비율의 N-메틸-2-피롤리디논과 다이메틸 폼아마이드(2.4 mL)에 녹인 후 불화수소 암모늄(29.3 mg, 0.513 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 상온에서 30시간 동안 교반하였다. 혼합물은 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 3:1(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 16(58.0 mg, 72%) 을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.67-7.62 (m, 3H), 7.38-7.33 (m, 3H), 6.92-6.89 (m, 3H), 6.86 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 6.25 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 5.52 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 5.26 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 4.74 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 4.29-4.24 (m, 2H), 3.52-3.44 (m, 1H), 3.33 (dd, J = 3.0, 6.3 Hz, 1H), 1.35 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.25 (d, J = 7.2 Hz, 3H).

1.17. (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸-4-메틸-7-옥소-3-((4-(((2-옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실산 (OMCL01203) 제조

[화합물 OMCL01203]

0 ℃에서 화합물 16(26.0 mg, 0.041 mmol)과 and 5% Rh/C (2.6 mg)을 2:1 비율의 테트라하이드로 퓨란과 수용액에 (1.4 mL)의 녹인 후 상온으로 가온시켰다. 수소 기체 하에서 2시간동안 교반 후, 혼합물을 PTFE 실린지 필터를 이용하여 여과시켰다. 여과물은 Preparative RP-HPLC(아세토나이트릴/수용액, 2:8 to 100:0(v/v))로 정제한 후, 감압 하에 동결 건조하여 흰색 분말의 화합물 OMCL01203 (10.0 mg, 50%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.87 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.98-6.96 (m,4 H), 6.23 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.54 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.68 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 4.08-4.02 (m, 2H), 3.47-3.46 (m, 1H), 3.17 (dd, J = 2.8, 7,5 Hz, 1H), 3.12-3.11 (m, 1H), 1.25 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.17 (d, J = 7.1 Hz, 3H).

1.18. 4-나이트로 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-((tert-부틸메틸실릴)옥시)에틸)-4-메틸-7-옥소 ??3-((E)-3-(4-(((2-옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)프로프-1-엔-1-일)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (18) 제조

[화합물 18]

알릴알코올 화합물 7(20 mg, 0.039 mmol)을 톨루엔((0.8 mL)에 녹인 후 페놀 화합물 14(11.5 mg, 0.043 mmol)과 트라이페닐포스핀(13.7 mg, 0.047 mmol)을 0 ℃에서 첨가하였다. 2분간 교반 후 혼합물에 다이아이소프로필 아조다이카복실레이트(9.8 μL, 0.058 mmol) 을 첨가하였다. 상기 반응을 상온까지 가온시킨 후 30분간 교반하였다. 상기 반응은 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 그 여과물의 용매를 진공 하에서 제거하였다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산/클로로폼, 2:5:4(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 18(22 mg, 74%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.21 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.43 (d, J =16.3 Hz, 1H), 7.38-7.34 (m, 3H), 6.93-6.84 (m, 4H), 6.25 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 6.24-6.19 (m, 1H), 5.44 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.69 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.27-4.24 (m, 1H), 4.20 (dd, J = 2.6, 9.4 Hz, 1H), 3.43-3.35 (m, 1H), 3.24 (dd, J = 2.6, 5.6 Hz, 1H), 1.26 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.23 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 0.86 (s, 9H), 0.07 (d, J = 5.0 Hz, 6H).

1.19. 4-나이트로벤질 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((E)-3-(4-(((2-옥소- 2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)프로프-1-엔-1-일)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (19) 제조

[화합물 19]

실릴 에터 화합물 18(44.0 mg, 0.057 mmol)을 1:3 비율의 N-메틸-2-피롤리디논과 다이메틸 폼아마이드(1:2 mL)에 녹인 후 불화수소 암모늄(13.1 mg, 0.229 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 상온에서 30시간 동안 교반하였다. 혼합물은 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 3:1(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 19(17.0 mg, 51%) 을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.21 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 7.43 (d, J =16.5 Hz, 1H), 7.38-7.33 (m, 3H), 6.92-6.85 (m, 4H), 6.26-6.19 (m, 2H), 5.48 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.69 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 4.28-4.21 (m, 2H), 3.48-3.41 (m, 1H), 3.28 (dd, J = 2.4, 6.7 Hz, 1H), 1.38 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.24 (d, J = 7.5 Hz, 3H).

1.20. (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((E)-3-(4-(((2-옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)프로프-1-엔-1-일)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실산 (OMCL01204) 제조

[화합물 OMCL01204]

0 ℃에서 화합물 19(36.0 mg, 0.066 mmol)과 and 5% Rh/C (4.2 mg을 2:1 비율의 테트라하이드로퓨란과 수용액(2.1 mL)에 녹인 후 상온으로 가온시켰다. 수소 기체하에서 2시간동안 교반 후, 혼합물을 PTFE 실린지 필터를 이용하여 여과시켰다. 여과물은 Preparative RP-HPLC (아세토나이트릴/수용액, 2:8 to 100:0(v/v))로 정제한 후, 감압 하에 동결 건조하여 흰색 분말의 화합물 OMCL01204 (12.0 mg, 44%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.87 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.42 (d, J =16.2 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.98-6.95 (m, 4H), 6.22 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 6.01 (dt, J = 6.0, 16.1 Hz, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.65 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 4.08-4.03 (m, 2H), 3.14-3.12 (m, 2H), 1.28 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.15 (d, J = 7.2 Hz, 3H).

1.21. 4-나이트로벤질(4S,5R,6S)-6-((R)-1-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((((2-옥소-4-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-7-일)카바모일))메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (21) 제조

[화합물 21]

7-아미노-4-트라이플루오로메틸쿠마린(50.0 mg, 0.218 mmol)을 무수 다이클로로메탄(2.2 mL)에 녹인 후 트라이에틸아민(60 μL, 0.436 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 10분 후에 트라이포스젠(65.0 mg, 0.218 mmol)을 천천히 첨가하고 90 ℃에서 6시간 교반하였다. 혼합 물질은 진공하에서 농축시킨 후, 별도의 정제 없이 다음 반응에 이용하였다. 중간체인 아이소사이아네이트 혼합물은 무수 테트라하이드로퓨란(0.5 mL)에 녹인 후 알코올 화합물 6(27.0 mg, 0.055 mmol)과 트라이에틸아민(23 μL, 0.165 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 상온에서 12시간 교반시켰다. 혼합 물질은 진공 하에서 농축시킨 후, 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산/클로로폼, 1:4:3(v/v))로 정제하여 밝은 노란색 분말의 화합물 21(32.0 mg, 78%) 을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.21 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.66-7.62 (m, 4H), 7.33 (dd, J = 2.0, 8.9 Hz, 1H), 7.01 (s, 1H), 6.68 (s, 1H), 5.60 (d, J =14.1 Hz, 1H), 5.46 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 4.30-4.25 (m, 2H), 3.34-3.28 (m, 2H), 1.24-1.22 (m, 6H), 0.85 (s, 9H), 0.07 (d, J = 3.5 Hz, 6H).

1.22. 4-나이트로벤질 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((((2-옥소-4-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-7-일)카바모일)옥시)메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (22) 제조

[화합물 22]

실릴 에터 화합물 21(23.9 mg, 0.032 mmol)을 1:3 비율의 N-메틸-2-피롤리디논과 다이메틸 폼아마이드(0.6 mL)에 녹인 후 불화수소 암모늄(7.4 mg, 0.120 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 상온에서 30시간 동안 교반하였다. 혼합물은 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 2:1(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 22(8.0 mg, 40%) 을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.67-7.62 (m, 4H), 7.33 (dd, J = 1.9, 8.8 Hz, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.69 (s, 1H), 5.58 (d, J =14.2 Hz, 1H), 5.50 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 5.27 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 4.95 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 4.31-4.25 (m, 2H), 3.39-3.31 (m, 2H), 1.35 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.24 (d, J = 7.2 Hz, 3H).

1.23. (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((((2-옥소-4-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-7-일)카바모일)옥시)메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실 산 (OMCL01205) 제조

[화합물 OMCL01205]

0 ℃에서 화합물 22(25.0 mg, 0.040 mmol)과 and 5% Rh/C (2.1 mg)을 2:1 비율의 테트라하이드로퓨란과 수용액(1.2 mL)에 녹인 후 상온으로 가온시켰다. 수소 기체 하에서 2시간동안 교반 후, 혼합물을 PTFE 실린지 필터를 이용하여 여과시켰다. 여과물은 Preparative RP-HPLC (아세토나이트릴/수용액, 2:8 to 100:0(v/v))로 정제한 후, 감압 하에 동결 건조하여 흰색 분말의 화합물 OMCL01205 (7.0 mg, 35%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.77 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.70-7.67 (m, 1H), 7.46 (dd, J = 2.1, 8.9 Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 5.56 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 4.97 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 4.17-4.09 (m, 2H), 3.26-3.15 (m, 2H), 1.30 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.21 (d, J = 7.3 Hz, 3H).

1.24. 4-나이트로벤질 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((E)-3-(((2-옥소-4-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-7-일)카바모일)옥시)프로프-1-엔-1-일)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (24) 제조

[화합물 24]

7-아미노-4-트라이플루오로메틸쿠마린(99.5 mg, 0.434 mmol)을 무수 다이클로로메탄(4.4 mL)에 녹인 후 트라이에틸아민(133 μL, 0.955 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 10분 후에 트라이포스젠(128.8 mg, 0.434 mmol)을 천천히 첨가하고 90 ℃에서 6시간 교반하였다. 혼합 물질은 진공하에서 농축시킨 후, 별도의 정제 없이 다음 반응에 이용하였다. 중간체인 아이소사이아네이트 혼합물은 무수 테트라하이드로퓨란(1.0 mL)에 녹인 후 알릴 알코올 화합물 7(56.3 mg, 0.109 mmol)과 트라이에틸아민(46 μL, 0.327 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 상온에서 12시간 교반시켰다. 혼합 물질은 진공 하에서 농축시킨 후, 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산/클로로폼, 1:4:3(v/v))로 정제하여 밝은 노란색 분말의 화합물 24(61.5 mg, 73%) 을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CD3CN) δ 8.33 (s, 1H), 8.11 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.63-7.59 (m, 4H), 7.33 (dd, J = 2.1, 8.9 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.20 (dt, J =5.6, 16.2 Hz, 1H), 5.37 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 5.24 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 4.78 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.25-4.18 (m, 2H), 3.46-3.42 (m, 1H), 3.28 (dd, J = 3.0, 4.6 Hz, 1H), 1.17-1.14 (m, 6H), 0.80 (s, 9H), 0.03 (d, J = 6.7 Hz, 6H).

1.25 4-나이트로벤질 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((E)-3-(((2-옥소-4-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-7-일)카바모일)옥시)프로프-1-엔-1-일)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (25) 제조

[화합물 25]

실릴 에터 화합물 24(35.0 mg, 0.032 mmol)을 1:3 비율의 N-메틸-2-피롤리디논과 다이메틸 폼아마이드(0.6 mL)에 녹인 후 불화수소 암모늄(7.4 mg, 0.120 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 상온에서 30시간 동안 교반하였다. 혼합물은 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 2:1(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 25(14.0 mg, 65%) 을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.21 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.67-7.62 (m, 4H), 7.39 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.14 (dt, J =5.9, 16.2 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 4.83 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 4.28-4.22 (m, 2H), 3.46-3.39 (m, 1H), 3.28 (dd, J = 2.6, 6.7 Hz, 1H), 1.37 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.23 (d, J = 7.3 Hz, 3H).

1.26. (4S,5R,6S)-6-((R)-1-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((E)-3-(((2-옥소-4-(트라이플루오로메틸)-2H-크로멘-7-일)카바모일)옥시)프로프-1-엔-1-일)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실산 (OMCL01206) 제조

[화합물 OMCL01206]

0 ℃에서 화합물 25(48.0 mg, 0.073 mmol)과 and 5% Rh/C (3.8 mg)을 2:1 비율의 테트라하이드로퓨란과 수용액(1.2 mL)에 녹인 후 상온으로 가온시켰다. 수소 기체 하에서 2시간동안 교반 후, 혼합물을 PTFE 실린지 필터를 이용하여 여과시켰다. 여과물은 Preparative RP-HPLC (아세토나이트릴/수용액, 2:8 to 100:0(v/v))로 정제한 후, 감압 하에 동결 건조하여 흰색 분말의 화합물 OMCL01206 (17.0 mg, 45%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.75(d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 1.8, 8.9 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.71 (s, 1H), 5.97 (dt, J =5.8, 16.3 Hz, 1H), 4.76 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 4.09-4.03 (m, 2H), 3.34-3.33 (m, 1H), 3.15-3.11 (m, 1H), 1.28 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.17 (d, J = 7.2 Hz, 3H).

1.27. tert-부틸(2-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)벤질)옥시)다이메틸실레인 (27) 제조

[화합물 27]

하이드록시 벤질 알코올(500 mg, 4.03 mmol)을 무수 다이메틸 폼아마이드(20.2 mL)에 녹인 후 이미다졸(1.27 g, 10.1 mmol)과 tert-부틸다이메틸실릴 클로라이드(1.52 g, 10.1 mmol)를 0 ℃에서 첨가하였다. 상기 반응은 상온으로 가온시킨 후 12시간 교반하였다. 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후 에틸 아세테이트와 수용액으로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 사용하여 건조시킨 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 1:15 (v/v))로 정제하여 무색 오일 화합물 27(1.08 g, 76%)을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.46 (dt, J = 1.0, 9.4 Hz, 1H), 7.11 (td, J = 2.0, 9.6 Hz, 1H), 6.97 (td, J = 1.2, 9.3 Hz, 1H), 6.74 (dd, J = 1.2, 10.0 Hz, 1H), 4.76 (s, 2H), 1.01 (s, 9H), 0.95 (s, 9H), 0.22 (s, 6H), 0.10 (s, 6H).

1.28. (2-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)페닐)메탄올 (28) 제조

[화합물 28]

상온에서 실릴 에터 화합물 27(636 mg, 1.80 mmol)을 아세토나이트릴(25.8 mL)에 녹인 후 염화세륨 헵타하이드레이트(13.4 g, 3.61 mmol)를 첨가하였다. 90 ℃에서 12시간동안 교반 후 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후 에틸 아세테이트와 수용액으로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO₄를 사용하여 건조 시킨 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 1:8 to 1:4 (v/v))로 정제하여 무색의 오일 화합물 28(49.0 mg, 72%)을 생산하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.31 (dd, J = 2.0, 9.3 Hz, 1H), 7.18 (td, J = 2.1, 9.7 Hz, 1H), 6.96 (dt, J = 1.2, 9.3 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 4.68 (s, 2H), 1.02 (s, 9H), 0.26 (s, 6H).

1.29. 7-((2-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)벤질)옥시)-2H-크로멘-2-온 (29) 제조

[화합물 29]

벤질 알코올 28(68.0 mg, 0.285 mmol)을 톨루엔(5.80 mL)에 녹인 후, 움벨리페론(50.8 mg, 0.314 mmol)과 트라이페닐포스핀(100 mg, 0.342 mmol)을 0 ℃에서 첨가하였다. 2분간 교반 후 혼합물에 다이아이소프로필 아조다이카복실레이트(0.072 mL, 0.428 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응을 상온까지 가온시킨 후 30분간 교반하였다. 상기 반응은 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 1:8(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 29(84.0 mg, 77%)을 생산하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.62 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 1.9, 9.5 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 7.22 (td, J = 2.0, 9.7 Hz, 1H), 6.97 (td, J = 1.2, 9.4 Hz, 1H), 6.91-6.85 (m, 3H), 6.24 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.12 (s, 2H), 0.97 (s, 9H), 0.25 (s, 6H).

1.30. 7-((2-하이드록시벤질)옥시)-2H-크로멘-2-온 (30) 제조

[화합물 30]

아르곤 기체 하에서 화합물 29(427 mg, 1.12 mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란 (11.2 mL)에 녹인 후 0℃에서 아세트산(0.447 mL, 7.81 mmol)와 테트라부틸암모늄 플루오르화물(1M 용액 in THF, 5.6 mL, 5.58 mmol)을 순차적으로 천천히 첨가하였다. 상기 반응은 상온으로 가온 후, 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 진공 하에서 농축시킨 후, 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(아세톤/n-헥산, 1:2 (v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 30(292 mg, 98%)을 생산하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.89 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 1.8, 9.4 Hz, 1H), 7.20 (td, J = 1.9, 9.6 Hz, 1H), 7.01-6.98 (m, 2H), 6.94 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 6.88 (td, J = 1.1, 9.3 Hz, 1H), 6.21 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H).

1.31. 4-나이트로벤질 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-((tert-부틸메틸실릴)옥시)에틸)-4-메틸-7 ??옥소-3-((2-(((2-옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (31) 제조

[화합물 31]

알코올 화합물 6(117 mg, 0.238 mmol)을 톨루엔(4.8 mL)에 녹인 후 페놀 화합물 30(70.4 mg, 0.262 mmol)과 트라이페닐포스핀(83.5 mg, 0.286 mmol)을 0 ℃에서 첨가하였다. 2분간 교반 후 혼합물에 다이아이소프로필 아조다이카복실레이트(60 μL, 0.357 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응을 상온까지 가온시킨 후 30분간 교반하였다. 상기 반응은 염화암모늄 수용액을 이용하여 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산/클로로폼, 2:5:4(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 31(87.6 mg, 50%)을 생산하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.22 (d, J = 10.8 Hz, 2H), 7.68-7.58 (m, 3H), 7.42 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 7.32 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 7.02 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 6.95-6.89 (m, 3H), 6.26 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.53 (d, J = 18.2 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.80 (d, J = 18.4 Hz, 1H), 4.27-4.20 (m, 2H), 3.41-3.33 (m, 1H), 3.27 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 1.21 (d, J = 5.8 Hz, 3H), 1.20 (d, J = 4.3 Hz, 3H), 0.83 (s, 9H), 0.05 (d, J = 10.9 Hz, 6H).

1.32. 4-나이트로벤질 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((2-(((2-옥소- 2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (32) 제조

[화합물 32]

실릴 에터 화합물 31(69.9 mg, 0.094 mmol)을 1:3 비율의 N-메틸-2-피롤리디논과 다이메틸 폼아마이드(1.9 mL)에 녹인 후 불화수소 암모늄(21.6 mg, 0.378 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 상온에서 30시간 동안 교반하였다. 혼합물은 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 3:1(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 32(28.1 mg, 48%) 을 생산하였다.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.21 (d, J = 10.8 Hz, 2H), 7.67-7.59 (m, 3H), 7.42 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 7.32 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 7.01 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 6.96-6.89 (m, 3H), 6.25 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.52 (d, J = 18.2 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 4.79 (d, J = 18.4 Hz, 1H), 4.28-4.21 (m, 2H), 3.41-3.43 (m, 1H), 3.28 (dd, J = 3.0, 6.3 Hz, 1H), 1.35 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.25 (d, J = 7.2 Hz, 3H).

1.33. (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-7-옥소-3-((2-(((2-옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실산 (OMCL01207) 제조

[화합물 OMCL01207]

0 ℃에서 화합물 32(22.0 mg, 0.035 mmol)과 and 5% Rh/C (2.2 mg)을 2:1 비율의 테트라하이드로 퓨란과 수용액에 (1.2 mL)의 녹인 후 상온으로 가온시켰다. 수소 기체 하에서 2시간동안 교반 후, 혼합물을 PTFE 실린지 필터를 이용하여 여과시켰다. 여과물은 Preparative RP-HPLC(아세토나이트릴/수용액, 2:8 to 10:0(v/v))로 정제한 후, 감압 하에 동결 건조하여 흰색 분말의 화합물 OMCL01207 (5.4 mg, 31%)을 생산하였다.

¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.82 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.95-6.89 (m, 3H), 6.26 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 5.53 (d, J = 18.2 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.80 (d, J = 18.4 Hz, 1H), 4.27-4.20 (m, 2H), 3.41-3.33 (m, 1H), 3.27 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 1.21 (d, J = 5.8 Hz, 3H), 1.20 (d, J = 4.3 Hz, 3H).

1.34. 4-나이트로벤질(4S,5R,6S)-6-((R)-1-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)에틸)-4-메틸-3-((((4-메틸-2-옥소-2H-크로멘-7-일)카바모일)옥시)메틸)-7-옥소-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (34) 제조

[화합물 34]

7-아미노-4-메틸쿠마린(224 mg, 1.28 mmol)을 무수 다이클로로메탄(6.4 mL)에 녹인 후 트라이에틸아민(393 μL, 2.81 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 10분 후에 트라이포스젠(129 mg, 1.28 mmol)을 천천히 첨가하고 90 ℃에서 6시간 교반하였다. 혼합 물질은 진공하에서 농축시킨 후, 별도의 정제 없이 다음 반응에 이용하였다. 중간체인 아이소사이아네이트 혼합물은 무수 테트라하이드로퓨란(1.6 mL)에 녹인 후 알코올 화합물 6(157 mg, 0.320 mmol)과 트라이에틸아민(134 μL, 0.960 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 상온에서 12시간 교반시켰다. 혼합 물질은 진공 하에서 농축시킨 후, 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산/클로로폼, 2:4:5(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 34(72.0 mg, 33%) 을 생산하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.21 (dd, J = 2.3, 8.6 Hz, 2H), 7.66 (d, J =10.9 Hz, 2H), 7.54 (d, J =10.9 Hz, 1H), 7.41 (d, J =10.1 Hz, 2H), 6.95 (s, 1H), 6.20 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 5.59 (d, J =17.7 Hz, 1H), 5.46 (d, J =17.2 Hz, 1H), 5.29 (d, J =17.3 Hz, 1H), 4.93 (d, J = 17.8 Hz, 1H), 4.29-4.25 (m, 2H), 3.33-3.29 (m, 2H), 2.41 (d, J =1.3 Hz, 3H), 1.23 (d, J =7.6 Hz, 3H), 1.22 (d, J =3.1 Hz, 3H), 0.86 (s, 9H), 0.07 (d, J = 3.9 Hz, 6H).

1.35. 4-나이트로벤질(4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-3-((((4-메틸-2-옥소-2H-크로멘-7-일)카바모일)옥시)메틸)-7-옥소-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (35) 제조

[화합물 35]

실릴 에터 화합물 34(82.0 mg, 0.119 mmol)을 1:3 비율의 N-메틸-2-피롤리디논과 다이메틸 폼아마이드(2.4 mL)에 녹인 후 불화수소 암모늄(27.0 mg, 0.474 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 상온에서 30시간 동안 교반하였다. 혼합물은 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 3:1(v/v))로 정제하여 흰색 분말의 화합물 35(35.0 mg, 51%) 을 생산하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.23 (d, J = 10.9 Hz, 2H), 7.66 (d, J =10.8 Hz, 2H), 7.54 (d, J =10.8 Hz, 1H), 7.41-7.40 (m, 2H), 6.96 (s, 1H), 6.20 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 5.58 (d, J =17.8 Hz, 1H), 5.51 (d, J =17.0 Hz, 1H), 5.25 (d, J =17.1 Hz, 1H), 4.93 (d, J = 18.1 Hz, 1H), 4.31-4.26 (m, 2H), 3.40-3.26 (m, 2H), 2.38 (d, J =10.2 Hz, 3H), 1.35 (d, J =7.8 Hz, 3H), 1.25 (d, J =9.1 Hz, 3H).

1.36. (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-3-((((4-메틸-2-옥소-2H-크로멘-7-일)카바모일)옥시)메틸)-7-옥소-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실 산 (OMCL01208) 제조

[화합물 OMCL01208]

0 ℃에서 화합물 35(35.0 mg, 0.061 mmol)과 and 5% Rh/C (3.8 mg)을 2:1 비율의 테트라하이드로퓨란과 수용액(2.1 mL)에 녹인 후 상온으로 가온시켰다. 수소 기체 하에서 2시간동안 교반 후, 혼합물을 PTFE 실린지 필터를 이용하여 여과시켰다. 여과물은 Preparative RP-HPLC (아세토나이트릴/수용액, 2:8 to 10:0(v/v))로 정제한 후, 감압 하에 동결 건조하여 흰색 분말의 화합물 OMCL01208 (7.0 mg, 26%)을 생산하였다.

¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.71 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 7.63 (d, J =2.4 Hz, 1H), 7.44 (dd, J =2.5, 10.8 Hz, 1H), 6.22 (s, 1H), 5.55 (d, J = 16.9 Hz, 1H), 4.96 (d, J =17.0 Hz, 1H), 4.17-4.10 (m, 2H), 3.24-3.22 (m, 2H), 2.47 (s, 3H), 1.30 (d, J =7.9 Hz, 3H), 1.21 (d, J =9.1 Hz, 3H).

1.37. 4-나이트로벤질(4S,5R,6S)-6-((R)-1-tert-부틸다이메틸실릴)옥시)에틸)-3-폼일-4-메틸-7-옥소-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (37) 제조

[화합물 37]

0 ℃에서 알코올 화합물 6(20.0 mg, 0.041 mmol)을 무수 다이클로로메탄(0.3 mL)에 녹인 후 데스-마틴 페리오디난(19.1 mg, 0.045 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 1시간동안 교반하였다. 혼합물은 5 ℃ 수용액으로 반응을 종결시킨 후, 다이클로로메탄과 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 1:8(v/v))로 정제하여 밝은 노란색 분말의 화합물 37(12.7 mg, 64%) 을 생산하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 10.4, (s, 1H), 8.24 (d, J = 10.8 Hz, 2H), 7.66 (d, J =10.8 Hz, 2H), 5.50 (d, J =17.1 Hz, 1H), 5.36 (d, J = 17.1 Hz, 1H), 4.36 (dd, J =4.3, 13.0 Hz, 1H), 4.33-4.27 (m, 1H), 3.55-3.47 (m, 1H), 3.41 (t, J =5.0 Hz, 1H), 1.24 (d, J =9.4 Hz, 3H), 1.22 (d, J =8.0 Hz, 3H), 0.85 (s, 9H), 0.08 (d, J = 6.4 Hz, 6H).

1.38. 4-나이트로벤질(4S,5R,6S)-6-((R)-1-((tert-부틸다이메틸실릴)옥시)에틸)-4-메틸-3-((((4-메틸-2-옥소-2H-크로멘-7-일)아미노)메틸)-7-옥소-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (38) 제조

[화합물 38]

7-아미노-4-메틸쿠마린(56.7 mg, 0.324 mmol)을 무수 다이클로로메탄(1.7 mL)에 녹인 후 알데하이드 37(105.4 mg, 0.216 mmol)과 아세트산 ( 2 μL, 0.216 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 3시간 교반 후에 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 (137 mg, 0.648 mmol)을 첨가하고 상온에서 12시간 교반하였다. 혼합물은 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물은 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 1:2(v/v))로 정제하여 노란색 분말의 화합물 38(66.6 mg, 48%)을 생산하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.20 (d, J = 10.7 Hz, 2H), 7.67 (d, J =10.6 Hz, 2H), 7.34 (d, J =11.2 Hz, 1H), 6.58-6.50 (m, 3H), 5.98 (s, 1H), 5.48 (d, J = 17.4 Hz, 1H), 5.30 (d, J =17.4 Hz, 1H), 4.72 (d, J =20.4 Hz, 1H), 4.24 (t, J =7.1 Hz, 1H), 4.18 (dd, J = 3.5, 12.8 Hz, 1H), 3.98 (d, J =20.5 Hz, 1H), 3.26-3.17 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 1.20 (d, J =8.2 Hz, 6H), 0.83 (s, 9H), 0.05 (d, J = 4.7 Hz, 6H).

1.39. 4-나이트로벤질(4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-3-((((4-메틸-2-옥소-2H-크로멘-7-일)아미노)메틸)-7-옥소-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실레이트 (39) 제조

[화합물 39]

실릴 에터 화합물 38(107 mg, 0.155 mmol)을 1:3 비율의 N-메틸-2-피롤리디논과 다이메틸 폼아마이드(3.2 mL)에 녹인 후 불화수소 암모늄(35.4 mg, 0.621 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응은 상온에서 30시간 동안 교반하였다. 혼합물은 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결시킨 후, 에틸아세테이트와 증류수로 추출하였다. 유기층은 무수 MgSO4를 넣어 건조한 후 여과하였고, 여과물을 진공 하에서 농축시켰다. 혼합 물질은 실리카 젤 상에서 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/n-헥산, 3:1(v/v))로 정제하여 밝은 노란색 분말의 화합물 39(48.1 mg, 54%) 을 생산하였다

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.18 (d, J = 10.8 Hz, 2H), 7.65 (d, J =10.8 Hz, 2H), 7.30 (d, J =10.8 Hz, 1H), 6.48 (dd, J = 2.8, 10.8 Hz, 1H), 6.42 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 5.95 (s, 1H), 5.51 (d, J = 17.42 Hz, 1H), 5.25 (d, J =17.2 Hz, 1H), 4.71 (d, J =20.8 Hz, 1H), 4.19-4.15 (m, 2H), 3.95 (d, J = 20.9 Hz, 1H), 3.25-3.18 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 1.29 (d, J =7.8 Hz, 3H), 1.18 (d, J = 9.1 Hz, 3H).

1.40. (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸)-4-메틸-3-((((4-메틸-2-옥소-2H-크로멘-7-일)아미노)메틸)-7-옥소-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실 산 (OMCL01209) 제조

[화합물 OMCL01209]

0 ℃에서 화합물 39(40.5 mg, 0.076 mmol)과 and 5% Rh/C (6.4 mg)을 2:1 비율의 테트라하이드로퓨란과 수용액(2.4 mL)에 녹인 후 상온으로 가온시켰다. 수소 기체 하에서 2시간동안 교반 후, 혼합물을 PTFE 실린지 필터를 이용하여 여과시켰다. 여과물은 Preparative RP-HPLC (아세토나이트릴/수용액, 2:8 to 10:0(v/v))로 정제한 후, 감압 하에 동결 건조하여 흰색 분말의 화합물 OMCL01209 (7.3 mg, 24%)을 생산하였다.

¹H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.46 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 6.67 (dd, J =2.5, 10.9 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 5.91 (s, 1H), 5.48 (s, 1H), 4.78 (d, J = 20.1 Hz, 1H), 4.04 (t, J =8.5 Hz, 1H), 3.98 (dd, J = 3.4, 12.3 Hz, 1H), 3.88 (d, J = 20.2 Hz, 1H), 3.13-3.05 (m, 2H), 2.36 (s, 3H), 1.24 (d, J =7.8 Hz, 3H), 1.14 (d, J =9.1 Hz, 3H).

실시예 2: 임상 시료에서의 항생제 내성 박테리아 검출

강남 성모 병원에서 하기 표 1의 박테리아 균주에 대하여 대조군 OMCL01201 프로브(중국공개특허 CN106279178A에 기재된 CPC-1 화합물)를 대조군으로 본 발명의 OMCL01203 프로브의 카바페넴아제 생성 카바페넴 내성 박테리아 검출 효능을 평가하였다.

실험 과정을 간략히 설명하면, 10 μl 의 샘플을 Tris-HCl buffer (B-PER, Thermo Scientific Pierce) 용액으로 lysis 하고, vortex에서 1분 처리하였다. 30 분 동안 상온에서 배양하고 5분 동안 원심분리기를 사용하여(10,000 g) 상분리하였다. 30 μl 의 상등액을 취하여 100 μl PBS 용액과 13 μl 의 형광 프로브(1 mM)을 첨가하여 반응시킨 후, 50분 동안 매 5분마다 형광 plate reader (Infinite F200pro, Tecan Group Ltd.)를 사용하여 측정하였다.

Carbapenemase class and gene	No. of isolates	CPC-1 result(s)	Pos.%	OMCL01203 result(s)	Pos.%
Ambler class A (39)
KPC	33	15	45%	33	100%
GES	2	0	0%	2	100%
Ambler class B (17)
NDM	9	8	89%	8	89%
VIM	7	3	43%	7	100%
IMP	1	0	0%	1	100%
Ambler class D (6)
OXA	6	1	17%	5	83%
co-producing (3)
KPC/OXA	2		0%	2	100%
NDM/OXA	1	1	100%	1	100%
CPE total	61	28	46%	59	97%
Non-CP CRE (40)	40	0	0%	0	0%

그 결과, 대조군 CPC-1 프로브는 61개의 CPE (carbapenemase-producing Enterobacteriaceae)에 대하여 61개 중에서 28개를 양성 판정하였고(46%), 음성 균주인 Non-CPE 그룹에 대해서는 40개 중에서 40개 모두 음성 판정하였다.

이와는 달리, OMCL01203 프로브는 61개의 CPE에 대하여 61개 중에서 59개를 양성 판정하였고(97%), 음성 균주인 Non-CPE 그룹에 대해서는 40개 중에서 40개 모두 음성 판정하였다.

추가적으로 OMCL01203 프로브를 이용한 형광검출법, mCIM, CarbaNP, CIT 방법을 사용하여 카바페넴아제 생성 카바페넴 내성 박테리아(CP-CRE)와 카바페넴아제 비생성 카바페넴 내성 박테리아(Non CP-CRE)에 대한 검출 효능을 비교하여 하기 표 2에 나타내었다.

그 결과, OMCL01203번 프로브를 이용한 형광 검출법은 양성인 균주 65개 중에서 단지 3개만를 위양성으로 판단하였으며, 음성인 균주는 모두 음성 판정하였다.

이에 반하여 다른 검출법에서는 OMCL01203번 프로브를 이용한 형광 검출법에 비교하여 mCIM은 위음성 비율이 높고, CarbNP는 위양성 비율이 높았으며, CIT는 위양성, 위음성 비율 모두 높았다.

따라서, 상기 결과로부터 본 발명에서 개발한 프로브가 우수한 검출 능력을 갖고 있다는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Carbapenemase class and gene		No. of isolates	MICs (μg/ml)			Fluore result	mCIM result	CNP result	CIT result
Carbapenemase class and gene	Species	No. of isolates	IPM	MEM	ERT	Fluore result	mCIM result	CNP result	CIT result
CPE (65)
Ambler Class A (39)
KPC (36)	Citrobacter freundii	1	>16	8	>16	Pos	Pos	Pos	Pos-A
	Escherichia coli	3	2 to 8	4	8	Pos	Pos	Pos	Pos-A
	Klebsiella aerogenes	1	>16	16	>16	Pos	Pos	Pos	Pos-A
	Klebsiella oxytoca	1	>16	>16	>16	Pos	Pos	Pos	Pos-A
	Klebsiella pneumoniae	30	4 to >16	8 to >16	16 to >16	Pos	Pos	Pos	Pos-A
GES (3)	Escherichia coli	2	1 to >16	2 to >16	8 to >16	Pos	Neg	Neg(2)	Pos-A(1); Neg(1)
	Klebsiella pneumoniae	1	>16	>16	>16	Neg(1)	Neg	Neg(1)	Pos-A
Ambler Class B (17)
NDM (9)	Citrobacter freundii	1	8	16	>16	Pos	Pos	Pos-B	Pos-B
	Enterobacter cloacae	2	>16	>16	>16	Pos	Pos	Pos-B	Pos-B
	Escherichia coli	4	8 to 16	>16	>16	Pos	Pos	Pos-B	Pos-B
	Klebsiella pneumoniae	1	>16	>16	>16	Pos	Pos	Pos-B	Pos-B
	Morganella morganii	1	>16	4	2	Pos	Pos	Pos-B	Pos-B
VIM (7)	Citrobacter freundii	4	0.5 to >16	16 to >16	2 to >16	Pos	Pos	Pos-B(3); Neg(1)	Pos-B(3); Neg(1)
	Enterobacter cloacae	1	4	2	1	Pos	Pos	Neg(1)	Pos-B
	Klebsiella oxytoca	1	2	1	0.5	Pos	Pos	Neg(1)	Neg(1)
	Klebsiella pneumoniae	1	>16	>16	>16	Pos	Pos	Pos-B	Pos-B
IMP (1)	Escherichia coli	1	1	1	4	Pos	Pos	Neg(1)	Neg(1)
Ambler Class D (6)
OXA (6)	Citrobacter freundii	1	2	0.5	1	Pos	Pos	Neg(1)	Neg(1)
	Escherichia coli	3	0.5 to 8	=0.25 to 4	≤=0.125 to >16	Pos(1); Neg(2)	Pos(2); Neg(1)	Neg(3)	Neg(3)
	Klebsiella pneumoniae	2	2 to 4	0.5 to 16	2 to >16	Pos	Pos	Pos(1); Neg(1)	Neg(2)
co-producing (3)
KPC/OXA (2)	Klebsiella pneumoniae	2	4 to 16	4 to >16	8 to >16	Pos	Pos	Pos	Pos-A
NDM/OXA (1)	Klebsiella pneumoniae	1	4	4	16	Pos	Pos	Pos-B	Pos-B

non-CPE (154)
non-CP-CRE (48)	Citrobacter freundii	1	1	0.5	2	Neg	Neg	Neg	Neg
	Enterobacter amnigenus	4	8 to 16	2 to 8	16 to >16	Neg	Neg	Neg	Neg
	Enterobacter cloacae	10	0.5 to >16	=0.25 to >16	2 to 16	Neg	Neg	Neg	Pos-A(1); Neg(9)
	Escherichia coli	8	0.5 to 16	=0.25 to 8	4 to >16	Neg	Neg	Neg	Neg
	Klebsiella aerogenes	3	1 to >16	0.5 to 16	4 to >16	Neg	Neg	Neg	Neg
	Klebsiella pneumoniae	22	0.5 to 16	0.5 to 8	4 to >16	Neg	Neg	Neg	Neg
ESBL-producer (53)
CTX-M (53)	Escherichia coli	29	=0.25 to 1	≤=0.25 to 1	≤=0.125 to 1	Neg	Ind(2); Neg(27)	Neg	Neg
	Klebsiella pneumoniae	24	=0.25 to 1	≤=0.25	≤=0.125 to 1	Neg	Ind(2); Neg(22)	Neg	Neg
non-producer (53)
	Escherichia coli	32	=0.25 to 0.5	≤=0.25	≤=0.125	Neg	Neg	Neg	Neg
	Klebsiella pneumoniae	21	=0.25 to 1	≤=0.25	≤=0.125	Neg	Neg	Neg	Neg

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
[화학식 1]

상기 식에서,
R은 수소원자 또는 C₁-C₂ 알킬기(alkyl)이고;
L은 -CH₂-O-Ar-CH₂-, 또는 -(CH=CH)_nCH₂-O-Ar-CH₂-이고;
상기 n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
Z는 형광염료임.
제1항에 있어서,
상기 Ar은
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
, 또는
이고;
상기
,
, 및
에서 Y는 O, NH, 또는 S인 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항에 있어서,
상기 형광염료는 쿠마린 (coumarin), 움벨리페론 (umbeliferone), 아미노쿠마린 (aminocoumarin), 플루오레세인 (fluorescene), 레소루핀 (resorufin), 카복시로다민(carboxyrodamin),로다민 (rhodamin), 나프탈이미드 (naphthal), 시아닌 (cyanine), 루시페린 (luciferin), CR110, EvoBlue, Alexa Fluor, Flamma, Indocyanine green, 및 2-((이)-2-((이)-2-(4-(2-카르복시에틸)페녹시)-3-((이)-2-(3,3-디메틸5-설포네이토-1-(3-(트리-메틸아미노)-프로필)인돌린-2-이리딘)에티리딘)사이클로헥스-1-에닐)비닐)-3,3디메틸-1-(3-(트리메틸 아미노)-프로필)-3 H 인돌리움-5-설포네이트 디소윰 브로마이드 (2-(( E )-2-(( E )-2-(4-(2-carboxyethyl)phenoxy)-3-(( E )-2-(3,3-dimethyl5-sulfonato-1-(3-(tri-methyl ammonio)-propyl)indolin-2-ylidene)ethylidene)cyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3dimethyl-1-(3-(trimethyl amino)-propyl)-3 H -indolium-5-sulfonate disodium bromide)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 화학식 1의 Z는 L과 함께 β-락타마제(β-lactamases) 또는 카바페넴아제(carbapenemase)에 의해 상기 화학식 1로부터 분리되어 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는, 화합물:
[화합물 OMCL01203]

;
[화합물 OMCL01204]

; 및
[화합물 OMCL01207]

.
제1항 내지 제3항, 제5항, 및 제6항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 프로브.
제7항에 있어서,
상기 항생제는 카바페넴(carbapenem)계 항생제인 것을 특징으로 하는 프로브.
제7항에 있어서,
상기 항생제 내성 박테리아는 카바페넴아제(carbapenemase)를 발현하는 박테리아인 것을 특징으로 하는 프로브.
제8항에 있어서,
상기 카바페넴계 항생제는 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 엘르타페넴(ertapenem), 및 도리페넴(doripenem)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항생제인 것을 특징으로 하는 프로브.
제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 검출용 시약 조성물.
제1항 내지 제3항, 제5항, 및 제6항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 항생제 내성 박테리아 감염 진단용 키트.
제12항에 있어서,
상기 박테리아 감염은 카바페넴아제(carbapenemase)를 발현하는 박테리아 감염인 것을 특징으로 하는 키트.
제13항에 있어서,
상기 카바페넴아제를 발현하는 박테리아 감염에 의한 질환은 피부 및 연조직 감염, 발열성 호중구감소증, 기도관 감염, 상기도관 감염, 세기관지염, 병원성 폐렴, 폐혈증, 뇌수막염, 수술 중 감염, 이질, 전염성 부비동염, 복막염, 탄저병, 라임병, 골수염, 레지오넬라증, 브루셀라병(Brucellosis), 급성 장염, 공동체-획득성 호흡 감염, 트라코마, 신생아의 봉입체결막염, 보눌리눔 식중독, 급성식중독, 설사, 출혈성 대장염, 기관지염, 위궤양, 심장 내막염, 살모넬라증, 위장염, 적리, 기회 감염, 중이염, 부비동염, 인두염, 여드름, 모공성 각화증(keratosis pilaris), 주사비, 할리퀸 어린선, 색소성 건피증, 각화증, 습진, 및 뇌사성 근막염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 특징으로 하는 키트.
하기 단계를 포함하는 항생제 내성 박테리아를 검출하는 방법:
(a) 제1항 내지 제3항, 제5항, 및 제6항 중 어느 한 항의 화합물을 목적 시료와 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 목적 시료에서 제1항 내지 제3항, 제5항, 및 제6항 중 어느 한 항의 화합물로부터 발생된 형광을 검출하는 단계.
제15항에 있어서,
상기 시료는 세포 배양액, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액, 소변, 대변, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
i) 하기 화학식 2로 표시되는 화합물로부터 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;
ii) 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물에 형광 염료를 혼합하여 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;
iii) 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 N-메틸-2-피롤리디논과 다이메틸 폼아마이드의 혼합 용액에 녹인 후 불화수소 암모늄을 첨가하고 상온에서 교반한 다음 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결하여 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 수득하는 단계; 및
iv) 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 테트라하이드로퓨란 수용액에 녹인 후 교반하여 혼합물을 여과시킨 후 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 수득하는 단계;를 포함하는, 화학식 1의 화합물 제조방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

상기 식에서 X는 -(CH=CH)_nCH₂OH (n = 0 ~ 4), 또는 프로파질 알콜이고,
TBS는 t-Butyldimethylsilyl이고, PNB는 PNB : p-nitrobenzyl 이고,
R은 수소원자 또는 C₁-C₂ 알킬기(alkyl)이고,
L은 -CH₂-O-Ar-CH₂-, 또는 -(CH=CH)_nCH₂-O-Ar-CH₂-이고;
상기 n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
Z는 형광염료임.
제 17항에 있어서,
상기 i) 단계에서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기 화합물 2이고,
상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 하기 화합물 2 및 화합물 3을 반응시켜 제조되는 하기 화합물 6이거나; 또는
하기 화합물 2 및 화합물 5를 반응시켜 제조되는 하기 화합물 7인, 제조방법:
[화합물 2]

;
[화합물 3]

;
[화합물 5]

;
[화합물 6]

;
[화합물 7]

상기에서 TBS는 t-Butyldimethylsilyl이고, PNB는 PNB : p-nitrobenzyl 임.
제 17항에 있어서,
상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인, 제조방법:
[화합물 15]

;
[화합물 18]

; 및
[화합물 31]

상기에서 TBS는 t-Butyldimethylsilyl이고 PNB는 PNB : p-nitrobenzyl 임.
제 17항에 있어서,
상기 화학식 4로 표시되는 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인, 제조방법:
[화합물 16]

;
[화합물 19]

; 및
[화합물 32]

상기에서 TBS는 t-Butyldimethylsilyl이고 PNB는 PNB : p-nitrobenzyl 임.