KR102275804B1 - 생체-거대분자를 분리하기 위한 흡착 물질 - Google Patents

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Abstract

분자 및 화학물질의 복합체 혼합물로부터 DNA의 단일 경로 추출에서 생체-거대분자의 일-단계 분리를 위한 흡착 물질이 개시된다. 하나의 구현예에서, 흡착 물질은 폴리(아릴 메타크릴레이트), 폴리(아릴 아크릴레이트), 폴리(헤테로아릴 메타크릴레이트), 폴리(헤테로아릴 아크릴레이트) 및 이의 공중합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리머로 적어도 부분적으로 코팅되거나 형성되는 실란화된 물질을 포함한다.

Description

생체-거대분자를 분리하기 위한 흡착 물질{SORBENT MATERIAL FOR SEPARATING BIO-MACROMOLECULES}
DNA는 핵산으로 불리는 분자를 함께 형성하는 뉴클레오티드로 불리는 서브유닛으로 구성되는 음이온성 폴리머이다. DNA는 Friedrich Miescher에 의해 1871년에 최초로 확인되고 분리되었다. DNA의 이중 나선 구조는 James Watson 및 Francis Crick에 의해 1953년에 추론되었다.
천연의 핵염기는 4 개의 서브유닛인 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G) 및 티민(T) 중 하나일 수 있다. 이중 나선의 DNA(dsDNA)는 상이한 뉴클레오티드 염기를 포함하는 두 개의 긴 사슬 뉴클레오티드(예를 들어, AGTCATCGTAGCT)를, 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 당 잔기와 포스페이트가 교대로 나오는 백본과 함께 포함한다. 핵염기는 두 가지 유형: 융합된 5- 및 6-원의 헤테로사이클 화합물인 푸린 A 및 G, 그리고 6-원환 피리미딘인 C 및 T으로 분류된다.
DNA 이중 나선에서, 한 가닥의 핵염기 각각의 유형은 다른 가닥에서 단지 한 유형의 핵염기에만 수소 결합한다. 이는 상보적 염기 접합(pairing)으로 불린다. 여기에서, 푸린은 피리미딘과 수소 결합을 형성하는데, 아데닌은 2 개의 수소 결합을 통해 티민에만 우선적으로 결합하고 시토신은 3 개의 수소 결합에 의해 구아닌과 결합한다. 이러한 이중 가닥의 역평행 구조(dsDNA)는 주로 가닥-내 염기 적층 상호작용에 의해 유지되는데, 이는 G, C 서열에서 가장 강하다. dsDNA 형태의 안정성은 GC-함량(% G, C 염기쌍)뿐 아니라 서열(적층은 서열 특이적이므로) 및 길이(더 긴 분자는 더 안정함)에도 의존한다. 안정성은 다양한 방법으로 측정될 수 있으며; 통상의 방법은 이중 가닥 분자의 50%가 단일 가닥의 분자로 전환되는 온도인 '용융 온도'이다. 용융 온도는 DNA의 농도 및 이온 강도에 의존한다. 결과적으로, DNA의 두 가닥 사이의 결합의 강도를 결정하는 것은 GC 염기쌍의 백분율 및 DNA 이중 나선의 전체 길이 둘 다이다. 높은 GC-함량을 갖는 긴 DNA 나선은 더 강한 상호작용의 가닥을 갖는 한편, 높은 AT 함량을 갖는 짧은 나선은 더 약한 상호작용의 가닥을 갖는다. 상보적 염기쌍 사이의 이러한 가역적이고 특이적인 상호작용은 생명체에서 DNA의 모든 기능에 대단히 중요하다.
DNA 이중 나선의 두 가닥은 서로 반대 방향으로 진행하여(역-평행), 하나의 백본은 3'(3 프라임)이고 다른 것은 5'(5 프라임)으로 5' 말단은 말단 포스페이트 그룹을 갖고 3' 말단은 말단 하이드록실 그룹을 갖는다. 유전 정보를 암호화하는 것은 백본에 따른 이들 4 개 핵염기의 서열로, 이는 단백질 내에서 아미노산의 서열을 특정한다.
모든 종의 DNA 구조는, 각각 34 옹스트롬(3.4 나노미터)의 피치 및 22 옹스트롬(2.2 나노미터)의 직경을 갖고 각각 동일 축 주위를 감는 두 개의 나선형 사슬을 포함한다.
가닥은 서로에 대하여 대칭적으로 위치하지 않으므로, 같지 않은 크기의 두 개 홈이 구조에서 발견될 수 있다. 주된 홈인 하나의 홈은 22Å 폭이고 작은 홈인 다른 것은 12Å 폭이다. 작은 홈의 협소함은 염기의 가장자리가 주된 홈에 더 잘 접근할 수 있음을 의미한다. 결과적으로, 이중-가닥의 DNA에서 특이적 서열에 결합할 수 있는 전사 인자와 같은 단백질은 보통 주된 홈에서 노출된 염기의 측면에 접촉한다.
용액, 현탁액, 조직 추출물 및 고정된 샘플을 포함하는 생물학적 샘플로부터의 신속하고/하거나 자동화된 DNA 분석에 도움을 주기 위해, 저분자량 화합물뿐 아니라 다른 생체-거대분자로부터 DNA의 일-단계 분리를 위한 흡착 물질이 탐색되고 있다. 일부 응용에서, 물질은 DNA 또는 비-DNA 불순물 중 하나의 우선적인 보유를 허용하여-이에 의해 DNA의 정제를 용이하게 할 가능성이 있는 것이 더욱 요망된다.
본 개시의 구현예는 채널을 통한 단일 흐름에서 생체-거대분자의 일-단계 분리를 위한 흡착 물질과 관련된다. 흡착 물질은 폴리(아릴 메타크릴레이트), 폴리(아릴 아크릴레이트), 폴리(헤테로아릴 메타크릴레이트), 폴리(헤테로아릴 아크릴레이트) 및 이의 코폴리머로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리머로 적어도 부분적으로 코팅된 실란화된 무기 물질을 포함한다. 재료의 표면에 별개의 구조를 생성하기 위한 입자 크기, 소수성 및 친수성 모노머 단위의 조합의 사용이 본원에 기술된다. 신규의 코-모노머 단위는 중합 및 표면 고정화 전에 표면 특성을 조정하기 위한 원-포트 해법을 제공한다. 본 개시에 걸쳐 혈액은 단지 실시예 샘플 유형만으로서 사용되고; 조직, 스왑, 객담 및 뇨를 포함하지만 이에 제한되지 않는 이러한 다른 샘플 유형이 사용될 수 있다. 본원에 기술되는 샘플 유형은 본 개시의 사용 범위를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다.
원하는 수행 특성의 적어도 일부를 제공하는 물질 및 방법론은 기공, 다공성 실리콘 나노구조(고체 구조체) 및 경성 형판/멤브레인 생산을 생성하기 위한 벌크 다공성 폴리머, 겔, 전기방사 매트/플러그, 공-압출 폴리머, 전기 방식용 염 또는 가용성 폴리머를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "아릴"은 모든 고리에 걸쳐 완전히 비국재화된 파이-전자 시스템을 갖는 탄소환(모두 탄소) 단환 또는 다환의 방향족 고리 시스템(두 개의 탄소환 고리가 화학적 결합을 공유하는 융합된 고리 시스템을 포함하는)을 말한다. 아릴기에서 탄소 원자의 수는 변화할 수 있다. 예를 들어, 아릴기는 C6-C14 아릴기, C6-C10 아릴기, 또는 C6 아릴기일 수 있다. 아릴기의 예로는 벤젠, 나프탈렌 및 아줄렌을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아릴기는 비치환 또는 치환, 예를 들어 메틸 또는 메톡시로 치환될 수 있고, 더 큰 분자의 다른 일부에 대한 아릴기의 연결은 아릴 고리를 통하거나 치환기를 통할 수 있다. 치환된 아릴기의 예로는 벤질, 하이드록시벤질, 2-페닐에틸, 벤즈히드릴, 트리페닐메틸, 아니솔메틸, 페닐에탄올, 및 나프탈렌메틸이 포함된다.
본원에서 사용되는 "헤테로아릴"은 하나 이상의 헤테로원자(예를 들어, 1, 2 또는 3 헤테로원자), 즉, 질소, 산소 및 황을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 탄소 이외의 원소를 포함하는 단환 또는 다환의 방향족 고리 시스템(완전히 비국재화된 파이-전자 시스템을 갖는 고리 시스템)을 말한다. 헤테로아릴의 고리(들)에서 원자의 수는 변화할 수 있다. 예를 들어, 헤테로아릴기는 고리(들)에서 4 내지 14 개의 원자, 고리(들)에서 5 내지 10 개의 원자 또는 고리(들)에서 5 내지 6 개의 원자를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "헤테로아릴"은 적어도 하나의 아릴 고리 및 적어도 하나의 헤테로아릴 고리, 또는 적어도 2 개의 헤테로아릴 고리와 같은 2 개의 고리가 적어도 하나의 화학적 결합을 공유하는 융합된 고리 시스템을 포함한다. 헤테로아릴 고리의 예로는 푸란, 푸라잔, 티오펜, 벤조티오펜, 프탈라진, 피롤, 옥사졸, 벤족사졸, 1,2,3-옥사디아졸, 1,2,4-옥사디아졸, 티아졸, 1,2,3-티아디아졸, 1,2,4-티아디아졸, 벤조티아졸, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 인돌, 인다졸, 피라졸, 벤조피라졸, 이속사졸, 벤조이속사졸, 이소티아졸, 트리아졸, 벤조트리아졸, 티아디아졸, 테트라졸, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 푸린, 프테리딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 시놀린 및 트리아진을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.　헤테로아릴기는 치환 또는 비치환, 예를 들어 메틸 또는 메톡시로 치환될 수 있고, 더 큰 분자의 다른 일부에 대한 헤테로아릴기의 연결은 헤테로아릴 고리 또는 치환기를 통할 수 있다. 피리딘메틸 및 티오펜-3-일메틸은 치환된 헤테로아릴기의 예이다.
하나의 양태에서, 여기에 제공되는 개시는 생체-거대분자를 분리하기 위한 흡착 물질과 관련된다. 흡착 물질은 폴리(아릴 메타크릴레이트), 폴리(아릴 아크릴레이트), 폴리(헤테로아릴 메타크릴레이트), 폴리(헤테로아릴 아크릴레이트) 및 이의 코폴리머로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리머로 적어도 부분적으로 코팅되거나 형성되는 실란화된 물질을 포함할 수 있다.
하나의 변형에서, 실란화된 무기 물질은 실란화된 실리카 입자, 실란화된 실리카 섬유 및 실란화된 실리카 멤브레인으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
하나의 변형에서, 실란화된 물질은 다공성 유기 물질 및 멤브레인으로 구성되는 군으로부터 선택되는 유기 물질이다.
다른 변형에서, 폴리머는 아니솔메틸 메타크릴레이트, 페닐에탄올 메타크릴레이트, 피리딘메틸 메타크릴레이트 및 나프탈렌메틸 메타크릴레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 반복 단위를 포함한다.
다른 변형에서, 흡착 물질은 약 65° 내지 약 100° 범위의 습윤도(wettability value)를 갖는다.
다른 변형에서, 흡착 물질은 약 0.1 ㎡ 내지 약 130 ㎡ 범위의 표면적을 갖는다.
다른 변형에서, 실란화된 무기 물질은 약 1 nm 내지 약 100 nm 범위의 평균 기공 크기를 갖는 실란화된 실리카 입자를 포함한다.
하나의 구현예에서, 평균 기공 크기는 약 30 nm이다.
다른 변형에서, 실란화된 무기 물질은 약 200 마이크론 미만의 평균 직경을 갖는 실란화된 실리카 입자를 포함한다.
하나의 구현예에서, 평균 직경은 약 15 마이크론이다.
다른 구현예에서는, 물품이 개시된다. 물품은 폴리(아릴 메타크릴레이트), 폴리(아릴 아크릴레이트), 폴리(헤테로아릴 메타크릴레이트), 폴리(헤테로아릴 아크릴레이트) 및 이의 코폴리머로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리머로 적어도 부분적으로 코팅된 실란화된 무기 물질을 포함하는 상기-기술된 흡착 물질을 포함한다.
물품은 미립자, 단일체(monolithic) 또는 멤브레인-유사로부터 선택되는 형태일 수 있다. 평균 틈새 거리(interstitial distance)는 약 10 nm보다 클 수 있다.
하나의 변형에서, 평균 틈새 거리는 약 12 마이크론 미만이다.
다른 변형에서, 물품은 멤브레인의 형태이고 흡착 물질은 다공성 유기 또는 무기 매트릭스에 매립된다.
폴리(벤질 메타크릴레이트)로 적어도 부분적으로 코팅된 실란화된 실리카를 포함하는 흡착 물질을 제조하는 방법이 개시된다. 본 방법은 다음을 포함한다: 트리플루오로톨루엔 중 디메틸비닐클로로실란의 용액에 실리카를 현탁시키고; 액체를 제거하고 새로운 트리플루오로톨루엔 중 디메틸비닐클로로실란의 용액에 실리카를 재현탁시키고; 선택적으로, 액체를 제거하고 새로운 트리플루오로톨루엔 중 디메틸비닐클로로실란의 5% 용액에 실리카를 다시 재현탁시키고; 생성된 실란화된 실리카를 수집하고 건조시키고; 실란화된 실리카, 벤질메타크릴레이트 및 포타슘 퍼옥소디설페이트를 물 중 스테아르산나트륨의 교반 용액으로 첨가하고; 생성된 폴리(벤질 메타크릴레이트)로 코팅된 실란화된 실리카를 포함하는 흡착 물질을 수집하고 건조하는 단계.
또 다른 양태에서, 여기에 제공되는 개시는 생물학적 샘플을 용해시키고 생물학적 샘플로부터 핵산을 분리하기 위한 이중 처리 장치와 관련된다. 본 장치는 샘플 투입 유닛, 샘플 용해 유닛, 핵산 추출 유닛, 및 핵산 수용 유닛을 포함한다. 핵산 추출 유닛은 폴리(아릴 메타크릴레이트), 폴리(아릴 아크릴레이트), 폴리(헤테로아릴 메타크릴레이트), 폴리(헤테로아릴 아크릴레이트) 및 이의 코폴리머로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리머로 적어도 부분적으로 코팅되거나 형성된 실란화된 물질을 포함한다. 실란화된 물질은 생물학적 샘플로부터 단백질 및 다른 비-핵산을 보유하고 핵산이 핵산 수용 유닛으로 통과하는 것을 허용하도록 구성된다.
하나의 변형에서, 샘플 용해 유닛은 생물학적 샘플을 용해시키기 위해 샘플 용해 유닛 내에서 회전하도록 구성되는 칼날(blade)을 포함한다.
하나의 변형에서, 샘플 용해 유닛은 비드(bead)를 포함한다.
하나의 변형에서, 장치는 샘플 용해 유닛에서 칼날의 회전을 제어하도록 구성되는 스프링 장전된 플런저를 추가로 포함한다.
하나의 변형에서, 장치는 생물학적 샘플이 샘플 용해 유닛 및/또는 핵산 추출 유닛에서 처리될 때 이동성 담체로서 작용하도록 구성되는 완충액을 추가로 포함한다.
하나의 변형에서, 핵산 수용 유닛은 캡(cap)을 포함한다.
하나의 변형에서, 캡은 장치로부터 제거될 수 있는 압력 밀봉된 캡이다.
또 다른 양태에서, 여기에 제공되는 개시는 생체-거대분자를 분리하기 위한 흡착 물질과 관련된다. 흡착 물질은 폴리머로 적어도 부분적으로 코팅되거나 형성된 실란화된 물질을 포함하는데, 여기에서 흡착 물질은 약 6 ㎛보다 크고 약 23 ㎛ 미만의 평균 사이 간격, 약 10 nm보다 크고 약 200 nm 미만의 기공 크기, 그리고 약 0.1 ㎡보다 크고 약 150 ㎡ 이하의 표면적을 포함한다.
첨부된 도면에 예시적 목적의 다양한 구현예가 도시되고, 어떠한 방식으로도 이 구현예의 범위를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 또한, 개시되는 상이한 구현예의 다양한 특성은 조합되어 추가의 구현예를 형성할 수 있으며, 이는 본 개시의 일부이다.
도 1은 형광 강도로 결정되는 접촉각의 함수로서 단백질 흡착을 보여준다.
도 2는 알킬 실란에 대한 다양한 노출 시간에서 Si/SiO2 기질에 침착된 나노순수 물 액적에 대한 접촉각의 변화를 보여준다.
도 3은 본 연구로부터 얻어진 전형적인 AFM 이미지를 보여준다. 70°보다 큰 접촉각은 DNA 접착을 방해하고(도 3a), 한편 60° 아래의 값은 물질의 대규모 침착을 야기하는 것으로 보였다(도 3b).
도 4는 표면 습윤성의 함수로서 분획 중 단백질 및 DNA의 정량화를 보여준다.
도 5는 광범위한 폴리머 시스템에서 연구된 벤질메타크릴레이트의 3 유도체로부터 수집된 분획에서 DNA 및 단백질 농도를 보여준다.
도 6은 컬럼의 예를 보여준다. 좌측; 평균 사이 간격/표면이 특정된 기준 밖에 있고 용해물이 컬럼을 바로 통과하는 것이 보이는 예. 우측; 평균 사이 간격/표면적이 부합하고, 용해물이 실질적으로 컬럼을 통과하지 않는 것이 명백한 예.
도 7은 전기 방사 폴리머, 단일체 컬럼 및 단일체 블록으로부터 수집된 용출액으로부터의 PCR 산물의 아가로스 겔 이미지를 보여준다. '+'는 첨가된 게놈 DNA와의 PCR 혼합물이고, '-'는 첨가된 물과의 PCR 혼합물이다. N.b 일부 밴드는 화면 해상도로 인해 부분적으로 보기 어렵다.
도 8은 전기 방사 폴리머, 단일체 컬럼 및 단일체 블록으로부터 수집된 용출액으로부터의 PCR 산물의 아가로스 겔 이미지를 보여준다. '+'는 첨가된 게놈 DNA와의 PCR 혼합물이고, '-'는 첨가된 물과의 PCR 혼합물이다. N.b 일부 밴드는 화면 해상도로 인해 보기 어렵다.
도 9는 넓은 분포의 입자를 나타내는 그래프를 보여준다.
도 10은 비교예를 대표하는 추출 물질에서 넓은 분포의 입자를 나타내는 전자현미경 이미지를 보여준다.
도 11은 기본 다공성 실리콘(좌측), 실란 변형된 다공성 실리콘(중앙), 그리고 벤질 메타크릴레이트로 변형된 다공성 실리콘(우측)을 보여준다.
도 12는 기본 다공성 실리콘의 AFM 분석을 보여준다.
도 13은 벤질 메타크릴레이트로 변형된 다공성 실리콘의 FT-Ir 스펙트럼을 보여준다(3500 - 2000 cm-1 영역).
도 14는 벤질 메타크릴레이트로 변형된 실리카 입자의 FT-Ir 스펙트럼을 보여준다(3500 - 2000 cm-1 영역).
도 15는 폴리 벤질 메타크릴레이트의 전기 방사 섬유의 SEM 이미지를 보여준다. SEM 배율은 180 x(좌측) 및 2.01 kx(우측)이다.
도 16은 벌크 단일체의 SEM 이미지를 보여준다(좌측 패널: SEM 배율은 4.97 kx이고, 우측 패널: SEM 배율은 9.99 kx이다).
도 17은 다공성 단일체의 범위를 나타내는 SEM 분석 결과를 보여준다. 좌측: 벤질 메타크릴레이트 모노머에 구성된 단일체의 SEM 이미지, 중앙: 벤질 메타크릴레이트 및 부틸 메타크릴레이트의 50:50 혼합물의 SEM 이미지, 우측: 부틸 메타크릴레이트에 구성된 단일체의 SEM 이미지.
도 18은 DNA 추출 카세트(DEC) 및 DEC에 의해 생산된 분획을 보여준다.
도 19는 원-위치(in-situ) 형성되어 구조 및 용기 비의존적인 대안의 패킹 내에서의 단일체 제조를 보여준다.
도 20은 생물학적 샘플을 용해시킨 다음 흡착 필터를 통해 용해물을 통과시킬 수 있는 이중 처리 장치의 구현예를 보여준다.
도 21은 연속적 유동 DEC를 사용한 E-coli 추출을 보여준다.
도 22A는 혈액 Q-필터와 대안의 장치(혈액 Q-필터 대 대안의 장치) 사이에서 DNA 농도의 비교 데이터를 보여준다. 도 22B-D는 조직(핀치 생검), 박테리아 플라스미드 및 구강 스왑에서 Q-필터 및 대안의 장치(혈액 Q-필터 대 대안의 장치)로부터의 DNA 수율을 비교하는 데이터를 보여준다.
혈액 용해물에서 유리 DNA는 감수성 분자 분석으로 용이하게 접근 가능하지 않다. 용해된 혈액은 지질, 단백질, 염 및 다른 세포 및 비-세포 물질의 고도의 복합적 혼합물이다. 이 물질의 다수는 핵산(DNA/RNA)의 하향 분석에 억제적이다. 이 복합체 용해 혼합물로부터 핵산의 정제는 분자적 및 비-분자적 기법에 의해 분석을 허용한다. 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응의 생화학은 혈액 용해물에 존재하는 헤모글로빈에 의해 억제된다. 혈액 용해물로부터 DNA의 정제는 헤모글로빈을 제거하고 PCR이 상당히 더 큰 효율로 수행되도록 한다. 일부 응용에서, 물질이 DNA 또는 비-DNA 불순물 중 하나의 우선적인 보유를 허용하고-이에 의해 DNA의 정제를 용이하게 할 것이 더욱 요망된다.
샘플로부터 DNA의 서열 및 생물학을 연구 또는 분석하기 위해서는 임상적 또는 생물학적 샘플의 나머지(즉, 지질, 탄수화물, 단백질 등과 같은 다른 세포 성분)로부터 핵산을 추출 또는 분리하는 것이 보통 필요하다. 이러한 방식으로 DNA의 분리를 달성하기 위한 표준 방법론은 응용 및 샘플 유형에 의존하는 상이한 변형을 갖는 프로토콜로 구성되어, DNA를 방출하기 위한 세포 파쇄 또는 세포 용해로 시작한다. 이는 통상적으로 기계적 용해(액체 질소에서 분쇄 또는 조직 분쇄와 같은), 초음파에 의해, 효소적 또는 화학적으로(샘플에 무질서(chaotropic) 염(예를 들어, 구아니디늄티오시아네이트)을 첨가하는 것과 같은) 달성된다. 세포 지질 멤브레인 및 다른 지질은 보통 세제를 첨가하는 것에 의해 제거되고 단백질은 보통 프로테아제(프로테이나제 K와 같은, 선택적이지만 거의 항상 시행)를 첨가하는 것에 의해 제거된다. 수-포화된 페놀, 클로로포름은 수성 샘플과 용액의 혼합물의 원심분리에 의해 상 분리를 허용하여, 상층의 수성 상을 초래하는 한편, 단백질은 유기상에서 발견된다. 최종 단계에서, RNA는 빙냉 2-프로판올 또는 에탄올 침전에 의해 수성 상으로부터 회수된다. DNA는 구아니디늄티오시아네이트의 부재시 수성 상에 위치할 것이다. DNA는 이들 알콜에 불용성이므로, 침전 및 응집하여 원심분리시 펠릿을 형성할 것이다. 이 단계는 또한 알콜-가용성 염을 제거한다. Mg2 + 및 Ca2 +와 같은 이가 양이온을 격리시키기 위한 킬레이트화제의 첨가는 DNA 분해 효소의 DNA 분해를 방지한다. DNA에 결합한 세포 및 히스톤 단백질은 프로테아제의 첨가에 의하거나 단백질을 아세트산 나트륨 또는 암모늄으로 침전시킨 다음 DNA-침전 전 페놀-클로로포름 혼합물로 추출하는 것에 의해 제거될 수 있다.
다른 방법에서, DNA는 고농도의 무질서 염의 존재 중 이에 결합하는 능력으로 인해 용해물(사용된 용해 방법과 무관하게)로부터 분리된다. DNA는 미세유동 카세트를 갖는 기둥이면 임의의 실리카 표면에, 실리카 코팅된 상자성 비드에, 스핀 컬럼 내의 실리카 필터 또는 다른 실리카 표면에 결합할 수 있다. 무질서 염은 다음에 알콜-기반의 세척으로 제거되고 DNA가 TE 완충액(트리스하이드록시메틸아미노메탄('Tris') 및 에틸렌디아민테트라아세트산('EDTA')으로 구성되는 완충액)과 같은 낮은 이온 강도 용액 또는 물에 용출된다. DNA는 탈수 및 수소 결합 형성으로 인해 실리카에 결합하는데, 이는 약한 정전기 척력에 대하여 경쟁한다. 따라서, 고농도의 염은 실리카로의 DNA 흡착을 도울 것이고 낮은 농도는 DNA를 방출할 것이다. DNA는 실리카 표면에 결합하므로 H2O 또는 TE 완충액 중 하나로 실리카에 결합된 DNA를 용출시키기 전에 나머지 세포 및 다른 파편은 세척 완충액으로 간단히 세척된다.
CHARGESWITCH®(Invitrogen) 방법론은 용해물에서 음으로 하전된 DNA(이의 음으로 하전된 포스페이트 백본을 통해)가 낮은 pH(<6.5)에서 양 전하를 얻는 특정 리간드에 결합하는 것을 참고한다. 단백질 및 다른 불순물은 수성 세척 완충액의 사용을 통해 CHARGESWITCH® - 결합된 핵산으로부터 제거된다. 핵산은 다음에 주위 매질의 pH가 상승하고(>8.5) 양 전하가 중화될 때 CHARGESWITCH® 리간드로부터 방출될 수 있다.
Nexttec DNA 분리 시스템은 세포 용해 다음 4 분 이내에 단일 원심분리 단계로 DNA 정제를 허용한다. 이는 현재 사용되는 다른 DNA 분리 시스템보다 5 배까지빠르다. 이것은 전매 흡착 매트릭스를 통해 가능한데, 이는 실리카 기반의 방법의 전환으로 저해 물질, 예를 들어 단백질 및 저분자량 물질을 보유하고 순수한 DNA를 용해된 샘플 내에서 통과되도록 허용한다. 이 방법의 하나의 제한은 60℃에서 긴 효소적 용해 단계에 의존한다는 것이다.
복합체 혼합물의 분리는 전형적으로 크로마토그래피 방법을 사용하여 수행된다. 여기에서, 액체 및 샘플 혼합물은 흡착제가 충전된 컬럼을 통과하여 샘플 성분의 분리를 유도한다. 컬럼의 활성 성분인 흡착제는 전형적으로 크기 2-50 마이크로미터의 고체 입자(예를 들어, 실리카, 폴리머)로 만들어진 과립 물질이다. 샘플 혼합물의 성분은 이들과 흡착제 입자와의 상호작용의 상이한 정도로 인해 서로 분리된다. 액체는 전형적으로 용매(예를 들어, 물, 완충액, 아세토니트릴 및/또는 메탄올)의 혼합물이고, '이동상'으로 언급된다. 이의 조성 및 온도는 샘플 성분과 흡착제 사이에서 일어나는 상호작용에 영향을 미치는 것에 의해 분리 공정에 중요한 역할을 한다. 이들 상호작용은 성질이 물리적, 예를 들어 소수성(분산적), 쌍극자-쌍극자 및 이온성으로, 종종 조합된다.
컬럼 크로마토그래피에 사용되는 실리카 입자는 전형적으로 테트라하이드록시실란으로부터 형성되는데, 이는 부분적으로 폴리에톡시실록산으로 가수분해되어 점성 액체를 형성하여 에탄올 물 혼합물에서 격렬한 교반을 통해 유화된다. 이러한 교반은 형성된 입자가 구형이 되도록 하고 이들 구는 촉매적으로 유도된 가수분해적 응축을 통해 실리카 하이드로겔로 전환되어('Unger' 방법), 이는 표면 실란올 종을 통해 과도한 가교를 야기한다. 하이드로겔 구는 다음에 가열(건조)되어 크세로겔을 생산한다. 실리카 졸 농도뿐 아니라 pH, 온도, 촉매 및 용매 모두 고도로 다공성인 실리카 크세로겔(때때로 졸-겔로 불림) 물질의 기공 크기 및 입자를 제어하도록 작용한다.
대안의 공정에서는 실리카 미소입자를 사용하는데, 이는 다음에 요소/포름알데히드 시약의 사용으로 용액에서 응집하여 집합된 미소구로 구성되는 입자 - 소위 '실-겔(sil-gel)' 물질을 생산한다. 반응 조건뿐 아니라 미소입자의 직경 및 농도는 생성되는 실-겔 입자의 기공 크기 및 입자 크기를 제어한다.
실리카 구의 입자 크기는 실리카 물질의 효율을 제어하고 실리카 입자의 평균 직경과 관련된다. 배압은 입자 크기에 역으로 비례하고 크로마토그래피 효율은 입자 크기에 역으로 비례한다.
작은 입자(<2 ㎛)는 전형적으로 더 긴 컬럼을 사용하는 고-해상도 분리 또는 더 짧은 컬럼을 사용하는 고-속도 분리를 위해 사용된다. 한편, 5 - 10 ㎛ 입자는 덜 복합체 샘플의 일상적인 분석을 위해, 또는 분석물 용량(부하)이 매우 중요한 예비 크로마토그래피를 위해 사용된다.
크로마토그래피를 위한 실리카 입자는 양호한 분석물 보유를 위해 요구되는 특성인 매우 높은 표면적을 갖는다. 표면적의 대부분은 99%가 넘는 이용 가능 표면적을 갖는 실리카 입자의 내부 기공 구조에 포함된다. 크로마토그래피에 사용되는 실리카를 위한 전형적인 표면적은 대략 330 ㎡/g이고 150 x 4.6 mm 컬럼에 실리카 1.5 g 정도가 존재할 수 있다.
입자의 표면적은 기공 직경에 역으로 비례하고, 따라서 120 nm 기공 직경을 갖는 3 mm 입자는 300 nm 기공 직경을 갖는 3 ㎛ 입자의 2 배가 넘는 표면적을 가질 것이다. 8 - 12 nm 범위의 기공 직경은 전형적으로, 기공으로 용이하게 침투하고 실리카 표면의 대부분에 접근할 수 있는, 작은 분자(<3,000 Da)의 분석에 사용된다. 이들 작은 기공 컬럼은 펩티드 또는 단백질과 같이 더 큰 분자의 분석에는 유용하지 않은데, 이들은 더 큰 유체역학적 용적으로 인해 기공으로부터 배제된다. 전형적으로 기공 직경은 접근 가능하도록 분석물의 유체역학적 직경의 3 배가 될 필요가 있다.
이론적으로, 반 딤터(van Deemter) 방정식(Eqn1)은 분리의 물리적, 운동 및 열역학적 특성과 관련하여 선형 이동상 속도에 대한 분리 컬럼의 단위 길이 당 변동량을 기술하는 데 사용될 수 있다. 여기에서, 컬럼의 분해능은 유동 및 운동 측면에서 기술된다.
Figure 112017025354517-pct00001
여기에서, H는 플레이트 높이, λ는 입자 형상(패킹과 관련하여), dp는 입자 직경, γ, ω, 및 R은 상수, Dm은 이동상의 확산 계수, dc는 모세관 직경, df는 필름 두께, Ds는 고정상의 확산 계수이고 u는 선형 속도이다. 명백하게, 패킹 물질의 입자 크기 감소는 컬럼 효율 및 최적 이동상 선형 속도를 증진시켜, 더 빠른 분석을 허용한다. 그러나, 비록 미소 입자 패킹 물질이 이러한 이점을 제공하지만, 이들은 또한 컬럼에서 압력 손실을 증가시키는 단점을 갖는다. 따라서, 패킹 물질 입자 크기는, 이의 압력의 단점을 완화시키면서 증가된 속도 및 더 높은 분리의 혜택을 이용하도록 최적화되어야 한다.
입자 크기 분포는 고려되어야 할 다른 핵심 변수이다. 입자 크기는 자동화된 서브-시브 정립 기법을 사용하여 실질적으로 제조자에 의해 달성되는 입자 크기의 분포로부터의 평균값으로서 명시된다. 실제로 입자의 넓은 분포는 컬럼 내에서 불균질, 그리고 이와 같이 분석물 분자가 컬럼을 통과할 수 있는 가변적 경로 길이의 증가를 유도할 것이다.
단백질이 대부분의 유기성 및 무기성 표면에 물리적으로 흡착될 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 이와 관련하여, 유기 폴리머의 구조를 조정할 기회는 표면 특성을 조정하기 위한 매우 큰 가능성을 제시한다. 이러한 응용에서, 폴리머는 생물학적 고정화 또는 반발을 위한 차별적 매트릭스로서 작용한다. 추가의 기능성; 중합 후 이용될 수 있는 기능성을 도입하기 위해 모노머 단위를 합성적으로 변형시키는 능력은, 여액-기질 계면 내에서 특이적 역할을 수행하도록 표면에 제시되는 기능성 그룹의 물리적 및 화학적 구조를 조정하기 위한 기회를 제시한다. 추가적으로, 최근에는 나노규모 치수를 갖는 물질의 제작에 주안점이 커지고 있다. 특히, 나노와이어, 나노섬유 및 나노튜브와 같이 고도의 이방성 형태의 폴리머를 생산하기 위한 방법의 강구에 주의가 집중되고 있다.
폴리머의 나노구조는 낮은 차원수를 갖는 이들 물질을 조합하는 잠재적 이점으로 인해 커가는 관심을 끌고 있다. 나노미터 체계의 치수를 갖는 물질은 용이하게 조정 가능한 표면 특성, 높은 기계적 유연성, 많은 무기 재료보다 더 큰 생체적합성 및 높은 표면적과 같이 매우 요망되는 특징을 많이 갖는다. 나노섬유 멤브레인 및 나노섬유 복합체는 드로잉, 경성/연성 형판 합성, 자기-조립 및 전기 방사를 포함하는 많은 방법으로 생산될 수 있다.
형판-유도 성장은 이러한 1-D 나노구조를 제조하기 위해 가장 흔히 사용되는 접근이고 몇 가지 다른 방법이 효과적인 것을 보여주었다. 여기에서는, 원하는 아키텍처로 폴리머의 성장을 유도하도록 외부 '멤브레인'이 사용된다. 두 가지 카테고리; '경성' 또는 '연성' 형판으로 광범위하게 분류될 수 있는 이 과정을 용이하게 하도록 다양한 대안의 물질이 사용되고 있다.
'경성' 형판의 사용은 Martin 등에 의해 개척되었다. 이 방법은 호스트 멤브레인으로서 나노규모 기공의 사용을 수반하고, 1) 멤브레인의 나노규모 기공을 모노머로 충전하고, 2) 기공 내의 모노머를 중합시키고, 그리고 3) 순수 폴리머를 얻기 위해 형판을 제거하는, 비교적 단순화된 3-단계 접근이 이어진다. 생성된 구조의 직경 및 형태학은 이용된 형판의 채널 또는 기공에 의해 결정된다. 최근, 가장 흔히 사용되는 경성-형판은 양극 방식으로 에칭된 기공을 포함하는 알루미나 필름이다(다공성 실리콘이 수성 또는 비-수성 매질에서 결정형 실리콘을 양극 방식으로 에칭하는 것에 의해 생성되고 기공 크기 및 두께는 전류에 의해 결정됨). 이들 멤브레인은 비교적 높은 밀도의 규칙적 육방 격자로 배열된 기공을 갖는 알루미늄 금속으로부터 제조될 수 있다. 다양한 기공 크기가 합성되고 일부 5 nm 정도로 작은 것이 보고되었다.
이 접근법을 사용하여, Martin 그룹은 특히 양극화된 산화알루미늄, 다공성 실리콘 및 트랙-에칭된 폴리카보네이트 멤브레인을 형판으로 사용하여 많은 수의 나노구조의 폴리아닐린(PAni), 폴리피롤(PPy), 폴리(피롤프로필산), 폴리아닐린 및 폴리티오펜(PTh)을 합성하였다. 이 방식으로 나노구조의 폴리머를 생성하기 위한 유일한 전제조건은 기공을 전구체 물질로 적재할 수 있어야 한다는 것이다.
이것은 흥미 있는 모노머 및 사용되는 멤브레인에 따라 난이도를 변화시킬 수 있다. 기공을 적재하기 위해 사용되는 상이한 방법에는 음의 압력, 액체 상 주입, 증기 상 침착 또는 형판을 모노머의 용액으로 침지시키는 것이 포함된다. 후자의 방법은 기공을 통과하는 모노머의 양을 제어함으로써 생산되는 구조의 길이에 대한 양호한 제어를 허용한다. 모노머-충전된 기공의 중합은 화학적 산화제의 첨가에 의해, 또는 더욱 통상적으로, 전기화학적 중합을 통해 달성될 수 있다.
연성-형판 방법은 폴리머 나노구조를 제작하기 위한 비교적 간단한, 저렴하고 강력한 다른 접근법이다. 이 방법은 나노규모 폴리머 물질의 자기-조립을 유도하기 위해 수소 결합, 반데르발스힘, π-π 스태킹, 배위 및 분산력과 같은 비-공유적 상호작용의 선택적 제어를 기반으로 한다. 현재까지, 콜로이드 입자, 올리고머, 비누 거품 및 콜로이드가 모두 와이어, 리본 및 구형 유사 나노구조를 제조하기 위한 연성 형판으로서 실시되었다. 예를 들어, PPy 나노튜브(~94 nm 직경 및 ~2 mm 길이)는 소듐 비스(2-에틸헥실) 설포숙시네이트(AOT) 역 원통형 미셀을 연성-형판으로서 사용하여 합성되었다.
자연에 존재하는 생물고분자와 같은 이미 존재하는 1-D 나노구조는 또한 폴리머 나노와이어의 성장을 유도하기 위한 시드 또는 유용한 연성-형판으로서 작용할 수 있다. 이 방식으로 생산된 폴리머 나노구조는 종종 생물고분자 코어 및 폴리머 피복으로 구성되는 복합체 코어-피복 물질로, 합성-후 형판을 제거할 필요를 없앤다. 다공성 매질에서의 형판과는 대조적으로, 이러한 접근에서는 비교적 최근 계열의 물질인 하이브리드 초분자 폴리머를 수득한다. 대체로 자기-조립되고 고도의 복합체 초분자 구조를 형성하는 능력으로 인해, 생물학적 분자는 많은 탐구된 전략으로 초분자 나노규모 구조의 구성에 사용하기 위한 인상적인 무기를 제공한다.
전기 방사는 폴리머 나노섬유가 형성될 수 있는 대안의 방법을 나타낸다. 여기에서는, 폴리머 용액 또는 용융물의 액체 제트 형성을 유도하기 위해 고전압이 적용된다. 기본적인 전기 방사 설정은 3 가지 주요 성분을 갖는다: 고-전압 동력 공급, 모세관 장치 및 컬렉터 접지. 펌프는 폴리머를 모세관 밖으로 나가도록 하여, 노즐에서 폴리머 액체의 수적을 장전하는 고-전압 전하가 적용된다. 모세관으로부터 흐르는 폴리머로의 높은 전기장의 적용은 표면 전하를 유도하고, 이는 표면 장력이 극복되자마자 컬렉터를 향해 이동하는 얇은 폴리머 제트의 방출을 야기한다. 전화 제트는 신축과 휘핑을 받아 길고 얇은 섬유를 생성한다. 전화 제트가 연속적으로 연장되고 용매가 증발하여, 수백 마이크로미터에서 수십 나노미터로 제트의 직경에서 상당한 감소가 생긴다. 하전 섬유는 부직포 매트 섬유와 같은 컬렉터 플레이트로 침적된다.
전기 방사 공정은 많은 상이한 인자에 의해 영향을 받고, 따라서 이들 인자의 제어는 원하는 치수의 나노섬유의 형성을 가능하게 한다. 전기 방사 공정을 조정하는 것에 의해, 평평한 원통형 섬유에 비드가 삽입되거나 기공이 만들어질 수 있다. 작동 조건 및 폴리머 용액 특성은 생산되는 나노섬유의 많은 특성을 규정한다. 컬렉터를 변경함으로써 무작위 또는 배열된 섬유를 얻도록 선택할 수 있다. 예를 들어, 회전 실린더, 회전 와이어 드럼, 또는 디스크 컬렉터를 사용할 수 있을 것이다.
마이크로유동 채널, 피펫 팁, 진공 플레이트, 스핀 컬럼 등으로 패킹되는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단일 경로 기술로 다른 세포 물질로부터 DNA를 분리하기 위해, 주어진 표면적에서 원하는 기능성 및 특성을 형성 또는 부여하기 위한 폴리머 물질의 사용이 본원에 기술된다. 구체적으로, 본 발명자들은 혈액 용해물과 같은 복합체 생물학적 혼합물의 분리를 제공하기 위해, 잘-정의된 활성 표면적, 소수성 및 친수성 특성, 그리고 적절한 크기의 구성체의 형성 또는 변형으로 별개의 표면 종단을 생성하도록 특징지어진 특정 모노머 단위의 조합을 사용하였다.
요망되는 수행 특성의 적어도 일부는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 벌크 다공성 폴리머, 겔, 전기방사 매트, 공-압출 폴리머, 전기방식용 염, 기공 생성이 가능한 용해 가능한 폴리머, 다공성 실리콘 나노구조 및 적절한 모노머 또는 폴리머 단위로 변형된 경성/연성 형판.
단일체 폴리머는 이들 접근법의 많은 유리한 특징을 조합하고 최근의 화학적 분리법 문헌에 상당한 흥미를 보이고, 특히 이들 자체를 유체 장치에 직접 도입하였다. 단일체 컬럼은 연속적 골격을 형성하는 상호연결 기공을 특징으로 하는 "단일의 큰 입자"를 생성한다. 이러한 대공극 구조는 단일체에 높은 투과성 및 높은 물질 전달을 포함하는 복수의 독특한 특성을 주어, 낮은 압력에서 높은 유속을 허용한다.
다음 기술에서는, 이의 일부를 형성하는 첨부된 도면을 참고한다. 상세한 설명, 도면 및 청구항에 기술된 예시적인 구현예는 제한적인 의미가 되지 않는다. 본원에 제시되는 주제의 범위 또는 정수로부터 벗어나지 않으면서, 다른 구현예가 이용될 수 있고 다른 변경이 이루어질 수 있다. 본원에 일반적으로 기술되고 예시되는 본 개시의 양태는 광범위한 다른 형태로 배열, 치환, 조합, 분리 및 고안될 수 있고, 이들 모두는 명백히 본원으로 고려된다. 상세한 설명 및 실시예에 개시된 모든 데이터 및 이미지는 출원인에 의해 만들어졌다
단백질 흡착
단백질의 물리흡착은 기질과 분자 사이의 정전기적 및 소수성 상호작용과 관련된 많은 인자에 의해 영향을 받는 복잡한 과정이다. 변형된 표면에 대한 단백질의 흡착은 표면의 습윤성에 일반적인 의존성을 나타내는 것을 보여준다. 단백질은 소수성 표면에 우선적으로 흡착한다(높은 접촉각). 리소짐(14.3 kDa, pl 11.4)과 같이 작은 단백질은 소수성 표면에 대하여 약한 흡착을 보인다. 한편 소 혈청 알부민(66.5 kDa, pl 4.7)과 같이 더 큰 단백질은 친수성 표면에 더 흡착한다(낮은 접촉각).
접촉각의 함수로서 단백질 흡착을 조사하기 위해, 본 발명자들은 형광 표지된 단백질(BSA-CF568 및 리소짐-CF568)로 샘플을 스폿팅하였다. 습도 챔버에서 배양한 다음 세척하고, 샘플을 공초점 형광 현미경 하에서 조사하였다. 도 1은 형광 강도로 결정된 접촉각의 함수로서 단백질 흡착을 보여준다. 보이는 결과로부터, 더 높은 접촉각 값(>40)은 대형 및 소형 단백질 둘 다의 표면에 대한 흡착을 초래한다는 결론을 내릴 수 있다.
DNA 반발
운모 및 이산화규소와 같은 Si-O 기능성을 제시하는 표면에 대한 DNA의 흡착은 잘 알려져 있다. 이러한 표면을 적절한 알킬 실란으로 처리하는 것은 소수성 표면 종단을 생성하도록 기질을 변형시킨다. 이러한 처리는 DNA와의 표면 상호작용을 감소시키고, 따라서 DNA 접착에 대한 차별을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
실란화된 이산화규소의 표면 습윤성의 추가적 이해를 얻기 위해, 본 발명자들은 접촉각 및 이에 따라 DNA 접착과 관련하여 다양한 배양 시간에 대한 실리콘 표면의 소수성을 결정하는 데 초점을 두었다. 도 2는 알킬 실란에 대한 다양한 노출 시간에서 Si<111> 기질에 침착된 나노순수 물의 액적에 대한 접촉각의 변화를 보여준다.
명백하게, 접촉각은 초기에 유의미하게 증가한 다음 ~20 초 노출 후 정체 상태를 유지하였다. 데이터는 이들 더 짧은 노출 시간(20-60 초)에서, 표면의 일부만이 변형되는 것으로 고려됨을 보여준다. 더 긴 노출 시간(>60 초)에서, 전체 표면이 변형될 것으로 보인다.
Si/SiO2 표면의 실란화에 이어, 다양한 접촉각에서 피펫 팁을 사용하여 웨이퍼를 가로질러 부분 표본 DNA 용액을 처리하였다. 도 3은 본 연구로부터 얻어진 전형적인 AFM 이미지를 보여준다. 70°보다 큰 접촉각은 DNA 접착을 방해하는 것으로 보이고(도 3a), 한편 60° 아래의 값은 물질의 대규모 침착을 야기한다(도 3b). Si/SiO2는 적어도 일부 구현예에서, 실리카 입자의 표면 특성을 모방하기 위해 사용된 벌크 실리콘 기질의 결정 구조를 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서 더 흔히 Si/SiO2로 언급되는 것은 이산화규소- 실질적으로 실리카와 유사하거나 동일한 표면 종단의 층으로 덮인 실리콘의 층일 수 있다.
습윤성의 함수로서의 생물학적 활성
DNA 흡착을 배제하면서 대형 및 소형 단백질 흡착을 위한 미세 균형 표면을 발견하기 위해, 본 발명자들은 광범위한 모노머 단위 및 이의 조합에서 표면 습윤성 특징의 함수로서의 이들의 수행 특성을 평가하였다. 여기에서는, N-도핑된 Si/SiO2 웨이퍼를 세정하고 각각의 모노머 시스템으로 변형하고 접촉각을 광범위한 샘플에 걸쳐 얻었다. 표 1은 연구된 16 가지 상이한 폴리머 시스템의 결과를 요약한다.
이들 발견에 근거하여, 본 발명자들은 습윤성의 함수로서 각 시스템의 성능 특성 조사를 진행하였다. 이 연구를 위해, 본 발명자들은 직경 ~15 ㎛이고 300 Å 기공을 갖는 실리카겔 입자를 사용하였다. 간단히, DNA 추출 카세트(DEC)-100 mg 흡착제를 유지하도록 고안된-를 화합물 또는 비변형된 실리카로 충전하고 40 ㎕의 혈액 용해물(비드 파쇄를 사용한 기계적 용해로 생성된)로부터, 또는 용해 완충액 단독으로부터 DNA를 정제하기 위해 사용하였다. DNA 추출 카세트는 흡착제 물질을 유지하고 용해된 혈액과 같은 액체를 패킹된 물질을 통해 통과시킬 수 있는 마이크로-치수의 성형 또는 가공된 열가소성 아키텍처일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. DEC의 형태 인자는 사실상 구불구불하고, 두껍고, 얇고, 또한 완전히 통합된 카세트일 수 있다. 기술된 흡착 물질의 기능 및 패킹은 물질을 유지하는 용기와 무관하다. 사실, 스핀-컬럼과 같은 다른 용기 또한, 다른 샘플 매트릭스 중 더러운 물에서 급증한 E. coli 및 혈청으로부터 무 세포 DNA를, 혈액으로부터 DNA-추출을 수행하기 위해 사용되었다. 광범위한 화합물로 패킹된 DEC로부터 분획된 단백질 및 DNA의 정량화. DNA를 100 ㎕/분의 유속을 사용하여 300 ㎕ 분획으로 용출시키고, Qubit 2.0 형광계(Invitrogen)를 사용한 DNA 및 단백질 정량화를 위해 이들 분획의 샘플을 사용하였다. DNA 농도를 또한 실-시간 정량 PCR(RT-qPCR)을 사용하여 결정하였다: 5 ㎕의 분획을 12.5 ㎕ 2x Rotor-Gene SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN), 0.25 ㎕ 100 μM CYP2C9*3f(정방향 프라이머), 0.25 ㎕ 100 μM CYP2C9*3r(역방향 프라이머) 및 탈이온수를 포함하는 RT-qPCR 반응에 첨가하여 25 ㎕의 최종 용적으로 만들었다. 다음 반응 조건을 사용하여 Rotor-Gene Q 사이클러(QIAGEN)를 사용하는 RT-qPCR을 수행하였다: 95℃, 5 분; 95℃, 10 초; 58℃, 20 초; 72℃, 20 초; 최종 3 단계 반복(x44), 50-99℃(용융). 주기 임계(Ct) 값을 알려진 농도의 인간 gDNA 표준품의 것과 비교함으로써 DNA 농도를 다음에 결정하였다.
표 1. 대안의 폴리머 시스템에서의 접촉각
모노머 단위 평균 접촉각
4-비닐페놀, 디비닐벤젠 및 메타크릴산 85.5
4-클로로스티렌, 알릴 알콜 및 디비닐벤젠 94.8
에틸 메타크릴레이트 87.0
에틸 메타크릴레이트 및 스티렌 81.9
에틸 메타크릴레이트, 디비닐벤젠 및 스티렌 93.6
2-하이드록시에틸 메타크릴레이트 57.0
2-하이드록시에틸 메타크릴레이트 및 스티렌 82.9
스티렌 95.3
디비닐벤젠 99.5
푸르푸릴 메타크릴레이트 82.8
사이클로헥실 메타크릴레이트 97.1
벤질 메타크릴레이트 83.5
벤질 메타크릴레이트 및 스티렌 90.7
벤질 메타크릴레이트, 디비닐벤젠 및 스티렌 92.3
2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 디비닐벤젠 및 스티렌 89.0
클로로(디메틸)비닐실란 92.6
도 4는 표면 습윤성의 함수로서 분획 중 단백질 및 DNA의 정량화를 보여준다. 흥미롭게도, 벌크 물질에서 관찰된 경향은 생물학적 성능 데이터에 잘 나타났다. 습윤성이 80°에 접근하면, DNA 농도는 일반적으로 증가하는 것이 관찰된 한편 단백질 농도는 감소하는 것으로 보인다. 현저하게, DNA 및 단백질 농도는 이들의 역반응을 서로 반영하여, 어느 물질이 DEC에 보유되는지의 양호한 지표를 준다. 유의미하게, DNA 접착을 또한 감소시키면서 대형 및 소형 단백질 둘 다의 흡착을 용이하게 하는 80-94° 표면 습윤성의 투명한 윈도가 있다.
구조적 변화의 함수로서의 생물학적 활성
단백질의 물리흡착은 기질과 분자 사이의 정전기적 및 소수성 상호작용과 관련되는 많은 인자에 의해 영향을 받는 복잡한 과정이다. 적절하게 기능화된 모노머 단위를 통한 수소 결합, 반데르발스힘, π-π 스태킹, 배위 및 분산력과 같은 비-공유적 상호작용의 선택적 제어가 주어진 기질에 대한 생물학적 종의 흡착/반발을 선택적으로 유도하는 데 관여할 수 있다.
요망되는 습윤성 범위에서 또는 근처임에도 불구하고 동시에 단백질을 흡착하고 DNA를 반발하는 데 있어서, 상당한 방향족 함량을 포함하는 샘플만이 잘 수행된다. 예를 들어, 4-비닐페놀, 디비닐벤젠 및 메타크릴산은 85.5°의 접촉각을 제시하는데, 이는 최적 윈도 내에 잘 들어온다. 그러나, DNA는 DEC 분획에서 수집된 높은 단백질 함량으로 컬럼 상에 보유되는 것으로 보인다. 한편 [벤질 메타크릴레이트], [벤질 메타크릴레이트 및 스티렌], [벤질 메타크릴레이트, 디비닐벤젠 및 스티렌], [2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 디비닐벤젠 및 스티렌]과 같은 방향족 함유 시스템은 DNA와 단백질 사이의 구별에서 더 양호한 것으로 보인다. 이는 87°의 접촉각, 높은 DNA 함량이지만 또한 높은 단백질 함량을 제공하는 [에틸 메타크릴레이트]에 의해 다시 예시된다. 도 5는 광범위한 폴리머 시스템에서 연구된 벤질메타크릴레이트의 3 유도체로부터 수집된 분획에서 DNA 및 단백질 농도를 보여준다. 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(2HM), 벤질메타크릴레이트(B) 또는 에틸 메타크릴레이트(E)로 변형된 실리카-스티렌(SS)/실리카-스티렌-디비닐벤젠(SSD)의 샘플이 사용되었고 DNA는 다시 혈액 용해물로부터 추출되었다.
여기에서, 컬럼으로부터 얻어진 DNA 농도에서 방향족 치환기의 역할은 명백한데, 모든 벤질 함유 화합물은 잘 수행되는 것을 보여준다. 벤질메타크릴레이트 단독의 직접적 표면 변형은 더 복잡한 시스템과 비슷한 성능을 제공한다. 하나의 구현예에서, 80-90° 사이의 접촉각 및 방향족의 구조적 요구가 동시적 단백질 흡착 및 DNA 반발에 바람직하다.
활성 표면적의 함수로서의 생물학적 활성
폴리머로 실리카를 변형하는 것은 전형적으로 기공을 원하는 물질로 충전시키는 것, 본질적으로 기공 내에 폴리머 브러쉬를 성장시키는 것을 초래한다. 앞서 논의된 바와 같이, 유체역학적 반경은 분석물이 기공에 들어가고 보유되도록 하기에 적절한 크기여야 한다. 이 경우, 본 발명자들은 이것을 활성 표면적으로서 정의하였다. 그러나, 본 발명자들은 시스템의 크기 배제 기전을 설명하기 위해, 활성 표면적이 기공 크기와 입자 사이의 평균 사이 간격으로 더 정확하게 기술되는 것을 인정한다.
폴리머 측면에서 활성 표면적의 효과를 조사하기 위해, 60 Å, 120 Å 또는 300 Å 기공 크기를 연구하였다. DNA는 100 ㎕/분의 유속을 사용하여 300 ㎕ 분획으로 용출시키고, 이들 분획을 앞서 기술한 바와 같이 DNA 및 단백질 정량화를 위해 사용하였다. 각 실험에서 경로 길이를 고정 상태로 유지한 것이 주목되어야 한다.
표 2. 기공 크기 및 관련된 생물학적 기능
기공 크기
60 Å DNA(RT-qPCR)
DNA(Qubit)
단백질		 -
48
412
120 Å DNA(RT-qPCR)
DNA(Qubit)
단백질		 -
122
452
300 Å DNA(RT-qPCR)
DNA(Qubit)
단백질		 65
37
<20
표 2는 활성 표면적을 증가시킴으로써 DNA와 단백질 사이의 구별이 증가하고 DNA 농도 증가와 단백질 함량 감소로 인해 DNA 추출 효율이 개선된 것을 보여준다. 역으로, 표면적이 증가할 때 입자 크기의 기능, 즉 활성 표면적 기여가 감소하여, 본 발명자들은 DNA 농도의 감소를 관찰한다(표 3).
Figure 112017025354517-pct00002
활성 표면적 기여를 증가시키면서 샘플의 전체 표면적을 감소시키는 것에 의해 기공 크기의 역할을 추가로 나타낸다. 표 4는 15 ㎛ 입자에서 300 Å 및 1000 Å 기공 크기에 대한 DNA 추출 성능을 비교한다. 표면적은 각각 108 ㎡/g 및 19 ㎡/g이다. 따라서, 1000 Å에서 활성 표면적의 비율 증가는 동일한 샘플로부터 더 높은 DNA 농도를 초래한다.
Figure 112017025354517-pct00003
활성 표면적이 단백질로부터 DNA의 분리를 가능하게 하는 데 관여하는 한편, 평균 사이 간격 역시 역할을 한다. 여기에서, 입자 크기는 높은 용적의 샘플이 분리가 일어나는 활성 표면적과의 충분한 접촉을 보장하는 역할을 한다. 틈새 거리 또는 평균 틈새 거리는 입자 크기에 비례한다. 이 값이 너무 클 경우, 추출 효율이 감소할 것이다. 따라서, 더 큰 입자는 더 낮은 성능 특징을 나타낸다. 평균 틈새 거리의 역할로부터 활성 표면적의 역할을 분리하기 어려운 반면, 평균 틈새 거리/면적은 추출 장치의 효율을 결정하는 데 있어서 하나의 인자이고 연구된 샘플의 치수에 근거하여 기능 영역이 0.2 - 1.5 ㎛ 및 12 - 24.5 ㎛2가 될 것으로 추정된다.
하향 공정(예를 들어, PCR )에서 구조적 균일성의 효과
앞서 논의된 바와 같이, 크로마토그래피 컬럼에서 명시된 임의의 입자 크기는 실제로, 자동화된 서브-시브 정립 기법을 사용하여 제조자에 의해 실제로 얻어진 입자 크기의 분포로부터의 평균값이다. 사실 입자의 넓은 분포는 컬럼 내에서 불균질을 유도할 것이고, 이는 분석물 분자가 컬럼을 통과하는 가변적 경로 길이에서의 증가를 유도할 수 있다. 이러한 균일성은 시험-간 변동을 감소시키는 핵심이다. 가변적 입자 크기의 효과는 고도의 불균질을 갖는 샘플에 대하여 균일한 크기 분포를 갖는 샘플의 qPCR을 사용하여 분석된 DNA 추출 능력을 비교할 때 명백하다. 표 5는 >55% 크기 분포를 갖는 물질(샘플 A) 및 크기 분포에서 12.5% 변동을 갖는 물질(샘플 B)에 대해 qPCR을 사용하여 분석된 DNA 추출 능력을 보여준다.
Figure 112017025354517-pct00004
결과는 분석물이 추출 장치를 통과하는 경로 길이에서 증가된 변동의 효과를 명백히 보여준다. 아래 기술하는 바와 같이, 흡착 물질 또는 이의 형태 인자와 무관하게 명백한 경향. 이처럼, 균일성은 추출 성능을 정의하는 다른 인자로 고려된다. 표면적 및 활성 표면적은 성능 특징을 정의하는 인자이다. 하나의 구현예에서, 평균 틈새 거리/면적의 기능 영역은 바람직하게는 약 0.2 - 1.5 ㎛ 및 12 - 24.5 ㎛2이다. 따라서, 치수 균일성은 추출 성능을 정의하는 하나의 인자이다.
표면적, 기공 크기 및 평균 사이 간격의 함수로서의 생물학적 활성
기술된 각 구현예의 근본적인 역할을 충분히 예시하기 위해, 흡착 물질을 기술된 변수에 따라 생성하였다. 각 재료의 생물학적 성능은 효과적인 DNA-추출에서 평균 사이 간격, 적절한 폴리머 선택, 기공 크기 및 활성 표면적의 특정 기준을 나타낸다.
효과적인 표면적 정의
실리카 입자
15 ㎛ 표면적 80-120 ㎡/g
평균 기공 크기 300 Å/30 nm
컬럼 중 200 mg 패킹/DEC = 장치에서 16-24 ㎡ 표면적
전기 방사 섬유
섬유의 표면적 = 2πrl
흡착 물질의 표면적 = 2πrl x 섬유의 수
R= SA/2πrl x 섬유의 수
SA = 16 ㎡(더 작은 간격) - 24 ㎡(더 큰 간격)
1% 유효 표면적 추정 = 0.16 ㎡ 즉 실리카 추출물로부터 입자의 기공만
1 cm는 ~50000(200 nm) 섬유 포함 1 cm 길이 사각형을 제공할 것임
R=2.58/섬유의 수 내지 381.9/섬유의 수 = 400 m/200 nm = 2 x 10E9 섬유
Figure 112017025354517-pct00005
= 5/섬유의 수 내지 800/섬유의 수
2.0x109/1.0x105(요구되는 섬유의 수/1 ㎠ 내의 섬유의 수) = 20000 시트의 수 x 200 nm = 4x10-3 m 경로 길이
전기 방사 폴리머
앞서 기술된 방식으로 생산된 벤질 메타크릴레이트 나노섬유(0.2 g)를 5 mL 시린지로 칭량하였다. 수동 압력을 사용하여, 섬유를 2 분 동안 압축하여 계산된 4x10-3 m 경로 길이를 제공하였다. 다음에 샘플을 40 도에서 30 분 동안 가열하고 그 뒤에 서서히 냉각시켰다. 활성화 완충액(700 ㎕)을 시스템을 통해 펌핑한 다음 용해물 80 ㎕를 첨가하였다. 유체를 시스템을 통해 밀어넣고 분석을 위해 용출액을 보유하였다. 도 7은 이 방식으로 제조된 시린지의 전형적인 성능을 보여준다.
적절한 경로 길이가 부합되지 않은(적절한 평균 사이 간격 및 표면적을 제공하기에) 모든 예에서 PCR을 위한 추출은 성공적이 아니었다(도 6 및 7).
단일체 시리즈의 관류 시험을 전-처리된 융합-실리카 모세관 내 및 스핀 컬럼 내, 전-처리된 유리 피펫, 전-처리 없는 유리 바이알 및 플라스틱 시린지에서 실시하였다. 여기에서는, 350 ㎕의 활성화 완충액을 첨가하고 원심분리기에서 1 분 동안 회전시켰다. 회전 속도를 5000 rpm으로 증가시켜 완충액을 용출시켰다. 활성화 완충액을 통과시킨 컬럼에 80 ㎕의 혈액 용해물을 첨가하고; 다음에 이를 5000 rpm에서 1 분 동안 회전시켰다. 용출액을 수집하고 겔 전기영동으로 이들의 생물학적 성분을 분석하였다(도 8).
실시예 요약
실리카(15 ㎛, 300 Å)의 평균 사이 간격을 균일한 패킹으로 추정되는 6.95 ㎛가 되도록 계산하였다. 평균 사이 간격은 또한 두 변수 사이의 비율 및 표면적의 함수이다. 모노머 단위를 고정시키고 표면적을 정의함으로써(위와 같이), 혈액 용해물로부터 DNA를 추출하기 위한 적절한 치수를 갖도록 신규 아키텍처가 형성되었다. 표 6에서 보는 바와 같이, 약 6 ㎛ 아래 또는 약 23 ㎛ 위의 평균 사이 간격을 갖는 실시예는 분석에서 허용 가능한 수준으로 DNA를 정제하는 데 실패한다.
표 6. 시험된 샘플의 치수
평균 사이 간격 실리카 입자
([DNA] ng/mL)		 단일체 컬럼
([DNA] ng/mL)		 전기 방사 매트
([DNA] ng/mL)
23.13 - 35.48 ㎛ 정량화되지 않음 정량화되지 않음 정량화되지 않음
6.25 - 23.13 ㎛ 2017(15 ㎛, 300 Å) 9.95 25.72
0 - 6.25 ㎛ 상업적으로
입수 가능하지 않음		 정량화되지 않음
(벌크 단일체)		 정량화되지 않음
평균 사이 간격에서 계산된 범위는 정확한 실리카 평균 직경값 및 단일체와 전기 방사 물질에서 측정된 값에 근거한다. "정량화되지 않음"은 RT-PCR 실패를 말하는데, 전형적으로 추출 장치로부터 지나치게 낮은 DNA가 얻어지거나 높은 단백질 농도로부터의 너무 많은 PCR 저해에 기인한다.
비교 실시예
입자 분포/기공 반경
넓은 분포의 입자 크기 및 기공 반경(도 9 및 10)은 컬럼 내에서 불균질, 이에 따라 분석물 분자가 컬럼을 통과할 수 있는 가변적 경로 길이에서 증가를 유도할 것이다. DNA-추출 효율은 이러한 경우에 심하게 손상되고 종종 높은 단백질 오염을 초래한다.
표면적
활성 표면적은 DNA-추출 효율에서 상당한 역할을 한다. 앞서 기술한 바와 같이, 본 발명자들은 최적 범위가 적어도 일부 구현예에서 0.1 ㎡ - 150 ㎡ 사이일 것으로 이해한다. 적어도 일부 구현예에서, 각각 명시된 범위 내에 들어오는 기술된 변수의 별개 조합은 혈액 용해물로부터 DNA를 추출하기 위한 흡착 물질의 능력을 결정하는 데 역할을 할 수 있다.
불량하게 추출하는 실리카 기반 물질의 측정된 표면적은 이 범위에 들어온다. 그러나, 앞서 제시된 데이터로부터 명백하듯이, DNA-추출 기전을 제공하는 것은 기공 크기와 관련된 표면적, 폴리머 시스템 및 평균 사이 간격의 특정 조합이다. 일부 시험된 샘플의 표면적이 표 7에 제공된다.
표 7. 시험된 샘플의 표면적
샘플 A 표면적
58.48 ㎡/g (BET 표면적)
80.24 ㎡/g (랭뮤어 표면적)
실시예
다공성 실리콘 웨이퍼의 합성
p-Si(100) 웨이퍼의 정전류양극산화는 다공성 실리콘 층을 형성하였다. 이는 48% 수성 HF 및 에탄올 용액의 1:1 v/v 용액을 함유하는 전지를 사용하여 수행되었다. 전기화학 전지는 PTFE로 구성되고 원형 횡-단면을 가졌다. 실리콘 웨이퍼는 테플론 코팅된 Viton™ O-링을 사용하여 기부까지 밀봉하였다. 상대 전극은 고리로 감긴 텅스텐 와이어로 구성되는데; 이것은 균일한 전류 분포를 제공하였다. 높은 전류 밀도(500 mA ㎠에서 5 분)를 사용하여 다공성 실리콘의 층을 생산하였다. 도 11은 기본 다공성 실리콘(좌측), 실란 변형된 다공성 실리콘(중앙), 그리고 벤질 메타크릴레이트로 변형된 다공성 실리콘(우측)을 보여주고, 도 12는 기본 다공성 실리콘의 AFM 분석을 보여준다.
도 13은 벤질 메타크릴레이트로 변형된 다공성 실리콘의 FT-Ir 스펙트럼을 보여준다(3500 - 2000 cm-1 영역). 폴리머 고정이 진동 및 이에 따른 기능성 그룹의 진동 양식에 미치는 제한적 효과는 스펙트럼에서 명백하였고 더 낮은 파수로 이동한 C-H 진동에 기인하는 많은 밴드를 야기하였다. 벤질 그룹의 방향족 C-H 진동은 명백하고 3066 cm- 1으로부터 ~2950 cm-1로 이동한 것이 관찰되었다. 주 - 2300 cm-1에서 관찰된 강한 밴드는 대기 CO2의 존재에 기인한다.
실리카 입자, 15 마이크론, 300 Å 기공 크기
300 Å 실리카(2.20 g)를 진공 중 200℃에서 3 시간 동안, 다음에 저장 진공 하에 실온에서 밤새 건조하였다. 50 mL 둥근 바닥 플라스크 및 교반기를 오븐에서 밤새 건조하였다.
300 Å 실리카(2.15 g)를 트리플루오로톨루엔(6 mL) 중 디메틸비닐클로로실란의 5% 용액에 현탁시키고 110℃에서 15 분 동안 교반하였다. 혼합물을 실온까지 냉각되도록 하고 교반을 중지하였다. 일단 실리카가 가라앉으면 액체를 피펫으로 제거하고 새로운 트리플루오로톨루엔(6 mL) 중 디메틸비닐클로로실란의 5% 용액으로 교체하였다. 다음에 혼합물을 110℃까지 재가열하고 15 분 동안 교반하였다. 이 방법을 추가로 수행한 다음 실온까지 냉각하고 여과하였다. 실리카를 진공 여과를 통해 수집하고 아세톤(5×10 mL) 및 물(5×10 mL)로 세척하였다. 실리카를 실온에서 30 분 동안 공기-건조한 다음, 120℃까지 온도를 주의하여 올리면서 진공 중 3 시간 동안 건조하여 실리카의 임의의 손실을 회피하였다.
물(10 mL) 중 스테아르산나트륨(140 mg)의 교반 용액으로 실리카(~2 g), 벤질메타크릴레이트(0.53 mL) 및 포타슘 퍼옥소디설페이트(5 mg)를 첨가하였다. 중합은 95℃에서 4 시간 동안 수행하였다. 혼합물을 실온까지 냉각시키고 여과하였다. 생성된 실리카를 DMF(5×10 mL), 에탄올(5×10 mL) 및 물(5×10 mL)로 세척한 다음 30 분 동안 실온에서 공기-건조하였다. 80℃까지 온도를 주의하여 올리고 물로 포화시 트랩을 바꾸면서 실리카를 최종적으로 3 시간 동안 진공에서 건조하였다. 300 Å의 실란화된 실리카-벤질메타크릴레이트(2.21 g)를 백색 고체로서 수득하였다.
도 14는 벤질 메타크릴레이트로 변형된 실리카 입자의 FT-Ir 스펙트럼을 보여준다(3500 - 2000 cm-1 영역). 폴리머 고정이 진동 및 이에 따른 기능성 그룹의 진동 양식에 미치는 제한적 효과는 스펙트럼에서 명백하였고 더 낮은 파수로 이동한 C-H 진동에 기인하는 많은 밴드를 야기하였다. 벤질 그룹의 방향족 C-H 진동은 명백하고 3066 cm-1으로부터 ~2900 cm-1로 이동한 것이 관찰되었다.
실리카 입자 합성의 추가 실시예
300 Å, 15 ㎛( 실란화된 실리카) 중합
물(4.8 mL) 중 스테아르산나트륨(67 mg)의 교반 용액으로 실리카, 모노머 및 포타슘 퍼옥소디설페이트(2.4 mg)를 첨가하였다. 중합은 95℃에서 4 시간 동안 수행하였다. 혼합물을 실온까지 냉각시키고 여과하였다. 생성된 실리카를 DMF(5×5 mL), 에탄올(5×5 mL) 및 물(5×5 mL)로 세척한 다음 30 분 동안 실온에서 공기-건조하였다. 80℃까지 온도를 주의하여 올리고 물로 포화시 트랩을 바꾸면서 실리카를 최종적으로 3 시간 동안 진공에서 건조하였다.
300 Å, 15 ㎛( 실란화된 실리카-스티렌)의 합성
300 Å 실리카(2.20 g)를 진공 중 200℃에서 3 시간 동안, 다음에 저장 진공 하에 실온에서 밤새 건조하였다. 50 mL 둥근 바닥 플라스크 및 교반기를 오븐에서 밤새 건조하였다.
300 Å 실리카(2.15 g)를 트리플루오로톨루엔(6 mL) 중 디메틸비닐클로로실란의 5% 용액에 현탁시키고 110℃에서 15 분 동안 교반하였다. 혼합물을 실온까지 냉각되도록 하고 교반을 중지하였다. 일단 실리카가 가라앉으면 액체를 피펫으로 제거하고 새로운 트리플루오로톨루엔(6 mL) 중 디메틸비닐클로로실란의 5% 용액으로 교체하였다. 다음에 혼합물을 110℃까지 재가열하고 15 분 동안 교반하였다. 이 방법을 추가로 수행한 다음 실온까지 냉각하고 여과하였다. 실리카를 진공 여과를 통해 수집하고 아세톤(5×10 mL) 및 물(5×10 mL)로 세척하였다. 실리카를 실온에서 30 분 동안 공기-건조한 다음, 120℃까지 온도를 주의하여 올리면서 진공 중 3 시간 동안 건조하여 실리카의 임의의 손실을 회피하였다.
물(10 mL) 중 스테아르산나트륨(140 mg)의 교반 용액으로 실리카(~2 g), 스티렌(0.52 mL) 및 포타슘 퍼옥소디설페이트(5 mg)를 첨가하였다. 중합은 95℃에서 4 시간 동안 수행하였다. 혼합물을 실온까지 냉각시키고 여과하였다. 생성된 실리카를 DMF(5×10 mL), 에탄올(5×10 mL) 및 물(5×10 mL)로 세척한 다음 30 분 동안 실온에서 공기-건조하였다. 실리카를 80℃까지 온도를 주의하여 올리고 물로 포화시 트랩을 바꾸면서 최종적으로 3 시간 동안 진공에서 건조하였다. 300 Å의 실란화된 실리카-스티렌(1.68 g)를 백색 고체로서 수득하였다.
300 Å, 15 ㎛ 실란화된 실리카- 디비닐벤젠의 합성
300 Å 실리카(1.20 g)를 진공 중 200℃에서 3 시간 동안, 다음에 저장 진공 하에 실온에서 밤새 건조하였다. 50 mL 둥근 바닥 플라스크 및 교반기를 오븐에서 밤새 건조하였다.
300 Å 실리카(1.15 g)를 트리플루오로톨루엔(3 mL) 중 디메틸비닐클로로실란의 5% 용액에 현탁시키고 110℃에서 15 분 동안 교반하였다. 혼합물을 실온까지 냉각되도록 하고 교반을 중지하였다. 일단 실리카가 가라앉으면 액체를 피펫으로 제거하고 새로운 트리플루오로톨루엔(3 mL) 중 디메틸비닐클로로실란의 5% 용액으로 교체하였다. 다음에 혼합물을 110℃까지 재가열하고 15 분 동안 교반하였다. 이 방법을 추가로 수행한 다음 실온까지 냉각하고 여과하였다. 실리카를 진공 여과를 통해 수집하고 아세톤(5×5 mL) 및 물(5×5 mL)로 세척하였다. 실리카를 실온에서 30 분 동안 공기-건조한 다음, 120℃까지 온도를 주의하여 올리면서 진공 중 3 시간 동안 건조하여 실리카의 임의의 손실을 회피하였다.
물(5 mL) 중 스테아르산나트륨(70 mg)의 교반 용액으로 실리카(~1 g), 디비닐벤젠(0.38 mL) 및 포타슘 퍼옥소디설페이트(2.5 mg)를 첨가하였다. 중합은 95℃에서 4 시간 동안 수행하였다. 혼합물을 실온까지 냉각시키고 여과하였다. 생성된 실리카를 DMF(5×5 mL), 에탄올(5×5 mL) 및 물(5×5 mL)로 세척한 다음 30 분 동안 실온에서 공기-건조하였다. 실리카를 80℃까지 온도를 주의하여 올리고 물로 포화시 트랩을 바꾸면서 최종적으로 3 시간 동안 진공에서 건조하였다. 300 Å의 실란화된 실리카-디비닐벤젠(1.00 g)를 백색 고체로서 수득하였다.
300 Å, 15 ㎛( 실란화된 실리카-2- 하이드록시에틸메타크릴레이트 )의 합성
300 Å 실리카(1.20 g)를 진공 중 200℃에서 3 시간 동안, 다음에 저장 진공 하에 실온에서 밤새 건조하였다. 50 mL 둥근 바닥 플라스크 및 교반기를 오븐에서 밤새 건조하였다.
300 Å 실리카(1.15 g)를 트리플루오로톨루엔(3 mL) 중 디메틸비닐클로로실란의 5% 용액에 현탁시키고 110℃에서 15 분 동안 교반하였다. 혼합물을 실온까지 냉각되도록 하고 교반을 중지하였다. 일단 실리카가 가라앉으면 액체를 피펫으로 제거하고 새로운 트리플루오로톨루엔(3 mL) 중 디메틸비닐클로로실란의 5% 용액으로 교체하였다. 다음에 혼합물을 110℃까지 재가열하고 15 분 동안 교반하였다. 이 방법을 추가로 수행한 다음 실온까지 냉각하고 여과하였다. 실리카를 진공 여과를 통해 수집하고 아세톤(5×5 mL) 및 물(5×5 mL)로 세척하였다. 실리카를 실온에서 30 분 동안 공기-건조한 다음, 120℃까지 온도를 주의하여 올리면서 진공 중 3 시간 동안 건조하여 실리카의 임의의 손실을 회피하였다.
물(5 mL) 중 스테아르산나트륨(70 mg)의 교반 용액으로 실리카(~1 g), 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(0.33 mL) 및 포타슘 퍼옥소디설페이트(2.5 mg)를 첨가하였다. 중합은 95℃에서 4 시간 동안 수행하였다. 혼합물을 실온까지 냉각시키고 여과하였다. 생성된 실리카를 DMF(5×5 mL), 에탄올(5×5 mL) 및 물(5×5 mL)로 세척한 다음 30 분 동안 실온에서 공기-건조하였다. 실리카를 80℃까지 온도를 주의하여 올리고 물로 포화시 트랩을 바꾸면서 최종적으로 3 시간 동안 진공에서 건조하였다. 300 Å의 실란화된 실리카-2-하이드록시에틸메타크릴레이트(1.00 g)를 백색 고체로서 수득하였다.
혼합된 입자 크기
실리카 입자의 혼합물을 먼저 두 가지 별개 뱃치의 재료를, 이에 제한되지 않는 예를 들어, 특정 구현예에서 각각 스티렌 및 2-하이드록시에틸메타크릴레이트 모노머 시스템을 사용하여, 상보적 또는 동일한 폴리머 시스템으로 변형시켜 제조하였다. 원하는 비율의 입자 혼합물은 조성물이 매스 조성의 비율에 의해 조정되도록 하여 추출되는 샘플 유형에 따라 추출 특성을 확인할 수 있다.
실리콘 표면의 변형
실리콘 칩(벌크 및 다공성, 1 ㎠)을 진공 중 200℃에서 3 시간 동안, 다음에 저장 진공 하에 실온에서 밤새 건조하였다. 50 mL 둥근 바닥 플라스크 및 교반기를 오븐에서 밤새 건조하였다.
실리카 칩(1 ㎠)을 트리플루오로톨루엔(12 mL) 중 디메틸비닐클로로실란의 5% 용액에 현탁시키고 110℃에서 15 분 동안 교반하였다. 혼합물을 실온까지 냉각되도록 하고 교반을 중지하였다. 일단 실리카가 가라앉으면 액체를 피펫으로 제거하고 새로운 트리플루오로톨루엔(12 mL) 중 디메틸비닐클로로실란의 5% 용액으로 교체하였다. 다음에 혼합물을 110℃까지 재가열하고 15 분 동안 교반하였다. 이 방법을 추가로 수행한 다음 실온까지 냉각하고 여과하였다. 실리카를 진공 여과를 통해 수집하고 아세톤(5×20 mL) 및 물(5×20 mL)로 세척하였다. 실리카를 실온에서 30 분 동안 공기-건조한 다음, 120℃까지 온도를 주의하여 올리면서 진공 중 3 시간 동안 건조하였다.
물(20 mL) 중 스테아르산나트륨(280 mg)의 교반 용액으로 스티렌(1.04 mL), 디비닐벤젠(128 ㎕), 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(120 ㎕) 및 포타슘 퍼옥소디설페이트(10 mg)를 첨가하였다. 실리카 칩을 용액에 첨가하였다. 중합은 95℃에서 4 시간 동안 수행하였다. 혼합물을 실온까지 냉각시키고 여과하였다. 생성된 실리카를 DMF(5×20 mL), 에탄올(5×20 mL) 및 물(5×20 mL)로 세척한 다음 30 분 동안 실온에서 공기-건조하였다. 실리카를 80℃까지 온도를 주의하여 올리고 물로 포화시 트랩을 바꾸면서 최종적으로 3 시간 동안 진공에서 건조하였다.
전기 방사 매트
폴리비닐알콜( PVA )
10% wt. PVA(mw 89,000-98,000) 용액을 구리 막대에 감은 알루미늄 호일을 향해 펌핑하였다. 바늘과 컬렉터 사이의 거리는 16 cm이고 20 kV의 전압이 적용되었다. 폴리머 용액의 유속은 0.075 mL/시간이었다. 환경 조건: 19% R.H., 20.3℃.
폴리벤질메타크릴레이트(P( BzMA )
THF 용액 중 37.5% wt. P(BzMA)를 구리 막대에 감은 알루미늄 호일을 향해 펌핑하였다. 바늘과 컬렉터 사이의 거리는 10 cm이고 20 kV의 전압이 적용되었다. 폴리머 용액의 유속은 0.05 mL/분이었다. 환경 조건: 21% R.H., 20.6℃. 도 15는 폴리벤질메타크릴레이트(P(BzMA))의 전기 방사 매트의 광학 이미지를 보여준다.
이 예에서 기공 크기는 평균 사이 간격과 비슷한 것으로 고려되는 한편, 표면적은 앞서 보여준 바와 같이 섬유 크기로부터 계산될 수 있다. 활성 표면적의 역할을 평균 틈새 거리의 역할로부터 분리하는 것은 어렵지만, 본 발명자들은 평균 틈새 거리/면적이 추출 장치의 효율을 결정하는 데 하나의 인자가 될 것으로 이해한다. 일반적으로, 평균 틈새 거리는 약 10 nm보다 클 수 있다. 하나의 변형에서, 평균 틈새 거리는 약 12 마이크론 미만이다.
다공성 폴리벤질메타크릴레이트 섬유
17.5% w/w 폴리머/아세톤으로 용액을 제조하고 실온에서 물 중에 밤새 방치하였다. 대안으로서, 호일 상의 2 ㎠ 사각형 섬유 매트를 약산(1 M 에타노산), 에탄올과 물의 50:50 조합, 메탄올과 물의 50:50 조합으로 물 중 40℃에서 처리하였다.
신규 모노머 단위의 합성
아니솔메틸 메타크릴레이트
Figure 112017025354517-pct00006
무수 디클로로메탄(12 mL) 중 메타크릴산(169 mg, 167 ㎕, 1.96 mmol), 3-메톡시벤질 알콜(271 mg, 244 ㎕, 9.16 mmol) 및 4-(디메틸아미노)피리딘(311 mg, 2.55 mmol)의 교반 용액으로 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(0.52 g, 2.75 mmol)를 첨가하고 교반을 밤새 계속하였다. 용액을 포화 수성 NaHCO3(10 mL), 물(10 mL) 및 포화 염수(10 mL)로 세척하고, 건조(MgSO4) 및 농축하여 점성 오일을 얻었다. 이 물질을 Biotage Isolera 자동화된 크로마토그래피 시스템을 사용하여 순상 조건 하(실리카 컬럼, 2→16 % 페트롤 중 디에틸에테르의 구배) 254 nm 검출로 정제하여 아니솔메틸 메타크릴레이트(121 mg, 30 %)를 무색 오일로서 얻었다. Rf 0.33(페트롤 - 디에틸에테르, 92 : 8 v/v).
페닐에탄올 메타크릴레이트
Figure 112017025354517-pct00007
무수 디클로로메탄(5 mL) 중 페닐에탄올(0.50 g, 0.50 mL, 4.09 mmol) 및 트리에틸아민(1.24 g, 1.71 mL, 12.27 mmol)의 교반 용액으로 0℃에서 메타크릴로일 클로라이드(470 mg, 436 ㎕, 4.50 mmol)를 적가하고, 혼합물이 실온까지 가온되는 시간 동안 30 분간 교반을 계속하였다. 물(25 mL)을 첨가하고 혼합물을 디클로로메탄(3×25 mL)으로 추출하였다. 유기층을 모아서 건조(MgSO4) 및 농축하여 황색 오일(0.74 g)을 얻었다. 이 물질을 Biotage Isolera 자동화된 크로마토그래피 시스템을 사용하여 순상 조건 하(실리카 컬럼, 12→100 % 페트롤 중 디에틸에테르의 구배) 254 nm 검출로 정제하여 페닐에탄올 메타크릴레이트((0.80 g, 정량적)를 무색 오일로서 얻었다. Rf 0.61(페트롤 - 디에틸에테르, 3 : 1 v/v).
피리딘메틸 메타크릴레이트
Figure 112017025354517-pct00008
무수 디클로로메탄(23 mL) 중 메타크릴산(0.72 g, 0.71 mL, 8.33 mmol) 및 3-피리딘메탄올(1.00 g, 0.89 mL, 9.16 mmol)의 교반 용액으로 0℃에서 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(2.23 g, 11.66 mmol), 트리에틸아민(1.05 g, 1.45 mL, 10.41 mmol) 및 4-(디메틸아미노)피리딘(102 mg, 0.83 mmol)을 첨가하고, 혼합물이 실온까지 가온되는 시간 동안 밤새 교반을 계속하였다. 용액을 디클로로메탄(50 mL)으로 희석하고 포화 수성 NaHCO3(30 mL), 물(2×30 mL) 및 포화 염수(30 mL)로 세척하고 건조(MgSO4) 및 농축하여 점성의 오일을 얻었다. 이 물질을 Biotage Isolera 자동화된 크로마토그래피 시스템을 사용하여 순상 조건 하(실리카 컬럼, 12→100 % 페트롤 중 에틸아세테이트의 구배) 254 nm 검출로 정제하여 피리딘메틸 메타크릴레이트((1.06 g, 72%)를 무색 오일로서 얻었다. Rf 0.38(페트롤 - 에틸아세테이트, 1 : 1 v/v).
나프탈렌메틸 메타크릴레이트
Figure 112017025354517-pct00009
무수 디클로로메탄(23 mL) 중 메타크릴산(0.72 g, 0.71 mL, 8.33 mmol) 및 1-나프탈렌메탄올(1.45 g, 9.16 mmol)의 교반 용액으로 0℃에서 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(2.23 g, 11.66 mmol), 트리에틸아민(1.05 g, 1.45 mL, 10.41 mmol) 및 4-(디메틸아미노)피리딘(102 mg, 0.83 mmol)을 첨가하고, 혼합물이 실온까지 가온되는 시간 동안 밤새 교반을 계속하였다. 용액을 디클로로메탄(50 mL)으로 희석하고 포화 수성 NaHCO3(30 mL), 물(2×30 mL) 및 포화 염수(30 mL)로 세척하고 건조(MgSO4) 및 농축하여 점성의 오일을 얻었다. 이 물질을 Biotage Isolera 자동화된 크로마토그래피 시스템을 사용하여 순상 조건 하(실리카 컬럼, 2→20 % 페트롤 중 에틸아세테이트의 구배) 254 nm 검출로 정제하여 나프탈렌메틸 메타크릴레이트(1.28 g, 68%)를 무색 오일로서 얻었다. Rf 0.53(페트롤 - 에틸아세테이트, 9:1 v/v).
티오펜-3- 일메틸 메타크릴레이트
Figure 112017025354517-pct00010
무수 메탄올(30 mL) 중 티오펜-3-카복스알데히드(1.00 g, 0.78 mL, 8.92 mmol)의 교반 용액으로 0℃에서 소듐 보로하이드라이드(0.35 g, 9.36 mmol)를 소량씩 첨가하고, 혼합물이 실온까지 가온되는 시간 동안 교반을 2 시간 동안 계속하였다. 용액을 농축하고 에틸아세테이트(25 mL) 및 물(25 mL)을 첨가하였다. 층을 분리시키고 수층을 에틸아세테이트(2×25 mL)로 추출하였다. 유기층을 모아서 물(2×30 mL) 및 포화 염수(25 mL)로 세척하고 건조(MgSO4) 및 농축하여 티오펜-3-일메탄올(1.01 g, 98 %)을 갈색 오일로서 얻었다. 이 물질을 추가 정제 없이 사용하였다.
무수 디클로로메탄(20 mL) 중 티오펜-3-일메탄올(1.01 g, 8.92 mmol) 및 무수 피리딘(2.04 g, 2.08 mL, 25.82 mmol)의 교반 용액으로 0℃에서 메타크릴로일 클로라이드(0.99 g, 0.92 mL, 9.81 mmol)를 적가하고, 혼합물이 실온까지 가온되는 시간 동안 교반을 1 시간 동안 계속하였다. 용액을 물(25 mL)로 희석하고 디클로로메탄(3×25 mL)으로 추출하였다. 유기층을 모아서 0.5 M 염산(25 mL), 물(2×25 mL), 포화 염수(25 mL)로 세척하고 건조(MgSO4) 및 농축하여 갈색 오일을 얻었다. 이 물질을 Biotage Isolera 자동화된 크로마토그래피 시스템을 사용하여 순상 조건 하(실리카 컬럼, 0→100 % 페트롤 중 디클로로메탄의 구배) 254 nm 검출로 정제하여 티오펜-3-일메틸 메타크릴레이트(0.68 g, 44%)를 무색 오일로서 얻었다. Rf 0.53(페트롤 - 디클로로메탄, 2:3 v/v)
벤질 아크릴레이트
Figure 112017025354517-pct00011
무수 디클로로메탄(25 mL) 중 벤질알콜(2.00 g, 18.5 mmol) 및 트리에틸아민(4.67 g, 6.43 mL, 46.3 mmol)의 교반 용액으로 실온에서 아크릴로일클로라이드(1.76 g, 1.58 mL, 19.4 mmol)를 적가하고, 교반을 3 시간 동안 계속하였다. 용액을 물(30 mL)로 희석하고 디클로로메탄(2×30 mL)으로 추출하였다. 유기층을 모아서 포화 염수(30 mL)로 세척하고 건조(MgSO4) 및 농축하여 등색 오일을 얻었다. 이 물질을 Biotage Isolera 자동화된 크로마토그래피 시스템을 사용하여 순상 조건 하(실리카 컬럼, 7→60 % 페트롤 중 에틸아세테이트의 구배) 254 nm 검출로 정제하여 벤질 아크릴레이트(2.02 g, 67%)를 무색 오일로서 얻었다. Rf 0.69(페트롤 - 에틸아세테이트, 7:3 v/v)
2- 하이드록시벤질 메타크릴레이트
Figure 112017025354517-pct00012
무수 디클로로메탄(10 mL) 중 2-하이드록시벤질알콜(1.00 g, 8.06 mmol) 및 피리딘(1.91 g, 1.96 mL, 24.2 mmol)의 교반 용액으로 0℃에서 메타크릴로일클로라이드(0.84 g, 0.78 mL, 8.06 mmol)를 적가하고, 실온까지 가온되도록 교반을 1 시간 동안 계속하였다. 용액을 0.5 M 염산(10 mL), 물(10　mL)로 희석하고 디클로로메탄(3×10 mL)으로 추출하였다. 유기층을 모아서 포화 염수(25 mL)로 세척하고 건조(MgSO4) 및 농축하여 담갈색 오일을 얻었다. 이 물질을 Biotage Isolera 자동화된 크로마토그래피 시스템을 사용하여 순상 조건 하(실리카 컬럼, 15→100 % 페트롤 중 디클로로메탄의 구배) 254 nm 검출로 정제하여 2-하이드록시벤질 메타크릴레이트(381 mg, 25%)를 무색 오일로서 얻었다. Rf 0.36(디클로로메탄 - 페트롤, 6:4 v/v)
2- 페닐에틸메타크릴레이트
Figure 112017025354517-pct00013
무수 디클로로메탄(35 mL) 중 2-페닐에탄올(2.50 g, 20.5 mmol) 및 트리에틸아민(6.20 g, 8.54 mL, 61.4 mmol)의 교반 용액으로 메타크릴로일 클로라이드(2.16 g, 2.00　mL, 20.7 mmol)를 적가하고, 교반을 실온에서 2 시간 동안 계속하였다. 용액을 물(30　mL)로 희석하고 디클로로메탄(3×30 mL)으로 추출하였다. 유기층을 모아서 포화 염수(30 mL)로 세척하고 건조(MgSO4) 및 농축하여 황색 오일을 얻었다. 이 물질을 Biotage Isolera 자동화된 크로마토그래피 시스템을 사용하여 순상 조건 하(실리카 컬럼, 7→42 % 페트롤 중 에틸아세테이트의 구배) 254 nm 검출로 정제하여 2-페닐에틸 메타크릴레이트(3.23 g, 83%)를 황색 오일로서 얻었다.
Rf 0.58(페트롤 - 에틸아세테이트, 7:3 v/v)
벤즈히드릴 메타크릴레이트
Figure 112017025354517-pct00014
무수 디클로로메탄(35 mL) 중 벤즈히드롤(3.77 g, 20.5 mmol) 및 트리에틸아민(6.21 g, 8.55 mL, 61.4　mmol)의 교반 용액으로 메타크릴로일 클로라이드(2.16 g, 2.00　mL, 20.7 mmol)를 적가하고, 교반을 실온에서 2 시간 동안 계속하였다. 용액을 물(30　mL)로 희석하고 디클로로메탄(2×20 mL)으로 추출하였다. 유기층을 모아서 포화 염수(40 mL)로 세척하고 건조(MgSO4) 및 농축하여 등색 오일을 얻었다. 이 물질을 Biotage Isolera 자동화된 크로마토그래피 시스템을 사용하여 순상 조건 하(실리카 컬럼, 7→33 % 페트롤 중 에틸아세테이트의 구배) 254 nm 검출로 정제하여 벤즈히드릴 메타크릴레이트(3.85 g, 75%)를 백색 고체로서 얻었다.
Rf 0.77(페트롤 - 에틸아세테이트, 7:3 v/v)
트리페닐메틸메타크릴레이트
Figure 112017025354517-pct00015
N2 하의 빙욕에서 무수 DME(60 mL) 중 트리페닐메틸 클로라이드(6.11 g, 22.0 mmol) 및 트리에틸아민(11.1 g, 15.3　mL, 110 mmol)의 교반 용액으로 메타크릴산(9.47 g, 9.30 mL, 110 mmol)을 적가하고 교반을 80℃까지 가온하면서 1 시간 동안 계속하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 여액을 포화 수성 NaHCO3(3×40　mL), 포화 염수(30 mL)로 세척하고, 건조(MgSO4) 및 농축하여 크림/백색 고체를 얻었다. 이 고체를 진공으로 실온에서 3 시간 동안 건조하여 트리페닐메틸 메타크릴레이트를 황백색 고체로서 얻었다(6.51　g, 90 %).
R f 0.52 (페트롤 - 에틸아세테이트 9:1 v/v)
2-( 하이드록시메틸 ) 테트라하이드로피란 메타크릴레이트
Figure 112017025354517-pct00016
무수 디클로로메탄(40 mL) 중 2-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란(2.75 g, 2.68 mL, 23.7 mmol) 및 트리에틸아민(7.18 g, 9.9 mL, 71.0 mmol)의 교반 용액으로 메타크릴로일 클로라이드(2.50 g, 2.31 mL, 23.9 mmol)를 적가하고, 교반을 1 시간 동안 계속하였다. 용액을 물(40　mL)로 희석하고 디클로로메탄(3×10 mL)으로 추출하였다. 유기층을 모아서 포화 염수(30 mL)로 세척하고 건조(MgSO4) 및 농축하여 등색 오일을 얻었다. 이 물질을 Biotage Isolera 자동화된 크로마토그래피 시스템을 사용하여 순상 조건 하(실리카 컬럼, 7→54 % 페트롤 중 에틸아세테이트의 구배) 254 nm 검출로 정제하여 2-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란 메타크릴레이트(3.09 g, 71 %)를 무색 오일로서 얻었다. R f 0.66(페트롤 - 에틸아세테이트 7:3 v/v)
다른 가능한 모노머
표 8은 본 개시의 일부 구현예에서 사용될 수 있는 일부 다른 모노머를 수록한다.
표 8. 다른 모노머 단위
모노머 문헌에 제조된 모노머
나프탈렌-1-일메틸 메타크릴레이트 예
테트라하이드로푸란-2-일메틸 메타크릴레이트 예
페닐에탄올 메타크릴레이트 아니오
3-메톡시벤질 메타크릴레이트 아니오
1-페닐에탄올 메타크릴레이트 예
티오펜-3-일메틸 메타크릴레이트 아니오
표 9는 본 개시의 시험된 모노머 일부의 생물학적 특성을 요약한다.
표 9. 생물학적 활성 요약(실리카, 15 ㎛, 300 Å 입자)
화합물 생물학적 시험
스티렌-디비닐벤젠-메타크릴레이트 통과
하이드록시비닐벤젠-디비닐벤젠-메타크릴레이트 실패
클로로비닐벤젠-디비닐벤젠-알릴알콜 실패
스티렌-2-하이드록시에틸메타크릴레이트 통과
2(스티렌)-2-하이드록시에틸메타크릴레이트 실패
실리카-스티렌-2(2-하이드록시에틸메타크릴레이트) 실패
스티렌 통과
디비닐벤젠 실패
2-하이드록시에틸메타크릴레이트 실패
스티렌-디비닐벤젠-2-하이드록시에틸메타크릴레이트 실패
벤질메타크릴레이트 통과
스티렌-벤질메타크릴레이트 통과
스티렌-디비닐벤젠-벤질메타크릴레이트 통과
에틸메타크릴레이트 통과
스티렌-에틸메타크릴레이트 실패
스티렌-디비닐벤젠-에틸메타크릴레이트 실패
사이클로헥실메타크릴레이트 실패
푸르푸릴메타크릴레이트 실패
나프탈렌-1-일메타크릴레이트 통과
테트라하이드로푸란-2-일메타크릴레이트 통과
피리딘-3-일메타크릴레이트 실패
3-메톡시벤질메타크릴레이트 통과
1-페닐에틸메타크릴레이트 통과
티오펜-3-일메틸메타크릴레이트 실패
벤질아크릴레이트 통과
2-하이드록시벤질메타크릴레이트 통과
2-페닐에틸메타크릴레이트 통과
벤즈히드릴메타크릴레이트 통과
2-(하이드록시메틸)테트라하이드로피란 통과
단일체 폴리머
샘플 전-처리
다음 기본적인 과정은, 유리 전-처리가 수행될 수 없는 플라스틱 용기에서 생산된 샘플을 제외하고, 모든 단일체 샘플 제조에 이어진다. 0.1M 수산화나트륨 세척(5 분), 탈-이온수 세척(20 분), 메탄올 세척(5 분), 질소 흐름 하의 건조, 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트(MSMA):메탄올(1:1) 주입, 용기 단부 밀봉, 용기를 35℃ 수욕에 침지(17 시간), 메탄올 세척(13 분), 탈-이온수 세척(13 분), 질소 흐름 하의 건조.
단일체 중합
용기를 예비-조정한 직후 라디칼 중합을 통해 기능화를 위한 중합 반응 혼합물로 채울 수 있다. 모세관 또는 다른 용기로 주입될 모노머, 라디칼 개시제 및 기공생성 용매 시스템으로 구성되는 반응 혼합물을 이와 같이 제조하였다. 모노머 혼합물은 예비혼합되고 다양한 비율의 스티렌(Sty), 부틸메타크릴레이트(But) 및/또는 벤질메타크릴레이트(Bnz)를 디비닐벤젠(DVB) 또는 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트(EDMA) 가교제와 함께 포함하였다. 다음에 활성화제, 비닐벤젠설폰산(VBSA) 및/또는 아조비스이소부티로니트릴(AIBN)을 첨가하였다. 다음에 1 또는 2 기공형성 용매 시스템을 반응 혼합물(사이클로헥산올, 물 및 NMP 또는 1-프로판-1-올, 1,4-부탄디올)에 첨가하였다. 모노머 혼합물을 초음파 처리(15 분/균질화까지)하였다. 다음에 단일체 용기에 모노머 혼합물을 주입하고 단부를 밀봉하였다. 나머지 모노머 혼합물을 유리 바이알로 옮겼다. 용기를 70℃ 수욕에 20 시간 동안 침지시키거나 UV 광으로 15 분 동안 처리하였다. 샘플을 메탄올로 세척(15 분)하였다.
다양한 용기에서 광범위한 기공생성 용매 시스템과 함께 다양한 모노머 구성을 사용하여 일련의 단일체 제제를 제조하였다(표 10 및 도 19). 용기는 두 가지 형태: 샘플 검사 및 분석을 위한 유리 바이알/플라스틱 에펜도르프 관; 그리고 융합-실리카 유리 모세관, DNA 추출 스핀 컬럼 및 다른 1회용 필터 및 유리 피펫과 같은 DNA 추출에 사용하기 위해 고안된 형태를 따른다(수치가 다른 패킹된 컬럼).
표 10. 제조된 단일체의 목록
형식 개시제 방법 모노머 조성 기공생성 시스템 성상 및 무결성
전-처리된
유리 바이알 		AIBN, VBSA
70℃에서 가열		 Bnz : Sty:
DVB		 사이클로헥산올
: NMP : 물		 백색 고체,
불안정
전-처리 없는
유리 바이알 		AIBN, VBSA
70℃에서 가열		 Bnz : Sty:
DVB		 사이클로헥산올
: NMP : 물		 백색 고체,
매우 불안정
폴리프로필렌
에펜도르프 바이알 		AIBN, VBSA
70℃에서 가열		 Bnz : Sty:
DVB		 사이클로헥산올
: NMP : 물		 백색 고체,
특히 불안정
폴리프로필렌
에펜도르프 바이알 		AIBN, VBSA
70℃에서 가열		 Bnz : DVB 사이클로헥산올
: NMP : 물		 백색 고체,
경질 및 밀랍성
스핀 컬럼 AIBN, VBSA
70℃에서 가열		 Bnz : DVB 사이클로헥산올
: NMP : 물		 백색 고체,
불안정
전-처리된
융합-실리카 모세관 		AIBN
70℃에서 가열		 Bnz : DVB 사이클로헥산올
: NMP : 물		 백색 고체,
불안정
전-처리된
유리 피펫 		AIBN
70℃에서 가열		 Bnz : DVB 사이클로헥산올
: NMP : 물		 백색 고체,
불안정
플라스틱
시린지 		AIBN
70℃에서 가열		 Bnz : DVB 사이클로헥산올
: NMP : 물		 백색 고체,
불안정
전-처리 없는
유리 바이알 		AIBN
70℃에서 가열		 Bnz : DVB 사이클로헥산올
: NMP : 물		 백색 고체,
불안정
전-처리 없는
유리 바이알 		AIBN
70℃에서 가열		 Bnz: But:
EDMA		 1-프로판올 :
1,4-부탄디올 : 물		 백색 고체,
불안정
전-처리 없는
유리 바이알 (디스크) 		AIBN
70℃에서 가열		 But: EDMA 1-프로판올 :
1,4-부탄디올 : 물		 백색 고체,
불안정
전-처리 없는
유리 바이알 (디스크) 		AIBN
70℃에서 가열		 Bnz: EDMA 1-프로판올 :
1,4-부탄디올 : 물		 백색 고체,
불안정
전-처리된
융합-실리카 모세관 		AIBN
70℃에서 가열		 But: EDMA 1-프로판올 :
1,4-부탄디올 : 물		 백색 고체,
불안정
전-처리된
융합-실리카 모세관 		AIBN
70℃에서 가열		 Bnz: EDMA 1-프로판올 :
1,4-부탄디올 : 물		 백색 고체,
불안정
스핀 컬럼 AIBN
70℃에서 가열		 But: EDMA 1-프로판올 :
1,4-부탄디올 : 물		 백색 고체,
불안정
스핀 컬럼 AIBN
70℃에서 가열		 Bnz: EDMA 1-프로판올 :
1,4-부탄디올 : 물		 백색 고체,
불안정
스핀 컬럼 AIBN
UV 조사		 Bnz: EDMA 1-프로판올 :
1,4-부탄디올 : 물		 백색 고체,
불안정
스핀 컬럼 AIBN
60℃에서 가열		 Bnz: EDMA 1-프로판올 :
1,4-부탄디올 : 물		 백색 고체,
불안정
알케닐-포함 실란으로 융합-실리카 모세관 및 유리 바이알의 내부 표면을 기능화하는 것은 이 기질로 직접적인 단일체 결합을 허용하는데, 이는 더욱 강력하고 내구성의 단일체를 생산한다.
벤질 메타크릴레이트 모노머로 구성되는 단일체는 미소다공성 구조를 갖고(도 16, 벌크 단일체) 대공성 특성이 결여된 것을 보여준다. 벤질 메타크릴레이트와 부틸 메타크릴레이트의 50:50 혼합은 부틸 메타크릴레이트의 부가로 인해 유의미하게 다공성을 증가시킨다.
SEM 분석은 광범위한 다공성 단일체의 생산을 성공적으로 밝힌다. 벤질 메타크릴레이트 모노머로 구성된 단일체는 미소다공성 구조를 갖는 것을 보여준다(도 17, 좌측). 벤질 메타크릴레이트와 부틸 메타크릴레이트의 50:50 혼합은 부틸 메타크릴레이트의 부가로 인해 유의미하게 다공성을 증가시킨다(도 17, 중앙).
여기에서 단일체는 단일체 컬럼 관통 특징인 대공성 및 미소다공성 특성 둘 다를 보여준다. 부틸 메타크릴레이트만을 포함하는 컬럼은 또한 대공성 및 미소다공성 특성 둘 다를 나타낸다(도 17, 우측). 이들 발견은 원하는 다공성 특징을 달성하기 위해 알킬 메타크릴레이트 성분을 모노머 반응 혼합물로 도입하는 역할을 강조한다. 실리카 입자의 실란 변형과 유사하게, 알킬 메타크릴레이트 성분은 전체 규모 DNA 접착에 대한 구별 및 단백질의 흡착을 위해 적절한 표면 습윤성을 제공한다.
흡착 물질의 분야-내 적용
하나의 실시예에서, DNA 추출 카세트(DEC, 도 18)-흡착 물질을 유지하도록 고안된-가 DNA를 40 ㎕의 혈액 용해물(비드 파쇄를 사용한 기계적 용해에 의해 생성된)로부터, 또는 용해 완충액 단독으로부터 정제하기 위해 사용되었다. 앞서 기술된 작업은 흡착제(표 2-5)로 패킹된 DEC가 DNA를 혈액 용해물로부터 정제할 수 있음을 보여주었다. 도 21은 연속적 유동 DEC를 사용한 E-coli 추출을 보여준다. 이 도면은 저하되는 농도의 E. coli 샘플(세포/mL)로부터 유래되는 도입 용해 물질로부터 생성된 DEC로부터 용출 DNA의 농도(pg/mL)를 100 ㎕ 분획으로 보여준다.
다른 실시예에서, 이 구현예는 생물학적 샘플을 용해시키는 것과 다음에 용해물을 기술된 흡착 필터를 통해 통과시키는 것 둘 다 가능한 이중 처리 장치의 일부를 수행한다. 장치의 예시적 구현예는 도 20에 예시된다. 여기에서, 세포 기질은 장치 내에 포함된 흡착 물질에 결합하는 한편, DNA는 제거되고 분석을 위해 저장될/보내질 수 있는 샘플 수용 장치로 필터를 통해 통과되도록 허용된다. 처리 시간은 5 분 이내로 완료된다.
장치는 압력 밀봉 캡을 갖는 샘플 수용 포트를 이용한다. 샘플은 사용자가 챔버 내에서 칼날을 회전시키고 교반되는 챔버 내에서 칼날 자체 또는 비드 중 하나를 사용하여 샘플을 용해시키도록 허용하는 스프링 장전된 플런저에 의해 제어되는 용해 챔버 내에 놓인다. 샘플 챔버는 또한 추출 단계를 통해 이동성 담체로서 작용하거나, 샘플의 필요에 따라 효소적 또는 화학적으로 용해를 보조하는 완충액을 포함할 수 있다.
동시에, 기계적 용해의 작용은 또한 장치 내에 압력을 만들어낸다. 이러한 압력의 형성은 샘플이 필터를 통해 이동하도록 하는 구동력을 제공하고 용해물이 필터 위에 남고 DNA/RNA/핵산을 포함하는 상등액이 이후 제거 및 저장/분석될 수 있는 샘플 수용 "캡"으로 흐르도록 허용한다.
장치의 추출 부분으로의 용해물의 방출은 두 부분을 회전시켜 압력 방출을 허용하거나, 두 성분 사이에서 밀봉을 별도로 관통시킴으로써 달성될 수 있다.
다른 실시예에서, 스핀 컬럼은 기술된 폴리머로 코팅된 실리카 비드로 패킹된다. 전형적으로, 활성화 완충액이 첨가되고 원심분리기에서 1 분 동안 회전된다. 회전 속도는 완충액을 용출하기 위해 5000 rpm까지 증가된다. 80 ㎕의 혈액 용해물을 활성화 완충액이 통과했던 컬럼에 첨가하고; 다음에 이들을 5000 rpm에서 1 분 동안 회전시켰다. 용출액을 수집하고 겔 전기영동에 의해 생물학적 성분을 분석하였다. 일반적인 스핀 컬럼의 형식 및 각 샘플 유형에 따라 상이한 프로토콜을 가지고 다음 샘플 유형에 따라 DNA 추출이 수행되었다.
달리 표시하지 않는 한 스핀 컬럼을 사용한, 다양한 샘플 유형에서 개시된 DNA 추출 공정(본원에서 'Q-Filter'로 알려진) 데이터의 비교. 도 22A는 혈액 Q-필터와 대안의 장치 사이에서의 DNA 농도의 비교 데이터를 보여준다(혈액 Q-필터 대 대안의 장치). 도 22B-D는 조직(핀치 생검), 박테리아 플라스미드 및 구강 스왑에서 Q-필터 및 대안의 장치로부터의 DNA 수율을 비교하는 데이터를 보여준다(혈액 Q-필터 대 대안의 장치).
본 개시는, 다양한 양태의 예시로 의도되는 본 출원에서 기술되는 특정 구현예의 측면에서 제한되지 않을 것이다. 해당 분야의 당업자에게 명백한 바와 같이, 이의 정수 및 범위로부터 벗어나지 않고 많은 변형 및 변화가 이루어질 수 있다. 본 개시의 범위 내에서 기능적으로 동등한 방법 및 장치는, 본원에 열거된 것에 추가하여 전술한 기술로부터 해당 분야의 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구항의 범위 내에 들어오도록 의도된다. 본 개시는 이러한 청구항에 주어지는 균등물의 전체 범위와 함께, 첨부된 청구항의 용어에 의해서만 제한될 것이다. 본 개시는 물론 변경 가능한 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템으로 제한되지 않음이 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 용어는 특정 구현예를 기술하기 위한 목적만을 위한 것이고, 제한되는 것으로 의도되지 않음이 또한 이해될 것이다.
해당 분야의 당업자는 본원에 개시되는 이들 및 다른 공정 및 방법에서 공정 및 방법에 수행되는 기능이 다른 순서로 시행될 수 있음을 인정할 것이다. 또한, 개설된 단계 및 작업은 단지 실시예로서 제공되는 것이고, 일부의 단계 및 작업은 선택적이고, 개시된 구현예의 정수로부터 벗어나지 않으면서 더 적은 단계 및 작업과 조합되거나, 추가의 단계 및 작업으로 확장될 수 있다.
본원에서 실질적으로 임의의 복수 및/또는 단수 용어의 사용과 관련하여, 해당 분야의 당업자는 문맥 및/또는 응용에 적절하다면 복수를 단수로, 그리고/또는 단수를 복수로 해석할 수 있다. 다양한 단수/복수 순열은 명확성을 위해 본원에서 특별히 제시될 수 있다.
일반적으로 본원에서, 그리고 특히 첨부된 청구항(예를 들어, 첨부된 청구항의 본문)에서 사용되는 용어는 보통 "개방형" 용어로서 의도됨이 해당 분야의 당업자에게 이해될 것이다(예를 들어, 용어 "포함하는"은 "제한되지 않고 포함하는"으로서 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로서 해석되어야 하고, 용어 "포함하다"는 "포함하지만 제한되지 않는다" 등으로서 해석되어야 한다). 도입된 청구항 인용의 특정 숫자가 의도될 경우, 이러한 의도는 명백히 청구항에서 인용될 것이고 이러한 인용의 부재시 이러한 의도는 존재하지 않음이 해당 분야의 당업자에게 또한 이해될 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위해, 다음에 첨부된 청구항은 청구항 인용을 도입하기 위해 도입 구절 "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 사용을 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 구절의 사용은, 동일한 청구항이 도입 구절 "하나 이상" 또는 "적어도 하나" 및 "a" 또는 "an"과 같은 부정 관사를 포함할 때조차도, 부정 관사 "a" 또는 "an"에 의한 청구항 인용의 도입이 이렇게 도입된 청구항 인용을 포함하는 임의의 특정 청구항을 단지 하나의 이러한 인용을 포함하는 구현예로 제한하는 것을 시사하도록 해석되어서는 안되고(예를 들어, "a" 및/또는 "an"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하도록 해석되어야 함); 청구항 인용을 도입하기 위해 사용되는 정관사의 사용에서도 동일하게 유효하다. 또한, 도입된 청구항 인용의 특정 숫자가 명백하게 인용된 경우에도, 해당 분야의 당업자는 이러한 인용이 적어도 인용된 숫자를 의도하는 것으로 해석되어야 할 것임을 인식할 것이다(예를 들어, 다른 수식어 없는 기본 인용인 "2 인용"은 적어도 2 인용, 또는 둘 이상의 인용을 의미함). 더욱이, "A, B, 및 C 등의 적어도 하나"와 유사한 관용어가 사용되는 경우에, 보통 이러한 구성은 해당 분야의 당업자가 관용어를 이해하는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B, 및 C의 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B를 함께, A 및 C를 함께, B 및 C를 함께, 및/또는 A, B, 및 C를 함께 등을 갖는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않을 것임). "A, B, 또는 C 등의 적어도 하나"와 유사한 관용어가 사용되는 경우에, 보통 이러한 구성은 해당 분야의 당업자가 관용어를 이해하는 의미로 의도된다(예를 들어, "A, B, 또는 C의 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B를 함께, A 및 C를 함께, B 및 C를 함께, 및/또는 A, B, 및 C를 함께 등을 갖는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않을 것임). 둘 이상의 대안적인 용어를 제시하는 사실상 임의의 이접적인 단어 및/또는 구절은 상세한 설명, 청구항 또는 도면에서 용어의 하나, 용어의 둘 중 하나, 또는 둘 다의 용어를 포함할 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 함이 해당 분야의 당업자에게 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 구절 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하도록 이해될 것이다.
또한, 본 개시의 특징 또는 양태가 마쿠쉬(Markush) 그룹으로 기술되는 경우, 해당 분야의 당업자는 본 개시가 또한 이에 의해 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 서브그룹으로 기술되는 것을 이해할 것이다.
해당 분야의 당업자에 의해 이해되듯이, 서면으로 된 기술을 제공하는 측면에서와 같이 임의의 모든 목적을 위해, 본원에 개시되는 모든 범위는 또한 임의의 모든 가능한 서브 범위 및 이의 서브 범위의 조합을 포함한다. 임의의 수록된 범위는 충분히 서술적이고 동일한 범위가 적어도 동일한 절반, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 나누어질 수 있는 것으로 용이하게 인식될 수 있다. 비-제한적 예로서, 본원에서 논의되는 각각의 범위는 3분의 1 아래, 3분의 1 중간, 3분의 1 위 등으로 용이하게 나누어질 수 있다. 해당 분야의 당업자에 의해 또한 이해되듯이, "까지", "적어도" 등과 같은 모든 언어는 인용된 수를 포함하고 위에 논의된 것과 같이 차후에 서브 범위로 나누어질 수 있는 범위를 말한다. 최종적으로, 해당 분야의 당업자에 의해 이해되듯이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어 1-3 세포를 갖는 그룹은 1, 2, 또는 3 세포를 갖는 그룹을 말한다. 유사하게, 1-5 세포를 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4, 또는 5 세포를 갖는 그룹 등을 말한다.
전술한 바로부터, 본 개시의 다양한 구현예가 예시의 목적으로 본원에 기술되고, 본 개시의 범위 및 정수로부터 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 인정될 것이다. 따라서, 본원에 개시되는 다양한 구현예는 다음의 청구항에 의해 지시되는 진정한 범위 및 정수와 함께 제한적인 것으로 의도되지 않는다.

Claims (22)

  1. 단백질 및 기타 비-핵산을 보유할 수 있으나 핵산을 보유하지 않는, 생체-거대분자를 분리하기 위한 흡착 물질로서,
    상기 흡착 물질은
    폴리(아릴 메타크릴레이트), 폴리(아릴 아크릴레이트), 폴리(헤테로아릴 메타크릴레이트), 및 폴리(헤테로아릴 아크릴레이트)로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리머로 형성되거나 상기 폴리머로 적어도 부분적으로 코팅된 실란화된 물질
    을 포함하는, 흡착 물질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 실란화된 물질은 실란화된 실리카 입자, 실란화된 실리카 섬유 및 실란화된 실리카 단일체 멤브레인 또는 구조((monolithic membrane or structure)로 구성되는 군으로부터 선택되는 무기 물질인, 흡착 물질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 실란화된 물질은 다공성 유기 물질 및 멤브레인으로 구성되는 군으로부터 선택되는 유기 물질인, 흡착 물질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리머는 벤질 메타크릴레이트, 아니솔메틸 메타크릴레이트, 페닐에탄올 메타크릴레이트, 피리딘메틸 메타크릴레이트 및 나프탈렌메틸 메타크릴레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 반복 단위를 포함하는, 흡착 물질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 흡착 물질은 65° 내지 100° 범위의 습윤도(wettability value)를 갖는 것인, 흡착 물질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 흡착 물질은 0.1㎡ 내지 130㎡ 범위의 표면적을 갖는 것인, 흡착 물질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 실란화된 물질은 1nm 내지 100nm 범위의 평균 기공 크기를 갖는 실란화된 실리카 입자를 포함하는, 흡착 물질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 평균 기공 크기는 30nm인, 흡착 물질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 실란화된 물질은 200 마이크론 미만의 평균 직경을 갖는 실란화된 실리카 입자를 포함하는, 흡착 물질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 평균 직경은 15 마이크론인, 흡착 물질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 흡착 물질을 포함하는 물품으로서,
    상기 물품은 미립자, 단일체(monolithic) 또는 멤브레인-유사체로부터 선택되는 형태이고, 흡착 물질의 평균 사이 간격이 10nm보다 큰 것인, 물품.
  12. 제11항에 있어서, 상기 평균 사이 간격이 12 마이크론 미만인, 물품.
  13. 제12항에 있어서, 상기 물품은 멤브레인의 형태이고, 상기 흡착 물질은 다공성 유기 또는 무기 매트릭스에 매립되는, 물품.
  14. 트리플루오로톨루엔 중 디메틸비닐클로로실란 용액에 실리카를 현탁시키는 단계;
    액체를 제거하고 새로운 트리플루오로톨루엔 중 디메틸비닐클로로실란 용액에 실리카를 재현탁시키는 단계;
    선택적으로, 액체를 제거하고 새로운 트리플루오로톨루엔 중 디메틸비닐클로로실란 5% 용액에 실리카를 다시 재현탁시키는 단계;
    생성된 실란화된 실리카를 수집하여 건조시키는 단계;
    실란화된 실리카, 벤질메타크릴레이트 및 포타슘 퍼옥소디설페이트를 물 중 스테아르산나트륨 교반 용액에 첨가하는 단계; 및
    생성된 폴리(벤질 메타크릴레이트)로 코팅된 실란화된 실리카를 포함하는 흡착 물질을 수집하고 건조하는 단계
    를 포함하는,
    폴리(벤질 메타크릴레이트)로 적어도 부분적으로 코팅된 실란화된 실리카를 포함하는, 단백질 및 기타 비-핵산을 보유할 수 있으나 핵산을 보유하지 않는 흡착 물질의 제조 방법.
  15. 생체-거대분자를 분리하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 흡착 물질로서,
    상기 흡착 물질은
    폴리(아릴 메타크릴레이트), 폴리(아릴 아크릴레이트), 폴리(헤테로아릴 메타크릴레이트), 및 폴리(헤테로아릴 아크릴레이트)로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리머로 형성되거나 상기 폴리머로 적어도 부분적으로 코팅된 실란화된 물질
    을 포함하고,
    상기 흡착 물질은 6㎛ 초과 내지 23㎛ 미만의 평균 사이 간격, 10nm 초과 내지 200nm 미만의 기공 크기, 및 0.1㎡ 초과 내지 150㎡ 이하의 표면적을 갖는,
    흡착 물질.
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