KR102285913B1

KR102285913B1 - 담즙산을 이용한 표면 개질 엑소좀, 그 생산 방법 및 세포 증식 유도 방법

Info

Publication number: KR102285913B1
Application number: KR1020190160025A
Authority: KR
Inventors: 이수홍; 요시에 아라이
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2019-12-04
Publication date: 2021-08-06
Also published as: KR20200092860A

Abstract

본 발명은 담즙산을 이용한 표면 개질 엑소좀, 상기 엑소좀의 생산 방법 및 담즙산을 이용한 세포 증식 유도 방법을 제공한다.
상기 세포 증식 유도 방법 및 엑소좀 생산 방법에 따라 담즙산을 이용하여 효과적으로 세포 증식할 수 있고, 엑소좀의 생산 효율도 증가시킬 수 있으며, 상기 담즙산 표면 개질 엑소좀은 향상된 연골 재생 효율 및 생체 안정성을 가질 수 있다.
또한, 상기 세포 증식 유도 방법에 따라 증식된 세포 및 상기 담즙산 표면 개질 엑소좀은 조직 재생용 조성물로서 이용할 수 있고, 이를 이용하여 연골 조직 재생 등의 치료 효과를 보다 향상시킬 수 있다.

Description

담즙산을 이용한 표면 개질 엑소좀, 그 생산 방법 및 세포 증식 유도 방법{SURFACE-MODIFIED EXOSOMES USING BILE ACID, METHOD FOR PRODUCING THEREOF AND METHOD FOR INDUCING PROLIFERATION OF CELLS}

본 발명은 담즙산을 이용한 표면 개질 엑소좀, 상기 엑소좀의 생산 방법 및 담즙산을 이용한 세포 증식 유도 방법에 관한 것이다.

세포는 다양한 크기의 지질 이중 막에 싸여 세포외 소포 (Extracellular vesicles, EVs)를 분비하는 것으로 알려져 있다. 세포외 소포는 크기의 차이에 따라, 엑소좀 (Exosome, 30-200nm), 미세소낭 (Microvesicle, 200-1000nm), 대형 온코좀 (Large oncosome, 1-10μm) 으로 분류된다. 그 중에서도 엑소좀은 2000년대 후반부터 세포 간 커뮤니케이션 수단으로, 각종 질환의 조기 진단의 목적으로 주목 받고 있어 분비, 이동 방식 및 엑소좀 내 포함된 물질 등에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

엑소좀 내에는 mRNA와 miRNA 같은 핵산과 단백질 등이 들어있다. 분비를 하는 세포는 특정 메시지를 엑소좀 형태로 분비하고 엑소좀은 그 표면 마커(Marker)나 크기 등에 의해 특정 세포를 식별하며, 이것이 엑소좀 내 mRNA, miRNA 및 단백질 등을 수용하는 세포에 영향을 미치게 됨으로써 세포 간 신호전달 역할이 수행될 수 있다.

엑소좀의 주요 기능으로 조직재생, 면역조절, 약물전달, 암치료 등이 있으며, 그 외에도 진단을 위한 엑소좀의 연구 개발도 이루어지고 있다. 또한, 최근 세포를 사용한 조직 재생 및 질병 치료에서 중요하게 생각되는 원인 기작중 하나인 파라크라인 효과 (paracrine effect; 주변세포 영향효과)가 엑소좀으로부터 기인한 것이라는 사실이 알려지면서 엑소좀에 대한 연구가 더 많은 관심을 받고 있다.

하지만, 세포에서 추출된 단순 엑소좀의 경우 수득 효율이 낮고 조직 재생학적 기능성이 적은 문제점이 있다. 또한, 엑소좀을 질병 모델의 생체 내에 주입할 경우 간, 비장 및 신장에 대부분 축적되고 병변 부위에 대한 표적능이 매우 부족한 것으로 알려져 있다. 이는 인지질, 다당류, 단백질 등으로 구성된 엑소좀의 표면성질로 인한 것이며, 따라서, 생체분포 거동을 제어하기 위해서는 표면을 효과적으로 개질할 수 있는 기술이 요구된다.

한국등록특허 제10-1789917호 (2017.10.26. 공고)

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 세포 증식 유도 방법을 제공한다.

본 발명은 엑소좀 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 표면 개질된 엑소좀을 제공한다.

본 발명에 따른 세포 증식 유도 방법은 담즙산을 포함하는 배지 조성물에 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 엑소좀 생산 방법은 담즙산을 포함하는 배지 조성물에 세포를 배양하는 단계 및 상기 배양된 세포로부터 엑소좀을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 표면 개질 엑소좀은 담즙산을 처리하여 표면 개질될 수 있다.

본 발명에 따른 조직 재생용 조성물은 상기 표면 개질 엑소좀 또는 상기 방법으로 생산된 세포를 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 연골 질환 치료용 약학 조성물은 상기 표면 개질 엑소좀을 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 증식 유도 방법 및 엑소좀 생산 방법에 따라 담즙산을 이용하여 효과적으로 세포 증식할 수 있고, 엑소좀의 생산 효율도 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 엑소좀은 담즙산 처리에 의해 표면이 개질되어 향상된 연골 재생 효율 및 생체 안정성을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 세포 증식 유도 방법에 따라 증식된 세포 및 상기 담즙산 표면 개질 엑소좀은 조직 재생용 조성물로서 이용할 수 있고, 이를 이용하여 연골 조직 재생 등의 치료 효과를 보다 향상시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 증식 변화를 나타내는 흡광도 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 엑소좀 생산율 분석을 위한 시료별 특정 파장에서의 흡광도 차이에 관한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀의 담즙산 함유여부 분석을 위한 시료별 특정 파장에서의 흡광도 차이에 관한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 엑소좀 생산율 분석을 위한 시료 별 입자 수 차이에 관한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 연골세포의 유전자 발현의 변화를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자는 생체 유래물인 담즙산 처리를 통해 조직 재생학적 기능을 가진 세포 및 엑소좀을 생산하고 그 생산율도 증가시킬 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 세포 증식 유도 방법을 제공한다.

본 발명에서, "증식"이란, 세포 수의 증가를 의미하는 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 담즙산을 포함하는 배지 조성물에서 세포를 배양할 경우, 담즙산을 포함하지 않은 대조군에 비해 세포 수가 유의적으로 증가했음을 확인할 수 있다.

본 발명에서, "배지 조성물"이란, 생체 외(in vitro)에서 세포의 성장과 증식에 필요한 필수 성분을 포함하는 조성물을 의미한다. 상기 배지 조성물은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지를 포함할 수 있다. 예를 들어, 둘베코수정이글배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM), 최소필수영양배지 (Minimal Essential Medium, MEM), 이글의 기초배양배지 (Basal Medium Eagle, BME), RPMI1640 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 배지 조성물은 아미노산, 항생제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명에서, "담즙산 (bile acid)"이란, 담즙 (bile juice)을 구성하는 주요 유기 물질로서, 소화기계 중에서 특히 간과 장관에서 중요한 생리적 기능을 담당하는 생체 물질을 말한다. 담즙산은 크게 1차성과 2차성으로 구분되는데, 1차성 담즙산은 간 세포 (hepatic cell)에서 지용성 물질인 콜레스테롤을 원료로 모핵에 수용성기를 첨가함으로써 생성되며, 최종적으로 지용성이자 수용성을 띠는 양성 물질로 합성된다. 인체 내에서 생성되는 1차성 담즙산으로는 콜산 (cholic acid, CA)과 케노데옥시콜산 (chenodeoxycholic acid, CDCA)이 있으며, 2차성 담즙산은 상기 콜산과 케노데옥시콜산이 위장관 내부에서 장내 세균에 의해 변화된 형태의 물질로 다양한 생리 활성을 지니는데, 예를 들어, 매우 소량만이 존재하는 우르소데옥시콜산 (ursodeoxycholic acid, UDCA)은 간 기능 개선이라는 약리적 효과를 가진다.

본 발명에 따른 세포 증식 유도 방법에 있어서, 상기 배지 조성물은 담즙산을 포함할 수 있고, 상기 담즙산은 타우로우르소데옥시콜산 (tauroursodeoxycholic acid, TUDCA)을 포함할 수 있다.

상기 타우로우르소데옥시콜산은 양쪽성 (ambiphilic) 담즙산으로, 우르소데옥시콜산(UDCA)의 타우린 (taurine) 접합체 형태이다. 상기 타우로우르소데옥시콜산은 인체에는 극미량 존재한다.

본 발명에 따른 세포 증식 유도 방법에 있어서, 상기 타우로우르소데옥시콜산은 상기 배지에 10μM 내지 4,000μM 농도로, 바람직하게는 1,000μM 내지 4,000μM 농도로, 보다 바람직하게는 2,000μM 내지 3,000μM 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도가 10μM 미만일 경우에는 세포의 증식이 유도되지 않을 수 있고, 4,000μM을 초과할 경우에는 세포 독성이 나타날 수 있으므로, 세포 독성이 나타나지 않으면서 세포 증식이 유의적으로 증진될 수 있는 상기 범위의 농도가 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배지 조성물은 상기 타우로우르소데옥시콜산 외의 당 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 세포 증식 유도에 직·간접적으로 영향을 주는 물질들을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 증식 유도 방법에 있어서, 상기 세포는 줄기세포를 포함할 수 있다.

본 발명에서, "줄기세포"란, 특정 세포로 분화가 진행되지 않은 미분화 세포로서 자가 복제 능력을 가지고, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 의미한다.

본 발명에 따른 세포 증식 유도 방법에 있어서, 상기 줄기세포는 자가 또는 동종 유래의 줄기세포일 수 있고, 인간을 포함한 포유류에서 유래된 줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있으며, 상기 성체줄기세포는 신경, 근육, 지방, 피부, 양막, 태반 또는 제대혈 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, "성체줄기세포"란, 배아 발달단계 이후에도 성체 전반에서 발견되는 분화되지 않은 줄기세포로, 세포 분열에 의해 증식하여 사멸된 세포를 대체하고 손상된 조직을 재생하는 역할을 하는 줄기세포를 의미한다. 성체줄기세포는 주변조직의 특성에 세포 자신을 맞추어 분화하는 조직 특이적 분화능력 (sitespecific differentiation)을 가지고 있다.

본 발명에 따른 세포 증식 유도시 성체줄기세포를 사용하면, 상기 세포를 인체에 적용하는 경우 안전성을 확보하고 부작용을 최소화할 수 있다. 또한, 성체줄기세포는 인간배아에서 추출한 배아줄기세포와 달리 골수나 뇌세포 등 이미 성장한 신체조직에서 추출하기 때문에 윤리논쟁을 피할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 세포 증식 유도 방법에 있어서, 상기 세포는 연골세포를 포함할 수 있다.

본 발명에서, "연골세포"란, 연골조직을 이루는 연골기질 내 소강에 위치하여 연골 내부에서 콜라겐 등의 연골기질을 생산하고 유지하는 기능을 하는 세포를 의미한다. 연골기질은 연골에 탄력성을 더해주고, 이들이 모여 세 가지 종류의 연골조직 (초자연골, 섬유연골, 탄성연골)을 구성할 수 있다. 또한, 상기 줄기세포로부터 분화된 연골세포일 수 있다.

본 발명에 따른 세포 증식 유도 방법을 통해 세포의 증식을 유도하여 상기 세포를 대량 생산할 수 있다. 보다 상세한 것은 하기 실시예에서 후술될 것이다.

본 발명은 엑소좀 생산 방법을 제공한다.

본 발명에서, "엑소좀"이란, 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 작은 크기(30-100nm)의 세포 유래 소포(vesicles)로, 세포의 다소포체 (multivesicular body)가 원형질막에 융합되어 분비되거나 원형질막으로부터 직접적으로 분비되며, 응집, 세포 내 신호전달, 세포 노폐물 관리 등의 과정에서 중요한 특정 기능을 수행한다.

엑소좀은 해당 엑소좀이 유래된 세포 타입을 반영하는 RNA, 단백질, 지질 및 대사물질들을 함유할 수 있고, 엑소좀에 포함되어 있는 단백질들은 세포막 형태의 인지질에 의해 보호되고 있어 단백질 분해효소 등에 의해 활성을 쉽게 잃지 않아 가용성 형태의 단순 단백질 (soluble protein) 보다 안정적인 기능을 수행할 수 있다. 또한, 지질 이중층의 구조는 세포막과 쉽게 융합되므로 엑소좀 내의 물질들은 세포에 효율적으로 전달될 수 있다. 엑소좀 생산 및 그 함량은 엑소좀을 생산하는 세포가 받은 분자 신호에 의해 영향을 받을 수 있다.

본 발명에 따른 엑소좀 생산 방법에 있어서, 상기 세포 배양 단계는 상술한 세포 증식 유도 방법의 세포 배양 단계와 유사한 단계일 수 있고, 이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명에 따른 엑소좀 생산 방법에 있어서, 상기 세포 배양 단계의 배지 조성물은 담즙산을 포함할 수 있다. 상기 담즙산은 타우로우르소데옥시콜산을 포함할 수 있고, 상기 타우로우르소데옥시콜산은 상기 배지에 10μM 내지 4,000μM 농도로, 바람직하게는 1,000μM 내지 4,000μM 농도로, 보다 바람직하게는 2,000μM 내지 3,000μM 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도가 10μM 미만일 경우에는 세포 및 엑소좀의 증식이 유도되지 않을 수 있고, 4,000μM을 초과할 경우에는 세포 독성이 나타날 수 있으므로, 세포 독성이 나타나지 않으면서 세포 및 엑소좀의 증식이 증진될 수 있는 상기 범위의 농도가 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배지 조성물은 상기 타우로우르소데옥시콜산 외의 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 엑소좀 생산 향상에 직·간접적으로 영향을 주는 물질들을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 엑소좀 생산 방법에 있어서, 상기 엑소좀 수득 단계는 상기 담즙산을 포함하는 배지 조성물로부터 배양된 세포로부터 상기 엑소좀을 수득하는 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면 담즙산이 처리된 세포에 무혈청 배양액을 처리하여 상기 엑소좀을 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 엑소좀 생산 방법에 있어서, 상기 엑소좀을 수득할 수 있는 세포는 줄기세포 및 연골세포를 포함할 수 있고, 상기 세포를 배양한 후 수득된 배양액에서 수득될 수도 있다. 또한, 상기 엑소좀은 이를 함유한 배양액으로 생산될 수 있고, 상기 배양액으로부터 세포를 제거한 상태로 생산될 수도 있다.

본 발명에 따른 엑소좀 생산 방법에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 방법을 통해 엑소좀의 생산이 증진될 수 있고, 대량 생산될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 지방유래 줄기세포에 담즙산을 처리한 경우, 처리하지 않은 대조군에 비해 엑소좀 생산량이 4배 이상으로 증가하는 것을 확인할 수 있다.

본 발명은 담즙산 표면 개질 엑소좀을 제공한다.

본 발명에 따른 엑소좀은 담즙산을 처리하여 담즙산에 의해 표면 개질된 것으로, 보다 상세하게는 담즙산을 포함하는 배지 조성물에서 배양된 세포로부터 담즙산이 함유된 엑소좀을 수득할 수 있다. 상기 담즙산에 의해 상기 세포의 세포막이 개질될 수 있고, 상기 세포에서 수득된, 즉 상기 개질된 세포막으로부터 단리된 상기 엑소좀 또한 상기 담즙산에 의해 표면이 개질될 수 있다.

본 발명에 따라 표면이 개질된 엑소좀을 공여하는 세포는 줄기세포 및 연골세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 담즙산 표면 개질 엑소좀은 기존의 일반 엑소좀에 비해 향상된 연골 재생 효율을 가질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 담즙산으로 표면 개질된 엑소좀이 처리된 경우, 연골 분화 인자인 제2형 콜라겐 (Collagenase type II; Col2)의 mRNA 발현이 엑소좀이 처리되지 않은 대조군과 담즙산 처리되지 않은 엑소좀 실험군에 비해 약 7배 또는 약 10배 이상 유의적으로 증가하는 것으로 확인되었다. 제2형 콜라겐은 인체를 구성하는 콜라겐 중에서도 손가락이나 무릎, 연골 등과 같이 연골에서만 발견되는 특수 콜라겐이다.

또한, 담즙산으로 표면 개질된 엑소좀이 처리된 경우, 연골 비후화 인자인 제10형 콜라겐 (Collagenage type X; Col10)의 mRNA 발현은 상기 대조군 및 실험군에 비해 유의적으로 감소하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 담즙산 표면 개질된 엑소좀이 연골 재생을 위한 조성물로서의 가능성을 나타낸다.

또한, 본 발명은 조직 재생용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "조직 재생"이란, 손상된 조직을 복원하거나 또는 부족한 조직의 생성을 유도하여 조직의 기능을 회복하려는 작용을 의미한다. 예를 들어, 연골 조직의 재생 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조직 재생용 조성물은 상술된 세포 증식 유도 방법에 따라 생산된 세포를 유효성분으로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 치료 조직에 투여하였을 때 상기 세포의 활성을 증대시켜 연골 조직 재생 등의 치료 효과를 극대화하기 위하여 최적화된 조성물을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 조직 재생용 조성물은 상술된 담즙산 표면 개질 엑소좀을 유효성분으로 포함할 수 있다. 상기 담즙산 표면 개질 엑소좀은 기존의 일반 엑소좀에 비해 연골 재생 효율을 향상시킬 수 있기 때문에 기존의 엑소좀을 대신하여 조직 재생용 조성물로 활용될 수 있다.

본 발명에 따른 조직 재생용 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 향상된 재생 기능으로 효과적으로 지속가능한 조직 재생을 이룰 수 있고, 세포막과 유사한 지질 구조를 가지고 있기 때문에 체내에 주입되었을 때 주변 세포로의 흡수율이 뛰어나 효능 물질의 빠른 전달로 조직의 효과적 재생 유도가 가능하다.

본 발명에 따른 조직 재생용 조성물은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 조직 재생 효율을 높이는 기타 성분들을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 담즙산 표면 개질 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 연골 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 연골 질환은 연골 조직의 손상으로부터 유래한 연골 질환일 수 있고, 예를 들어, 골관절염, 연골형성이상증, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골연화증, 섬유성 골염 및 무형성 골질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 연골 관절 내 직접 주입 가능한 형태로 제형화될 수 있고, 이에 따라 상기 연골 관절 내 삽입되어 연골 손상 부위 또는 결손 부위를 재생시키거나 치료할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 엑소좀의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.

특히, 주사제 형태로 제형화되는 경우, 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조될 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질 방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알콜 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 연골 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 피하, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 연골 질환 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 담즙산 처리에 따른 연골세포의 증식 변화 확인

담즙산이 처리된 연골세포의 세포 증식 변화를 확인하였다.

표 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 대조군 및 실험군이다. 하기 표 1에 기재된 바와 같이 대조군과 실험군을 제조하였고, 담즙산이 포함된 배양액은 2일에 한번 교체되었으며 1일, 3일, 7일 및 14일 동안 배양하였다. 세포의 증식은 세포 카운팅 키트 (Cell Counting Kit-8,CCK-8) 분석을 이용하여 확인하였다.

구분	TUDCA (μM)
대조군	0
제1 실험군	0.1
제2 실험군	1
제3 실험군	10
제4 실험군	100
제5 실험군	1000
제6 실험군	2500
제7 실험군	5000
제8 실험군	7500
제9 실험군	10000

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 증식 변화를 나타내는 흡광도 그래프이다.

도 1을 참조하면, 450nm의 특정 파장에서 TUDCA 농도를 달리한 시료들에서 배양 기간에 따라 흡광도 차이가 나타났다. TUDCA 농도가 5000μM 미만인 경우, 14일간 배양한 시료는 다른 기간의 시료들에 비해 흡광도가 높은 것으로 나타났고, 특히 TUDCA 농도가 2500μM 일 때 흡광도가 가장 높은 것으로 나타났다. TUDCA 농도가 5000μM 이상일 경우, 배양 기간별 시료들의 흡광도 차이는 거의 없는 것으로 나타났다.

<실시예 2> 담즙산의 처리에 따른 연골세포의 엑소좀 생산량 확인

담즙산이 처리된 연골세포의 대조군과 실험군들에 대해 엑소좀 생산량을 확인하였다.

표 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 대조군 및 실험군이다. 하기 표 2에 기재된 바와 같이 대조군과 실험군을 제조하였고, 담즙산이 포함된 배양액은 2일에 한번 교체되었으며 7일 동안 배양하였다.

구분	TUDCA(μM)	세포 유무
대조군 1(Con)	0	무
대조군 2(EV0)	0	유
제1 실험군(EV1)	1000	유
제2 실험군(EV2.5)	2500	유

엑소좀은 담즙산이 7일 동안 처리된 세포에 혈청 미포함 배양액을 24시간 동안 처리하여 수득하였다. 엑소좀이 포함된 배양액에서 엑소좀을 추출하기 위해서 0.22μm 주사기 필터 (Millipore 사)를 이용하여 필터한 후, AU-15 필터 (10 kDa MWCO, Millipore 사)를 이용하여 4000×g에서 30분 동안 원심분리 하여 엑소좀을 추출하였다. AU-15 필터를 이용하여 걸러진 엑소좀에 존재하는 잔존 배양액의 제거 및 용매의 치환을 위해서 PBS 첨가 후 4000×g에서 30분 동안 원심분리하였다. 엑소좀의 생산량은 단백질 정량법인 BSA 분석법을 이용하여 확인하였다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 엑소좀 생산율 분석을 위한 시료별 특정 파장에서의 흡광도 차이에 관한 그래프이다. 엑소좀에 존재하는 단백질의 정량분석을 통해 엑소좀의 양을 분석하였다.

도 2를 참조하면, 562nm의 특정 파장에서 TUDCA의 처리에 따라서 흡광도에 차이가 나타났다. 엑소좀이 포함이 되지 않은 대조군 1(Con)에서 단백질의 양이 0μg/μl일 때, 세포에서 추출된 엑소좀이 존재하는 대조군 2(EV0)에서 단백질의 양이 1.275 g/μl 이였으며, TUDCA가 7일 동안 처리된 세포에서 추출된 엑소좀이 존재하는 비교군 1(EV1) 과 비교군 2(EV2.5)에서는 단백질의 양이 각각 1.304μg/μl 및 2.026μg/μl으로 나타났다. 대조군 2(EV0)과 실험군 1(EV1)간의 단백질 양 차이는 거의 없는 것으로 나타났다. TUDCA가 처리된 세포 중에서도 특히 2500μM의 TUDCA가 처리된 세포의 엑소좀의 생산량이 TUDCA가 처리되지 않거나 1000μM의 TUDCA가 처리된 세포의 엑소좀의 생산량에 비해 증가하였다.

<실시예 3> 담즙산 표면개질 엑소좀의 담즙산 담지 확인

담즙산이 처리된 연골세포의 대조군과 실험군들에 대해 엑소좀의 담즙산 담지여부를 확인하였다.

표 3은 본 발명의 실시예 3에 따른 대조군 및 실험군이다. 상기 표 3에 기재된 바와 같이 대조군과 실험군을 제조하였고, 담즙산이 포함된 배양액은 2일에 한번 교체되었으며 7일 동안 배양하였다.

엑소좀은 담즙산이 7일 동안 처리된 세포에 혈청 미포함 배양액을 24시간 동안 처리하여 수득하였다. 엑소좀의 담즙산 담지여부는 담즙산 분석법을 이용하여 확인하였다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀의 담즙산 함유여부 분석을 위한 시료별 특정 파장에서의 흡광도 차이에 관한 그래프이다.

도 3을 참조하면, 405nm의 특정 파장에서 TUDCA의 처리에 따라 흡광도 차이가 나타났다. 대조군 1(Con)에서 담즙산의 양이 1.0μM일 때, 대조군 2(EV0)에서 담즙산의 양이 2.6μM이였으며, TUDCA가 처리된 세포에서 추출된 엑소좀인 비교군 1(EV1) 과 비교군 2(EV2.5)에서는 담즙산의 양이 각각 10.6μM 및 27.6μM로 나타났다. TUDCA가 처리된 세포는 담즙산이 포함된 엑소좀을 생산하며, 2500μM의 TUDCA가 처리된 세포에서 추출된 엑소좀이 가장 많은 양의 담즙산을 포함하는 것으로 나타났다.

<실시예 4> 담즙산의 처리에 따른 지방유래 줄기세포의 엑소좀 생산량 확인

담즙산이 처리된 지방유래 줄기세포의 대조군과 실험군들에 대해 엑소좀 생산량을 확인하였다.

표 4는 본 발명의 실시예 4에 따른 대조군 및 실험군이다. 하기 표 4에 기재된 바와 같이 대조군과 실험군을 제조하였고 담즙산이 포함된 배양액을 처리하여 24시간 동안 배양하였다.

구분	TUDCA (μM)
대조군 (Con, EV0)	0
실험군 (EV2.5)	2500

엑소좀은 담즙산이 24시간 동안 처리된 세포에 혈청 미포함 배양액을 24시간 동안 처리하여 수득하였다. 엑소좀이 포함된 배양액에서 엑소좀을 추출하기 위해서 0.22μm 주사기 필터 (Millipore 사)를 이용하여 필터한 후, AU-15 필터 (10kDa MWCO, Millipore 사)를 이용하여 4000×g에서 30분 동안 원심분리 하여 엑소좀을 추출하였다. AU-15 필터를 이용하여 걸러진 엑소좀에 존재하는 잔존 배양액의 제거 및 용매의 치환을 위해서 PBS 첨가 후 4000×g에서 30분 동안 원심분리하였다. 엑소좀의 생산량은 나노입자 추적분석법 (nanoparticle tracking analysis, NS300, Malvern 사)을 이용하여 확인하였다

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 엑소좀 생산율 분석을 위한 시료 별 입자 수 차이에 관한 그래프이다.

도 4를 참조하면, TUDCA의 처리에 따라서 엑소좀의 입자 수에 차이가 나타났다. 아무것도 처리되지 않은 배양액에 배양된 세포에서 추출된 엑소좀이 존재하는 대조군(EV0)에서 엑소좀의 입자 수가 2.1E+09개일 때, 2500μM의 TUDCA가 24시간 동안 처리된 세포에서 추출된 엑소좀이 존재하는 비교군(EV2.5)에서는 엑소좀의 입자 수가 9.4E+09개로 나타났다. 2500μM의 TUDCA가 처리된 세포의 엑소좀의 생산량이 TUDCA가 처리되지 않은 세포의 엑소좀의 생산량에 비해 약 4.48배 증가하였다.

<실시예 5> 담즙산 표면개질 엑소좀을 이용한 연골세포의 연골표지 유전자 (COL2)의 증가 및 비대성 유전자(COL10)의 감소 확인

줄기세포 유래 담즙산 표면개질 엑소좀이 처리된 연골세포의 연골표지 유전자 및 비대성 유전자의 mRNA 발현을 qPCR을 통해서 확인하였다.

표 5는 본 발명의 실시예 5에 따른 대조군 및 실험군이다. 하기 표 5에 기재된 바와 같이 대조군과 실험군을 제조하였고 담즙산 표면개질 엑소좀이 포함된 배양액은 2일에 한번 교체되었으며 7일 동안 배양하였다.

구분	TUDCA(μM)	엑소좀의 유무
대조군 (Con)	0	무
실험군 1(EV0)	0	유
실험군 2(EV2.5)	2500	유

연골세포의 mRNA 발현을 분석하기 위해 실시예 4에 따라 제작된 담즙산 표면개질 엑소좀이 포함된 배양액에서 배양된 세포의 RNA를 Trizol (Invitrogen 사)을 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA를 이용하여 cDNA를 제작하여 qPCR기법을 통해 mRNA 발현을 확인하였다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 연골세포의 유전자 발현의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 5를 참조하면, 엑소좀 혹은 담즙산 표면개질 엑소좀이 처리된 시료의 qPCR기법을 통해서 분석된 유전자의 mRNA 발현에서 차이가 나타났다.

연골표지 유전자인 COL2 유전자의 mRNA 발현은 엑소좀이 처리되지 않은 배양액에 배양된 대조군(Con) 및 엑소좀이 처리된 배양액에 배양된 실험군 1(EV0)에 비하여 담즙산 표면개질 엑소좀이 처리된 배양액에 배양된 실험군 2(EV2.5)에서 각각 약 7.00배 및 약 10.02배 유의적으로 증가하였다.

연골의 비대성 유전자인 COL10 유전자의 mRNA 발현은 엑소좀이 처리되지 않은 배양액에 배양된 대조군(Con) 및 엑소좀이 처리된 배양액에 배양된 실험군 1(EV0)에 비하여 담즙산 표면개질 엑소좀이 처리된 배양액에 배양된 실험군 2(EV2.5)에서 각각 약 1.48배 및 약 1.64배 유의적으로 감소하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

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타우로우르소데옥시콜산(tauroursodeoxycholic acid, TUDCA) 2,500μM 내지 3,500μM을 포함하는 배지 조성물에 세포를 배양하는 단계; 및
상기 배양된 세포로부터 엑소좀을 수득하는 단계;를 포함하는, 엑소좀 생산 방법.
제 5 항에 있어서,
상기 세포는,
줄기세포 또는 연골세포인 것을 특징으로 하는, 엑소좀 생산 방법.
삭제
제 5 항에 있어서,
상기 방법은,
상기 엑소좀을 대량 생산하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀 생산 방법.
제 5 항, 제 6 항 또는 제 8 항에 따른 방법에 따라 생산된 타우로우르소데옥시콜산(TUDCA)이 담지된 엑소좀.
삭제
제 9 항에 따른 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물.
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제 9 항에 따른 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 연골 질환 치료용 약학 조성물.