KR102276022B1

KR102276022B1 - 돌연변이체 idh1 및 idh2 억제제로서의 7-페닐에틸아미노-4h-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 화합물

Info

Publication number: KR102276022B1
Application number: KR1020197016855A
Authority: KR
Inventors: 레나토 알레한드로 바우어; 서지 루이즈 불레; 티모시 폴 버크홀더; 레이몬드 길모어; 패트릭 제임스 한; 조란 란코빅
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2021-07-13
Also published as: US20200079791A1; MA47399A; DK3555105T3; CN110072867A; RS61108B1; IL267236A; JOP20190142A1; JOP20190142B1; MA47399B1; AU2017378060B2; TN2019000158A1; CO2019005287A2; SI3555105T1; ES2835281T3; BR112019009648A2; US20210230185A1; NZ754115A; US11649247B2; KR20190077539A; AU2020260493B2

Abstract

하기 구조를 가지며 IDH1 또는 IDH2 돌연변이체 암을 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 화합물, 또는 상기 화합물을 함유하는 제약 조성물:

Description

돌연변이체 IDH1 및 IDH2 억제제로서의 7-페닐에틸아미노-4H-피리미도[4,5-D][1,3]옥사진-2-온 화합물

이소시트레이트 데히드로게나제 (IDH) 단백질은 시트르산 (트리카르복실산 또는 크렙스) 회로에서 중요한 효소이다. 시트르산 회로는 많은 생화학적 경로에 중추적으로 중요하며 세포 대사의 가장 초기에 확립된 구성성분 중 하나이다.

이소시트레이트 데히드로게나제 (IDH)는 이소시트레이트의 α-케토글루타레이트 (2-옥소글루타레이트)로의 산화성 탈카르복실화를 촉매한다. 이들 효소는 2 가지 구별되는 하위 부류에 속하며, 이들 중 한 부류는 전자 수용자로서 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD(+))를 활용하고 다른 한 부류는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADP(+))를 활용한다. 3종의 포유동물 이소시트레이트 데히드로게나제가 보고되어 있다: 미토콘드리아 매트릭스에 국재화된 다중 소단위(multisubunit) 효소인 1종의 NAD(+)-의존성 이소시트레이트 데히드로게나제, 및 하나는 미토콘드리아성이고 다른 하나는 주로 시토졸성인, 2종의 NADP(+)-의존성 이소시트레이트 데히드로게나제. 각각의 NADP(+)-의존성 동종효소는 이량체이다. IDH1 유전자에 의해 코딩된 단백질은 세포질 및 퍼옥시솜에서 발견된 NADP(+)-의존성 이소시트레이트 데히드로게나제이다. 세포질 효소는 세포질 NADPH 생성에서 중요한 역할을 한다. IDH1은 완전 시트르산 회로가 없는 유기체 및 광범위한 종에서 발현된다.

최근에, IDH1, 및 관련 이소형 IDH2에서의 돌연변이가 몇몇 유형의 암에서 발견되었다. 돌연변이는 단백질 서열을 따라 특정 아미노산에서 발생하며 이종접합적으로 발현되며, 기능 획득과 일치하는 것으로 밝혀졌다. 이들 돌연변이는 기능적으로 보존된 잔기에서 발생하며 IDH1 및 IDH2의 돌연변이체 형태의 생화학적 연구는 이소시트레이트의 α-케토글루타레이트로의 가역적 전환인 정상 기능의 상실을 입증하였다. 이들 돌연변이의 결과는 α-케토글루타레이트 (αKG)의 2-히드록시글루타레이트 (2HG)로의 새로운 (또는 네오모르프(neomorphic)) 전환을 가능하게 하는 것이다. 결과적으로, IDH1 또는 IDH2의 돌연변이체 형태를 보유하는 암세포는 실질적으로 보다 높은 농도의 2HG를 형성한다. 높은 수준의 2HG는 세포 분화에서의 차단을 초래하고, 이는 돌연변이체 IDH1 또는 IDH2 억제에 의해 역전될 수 있다.

출원 PCT/US2016/043264는 돌연변이체 IDH1의 공유적 억제제를 개시한다. 다양한 암의 치료를 위해 돌연변이체 IDH1 및 IDH2 효소를 선택적으로 억제하는 화합물에 대한 추가 필요성이 있다. 다양한 암의 치료를 위해 야생형 IDH1 및 IDH2에 비해, 네오모르프 활성을 나타내는 돌연변이체 IDH1 및 IDH2 효소를 선택적으로 억제하는 화합물에 대한 추가 필요성이 있다. 본 발명은 돌연변이체 IDH1 및 IDH2의 억제제인 화학식 I 또는 Ia의 화합물을 제공한다. 화학식 I 또는 Ia의 화합물은 돌연변이체 IDH1 및 IDH2를 선택적으로 억제하는 공유적 억제제이다.

본 발명의 한 측면은 하기 화학식의 돌연변이체 IDH1 및 IDH2 효소 억제제 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하는 것이다:

상기 식에서,

R¹은 -CH₂CH(CH₃)₂, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂OCH₃, 또는 -CH₂-시클로프로필이고;

R²는 -CH₃ 또는 -CH₂CH₃이고;

X는 N 또는 CH이다.

본 발명의 추가 측면은 하기 화학식의 돌연변이체 IDH1 및 IDH2 효소 억제제 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공하는 것이다:

상기 식에서,

R²는 -CH₃ 또는 -CH₂CH₃이다.

본 발명의 추가 측면은 다음과 같은 화학식 I 또는 Ia의 화합물:

7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온;

7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온;

1-에틸-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)프로필]페닐]에틸]아미노]-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온, 이성질체 1;

1-에틸-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)프로필]페닐]에틸]아미노]-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온, 이성질체 2;

또는 이들 중 어느 하나의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온인 화학식 I 또는 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

본 발명의 또 다른 측면은 화학식 I 또는 Ia의 돌연변이체 IDH1 억제제 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 신경교종, 교모세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 핍지교종, 부신경절종, 섬유육종, 혈관면역모세포성 T 세포 림프종 (AITL), 골수이형성 증후군 (MDS), B 세포 급성 림프모구 백혈병 (B-ALL), 갑상선암, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병 (AML), 흑색종, 전립선암, 연골육종 또는 담관암종인 돌연변이체 IDH1 또는 돌연변이체 IDH2를 발현하는 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 상기 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 섬유육종, 급성 골수성 백혈병, 신경교종, 또는 교모세포종인 돌연변이체 IDH1 또는 돌연변이체 IDH2를 발현하는 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 상기 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 요법에 사용하기 위한, 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 신경교종, 교모세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 핍지교종, 부신경절종, 섬유육종, 혈관면역모세포성 T 세포 림프종 (AITL), 골수이형성 증후군 (MDS), B 세포 급성 림프모구 백혈병 (B-ALL), 갑상선암, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병 (AML), 흑색종, 전립선암, 연골육종 또는 담관암종인 돌연변이체 IDH1 또는 돌연변이체 IDH2를 발현하는 암의 치료에서 사용하기 위한, 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 섬유육종, 급성 골수성 백혈병, 신경교종, 또는 교모세포종인 돌연변이체 IDH1 또는 돌연변이체 IDH2를 발현하는 암의 치료에서 사용하기 위한, 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 신경교종, 교모세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 핍지교종, 부신경절종, 섬유육종, 혈관면역모세포성 T 세포 림프종 (AITL), 골수이형성 증후군 (MDS), B 세포 급성 림프모구 백혈병 (B-ALL), 갑상선암, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병 (AML), 흑색종, 전립선암, 연골육종 또는 담관암종인 돌연변이체 IDH1 또는 돌연변이체 IDH2를 발현하는 암의 치료용 의약의 제조를 위한, 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 섬유육종, 급성 골수성 백혈병, 신경교종, 또는 교모세포종인 돌연변이체 IDH1 또는 돌연변이체 IDH2를 발현하는 암의 치료용 의약의 제조를 위한, 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

용어 "환자"는 포유동물을 의미하며 "포유동물"은 인간을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

"치료 유효량"은 암 환자에서 돌연변이체 IDH1 또는 돌연변이체 IDH2를 억제함으로써, 분화에서의 차단을 해제하고 결과적으로 종양 세포 성장의 억제를 유도하여 환자에서 암을 제거하거나 암의 진행을 둔화시키거나 저지하는데 필요한 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 상기 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 함유하는 제약 조성물의 투여량을 의미한다. 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 예상되는 투여량은 1 mg/환자/일 내지 2000 mg/환자/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 5 mg/환자/일 내지 1800 mg/환자/일의 범위일 것으로 예상된다. 가장 바람직한 투여량은 40 mg/환자/일 내지 1600 mg/환자/일의 범위일 것으로 예상된다. 환자를 치료하는데 필요한 정확한 투여량 및 치료 시간의 길이는 질환의 단계와 중증도뿐만 아니라 개개 환자의 구체적인 필요와 반응을 고려하여 의사에 의해 결정될 것이다. 비록 1일 기준으로 투여량으로서 나타내긴 하지만, 복용량 투여는 환자에게 보다 최적의 치료 이익을 제공하고 임의의 약물 관련 독성을 관리하거나 개선하도록 조정될 수 있다. 매일 투여에 더하여, 1일 2회 (B.I.D.) 투여; 1일 3회 (T.I.D.) 투여; 격일로 투여 (Q2D); 5일 기간에 걸쳐 격일로 투여한 후 투여 없이 2일 (T.I.W.); 또는 3일마다 (Q3D)가 적절할 수 있다.

용어 "치료", "치료하다", 및 "치료하는"은, 환자가 앓고 있는 암에 대한 모든 영역을 포함하는 개입, 예컨대, 활성 화합물의 투여로 인해 비록 암이 실제로 제거되지 않더라도 암의 진행을 지연시키고 증상 중 하나 이상을 완화시키거나, 둔화시키거나, 역전시키는 것을 포함하는 것을 의미한다.

용어 -CH₂CH(CH₃)₂는 2-메틸프로필을 의미하며, 용어 -CH₂CH₂OCH₃은 2-메톡시에틸을 의미하며, 용어 -CH₂-시클로프로필은 시클로프로필메틸을 의미한다.

화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 바람직하게는 제약상 허용되는 담체를 사용하여 제약 조성물로서 제제화되고 여러 가지의 경로에 의해 투여된다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 경구 투여용이다. 이러한 제약 조성물 및 이들을 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, L.V. Allen, Editor, 22^nd Edition, Pharmaceutical Press, 2012]을 참조.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 7-{[(1S)-1-{4-[(1S)-1-(4-아크릴로일피페라진-1-일)-2-시클로프로필에틸]페닐}에틸]아미노}-1-에틸-1,4-디히드로-2H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 또는 그의 제약상 허용되는 염을, 제약상 허용되는 담체 및 임의로 특히 특정 암 유형 또는 일반적으로 암의 치료를 위한 다른 치료학적 성분과 함께 포함한다.

화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 1종 이상의 다른 치료제와 동시에, 또는 전에, 또는 후에 투여될 수 있다. 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 1종 이상의 다른 치료제(들)와 함께 투여될 때, 별도로, 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해, 또는 함께 다른 치료제 (들)와 동일한 제약 조성물로 투여될 수 있다. 1종 이상의 추가의 치료제가 투여되는 경우, 각각의 치료제의 투여는 동시, 개별, 또는 순차적일 수 있다.

화학식 I 또는 Ia의 화합물은 다수의 무기 및 유기 산과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가 염을 형성할 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 염 및 이들을 제조하기 위한 통상의 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002)]; [S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, "Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No.　1, January 1977] 참조.

화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 관련 기술분야에 공지된 여러 가지의 절차, 뿐만 아니라 하기 기재된 것들에 의해 제조될 수 있다. 구체적 합성 단계는 상이한 순서로 조합되어 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제조할 수 있다.

추가적으로, 하기 제조예에 기재된 특정 중간체는 1종 이상의 질소 보호기를 함유할 수 있다. 보호기는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이 수행되는 특정한 변환 및 특정한 반응 조건에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해된다. 보호 및 탈보호 조건은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어 문헌 ["Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fifth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2014] 참조).

화학식 I 또는 Ia의 화합물은 IUPAC에 따라 명명되며, 또한 CAS에 따라 명명될 수 있으며, 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 분명하게 식별하는데 다른 이름이 사용될 수도 있다.

화학식 I 또는 Ia의 화합물이 단일 입체이성질체로서 도시될 수 있음이 이해될 것이다. 4개의 부분입체이성질체를 생성하는 2개의 키랄 중심이 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단일 입체이성질체에 대한 언급은 명명되거나 도시된 화학식 I 또는 Ia의 화합물을 포함한, 입체이성질체 혼합물을 또한 포함하는 것을 의미한다. 여기서, (R)- 및 (S)-의 칸-인골드-프렐로그(Cahn-Ingold-Prelog) 지정은 구체적 입체이성질체를 지칭하는데 사용될 수 있다. 거울상이성질체적으로 순수한 또는 풍부한 출발 물질을 사용하여 입체특이적 합성에 의해 구체적 입체이성질체를 제조할 수 있다. 화학식 I 또는 Ia의 화합물을 포함한 라세미 혼합물, 중간체, 또는 출발 물질의 구체적 입체이성질체는 키랄 정지상 상의 크로마토그래피, 효소 분할, 또는 분별 결정 또는 그 목적을 위해 형성된 부분입체이성질체, 예컨대 부분입체이성질체 염의 크로마토그래피를 포함한, 관련 기술분야에 공지된 기술, 예컨대 문헌 [Stereochemistry of Organic Compounds, E. I. Eliel and S. H. Wilen (Wiley 1994)] 및 [Enantiomers, Racemates, and Resolutions, J., Jacques, A. Collet, and S. H. Wilen (Wiley 1991)]에서 발견된 것들에 의해 분할될 수 있다. 도시된 모든 입체중심을 가진 배위를 갖는 화학식 I 또는 Ia의 화합물의 경우, "실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한"은 이성질체 순도가 90% 초과의 거울상이성질체 과잉률인 것을 의미한다. 또 다른 실시양태에서 화학식 I 또는 Ia의 화합물의 이성질체 순도는 95% 초과의 거울상이성질체 과잉률이다. 또 다른 실시양태에서 화학식 I 또는 Ia의 화합물의 이성질체 순도는 98% 초과의 거울상이성질체 과잉률이다. 또 다른 실시양태에서 화학식 I 또는 Ia의 화합물의 이성질체 순도는 99% 초과의 거울상이성질체 과잉률이다. 개별적으로 및 화학식 I 또는 Ia의 화합물의 부분입체이성질체 혼합물을 포함한, 모든 입체이성질체는 본 발명의 범위 내에서 고려된다. "이성질체 1" 및 "이성질체 2" 및 "부분입체이성질체 1" 및 "부분입체이성질체 2"라는 지정은 키랄 크로마토그래피로부터 각각 첫번째 및 두번째로 용리되는 화합물을 지칭하고, 키랄 크로마토그래피가 합성에서 초기에 개시된다면, 동일한 지정이 후속 중간체 및 실시예에 적용된다.

화학식 I 또는 Ia의 화합물의 합성에서 초기 출발 물질로서 사용되는 화합물은 널리 공지되어 있고, 시판되지 않는 정도로, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상 사용되는 표준 절차에 의해, 제공된 특정 참고문헌을 사용하여 용이하게 합성되거나 일반적인 참고 문헌에서 발견된다.

공지된 절차 및 방법의 예는 일반적인 참고 문헌 예컨대 문헌 [Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of Organic Synthetic Methods, Volumes 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience]; [Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structure, 5^th Edition, Michael B. Smith and Jerry March, Wiley Interscience, 2001]; [Advanced Organic Chemistry, 4^th Edition, Part B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, Kluwer Academic / Plenum Publishers, 2000, etc.], 및 거기에 인용된 참고문헌에 기재된 것들을 포함한다.

특정 약어는 다음과 같이 정의된다: "ACN"은 아세토니트릴을 의미하며; "αKG"는 알파-케토글루타레이트 또는 2-케토글루타레이트를 의미하며; "alloc"는 알릴옥시카르보닐을 의미하며; "ATCC"는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture collection)을 의미하며; "BCA"는 비신초닌산(bicinchoninic acid)을 의미하며; "BSA"는 소 혈청 알부민을 의미하며; "CDI"는 1,1'-카르보닐디이미다졸을 의미하며; "DCC"는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드를 의미하며; "DCM"은 디클로로메탄을 의미하며; "DEAD"는 디에틸 아조디카르복실레이트를 의미하며; "DIAD"는 디이소프로필 아조디카르복실레이트를 의미하며; "DIC"는 디이소프로필카르보디이미드를 의미하며; "DIPEA"는 디이소프로필에틸아민 또는 N-에틸-N-이소프로필-프로판-2-아민을 의미하며; "DMAP"는 디메틸아미노피리딘을 의미하며; "DMF"는 디메틸포름아미드를 의미하며; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 의미하며; "DTT"는 디티오트레이톨을 의미하며; "EDC"는 EDAC, EDCI, 또는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드를 의미하며; "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 의미하며; "EGTA"는 에틸렌 글리콜 테트라아세트산을 의미하며; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 의미하며; "EtOH"는 에탄올 또는 에틸 알콜을 의미하며; "Ex"는 실시예를 의미하며; "HATU"는 (디메틸아미노)-N,N-디메틸(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)메탄이미늄 헥사플루오로포스페이트를 의미하며; "HBTU"는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트를 의미하며; "2HG"는 2-히드록시글루타레이트를 의미하며; "d₅-3HG"는 3-히드록시-1,5-펜탄디오산-2,2,3,4,4-d₅ 산을 의미하며; "HILIC"는 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피를 의미하며; "HOAt"는 1-히드록시-7-아조벤조트리아졸을 의미하며; "HOBt"는 1-히드록실벤조트리아졸 수화물을 의미하며; "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 의미하며; "IC₅₀"은 작용제에 대해 가능한 최대 억제 반응의 50%를 유도하는 상기 작용제의 농도를 의미하며; "mCPBA"는 메타-클로로퍼벤조산을 의미하며; "MeOH"는 메탄올 또는 메틸 알콜을 의미하며; "NADP⁺ 및 NADPH"는 각각 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트의 산화된 형태 및 환원된 형태 각각을 의미하며; "NMP"는 N-메틸-2-피롤리돈을 의미하며; "PG"는 보호기를 의미하며; "Prep"는 제조를 의미하며; "PyBOP"는 벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 의미하며; "PyBrop"는 브로모-트리스-피롤리디노 포스포늄헥사플루오로 포스페이트를 의미하며; "rpm"는 분당 회전수를 의미하며; "(R)-루시(RUCY)®-XylBINAP"는 RuCl[(R)-다이페나][(R)-xylbinap를 의미하며; "S_NAr"은 친핵성 방향족 치환을 의미하며; "TEA"는 트리에틸아민을 의미하며; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 의미하며; "THF"는 테트라히드로푸란을 의미하며; "Tris"는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 의미한다.

화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 관련 기술분야에 공지된 여러 가지의 절차에 의해 제조될 수 있으며, 그 중 일부는 하기 반응식, 제조예, 및 실시예에 예시되어 있다. 기재된 경로 각각에 대한 특정한 합성 단계가 상이한 방식으로, 또는 상이한 반응식으로부터의 단계와 함께 조합되어, 화학식 I 또는 Ia의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제조할 수 있다. 하기 반응식에서의 각각의 단계의 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리 및 결정화를 포함한, 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 회수될 수 있다. 하기 반응식에서, 달리 나타내지 않는 한, 모든 치환기는, 이전에 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 입수가능하다.

<반응식 1>

반응식 1에서, 일련의 반응은 R²가 이전에 정의된 바와 같은 단계 C의 생성물인 1-치환-7-(메틸술포닐)-1,4-디히드로-2H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온, (4)로 이어진다. "PG"는 아미노 기 또는 산소 기에 대해 예컨대 카르바메이트, 아미드 또는 에스테르에 대해 개발된 보호기이다. 예를 들어, 5-히드록시 메틸 4-아미노-2-메틸술파닐-피리미딘은 표준 카르바모일화 조건하에 약 -30 내지 -35℃의 온도에서 트리포스겐 및 유기 염기 예컨대 DIPEA 또는 TEA를 사용하여 옥사진-2-온으로 고리화시켜 단계 A의 생성물인 화합물 (2)를 수득할 수 있다. 대안적으로 디할라이드 카르보닐 또는 디-슈도할라이드 카르보닐 예컨대 CDI, 포스겐, 또는 디포스겐을 트리포스겐 대신에 사용하여 카르바모일화를 완료시킬 수 있다. 옥사진의 아민은 약 50-65℃의 온도에서 무기 염기 예컨대 K₂CO₃및 용매 예컨대 NMP 중 적절한 치환 알킬 할라이드 예컨대 아이오도 시약으로 알킬화시켜 단계 B의 생성물인 화합물 (3)을 수득할 수 있다. 대안적으로, 미츠노부(Mitsunobu) 반응을 완수하여 적절한 알콜 예컨대 MeOH를 사용하여 옥사진의 아민을 알킬화시킬 수 있다. 미츠노부 반응은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 용매 예컨대 THF 중 아조디카르복실레이트 예컨대 DIAD 또는 DEAD 및 트리페닐포스핀을 사용하여 다종다양한 친핵체 예컨대 카르바메이트에 의해 대체되는 이탈기로 히드록실 기를 전환시켜 화합물 (3)을 수득할 수 있다. 술피드는 관련 기술분야에 널리 공지된 조건 예컨대 용매 예컨대 ACN 또는 DCM 중 약 10 내지 25℃의 온도에서 mCPBA 또는 포타슘 퍼옥시모노술페이트 하에 술폰으로 산화시켜 단계 C의 생성물인 화합물 (4)를 수득할 수 있다.

<반응식 2>

반응식 2에서, (4-(1-아미노에틸)페닐)메탄올 (7)은 통상의 기술자에게 널리 공지된 절차를 사용하여 아릴 할라이드 예컨대 브로마이드 (5)로부터 수개의 단계를 거쳐 생성시킬 수 있다. 아민은 하위단계 1, 단계 D에서 보호할 수 있으며, 여기서 "PG"는 아미노 기 예컨대 아미드에 대해 발생된 보호기이다. 보호된 아릴 브로마이드 (5)는 리튬 카르보닐화 조건하에 케톤으로 전환시켜 하위단계 2, 단계 D에서 아릴 케톤 (6)을 수득할 수 있다. 그 다음에 케톤은 하위단계 1, 단계 E에서 용매 예컨대 MeOH 중 환원제 예컨대 수소화붕소나트륨을 사용하여 환원시킬 수 있다. 아민은 이 단계 (하위단계 2, 단계 E)에서 또는 합성의 후기 시점에서 탈보호하여 화합물 (7)을 수득할 수 있다. 대안적으로, 화합물 (6)은 용매 예컨대 THF 중 티타늄(IV) 이소프로폭시드를 사용하는 환원성 아미노화로 그리고 약 60℃로 가열한 후 냉각하고 MeOH 및 환원제 예컨대 소듐 시아노보로하이드리드를 첨가함으로써 화합물 (12)로 직접 전환시켜 화합물 (12)를 수득할 수 있다. 화합물 (7)은 용매 예컨대 DCM 중 할로겐화제 예컨대 티오닐 클로라이드 또는 POCl₃을사용하는 표준 할로겐화 조건하에 벤질 할라이드 예컨대 클로라이드로 전환시켜 단계 I의 화합물 (10)을 수득할 수 있다. 화합물 (10)은 단계 J에서 필요하다면 보호할 수 있고 알킬화시킬 수 있다. 예를 들어, 아민, (10)은 보호기 예컨대 트리플루오로아세틸 또는 CBZ를 사용하여 단계 J의 하위단계 1에서 보호할 수 있다. 이러한 보호기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 인식되어 있다. 대안적으로, 화합물 10은 알데히드, 화합물 (8)로부터 제조할 수 있다. 화합물 (8)은 용매 예컨대 DCM 중 데스-마틴(Dess-Martin) 페리오디난과 같은 조건하에 상응하는 벤질 알콜을 산화시켜 알데히드 (8)을 수득함으로써 제조할 수 있다. 그리냐르 반응을 단계 G에서 알데히드상에서 완수하여 화합물 (7)을 수득할 수 있다. 단계 G로부터의 화합물 (7)은 단계 H에서 염소화하여 단계 I에 대해 상기 논의된 바와 같이 화합물 (10)을 수득할 수 있다. 화합물 (10)의 클로라이드는 두-단계, 원 팟(one pot) 절차로 일-보호 피페라진으로 대체될 수 있다. 항상 1-페닐에틸아민을 보호할 필요는 없으나 보호가 선택된다면, 단계 J, 하위단계 1의 피페라진 아민 생성물 (11)보다는 1-페닐에틸아민 상에서 상이한 보호기를 사용하여, 하나 또는 다른 하나의 PG를 원하는 단계에서 선택적으로 탈보호하는 것이 유리하다. 예를 들어, 1-페닐에틸아민은 약 0-5℃의 온도에서 용매 예컨대 DCM 중 유기 염기 예컨대 TEA를 사용하여 트리플루오로아세트산 무수물과 반응시켜 하위단계 1, 단계 J의 보호된 아민 생성물을 수득할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 보호기가 아민 예컨대 CBZ에 활용될 수 있음을 이해할 것이다. 그 다음에 클로라이드의 대체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 널리 공지된 조건하에 완수될 수 있다. 예를 들어, 할라이드는 반응을 가속화하는 친핵성 촉매로서 KI 또는 NaI를 활용하고 무기 염기 예컨대 K₂CO₃을 사용하여 보호되거나 보호되지 않은 피페리딘에 의해 대체될 수 있다. 혼합물을 용매 예컨대 ACN 중에서 약 60-80℃로 가열하여 하위단계 2, 단계 J의 보호된 화합물 (11)을 수득할 수 있다. 1-페닐에틸아민 상의 보호기는 염기 예컨대 수성 수산화칼륨으로 제거하여 하위단계 3, 단계 J의 화합물 (11)을 수득할 수 있다.

<반응식 3>

반응식 3에서, 화합물 (11)은 반응을 가속화하는 유기 염기 예컨대 DIPEA, CsF, 용매 예컨대 DMSO, 및 약 70-80℃의 온도를 사용하는 S_NAr 반응으로, 반응식 1의 화합물 (4)와 반응시켜, 단계 L의 생성물을 수득할 수 있다. 단계 M, 하위단계 1에서, tert-부톡시 보호된 피페라진은 DCM 중 TFA 또는 MeOH 및 디옥산 중 산 예컨대 HCl을 사용하여 탈보호할 수 있으며 한편 alloc 보호된 피페라진은 연성 친핵체 예컨대 디메돈을 사용하여 용매 예컨대 THF 중 팔라듐 공급원 예컨대 촉매적 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)의 존재하에 탈보호하여 하위단계 1, 단계 M의 탈보호된 피페라진을 수득할 수 있다. 하위단계 2, 단계 M에서, 피페라진은 아민이 용매 예컨대 DCM 중 산 염인 경우 유기 염기 예컨대 TEA를 사용하거나 사용하지 않고 약 -50 내지 -78℃의 온도에서 아크릴로일 클로라이드로 아미드화되어 화학식 Ia의 화합물을 수득할 수 있다. 대안적으로, 아미드 커플링은 아크릴산 및 용매 예컨대 DMF 중 적절한 아민과 커플링 시약 예컨대 EDC 및 첨가제 예컨대 HOBt를 사용하여 완수할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 카르복실산과 아민의 반응으로 생기는 아미드 형성을 위한 다수의 방법 및 시약이 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 유기 염기 예컨대 DIPEA 또는 TEA를 사용하거나 사용하지 않고 커플링 시약의 존재하에 적절한 아민과 아크릴산을 반응시켜 화학식 Ia의 화합물을 수득할 수 있다. 다른 커플링 시약은 카르보디이미드, 예컨대 DCC, DIC, 또는 카르보닐디이미다졸 예컨대 CDI를 포함한다. 다른 아미드 커플링 첨가제, 예컨대 HOAt를 또한 사용하여 반응을 향상시킬 수 있다. 추가적으로, 비-친핵성 음이온의 우로늄 또는 포스포늄 염, 예컨대 HBTU, HATU, PyBOP, 및 PyBrOP를 더 통상적인 커플링 시약 대신에 사용할 수 있을 것이다. 첨가제 예컨대 DMAP를 사용하여 원하는 아미드화 반응을 가속화할 수 있다.

<반응식 4>

대안적으로 반응식 4에서, 반응식 2의 화합물 (7)의 탈보호된 생성물의 아민 을 S_NAr 알킬화로 반응식 3, 단계 L에 기재된 바와 같이 화합물 (4)과 반응시켜 화합물 13을 수득할 수 있다. 히드록실은 단계 I, 반응식 2에 기재된 바와 같이 염소화하여 단계 O의 화합물 14를 수득할 수 있다. 화합물 (14)의 염소는 반응식 2, 단계 11, 하위단계 2에 기재된 바와 같이 피페라진으로 알킬화에서 대체되어 화합물 (5)를 수득할 수 있다. 보호된 피페라진은 탈보호할 수 있으며 그 다음에 피페라진은 반응식 3, 단계 M에 기재된 바와 같이 아미드화하여 화학식 Ia의 화합물을 수득할 수 있다.

<반응식 5>

반응식 5에서, 키랄 (4-(1-아미노에틸)페닐)메탄올 (7a)은 통상의 기술자에게 널리 공지된 절차를 사용하여 아릴 할라이드 예컨대 브로마이드 (5a)로부터 수개의 단계를 거쳐 생성시킬 수 있다. 아민은 하위단계 1, 단계 D에서 보호할 수 있으며, 여기서 "PG"는 아미노 기 예컨대 아미드에 대해 발생된 보호기이다. 아릴 브로마이드 (5a)는 리튬 카르보닐화 조건하에 케톤으로 전환시켜 하위단계 2, 단계 D에서 아릴 케톤 (6a)을 수득할 수 있다. 그 다음에 케톤은 용매 예컨대 EtOH 중 키랄 환원제 예컨대 (R)-루시-XylBINAP를 사용하여 비대칭적으로 환원시켜 하위단계 1, 단계 E에서 화합물 7a를 수득할 수 있다. 화합물 (7a)는 용매 예컨대 t-부틸 에테르 중 할로겐화제 예컨대 벤조일 클로라이드를 사용하는 표준 할로겐화 조건하에 키랄 벤질 할라이드 예컨대 클로라이드로 전환시켜 단계 I의 화합물 (10a)를 수득할 수 있다. 화합물 (10a)를 먼저 용매 예컨대 아세토니트릴 중 염기 에컨대 중탄산나트륨의 존재하에 보호된 피페라진 (PG-피페라진)과 반응시켜 하위단계 1, 단계 J에서 보호된 형태를 수득한다. 그 다음에 보호된 형태는 용매 예컨대 EtOH 중 염기 예컨대 수성 수산화칼륨으로 탈보호하여 하위단계 2, 단계 J의 화합물 (11a)를 제공한다.

<반응식 6>

반응식 6에서, 일련의 반응은 R²가 이전에 정의된 바와 같은 단계 C의 생성물인 1-치환-7-클로로-4H-피리도[4,3-d][1,3]옥사진-2-온 (18)을 야기한다. 예를 들어, 에틸 4,6-디클로로피리딘-3-카르복실레이트 (15)는 아민과 표준 조건하에 반응시켜 용매 예컨대 아세토니트릴 중 6-클로로-4-(아미노)피리딘-3-카르복실레이트 (16)를 수득할 수 있다. 용매 예컨대 THF 중 수소화물 시약 예컨대 수소화알루미늄리튬을 사용하여 화합물 (16) 중 에스테르 기를 환원시켜 (4-아미노-6-클로로-3-피리딜)메탄올 (17)을 수득한다. 화합물 예컨대 17은 표준 카르바모일화 조건하에 약 -20℃의 온도에서 트리포스겐 및 유기 염기 예컨대 DIPEA 또는 TEA를 사용하여 옥사진-2-온으로 고리화시켜 단계 C의 생성물인 화합물 (18)을 수득할 수 있다. 대안적으로 디할라이드 카르보닐 또는 디-슈도할라이드 카르보닐 예컨대 CDI, 포스겐, 또는 디포스겐을 트리포스겐 대신에 사용하여 카르바모일화를 완료시킬 수 있다. 반응식 2 또는 5에서 상기에 나타낸 바와 같이, 또는 두 반응식 중 어느 하나에 대한 대안으로 기재된 바와 같이 제조된 화합물 11은 표준 알킬화 조건하에 화합물 18과 반응시킬 수 있다. 그 다음에, 생성된 중간체 화합물을 반응식 3 또는 4에서 상기 기재된 바와 같이 탈보호하고 아미드화시켜 X가 CH인 화학식 I의 화합물을 수득한다.

임의적 단계에서, 화학식 I 또는 Ia의 화합물의 제약상 허용되는 염은 화학식 I 또는 Ia의 적절한 유리 염기를 표준 조건하에 적합한 용매 중에서 적절한 제약상 허용되는 산과 반응시킴으로써 형성시킬 수 있다. 추가적으로, 이러한 염의 형성은 질소 보호기의 탈보호시 동시에 발생할 수 있다. 이러한 염의 형성은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 인식되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986)]; [Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000)]; 및 [Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)] 참조. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 화학식 I 또는 Ia의 화합물이 제약상 허용되는 염으로 용이하게 전환되고 단리될 수 있음을 인식할 것이다.

제조예 1

7-메틸술파닐-1,4-디히드로피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온

트리포스겐 (859 g, 2.9 mol)을 -30℃에서 15분에 걸쳐 THF (22.5 L) 중 (4-아미노-2-메틸술파닐-피리미딘-5-일)메탄올 (900 g, 5.26 mol)의 용액에 첨가하였다. DIPEA (2.449 g, 18.92 mol)를 반응 온도를 -35 내지 -30℃로 유지하면서 1시간에 걸쳐 첨가하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 얼음물 (30 L) 위에 붓고 2-메틸테트라히드로푸란 (10 L)을 첨가하였다. 유기 상을 물 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 Na₂SO₄상에서 건조시키고 농축 건조시켰다. 조 생성물을 석유 에테르 / EtOAc (1:1)로 슬러리화하고, 여과하고, 농축하여 황색 고체를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 진행시켰다 (890.5 g, 1.62 mol, 83% 순도, 86% 수율). MS (m/z): 198 (M+H).

제조예 2

1-에틸-7-(메틸티오)-1,4-디히드로-2H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온

NMP (2.24 L) 중 7-메틸술파닐-1,4-디히드로피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 (280 g, 1.42 mol)의 용액에 K₂CO₃ (294.2 g, 2.13 mol) 및 에틸 아이오다이드 (336.3 g, 1.99 mol)를 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 16시간 동안 교반한 다음에 DCM (3 L) 및 물 (6 L)로 희석하였다. 유기 상을 분리시키고 물 및 염수로 세척하고 농축 건조시켜 조 표제 화합물 (286 g, 1.27 mol, 83% 순도, 91% 수율)을 수득하였다. MS (m/z): 226 (M+H).

제조예 3

1-메틸-7-메틸술파닐-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온

THF (25 mL) 중 트리페닐포스핀 (1.61 g, 6.08 mmol) 및 7-메틸술파닐-1,4-디히드로피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 (1.00 g, 5.07 mmol)의 용액에 MeOH (0.248 mL, 6.08 mmol)를 첨가한 후에 DIAD (1.21 mL, 6.08 mmol)를 주위 온도에서 적가하였다. 밤새 교반한 후 용매를 진공하에 제거하고, 생성된 황색 오일을 실리카 겔 크로마토그래피 (40-50% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 표제 화합물을 백색 고체 (1.08 g, 5.11 mmol, 정량적)로서 수득하였다. MS (m/z): 212 (M+H).

제조예 4

1-에틸-7-(메틸술포닐)-1,4-디히드로-2H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온

ACN (2.8 L) 및 물(1.4 L) 중 1-에틸-7-(메틸티오)-1,4-디히드로-2H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 (286 g, 1.24 mol)의 교반 용액에 20분에 걸쳐 고체로서 포타슘 퍼옥시모노술페이트 (1526 g, 2.48 mol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 10-20℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 수득된 여과 케이크를 DCM으로 세척하였다. 합해진 여액 및 DCM을 5% Na₂SO₃, 물, 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 Na₂SO₄상에서 건조시키고 농축하여 표제 화합물 (133.8 g, 93% 순도, 41% 수율)을 수득하였다. MS (m/z): 258 (M+H).

하기 화합물을 본질적으로 제조예 4의 방법에 의해 제조하였다.

<표 1>

제조예 6

N-[(1S)-1-(4-브로모페닐)에틸]-2,2,2-트리플루오로-아세트아미드

트리플루오로아세트산 무수물 (165 mL, 1.17 mol)을 5℃에서 ACN (1.3 L) 중 (1S)-1-(4-브로모페닐)에탄아민 (213 g, 1.06 mol)의 용액에 적가한 후 1시간에 걸쳐 TEA (326 mL, 2.34 mol)를 적가하였다. 30분 후, 물 (3 L) 및 염수 (1 L)를 첨가하여 무색 침전물의 형성을 결과하였다. 슬러리를 15분 동안 교반한 다음에 고체를 여과하고, 물 및 헥산으로 세척하고, 기류에 의해 건조 후 40℃에서 진공하에 건조시켜 표제 화합물 (290 g, 92%)을 수득하였다. ¹H NMR (d₆-DMSO) δ 1.44 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 4.98 (dddd, 1H, J= 7.6, 7.1, 7.1, 7.1 Hz), 7.30 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.55 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 9.91 (d, 1H, J = 7.6 Hz).

제조예 7

N-[(1S)-1-[4-(2-시클로프로필아세틸)페닐]에틸]-2,2,2-트리플루오로-아세트아미드

n-부틸 리튬 (헥산 중 2.5 M, 53 mL, 130 mmol)을 -78℃에서 THF (600 mL) 중 N-[(1S)-1-(4-브로모페닐)에틸]-2,2,2-트리플루오로-아세트아미드 (18.00 g, 60.79 mmol)의 용액에 적가하여 내부 온도를 -70℃ 미만으로 유지하도록 하였다. 첨가가 완료된 후, 혼합물을 -78℃에서 45분 동안 교반한 다음에 2-시클로프로필-N-메톡시-N-메틸-아세트아미드 (11.4 g, 79.6 mmol)를 THF (10 mL) 중 용액으로서 첨가하였다. 혼합물을 45분 동안 -78℃에서 교반하고, 포화 수성 염화암모늄을 첨가하고, 혼합물을 실온으로 가온하였다. 층을 분리하고 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 상기 고체에 소량의 DCM을 첨가하고 혼합물을 단시간 가열하여 고체를 용해시켰다. 혼합물을 침전 직전까지 농축한 다음에 격렬히 교반하면서 헥산 (150 mL)을 적가하여 무색 고체를 수득하였다. 고체를 여과를 통해 수집하고, 소량의 헥산으로 세척하고, 감압하에 건조시켜 표제 화합물 (13.82 g, 76%)을 무색 고체로서 수득하였다. MS (m/z): 298.3 (M-H).

하기 화합물을 본질적으로 제조예 7의 방법에 의해 제조하였다.

<표 2>

제조예 9

1-[4-[(1S)-1-아미노에틸]페닐]-2-시클로프로필-에탄올

수소화붕소나트륨 (0.1411 g, 2 당량, 3.729 mmol)을 얼음물 조에서 냉각된 MeOH (15 mL) 중 N-[(1S)-1-[4-(2-시클로프로필아세틸)페닐]에틸]-2,2,2-트리플루오로-아세트아미드 (558 mg, 1.86 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 약 2.5시간 동안 교반한 다음에, 물 (3 mL) 중 수산화칼륨 (800 mg, 14.2 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 약 20시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 농축하고 DCM과 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 표제 화합물 (354 mg, 1.38 mmol, 74%)을 백색 고체로서 수득하였다. 상기 물질을 추가 정제 없이 사용하였다. ES/MS (m/z): 189.0 (M-OH).

제조예 10

2,2,2-트리플루오로-N-[(1S)-1-(4-포르밀페닐)에틸]아세트아미드

데스-마틴 페리오디난 (20.9 g, 49.3 mmol)을 DCM (450 mL) 중 2,2,2-트리플루오로-N-[(1S)-1-[4-(히드록시메틸)페닐]에틸]아세트아미드 (11.1 g, 44.9 mmol)의 0℃ 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하고 실온으로 가온하였다. 반응 혼합물을 추가적 DCM으로 희석하고 포화 수성 NaHCO₃, 포화 수성 Na₂S₂O₃, 및 염수로 세척하였다. 합해진 유기물을 건조시키고 (Na₂SO₄), 여과하고, 농축하여 잔류물을 수득하고 이를 0-50% EtOAc/헥산의 구배로 용리시키는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 백색 고체 (9.5 g, 39 mmol, 86%)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 244 (M-H).

제조예 10a

2,2,2-트리플루오로-N-[(1S)-1-[4-(히드록시메틸)페닐]에틸]아세트아미드

트리플루오로아세트산 무수물 (12 mL, 85.4 mmol)을 CH₂Cl₂ (150 mL) 중 [4-[(1S)-1-아미노에틸]페닐]메탄올 (10.8 g, 71.4 mmol)의 0℃ 용액에 첨가하였다. 10분 후, CH₂Cl₂ (8 mL) 중 트리에틸아민 (24 mL, 172 mmol)을 30분에 걸쳐 적가하고, 냉각조를 제거하고 반응물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 진공하에 농축하고, 추가적 CH₂Cl₂로 희석하고, 1 N 수성 HCl 및 물로 세척하였다. 유기 상을 건조시키고 (Na₂SO₄), 여과하고, 농축하였다. 조 물질을 0-50% EtOAc/헥산의 구배로 용리시키는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 백색 고체 (11.1 g, 44.9 mmol, 63%)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 246 (M-H).

제조예 11

2,2,2-트리플루오로-N-[(1S)-1-[4-(1-히드록시-3-메틸-부틸)페닐]에틸]아세트아미드

얼음물 조에서 냉각된 THF (35 mL) 중 2,2,2-트리플루오로-N-[(1S)-1-(4-포르밀페닐)에틸]아세트아미드 (1.72 g, 7.01 mmol)의 용액에 이소부틸마그네슘 브로마이드 (디에틸 에테르 중 2 M, 7.0 mL, 14.0 mmol)를 첨가하고 약 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 포화 수성 염화암모늄으로 켄칭하고 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 오일 (1.40 g, 4.15 mmol, 59%)로서 수득하고 이를 추가 정제 없이 사용하였다. ES/MS (m/z): 302.0 (M-H).

하기 화합물을 본질적으로 제조예 11의 방법에 의해 제조하였다.

<표 3>

제조예 13

tert-부틸 4-[2-시클로프로필-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-트리플루오로아세틸)아미노]에틸]페닐]에틸]피페라진-1-카르복실레이트

티타늄(IV) 이소프로폭시드 (60 mL, 200 mmol)를 THF (80 mL) 중 N-[(1S)-1-[4-(2-시클로프로필아세틸)페닐]에틸]-2,2,2-트리플루오로-아세트아미드 (12.0 g, 40.1 mmol) 및 tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (17.9 g, 96.1 mmol)의 용액에 첨가하고 혼합물을 밤새 60℃에서 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 MeOH (80 mL)를 첨가한 후 소듐 시아노보로하이드리드 (5.3 g, 80 mmol)를 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 8시간 동안 실온에서 교반한 다음에 물 및 MeOH를 첨가하고 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 혼합물을 여과하여 고체를 제거하고 고체를 MeOH 및 물로 세정하였다. 여액을 부분 농축하여 MeOH의 대부분을 제거하고 잔류물을 EtOAc (2×)로 추출하였다. 합해진 유기 추출물을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 조 물질을 용매 B (여기서 용매 B는 1:1 헥산:DCM이다) 중 0% 내지 30% EtOAc의 구배로 용리시키는 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 표제 화합물 (10.5 g, 56%)을 무색 고체로서 수득하였다. MS (m/z): 470.3 (M+H).

제조예 14

tert-부틸 4-[1-[4-[(1S)-1-아미노에틸]페닐]-2-시클로프로필-에틸]피페라진-1-카르복실레이트

수성 수산화칼륨 (5 M, 69 mL, 350 mmol)을 EtOH (350 mL) 중 tert-부틸 4-[2-시클로프로필-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-트리플루오로아세틸)아미노]에틸]페닐]에틸] 피페라진-1-카르복실레이트 (32.24 g, 68.67 mmol)의 용액에 첨가하고 생성된 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하였다. EtOH를 감압하에 제거하고 잔류물에 포화 수성 중탄산나트륨을 첨가하고 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 합해진 유기 추출물을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여 표제 화합물 (24.33 g, 3.5% 잔류 DCM을 함유하는 96.5% 순도, 92% 수율)을 무색 점성 오일로서 수득하였다. MS (m/z): 374.3 (M+H).

하기 화합물을 본질적으로 제조예 14의 방법에 의해 제조하였다.

<표 4>

대안적 제조예 14

물 (4 mL) 중 수산화칼륨 (1.28 g, 22.9 mmol)의 용액을 EtOH (23 mL) 중 tert-부틸 4-[2-시클로프로필-1-[4-[(1s)-1-[(2,2,2-트리플루오로아세틸)아미노]에틸]페닐]에틸]피페라진-1-카르복실레이트 (2.15 g, 4.58 mmol)의 용액에 첨가하고 혼합물을 실온에서 교반하였다. 약 6시간 후, 혼합물을 농축하였다. 잔류물을 DCM과 포화 중탄산나트륨 용액 사이에 분배하였다. 유기 층을 물 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 표제 화합물을 오일로서 수득하고 이를 정제 없이 사용하였다 (1.73 g, 4.49 mmol, 98%). ES/MS (m/z): 374.2 (M+H).

제조예 18

tert-부틸 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-아미노에틸]페닐]-2-시클로프로필-에틸]피페라진-1-카르복실레이트, 부분입체이성질체 1

제조예 19

tert-부틸 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-아미노에틸]페닐]-2-시클로프로필-에틸]피페라진-1-카르복실레이트, 부분입체이성질체 2

tert-부틸 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-아미노에틸]페닐]-2-시클로프로필-에틸]피페라진-1-카르복실레이트, 부분입체이성질체 1 및 tert-부틸 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-아미노에틸]페닐]-2-시클로프로필-에틸]피페라진-1-카르복실레이트, 부분입체이성질체 2 (3.23 g)의 1:1 혼합물을 MeOH (40 mL)에 용해시키고 하기 조건을 사용하는 제조용 키랄 HPLC 크로마토그래피에 의해 개별 부분입체이성질체로 분리하였다: 칼럼 키랄팩 AD, 20 μm, (8 x 33 cm); 주입 부피 10 mL; 용리액 100% MeOH (0.2% DMEA 가짐); 검출 파장 220 nm; 유량 400 mL/분. 제조예 12, tert-부틸 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-아미노에틸]페닐]-2-시클로프로필-에틸]피페라진-1-카르복실레이트, 부분입체이성질체 1을, 제1 용리 피크로부터 투명한 점성 오일 (1.50 g, 46%, >99% de)로서 수득하였다. MS (m/z): 374.3 (M+H). 제조예 13, tert-부틸 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-아미노에틸]페닐]-2-시클로프로필-에틸]피페라진-1-카르복실레이트, 부분입체이성질체 2를, 제2 용리 피크로부터 투명한 점성 오일 (1.46 g, 45%, >98.2% de)로서 수득하였다. MS (m/z): 374.3 (M+H).

제조예 20

N,3-디메톡시-N-메틸-프로판아미드

DCM (1200 mL) 중 3-메톡시프로판산 (62 g, 577.7 mmol)의 용액을 1,1'-카르보닐디이미다졸 (103 g, 635.2 mmol)로 서서히 조금씩 처리하고 2시간 동안 실온에서 교반하였다. N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (62 g, 635.6 mmol)를 첨가하고 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 혼합물을 물 (2×), 0.1M 수성 HCl (2×), 및 포화 수성 중탄산나트륨 (2×)으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고 농축 건조시켜 조 물질을 수득하였다. 조 물질을 헥산 중 20-40% 아세톤의 구배로 용리시키는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하였다. 생성된 오일을 진공하에 밤새 건조시켜 표제 화합물 (69.5 g, 81.7%)을 수득하였다. ¹H NMR (CDCl₃) δ 2.72 (t, 2H), 3.2 (s, 3H), 3.38 (s, 3H), 3.7 (m, 5H).

제조예 21

2,2,2-트리플루오로-N-[(1S)-1-[4-(1-히드록시-3-메톡시-프로필)페닐]에틸]아세트아미드

2,2,2-트리플루오로-N-[(1S)-1-[4-(3-메톡시프로파노일)페닐]에틸]아세트아미드 (23.62 g, 73.98 mmol, 95 질량%)를 MeOH (700 mL)에 용해시키고 수소화붕소나트륨 (5.6　g, 150 mmol)으로 처리하였다. 2시간 동안 실온에서 교반한 후 혼합물을 포화 수성 염화암모늄으로 처리하고 MeOH는 증발되었다. 생성된 물질을 물과 EtOAc 사이에 분배하고, 분리하고 합해진 유기물을 Na₂SO₄상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켰다. 조 물질을 헥산 중 40% EtOAc로 용리시키는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 표제 화합물을 백색 고체 (17.82g, 79%)로서 수득하였다. MS (m/z): 306 (M+H).

제조예 22

tert-부틸 4-[3-메톡시-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-트리플루오로아세틸)아미노]에틸]페닐]프로필]피페라진-1-카르복실레이트

2,2,2-트리플루오로-N-[(1S)-1-[4-(1-히드록시-3-메톡시-프로필)페닐]에틸]아세트아미드 (21.76 g, 71.27 mmol)를 DCM (350 mL)에 용해시키고 -10℃로 냉각하였다. 티오닐 클로라이드 (26.12 g, 16 mL, 219.6 mmol)를 적가하고 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축 건조시키고, DCM에 재-용해시키고, 재-농축하였다. 조 물질을 ACN (300 mL)에 용해시키고 t-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (26.55 g, 142.6 mmol), 탄산칼륨 (39.5 g, 286 mmol) 아이오딘화칼륨 (12.0 g, 72.3 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 72시간 동안 80℃로 가열하였다. 생성된 백색 고체를 여과하고 EtOAc로 세척하였다. 합해진 여액을 수성 염화암모늄으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고 여과하고, 농축하였다. 조 물질을 헥산 중 40-80% EtOAc의 구배로 용리시키는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 표제 화합물을 백색 발포체 (29.63 g, 88%)로서 수득하였다. MS (m/z): 474 (M+H).

제조예 23

tert-부틸 4-[1-[4-(1S)-1-아미노에틸]페닐]-3-메톡시-프로필]피페라진-1-카르복실레이트, 부분입체이성질체 1

제조예 24

tert-부틸 4-[1-[4-(1S)-1-아미노에틸]페닐]-3-메톡시-프로필]피페라진-1-카르복실레이트, 부분입체이성질체 2

EtOH (310 mL) 중 tert-부틸 4-[3-메톡시-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-트리플루오로아세틸)아미노]-에틸]프로필]피페라진-1-카르복실레이트 (29.60 g, 62.5 mmol)의 용액에 수성 수산화칼륨 (63 mL, 5 M)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 4시간 동안 교반한 다음에 혼합물을 농축 건조시켰다. 조 잔류물을 물 및 포화 수성 중탄산나트륨으로 처리하고 DCM (3Х)으로 추출하였다. 합해진 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 표제 화합물 (23.6 g)을 수득하고 이를 MeOH (236 mL)에 용해시키고 하기 조건을 사용하는 키랄 SFC 크로마토그래피에 의해 개별 부분입체이성질체로 분리하였다: 칼럼: 룩스 셀룰로스(Lux Cellulose)- 1, (5 x 25 cm); 주입 부피: 2.5분마다 1 mL, 용리액 15% MeOH/CO₂, 검출 파장 230 nm; 유량 300 g/분; 칼럼 온도: 40℃; BPR 설정값: 100 bar; BPR 온도: 40℃. 제조예 28의 표제 화합물을 제1 용리 피크로부터 투명한 점성 황색 오일 (10.1 g, 42.8%, 96.6% de)로서 수득하였다. MS (m/z): 378 (M+H). 제조예 29의 화합물을 제2 용리 피크로서 투명한 점성 황색 오일 (10.3 g, 43.6%, 95.2% de)로서 단리하였다. MS (m/z): 378 (M+H).

제조예 25

7-[[(1S)-1-[4-(1-클로로-2-시클로프로필-에틸)페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온

티오닐 클로라이드 (0.23 mL, 3.219 mmol)를 DCM (20 mL) 중 7-[[(1S)-1-[4-(2-시클로프로필-1-히드록시-에틸)페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 (432 mg, 1.03 mmol) 및 탄산칼륨 (741 mg, 5.37 mmol)의 혼합물에 첨가하고 혼합물을 20분 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 규조토를 통해 여과하고 농축하여 표제 화합물 (518 mg, 1.07 mmol, 100%)을 백색 발포체로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. ES/MS (m/z): 401.2/403.2 (M+H).

하기 화합물을 본질적으로 제조예 25의 방법에 의해 제조하였다.

<표 5>

제조예 29

tert-부틸 4-[(1R)-2-시클로프로필-1-[4-[(1S)-1-[(1-에틸-2-옥소-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-7-일)아미노]에틸]페닐]에틸]피페라진-1-카르복실레이트

DMSO (15 mL) 중 tert-부틸 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-아미노에틸]페닐]-2-시클로프로필-에틸]피페라진-1-카르복실레이트 (864 mg, 3.35 mmol), 및 1-에틸-7-(메틸술포닐)-1,4-디히드로-2H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 (1.14 g, 3.05 mmol)의 용액에, CsF (1.39 g, 9.15 mmol) 및 DIPEA (0.80 mL, 4.6 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 1.5시간 동안 60℃에서 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고, EtOAc로 희석하고, 물 (2×)로 세척하였다. 합해진 수성 세척액을 EtOAc로 추출하고 합해진 유기 추출물을 건조시키고 (Na₂SO₄), 여과하고, 농축 건조시켰다. 생성된 조 생성물을 헥산 중 55% 내지 95% EtOAc의 구배로 용리시키는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물을 무색 고체 (1.47 g, 88%)로서 수득하였다. MS (m/z): 551.3 (M+H).

하기 화합물을 본질적으로 제조예 29의 방법에 의해 제조하였다.

<표 6>

제조예 39

7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-시클로프로필-1-피페라진-1-일-에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온

염산 (95 mL, 이소프로판올 중 5.5 M, 520 mmol)을 40℃에서 EtOAc (570 mL) 중 tert-부틸 4-[(1R)-2-시클로프로필-1-[4-[(1S)-1-[(1-에틸-2-옥소-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-7-일)아미노]에틸]페닐]에틸]피페라진-1-카르복실레이트 (29.45 g, 53.48 mmol)의 용액에 적가하였다. 혼합물을 3시간, 실온에서 교반한 다음에, 물 (300 mL)을 첨가하였다. 층을 분리하고 유기 층을 물 (2 × 150 mL)로 추출하였다. 합해진 수성 추출물의 pH를 5 N NaOH를 첨가함으로써 pH 10으로 조정하여 무색 고체의 형성을 결과하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 공기-건조시켜 표제 화합물 (25.18 g, 99%)을 무색 고체로서 수득하였다. MS (m/z): 451.2 (M+H).

하기 화합물을 본질적으로 제조예 39의 방법에 의해 제조하였다.

<표 7>

제조예 41

7-[[(1S)-1-[4-(2-시클로프로필-1-피페라진-1-일-에틸)페닐]에틸]아미노]-1-메틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온, 부분입체이성질체 1

tert-부틸 4-[2-시클로프로필-1-[4-[(1S)-1-[(1-메틸-2-옥소-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-7-일)아미노]에틸]페닐]에틸]피페라진-1-카르복실레이트, 부분입체이성질체 1 (245 mg, 0.46 mmol)을 DCM (2.5 mL)에 용해시켰다. TFA (0.7 mL, 9 mmol)를 첨가하고 반응물을 실온에서 90분 동안 교반하였다. 혼합물을 20% 수성 K₂CO₃로 켄칭하고 DCM (3×)으로 추출하였다. 합해진 유기 추출물을 Na₂SO₄상에서 건조시키고, 여과하고, 밤새 고진공 상에서 농축 건조시켜 표제 화합물을 백색 발포체, (196 mg, 88.5%)로서 수득하였다. MS (m/z): 437 (M+H).

하기 화합물을 본질적으로 제조예 41의 방법에 의해 제조하였다.

<표 8>

제조예 49

7-[[(1S)-1-[4-(2-시클로프로필-1-피페라진-1-일-에틸)페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온

ACN (3 mL) 중 7-[[(1S)-1-[4-(1-클로로-2-시클로프로필-에틸)페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 (518 mg, 1.07 mmol), 탄산칼륨 (445 mg, 3.217 mmol), 아이오딘화나트륨 (161 mg, 1.07 mmol) 및 피페라진 (277 mg, 3.22 mmol)의 혼합물을 밀봉 바이알에서 70℃로 가열한다. ~8시간 후, 혼합물을 실온으로 냉각하고, EtOAc로 희석하고, 규조토를 통해 여과하고, 농축하였다. 조 물질을 DCM 중 1% 내지 7% 3 M NH₃/MeOH의 구배로 용리시키는 실리카 겔 상에서 정제하여 표제 화합물 (306 mg, 0.66 mmol, 62%)을 백색 고체로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 451.2 (M+H).

하기 화합물을 적절한 보호된 피페라진을 사용하여 본질적으로 제조예 49의 방법에 의해 제조하였다.

<표 9>

제조예 53

tert-부틸 4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-트리플루오로아세틸)아미노]에틸]페닐]프로필]피페라진-1-카르복실레이트, 이성질체 1

제조예 54

tert-부틸 4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-트리플루오로아세틸)아미노]에틸]페닐]프로필]피페라진-1-카르복실레이트, 이성질체 2

tert-부틸 4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-트리플루오로아세틸)아미노]에틸]-페닐]프로필]피페라진-1-카르복실레이트 (29.2 g, 65.8 mmol)를 MeOH (584 mL)에 용해시키고 하기 조건을 사용하여 키랄 SFC 크로마토그래피에 의해 분할하였다: 칼럼: 키랄팩 AD-H, 5x25 cm; 용리액 85/15 CO₂/MeOH (0.5% 디메틸에틸아민을 가짐); 유량 300 g/분; 검출 파장 230 nm; 칼럼 온도 40℃; BPR 설정값 100 bar; 40℃ 용매 온도. 이성질체 1을 제1 용리 피크로서 단리하였다 (14.15 g, 31.9 mmol). ES/MS (m/z): 444 (M+H). 이성질체 2를 제2 용리 피크로서 단리하였다 (13.87 g, 31.3 mmol). ES/MS (m/z): 444 (M+H).

제조예 55

tert-부틸 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-에틸-2-옥소-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-7-일)아미노]에틸]페닐]-3-메틸-부틸]피페라진-1-카르복실레이트, 이성질체 1

제조예 56

tert-부틸 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-에틸-2-옥소-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-7-일)아미노]에틸]페닐]-3-메틸-부틸]피페라진-1-카르복실레이트, 이성질체 2

tert-부틸 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-에틸-2-옥소-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-7-일)아미노]에틸]페닐]-3-메틸-부틸]피페라진-1-카르복실레이트 (2.6 g, 4.70 mmol)를 4:1 이소프로판올:클로로포름 (50 mL)에 용해시키고 하기 조건을 사용하는 키랄 SFC 크로마토그래피에 의해 분할하였다: 칼럼: 키랄팩 AD-H, 5x25 cm; 주입 부피 1 mL; 용리액 75/25 CO₂/IPA (0.5% 디메틸에틸아민을 가짐); 유량 280 g/분; 검출 파장 240 nm; 칼럼 온도 40℃; BPR 설정값 100 bar; 40℃ 용매 온도. 제조예 45를 제1 용리 피크로서 단리하였다 (1.02 g, 1.89 mmol). ES/MS (m/z): 553.4 (M+H). 제조예 46을 제2 용리 피크로서 단리하였다 (1.05 g, 1.90 mmol). ES/MS (m/z): 553.4 (M+H).

실시예 1

7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온

아크릴로일 클로라이드 (305 μL, 3.75 mmol, 2 mL DCM 중)를 -78℃에서 DCM 중 7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-시클로프로필-1-피페라진-1-일-에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 (1.73 g, 3.26 mmol)의 용액에 적가하였다. -78℃에서 2분 후 몇 방울의 MeOH를 첨가한 후 포화 수성 중탄산나트륨을 첨가하고 혼합물을 실온으로 가온하였다. DCM을 첨가하고, 층을 분리하고, 수성 층을 DCM으로 추출하였다. 합해진 유기 추출물을 건조시키고 (Na₂SO₄), 여과하고, 농축 건조시켰다. 생성된 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피 (용매 B 중 25% 내지 40% 용매 A (여기서 용매 A는 10% MeOH/아세톤이고 용매 B는 헥산이다))에 의해 정제하여 표제 화합물을 무색 고체 (1.16 g, 70%)로서 수득하였다. MS (m/z): 505.3 (M+H).

하기 화합물을 본질적으로 실시예 1의 방법에 의해 제조하였다.

<표 11>

7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온과의 복합체로 IDH1 X-선 결정 구조의 결정.

7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온과의 복합체로 IDH1의 결정 구조를 일리노이주 60439 아르곤의 아르곤 국립 연구소(Argonne National Laboratory)에서 어드밴스트 포톤 소스(Advanced Photon Source)에서 작동하는 싱크로트론 빔-라인 APS 31-ID에서 수집된 X-선 회절 데이터로부터 결정하였다. R132H 돌연변이를 가진 IDH1 단백질은 다중 공급원으로부터 시판되고 있다. 대안적으로, IDH1 R132H 단백질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일상적으로 사용되고 널리 공지된 기술에 의해 돌연변이를 보유하는 시판되는 세포주로부터 단리될 수 있다. 결정은 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 5 mM 디티오트레이톨 및 2 mM 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온을 함유하는 완충제에서 15 mg/ml의 농도로 돌연변이 R132H를 가진 IDH1 단백질과 21℃에서 평형화된 시팅 드롭 트레이(sitting drop tray)로부터 수득하고, 100 mM Bis Tris pH 5, 5% DMSO, 22% PEG 3350 및 200 mM 황산암모늄을 함유하는 동등한 부피의 저장 용액과 혼합하였다. 결정을 3 mM의 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온을 함유하는 용액에 밤새 침지한 후, 22% 에틸렌 글리콜로 보충된 용액으로 옮기고 데이터 수집을 위해 플래시 동결시켰다. 2.8 Å 해상도에 대한 회절 데이터를 파장 0.9793 Å의 X-선 방사선으로 수집하였다. 결정은 셀 파라미터 a=82.74 Å, b=82.74 Å, c=299.4Å, α=β=γ=90°를 가진 공간 군 P4₃2₁2에 속하였다. 구조는 분자 대체(Molecular Replacement)에 의해 결정되며 IDH1의 하나의 이량체 분자를 함유하였다. IDH1 단백질을 모델링한 후에 계산된 차이 전자 밀도 맵은 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온의 2개의 결합된 분자의 명확한 밀도를 가졌다.

7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온의 입체화학은 전자 밀도로부터 결정되었으며, 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온의 두 분자 모두 모델링하였고 상기 공동-복합체(co-complex) 구조는 R워크(work)=0.192 및 R프리(free)=0.228의 R-인자(factor)로 정밀화하였다.

<표 12>

7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온의 좌표.

실시예 13

1-에틸-7-[[(1S)-1-[4-[3-메톡시-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)프로필]페닐]에틸]아미노]-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온, 부분입체이성질체 1

tert-부틸 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-[(1-에틸-2-옥소-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-7-일)아미노]에틸]페닐]-3-메톡시-프로필]피페라진-1-카르복실레이트 (1.372 g, 2.473 mmol)를 DCM (15 mL)에 용해시키고 TFA (10 mL, 15.08 g, 132.3 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 교반한 다음에 농축 건조시켰다. 조 물질을 DCM (12 mL) 및 DIPEA (1.25 mL, 7.17 mmol)에 용해시키고 혼합물을 -78도로 냉각하였다. 아크릴로일 클로라이드 (0.18 mL, 0.20 g, 2.2 mmol)를 적가하였다. 10분 후, 몇 방울의 메탄올을 첨가하여 잔류 아크릴로일 클로라이드를 켄칭하고 반응물을 농축 건조 (냉)시켰다. 조 물질을 헥산 중 50-70% 아세톤의 구배로 용리시키는 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 표제 화합물을 백색 발포체 (867 mg, 73%)로서 수득하였다. MS (m/z): 509 (M+H)

하기 화합물을 본질적으로 실시예 13의 방법에 의해 제조하였다.

<표 13>

실시예 15

7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 디술페이트

7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 (188 mg)을 1000 rpm/60℃에서 교반하면서 5 mL의 아세톤에 넣었다. 샘플은 투명한 용액이었다. 45 μL의 황산을 적가하였다 (2 mL의 아세톤에 희석). 농후한 백색 슬러리가 몇 방울 후 생성되었다. 황산의 절반을 첨가한 후, 슬러리 점조도가 변화되었다. 황산의 제2 절반부의 첨가는 서서히, 적가 방식으로 행해졌다. 슬러리가 약간 검화된 후 고체의 밝은 백색의 자유-유동 슬러리로 전환되었다. 30분 후 플레이트에 열을 차단시키고, 샘플을 실온으로 냉각하여, 백색 고체의 농후한 슬러리를 수득하였다. 진공 여과에 의해 백색 고체를 단리하였다. 생성된 케이크는 밝은 백색 고체이었다. 샘플을 20분 동안 공기 스트림하에 필터 상에서 제 자리에서, 이어서 밤새 70℃ 진공 오븐에서 건조시켰다. 266 mg을 회수하였다 (96.9% 수율).

실시예 16

7-[[(1S)-1-[4-[2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 4-히드록시벤조산

4-히드록시벤조산 (0.023 g, 0.165 mmol)을 디클로로메탄 (5 ml) 중 7-[[(1S)-1-[4-[2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 (84 mg, 0.165 mmol)의 용액에 첨가하였다. 5분 교반한 후, 용매는 질소류하에 서서히 증발시켰다. 생성된 고체를 진공하에 추가로 건조시켜 7-[[(1S)-1-[4-[2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온 4-히드록시벤조에이트 (105 mg, 0.1617 mmol)를 백색 고체로서 수득하였다. MS (m/z): 423.2 (M+H).

제조예 57

2-시클로프로필-N-메톡시-N-메틸아세트아미드

교반된 500 mL 환저 플라스크에 디클로로메탄 (160 mL, 8 부피) 및 1,1'-카르보닐디이미다졸 (35.63 g, 1.1 당량)을 채웠다. 불균질 혼합물을 15℃로 냉각하고 혼합물에 디클로로메탄 (40 mL, 2 부피) 중 2-시클로프로필아세트산 (20.0 g, 1.0 당량)의 용액을 내부 온도를 20℃ 미만으로 제어하는 속도로 채웠다. 생성된 용액을 25℃로 가온하고 2시간 동안 교반하였다. 그 다음에 용액을 15℃로 냉각하고 여기에 N,O-디메틸 히드록실아민 히드로클로라이드 (21.43 g, 1.1 당량)를, 내부 온도를 20℃ 미만으로 유지하면서, 조금씩 채웠다. 생성된 불균질 혼합물을 25℃로 가온하고 15시간 동안 교반하였다. 그 다음에 반응 혼합물을 물 (160 mL, 8 부피)로 희석하고 15분 동안 교반하였다. 교반을 정지하고 하부 수성 층을 분리하였다. 생성된 수성 층을 디클로로메탄으로 2회 더 (100 mL, 5 부피 x 2) 추출하고 유기 층을 합하였다. 합해진 유기 층을 1.5 N HCl (100 mL, 5 부피 x 2)로 2회 세척하였다. 그 다음에 유기 층을 10% 수성 중탄산나트륨 (100 mL, 5 부피 x 2)으로 2회 세척하였다. 그 다음에 유기 층을 물 (100 mL, 5 부피)에 이어서 포화 수성 염화나트륨 (100 mL, 5 부피)으로 세척하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨 상 (1.0% w/w)에서 건조시켰다. 덩어리를 여과하고 디클로로메탄 (20 mL, 1 부피)으로 세척한 다음에 진공하에 농축하였다. 생성된 고체를 5시간 동안 고진공하에 건조시켜 표제 화합물 (25.9 g, 90.5% 수율)을 수득하였다. ES/MS m/z 144.1 (M+H).

제조예 6의 대안적 합성

(S)-N-(1-(4-브로모페닐)에틸)-2,2,2-트리플루오로아세트아미드

교반된 250 mL 환저 플라스크에 디클로로메탄 (100 mL, 10 부피)에 이어서 (S)-(-)-1-(4-브로모페닐)에틸아민 (10.0 g, 1.0 당량)을 채웠다. 용액을 0℃로 냉각하고 냉각된 용액에 트리플루오로아세트산 무수물 (13.12g, 1.25 당량)을, 내부 온도를 5℃ 미만으로 유지하면서 서서히 채웠다. 생성된 불균질 혼합물을 2시간 동안 0℃에서 교반하고 이 때 트리메틸아민 (12.64g, 2.5 당량)을, 내부 온도를 5℃ 미만으로 유지하면서 서서히 채웠다. 혼합물을 추가 시간 동안 교반한 다음에 물 (30 mL, 3 부피)을 첨가함으로써 켄칭하였다. 2상 혼합물을 25℃로 가온하고 30분 동안 교반하였다. 그 다음에 층을 분리하고 수성 층을 디클로로메탄 (50 mL, 5 부피 x 2)으로 2회 추가로 추출하였다. 합해진 유기 층을 포화 수성 염화나트륨 (50 mL, 5 부피)으로 세척하고 무수 황산나트륨 (1 wt%) 상에서 건조시켰다. 건조된 용액을 여과하고 디클로로메탄 (10 mL, 1 부피)으로 세척하고 용액을 진공하에 농축하여 조 백색 고체를 수득하였다. 조 고체를 석유 에테르 (100 mL, 10 부피) 중에서 25℃에서 2시간 동안 슬러리화하고 고체를 여과에 의해 수집하였다. 습윤 고체를 8시간 동안 40℃에서 진공하에 건조시켜 표제 화합물 (13.3 g, 90% 수율)을 수득하였다. ES/MS m/z 295.3 (M+H).

제조예 58

(S)-N-(1-(4-(2-시클로프로필아세틸)페닐)에틸)-2,2,2-트리플루오로아세트아미드

오버헤드 교반을 갖춘 10 L 반응 용기에 메틸 tert-부틸 에테르 (1500 mL, 15 부피)를 채웠다. 교반된 용액에 (S)-N-(1-(4-브로모페닐)에틸)-2,2,2-트리플루오로아세트아미드 (100 g, 1.0 당량)를 채웠다. 불균질 혼합물을 30분 동안 25℃에서 교반한 다음에 테트라히드로푸란 (500 mL, 5 부피)을 채웠다. 생성된 균질 용액을 -83℃로 냉각하였다. n-부틸 리튬 (297 mL, 2.2 당량)을 온도를 -78℃ 미만으로 유지하면서 용액에 서서히 첨가하고 생성된 용액을 1.5시간 동안 -83℃에서 교반하였다. 냉각된 용액에 메틸 tert-부틸 에테르 (200 mL, 2 부피) 중 2-시클로프로필-N-메톡시-N-메틸아세트아미드 (53.19 g, 1.1 당량)의 용액을, 내부 온도를 -78℃ 미만으로 유지하면서 첨가하였다. 생성된 용액을 1.5시간 동안 -83℃에서 교반하고, 이 때 용액을 -30℃로 가온하고 포화 수성 염화암모늄 (5 L, 5 부피)을 첨가함으로써 켄칭하였다. 켄칭된 반응 혼합물을 25℃로 가온하고 층을 분리하였다. 수성 층을 메틸 tert-부틸 에테르 (500 mL, 5 부피)로 추출하였다. 합해진 유기 층을 물 (500 mL, 5 부피)에 이어서, 포화 수성 염화나트륨 (500 mL, 5 부피)으로 세척한 다음에 무수 황산나트륨 (50 g, 0.5% w/w) 상에서 건조시켰다. 덩어리를 여과하고 메틸 tert-부틸 에테르 (50 mL, 0.5 부피)로 세척하였다. 생성된 용액을 대략 1 부피의 용액이 남아 있을 때까지 진공하에 농축하였다. 석유 에테르 (1500 mL, 15 부피)를 농축된 혼합물에 채우고 생성된 슬러리를 2시간 동안 30℃ 미만으로 교반하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고 8시간 동안 40℃에서 진공하에 건조시켜 표제 화합물 (65.9 g, 67% 수율)을 수득하였다. ES/MS m/z 298.0 (M-H).

제조예 59

N-((S)-1-(4-((S)-2-시클로프로필-1-히드록시에틸)페닐)에틸)-2,2,2-트리플루오로아세트아미드

수소생산기 반응기(hydrogenator reactor)에 무수 에탄올 (7.89 kg, 10 부피)을 채웠다. 교반된 용액에 (S)-N-(1-(4-(2-시클로프로필아세틸)페닐)에틸)-2,2,2-트리플루오로아세트아미드 (1.0 kg, 1.0 당량)를 채웠다. 용액에 포타슘 tert-부톡시드 (tBuOH 중 1.0 M, 0.41 kg, 0.5 부피)의 용액을 내부 온도를 30℃ 미만으로 유지하면서 채웠다. 그 다음에 용액에 (R)-루시®-XylBINAP (0.0675 kg, 0.017 당량)를 채웠다. 25℃에서 교반하면서 수소생산기를 수소 기체로 2회 퍼지하였다. 퍼지 후, 용액을 5시간 동안 25℃에서 4.5 kg의 수소하에 교반하였다. 5시간 후, 용액을 통기한 다음에 42℃ 하에 진공을 사용하여 오일로 농축하였다. 오일을 메틸 tert-부틸 에테르 (11.115 kg, 15 부피)에 용해시킨 다음에 45℃ 하에 진공을 사용하여 오일로 농축하였다. 오일을 메틸 tert-부틸 에테르 (11.115 kg, 15 부피)에 용해시킨 다음에 45℃ 하에 진공을 사용하여 오일로 농축하였다. 오일에 25℃에서 메틸 tert-부틸 에테르 (22.23 kg, 30 부피)를 채웠다. 생성된 용액을 물 (15.0 kg, 15 부피)에 이어서 물 중 NaCl 용액 (15.0 L 물 중 5.4 kg NaCl)으로 세척하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨 (1.5 kg, 1.5 w/w) 상에서 건조시킨 다음에 여과하고 메틸 tert-부틸 에테르 (1.112 kg, 1.5 부피)로 세척하였다. 여과된 용액에 활성탄 (0.3 kg, 0.3 w/w)을 채우고 혼합물을 교반하고 2시간 동안 40℃에서 가열하였다. 그 다음에 혼합물을 여과하고 메틸 tert-부틸 에테르 (1.112 kg, 1.5 부피)로 세척하였다. 여과된 용액을 45℃ 하에 진공을 사용하여 오일로 농축하였다. 오일을 석유 에테르 (9.84 kg, 15 부피)에 용해시키고 45℃ 하에 진공을 사용하여 오일로 농축하였다. 오일을 석유 에테르 (9.84 kg, 15 부피)에 용해시키고 45℃ 하에 진공을 사용하여 오일로 농축하였다. 오일에 석유 에테르 (19.68 kg, 30 부피)를 채우고 혼합물을 3시간 동안 30℃에서 교반하고 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고 석유 에테르 (9.84 kg, 15 부피)로 세척하였다. 단리된 고체를 5시간 동안 40℃에서 진공하에 건조시켜 표제 화합물 (0.79 kg, 79%)을 수득하였다. ES/MS m/z 300.0 (M-H).

제조예 60

N-((S)-1-(4-((R)-1-클로로-2-시클로프로필에틸)페닐)에틸)-2,2,2-트리플루오로아세트아미드

반응기에 메틸 tert-부틸 에테르 (4.45 kg, 6 부피) 및 N-((S)-1-(4-((S)-2-시클로프로필-1-히드록시에틸)페닐)에틸)-2,2,2-트리플루오로아세트아미드 (1.0 kg, 1.0 당량)를 채웠다. 용액을 10℃로 냉각하고 여기에 1-포르밀피롤리딘 (0.066 kg, 0.2 당량)을 내부 온도를 13℃ 미만으로 유지하면서 서서히 채웠다. 그 다음에 용액에 벤조일 클로라이드 (0.56 kg, 1.2 당량)를 내부 온도를 13℃ 미만으로 유지하면서 서서히 채웠다. 생성된 용액을 25℃로 가온하고 최대 36시간 동안 교반하였다 (반응의 과정 동안에 반응을 모니터링할 수 있으며, 반응 속도가 떨어진다면 1-포르밀피롤리딘 및 벤조일 클로라이드를 추가로 채울 수 있다). 그 다음에, 완료된 반응물을 40℃ 하에 진공을 사용하여 오일로 농축하였다. 오일을 15℃로 냉각한 다음에 수성 10% 중탄산나트륨 용액 (22.0 kg, 20 부피)으로 켄칭하고 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. 2상 혼합물에 석유 에테르 (6.56 kg, 10 부피)를 채웠다. 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 석유 에테르 (6.56 kg, 10 부피)로 추출하였다. 합해진 유기 층을 수성 10% 중탄산나트륨 (5.0 L, 5 부피)으로 3회 세척하였다. 그 다음에 유기 층을 물 (5.0 L, 5 부피)에 이어서 염수 (5.0 L, 5 부피)로 세척하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨 (0.5 kg, 0.5 w/w) 상에서 건조시켰다. 그 다음에 혼합물을 여과하고 석유 에테르 (0.33 kg, 0.5 부피)로 세척하였다. 여액을 40℃ 하에 진공을 사용하여 오일로 농축하였다. 오일을 아세토니트릴 (3.93 kg, 5 부피)에 용해시키고 40℃ 하에 진공을 사용하여 오일로 농축하였다. 오일을 아세토니트릴 (3.93 kg, 5 부피)에 용해시키고 40℃ 하에 진공을 사용하여 오일로 농축하였다. 오일을 아세토니트릴 (7.86 kg, 10 부피)에 용해시키고 표제 화합물의 수득된 용액을 다음 단계에서 원래 그대로 사용하였다. ES/MS m/z 318.0 (M-H).

제조예 61

tert-부틸 4-((S)-2-시클로프로필-1-(4-((S)-1-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)에틸)페닐)에틸피페라진-1-카르복실레이트

N-((S)-1-(4-((R)-1-클로로-2-시클로프로필에틸)페닐)에틸)-2,2,2-트리플루오로아세트아미드의 이전에 수득된 용액에 N-Boc-피페라진 (0.924 kg, 1.5 당량)에 이어서 중탄산나트륨 (1.1 kg, 4.0 당량)을 채웠다. 생성된 혼합물을 60시간 동안 85℃로 가열하였다. 주: 반응물을 24시간마다 샘플링하고 각각의 샘플을 취한 후, 반응물을 추가량의 N-Boc-피페라진 (0.31 kg, 0.5 당량)으로 채웠다. 일단 완료되면, 반응물을 45℃ 하에 진공을 사용하여 농축하여 오일을 수득하였다. 오일을 물 (10.0 kg, 10 부피) 및 메틸 tert-부틸 에테르 (7.41 kg, 10 부피)로 희석하였다. 생성된 2상 혼합물을 분리하고 수성 층을 메틸 tert-부틸 에테르 (7.41 kg, 10 부피)로 추출하였다. 합해진 유기 층을 30% 시트르산 (5.0 L, 5 부피)으로 5회 추출하였다. 합해진 수성 층을 석유 에테르 (6.56 kg, 10 부피)로 2회 세척하였다. 수성 층을 15℃에서 탄산나트륨 (대략 25.0 kg, 25 w/w)을 첨가하여 pH를 9로 조정하였다. 염기성화된 수성 층을 메틸 tert-부틸 에테르 (7.41 kg, 10 부피)로 추출하였다. 합해진 유기 층을 물 (5.0 L, 5 부피) 및 염수 (5.0 L, 5 부피)로 세척하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨 (0.5 kg, 50% w/w) 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고 메틸 tert-부틸 에테르 (0.37 kg, 0.5 부피)로 세척하였다. 여액을 40℃ 하에 진공에 의해 오일로 농축하였다. 생성된 오일을 무수 에탄올 (3.95 kg, 5 부피)에 용해시키고 표제 화합물의 조 용액을 다음 단계에서 직접 사용하였다. ES/MS m/z 374.3 (M+H-CF₃CO).

제조예 62

tert-부틸 4-((S)-1-(4-((S)-1-아미노에틸)페닐)-2-시클로프로필에틸)피페라진-1-카르복실레이트

tert-부틸 4-((S)-2-시클로프로필-1-(4-((S)-1-(2,2,2-트리플루오로아세트아미도)에틸)페닐)에틸피페라진-1-카르복실레이트의 이전에 수득된 용액에 무수 에탄올 (3.7 kg, 3.7 w/w)을 채웠다. 용액을 20℃로 냉각하고 여기에 수성 1 M 수산화칼륨 (3.0 kg 물 중 0.168 kg KOH)을 채웠다. 생성된 혼합물을 10시간 동안 25℃에서 교반한 다음에 30% 수성 시트르산 (5.0 kg, 5 w/w)을 내부 온도를 30℃ 미만으로 유지하면서 서서히 첨가함으로써 켄칭하였다. 켄칭된 용액에 메틸 tert-부틸 에테르 (7.41 kg, 7.41 w/w)를 채웠다. 층을 분리하고 유기 층을 30% 수성 시트르산 (5.0 kg, 5 w/w)으로 추출하였다. 수성 층을 15℃에서 탄산나트륨 (대략 25.0 kg, 25 w/w)을 첨가하여 pH를 8로 조정하였다. 염기성화된 수성 층을 에틸 아세테이트 (7.41 kg, 7.41 w/w)로 2회 추출하였다. 합해진 유기 층을 물 (5.0 kg, 5 w/w) 및 그 다음에 염수 (5.0 kg, 5 w/w)로 세척하였다. 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 다음에 (0.5 kg, 50 wt%), 여과하고 에틸 아세테이트 (0.37 kg, 0.37 w/w)로 세척하였다. 용액을 45℃ 하에 진공에 의해 오일로 농축하였다. 생성된 오일을 이소프로필 알콜 (2 L, 2 부피)에 용해시키고, 생성된 용액을 45℃ 하에 진공에 의해 오일로 농축하였다. 생성된 오일을 이소프로필 알콜 (1.2 L, 1.2 부피)에 용해시키고 표제 화합물의 조 용액을 다음 정제 단계에서 직접 사용하였다. ES/MS m/z 374.2 (M+H).

1000 mL 환저 플라스크에 이소프로필 알콜 (270 mL, 9 부피) 중 tert-부틸 4-((S)-1-(4-((S)-1-아미노에틸)페닐)-2-시클로프로필에틸)피페라진-1-카르복실레이트 (30.0 g, 1.0 당량)의 용액을 채웠다. 20-30℃에서 교반된 용액에 L-디벤조일 타르타르산 (L-DBTA, 34.5 g, 1.2 당량)을 채웠다. 용액을 2-4시간 동안 20-30℃에서 교반하였다. 생성된 슬러리를 20-30℃에서 8-12시간에 걸쳐 교반하였다. 경질(light) 슬러리에 MTBE (300 mL, 10 부피)를 채웠다. 생성된 슬러리를 교반하고 12-16시간에 걸쳐 20-30℃에서 농후화하였다. 그 다음에 고체를 여과에 의해 수집하고 MTBE (150 mL, 5 부피)로 세척하였다. 고체를 12시간 동안 45-55℃에서 감압하에 건조시켜 tert-부틸 4-((S)-1-(4-((S)-1-아미노에틸)페닐)-2-시클로프로필에틸)피페라진-1-카르복실레이트 L-디벤조일 타르타르산 염을 백색 고체 (48.8 g, 83% 수율, >98:2 dr)로서 수득하였다.

교반된 1000 mL 환저 플라스크에 tert-부틸 4-((S)-1-(4-((S)-1-아미노에틸)페닐)-2-시클로프로필에틸)피페라진-1-카르복실레이트 L-디벤조일 타르타르산 염 (40.0 g, 1.0 당량)에 이어서 디클로로메탄 (400 mL, 10 부피)을 채웠다. 15-25℃에서 교반된 용액에 10% Na₂CO₃의 수성 용액을 채웠다 (pH를 8-10으로 조정하기에 충분, 대략 6-8 부피). 2상 혼합물을 15-25℃에서 1시간 동안 교반한 다음에 층을 분액 깔때기에서 분리하였다. 유기 층에 DMSO (240 mL, 6 부피)를 채웠다. 용액을 40℃ 미만으로 감압하에 농축하여 디클로로메탄을 제거하였다. 그 다음에 DMSO 중 프리베이스(freebased) tert-부틸 4-((S)-1-(4-((S)-1-아미노에틸)페닐)-2-시클로프로필에틸)피페라진-1-카르복실레이트의 용액을 다음 단계에서 직접 사용하였다.

제조예 63

에틸 6-클로로-4-(메틸아미노)피리딘-3-카르복실레이트

메틸 아민 (16 mL, 물 중 11.6 mol/L, 186 mmol)을 0℃에서 아세토니트릴 (300 mL) 중 에틸 4,6-디클로로피리딘-3-카르복실레이트 (20 g, 92 mmol)의 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 2시간에 걸쳐 실온으로 가온하였다. 반응 혼합물에 물 및 에틸 아세테이트를 첨가하고 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합해진 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켰다. 생성된 조 물질을 실리카 겔 크로마토그래피 (0-100% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여, 적절한 분획물의 농축 후, 에틸 6-클로로-4-(메틸아미노)피리딘-3-카르복실레이트를 백색 고체 (10.46 g, 52.14 mmol, 57% 수율)로서 수득하였다. MS (m/z): 201 (M+H).

제조예 64

[6-클로로-4-(메틸아미노)-3-피리딜]메탄올

THF (100 mL) 중 에틸 6-클로로-4-(메틸아미노)피리딘-3-카르복실레이트 (10.46 g, 52.14 mmol)의 용액을 0℃에서 수소화알루미늄리튬 (78.2 mL, THF 중 1.0 mol/L, 78.2 mmol)의 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 1.5시간에 걸쳐 실온으로 가온하였다. 반응 혼합물에, 순차적으로, 물 (3 mL), 15% 수성 NaOH (3 ml), 및 그 다음에 물 (9 mL)을 첨가하였다. 교반한 후, 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 여액을 물로 희석하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 합해진 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켜 [6-클로로-4-(메틸아미노)-3-피리딜]메탄올을 담황색 고체 (2.78 g, 27% 수율)로서 수득하였다. 셀라이트 여과 케이크를 메탄올로 추가로 세척하고 여액을 농축 건조시켰다. 여과 케이크로부터의 고체를 수집하고 디클로로메탄과 함께 교반하고 셀라이트를 통해 여과하였다. 여액을 메탄올 세척액으로부터의 잔류물과 합하고 물질을 농축 건조시키고 물질을 비축하였다. 여과로부터의 수집된 고체에 4:1 클로로포름: 이소프로필 알콜을 첨가하고 혼합물을 밤새 교반하였다. 혼합물을 셀라이트의 패드 상에서 여과하고, 여액을 비축된 잔류물과 합하고 농축 건조시켜 추가량의 [6-클로로-4-(메틸아미노)-3-피리딜]메탄올을 담황색 고체 (5.07 g, 56% 수율)로서 수득하였다. [6-클로로-4-(메틸아미노)-3-피리딜]메탄올의 총 회수는 7.85 g, 83% 수율)이었다. MS (m/z): 173 (M+H).

제조예 65

7-클로로-1-메틸-4H-피리도[4,3-d][1,3]옥사진-2-온

트리포스겐 (6.04 g, 20.4 mol)을 -20℃에서 THF (100 mL) 중 [6-클로로-4-(메틸아미노)-3-피리딜]메탄올 (5.07 g, 29.1 mol) 및 DIPEA (51.2 mL, 291 mmol)의 용액에 첨가하였다. 냉조를 제거하고 혼합물을 실온으로 가온하였다. 30분 후, 물을 첨가하고 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합해진 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켰다. 생성된 조 물질을 실리카 겔 크로마토그래피 (0-100% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여, 적절한 분획물의 농축 후, 7-클로로-1-메틸-4H-피리도[4,3-d][1,3]옥사진-2-온을 오렌지색 고체 (5.13 g, 24.5 mmol, 84% 수율)로서 수득하였다. MS (m/z): 199 (M+H).

제조예 66

tert-부틸 4-[2-시클로프로필-1-[4-[(1S)-1-[(1-메틸-2-옥소-4H-피리도[4,3-d][1,3]옥사진-7-일)아미노]에틸]페닐]에틸]피페라진-1-카르복실레이트, 부분입체이성질체 1

질소하에 톨루엔 (17.4 mL) 중 tert-부틸 4-[1-[4-[(1S)-1-아미노에틸]페닐]-2-시클로프로필-에틸]피페라진-1-카르복실레이트 (1.30 g, 3.48 mmol), 7-클로로-1-메틸-4H-피리도[4,3-d][1,3]옥사진-2-온 (864 mgs, 4.35 mmol), 및 탄산세슘 (2.27 g, 6.96 mmol)의 용액에 디클로로[1,3-비스(2,6-디-3-펜틸페닐)이미다졸-2-일리덴](3-클로로피리딜)팔라듐(II) (291 mgs, 0.348 mmol)을 첨가하고 혼합물을 밤새 75℃에서 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 혼합물을 실리카 겔의 플러그를 통해 여과하고 에틸 아세테이트로 용리시켰다. 여액을 감압하에 농축하고 획득한 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (20-100% EtOAc/헥산)에 의해 정제하였다. 혼합된 분획물을 실리카 겔 크로마토그래피 (50-100% 메틸 tert-부틸 에테르/헥산)에 의해 재정제하고 칼럼 둘 다로부터의 합해진 순수한 분획물을 농축하여 tert-부틸 4-[2-시클로프로필-1-[4-[(1S)-1-[(1-메틸-2-옥소-4H-피리도[4,3-d][1,3]옥사진-7-일)아미노]에틸]페닐]에틸]피페라진-1-카르복실레이트, 부분입체이성질체 1을 회백색 발포체 (1.312 g, 2.400 mmol, 69% 수율)로서 수득하였다. MS (m/z): 536 (M+).

암은 세포 및 조직 미세환경에서 DNA 수복, 게놈 안정성, 세포 증식, 세포 사멸, 유착, 혈관신생, 침입, 및 전이를 조절하는 하나 이상의 유전자의 이상 기능에 의해 개시 및 진행이 유도되는 질환의 불균질 집적으로서 점점 더 인식되고 있다. "암" 유전자의 변이체 또는 이상 기능은 자연 발생 DNA 다형성, 게놈 카피 수의 변화 (증폭, 결실, 염색체 손실, 또는 복제를 통함), 유전자 및 염색체 구조의 변화 (염색체 전위, 역전, 또는 탈조절된 유전자 발현을 야기하는 기타 재배열), 및 점 돌연변이로부터 기인할 수 있다. 암성 신생물은 하나의 이상 유전자 기능에 의해 유도될 수 있고, 동일한 이상 유전자 기능에 의해 유지되거나, 추가적인 이상 유전자 기능에 의해 악화된 유지 및 진행에 의해 유지될 수 있다.

상기 언급된 유전적 염색체 이상을 넘어서, 암 각각은 DNA 메틸화, 게놈 각인, 및 아세틸화, 메틸화, 또는 인산화에 의한 히스톤 변형을 포함한 게놈의 후성적 변형을 또한 포함할 수 있다. 후성적 변형은 악성 종양의 유도 및/또는 유지에 역할을 할 수 있다.

인간 암에서의 세포 유전학적 이상의 광범위한 카탈로그가 편집되어 온라인으로 정기적으로 유지되고 업데이트되고 있다 (미국 국립 암 연구소 (NCI) 암 게놈 해부학 프로젝트 (CGAP) 웹 사이트에서 암에서 염색체 이상의 미텔만 데이터베이스[The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at the US National Cancer Institute (NCI) Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) Web site] 참조). 웰컴 트러스트 생거 연구소 암 게놈 프로젝트(Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project)는 종양생성과 인과 관계가 있는 모든 인간 유전자의 상세한 온라인 "암 유전자 조사(Cancer Gene Census)"뿐만 아니라 인간 암의 체세포 돌연변이의 COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) 데이터베이스를 유지한다. 다양한 암과 인과 관계가 있는 세포유전학적 변화에 대한 풍부한 정보를 담고 있는 추가 공급원은 종양학 및 혈액학에서 유전학 및 세포 유전학의 지도(Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology)이다.

생검, 면역표현형 검사 및 기타 검사에 의한 암성 악성 종양의 진단은 공지되어 있고 일상적으로 사용된다. 고해상도 염색체 밴딩 및 고급 염색체 영상화 기술 외에도, 의심되는 암 사례에서의 염색체 이상은 세포유전학적 분석 예컨대 계내 하이브리드화 (FISH)에서의 형광, 핵형 분석, 스펙트럼 핵형 분석 (SKY), 다중 FISH (M-FISH), 비교 게놈 하이브리드화 (CGH), 단일 뉴클레오티드 다형성 배열 (SNP 칩) 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지되고 사용되는 기타 진단 및 분석 시험을 통해 결정될 수 있다.

IDH1 및 IDH2의 돌연변이는 신경교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 핍지교종, 부신경절종, 골수이형성 증후군 (MDS), B 세포 급성 림프모구 백혈병 (B-ALL), 갑상선, 결장직장, 급성 골수성 백혈병 (AML) [Dang et al., Trends Mol. Med., 2010, 16: 387-397; Ward et al., Oncogene, 2012, 31(19): 2491-2498]; 흑색종 [Shibata et al., Am. J. Pathol., 2010, 178(3): 1395-1402]; 전립선 [Flaherty et al., J. Clin. Oncol., 2014, 32 (suppl. 4; Abstract 213); Cairns et al., Cancer Discovery, 2013, 3: 730-741]; 연골육종 및 담관암종 [Balss et al., Acta Neuropathol., 2012, 124: 883-891; Cairns et al., Cancer Discovery, 2013, 3: 730-741]; 혈관면역모세포성 T 세포 림프종 (AITL) [Cairns et al. Blood, 2012. 119(8):1901-1903]을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 많은 암 종양 유형에서 동정되어 있다. 돌연변이는 활성 부위의 특정 잔기 또는 그 부근에서 밝혀졌다: IDH1의 경우 G97D, R100, R132H, R132C, R132S, R132V, R132G, V71I, R132L, 및 G123R [Dang et al., Trends Mol. Med., 2010, 16: 387-397; Ward et al., 2012 and Supplementary Table 2].

IDH1 및 IDH2의 돌연변이체 형태는 α-케토글루타레이트를 2-히드록시글루타레이트로 환원시키는 네오모르프 활성 (기능 획득)을 갖는 것으로 나타났다. 2-히드록시글루타레이트의 내인성 생성은 거울상 특이적이므로 D-거울상이성질체 (또한 (R) 거울상이성질체라고도 함)를 결과한다. 통상, 세포는 낮은 수준의 2-히드록시글루타레이트를 가지며 한편 IDH1 또는 IDH2 돌연변이를 보유하는 세포는 상당히 상승된 수준의 2-히드록시글루타레이트를 나타낸다. 상당히 상승된 수준의 2-히드록시글루타레이트는 돌연변이체 IDH1 또는 IDH2를 가진 환자의 혈장에서 그리고 상기 돌연변이를 보유하는 종양에서 검출된다. 높은 수준의 2-히드록시글루타레이트는 과메틸화 표현형과 연관되어 있고, 이는 분화에서의 차단을 초래하여 증진된 종양생성을 야기한다.

특정 비가역적 공유적 억제제의 활성은 K_I에 의해 정의된, 표적 (IDH1 또는 IDH2)에 대한 그의 결합, 및 k_inact에 의해 정의된, 공유 결합 형성의 최대 잠재 속도에 의해 정의된다. 이들 두 인자는 별도의 실체가 아니라, 오히려 함께 작동하여 공유 결합 형성의 원하는 효과를 초래한다. 이는 하기 3 가지 점에 의해 설명된다.

첫째, 친전자체 예를 들어, 아크릴아미드가, 친핵체 예를 들어, 시스테인에 대해 적절히 위치되어야 한다는 사실은 유기 화학에서 공유 결합 형성의 기본 구성요소이다. 공유 결합을 형성하기 위해 친핵체가 친전자체에 접근하여야 하는 정밀한 각도 및 거리가 있다. 친핵체 근처에 친전자체의 단순 배치는 공유 결합 형성에 충분하지 않다.

둘째, 효소 예를 들어, 배향 코어에 대한 억제제의 결합을 안정화시키기 위해 수소 결합 모이어티를 함유하는 코어 상에 반응성 기를 혼입시키는 경우, 통상의 기술자는 상기 언급된 최적의 각도 및 거리에 비추어 어떻게 배향 코어가 표적에 결합하고 친핵체에 대해 친전자체를 위치시키는지 고려하여야 한다. 다시 말하면, 친핵체 근처에 친전자체의 단순 배치는 공유 결합 형성에 충분하지 않다. 배향 코어의 변화는 공유 결합을 형성하는 억제제 화합물의 능력에 영향을 줄 수 있다.

셋째, 상기 두 가지 점을 함께 고려할 경우, 배향 코어 상에 친전자체 모이어티의 단순 존재는 공유 결합이 형성될 것이라는 점을 시사하기에 충분하지 않다.

하기 시험관내 및 생체내 연구는 다양한 특정 암 세포주에 대하여 시험된 화학식 I 또는 Ia의 화합물의 돌연변이체 IDH1 및 IDH2 단백질 억제 활성 및 효능을 입증한다. 이들 검정은 인간 임상적 치료 활성을 나타내는 것으로서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 인식된다. 개시된 연구에서 돌연변이체 IDH1 또는 IDH2 네오모르프 단백질의 억제는 추가 돌연변이체 IDH1 및 IDH2 네오모르프 단백질에 대하여 효과적일 것으로 여겨진다. 돌연변이체 IDH1 또는 IDH2 억제 활성 및 효능을 입증하는 검정은 실질적으로 다음과 같이 또는 유사한 데이터를 제공하는 유사한 검정에 의해 수행될 수 있다.

하기 검정의 결과는, 예시되고 시험된 화합물이 IDH1 및 IDH2 돌연변이체 억제제로서 유용하며 돌연변이체 IDH1 또는 IDH2를 발현하는 암을 치료하는데 유용할 수 있음을 입증한다.

IDH1 및 IDH2 돌연변이체 효소에 대한 생화학적 검정

IDH1-R132H, IDH1-R132C, IDH2-R172K 및 IDH2-R140Q 돌연변이체 효소는 αKG의 2HG로의 전환을 촉매한다. 2HG는 인-라인 고체상 추출 및 질량 분석법을 사용하여 분석하였다. 이 분석은 6460 삼중 사중극자 질량 분석계 (G6460A 아질런트(Agilent))에 연결된 래피드파이어(RapidFire)® 기기에서 수행하였다.

N-말단 His-태그를 함유하는 IDH1 돌연변이체 (R132H 및 R132C) 및 IDH2 돌연변이체 (R140Q 및 R172K) 단백질을 이.콜라이(E.coli)에서 발현시키고, 니켈 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 효소 검정은 100 mM 트리스-HCl 완충제, 1 mM DTT, 0.005% 트리톤(TRITON)™ X-100, 120 mM NaCl을 함유하는 V형-바닥 96 웰 폴리프로필렌 플레이트에서 수행하였다. IDH1 R132H의 경우, α-케토글루타레이트, NADPH 및 MnCl₂가 각각 300 μM, 2.5 μM 및 300 μM의 최종 농도로 포함되었다. IDH1 R132C의 경우, α-케토글루타레이트, NADPH 및 MnCl₂가 각각 100 μM, 10 μM 및 100 μM의 최종 농도로 포함되었다. IDH2 R172K의 경우, α-케토글루타레이트, NADPH 및 MnCl₂를 각각 150 μM, 10 μM 및 150 μM의 최종 농도로 포함시켰다. IDH2 R140Q의 경우, α-케토글루타레이트, NADPH 및 MnCl₂를 각각 3000 μM, 10 μM 및 100 μM의 최종 농도로 포함시켰다. 최종 pH = 7.0. DMSO 스톡에 용해된 시험 화합물을 4%의 최종 DMSO 농도에서 반응 혼합물에 희석하였다. 화합물은 용량-반응 형식으로 시험하였다. 검정은 효소의 첨가에 의해 시작하였다. 효소는 하기 최종 농도에서 사용하였다: IDH1 R132H, 2 nM; IDH1 R132C, 0.5 nM; IDH2 R172K, 1.2 nM; IDH2 R140Q, 1.2 nM. 90분 후, 반응 생성물의 질량 분석법 분석 및 정량을 위한 내부 표준으로서 3-히드록시-1,5-펜탄디오산-2,2,3,4,4-d₅ 산 (5d₅-3HG)을 함유하는 ACN (50:50)을 첨가함으로써 반응물을 켄칭하였다. 강한 음이온성 교환 칼럼 크로마토그래피 (페노메넥스(Phenomenex) 스트라타(Strata)-X-A 시큐러티가드(SecurityGuard))를 사용하여 켄칭된 샘플 중의 2-히드록시글루타레이트 (2HG)를 분리하고 6460 삼중 사중극자 질량 분석계 (G6460A 아질런트)에서 질량 분석법에 의해 분석하였다. 검출된 2HG 신호는 공지된 2HG 농도를 사용하여 생성된 검량선을 사용하여 분석물 농도로 변환시켰다. 시험된 각각의 화합물에 대해, % 억제는 DMSO 대조군 샘플을 0% 억제로서 사용하고 무효소 대조군을 100% 억제로서 사용하여 계산하였다. IC₅₀ 값은 4-파라미터 방정식을 사용하여 상이한 화합물 농도에서의 개별 % 억제 값으로부터 수득하였다. 이들 계산은 액티버티 베이스(Activity Base) (IDBS) 또는 스크리너(Screener) (진데이터(Genedata)) 데이터 분석 프로그램을 사용하여 수행하였다.

이 검정의 결과는, 예시되고 시험된 화합물이 IDH1/R132H 및 IDH1/R132C에 대한 돌연변이체 IDH1 활성을 억제하고 IDH2/R140Q 및 IDH2/R172K에 대한 돌연변이체 IDH2 활성을 억제함을 입증한다.

하기 실시예는 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였고, 하기 표 14에 나타낸 바와 같이 돌연변이체 IDH1 및 돌연변이체 IDH2에 대한 활성을 나타낸다.

<표 14>

평균 + 평균의 표준 편차.

야생형 IDH1 및 IDH2 효소에 대한 생화학적 검정

IDH1 및 IDH2 효소는 이소시트레이트의 αKG로의 전환을 촉매한다.

N-말단 His-태그를 함유하는 야생형 IDH1 (국립 생명 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information), 수탁: NP_001269316.1) 및 IDH2 (국립 생명 공학 정보 센터, 수탁: EAX02082.1) 단백질을 이.콜라이에서 발현시키고, 니켈 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 효소 검정은 pH 7.5의 100 mM 트리스-HCl 완충제, 1 mM DTT, 0.005% 트리톤™ X-100, 120 mM NaCl을 함유하는 V형-바닥 96 웰 폴리프로필렌 플레이트에서 수행하였다. IDH1 야생형 검정 이소시트레이트의 경우, NADP⁺ 및 MnCl₂를 각각 85 μM, 50 μM 및 20 μM의 농도로 포함시켰다. IDH2 야생형 검정 이소시트레이트의 경우, NADP⁺ 및 MnCl₂를 각각 30 μM, 50 μM 및 10 μM의 농도로 포함시켰다. DMSO 스톡 용액에 용해된 억제제를 4%의 최종 DMSO 농도에서 반응 혼합물에 희석하였다. 효소 검정은 질량 분석법 분석을 위한 내부 표준으로서 d6-2-케토펜탄디오산 (d6-αKG)을 함유하는 ACN (50:50)을 첨가함으로써 종결 (켄칭)하였다. 10 마이크로리터의 반응 혼합물을 100 μL의 물, 피리딘 완충제 (8.6% 피리딘, pH 5) 중 50 μL의 1 M O-벤질히드록실아민, 및 피리딘 완충제 중 50 μL의 1 M N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC)와 합하였다. 1시간 동안 실온에서 유도체화시킨 후, 샘플을 600 μL의 EtOAc로 추출하였다. 400 μL의 상부 층을 제거하고, 가열된 질소하에 건조시키고 100 μL의 MeOH/물 (1:1)로 재구성하였다. 10 μL의 유도체화된 샘플을 시마즈 프로미넌스(Shimadzu Prominence) 20A HPLC 시스템 및 더 써모(The Thermo) 콴텀 울트라(Quantum Ultra)™ 삼중 사중극자 질량 분석계로 이루어진 LC-MS 시스템 상에 주입하였다. 분석물을 0.6 mL/분의 유량으로 워터스(Waters) 엑스브릿지(XBridge)™ C18 칼럼 (2.1 x 50 mm, 3.5 μm) 상에서 분리하였다. 이동상 A는 물 중 0.1% 포름산이고 이동상 B는 MeOH이었다. 검출된 αKG 신호는 알려진 αKG 농도를 사용하여 생성된 검량선을 사용하여 분석물 농도로 변환시켰다. 시험된 각각의 화합물에 대해, % 억제는 DMSO 대조군 샘플을 0% 억제로서 사용하고 무효소 대조군을 100% 억제로서 사용하여 계산하였다. IC₅₀ 값은 4-파라미터 방정식을 사용하여 상이한 화합물 농도에서의 개별 % 억제 값으로부터 수득하였다. 이들 계산은 액티버티 베이스 (IDBS) 또는 스크리너 (진데이터) 데이터 분석 프로그램을 사용하여 수행하였다.

이 검정의 결과는, 예시되고 시험된 화합물이 IDH1 R132H 또는 R132C 돌연변이체 효소와 비교하여 IDH1 야생형 효소를 억제하는데 덜 활성이고 IDH2 R140Q 또는 R172K 돌연변이체 효소와 비교하여 IDH2 야생형 효소를 억제하는데 덜 활성임을 입증한다.

표 15에서의 하기 실시예는 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였고, 상기 돌연변이체 효소와 비교하여 상기 야생형 효소를 억제하는데 덜 활성이다.

<표 15>

IDH1 (R132H) 생화학적 점프(Jump) 희석 검정

동결건조된 실시예 화합물을 100% DMSO로 10 mM 또는 100 mM로 재구성하고 시험될 때까지 실온에서 유지하였다. IDH1(R132H)-His 단백질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되고 통상 사용되는 방법에 의해 발현시키고 정제하였다. 검정 시약은 다음을 포함하였다: α-케토글루타르산 (시그마(Sigma) 카탈로그 번호 K1875), MnCl₂ - 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) 카탈로그 번호 M87-100, NADPH - 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 카탈로그 번호 N7505, 트리스-HCl (인비트로겐(Invitrogen), 카탈로그 번호15567-027), NaCl (시그마, S3014), 디티오트레이톨 (시그마, D5545), 및 트리톤™ X100 (피어스(Pierce), 28314). 프로메가로부터의 NAD(P)H-Glo™ 키트 (G9061).

전체에 걸쳐 사용된 검정 완충제는 100 mM 트리스-HCl pH 7.0, 120 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.005% 트리톤™ X-100, 및 2% DMSO (시험 화합물의 첨가로부터)를 함유하였다. 각각의 화합물의 IC₅₀은, 에코(Echo) 555 상에서 제조된, 화합물의 용량 반응을 검정 완충제 중 1.5 nM IDH1(R132H), 1 mM α-케토글루타레이트, 1 mM MnCl₂, 및 15 μM NADPH와 인큐베이션함으로써 결정하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음에, 6-시클로프로필-5-(이소퀴놀린-5-일)-2-[(3R)-4-(3-메톡시프로파노일)-3-메틸피페라진-1-일]피리딘-3-카르보니트릴 (10 μM)을 사용하여 정지하였다. NADPH 농도는 판매 회사가 명시한 바와 같은, NAD(P)H-Glo™ 키트를 사용하여 측정하였다. 발광 신호는 인비젼(Envision) (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 0.1초/발광 거울(Luminescense Mirror)/Lum700 WL400-700 필터) 상에서 판독하였다. 후속 점프 희석 실험에서, 10× IC₅₀에 상당하는 화합물 농도를 100 nM IDH1 (R132H)과 사전-인큐베이션하였다. 화합물의 농도는 항상 효소 농도 이상이다. 실온에서 2시간 후, 이 혼합물을 α-케토글루타레이트 (10 mM), MnCl₂ (10 mM), 및 NADPH (15 μM)를 함유하는 용액으로 1:100으로 희석하였다. 이 최종 효소 반응은 1nM IDH1 (R132H) 및 0.1 × [IC₅₀]을 함유하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션 후, NADPH 농도는 6-시클로프로필-5-(이소퀴놀린-5-일)-2-[(3R)-4-(3-메톡시프로파노일)-3-메틸피페라진-1-일]피리딘-3-카르보니트릴 및 NAD(P)H-Glo™ 키트를 사용하여 상기 명시된 바와 같이 측정하였다. 세 가지 대조군이 포함되었다: 1) 효소 활성을 측정하는 최종 검정에서 1 mM α-케토글루타레이트, 1 mM MnCl₂, 및 15 μM NADPH를 제외하고 사전 인큐베이션 및 효소 검정에서 10×IC₅₀ 화합물을 함유하는 "10× 대조군", 2) 사전 인큐베이션 및 효소 검정 둘 다를 위한 화합물 대신에 DMSO를 함유하는 "최대 활성 대조군(Max Activity Control)", 및 3) 효소 검정에서 0.1×IC₅₀ 화합물 및 사전 인큐베이션에서 화합물 대신에 DMSO를 함유하는 "0.1× 대조군". 효소는 없으나, 그외에는 "최대 활성 대조군"과 동등한 "최소 활성 대조군(Min Activity Control)"을 포함시켰다. 최대 및 최소 활성 대조군의 두 번째 세트는 1 mM α-케토글루타레이트, 1 mM MnCl₂, 및 15 μM NADPH를 사용하여 수행하였다. 각각의 검정 조건을 삼중으로 시험하였으며 최대 활성 대조군 (10 mM) 및 최소 활성 대조군 (10 mM)에 대해 32회 반복실험을 수행하였으며 한편 최대 활성 대조군 (1 mM) 및 최소 활성 대조군 (1 mM)에 대해 16회 반복실험을 수행하였다.

각각의 실험/대조군에서 생성된 NADP (생성물)의 농도는, 15 μM NADPH를 함유하는 최소 활성 대조군 대비 관찰된 신호의 감소율을 사용하여 결정하였다. 최소 활성 대조군 (1 mM 및 10 mM)과 최대 활성 대조군 (1 mM 및 10 mM)을 평균하고 각각에 대해 표준 편차를 계산하였다. 각각의 점프 희석 및 0.1× 대조군에 대한 신호에 15를 곱한 다음에 최소 활성 대조군 (10 mM) 웰의 평균 카운트로 나누었다. 이 숫자를 15에서 빼서 NADP (μM 생성물)를 계산하였다. 동일한 계산을 10× 대조군에 대해 사용하되 최소 활성 대조군 (1 mM)을 사용하였다. 최대 활성 대조군 (1 mM 및 10 mM)에 대한 생성물의 μmol은 평균 카운트에 15를 곱한 다음에 각각의 최소 활성 대조군 (1 mM 및 10 mM)으로 나누어 계산하였다. 각각의 웰에 대한 μM NADP는 평균 최대 활성 대조군 (1 mM 또는 10 mM)으로 나눈 다음에 100을 곱하여 화합물 점프 희석, 10× 대조군, 및 0.1× 대조군에 대한 % IDH 활성을 결정하였다. 통과 화합물은 10× 대조군에 대해 <30% 활성을 나타내야 하며 - 이는 사전-인큐베이션 농도가 화합물로 효소를 포화시키기에 충분하다는 것을 나타내는 것이다. 게다가, 화합물은 0.1× 대조군에 대해 >70-80% 활성을 나타내야 하며 이는 0.1×/희석된 화합물 농도에서 억제가 전혀 없음을 확인해 주는 것이다.

실시예 화합물은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였고 본 검정에서 IDH1/R132H에 대한 % 회복 데이터를 나타냈다. 본 발명의 예시되고 시험된 화합물은 해당 % 회복으로, 희석 2시간 후에 효소를 억제하지 않았던 관련 기술분야의 화합물(들)과는 달리 희석 2시간 후 효소를 억제하였다. 본 검정으로부터의 데이터는 억제제의 희석이 효소 활성의 회복을 결과하지 않기 때문에 본 발명의 시험된 화합물이 돌연변이체 IDH1의 공유적 억제와 일치하는 방식으로 작용함을 입증한다.

IDH1 돌연변이체 억제제에 대한 세포-기반 검정

IDH1 돌연변이체 R132C의 세포 억제를 시험하기 위해, 섬유육종 세포주 HT1080 (ATCC로부터 구매)을 사용하였다. R132H 돌연변이의 세포-기반 억제를 시험하기 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 일상적으로 사용되는 방법에 의해 R132H 돌연변이체 효소를 발현하는 DNA 구조물로 U87 MG 신경교종 세포주 (ATCC)를 안정하게 형질감염시켰다.

HT1080 세포 검정:

화합물 처리 18-24시간 전에 폴리-D-lys로 코팅된 96 웰 플레이트에 만오천개의 세포 (15,000개 세포/웰)를 플레이팅하였다. 화합물 처리 4시간 전에, 정상 배지를 제거하고 무글루타민 배지로 대체함으로써 세포에 글루타민-기아를 유발하였다. 기아 후에, 그 다음에 세포를 0.2%의 최종 농도로 DMSO를 함유하는 무글루타민 배지에 용해시킨 시험 화합물의 상이한 농도 (20 μM 내지 1 nM 또는 0.2 μM 내지 0.01 nM)로 처리하였다. 초기 화합물 인큐베이션은 37℃/5% CO₂에서 1시간이었다. 1시간 후, 글루타민을 최종 2 mM 농도에 첨가한 다음에, 처리된 세포를 37℃/5% CO₂에서 18시간 더 인큐베이션하였다. 상기 18시간 인큐베이션 후에, 세포내 2HG 및 αKG를 세포 용해물에서 분석하였다. 용해물은 배지를 제거하고 25 mM 트리스-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA/1% 트리톤™-X 100을 함유하는 완충제를 세포에 첨가한 후 제조하였다. 분취량의 용해물을 내부 표준으로서의 d₆-αKG와 d₅-3HG의 믹스에 첨가하고 혼합물을 N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 피리딘의 존재하에 O-벤질히드록실아민으로 처리하였다. 그 다음에 분석물 유도체를 EtOAc로 추출하고, 건조시킨 다음에, H₂O 중 50% MeOH로 재구성하였다. 기재된 바와 같이 제조된 샘플을 HPLC에 주입하여 C18 칼럼에서 역상 크로마토그래피를 사용하여 2HG 및 αKG 유도체 (및 상응하는 내부 표준)를 분리하였다. 샘플의 분석은 6460 삼중 사중극자 질량 분석계 (G6460A 애질런트)를 사용하여 수행하였다. 검출된 2HG 및 αKG 신호는 검량선 내에서 외삽된 2HG/d₅-3HG의 비 및 αKG/d₆-αKG의 비를 사용하여 분석물 농도로 변환시켰다. 계산된 2HG 또는 αKG 농도를, 화합물로 세포 처리하는 동안에 글루타민의 존재하에 및 부재하에 수득된 최대 및 최소 기준에 대해 정규화한 후에 각각의 개별 샘플에 대한 퍼센트 억제를 수득하였다. IC₅₀ 값은 S자형 용량-반응 4-파라미터 방정식을 사용하여 개별 % 억제로부터 수득하였다. 이들 계산은 액티버티 베이스 (IDBS) 또는 스크리너 (진데이터) 데이터 분석 프로그램을 사용하여 자동으로 수행하였다.

이 분석의 결과는 표 15에서의 시험된 실시예가 2-히드록시글루타레이트의 생성을 억제함을 입증하며, 이는 이 검정에서 세포에서 돌연변이체 IDH1 R132C의 억제를 나타내는 것이다. 야생형 IDH1에 의해 생성된 대사산물인 αKG는 억제제에 의해 영향을 받지 않으며, 이는 이 검정에서 화합물이 세포에서 야생형 IDH1에 비해 돌연변이체 IDH1에 대해 선택적임을 나타내는 것이다. 하기 실시예에 대한 생성된 IC₅₀ 값을 표 16에 나타냈다. 억제 곡선이 50%에 도달하지 않은 그러한 검정의 경우, 시험된 최고 농도를 나타냈다 (예를 들어 IC50 >20 μM 또는 >0.2 μM).

<표 16>

평균 + 평균의 표준 편차.

U87MG/IDH1R132H 세포 검정

화합물 처리 18-24 시간 전에 폴리-D-lys로 코팅된 96 웰 플레이트에 세포 (12,000개 세포/웰)를 플레이팅하였다. 화합물 처리 4시간 전에, 정상 배지를 제거하고 무글루타민 배지로 대체함으로써 세포에 글루타민-기아를 유발하였다. 기아 후에, 그 다음에 세포를 0.2%의 최종 농도로 DMSO를 함유하는 무글루타민 배지에 용해시킨 시험 화합물의 상이한 농도 (20 μM 내지 1 nM )로 처리하였다. 초기 화합물 인큐베이션은 37℃/5% CO₂에서 1시간이었다. 1시간 후, 글루타민을 최종 2 mM 농도에 첨가한 다음에, 처리된 세포를 37℃/5% CO₂에서 18시간 더 인큐베이션하였다. 세포내 2HG를, 배지를 제거하고 용해 완충제 (25 mM 트리스-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA/1% 트리톤™-X 100)로 처리한 후 수득된 세포 용해물에서 분석하였다. 세포 용해물은 프로세싱할 때까지 -80℃에서 보존하였다. 분석물 추출을 위해, 해동된 용해물의 분취액을 딥 96-웰 플레이트로 옮기고 내부 표준으로서 d₅-3HG를 함유하는 냉 MeOH에 이어서 클로로포름 및 H₂O (1:4:3:2)로 처리하였다. 상부 상을 분리 후 수집하고 HPLC에 주입하여 6460 삼중 사중극자 질량 분석계에서 MS/MS 검출과 연결된 친수성 상호작용 (HILIC) 크로마토그래피를 사용하여 2HG (및 내부 표준)를 분리하였다. 계산된 2HG 농도를, 화합물로 세포 처리하는 동안에 글루타민의 존재하에 및 부재하에 수득된 최대 및 최소 기준으로 정규화한 후에 각각의 개별 샘플에 대한 퍼센트 억제를 수득하였다. IC₅₀ 값은 S자형 용량-반응 4-파라미터 방정식을 사용하여 개별 % 억제로부터 수득하였다. 이들 계산은 액티버티 베이스 (IDBS) 또는 스크리너 (진데이터) 데이터 분석 프로그램을 사용하여 자동으로 수행하였다.

하기 실시예는 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였고, 하기 표 17에 나타낸 바와 같이 본 검정에서 U87 MG 세포에서 돌연변이체 IDH1/R132H에 대한 억제 활성을 나타낸다.

<표 17>

평균 + 평균의 표준 편차.

생체내 2-히드록시글루타레이트 검정

IDH1 억제제의 생체내 시험을 위해, HT1080 세포 (R132C 돌연변이체 IDH1을 갖는 섬유육종) 또는 TB08 세포 (R132H 돌연변이체 IDH1을 갖는 속발성 교모세포종)의 이식 후에 피하 이종이식 종양을 무흉선 누드 마우스 (20-22 g, 할란 레이보러토리즈(Harlan Laboratories))에서 성장시켰다. 마우스에게 급식하고 무제한으로 물을 공급하고 세포 이식 전에 1주 동안 순응시켰다. 종양 세포 (HT1080) 또는 종양 단편 (TB08)을 우측 뒤 옆구리에 이식하였다. HT1080의 경우, 5.0 x 10⁶개 세포를 마트리겔(Matrigel)과 1:1 혼합물로 0.2 ml의 최종 부피로 이식하였다. TB08의 경우, 외식된 종양 샘플로부터 생성된 종양 단편을 뒷쪽 옆구리에 직접 이식하였다. 종양 부피를 캘리퍼스로 주 2회 측정하고 0.536 × L × W² (여기서 L=길이 및 W=너비)를 사용하여 종양 부피를 계산하였다. 종양 부피가 150-400 mm³에 이르렀을 때, 동물을 무작위화하고, 군 (군당 n=3-6)으로 배치하고 IDH1 억제제 또는 비히클 대조군을 투여하였다. IDH1 억제제의 경우, 화합물을 1% 히드록시에틸셀룰로스/0.25% 트윈(Tween)™ 80/0.05% 소포제 또는 1.1 mol 당량의 HCl을 가진 10% 아카시아를 함유하는 비히클에서 제제화하였다. 화합물을 배쓰 초음파처리하여 현탁액을 수득하였다. 화합물은 0.2 ml의 최종 부피로 경구 위관영양을 통해 킬로그램당 밀리그램 (mpk) 기준으로 투여하였다. 2HG의 억제를 결정하기 위해, 화합물을 3일 동안 1일 2회 (BID) 투여하였다 (총 투여수 = 6). 화합물 처리 후, 마우스를 이소플루오란 마취 및 경추 탈구로 안락사시켰다. 종양을 절제하고, 표지된 관에 넣고, 액체 질소로 즉시 동결시켰다. 종양을 프로세싱을 위해 -80℃에서 보관하였다.

종양 용해물의 제조

XY 라이트(Lite) 완충제는 분자 등급의 물에서 제조하였으며 하기 구성성분을 함유하였다: 25 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% 트리톤™ X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. XY 라이트 (40 ml)에, 800 μL의 홀트(Halt) 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (홀트™ 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일, 무-EDTA 써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 카탈로그 번호 78441)을 첨가하였다. 샘플을 볼텍싱한 다음에 얼음 위에서 칠링하였다. 오렌지색 캡 용해-관을 표지하고 얼음 위에 받침대에 배치하였다. 세라믹 절구와 절굿공이를 드라이아이스에 넣어 냉각시켰다. 2 × 2 인치 정사각형의 알루미늄 호일을 절구의 바닥에 배치하였다. 종양 샘플을 상기 호일 정사각형 위에 미리 칠링된 절구로 옮겼다. 액체 질소 (약 5 ml)를 첨가하고 증발시켜, 종양을 과냉각시켰다. 호일의 또 다른 조각을 종양 위에 배치하고 종양은 세라믹 절굿공이로 작은 조각으로 분쇄하였다. 분쇄된 종양을 용해 관으로 신속하게 옮겼다. 빙-냉 XY 라이트 (500 μL)를 각각의 관에 첨가하고 캡핑하였다. 그 다음에 종양을 패스트프렙(FastPrep)-24 엠피 바이오메디칼즈(MP Biomedicals) 상에서 속도 설정 5에서 각각 35초 동안 2회 회전하여 프로세싱하였다. 그 다음에 샘플을 벡크만(Beckman) 마이크로퓨즈(Microfuge) R에서 4℃에서 14,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 미리 칠링된 96 딥 웰 플레이트로 옮겼다. 펠릿은 폐기하였다.

단백질 검정

XY 완충제 (145 μl)를 비-멸균 96 웰 환저 코닝(Corning) 플레이트에 첨가함으로써 단백질 검정 희석 플레이트를 먼저 생성시켰다. 여기에, 종양 용해물 (5 μL)을 첨가하고 부드럽게 혼합하였다. 플레이트는 얼음 위에 유지시켰다. BSA 표준 (써모 사이언티픽 카탈로그 23209 2 mg/mL)의 연속 희석을 다음과 같이 설정하였다: 5개의 0.5 mL 관을 받침대에 배치하고 XY 완충제 (60 μL)를 각각에 첨가하였다. 스톡 BSA (60 μl)를 첫 번째 관에 첨가하고 볼텍싱하였다. 연속 희석이 다음과 같이 완료될 때까지, 첫 번째 관으로부터 60 μl를 그 다음 관으로 옮기고, 볼텍싱 등을 하였다: 관 1= 스톡 BSA, 관 2-5는 1:2 연속 희석액이며, 관 6= XY 완충제 단독이었다. 써모(Thermo) BCA 단백질 검정 시약을 제조업체 지침에 따라 혼합하였다. 혼합된 BCA 시약 (200 μl)을 각각의 샘플에 첨가하고 15분 동안 인큐베이션하였다. 단백질 검정 결과는 소프트맥스 프로(SOFTmax Pro) 플레이트 판독기(Plate Reader) 상에서 판독하였다. 단백질 검정 결과를 기반으로, 적절한 양의 XY 완충제를 각각의 종양 용해물에 첨가하여 5 mg/mL의 최종 단백질 농도를 생성시켰다. 모든 샘플은 표지하여 -80℃에서 보관하였다.

종양 용해물에서의 대사산물 분석

총 2HG 및 αKG의 농도에 미치는 IDH1 억제의 생체내 영향은 종양 이종이식편의 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS) 분석에 의해 결정하였다. 상기 방법은 LC-MS에 의한 분석 전에 O-벤질히드록실아민으로 유도체화를 활용하였다. 10 마이크로리터의 각각의 종양 용해물을 딥-웰 96-웰 플레이트에 배치하고 10 μM d₅-3HG 및 10 μM d6-αKG를 함유하는 100 μL의 내부 표준 용액과 합하였다. 피리딘 완충제 (8.6% 피리딘, pH 5) 중의 50 μL의 1 M O-벤질히드록실아민 및 피리딘 완충제 중의 50 μL의 1 M N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC)를 각각의 샘플에 첨가하였다. 유도체화 반응은 1시간 동안 실온에서 진행되었다. 벡크만 바이오멕(Biomek) FX 액체 취급기를 사용하여 600 μL의 EtOAc를 각각의 샘플에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 5분 동안 볼텍싱한 다음에, 에펜도르프(Eppendorf) 5810R 원심분리기에서 4000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 400 μL의 상부 층을 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다. 샘플을 50℃에서 가열된 질소하에 건조시키고 100 μL의 MeOH/물 (1:1)로 재구성하였다. 1 마이크로리터의 유도체화된 샘플을 시마즈 프로미넌스 20A HPLC 시스템 및 써모 콴텀 울트라™ 삼중 사중극자 질량 분석계로 이루어진 LC-MS 시스템 상에 주입하였다. 분석물을 0.6 mL/분의 유량으로 워터스 엑스브릿지™ C18 칼럼 (2.1 x 50 mm, 3.5 μm) 상에서 분리하였다.

이동상 A는 물 중 0.1% 포름산이고 이동상 B는 MeOH이었다. 구배 프로파일은: 0분, 5% B; 3분, 100% B; 4.00분, 100% B; 4.1분, 5% B; 5.50분, 정지였다. 질량 분석계는 양이온 선택 반응 모니터링 모드에서 작동하는 HESI-II 프로브를 활용하였다. 검량선은 분석물 농도 대 분석물/내부 표준 피크 면적 비를 플로팅하고엑스칼리부르(Xcalibur)™ 소프트웨어로 1/농도 가중치를 사용하는 데이터의 이차차 피팅(quadratic fit)을 수행함으로써 구축하였다. 미지의 분석물 농도는 검량선으로부터 역-계산하였다. LC-MS 검정으로부터의 대사산물 데이터는 nmol/mg 단백질로 표시하였다. 비히클 처리 군의 평균 2HG 수준을 사용하여 0% 억제 대조군을 결정하였다. 그 다음에, 각각의 억제제 처리된 동물에서 비히클 대조군 대비 % 억제를 결정하였다. JMP 소프트웨어에서 데이터를 분석하여 각각의 용량 군에서 평균 % 억제, 표준 편차, 및 표준 오차를 결정하였다.

예시되고 시험된 화합물에 의한 IDH1 돌연변이체 이종이식 마우스에서 2-히드록시글루타레이트의 생체내 억제를 입증하는 데이터를 하기 표 18에 나타냈다.

<표 18>

Claims

하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.

상기 식에서,
R¹은 -CH₂CH(CH₃)₂, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂OCH₃, 또는 -CH₂-시클로프로필이고;
R²는 -CH₃ 또는 -CH₂CH₃이다.
제1항에 있어서,
7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온;
7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온;
1-에틸-7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)프로필]페닐]에틸]아미노]-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온; 또는
1-에틸-7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)프로필]페닐]에틸]아미노]-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온인 화합물
또는 그의 제약상 허용되는 염.
제2항에 있어서, 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-시클로프로필-1-(4-프로프-2-에노일피페라진-1-일)에틸]페닐]에틸]아미노]-1-에틸-4H-피리미도[4,5-d][1,3]옥사진-2-온인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
신경교종, 교모세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 핍지교종, 부신경절종, 섬유육종, 혈관면역모세포성 T 세포 림프종 (AITL), 골수이형성 증후군 (MDS), B 세포 급성 림프모구 백혈병 (B-ALL), 갑상선암, 결장직장암, 급성 골수성 백혈병 (AML), 흑색종, 전립선암, 연골육종 또는 담관암종인 돌연변이체 IDH1 또는 돌연변이체 IDH2를 발현하는 암의 치료를 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염으로부터 제조된 의약.
제4항에 있어서, 돌연변이체 IDH1 또는 돌연변이체 IDH2를 발현하는 암이 섬유육종, 급성 골수성 백혈병, 신경교종, 또는 교모세포종인 의약.
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