KR102283368B1 - 포도 품종에서 고기능성 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 위한 정량 pcr 마커 및 이의 용도 - Google Patents

포도 품종에서 고기능성 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 위한 정량 pcr 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포도 품종에서 고기능성 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 위한 정량 PCR 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 항산화, 항염증, 항암 활성 등에 뛰어난 기능을 갖는 안토시아닌을 많이 함유한 포도 계통이나 자원선발을 위해서는 안토시아닌 물질 분석을 수행해야 하는데 시간과 비용이 많이 소요된다. 그러나 본 발명에서 개발한 안토시아닌 생산과 관련된 유전자를 이용한 정량 PCR (qRT-PCR) 마커 세트를 이용한다면 단시간 내에 안토시아닌 함량이 높은 포도 선발 및 확인이 가능하다. 본 발명에 따른 3개의 유전자 정보로 구성된 고기능성 안토시아닌 발현 마커 세트를 이용함으로써 고기능성 안토시아닌 함량이 강화된 포도 자원 및 계통을 조기에 선발함으로써 포도육종 비용의 절감 뿐만 아니라 육종효율 증대에도 기여할 것으로 기대된다.

Description

포도 품종에서 고기능성 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 위한 정량 PCR 마커 및 이의 용도{A set of qRT-PCR markers for analysis of high functional anthocyanin biosynthesis-related gene expression in grapes and uses thereof}
본 발명은 포도 품종에서 고기능성 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 위한 정량 PCR 마커 및 이의 용도에 대한 것이다.
포도는 전 세계적으로 생산되는 주요 과수 중의 하나로, 생식용으로는 물론 포도주와 건포도를 비롯한 가공품으로 소비되고 있으며, 소비시장은 계속해서 확대되고 있다. 포도는 당과 유기산을 함유하고 있을 뿐만 아니라 페놀산, 플라보노이드(flavonols, flavan-3-ols 및 flavanonols), 레즈베라트롤(resveratrol) 및 안토시아닌 색소 등의 항산화성 폴리페놀화합물들을 다량 함유하고 있다. 이 성분들이 항암, 항고혈압, 항염증성 등에 작용함이 밝혀짐에 따라 포도 음료 및 포도주 등의 여러 가공식품의 소비가 크게 증가하고 있다.
안토시아닌은 붉은색, 보라색 계통의 꽃과 과일, 채소 곡물 등에 다량 함유되어 있는 플라보노이드계 수용성 색소로 식물 조직의 착색에 중요한 역할을 수행하는 주요 성분이다. 또한, 식물 병원균에 대한 방어, UV-B에 의한 손상과 해로운 활성 산소로부터의 보호 및 식물-동물/식물/미생물 간의 상호 작용 등 다양한 생리적, 생태적 역할을 수행한다. 특히 안토시아닌은 항산화, 항염증, 항암 활성 등에 있어서 뛰어난 기능성을 갖는 것으로도 잘 알려져 있다. 항산화물질은 불포화지방산의 자동산화과정에서 생성되는 활성카르보닐화합물 유래의 라디칼 종(ROO·, RO·및 ROOH)을 포착 및 제거하여 지방을 함유한 식품의 산패를 억제해 줄 뿐 아니라 생체 내에서 생성되는 활성산소 라디칼(1O2, O- 2, H2O2,·OH)에 의한 지질과산화반응을 억제하여 암, 심장병, 동맥경화증, 염증, 면역저하 및 노화를 예방해주는 생리활성물질로써 크게 각광을 받고 있다.
포도 과피에 다량 함유되어 있는 안토시아닌 색소는 생체 내 활성산소에 의해 유도되는 세포막의 지질과산화반응을 효과적으로 억제할 수 있는 천연 항산화제로서의 기능뿐만 아니라 지질단백질(LDL) 산화를 억제하는 항고혈압성 생리활성물질로서도 기능이 알려져 있다. 현재 안토시아닌은 식품 착색료로서 사용만이 아닌 식이성 기능성식품 신소재로 널리 사용된다.
분자 마커는 생물체의 유전 변이를 분자적 수준에서 식별하는 마커로, 집단유전학 연구, 생물종 다양성 연구, 생물체 내 유전자의 특성과 기능을 규명하는 분야 등으로 그 적용분야를 확대하고 있다. 향후 유전육종의 메가트렌드는 건강한 식생활에 대한 수요의 증가로 인해 기능성 식물의 육종이 될 것으로 전망된다.
한국등록특허 제10-1976974호(2019.05.02 등록)
본 발명의 목적은 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종 구별용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종 구별용 키트 및 이를 이용한 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종 구별 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 이루어진 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종 구별용 프라이머 세트를 포함하는 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종 구별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종 구별용 프라이머 세트를 이용한 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종 구별 방법을 제공한다.
본 발명은 포도 품종에서 고기능성 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 위한 정량 PCR 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 항산화, 항염증, 항암 활성 등에 뛰어난 기능을 갖는 안토시아닌을 많이 함유한 포도 계통이나 자원선발을 위해서는 안토시아닌 물질 분석을 수행해야 하는데 시간과 비용이 많이 소요된다. 그러나 본 발명에서 개발한 안토시아닌 생산과 관련된 유전자를 이용한 정량 PCR (qRT-PCR) 마커 세트를 이용한다면 단시간 내에 안토시아닌 함량이 높은 포도 선발 및 확인이 가능하다. 본 발명에 따른 3개의 유전자 정보로 구성된 고기능성 안토시아닌 발현 마커 세트를 이용함으로써 고기능성 안토시아닌 함량이 강화된 포도 자원 및 계통을 조기에 선발함으로써 포도육종 비용의 절감 뿐만 아니라 육종효율 증대에도 기여할 것으로 기대된다.
도 1은 각 단계의 포도 송이에 대한 사진을 나타낸다.
도 2는 식물 내에서의 안토시아닌 생합성 경로 및 안토시아닌 생합성 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자들을 나타낸다. PAL, 페닐알라닌 암모니아 라이에이즈(phenylalanine ammonia lyase); C4H, 신나메이트-4-하이드록실레이즈(cinnarmate-4-hydroxylase); 4CL, 4-쿠마로일-coA 합성효소(4-coumaroyl-coA synthase); CHS, 찰콘 합성효소(chalcone synthase); CHI, 찰콘 이소머레이즈(chalcone isomerase); F3H, 플라바논 3β-하이드록실레이즈(flavanone 3β-hydroxylase); DFR, 디하이드로플라보놀 4-환원효소(dihydroflavonol 4-reductase); LDOX, 류코안토시아니딘 디옥시게네이즈(leucoanthocyanidin dioxygenase) [=ANS, 안토시아니딘 합성효소(anthocyanidin synthase)]; UFGT, 플라보노이드 글루코실트랜스퍼레이즈(flavonoid glucosyltransferase) [=3-GT, 3-O-글루코실트랜스퍼레이즈(3-O-glucosyltransferase)]; OMT, O-메틸트랜스퍼레이즈(O-methyltransferase); 5-GT, 5-O-글루코실트랜스퍼레이즈(5-O-glucosyltransferase); AT, 안토시아닌 아실트랜스퍼레이즈(anthocyanin acyltransferases); GST, 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈(glutathione S-transferase); MRTE, 다중약물 및 독성 화합물 분비(multidrug and toxic compound extrusion); ABC, ATP-결합 카세트(ATP-binding cassette).
도 3은 4종의 포도 품종 각 단계에서 선별된 안토시아닌 경로 관련 유전자들에 대한 qRT-PCR 결과를 나타낸다.
본 발명에서는 포도의 고기능성 안토시아닌 생합성 및 조절에 관여하는 주요 유전자를 이용하여, 안토시아닌 고함량 포도 계통 및 자원을 선발할 수 있는 정량 PCR 마커 세트를 개발하고자 하였다. 이를 위해 유색 포도와 무색 포도의 과립의 발현체(transcriptome)를 비교하여, 무색 포도(청포도)에서는 매우 낮은 발현을 보이거나 거의 발현되지 않지만, 유색 포도(적포도)에서는 매우 높은 발현을 보이는 안토시아닌 생합성 및 조절에 관련된 주요 유전자의 발현 정도를 비교하였다. 이들 정보로부터 고기능성 안토시아닌 함량이 강화된 포도 품종 육성 및 유전자원 발굴에 유용하게 사용할 수 있는 정량 PCR 마커 세트를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서는 고기능성 안토시아닌 생합성 및 조절에 관여하는 주요 유전자의 발현 분석을 위하여 3개의 발현 마커로 구성된 세트를 제안하였다. 안토시아닌 생합성 및 조절에 관여하는 유전자의 LCB(Linear Conserved Block)을 확인하고, 이를 바탕으로 발현 마커를 구성할 프라이머 제작이 가능한 서열을 선별하고 20~30여개의 유전자 후보를 선발하여 프라이머 세트를 제작하였다. 제작된 프라이머 세트로 유색 포도 2종의 과피와 무색 포도 2종의 과피에 대해 qRT-PCR을 수행하였다. 그 결과를 바탕으로 유색과 무색 품종을 뚜렷하게 구분할 수 있는 3개의 프라이머 세트를 선발하였다. 안토시아닌 유전자의 발현을 비교할 수 있는 3개의 고기능성 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 위한 정량 PCR 마커 세트는 이 중 하나의 유전자 발현마커만을 사용하여도 유색 포도인지 무색 포도인지를 판정할 수 있고, 고함량의 안토시아닌을 갖는 포도의 선발이 가능하다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 이루어진 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 유색 포도는‘캠벨얼리(Campbell Early)’또는‘홍주(Hongju)’일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자 마커(molecular marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 본 발명에 있어서, 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종 구별용 프라이머 세트를 포함하는 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종 구별용 키트를 제공한다.
상기의 프라이머 세트 이외에, qRT-PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2 +와 같은 보조인자(cofactor) 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 포도에서 RNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 이루어진 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 qRT-PCR 증폭을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 qRT-PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종 구별 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 유색 포도는 ‘캠벨얼리(Campbell Early)’ 또는 ‘홍주(Hongju)’일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트는 찰콘 합성효소(chalcone synthase; CHS)의 발현 정도를, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트는 플라바논 3-수산화효소(flavanone 3-hydroxylase; F3H)의 발현정도를, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트는 UDP-Glc-플라보노이드 3-O-글루코실 트랜스퍼레이즈(UDP-Glc-flavonoid 3-O-glucosyl transferase; UFGT)의 발현정도를 확인하기 위한 것일 수 있다.
본 발명에 사용된 찰콘 합성효소(chalcone synthase; CHS)는 LOC100258106로서, CDS 서열은 XM_002263983.3이다.
본 발명에 사용된 플라바논 3-수산화효소(flavanone 3-hydroxylase; F3H)는 LOC100233079로서, CDS 서열은 NM_001281105.1이다.
본 발명에 사용된 UDP-Glc-플라보노이드 3-O-글루코실 트랜스퍼레이즈(UDP-Glc-flavonoid 3-O-glucosyl transferase; UFGT)는 LOC100233099로서, CDS 서열은 XM_002276999.4이다.
포도에서 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 또한, qRT-PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 qRT-PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법은 상기 qRT-PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 젤 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 젤 전기영동을 수행할 수 있으며, 젤 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로오스 젤 전기영동 또는 아크릴아미드 젤 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 식물 재료 및 total RNA 추출
식물 재료로는 경기도 부천시 가톨릭대학교 포도밭에서 재배 중인 4종의 포도를 사용하였다(표 1). 포도는 아조변이 등이 심하므로 포도 품종 간에 변이 확인을 위해 공통적으로 각 포도 품종별로 1~2개체의 포도나무, 총 8개체 포도나무에서 과피색의 변화 단계를 3단계-1단계: 수정 후 50일경(green), 2단계: 수정 후 60일경(color change), 3단계: 90일 이후(ripened)-로 구분하여 포도 과립을 채취하였다(도 1).
채취한 포도 과립에서 과피만을 분리하여 CTAB method (Peng et al., 2014; Reid et al., 2006)를 이용하여 total RNA를 추출하였고, NanoDrop spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)로 total RNA 정량하였다. total RNA 500ng으로 cDNA를 합성하여 real time PCR (StepOnePlus real time PCR System, Applied Biosystems, USA) 반응에 사용하였다.
Cultivar name Classification of breeding Skin color
Vitis labrusca cv. Campbell Early overseas red
V. vinifera cv. Hongju domestic
V. vinifera cv. Italia overseas white
V. vinifera cv. Shine Muscat overseas
2. 정량적 실시간- PCR (Quantitative realtime - PCR ; qRT - PCR )
Total RNA 500ng을 사용하여 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, California, USA)으로 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR은 VvActin (LOC100232866 Actin-7, VvActin-F : 5’-CTTGCATCCCTCAGCACCTT-3’ / VvActin-R: 5’-TCCTGTGGACAATGGATGGA-3’)를 내부대조군으로 하였고, Power SYBR Green PCR master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, USA)를 사용하였다. 실시간유전자증폭의 분석은 StepOne Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Warrington, UK)을 이용하여 분석하였다. PCR 은 95℃에서 10 분 변성과정 후 95℃ 30 초, 60℃ 30 초, 72℃ 30 초의 과정을 40 번 반복 후 95℃에서 15 초동안 반응을 수행하였다. 이후 60℃부터 95℃까지 0.3℃씩 증가시키며 용융곡선 분석을 진행하였다. 측정결과에 대한 상대발현양 분석은 ‘이탈리아(Italia)’를 기준으로 2-ΔΔCt 방법(Livak and Schmittgen, 2001)을 사용하여 계산하였다.
3. 후보 발현 마커의 발굴
NCBI의 'Pinot Noir' 표준유전체(PN40024, assembly 12X, NCBI annotation release 102, Nov 2016) 정보에서 안토시아닌 색소의 생합성에 관여하는 효소 유전자와 발현조절 유전자의 정보를 수집하고 LCB (Linear Conserved Block)을 품종별로 비교하였고 후보 유전자를 선발하였다. 후보 유전자들의 발현 수준은 유색 포도 품종인 ‘홍주(Hongju)’과립의 일자별 (수정후 7일, 수정후 14일, 수정후 60일, 수정후 90일) 전사체 분석 정보(unpublished data)와 ‘홍주’ 와 ‘이탈리아(Italia)’의 종자(수정후 매 7일 간격으로 7일자~ 42일자)에서의 전사체 정보(PRJNA533855)를 이용하였다. 각 후보 유전자별 read count 값은 TMM (Trimmed Mean of M value) 값으로 표준화하였다. TMM 값을 기반으로 ‘홍주’ 와 ‘이탈리아(Italia)’의 종자에서는 발현이 낮거나 발현되지 않고, ‘홍주’60일과 90일차에서 차등 발현하는 유전자를 선발하였다. 차등 발현 유전자 (differentially expressed gene, DEG) 는 R Bioconductor 의 EdgeR 프로그램(Robinson et al., 2010)을 이용하여 선별하였다. 선별 조건은 false discovery rate (FDR) 0.001 미만, fold-changes 4 이상으로 수행하였다.
4. 안토시아닌 생합성과 관련된 유전자의 발현 확인이 가능한 발현 마커 선발
안토시아닌 생합성 조절과 관련된 차등 발현 유전자를 산발하여 추출한 발현 마커 가용 영역에서 수정된 PrimerPro Perl pipeline에 있는 Prime3(version 2.3.6) 알고리즘을 이용하여 정량 PCR 수행을 위한 프라이머(primer)를 3쌍씩 임의로 디자인하였다. 이때 프라이머 길이는 18~25mer, GC contents는 40~60%, PCR product size는 100~300bp 조건으로 하여 수행하였다.
디자인된 프라이머는 PrimerPro Perl pipeline에 있는 e-PCR(NCBI e-PCR package)을 이용하여 증폭이 잘 되는지 in silico PCR로 확인하였다.
5. 안토시아닌 발현 마커 세트의 검정
선발된 3개 발현 유전자 증폭 프라이머 세트로 구성된 고기능성 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 위한 정량 PCR 마커 세트에 대해 보라색(grape-Med)의 과립색을 갖는 ‘홍주’와 어두운 보라색(grape-DK)을 갖는‘캠벨얼리(Campbell Early)’의 유색 포도 2종과 밝은 황녹색(Moss Green-LT)을 갖는‘이탈리아’와 연두색(Yellow Green)을 갖는 ‘샤인 머스켓(Shine Muscat)’의 백색 포도 2종을 재료로 하여 과피색 변화가 있는 3 시기에서 각각 RNA를 추출하였다. cDNA를 합성 후 이를 주형으로 qRT-PCR을 수행하였고 2- ΔΔCt 값을 계산하여 상대 발현량을 확인하였다.
< 실시예 >
1. 차등 발현 유전자 선발 및 qRT - PCR primer 제작 및 고기능성 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 위한 정량 PCR 마커 세트 구성
표준유전체에 매핑된 RNA-seq reads 중 유전자영역에 매핑된 서열은 표준유전체의 유전자구간 정보를 바탕으로 유전자별 read count로 변환하여 추출하였다. 유전자별 read count 값은 TMM 값으로 표준화하였다. TMM 값을 기반으로 유색 포도인 ‘홍주’60일차와 90일차에서 차등발현 되는 유전자를 분석하고 선발하였다. 안토시아닌 생합성 관련 효소 유전자와 전사인자를 17개 선발하여 Prime3(version 2.3.6) 알고리즘을 이용하여 51개 primer 세트를 제작하였다(도 2). 유색 포도 2품종(‘홍주’, ‘캠벨얼리’)와 무색 포도 2품종(‘이탈리아’, ‘샤인 머스켓’)에서 제작된 프라이머 세트로 qRT-PCR을 진행하여 발현을 검정하였다. 그 결과를 바탕으로 고기능성 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 위한 정량 PCR 마커 세트를 구성하는데 가장 적절한 3개 프라이머 세트를 확정하였다(표 2).
선발된 3개 대상 유전자는 안토시아닌 생합성 기작에 관여하는 효소인 찰콘 합성효소(chalcone synthase; CHS)와 플라바논 3-수산화효소(flavanone 3-hydroxylase; F3H), 그리고 UDP-Glc-플라보노이드 3-O-글루코실 트랜스퍼레이즈(UDP-Glc-flavonoid 3-O-glucosyl transferase; UFGT)를 암호화하고 있는 유전자이며, 이들의 발현 유전자에서 제작된 프라이머 세트로 이루어졌다. 2개의 유색 포도와 2개의 무색 포도에 대해 3개 프라이머 세트를 qRT-PCR을 수행한 결과를 도 3에 도식화하였다.
qRT-PCR을 수행한 결과, 선발된 유전자들은 유색 포도인 ‘캠벨얼리’와 ‘홍주’에서 무색 포도인 ‘이탈리아’와 ‘샤인머스켓’보다 현저하게 높은 발현을 보였다. 이는 발굴된 3개 프라이머 세트가 유색 포도 품종과 무색 포도 품종을 명확하게 구분하였음을 나타낸다. 선발한 3개 고기능성 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 위한 정량 PCR 마커 세트를 이용하여 고기능성 안토시아닌 함량이 높은 포도 품종 선별이 가능함으로써, 안토시아닌 물질 분석에 대한 시간과 노력을 절감할 수 있고, 안토시아닌 함량이 강화된 포도 품종 육성 및 유전자원 발굴에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
Name Sequence(5' to 3') size(mer) GC% Product(bp)
VvCHS -F CCCATGTTCGAATTGGTTTC (서열번호 1) 20 45 206
-R TGTGCAATCCAGAAAATGGA (서열번호 2) 20 40
VvF3H -F AAGATGAACGTCCCAAGGTG (서열번호 3) 20 50 148
-R ACTTGGAAAATCCCCCAGTC (서열번호 4) 20 50
VvUFGT -F CTCGACGATTCCCTAACCAA (서열번호 5) 20 50 173
-R GTGACGGTGCCAAAGCTAAT (서열번호 6) 20 50
즉, 본 발명은 고기능성 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석을 위한 정량 PCR 마커 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 포도의 과립의 과피에서 기능하는 안토시아닌 생산과 관련된 유전자의 발현 정도를 파악함으로써, 유색 포도인지 무색 포도인지를 뚜렷하게 구분할 수 있는 3개 프라이머 세트로 구성되어 있다. 본 발명의 세트를 구성하는 3개 유전자 중 하나의 유전자 발현 마커만을 사용하여도 안토시아닌의 함량이 높은 포도 계통 및 자원의 선별이 가능하다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A set of qRT-PCR markers for analysis of high functional anthocyanin biosynthesis-related gene expression in grapes and uses thereof <130> ADP-2019-0615 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Vitis vinifera <400> 1 cccatgttcg aattggtttc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Vitis vinifera <400> 2 tgtgcaatcc agaaaatgga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Vitis vinifera <400> 3 aagatgaacg tcccaaggtg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Vitis vinifera <400> 4 acttggaaaa tcccccagtc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Vitis vinifera <400> 5 ctcgacgatt ccctaaccaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Vitis vinifera <400> 6 gtgacggtgc caaagctaat 20

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종인 ‘캠벨얼리(Campbell Early)’또는 ‘홍주(Hongju)’ 구별용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 따른 조성물을 포함하는 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종인 ‘캠벨얼리(Campbell Early)’또는 ‘홍주(Hongju)’ 구별용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종인 ‘캠벨얼리(Campbell Early)’또는 ‘홍주(Hongju)’ 구별용 키트.
  5. (1) 포도에서 RNA를 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리된 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 qRT-PCR 증폭을 수행하는 단계; 및
    (3) 상기 qRT-PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종인 ‘캠벨얼리(Campbell Early)’또는 ‘홍주(Hongju)’ 구별 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트는 찰콘 합성효소(chalcone synthase; CHS)의 발현 정도를, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트는 플라바논 3-수산화효소(flavanone 3-hydroxylase; F3H)의 발현정도를, 상기 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트는 UDP-Glc-플라보노이드 3-O-글루코실 트랜스퍼레이즈(UDP-Glc-flavonoid 3-O-glucosyl transferase; UFGT)의 발현정도를 확인하기 위한 것을 특징으로 하는 안토시아닌 고함량 유색 포도 품종인 ‘캠벨얼리(Campbell Early)’또는 ‘홍주(Hongju)’ 구별 방법.
  7. 삭제
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