KR102279347B1

KR102279347B1 - 피리딘계 화합물을 유효성분으로 함유하는 dyrk 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102279347B1
Application number: KR1020170172214A
Authority: KR
Inventors: 조성찬; 최미리; 이주연
Original assignee: 한국생명공학연구원; 한국화학연구원
Priority date: 2016-12-15
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2021-07-21
Also published as: US10765669B2; KR20180069733A; EP3542797A1; JP2021073292A; EP3542797A4; US20200085803A1; JP2020502167A; CN110325189A

Abstract

본 발명은 피리딘계 화합물을 유효성분으로 함유하는 DYRK 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 약학적 조성물의 유효성분으로 이용되는 본 발명의 피리딘계 화합물은 매우 높은 효능으로, 그리고 매우 높은 선택성으로 DYRK1A의 활성을 억제하는바, 다운증후군, 퇴행성 뇌질환, 암 질환, 대사성 질환 등과 같은 DYRK 관련 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

피리딘계 화합물을 유효성분으로 함유하는 DYRK 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention and treatment of DYRK related diseases comprising pyridine compounds}

본 발명은 피리딘계 화합물을 유효성분으로 함유하는 DYRK 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

DYRK(이중 특이성 티로신 인산화 조절 키나아제)는 세린 / 트레오닌 키나아제로 진화적으로 매우 보전성이 높고, 중추 신경계 발달 및 기능에서 다양한 역할을 수행한다. 인간은 DYRK1A, DYRK1B, DYRK2, DYRK3, DYRK4 이상 5개의 아형(isoform)을 가지고 있는데, 이 중에서 다운증후군 및 퇴행성 뇌질환 등과 관련되어 DYRK1A가 가장 관심을 받고 폭넓게 연구되고 있다. DYRK1A의 유전자는 인간의 21번 염색체 다운증후군 위험 지역 (DSCR)에 위치해 있으며, 다운증후군 환자들에게 전형적으로 나타나는 인지장애의 결정적인 요인으로 밝혀지면서 더 많은 관심을 받게 되었다. 다운증후군 환자들의 경우 35-40세 정도부터 알츠하이머병에서 주로 나타나는 인지장애, 기억력장애를 겪게 된다. 흥미롭게도 DYRK1A의 발현 및 활성 증가는 다운증후군 뿐만 아니라 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽병과 같은 퇴행성 뇌질환 환자에서도 나타난다.

알츠하이머병은 amyloid β peptide의 불용성 침전물의 세포 축적인 노인반(amyloid plaque), 과인산화된 타우의 집합체로 구성된 세포 내 신경 섬유 엉킴(neurofibrillary tangles)의 형성, 크게 이 두 가지 유형의 신경 병리를 동반하는데, DYRK1A는 이러한 신경병리의 형성에 핵심적인 단백질들인 타우(Tau), amyloid β 전구체 단백질 (APP), Presenilin 1 (PS1) 등을 직접 인산화하여 알츠하이머 발병과 관련되는 것으로 알려져 있다. 또한, DYRK1A는 다른 퇴행성 뇌질환에서도 중요한 역할을 하는데, α-synuclein의 인산화를 통해서 파킨슨병의 핵심 신경병리인 Lewy body의 형성에 영향을 주고, HIP-1의 인산화를 통해서 헌팅턴병의 발병에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 이러한 사실들은 DYRK1A가 Tau, APP, PS1, α-synuclein, HIP-1 등의 인산화를 통해서 다양한 신경 병리의 형성에 기여하고 결과적으로 다운증후군 뿐만 아니라 다양한 퇴행성 뇌질환에서 인지 및 기억장애를 초래하는 것을 말해준다.

실제로 인간 또는 쥐의 DYRK1A를 과발현 하는 형질전환 마우스 모델은 해마에 의존하는 공간학습과 운동신경 결핍 및 발달 지연을 포함하는 다운증후군의 표현형을 보이는데, 이것은 다운증후군과 관련된 정신지체에 있어서 DYRK1A의 중요한 기능을 암시하고 있다.

기존에 알츠하이머병에 대한 치료제로 FDA 승인된 약물들은 주로 신경전달물질의 이상을 개선하는 방식으로 작용하고 병의 증상을 일부 완화시키는 제한적 수준의 효과가 있었다. 앞으로의 치료제 개발 전략은 알츠하이머병의 발병과 직접적으로 관련된 노인반, 신경섬유 엉킴 등을 억제하는 방식으로의 보다 근본적인 치료접근법이 요구된다. 그러나 이러한 기존의 근본적인 접근법 또한 단일 신경병리에 대한 개선만으로는 제대로 된 치료효과를 기대하기 어렵다는 것이 정설화 되어 있어, 노인반과 신경섬유엉킴을 동시에 제어할 수 있는 다중표적방식의 새로운 전략이 요구되는 상황이다.

이러한 관점에서 본 발명자들은 노인반과 신경섬유엉킴을 동시에 제어할 수 있는 전략을 연구하던 중 DYRK1A를 표적으로 하는 약물개발을 시도하였고 본 발명에 따른 피리딘계 화합물이 기존에 공지된 DYRK1A 억제물질과 구조적으로 상이하고, 억제효능이 더 우수하고, DYRK1A에 대한 선택성이 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

더불어 최근 연구에 의하면 DYRK1A는 다운증후군, 퇴행성 뇌질환 외에도 제1형 당뇨의 치료제 개발 표적으로도 관심을 가지고 있다. DYRK1A는 NFAT 신호전달을 통해서 췌장의 인슐린 생성세포인 베타세포의 증식 조절에 관여하는데, DYRK1A를 억제하게 되면 이 세포의 증식이 활성화 되는 것이 여러 연구그룹에 의해서 확인 되었다. 결국, DYRK1A의 효과적인 억제약물은 췌장 베타세포의 증식을 활성화해서 인슐린 생성 및 분비를 촉진하게 됨으로써 제1형 당뇨의 환자에게서 치료효과를 기대할 수 있다.

또한, DYRK1A는 몇 몇 암종에서 발현이 높게 나타나는데 뇌종양 및 혈액암이 대표적인 예이다. DYRK1A는 세포내 여러 인자들 (p27, cyclin D1, DREAM, c-myc, Sprouty) 등의 인산화를 통해 암의 생성 및 진행에 관여하는 것으로 보고되고 있다. 특히 Sprouty의 경우 cancer stem cell의 stemness 유지에 중요한 EGFR의 recyclining을 조절하는 중요한 인자인데, DYRK1A를 억제함으로써 결과적으로 cancer stem cell의 stemness를 억제하는 방식으로 항암효과를 기대할 수 있다.

본 발명으로 도출된 화합물은 DYRK1A에 대해서 상대적으로 높은 억제효능을 보이긴 하나 DYRK1B, DYRK3, DYRK4에도 억제효능이 확인되어 이들 아형(isoform)이 주로 관여하는 것으로 알려진 세포주기의 조절을 통해서 항암 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 목적은 다운증후군, 퇴행성 뇌질환, 암 질환, 대사성 질환 등과 같은 DYRK 관련 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 DYRK 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

(상기 화학식에서, R¹, R², R³, R⁴ 및 R⁵는 본 발명에서 정의한 바와 같다).

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 강력한 DYRK1A 억제 활성을 가질 뿐만 아니라, DYRK 단백질에 대한 선택성이 매우 높으므로, 다운증후군, 퇴행성 뇌질환, 암 질환, 대사성 질환 등과 같은 DYRK 관련 질병의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 DYRK1A 억제물질 발굴을 위한 가상 탐색(virtual screening) 프로세스를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 피리딘계 DYRK1A 신규 억제 물질 3종의 발굴 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 세포기반의 DYRK1A 효능평가 시스템인 NFAT 신호전달 리포터의 작동 원리와 이를 이용하여 수행한 2차 효능 평가의 결과를 나타낸다.
도 4는 화학식 2 및 3으로 표시되는 화합물들의 농도의존적 DYRK1A 억제효능을 확인한 NFAT 신호전달 리포터 발현 그래프로서, 화합물 1은 화학식 2로 표시되는 화합물을, 화합물 2는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 나타낸다.
도 5A는 포유동물 세포 수준에서 본 발명에 따른 화학식 2로 표시되는 화합물의 Tau 인산화 억제 효능을 나타낸 사진이고, 도 5B는 포유동물 세포 수준에서 본 발명에 따른 화학식 2로 표시되는 화합물의 Tau 인산화 억제 효능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 화학식 2로 표시되는 화합물의 인 비트로 CMGC 키나아제(in vitro CMGC kinase) 효소 활성 억제 효능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 화학식 2 및 3으로 표시되는 화합물들의 DYRK1A와의 결합구조 예측 모델을 나타낸 그림으로서, 화합물 1은 화학식 2로 표시되는 화합물을, 화합물 2는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.

상기 화학식 1에서, R¹은 수소 또는 -NR⁶R⁷일 수 있다. 여기서, R⁶ 및 R⁷은 서로 독립적으로 수소, C₁-C₅의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 또는 벤질일 수 있고, 구체적으로는 상기 R⁶ 및 R⁷은 서로 독립적으로 수소 또는 C₁-C₃의 직쇄 또는 분지쇄 알킬일 수 있다.

상기 화학식 1에서, R², R³ 및 R⁴는 서로 독립적으로 수소, 할로겐, C₁-C₅의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, -NR⁸R⁹, OR⁸, -CN, -NHC(O)R⁸, -SO₂R⁸, -OS(O)₂R⁸, 피롤리딘, 피페리딘 또는 모폴린일 수 있고, 구체적으로 상기 R², R³ 및 R⁴는 서로 독립적으로 수소, -F, -Cl, -Br, -I, C₁-C₃의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, -NR⁸R⁹, OR⁸, -CN, -NHC(O)R⁸, -SO₂R⁸, -OS(O)₂R⁸, 피롤리딘, 피페리딘 또는 모폴린일 수 있고, 더욱 구체적으로 상기 R², R³ 및 R⁴는 서로 독립적으로 수소, -F, -Cl, -Br, -I, C₁-C₃의 직쇄 또는 분지쇄 알킬일 수 있다. 여기서, 상기 R⁸ 및 R⁹는 서로 독립적으로 수소, C₁-C₅의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, C₁-C₅의 직쇄 또는 분지쇄 알키닐, C₁-C₅의 직쇄 또는 분지쇄 알케닐, C₆-C₁₂의 아릴, 할로겐으로 치환된 C₆-C₁₂의 아릴 또는 트리할로겐메틸로 치환된 C₆-C₁₂의 아릴일 수 있고, 구체적으로 상기 R⁸ 및 R⁹는 서로 독립적으로 수소, C₁-C₅의 직쇄 또는 분지쇄 알킬일 수 있다.

상기 화학식 1에서, R⁵는 수소, C₁-C₅의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 비치환 4-피페리딘 또는 아세틸 치환된 4-피페리딘일 수 있고, 구체적으로 상기 R⁵는 수소, C₁-C₃의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 비치환 4-피페리딘 또는 아세틸 치환된 4-피페리딘일 수 있다.

상기 화학식 1에서, A는 탄소 또는 질소일 수 있고, 구체적으로 상기 A는 질소일 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물로 표시되는 화합물일 수 있다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 DYRK의 활성을 억제하는 효과를 가진다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 화학식 1로 표시되는 화합물이 DYRK1A를 강력하면서도 선택성 있게 저해하는 것을 확인하고, DYRK1A의 대표적인 기질 단백질이면서 신경섬유엉킴(neurofibrillary tangle) 형성의 핵심 인자인 Tau 단백질의 인산화 억제를 확인하였고, 분자 모델링을 통해 ATP와 경쟁적인 방식으로 억제작용을 한다는 사실을 확인하였다. 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 DYRK 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 DYRK 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 "예방"은 질환 또는 장애에 걸릴 위험을 감소시키는 것을 나타내며, 즉, 질환에 노출되거나 질환에 걸리기는 쉽지만 아직 질환에 걸리거나 질환의 증후를 나타내지 않는 대상에서 질병의 1종 이상의 임상적 증후가 진행되지 않도록 하는 것을 나타낸다. 상기 "치료"는 질환 또는 장애를 경감시키는 것을 나타내며, 즉 질환 또는 이의 1종 이상의 임상적 증후의 진행을 저지 또는 감소시키는 것을 나타낸다.

상기 DYRK 관련 질환은 DYRK의 과발현 및 과활성화에 의해 유발되는 질환을 의미하고, 예를 들어 다운증후군, 퇴행성 뇌질환, 암 질환, 대사성 질환 등일 수 있다.

상기 퇴행성 뇌질환은 픽병, 혈관성 치매, 알츠하이머, 파킨슨병, 루이체 치매, 전두측두엽 치매, 크로이츠펠트-야곱병, 헌팅턴병-무도병, 다발성 경화증, 길랑-바레 증후군 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환일 수 있다.

상기 암 질환은 폐암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 주위 암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암, 자궁내막 암, 자궁 경부암, 질암, 외음부암, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신세포암, 신우암, 중추 신경계(CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

나아가, 상기 대사성 질환은 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증, 지방간, 심장병, 당뇨, 심근경색, 협심증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예들에서는 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물이 DYRK1A를 효과적으로 억제함으로써 Tau, APP, PS1, α-synuclein, HIP1 등의 인산화 조절에 의한 신경섬유엉킴, 노인반, lewy body 형성을 조절하고 결국 알츠하이머를 비롯한 여러 퇴행성 뇌질환과 같은 DYRK 관련 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있음을 확인하였다.

상기 "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용가능하면서, 모 화합물의 목적하는 약리학적 활성을 갖는 본 발명의 화합물의 염을 지칭한다. 이러한 염은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로, 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 황산수소나트륨, 인산, 질산, 탄산 등과 같은 무기산과의 염, 개미산, 초산, 프로피온산, 옥살산, 석신산, 벤조산, 시트르산, 말레인산, 말론산, 타르타르산, 글루콘산, 락트산, 게스티스산, 푸마르산, 락토비온산, 살리실릭산, 또는 아세틸살리실릭산(아스피린)과 같은 유기산과의 염, 글리신, 알라닌, 바닐린, 이소루신, 세린, 시스테인, 시스틴, 아스파라진산, 글루타민, 리진, 아르기닌, 타이로신, 프롤린 등과 같은 아미노산과의 염, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산과의 염, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속과의 반응에 의한 금속염, 또는 암모늄 이온과의 염 등을 포함한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상적인 방법에 따라 무독성이면서 약학적으로 허용 가능한 담체, 보강제 및 부형제 등을 첨가하여 제형화 될 수 있으며, 예컨대 정제, 캅셀제, 트로키제, 액제, 현탁제 등의 경구 투여용 제제 또는 비경구 투여용 제제로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 사용될 수 있는 부형제로는 감미제, 결합제, 용해제, 용해보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡착제, 붕해제, 산화방지제, 방부제, 활탁제, 충진제, 방향제 등이 있으며, 예를 들면 락토스, 덱스트 로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스, 글라이신, 실리카, 탈크, 스테아린산, 스테린, 마그네슘 스테아 린산염, 마그네슘 알루미늄 규산염, 녹말, 젤라틴, 트라가칸트 고무, 알지닌산, 소디움 알진산염, 메틸셀룰로오스, 소디움 카르복실메틸셀룰로오스, 아가, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼슘, 오렌지 엣센스, 딸기 엣센스, 바닐라 향 등을 들 수 있다.

본 발명의 화합물은 약학적 조성물 총 중량에 대해서 0.1중량% 내지 95중량% 범위의 농도 수준으로, 즉 목적하는 효과를 얻기에 충분한 양으로 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은, 예를 들면 피부, 경구, 직장, 정맥, 복강, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있고, 바람직하게는 경구 또는 정맥 중 어느 하나의 경로로 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

상기 투여는 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화합물은 다양한 제제화가 용이하며, 예를 들면 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주입용 제형, 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립 또는 주사액제로 제제화할 수 있다.

상기 투여시 화합물의 양은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 화합물의 일일 투여량은 0.0001~100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001~30 mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 아울러, 투여 기간은 1일 내지 2개월일 수 있으나, 질환의 예방 또는 치료 효과가 나타날 때까지 제한 없이 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 DYRK관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 건강기능성 식품 조성물은 다운증후군, 퇴행성 뇌질환, 암 질환, 대사성 질환 등과 같은 DYRK 관련 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 식품, 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품, 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 g 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 화학식 1의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 퀴놀린 4-온 유도체는 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 퀴놀린 4-온 유도체를 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 하기 실험예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실험예 1] 본 발명에 따른 피리딘계 화합물의 스크리닝

본 발명에 따른 피리딘계 화합물을 찾아내기 위해 약 34만 종의 화합물을 대상으로 가상 탐색 및 실험을 진행하여 DYRK1A 억제 효능이 있는 화합물을 도출하였다.

[1-1] Virtual screening을 이용한 신규 억제물질 도출 (1차 스크리닝)

대량의 화합물 라이브러리에서 DYRK1A 타겟을 저해하는 효능이 예상되는 화합물을 선별하기 위해 가용 자원을 효율적으로 사용하고자 분자모델링 기술을 적용하였다. 컴퓨터를 이용한 시뮬레이션은 크게 두가지 기준으로 나눠 세부적으로 다양한 방법을 적용할 수 있는데, 타겟 단백질의 3D 결정구조가 밝혀져 있는 경우 단백질의 3차원 구조를 이용하는 SBDD(Structure-Based Drug Design)와 리간드의 구조만을 알고 있을 때 적용할 수 있는 LBDD(Ligand-Based Drug Design)가 있다.

DYRK1A는 타겟의 x-ray 결정구조가 밝혀져 있으므로 단백질 구조 기반의 방법(Structure-Based Virtual Screening, SBVS)을 선정하고 반출 활용 가능한 한국화합물은행 보유 34만종의 화합물 라이브러리를 활용하였다. 알려진 21개의 x-ray 구조중 단백질의 3차 구조 분석을 통하여 결합 자리(binding site)의 공간, 입체구조(conformation) 차이 및 억제제(inhibitor) 구조의 다양성을 고려하고자 사용한 단백질은 PDB code 4MQ1 (2.35Å) 및 4YLL (1.4Å)으로 각각 피리도[2,3-d]피리미딘(pyrido[2,3-d]pyrimidine) 및 인돌[3,2-c]퀴놀린 카르복시산(indole[3,2-c]quinoline carboxylic acid) 유도체가 결합되어 있다. 활성 자리(active site)를 분석해 보면 힌지 영역(hinge region)의 수소 결합이 중요한 기능적 약리단(functional pharmacophore)이라 예상되어 가상탐색 적용시에는 선정한 2개의 단백질 구조에 대해 각각 2개씩의 조건을 적용하여 총 4회에 걸쳐 방대한 34만종의 화합물 라이브러리를 검색하였다.

위에서 제안한 SBVS 방법을 적용하여 걸러낸 각 5만 종의 화합물에 대해서는 화합물 구조 및 예측 결합모드를 분석하여 구조적 다양성을 최대한 고려하여 최종 육안-선별(eye-selection)로 570종을 선별하였다(도 1). 후속과정을 요약하면 570종의 후보약물에 대해 세포기반의 DYRK1A 활성평가를 이용한 이차 스크리닝 및 검증을 통해 동일 화학형(chemotype)의 우수한 억제약물 2종을 확인하였고, 추가 유도체 분석을 통해서 동일 화학형 약물 1종을 더 확인해서 도합 3종의 피리딘 계열 약물을 발굴하였다(도 2).

[1-2] 포유동물세포에서 DYRK1A 억제 효능 평가 (2차 스크리닝)

가상 탐색(virtual screening)을 통해 DYRK1A 억제 후보물질로 도출된 570종의 화합물에 대해서, 이미 잘 확립된 세포기반의 DYRK1A 효능평가 시스템인 NFAT 신호전달 리포터를 이용해서 2차 효능평가를 수행하였다(도 3). NFAT 신호전달 리포터는 DYRK1A 의존도가 매우 높으므로 제대로된 DYRK1A 억제 후보물질 도출실험에 효과적이다.

DYRK1A는 칼시뉴린(calcineurin)/NFAT(nuclear factor of activated T cells) 신호를 조절하고 인간의 발달 과정 단계에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. NFATc1 전사 인자는 보통 세포질에서 인산화되어 있는 단백질로 존재하다가 세포의 Ca²⁺ 농도가 올라가게 되면 Ca²⁺ 의존성 단백질인 인산가수분해 효소 칼시뉴린에 의해서 NFATc1가 탈인산화 되고 NFATc1는 핵 내로 이동하게 된다. 핵으로 들어간 NFATc1는 파트너 단백질 NFATn와 전사 복합체를 형성하고 표적 유전자의 프로모터에 결합하여 타겟유전자 발현을 유도하게 된다. 반대로 DYRK1A는 NFATc1를 인산화시킴으로써 NFATc1의 핵으로의 이동을 억제해서, 결과적으로 타겟 유전자의 발현이 억제되게 된다.

570개의 후보물질의 DYRK1A 억제효능을 NFATc1의 전사활성을 통해서 확인해 보았는데, 이를 위해 NFATc1의 전사활성을 측정하는데 유용한 NFAT-RE(NFAT response element)를 포함하는 루시퍼라제 리포터를 사용하였다. NFAT-RE-루시퍼라제 리포터를 293T 세포에서 과발현한 후 이오노마이신(ionomycin, IM) 과 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 처리해 세포내 Ca²⁺ 농도를 증가시킨 결과 루시퍼라제의 발현이 급격하게 증가되었다. 여기에 DYRK1A를 과발현했더니 루시퍼라제 발현이 상대적으로 억제되는 것을 확인하였다. 이 조건에서 처리한 후보약물이 DYRK1A를 억제하게되면 루시퍼라제의 증가결과를 나타내게 된다. 실제로 570개의 후보약물을 10 μM 농도로 처리한 결과, 상기 화학식 2, 3 및 4로 표시되는 화합물이 가장 높은 루시퍼라제 증가효과를 나타내었고(도 3), 그 활성수준이 기존에 보고된 DYRK1A 억제물질인 하르민(harmine), CX-4945보다 뚜렷하게 높게 나타났다.

최종적으로 확보된 3종의 DYRK1A 억제물질들은 구조적으로 벤즈옥사졸로와 피라졸이 결합된 피리딘 구조를 공통적으로 가지고 있고, 특히 화학식 4로 표시되는 화합물 3이 DYRK1A 억제 활성을 갖는 화합물의 최소단위인 것으로 판단된다.

화학식 2 및 3으로 표시되는 화합물들의 효능 수준을 보다 심층적으로 분석한 결과, 동일 조건에서 농도구배를 두어 처리했을 때 루시퍼라제의 활성이 점진적으로 증가하고, 3 μM을 처리하였을 경우에는 DYRK1A를 과발현하지 않은 조건의 루시퍼라제 활성보다 높게 나타났다. 앞서 언급된 것처럼, 화학식 2 및 3으로 표시되는 화합물들의 루시퍼라제 증가 효과는 기존에 보고된 DYRK1A 억제물질인 하르민, CX-4945보다 10배 정도 낮은 EC₅₀를 보여, 이들 보다 더욱 효능이 우수함을 확인하였다(도 4).

[실험예 2] 세포 수준에서 Tau 단백질 인산화 억제효능 평가

포유동물 세포 수준에서 화학식 2로 표시되는 화합물이 DYRK1A를 억제 할 수 있는지를 좀 더 명확히 확인하기 위해, DYRK1A의 대표적인 기질 단백질이면서 알츠하이머 및 다운증후군 등의 발병의 주요인자인 Tau의 인산화를 통해 확인하였다. Tau는 미세소관 관련 단백질로 DYRK1A는 Tau 단백질의 Thr212를 주로 인산화하고, 이러한 인산화는 DYRK1A가 과발현 된 다운증후군 모델 마우스의 해마조직에서 뚜렷하게 관찰된 바 있다. 포유동물세포인 293T에서 Tau 단백질만을 과발현 하였을 때 나타나지 않던 인산화가 DYRK1A를 같이 과발현 하였을 때 뚜렷하게 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 여기에 화학식 2로 표시되는 화합물을 농도를 증가시키면서 처리함에 따라 Tau의 인산화가 뚜렷하게 감소함을 확인하였다(도 5). 화학식 2로 표시되는 화합물에 의한 Tau 인산화 억제는 IC₅₀가 대략 50 nM 정도로 매우 낮게 나타났고, 이는 기존에 동일 실험조건에서 테스트한 하르민(IC₅₀=~500 nM), INDY, proINDY(IC₅₀s=~ 3000 nM)보다 약 10-60배 이상 강한 억제 효능에 해당된다. 이러한 결과는 포유동물 세포 수준에서 화학식 2로 표시되는 화합물이 DYRK1A의 강력한 억제 효과가 있음을 보여준다.

[실험예 3] 인 비트로 DYRK1A 인산화 활성 억제 효과 확인

화학식 2로 표시되는 화합물이 DYRK1A를 직접적으로 억제하는지를 확인하기 위해서, 순수 분리정제 된 DYRK1A 단백질을 이용한 인 비트로 키나아제 분석(in vitro kinase assay)을 수행하였고, DYRK1B, DYRK3, DYRK4 등의 DYRK family kinase 뿐만 아니라 대표적인 CMGC kinase들도 포함하여 DYRK1A에 대한 선택적 효능 여부도 확인하였다. 화학식 2로 표시되는 화합물은 DYRK1A에 가장 강력한 억제 효능을 보였는데, 100 nM 농도에서 95% 정도의 억제효과가 나타났고, 대략 10 nM의 IC₅₀가 예측될 정도로 강력한 억제 효과이다(도 6). 참고로 화학식 2로 표시되는 화합물은 DYRK1A 다음으로 GSK3β에 대해서도 높은 억제효능을 보였는데, DYRK1A와 더불어서 GSK3β도 퇴행성 뇌질환의 주요 신경병리인 아밀로이드 플락(amyloid plaque)과 신경섬유매듭(neurofibrillary tangle)의 형성에 중요한 키나아제인 점을 고려할 때 상승 효과를 기대할 수 있을 것으로 기대된다.

[실험예 4] 결합 분자모델링 측정

화학식 2 및 3으로 표시되는 화합물들은 기존 연구에서 c-Met 키아나제의 억제물질로 보고되어 있는데, ATP 경쟁적 방식으로 작용하는 것이 밝혀져 있다. 상기 화학식 2 및 3으로 표시되는 화합물들이 DYRK1A에 대해서도 ATP 경쟁적 방식으로 억제효능을 보이는지 그리고 어떤 결합력이 작용하는지 보다 심층적으로 확인하기 위해서, 컴퓨터를 이용한 분자모델링 기법을 활용해 상기 두 화합물들과 DYRK1A의 ATP 결합부위 사이의 docking 연구를 수행하였다.

그 결과를 나타낸 도 7에 따르면, 화학식 2 및 3으로 표시되는 화합물들은 각각 DYRK1A의 ATP 결합부위에 구조적으로 잘 맞아들어(fitting) 갔고, 특히 피리딘 고리(pyridine ring)의 질소와 DYRK1A 힌지 영역의 Leu241, Glu239 사이에서 형성되는 수소 결합이 중요한 역할을 하는 것으로 예측된다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 DYRK(dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinas) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 DYRK 관련 질환은 DYRK가 과발현 또는 과활성화 된 퇴행성 뇌질환이고,
상기 퇴행성 뇌질환은 픽병(Pick), 알츠하이머, 파킨슨 질환, 헌팅톤병-무도병 및 다운증후군으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환인 것인 약학적 조성물:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,
R¹은 -NH₂ 이고;
R², R³ 및 R⁴는 서로 독립적으로 수소이고;
R⁵는 수소, C₁-C₅의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 비치환 4-피페리딘, 아세틸 치환된 4-피페리딘이다).
제1항에 있어서,
상기 R⁵는 C₁-C₃의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 비치환 4-피페리딘 또는 아세틸 치환된 4-피페리딘인 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 R⁵는 C₁의 알킬, 비치환 4-피페리딘 또는 아세틸 치환된 4-피페리딘인 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 화학식 4로 표시되는 화합물인 것인 약학적 조성물:
[화학식 2]

[화학식 4]

.
제1항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것인 약학적 조성물:
[화학식 2]

.
삭제
삭제
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 DYRK(dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinas) 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물로서,
상기 DYRK 관련 질환은 DYRK가 과발현 또는 과활성화 된 퇴행성 뇌질환이고,
상기 퇴행성 뇌질환은 픽병(Pick), 알츠하이머, 파킨슨 질환, 헌팅톤병-무도병 및 다운증후군으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환인 것인 건강기능성 식품 조성물:
[화학식 1]

(상기 화학식에서,
R¹은 -NH₂이고;
R², R³ 및 R⁴는 서로 독립적으로 수소이고;
R⁵는 수소, C₁-C₅의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 비치환 4-피페리딘, 아세틸 치환된 4-피페리딘이다).
제8항에 있어서,
상기 R⁵는 C₁-C₃의 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 비치환 4-피페리딘 또는 아세틸 치환된 4-피페리딘인 건강기능성 식품 조성물.
제8항에 있어서,
상기 R⁵는 C₁의 알킬, 비치환 4-피페리딘 또는 아세틸 치환된 4-피페리딘인 건강기능성 식품 조성물.