KR102274829B1 - 선퇴추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 선퇴추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 내지 신경세포 보호용 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 선퇴추출물은 Nurr1 단백체의 활성을 증가시켜 신경 영양 인자 내지 도파민을 증폭시키며, 신경세포 사멸 내지 신경 염증을 억제하여 신경세포 보호 효과를 가짐으로써 파킨슨병 등의 퇴행성 뇌질환으로 인한 행동장애를 개선시킬 수 있으며, 더 나아가 도파민 저하로 인한 집중력 저하, ADHD, 정신분열증, 우울증 내지 조울증의 개선효과도 기대할 수 있다.

Description

선퇴추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing, improving or treating degenerative brain diseases comprising Cicadidae Periostracum extract}

본 발명은 선퇴추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 내지 신경세포 보호용 조성물에 대한 것이다.

파킨슨병(Parkinson’s disease, PD)은 발병 원인이 완전히 밝혀지지 않은 특발성 퇴행성 뇌질환(idiopathic brain degenerative disease)이다. 이 질환은 65 세 이상으로 전 세계 인구의 1-2 %에 영향을 미치는데, 급속하게 노령화 사회로 진입하는 현대의 대표적인 퇴행성 운동장애 뇌질환으로서 그 환자의 수도 급격하게 증가 추세에 있다. 대표적 증상으로 떨림(tremor), 강직(rigidity) 및 운동느림증(bradykinesis) 등이 있는데, 병리학적인 소견으로는 뇌 흑색질(substantia nigra pars compacta, SNpc) 또는 선조체(striatum, ST)에서 도파민 신경세포(dopaminergic neuron)가 소실되어 80% 이상의 도파민의 농도가 감소된 도파민 결핍 증상이 나타나고, 이로서 운동회로 조절의 이상으로 행동학적 이상이 나타난다. 또한, PD 환자에서는 루이체(Lewy body)라고 불리는 세포질 내 침전물(cytoplasmic inclusion) 형성이 관찰되고 이의 주 구성단백질은 알파시누클레인(alpha-synuclein)으로 보고되고 있다. 이러한 사실에 근거하여 파킨슨병에서 알파시누클레인이 중요한 역할을 할 것으로 추정하고 있다. 또한, 산화적 스트레스(oxidative stress)와 미토콘드리아 기능부전(mitochondria dysfunction)도 PD 발병 기작에 관련이 있을 것으로 추정되고 있다. 하지만, 주요 병변인 도파민 신경세포의 사멸 및 집적체의 형성을 제어하여 PD의 증상 및 진행을 치료할 수 있는 치료제는 전무하기 때문에 신규 질환 타겟의 발굴이 필요한 실정이다.

핵 수용체 관련 1 단백질(nuclear receptor related 1 protein, Nurr1)은 뇌의 도파민성 체계의 발달, 유지 또는 생존에 중요한 역할을 한다. 특히, Nurr1은 도파민 합성, 저장 및 재흡수를 통제하는 유전자의 전사를 조절함으로써 도파민 항상성을 유지하는데 근본적인 역할을 한다. 또한 신경 영양 인자(neurotrophic factors), 항 염증 반응 및 산화 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애 관리를 암호화하는 유전자의 전사를 자극하고 전 염증 유전자의 전사 및 발현을 억제함으로써 도파민성 뉴런의 생존을 조절한다. 이 유전자의 돌연변이는 PD, 정신 분열증 또는 조울증을 비롯한 도파민성 기능 장애와 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 선퇴(Cicadidae Periostracum)는 참매미 또는 말매미의 허물을 의미하며, '선태'라고도 한다. 선퇴는 구부러진 타원형으로 매미와 비슷한 모양이고 길이 약 3.5cm, 지름이 약 2cm이며, 바깥면은 황백색 내지 황갈색으로 반투명이고 광택이 있으며, 냄새는 거의 없고 맛은 덤덤하다. 한방에서는 옛날부터 해열제, 진통제로 사용되어 왔으며, 날개와 다리를 제거한 선퇴 5 마리를 분쇄하여 하루 3번 끼니 뒤에 먹어 간질에 사용되기도 한다. 또한, 감기로 인한 발열, 만성 해소 천식, 인후염, 파상풍, 가려움증, 안질, 종창 또는 두드러기 등의 치료에도 사용된다.

대한민국 특허출원 제10-2005-0056188호는 선퇴추출물 또는 이로부터 분리된 아세틸도파민계 화합물을 포함하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 조성물에 대한 것으로서, 선퇴추출물 또는 이로부터 분리된 신규한 아세틸도파민계 화합물은 저밀도 지질단백질에 대한 항산화 활성이 우수하므로 저밀도 지질단백질의 산화에 의해 유발되는 고지혈증 또는 동맥경화와 같은 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 효과적임을 개시하고 있다.

그러나, 선퇴추출물의 퇴행성 뇌질환에 대한 효과, 특히 Nurr1 단백질과 관련된 효과에 대한 연구 내지 기재는 개시된 바 없다.

이에 본 발명자들은 자연 천연물에서 유래하는 자원을 이용하여 부작용이 적으면서도 파킨슨병 등 퇴행성 뇌질환에 효과적인 조성물은 제공하고자 예의 노력한 결과, 선퇴추출물은 Nurr1 단백체의 활성을 증가시킴으로서 궁극적으로 퇴행성 뇌질환으로 인한 행동장애를 개선시키는 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 선퇴추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 내지 신경세포 보호용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 선퇴(Cicadidae Periostracum) 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 내지 신경세포 보호용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 선퇴추출물은 물, 유기용매 및 무기용매로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 용매로 하여 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 추출물은 감압고온 추출, 열탕 추출, 환류 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온 추출, 초음파 추출 및 증기 추출방법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 추출방법으로 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 퇴행성 뇌질환은 Nurr1 단백체의 기능 장애로 인해 발생하는 질환인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 Nurr1 단백체의 기능 장애로 인해 발생하는 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 루게릭병, 헌팅턴병, 전측두엽 치매, 피질-기저핵 퇴행증, 진행성 핵상마비, 집중력 저하, ADHD, 정신분열증, 우울증 및 조울증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 신경세포는 뇌 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 미세아교세포(microglia), 희소돌기아교세포(oligodendroglia), 뇌실막세포(ependymal cell), 슈반세포(Schwann's cell) 및 신경절교세포(capsular cell) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 조성물은 신경세포의 사멸 또는 신경 염증을 억제하는 효과를 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 조성물은 식품 조성물, 의약품 조성물 또는 의약외품 조성물인 것일 수 있다.

본 발명의 선퇴추출물은 Nurr1 단백체의 활성을 증가시켜 신경 영양 인자 내지 도파민을 증폭시키며, 신경세포 사멸 내지 신경 염증을 억제하여 신경세포 보호 효과를 가짐으로써 파킨슨병 등의 퇴행성 뇌질환으로 인한 행동장애를 개선시킬 수 있으며, 더 나아가 도파민 저하로 인한 집중력 저하, ADHD, 정신분열증, 우울증 내지 조울증의 개선효과도 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명의 선퇴추출물의 효능을 개략적으로 나타낸다. 본 발명의 선퇴추출물은 Nurr1 단백체의 활성을 증대시켜 GDNF를 비롯한 신경영양인자(neurotrophic factor)의 양을 증가시키며, 신경세포사멸 및 신경염증을 억제시킬 수 있고, 도파민의 양을 증대시켜 결과적으로 파킨슨병 등 퇴행성 뇌질환의 행동장애를 개선시킬 수 있다.
도 2는 선퇴추출물(CP)의 퇴행성 뇌질환 동물 모델에 대한 효과를 확인하기 위한 동물 실험의 설계를 나타낸다.
도 3은 선퇴추출물(CP)의 MPTP 퇴행성 뇌질환 동물 모델에 대한 효과를 나타낸다. 선퇴추출물이 MPTP로 유발된 퇴행성 뇌질환 동물 모델의 행동장애를 개선시킨 것을 확인할 수 있었다.
도 4는 MPTP-유도 도파민 신경 세포 사멸에 대한 선퇴추출물(CP)의 효과를 나타낸다. (A)는 SNpc에서 TH-면역 양성 도파민성 뉴런의 수를 나타내고, (B)는 ST의 광학 밀도(TH-양성 도파민성 섬유 밀도)를 나타낸다. (C)는 ST에서 도파민의 수준을 나타내고, (D)는 무 세포 시스템에서 MAO-B 억제율을 나타낸다. (E)는 SNpc 및 ST의 현미경 사진을 나타낸다. 값은 평균±S.E.M.로 표시된다. 대조군과 비교하여 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001 및 MPTP-처리군 또는 대조군과 비교하여 #p<0.05, ##p<0.01 및 ###p<0.001.
도 5는 선퇴추출물(CP)의 신경세포에 대한 효과를 확인하기 위한 세포 실험의 설계를 나타낸다.
도 6은 PC12 및 분화된 PC12 세포 뉴런 손상에 대한 선퇴추출물(CP)의 효과를 나타낸다. CP가 100 ㎍/㎖ 이상인 경우 세포독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
도 7은 분화된 PC12 세포(C), 마우스 SNpc(D) 및 선퇴추출물(CP) 및 ERK 억제제(SCH772984)로 전처리한 분화된 PC12 세포에서 Nurr1 및 이의 조절 단백질인 신경 영양 인자들을 웨스턴 블롯팅에 의해 측정한 결과를 나타낸다. 막대 그래프는 (C-E)에 대한 Nurr1 (F), TH (G), DDC (H), DAT (I) 및 VMAT2 (J)의 상대적인 표현을 나타낸다. 값은 평균±S.E.M.로 표시된다. *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001은 대조군과 비교하였고, #p<0.05 및 ##p<0.01은 CP 처리군과 비교하였다.
도 8은 MPTP로 유발된 Nurr1 조절 신경 영양 인자에 대한 선퇴추출물(CP)의 효과를 나타낸다. 도파민성 뉴런에서 IHC 및 SNpc 에서 웨스턴 블롯팅으로 Nurr1 수준을 측정 하였다. (C)는 SNpc의 대표적인 현미경 사진을 나타낸다.
도 9는 Nurr1, TH, DDC, DAT 및 VMAT2의 발현은 SNpc (D)에서 특정 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출되었다. 막대 그래프는 (D)에 대한 Nurr1 (A), TH (E), DDC (F), DAT (G) 및 VMAT2 (H)의 상대적인 표현을 나타낸다. Nurr1 (I), TH (J), DAT (K) 및 VMAT2 (L)의 mRNA 발현에 대한 선퇴추출물(CP)의 효과를 보기 위해 실시간 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸다. 더욱이, Nurr1 siRNA-형질 감염된 분화 된 PC12 세포 (M)에서 신경 조절 인자(TH, DAT 및 VMAT2)를 상향 조절하는 Nurr1의 효과를 나타낸다. 표시된 값은 평균±S.E.M.을 나타낸다. *p<0.05 및 ***p<0.001은 대조군과 비교하였고, #p<0.05, ##p<0.01 및 ###p<0.001은 MPTP 처리군과 비교하였다.
도 10은 MPTP-유도 미토콘드리아-매개 세포 자멸사에 대한 선퇴추출물(CP)의 효과를 나타낸다. (A)는 미토콘드리아-유도 세포자멸사 인자인 Bcl-2, Bax, Cyt-c, 절단된 카스파제-3, 절단된 카스파제-9 및 PARP1를 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과를 나타낸다. 분화된 PC12 세포를 CP로 처리하고 48 시간 동안 MPP +에 노출시킨 후 미토콘드리아 막 전위의 형광의 적색, 녹색(B) 및 비율(C)을 대조군에 대한 백분율로 표현하였다.
도 11은 MPTP-유도 생존 관련 GDNF 신호 전달 인자에 대한 선퇴추출물(CP)의 효과를 나타낸다. GFNF 및 Ret는 웨스턴 블롯팅(D) 및 ELISA 키트(E)에 의해 측정되었다. 값은 평균±S.E.M.로 표시된다. 대조군과 비교하여 ***p<0.001 및 MPP+ 또는 MPTP- 처리된 군과 비교하여 #p<0.05 또는 ### p<0.001.
도 12는 MPTP-유도된 신경 염증 신호 전달 인자에 대한 선퇴추출물(CP)의 효과를 나타낸다. 웨스턴 블롯팅 또는 IHC(A 및 B)에 의해 신경 아교 활성화 단백질(GFAP 및 Iba-1) 및 신경 염증 신호 전달 인자(iNOS 및 Cox-2)를 측정 하였다. 신경 염증 신호 전달 인자의 수준은 β-액틴(C-F)으로 정규화되었다. (G)는 SNpc의 대표적인 현미경 사진을 나타낸다.
도 13은 (I) 내지 (M)은 어레이의 밀도계 비를 나타내며, 사이토카인 마커(ICAM-1, KC, IL-6, MCP-5 및 RANTES)에서 차이를 나타냈다. (N)은 신경 교양 활성화 마커(GFAP 및 Iba-1) 및 신경 염증 신호 전달 인자(iNOS 및 Cox-2)를 웨스턴 블롯팅(N)을 사용하여 측정한 결과를 나타낸다. 막대 그래프는(N)에 대한 GFAP, Iba-1, iNOS 및 Cox-2 (O)의 상대적인 표현을 나타낸다. 표시된 값은 평균±S.E.M.을 나타낸다. *p<0.05 및 ***p<0.001은 대조군과 비교하였고, #p<0.05, ##p<0.01 및 ###p<0.001은 MPTP 처리군과 비교하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 선퇴추출물(CP)은 Nurr1 단백체의 활성을 증가시켜 신경 영양 인자 내지 도파민을 증폭시키며, 신경세포 사멸 내지 신경 염증을 억제하여 신경세포 보호 효과를 가짐으로써 파킨슨병 등의 퇴행성 뇌질환으로 인한 행동장애를 개선시킬 수 있으며, 더 나아가 도파민 저하로 인한 집중력 저하, ADHD, 정신분열증, 우울증 내지 조울증의 개선효과도 기대할 수 있다(도 1).

MPTP로 퇴행성 뇌질환을 일으킨 마우스 모델에 본 발명의 CP를 투여한 경우 저하되었던 마우스의 운동능력이 향상되었으며(실시예 3)다. 또한, 상기 마우스 모델들의 뇌 조직 내지 마우스 유래 PC12 세포주 또는 미세아교세포 BV2 세포주에 CP를 직접적으로 처리하는 경우 도파민성 신경세포 내지 도파민이 증가되었으며(실시예 5, 실시예 <8-2>), Nurr1 및 그 조절 단백질들인 신경 영양 관련 인자(neurotrophic factors)의 수준이 증가하였다(실시예 7). 또한 파킨슨병 등 퇴행성 뇌질환의 병인 중 하나인 것으로 알려진 미토콘드리아의 막 전위 탈 분극도 방지(실시예 <8-1>)하였으며, 신경 염증 관련 인자들의 수준도 억제시켰다(실시예 <8-3>).

따라서, 본 발명은 선퇴(Cicadidae Periostracum) 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 선퇴추출물은 매미의 허물인 선퇴의 추출물로서, 추출시 사용할 수 있는 용매는 물, 유기용매 및 무기용매로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 용매로 하여 추출된 것일 수 있다. 바람직하게는 물 또는 C1 내지 C4의 저급알코올인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 물, 메탄올, 에탄올 또는 프로판올 인 것이 바람직하며 가장 바람직하게는 물을 용매로 하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 상기 선퇴추출물은 감압고온 추출, 열탕 추출, 환류 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온 추출, 초음파 추출 및 증기 추출방법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 추출방법으로 추출된 것일 수 있으며, 바람직하게는 감압고온 추출, 열탕 추출, 환류 추출 및 열수 추출로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 추출방법으로 추출된 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 환류 추출방법으로 추출된 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 퇴행성 뇌질환은 Nurr1 단백체의 기능 장애로 인해 발생하는 질환인 것일 수 있는데, 상기 Nurr1 단백체의 기능 장애로 인해 발생하는 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 루게릭병, 헌팅턴병, 전측두엽 치매, 피질-기저핵 퇴행증, 진행성 핵상마비, 집중력 저하, ADHD, 정신분열증, 우울증 및 조울증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 파킨슨병, 알츠하이머병, 집중력 저하, ADHD, 정신분열증, 우울증 및 조울증으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 파킨슨병인 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.

또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제; 경피 투여제; 또는 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.

상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 약학 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 선퇴추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg 당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 선퇴추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg 당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 선퇴추출물을 유효성분으로 포함하는 외용제의 제형으로 제공할 수 있다. 본 발명의 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.

또한, 본 발명은 선퇴(Cicadidae Periostracum)추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공할 수 있다.

상기 선퇴추출물은 상기 약학적 조성물에 포함되는 것과 동일하므로 설명은 상기 기재로 대신한다.

상기 퇴행성 뇌질환은 상기 약학적 조성물이 대상으로 하는 것과 동일하므로 설명은 상기 기재로 대신한다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 선퇴추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 본 발명의 선퇴추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 본 발명의 선퇴추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 선퇴추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 선퇴추출물과 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 선퇴추출물을 건강음료로 이용하는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

또한, 본 발명의 선퇴추출물은 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선 작용을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 선퇴추출물과 함께 퇴행성 뇌질환에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 선퇴추출물을 포함하는 신경세포 보호용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 신경세포는 뇌 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 미세아교세포(microglia), 희소돌기아교세포(oligodendroglia), 뇌실막세포(ependymal cell), 슈반세포(Schwann's cell) 및 신경절교세포(capsular cell) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있고, 바람직하게는 뇌 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.

상기 신경세포 보호는 신경세포의 손상 내지 감소를 억제 내지 완화하는 모든 효과를 의미하므로, 본 발명의 상기 조성물은 신경세포의 손상 내지 감소를 억제 내지 완화하는 효과를 가질 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 조성물은 신경세포의 사멸 또는 신경 염증을 억제하는 효과를 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 식품 조성물, 의약품 조성물 또는 의약외품 조성물인 것일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.

선퇴 추출물 제조

선퇴(Cicadidae Periostracum, CP; 광명당, 울산, 한국)를 구매하여 한국한의학연구원 한약자원연구센터 최고야 박사의 감별을 받아 바우처 표본(3-18-0038)은 한국한의학연구원 한약자원연구센터에 기탁되었다. 간단하게, 선퇴에 증류수를 가하여 약 3시간 동안 100±2 ℃ 에서 환류추출한 후 여과하였다. 선퇴추출물의 여과액은 회전식 진공 증발기에서 증발시켜 동결건조하였으며(수율: 6.30 %), 사용시까지 시료를 4 ℃ 에서 보관하였다.

동물 실험군 준비

수컷 C57BL/6 마우스(8 주, 23~24g)를 구입(두열 바이오텍, 서울)하고 온도 및 광 조절 조건(20-23 ℃, 12 시간 광/12 시간 암 주기)에서 보관하였다. 모든 동물은 약물 투여 전에 7 일 동안 순응시켰다. 실험 계획서는 한국한의학연구원(KIOM)의 기관 동물 보호위원회(KIOM-18-056)의 승인을 받았으며 KIOM의 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행되었다.

마우스들은 다음과 같은 11 그룹에 각각 할당하였다(도 2): (1) 대조군(N = 11); (2) MPTP(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; N = 11); (3) MPTP + 선퇴추출물(CP) 1 mg/kg/일(N = 11); (4) MPTP + CP 10 mg/kg/일(N = 11); (5) MPTP + CP 25 mg/kg/일(N = 11); (6) MPTP + 로피니롤(ropinirole) 1 mg/kg/일(N = 11); (7) CP 5 mg/kg/일(N = 5); (8) CP 25 mg/kg/일(N = 5); (9) 용매 대조군(N = 7); (10) 지질다당류(LPS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; N = 7); (11) LPS + CP 25 mg/kg/일(N = 7). 생리 식염수에 용해된 CP를 5 일 동안 연속적으로 경구투여하였다. 대조군 및 MPTP군은 0.25 ㎖의 정상 생리 식염수를 동일한 기간 동안 경구투여하였다. 이전에 기술된 바와 같이 MPTP 또는 LPS를 급성 투여하였다. CP 처리 3 일째에 MPTP(20 mg/kg, 식염수에 용해)를 2 시간 간격으로 4 회 복강 내 주사하였다. LPS 군에서는 CP의 마지막 투여 3 시간 후 LPS를 식염수에 녹여 5 mg/kg의 용량으로 복강 내 주사하였다.

MPTP 유발 파킨슨병 동물 모델 실험

<3-1> 로타로드 실험

로타로드 실험(Rotarod test)을 이용하여 MPTP 투여를 통해 유발된 파킨슨병(Parkinson's disease, PD) 마우스 모델의 운동저하증(hypokinesia) 등의 행동장애를 측정하고자 하였다.

구체적으로, 마우스를 마지막 MPTP 주사 후 1 일째 로타로드로 감각 운동 조정을 평가하였다. 로타로드 장치(Ugo Basile, Comerio Varese, Italy)는 직경 3cm의 회전 스핀들과 5 마리의 마우스를 동시에 테스트할 수 있는 5 개의 개별 구획으로 구성하였다. 5 일간의 투여 종료(실시예 4) 후, 첫째 날은 4rpm으로, 둘째날은 20rpm의 회전 속도로 트레이닝 시킨 후 셋째 날에 25 rpm에서 본 실험을 시행하였으며 이 때 낙하 시간을 측정하였다. 연습은 회당 300 초의 제한 시간을 두고 5 분 간격으로 2 회 시행하였고, 본 실험은 5분 간격으로 3 회 실행하여 평균값을 사용하였다.

그 결과, [도 3]의 (A)에서 나타나는 바와 같이 MPTP로 PD를 유도한 마우스 모델에 선퇴추출물(CP)을 투여한 경우 낙하 시간은 유의적으로 증가하였으며, 특히 5 mg/kg/일 내지 25 mg/kg/일 로 CP를 투여한 경우 대조군과 비슷한 수준의 낙하시간을 나타냈다. (MPTP: 13.71±2.06, MPTP + CP 1 mg/kg/일: 27.14±4.31, MPTP + CP 5 mg/kg/일: 56.86±13.99, MPTP + CP 25 mg/kg/일: 55.86±14.81).

<3-2> 폴 실험

폴 실험(Pole test)을 이용하여 MPTP 투여를 통해 유발된 PD 마우스 모델의 운동느림증(bradykinesia)과 같은 행동장애를 측정하고자 하였다.

마지막 MPTP 주사 후 5 일 또는 7 일에 폴 실험을 수행했다. 마우스를 막대(직경 8mm, 높이 55cm, 거친 표면) 위에 머리가 위로 향하게 놓고, 마우스가 꼭대기를 180° 돌아서 마우스의 머리가 완전히 아래로 내려오는 시간을 'time to turn(T-턴)', 마우스가 꼭대기를 180° 돌아서 내려와 네 다리가 땅에 닿을 때까지 걸리는 시간을 'time for locomotion activity(T-LA)'로 표기하였다. 각 실험은 50 초의 제한시간을 두고 시행하였으며, 각 생쥐를 3 회씩 연습시킨 후 5 회 본 실험 을 행하였다. 로피니롤(Ropinirole)은 양성대조군으로 사용하였다.

그 결과, [도 3]의 (B) 내지 (D)에서 나타나는 바와 같이 MPTP로 PD를 유도한 마우스 모델에 선퇴추출물(CP)을 투여한 경우 T-턴 또는 T-LA 시간은 유의적으로 감소하였다. 특히 5 mg/kg/일 내지 25 mg/kg/일 로 CP를 투여한 경우 대조군과 비슷한 수준의 낙하시간을 나타냈으며, 양성대조군인 로피니롤 투여군보다 더 효과적인 T-턴 또는 T-LA 시간 감소 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 5일차 T-턴(도 3의 B)의 경우, MPTP: 7.17±1.10, MPTP + CP 1 mg/kg/일: 5.70±1.41, MPTP + CP 25 mg/kg/일: 3.83±0.76s, MPTP + 로피니롤 1 mg/kg/일: 5.91±0.81s 이고, 7일차 T-턴(도 3의 D)의 경우 MPTP: 9.18±2.23, MPTP + CP 25 mg/kg/일: 2.52±0.40 이고,

5일차 T-LA(도 3의 C)의 경우, MPTP: 14.13±1.72, MPTP + CP 1 mg/kg/일: 13.58±2.34, MPTP + CP 25 mg/kg/일: 7.97±0.63s, MPTP + 로피니롤 1 mg/kg/일 12.09±1.02s이고, 7일차 T-LA(도 3의 E)의 경우, MPTP + CP 25 mg/kg/일: 7.79±0.40으로 나타나 유의적으로 단축되었다.

뇌 조직 준비

MPTP 처리 후 1 일 및 7 일째, 또는 LPS 처리 후 3 시간 째(실시예 2)에 마우스를 즉시 마취시키고 0.05M 인산염 완충 식염수(PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 경심관류(transcardially)시킨 후 차가운 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 0.1M 인산염 완충액에 용해시켰다. 4% PFA를 함유하는 0.1M 인산염 완충액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 뇌를 제거하고 4℃에서 하루동안 보관한 후, 0.05M PBS 중의 30% 수크로오스를 함유하는 용액에 한랭보호(cryoprotection)을 위해 침지시켰다. 15 또는 30㎛ 두께의 일련의 관상 절편은 냉동 마이크로톰(microtome)으로 절단하고(Leica Instruments GmbH, Nussloch, Germany), 한랭보호(25% 에틸렌글리콜(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 25% 글리세롤(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 0.05M 인산염 완충액)로 면역 조직 화학(immunohistochemistry, IHC) 연구에 사용할 때 까지 4 ℃에서 저장하였다. 웨스턴 블롯 분석과 키트 기반 분석을 위해 뇌 흑색질(SNpc)와 선조체(ST)를 숙련된 기술을 통해 신속하게 해부하고 균질화하고 원심 분리했다. 모든 상청액까지 최종 상등액을 -70 ℃에서 보관하였다.

선퇴추출물의 신경세포에 대한 효과

<5-1> 선퇴추출물의 도파민에 대한 효과

본 발명자들은 도파민 신경 세포 사멸, 도파민 수준 내지 MAO-B에 대한 선퇴추출물(CP)의 효과를 마우스의 뇌흑색질 또는 선조체를 이용하여 면역 조직 화학(Immunohistochemistry, IHC)을 통하여 확인하고자 하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 4>에서 준비한 뇌 조직을 PBS로 간단히 세척하고 15 분 동안 1 % 과산화수소(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 처리하였다. 절편은 0.3 % 트리톤 X-100(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 및 정상 염소 혈청(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 또는 정상 말 혈청(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)의 존재하에 4℃ 에서 24시간 동안 토끼 항 티로신 히드록실라제(TH; 1:1000)와 함께 배양하였다. 그 후 절편을 PBS로 세정한 후, 바이오티닐화된 항-토끼 IgG(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)(1:200)와 함께 90 분 동안 배양하고 세정하여 ABC(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA; 1:100)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 0.05M Tris-buffered saline(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 DAB(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 절편을 배양하여 퍼옥시다아제 활성을 시각화하였다. PBS로 수 차례 헹구고, 절편을 젤라틴 코팅 슬라이드에 올려 탈수시키고 히스토마운트(histomount) 배지를 사용하여 커버슬립(coverslip)하였다. ST에서의 도파민 수준 내지 무 세포 시스템에서 MAO-B 억제율은 ELISA를 사용하여 측정하였다. 셀레길린은 양성 대조군(0~1 μM)으로 사용되었다.

그 결과, [도 4]에서 나타나는 바와 같이 MPTP-유도 파킨슨병(PD) 마우스 모델에 CP를 처리하는 경우 TH-양성 도파민성 신경세포, ST의 광학 강도 내지 도파민 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 이는 양성대조군으로 사용된 로피니롤 처리군과 유사하거나 더 효과적인 것으로 나타났다. 반면에, CP는 MAO-B 활성에는 영향이 미미한 것으로 나타냈다.

즉, MPTP 처리된 마우스에서, SNpc의 TH-양성 세포의 수 및 ST의 광학 강도는 대조군과 비교하여 각각 48.51±3.85 % 및 38.20±3.37 % 감소하였다. 그러나 이 값은 1-25 mg/kg CP 또는 로피니롤 처리(82.64±1.31 % ~ 91.50±1.31 % 및 91.61±7.30 % 및 88.88±4.75 % ~ 79.01±18.21 % 및 91.64±6.30 %)에 의해 크게 증가했다(대조군과 비교). 또한, MPTP 처리는 대조군과 비교하여 스트리아탈 도파민(striatal dopamine)의 수준을 8.47±0.25 nmol/㎖ 까지 현저히 감소 시켰고, 1~25 mg/kg의 CP 또는 로피니롤로 처리하면 MPTP-유도된 스트리아탈 도파민을 12.84±1.36 ~ 15.20±1.18 nmol/㎖ 및 16.94±0.93 nmol/㎖ 까지 증가시켰다. 또한, 5~25 mg/kg CP로 처리한 경우에만 대조군과 비교하여 스트리아탈 도파민을 16.86±0.21에서 17.65±0.29 nmol/㎖ 까지 증가시켰다.

세포 실험

<6-1> 세포 배양

쥐의 부신 수질에서 유래한 갈색세포종(pheochromocytoma) PC12 세포주(한국 세포주 은행, # 21721)는 37℃에서 10% 열-비활성화된 태아 혈청(Gibco, MD, USA)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, MD, USA)을 보충한 RPMI 배지(Roswell Park Memorial Institute; Gibco, MD, USA)에 95% 공기와 5% CO₂ 으로 보관되었다. PC12 세포를 1 또는 2×10⁵ 세포/㎖의 밀도로 96-웰 플레이트 또는 6-웰 플레이트 상에 접종하고 24 시간 동안 상기 <실시예 1>에서 제조한 선퇴추출물(CP)을 PBS에 희석하여 0~1000㎍/㎖로 처리하였다. 분화된 PC12의 경우 배지를 2 ~ 3 일마다 새롭게 교체하였다. 분화된 PC12 세포를 7 일 동안 신경 성장 인자(NGF; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 처리하였고 24 시간마다 신선한 배지와 시약을 공급하였다. 분화된 PC12 세포는 CP(1 ~ 200 ㎍/㎖)로 1 시간 동안 처리하였다. 그 후 추가적으로 23 시간 동안 MPP⁺(100 μM)를 이용하여 자극하였다(도 5).

마우스 미세아교세포(microglial) BV2 세포주는 37 ℃에서 95 % 공기와 5 % CO²의 대기로 10% 열-비활성화 소 태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's 배지(Gibco, MD, USA)에 보관하였다. BV2 세포를 24-웰 플레이트에 1.5×10⁵ 세포/㎖의 밀도로 접종하고 24 시간 동안 CP(0 ~ 1000㎍/㎖)로 처리하였다(도 5).

<6-2> 세포독성

세포독성은 제조원의 프로토콜에 따라 Cell Counting Kit(CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan)를 사용하여 평가하였다. 상기 실시예 <6-1>의 PC12 세포를 96-웰 플레이트에 도말하고 상기 <실시예 1>에서 제조한 선퇴추출물(0, 0.1, 1, 10, 50, 100 또는 200 ㎍/㎖)로 처리하였다. CCK-8 시약을 각 웰에 첨가하고 혼합물을 4 시간 동안 배양하였다. 흡광도는 SpectraMax i3 다중 모드 검출 플랫폼(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)을 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 세포 생존력은 하기 수학식을 사용하여 계산하였다.

[수학식]

선퇴추출물 처리 후 잔류하는 세포의 % = (처리된 세포에서의 평균 흡광도 / 처리되지 않은 대조군에서의 평균 흡광도) × 100

그 결과, [도 6]에서 나타나는 바와 같이 선퇴추출물의 농도가 100 ㎍/㎖ 이상인 경우, 24 시간 후 PC12 및 분화된 PC12 세포의 신경 수축, 손상 및 수지상 길이가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이후 실험은 1 내지 50 ㎍/㎖ 의 CP로 수행되었다.

선퇴추출물의 신경 영양 관련 인자에 대한 영향

<7-1> 신경 영양 관련 인자 확인

Nurr1 및 그 조절 단백질에 대한 선퇴추출물(CP)의 효과를 조사하기 위해, 분화된 PC12 세포 내지 마우스 SNpc 에서 Nurr1, TH, DDC, DAT 및 VMAT2의 수준을 측정 하였다. 또한, ERK 활성화가 CP에 의한 Nurr1 발현 증가에 기여했는지 여부를 확인하고자 하였다. β-액틴 단백질을 내부 대조군으로 사용 하였다.

그 결과, [도 7]에서 나타나는 바와 같이 Nurr1을 비롯하여, 이에 조절되는 TH, DDC, DAT, VMAT2의 단백질 발현 수준은 CP 처리에 의해 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 7의 C 및 D). 또한, ERK의 선택적 억제제인 SCH772984를 10시간 동안 전처리하는 경우, 분화된 PC12 세포에서 CP에 의해 유도된 Nurr1, TH, DDC, DAT 및 VMAT2의 증가를 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 7의 E).

즉, 대조군에 비하여 분화된 PC12 세포는 CP 처리에 의해, Nurr1 : 95.42±8.31 %에서 226.96±22.30 %; TH : 152.26±14.77 %에서 272.45±29.81 %; DDC : 128.03±2.89 % 에서 173.43±22.66 %; DAT : 118.17±6.47 % 에서 278.32±29.55 %; VMAT2 : 147.26±3.32 % 에서 203.69±31.21 % 로 증가하였다.

또한, 대조군에 비하여 SNpc 세포는 CP 처리에 의해, Nurr1 : 201.02±32.55 %; TH : 197.50±33.64 %; DDC : 161.74±27.33 %; DAT : 140.97±14.67 %; 및 VMAT2 : 142.77±22.56 % 로 증가하였다.

또한, 대조군에 비하여 ERK 억제제로 처리된 분화된 PC12 세포는 CP 처리에 의해, Nurr1 : 196.24±30.19 % 및 94.31±11.10 %; TH : 258.87±33.33 % 및 111.47±19.10 %; DDC : 166.88±23.84 % 및 68.21±7.94 %; DAT : 350.47±56.53 % 및 187.24±16.89 %; 및 VMAT2 : 224.09±36.33 % 및 89.09±10.16 % 로 감소하였다.

<7-2> 도파민 뉴런에서 MPTP-유도 Nurr1 발현에 대한 선퇴추출물의 효과

도파민 뉴런에서 MPTP로 유도된 Nurr1 발현에 대한 선퇴추출물(CP)의 효과를 확인하고자 하였다.

구체적으로, Nurr1 특이적인 면역 형광 분석을 위해, 뇌 절편을 PBS로 간단히 세척하고 30 분 동안 0.5% BSA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 처리하였다. 절편을 마우스 anti-TH(1 : 100) 또는 토끼 항-유리 섬유성 산성 단백질(GFAP), 이온화된 calcium-binding adaptor molecule 1(Iba-1), Nurr1 또는 cyclooxygenase-2(Cox-2; 1 : 200)를 4 ℃에서 24시간 동안 0.3 % 트리톤 X-100 및 정상 염소 혈청 존재 하에서 배양하였다. 그 다음, Alexa Fluor-conjugated 2 차 항체(1 : 500)로 1 시간 배양했다. 절편을 PBS로 최종 세척하고 DAPI(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 함유한 Vectashield 장착 배지를 사용하여 장착하였다. 20X 대물 렌즈가 장착된 광학 현미경(Olympus Microscope System BX53, Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 40 배 및 100 배 배율로 이미지를 촬영했다. 또한, 웨스턴 블롯팅에 의해 Nurr1 발현 수준을 확인 하였다. β-액틴 단백질을 내부 대조군으로 사용 하였다.

그 결과, [도 8]에서 나타나는 바와 같이 MPTP는 대조군과 비교하여 수축된 도파민성 뉴런에서 Nurr1을 71.49±1.27%에서 33.40±3.17% 로 현저하게 감소 시켰으며, 5 ~ 25 mg/kg CP 처리는 Nurr1을 76.08±1.15 % ~ 82.67±1.30 % 에서 30.06±2.40 % 내지 95.06±7.22 % 로 증가시켰다. 또한, MPTP는 대조군과 비교하여 SNpc에서 Nurr1을 33.40±3.13 % 까지 현저하게 감소시켰고, 5-25 mg/kg CP로 처리한 MPTP로 유발된 Nurr1을 30.06±2.34 %에서 95.06±7.07 %로 증가시켰다. SNpc를 항-Nurr1 및 항-TH 항체로 이중-표지된 면역 형광 염색으로 촬영한 결과, TH 및 Nurr1 의 수준이 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 8의 C).

<7-3> MPTP-유도 Nurr1 조절 유전자 및 단백질의 발현에 대한 선퇴추출물의 효과

MPTP에 의해 유도된 Nurr1 및 조절 유전자 및 단백질의 발현에 대한 선퇴추출물(CP)의 효과를 확인하고자 하였다. 또한, CP로 유도된 TH, DAT 및 VMAT2가 Nurr1 활성화를 통해 매개되는지 여부를 추가로 확인하기 위해, Nurr1을 표적화하는 siRNA로 분화된 PC12 세포를 형질 감염시켰다.

구체적으로, 마우스 SNpc에서 Nurr1, TH, DDC, DAT 및 VMAT2의 수준을 Real Time RT-PCR 내지 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. SNpc 조직의 균질화는 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 수행 하였다. 균질화 후, 0.2 ㎖의 클로로포름을 각 샘플에 첨가 하였다. 튜브를 15 초 동안 손으로 격렬하게 진탕한 후, 실온에서 3 분 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 혼합물을 4 ℃에서 14,000 rpm으로 15 분 동안 원심 분리한 후, 상층액 400 ㎕을 0.5 ㎖의 2-프로판올이 첨가된 새로운 튜브로 옮겼다. 4 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션 한 후, 혼합물을 4 ℃에서 10 분 동안 14,000 rpm으로 다시 원심 분리 하였다. 분리 후, 상청액을 제거하고, 1 ㎖의 75 % 에탄올로 세척한 후, 4 ℃에서 5 분 동안 10,000 rpm으로 다시 원심 분리 하였다. 이어서, 생성된 RNA 펠렛을 건조시키고, 정제된 RNA를 DEPC(diethyl pyrocarbonate)-증류수에 용해시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 iScript cDNA 합성 키트 (Bio-Rad, Hercules, CA, United States)를 사용하여 동일한 양의 RNA(200 ㎍)를 cDNA로 역전사시켰다. 앰플리콘(amplicon)을 정량화하기 위해 CFX96 실시간 PCR 시스템(Bio-Rad) 및 SYBR 녹색 형광 정량 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 선택된 유전자에 대해 실시간 PCR을 수행 하였다. PCR 조건은 95 ℃ (30s), 58 ℃ (30s)의 50 사이클 및 표준 변성 곡선이었다. 프라이머 서열은 하기 [표 1]과 같으며 각 유전자의 결합온도(annealing)는 59℃ 이다. 각 표적에 대한 PCR 조건은 프라이머 농도, 프라이머 이량체 형성의 부재, 및 표적 유전자 및 증폭 유전자의 증폭 효율에 따라 최적화되었다. 하우스 키핑 제어 유전자. PCR 반응 혼합물은 1 ㎕의 cDNA 및 9.5 ㎕의 PCR 마스터 믹스를 포함하고, 이는 2×SYBR Green, 각각 10 pmol의 정방향 및 역방향 프라이머, 및 4.5 ㎕의 DEPC-증류수를 최종 부피 15 ㎕로 포함하였다. 샘플의 cDNA 함량을 정규화하기 위해, 본 발명자들은 내인성 기준 유전자인 글리세르 알데히드 3-포스페이트 탈수소효소에 대한 표적 유전자 카피 수의 정규화를 포함하는 비교 임계 값(comparative threshold, CT) 사이클 방법을 사용하였다. CT는 PCR 생성물의 증폭이 처음 검출될 때 프로브의 절단에 의해 생성된 형광이 고정된 임계 기준선을 통과하는 부분 사이클 수로 정의된다.

유전자	프라이머 서열 (5' to 3')	서열번호
Nurr1	F: GCAGACTTTAGGTGCATGTTGG	1
	R: CCCGTCAGATCTCCTTGTCC	2
TH	F: CAGAAGAGCCGTCTCAGAGC	3
	R: CCTCGAATACCACAGCCTCC	4
DAT	F: TGTATGTGGTCGTGGTCAGC	5
	R: GGCCAGTTTCTCTCGGAAGG	6
VMAT2	F: TGTGACCAACACGACTGTCC	7
	R: CAAGAGGAGCCGATTCCCTG	8
GAPDH	F: CCCTTAAGAGGGATGCTGCC	9
	R: ACTGTGCCGTTGAATTTGCC	10

또한, siRNA 형질감염은 분화된 PC12 세포를 100mm 접시에 80-85 %의 합류로 사용했다. 세포를 리포 펙타민 2000(Lipofectamine 2000; Inpotrogen, CA, USA)을 사용하여 스텔스(stealth) siRNA로 형질 감염시켰다. 리포펙타민 2000(10 ㎕)을 40 μM siRNA 용액(Nurr1 siRNA 및 스크램블링된 siRNA이 같은 몰 수로 혼합) 및 2.5 ㎖의 Opti-MEM 배지(Gibco-BRL, CA, USA)와 혼합하였다. 실온에서 30 분 후, 300 ㎕의 혼합물을 각 접시에서 300 ㎕의 무 혈청 RPMI에 첨가하고 24 시간 동안 배양하였다.

그 결과, [도 9]에 나타나는 바와 같이, MPTP는 대조군에 비해 TH (49.87±5.21%), DDC(36.73±8.28%), DAT(36.17±0.97%) 및 VMAT2(69.12±10.67%) 수준을 유의하게 감소 시켰다. 1-25 mg/kg CP는 TH(46.31±3.94 % 에서 95.71±10.59 %), DDC(53.45±16.29 % 에서 140.27±15.04 %), DAT(34.98±7.3 % 3에서 60.85±1.08 %) 및 VMAT2(42.14±9.55 % 내지 149.34±43.42 %) 의 MPTP-유도된 발현을 증가시켰다. 또한, MPTP는 Nurr1(0.82±0.01), TH(0.01±0.01), DAT(0.01±0.003) 및 VMAT2(0.05±0.003) 수준을 현저히 감소 시켰으며, 25 mg/kg CP 처리는 Nurr1(2.20±0.08), TH(0.04±0.001), DAT(0.08±0.01) 및 VMAT2(0.08±0.01)의 MPTP-유도된 발현을 증가시켰다(도 9의 I 내지 L). 결과는 TH, DAT 및 VMAT2 수준이 Nurr1 siRNA-형질 감염된 세포에서 CP에 의해 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 9의 M).

<8-1> 미토콘드리아 막 전위 측정

선퇴추출물(CP)이 미토콘드리아 기능 장애 및 미토콘드리아 매개 세포자멸사에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 분화된 PC12 세포에서의 미토콘드리아 막 전위 및 Bcl-2, Bax, Cyto-c, 절단된 카스파제-3, 절단된 카스파제-9 및 PARP1의 수준을 확인하였다.

Δψm은 Δψm 검출 키트와 함께 제공된 친유성 양이온성 프로브인 테트라 에틸벤즈이미다졸릴카보시아닌 아이오다이드(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide, JC-1) 시약을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 모니터링 하였다. 분화된 PC12 세포를 96-웰 플레이트의 커버 슬립에 시딩하고 24 시간 동안 1, 10, 또는 50 ㎍/㎖ 및 100 μM MPP+로 CP와 동시에 처리하였다. 이어서, 세포를 PBS로 헹구고 37 ℃에서 희석된 친유성 양이온성 프로브 JC-1와 배양 하였다 30 분 동안, 세포를 세척하고 96-웰 플레이트로 옮겼다. 적색(585/590nm) 및 녹색(510/527nm) 형광의 비는 형광판 판독기를 사용하여 결정되었다.

그 결과, [도 10]에 나타나는 바와 같이 MPTP는 Bcl-2의 현저한 감소 및 Bax, Cyto-c, PARP, 절단된 카스파제-9(cleaved caspase-9) 및 절단된 카스파제-3의 증가를 야기하였고; 1, 5 또는 25 mg/kg CP는 Bcl-2를 증가시켰고 Bax, Cyt-c, PARP, 절단된 카스파제 -9 및 절단된 카스파제-3을 감소시켰다(도 10의 A). 녹색 형광(단량체 형태, 낮은 Δψm) 및 적색 형광(집합 형태, 높은 Δψm)은 Δψm 탈분극을 나타낸다. MPP+로 유도된 독성은 Δψm을 4.64±0.08 증가시켰지만, CP 전처리는 미토콘드리아 막의 탈분극(1.99±0.05 내지 1.42±0.07 비)을 방지하였다.

<8-2> 도파민 발현 수준

선퇴추출물(CP)이 도파민 생산에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 마우스 SNpc에서 GDNF 및 Ret의 수준을 평가했다.

구체적으로, 마우스 뇌의 절편에서의 도파민 함량은 제조사(Rocky Mountain Diagnostics)가 제공한 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 형광 분석 검정 내지 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트를 사용하여 확인하였다.

그 결과, [도 11]에서 나타나는 바와 같이 MPTP는 GDNF 및 Ret의 발현을 현저히 감소시켰으며, 5 또는 25 mg/kg CP 처리는 GDNF 및 Ret의 수준을 증가시켰다(도 11의 D). MPTP는 GDNF를 SNpc에서 1.80±0.54 pg/㎖로, ST에서 2.45±1.30 pg/㎖로 각각 감소시켰다. 반면에, 1~25 mg/kg CP를 처리하는 경우 MPTP 처리로 인해 감소된 GDNF는 SNpc에서 3.01±0.63 내지 7.51±1.55 pg/㎖로, 및 ST에서 3.08±0.56 내지 14.30±1.35 pg/㎖ 로 증가하였다(도 11의 E).

<8-3> 사이토카인 발현 수준

선퇴추출물(CP)이 신경 염증 반응에 영향을 미치는지 확인하고자, 신경교/미세아교세포(glial/microglia) 활성화 및 미세아교 세포 BV2 세포 및 마우스 SNpc의 신경 염증 인자 수준을 평가 하였다.

구체적으로, 미세아교 BV2 세포를 2 시간 동안 CP로 처리하고 추가 22 시간 동안 LPS로 처리 하였다. 24 시간 인큐베이션 후, 배양물에 제조사의 지침(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)에 따라 사이토카인 멤브레인 어레이 키트를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 염증 자극에 따라 방출되는 GFAP, Iba-1, iNOS 및 Cox-2의 발현 수준을 측정 하였다. SNpc에서 항 -Cox-2, GFAP 및 Iba-1 항체로 면역 형광 염색하여 촬영 하였다.

그 결과, [도 12]에 나타나는 바와 같이, 웨스턴 블롯팅 분석에 따르면 MPTP 처리군의 SNpc에서 GFAP, Iba-1, iNOS 및 Cox-2의 수준이 각각 482.97±28.90 %, 384.06±65.22 %, 264.07±77.82 % 및 179.78±11.50 % 증가했다. 반대로 CP는 이러한 GFAP, Iba-1, iNOS 및 Cox-2 수준을 감소시켰다(381.29±19.15 %에서 52.02±24.48 %, 407.13±85.73 %에서 124.79±19.71 %, 164.17±23.04 %에서 63.20±24.39% 및 109.09±23.71 %에서 92.02±2.36 %). 상기 실시예 <6-2>의 MTT 분석 결과와 같이, Microglia BV2 세포는 1-62.5 ㎍/㎖ CP에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나, 125-1000 ㎍/㎖ CP는 세포 독성을 증가시켰다(데이터는 나타내지 않음). 따라서 모든 추가 실험은 1-62.5 ㎍/㎖에서 CP로 수행되었다.

또한, [도 13]에서 나타나는 바와 같이, 사이토카인 어레이 키트는 LPS 처리 된 미세아교 세포 BV2 세포에서 ICAM-1, IL-6, KC, MCP-5 및 RANTES의 수준이 각각 205.03±4.24%, 3468.59±51.63%, 687.96±6.04%, 336.64±0.07% 및 192.58±1.65%로 크게 증가함을 나타내었다. 대조적으로, CP는 LPS 처리에 의해 증가한 ICAM-1, IL-6, KC, MCP-5 및 RANTES를 각각 62.45±12.28 %, 2185.72±11.60 %, 102.53±2.19 %, 168.26±3.22% 및 104.78±0.46% 로 억제했다. LPS-처리군의 SNpc에서 iNOS 및 Cox-2의 수준 또한 각각 235.75±18.69% 및 555.89±55.49% 로 유의하게 증가 하였다. 또한, CP 처리는 이러한 iNOS 및 Cox-2의 증가를 118.92±10.06 % 및 301.61±58.46 % 로 억제하였다(도 13N-O).

[데이터 분석]

Science Citation Index 과학 및 서지 연구를 위한 공통 데이터 소스인 Web of Science 코어 콜렉션의 확장된 인용 색인 데이터베이스가 소스 데이터베이스로 검색되었다. 상호 작용 유전자 검색(STRING) 소프트웨어에 대한 검색 도구를 사용하여 알려진 단백질-단백질 상호 작용과 예측된 단백질-단백질 상호 작용을 기반으로 단백질 상호 작용을 보여주는 네트워크 모델을 구성했다. 또한, 단백질 온톨로지(ontology)와 기능적 관계는 교토 백과사전 및 게놈 데이터베이스(KEGG)에서 얻었다. 주요 연구 방법은 Scientometrics를 기반으로 했으며 분석 소프트웨어는 유사성 시각화 뷰어(VISviewer, 네덜란드 Leiden University의 van Eck 및 Waltman이 개발)(버전 1.6.9, www.vosviewer.com)와 텍스트 파일을 포함한다. VOSviewer는 프로젝트간의 연결 강도에 따라 클러스터링 분석을 사용하여 복잡한 네트워크를 분석 할 수 있다. 특히 클러스터링과 같은 지식 도메인 디스플레이 매핑; 대규모 데이터 세트를 분석; 복잡한 네트워크를 구축할 때 강력한 장점이 있다.

[통계 분석]

모든 통계 파라미터는 Graphpad Prism 5.0 소프트웨어(Graphpad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 계산하였다. 값은 평균±표준 오차(S.E.M.)로 표현된다. 서로 다른 처리법 간의 통계적 비교는 Tukey의 다중 비교 사후 테스트를 사용하여 일원분산분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었다. p 값 <0.05 는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> Composition for preventing, improving or treating degenerative brain diseases comprising Cicadidae Periostracum extract <130> 1065855 <160> 10 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nurr1_F <400> 1 gcagacttta ggtgcatgtt gg 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nurr1_R <400> 2 cccgtcagat ctccttgtcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TH-F <400> 3 cagaagagcc gtctcagagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TH_R <400> 4 cctcgaatac cacagcctcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DAT_F <400> 5 tgtatgtggt cgtggtcagc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DAT_R <400> 6 ggccagtttc tctcggaagg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VMAT2_F <400> 7 tgtgaccaac acgactgtcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VMAT2_R <400> 8 caagaggagc cgattccctg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH_F <400> 9 cccttaagag ggatgctgcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GAPDH_R <400> 10 actgtgccgt tgaatttgcc 20

Claims (12)

1. 선퇴(Cicadidae Periostracum) 추출물을 포함하는, Nurr1 단백체의 기능 장애로 인한 퇴행성 뇌질환인 파킨슨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 선퇴추출물은 물, 유기용매 및 무기용매로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 용매로 하여 추출된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 감압고온 추출, 열탕 추출, 환류 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온 추출, 초음파 추출 및 증기 추출방법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 추출방법으로 추출된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 선퇴(Cicadidae Periostracum) 추출물을 포함하는, Nurr1 단백체의 기능 장애로 인한 퇴행성 뇌질환인 파킨슨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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