KR102268010B1 - 반려동물의 암모니아성 악취 저감능 및 병원성 세균 생장 저해능이 뛰어난 락토바실러스 플랜타룸 gj-a20 및 락토바실러스 카제이 ebn-kc23 - Google Patents
반려동물의 암모니아성 악취 저감능 및 병원성 세균 생장 저해능이 뛰어난 락토바실러스 플랜타룸 gj-a20 및 락토바실러스 카제이 ebn-kc23 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 반려동물의 암모니아성 악취 저감능 및 병원성 세균 생장 저해능이 뛰어난 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P)와 이를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 선별한 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P) 균주는 반려동물에서 농피증을 일으키는 병원성 세균의 생장 저해를 통해 우수한 항균능을 가짐과, 동시에 우수한 암모니아성 악취물질 분해능을 가진다. 본 발명의 균주들을 이용하여 기존 화학적 방법의 대체법으로 사용하여 환경 친화적인 물질로서 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 반려동물의 암모니아성 악취 저감능 및 병원성 세균 생장 저해능이 뛰어난 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P)와 이를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
1인 가구 및 반려동물에 대한 수요 증가 추세와 더불어 쾌적한 동반생활 환경 조성 및 상호간 위생문제 해결을 위한 친환경 제제가 필요하다. 특히, 반려동물과의 동반생활 중 주요 문제점인 피부질환과 이취를 해결하는 것에 대한 소비자들의 관심이 높다.
반려동물의 피부질환 증상 중 흔하게 발병하는 농피증은 포도상구균(Staphylocococcus) 및 연쇄상구균(Streptococcus)이 외부로부터 살갗에 감염하여 일어나는 화농성 병변으로 피부에 생기는 질환이다. 농피증의 원인은 창상을 통한 세균의 감염, 알러지반응, 기생충 및 진균 감염 등으로 다양하며, 가장 일반적인 원인은 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius)으로 전체 피부염의 40.50%를 차지한다.
농피증을 예방하는 방법으로는 과산화 벤조일(Benzoyl peroxide)이나 클로로헥시딘이 첨가된 샴푸를 사용하여 목욕을 시켜주거나(화학적 방법), 깔개를 깔아주어 신체에 압박이 가해지는 부위가 없도록 하여 피부가 젖어 있지 않게 하는 방법 등이 있다. 또한, 농피증을 치료하는 방법으로는 최소 2주 동안 항생제를 투입하는 방법이 사용되며, 경구용 항생제로는 아목사실린, 클라불산, 세팔렉신 등이 있으며, 국소용 항생제로 Isaderm 등이 있다. 이와 같이 화학적 물질을 이용한 예방 및 치료방법이 있으나, 내성 및 부작용 등의 문제가 있어 환경친화적인 방법으로 농피증을 예방할 수 있는 기술이 필요하다.
한편, 반려동물의 이취를 제거하기 위해 시판되는 탈취제는 대부분 강한 향으로 악취를 덮는 마스킹 효과의 방향탈취제가 주로 이용된다. 하지만 이러한 방법은 근본적인 이취를 제거하지 못하므로 지효성이 떨어져 이를 보완하는 근본적인 이취 저감 방법을 개발하는 것이 필요한 실정이다.
본 발명은 반려동물의 암모니아성 악취 저감능 및 반려동물의 피부질환을 일으키는 병원성 세균에 대한 생장 저해능이 뛰어나 우수한 항균능을 가지는 균주 및 이를 포함하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 암모니아성 악취 저감능 및 병원성 세균 생장 저해능을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P)을 제공한다.
또한, 본 발명은 암모니아성 악취 저감능 및 병원성 세균 생장 저해능을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P) 균주, 이의 배양액 또는 상등액을 포함하는 것을 특징으로 하는 암모니아성 악취 물질 분해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P) 균주, 이의 배양액 또는 상등액을 포함하는 것을 특징으로 하는 암모니아성 악취 물질 분해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P) 균주, 이의 배양액 또는 상등액을 포함하는 것을 특징으로 하는 병원성 세균 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P) 균주, 이의 배양액 또는 상등액을 포함하는 것을 특징으로 하는 병원성 세균 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 선별한 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P) 균주는 반려동물에서 농피증을 일으키는 병원성 세균의 생장 저해를 통해 우수한 항균능을 가짐과, 동시에 우수한 암모니아성 악취물질 분해능을 가진다. 본 발명의 균주들을 이용하여 기존 화학적 방법의 대체법으로 사용하여 환경 친화적인 물질로서 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 각각의 배양액의 병원성 세균에 대한 생장 저해능을 나타낸 결과이며, GJ-A20은 LP로, EBN-KC23은 LC로 표기하였다. 도 1의 A)는 스타필로코커스 슐레페리(Staphylococcus schleiferi KACC 13170)에 대한 생장 저해능 결과이고, 도 1의 B)는 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius KCTC 3344)에 대한 생장 저해능을 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 각각의 펠렛(pellet)/상등액의 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius KCTC 3344)에 대한 생장 저해능을 나타낸 결과이며, GJ-A20은 LP로, EBN-KC23은 LC로 표기하였다.
도 3은 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23의 상등액을 혼합한 조성물(1:1)의 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius KCTC 3344)에 대한 생장 저해능을 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23의 상등액 혼합물과 라벤더 추출물을 혼합한 조성물(2:2:6)의 대장균(E.coli)과 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 생장 저해능을 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23의 상등액 혼합물과 라벤더 추출물을 혼합한 조성물(2:2:6)의 악취 저감능을 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 각각의 펠렛(pellet)/상등액의 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius KCTC 3344)에 대한 생장 저해능을 나타낸 결과이며, GJ-A20은 LP로, EBN-KC23은 LC로 표기하였다.
도 3은 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23의 상등액을 혼합한 조성물(1:1)의 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius KCTC 3344)에 대한 생장 저해능을 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23의 상등액 혼합물과 라벤더 추출물을 혼합한 조성물(2:2:6)의 대장균(E.coli)과 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 생장 저해능을 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23의 상등액 혼합물과 라벤더 추출물을 혼합한 조성물(2:2:6)의 악취 저감능을 나타낸 결과이다.
최근 들어 반려동물과의 동반생활을 쾌적하게 하기 위해 주요 문제점인 피부질환과 이취를 해결하는 것에 대한 수요가 높다. 특히, 반려동물의 피부질환 증상 중 흔하게 발병하는 농피증은 포도상구균(Staphylocococcus) 및 연쇄상구균(Streptococcus)이 외부로부터 살갗에 감염하여 일어나며, 가장 일반적인 원인으로는 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius)가 있다. 이를 예방 및 치료하기 위해 기존에 항생제 또는 화학물질 등의 화학적 방법을 이용하여왔지만, 내성 및 부작용 등의 문제가 있어 친환경적인 방법이 필요하다. 또한, 반려동물의 이취를 제거하기 위해 시판되는 탈취제는 대부분 강한 향으로 악취를 덮는 방법으로, 근본적인 이취를 제거하지 못하므로 지효성이 있는 악취 저감 방법이 필요하다. 따라서, 본 발명에서는 반려동물의 피부질환(특히, 농피증)을 예방 및 치료하면서도 근본적인 이취를 지효적으로 저감할 수 있는 친환경적 미생물학적 제제를 개발하였다.
이에 본 발명은 암모니아성 악취 저감능 및 병원성 세균 생장 저해능을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P)을 제공한다. 또한, 본 발명은 암모니아성 악취 저감능 및 병원성 세균 생장 저해능을 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P)를 제공한다.
본 발명에서는 국내 우사(젖소 분변) 또는 김치로부터 항균능이 우수한 균주들을 분리하여 각 균체의 DNA를 추출하고, 16S rDNA 부분 염기서열을 이용하여 분석한 결과, 락토바실러스 속의 신규 균주 2종임을 밝혔으며, 이들을 각각 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23라고 명명하였다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P) 균주, 이의 배양액 또는 상등액을 포함하는 것을 특징으로 하는 암모니아성 악취 물질 분해용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P) 균주, 이의 배양액 또는 상등액을 포함하는 것을 특징으로 하는 암모니아성 악취 물질 분해용 조성물을 제공한다. 이때, 암모니아성 악취 물질 분해용 조성물은 어느 것에 사용되든 제한되지 않으나, 일예로 탈취제 등으로 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 암모니아성 악취 물질 분해용 조성물에 있어서, 본 발명의 상기 균주 2종과 이취를 저감하는데 지효적인 효과를 줄 수 있는 천연추출물을 함께 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 천연추출물은 어느 것에 제한되지는 않으나 라벤더 추출물, 페퍼민트 추출물, 로즈마리 추출물, 잣송이 추출물 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 좋으며, 바람직하게는 라벤더 추출물인 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 상기 균주 2종과 천연추출물을 각각 2:2:6으로 혼합하여 사용하는 것이 좋다. 상기 범위에서 악취 물질을 탁월하게 저감하는 효능이 탁월하게 발휘될 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 암모니아성 악취 물질은 사람을 포함한 동물에게 불쾌감을 느끼게 하는 냄새를 유발하는 물질이다. 이에 어느 것에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 암모니아, 트리메틸아민, 황화수소, 메틸머캅탄 중 선택되는 어느 하나 이상의 물질일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 암모니아, 트리메틸아민 중 선택되는 어느 하나 이상의 물질일 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P) 균주, 이의 배양액 또는 상등액을 포함하는 것을 특징으로 하는 병원성 세균 방제용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P) 균주, 이의 배양액 또는 상등액을 포함하는 것을 특징으로 하는 병원성 세균 방제용 조성물을 제공한다.
한편, 본 발명의 병원성 세균 방제용 조성물에 있어서, 상기 병원성 세균은, 동물에게 주요한 피부질환인 농피증 등을 일으키는 병원성 세균이라면 어느 것에든 제한되지는 않으나, 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.), 대장균(E.coli) 및 녹농균 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 중 선택되는 어느 하나 이상의 것일 수 있다. 이때, 상기 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.)은 바람직하게 스타필로코커스 슐레페리(Staphylococcus schleiferi), 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius) 중 선택되는 어느 하나 이상의 것일 수 있다. 이와 같이 본 발명의 병원성 세균 방제용 조성물은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P) 균주 또는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P) 균주를 이용함으로써 반려동물의 피부질환(특히, 농피증)을 해결하는데 탁월한 효능을 발휘할 수 있다.
한편, 본 발명의 병원성 세균 방제용 조성물은 어느 것에 사용되든 제한되지 않으나, 일예로 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 "방제"는 일반적으로 병원체 감염을 예방, 감소 또는 차단시키는 것을 포함하여 의미한다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 항균능이 우수한 락토바실러스 플랜타룸(
Lactobacillus plantarum
) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(
Lactobacillus casei
) EBN-KC23 분리 및 동정]
본 실시예에서는 국내의 다양한 시료로부터 항균능이 우수한 균주를 분리 및 동정하였다.
젖소 분변과 김치 샘플을 취하여 멸균된 0.85% NaCl 용액 100 ml에 샘플 1 g를 넣고 진탕배양기(150 rpm)에서 30분간 교반하여 젖소 분변과 김치에 존재하는 미생물 시료 표본을 확보하였다. 이 시료를 MRS agar 배지에 획선배양하였다. 37℃ 정치 배양기에 3일 동안 배양한 후 생성된 콜로니(colony)를 다시 MRS agar 배지에서 계대배양을 거쳐 단일 균체로 분리하였다. 분리한 단일 균주들은 각각 MRS broth 배지에서 37℃, 150 rpm 조건으로 2일 동안 배양하였다. 병원성 세균을 100 ㎕ 도말한 Nutreint agar(NA) 배지 위에 별균된 paper disc(지름 5 mm)를 플레이트(plate) 가운데 올리고 paper disc 위에 상기 배양액을 50 ㎕ 분주하였다. 대조구에는 균주를 배양하지 않은 paper disc 위에 MRS broth를 50 ㎕ 분주하였고, 모든 평판 배지는 30℃에서 1일간 정치 배양하였다. 배양 후 paper disc 주위로 clear zone이 형성된 균주를 선발하였다.
상기와 같은 방법을 통해 선별한, GJ-A20 균주와 EBN-KC23 균주를 MRS 배지에 48시간 배양하여 충남대학교 농업과학연구소에 16S rRNA 유전자 서열분석을 의뢰하였고(이를 위해 16S rDNA 서열을 이용하였고, GJ-A20 균주과 EBN-KC23의 서열정보는 각각 서열번호 1 및 2에 기재하였음), National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 등록 균주정보를 통해 99% 이상 일치하는 상동성을 갖는 균주를 찾아 확인하였다. 그 결과, GJ-A20 균주는 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)으로, EBN-KC23 균주는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)으로 동정하였다.
따라서 본 발명의 발명자들은 동정한 균주들에 대하여 국립농업과학원에 2020년 09월 23일자로 락토바실러스 플랜타룸(Bacillus subtilis) GJ-A20 (KACC 92311P)를 기탁하고, 2020년 09월 28일자로 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P)을 기탁하였다.
[실험예 1 : 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(
Lactobacillus plantarum
) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(
Lactobacillus casei
) EBN-KC23의 항균 활성 확인]
본 실험예에서는 선별된 분리 균주 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23의 항균 활성을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 하기에서는 본 발명에서 선별된 균주를 각각 GJ-A20과 EBN-KC23으로 표기하였다(이하, 모든 실험예에 해당함). 실험에 이용된 농피증 유발 병원성 세균은 농업미생물은행 (Korea Agricultural Culture Collection: KACC)에서 분양받은 스타필로코커스 슐레페리(Staphylococcus schleiferi KACC 13170)과 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에서 분양받은 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius KCTC 3344)를 사용하였다(이하, 모든 실험예에 해당함).
1) GJ-A20과 EBN-KC23 균주의 병원성 세균 생장 저해능 유무 확인을 위한 paper disc method assay
GJ-A20과 EBN-KC23 균주의 항균능 유무를 확인하기 위해 농피증 유발 병원성 세균 생장 저해 여부로 이를 판별하고자 하였고, paper disc method assay를 수행하였다.
각 균주를 MRS broth 배지에서 37℃, 150 rpm 조건으로 2일 동안 배양하였다. 병원성 세균을 100 ㎕ 도말한 Nutreint agar(NA) 배지 플레이트(plate) 위에 멸균된 papaer disc(지름 5 mm)를 올리고 paper disc 위에 상기 배양액을 50 ㎕ 분주하였다. 모든 평판 배지는 30℃에서 1일간 정치 배양하였다. 배양 후 paper disc 주위로 clear zone의 형성 여부로 항균능을 확인하였다. 그 결과, 각 균주의 배양액(GJ-A20, EBN-KC23)에 의한 스타필로코커스 슐레페리(Staphylococcus schleiferi KACC 13170) (도 1의 A)와 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius KCTC 3344) (도 1의 B)에 대한 항균능 시험결과, 두 병원성 세균에 대해 모두 우수한 항균능(생장 저해)을 나타내는 것을 확인하였다(GJ-A20은 LP, EBN-KC23은 LC로 표기).
2) 배양배지에 따른 GJ-A20과 EBN-KC23 균주의 항균능 유무 확인을 위한 paper disc method assay
배양배지에 따라 GJ-A20과 EBN-KC23 균주의 항균능 유무를 확인하기 위해 농피증 유발 병원성 세균 생장 저해 여부로 이를 판별하고자 하였고, paper disc method assay를 수행하였다.
각 균주를 표 1의 각각의 균주 배양배지에서 37℃, 150 rpm 조건으로 2일 동안 배양하였다. 병원성 세균을 100 ㎕ 도말한 Nutreint agar(NA) 배지와 Typtic soy agar(TSA) 플레이트(plate) 위에 멸균된 papaer disc(지름 5 mm)를 올리고 paper disc 위에 상기 배양액을 50 ㎕ 분주하였다. 모든 평판 배지는 30℃에서 1일간 정치 배양하였다. 배양 후 paper disc 주위로 clear zone의 형성된 크기로 항균효과를 확인하였다.
상기와 같이 각각의 균주(GJ-A20, EBN-KC23)에 의한 스타필로코커스 슐레페리(Staphylococcus schleiferi)와 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius)에 대한 항균능 시험 결과는 하기 표 1과 같았다. 이때, + 하나당 clear zone 반경 5 mm를 의미한다. 미생물을 배양시, 법적으로 동물성 원료를 포함할 수 없기에, MRS 배지에서 동물성 원료인 펩톤(peptone) 대신 소이 펩톤(soy peptone)을 사용하여도 항균 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 이로부터 배양 조건을 개선하여 Soy peptone이 포함된 실용배지에서 우수한 항균능(생장 저해)을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
균주명 | 균주 배양배지 | Staphylococcus intermedius | Staphylococcus schleiferi | ||
항균 실험배지 TSA |
항균 실험배지 NA |
항균 실험배지 TSA |
항균 실험배지 NA |
||
L. casei | MRS | +++ | +++ | ++ | +++ |
L. plantarum | + | +++ | + | +++ | |
L. casei | MRS - peptone | - | - | + | +++ |
L. plantarum | - | - | + | +++ | |
L. casei | MRS - peptone + Soy peptone |
++ | +++ | +++ | +++ |
L. plantarum | + | ++ | + | +++ | |
L. casei | MRS + NB | + | - | + | +++ |
L. plantarum | + | - | + | +++ | |
L. casei | 실용배지 + Soy peptone |
+ | ++ | + | +++ |
L. plantarum | ++ | +++ | ++ | +++ | |
L. casei | 실용배지 + NB | + | + | + | +++ |
L. plantarum | ++ | - | - | +++ |
* NB: Nutreint Broth
3) 배양시간에 따른 GJ-A20과 EBN-KC23 균주의 항균능 유무 확인을 위한 paper disc method assay
상기 항균능이 우수한 배양배지조건(실용배지+Soy peptoe)에서 배양시간에 따라 GJ-A20과 EBN-KC23 균주의 항균능 유무를 확인하고자 했다. 이를 위해 농피증 유발 병원성 세균 생장 저해 여부로 판별하였고, paper disc method assay를 수행하였다.
각 균주를 '실용배지 + 소이 펩톤(soy peptone)' 배지에서 37℃, 150 rpm 조건으로 18시간, 24시간, 48시간에 샘플링하였다. 상기 배양액과 상기 배양액을 4℃, 10,000 rpm, 15분간 원심분리하여 얻은 상등액을 이용하여 paper disc method assay를 이용하여 항균효과를 확인하였다. 상기 paper disc method assay의 구체적인 방법은 병원성 세균을 100 ㎕ 도말한 Nutreint agar(NA) 배지와 Typtic soy agar(TSA) 플레이트(plate) 위에 멸균된 papaer disc(지름 5 mm)를 올리고 paper disc 위에 상기 배양액 및 상등액을 각각 50 ㎕ 분주하였다. 모든 평판 배지는 30℃에서 1일간 정치 배양하였다. 배양 후 paper disc 주위로 clear zone의 형성된 크기로 항균효과를 확인하였다.
상기와 같이 각각의 균주(GJ-A20, EBN-KC23)에 의한 스타필로코커스 슐레페리(Staphylococcus schleiferi)와 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius)에 대한 항균능 시험 결과는 하기 표 2와 같았다. 이때, + 하나당 clear zone 반경 5 mm를 의미하며, 48시간 배양액에서 가장 우수한 항균능(생장 저해)을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
18시간 배양액 | Staphylococcus intermedius | Staphylococcus schleiferi |
L. plantarum 배양액 | +++ | +++ |
L. plantarum 상등액 | - | ++ |
L. casei 배양액 | + | ++ |
L. casei 상등액 | + | ++ |
24시간 배양액 | Staphylococcus intermedius | Staphylococcus schleiferi |
L. plantarum 배양액 | +++ | +++ |
L. plantarum 상등액 | - | +++ |
L. casei 배양액 | ++ | ++ |
L. casei 상등액 | ++ | ++ |
48시간 배양액 | Staphylococcus intermedius | Staphylococcus schleiferi |
L. plantarum 배양액 | +++ | ++++ |
L. plantarum 상등액 | +++ | ++++ |
L. casei 배양액 | ++ | +++ |
L. casei 상등액 | ++ | +++ |
[실험예 2 : 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(
Lactobacillus plantarum
) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(
Lactobacillus casei
) EBN-KC23의 병원성 세균에 대한 항균능 확인]
본 실험예에서는 선별된 분리 균주 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23의 병원성 세균(스타필로코커스 슐레페리(Staphylococcus schleiferi)와 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius))의 항균능을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 이를 위해 농피증 유발 병원성 세균 생장 저해여부로 판별하였고, paper disc method assay를 수행하였으며 방법 및 사용한 병원성 세균은 실험예 1과 동일하였다.
1) 본 발명 균주 GJ-A20 및 EBN-KC23의 배양액/상등액에 의한 병원성 세균의 항균능 확인
상기 실험예 1에서 확립한 본 발명 균주의 최적 항균능 조건(Soy peptone이 포함된 실용배지에서 48시간 배양)에 따라 배양된 GJ-A20 및 EBN-KC23 각각의 펠렛(pellet)과 상등액에 의한 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius KCTC 3344)에 대한 항균능을 시험하였다. 이때, 펠렛(pellet)은 배양액이 아닌 생리식염수로 세척한 균주를 의미하는 것으로, 균주 배양액을 원심분리(4℃, 10,000rpm, 5분)한 후 상등액은 버리고 남은 균주 pellet에 동량의 멸균한 생리식염수를 넣고 볼텍싱(vortexing)하는 과정을 3회 반복하여 얻은 시료를 사용하였다. 즉, 최종 시료 펠렛(pellet)은 생리식염수에 포함된 미생물 균체를 의미한다.
비교를 위해 라벤더 열수추출물(라벤더로 표기)과 증류수(DW로 표기)를 사용하였다. 그 결과, 도 2와 같이 GJ-A20의 상등액과 EBN-KC23의 상등액에서만 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius KCTC 3344)에 대해 항균능(생장 저해)이 나타나는 것을 확인하였다(GJ-A20은 LP, EBN-KC23은 LC로 표기).
2) 본 발명 균주 GJ-A20 및 EBN-KC23의 상등액에 의한 병원성 세균의 항균능 확인
상기 실험예 1에서 확립한 본 발명 균주의 최적 항균능 조건(Soy peptone이 포함된 실용배지에서 48시간 배양)에 따라 배양된 GJ-A20의 상등액과, EBN-KC23의 상등액을 1:1로 혼합한 조성물을 농도별(0%, 0.1%, 5%, 10%)로 처리하여 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius KCTC 3344)에 대한 항균능을 확인하였다. 이때, 스타필로코커스 인터미디어스는 2.13 X 107 CFU/ml의 양으로 영양배지(Nutrient broth)에 포함된다. 그 결과, 도 3과 같이 본 발명 균주의 상등액의 혼합 조성물을 5% 이상 처리할 시 스타필로코커스 인터미디어스에 대한 항균능(성장 저해)이 탁월한 것으로 나타났다.
[실험예 3 : 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(
Lactobacillus plantarum
) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(
Lactobacillus casei
) EBN-KC23의 균주 상등액을 포함하는 조성물의 항균능 확인]
본 실험예에서는 선별된 분리 균주 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23의 균주 상등액을 포함하는 조성물의 병원성 세균(스타필로코커스 슐레페리(Staphylococcus schleiferi)와 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius))에 대한 항균능을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 이를 위해 상기 실험예들과 동일하게 농피증 유발 병원성 세균 생장 저해여부로 판별하였다.
37℃조건의 실용배지 + 소이 펩톤(soy peptone) 배지에서 48시간 동안 배양된 각각의 균주(GJ-A20, EBN-KC23) 상등액의 1:1 혼합 조성물(A)과, 라벤더 열수추출물(B)을 여러 비율로 혼합한 혼합물에 의한 스타필로코커스 슐레페리(Staphylococcus schleiferi)와 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius)에 대한 항균능 시험 결과는 하기 표 3과 같았다. 이때, + 하나당 clear zone 반경 5 mm를 의미하며, 각각의 균주(GJ-A20, EBN-KC23) 상등액의 1:1 혼합 조성물(A)의 함량이 4 이상일 때 우수한 항균능(생장 저해)이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
A:B 비율 | Staphylococcus intermedius | Staphylococcus schleiferi |
0:10 | - | - |
1:9 | - | - |
2:8 | - | + |
3:7 | - | ++ |
4:6 | + | +++ |
5:5 | + | +++ |
6:4 | ++ | +++ |
7:3 | ++ | +++ |
8:2 | +++ | +++ |
9:1 | +++ | +++ |
[실험예 4: 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(
Lactobacillus plantarum
) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(
Lactobacillus casei
) EBN-KC23의 상등액 혼합물과 라벤더 추출물을 포함하는 조성물의 항균능 확인]
본 실험예에서는 선별된 분리 균주 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23의 상등액 혼합물과 라벤더 추출물을 포함하는 조성물의 항균능을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 이때, 상기 실험예 3에서 A 함량이 4 이상(각 균주가 2씩)이었을 때 우수한 항균능을 나타낸 것으로부터 혼합비를 2:2:6으로 설정하였다. 항균능 확인을 위해 대장균(E.coli)과, 또 다른 반려동물 피부질환 원인인 녹농균 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 생장 저해 여부로 판별하였다.
그 결과, 하기 표 4 및 도 4와 같이 상기 조성물은 대조군(BLANK)과 비교하여 두 병원성 세균에 대해 항균능(생장 저해)이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
시험 항목 |
시험결과 |
시험환경 | |||||
초기농도 (CFU/mL) |
6시간 후 농도 (CFU/mL) |
6시간 후 감소율 (%) |
24시간 후 농도 (CFU/ml) |
24시간 후 감소율 (%) |
|||
E.coli ATCC 25922 (접종농도: 2.5 x 106) |
BLANK | 2.5 x 104 | 7.5 x 105 | - | 7.8 x 105 | - | (37.0±0.2)℃ |
조성물 (2:2:6) |
2.5 x 104 | <10 | 99.9 | <10 | 99.9 | ||
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 (접종농도: 4.2 x 106) |
BLANK | 4.2 x 104 | 6.4 x 105 | - | 6.8 x 105 | - | |
조성물 (2:2:6) |
4.2 x 104 | <10 | 99.9 | <10 | 99.9 |
[실험예 5 : 본 발명 락토바실러스 플랜타룸(
Lactobacillus plantarum
) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(
Lactobacillus casei
) EBN-KC23의 상등액 혼합물과 라벤더 추출물을 포함하는 조성물의 악취 저감능 확인]
본 실험예에서는 선별된 분리 균주 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23의 상등액 혼합물과 라벤더 추출물을 포함하는 조성물의 악취 저감능을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 이때, 상기 실험예 3에서 A 함량이 4 이상(각 균주가 2씩)이었을 때 우수한 항균능을 나타낸 것으로부터 혼합비를 2:2:6으로 설정하였다.
48시간 동안 37℃ 조건의 Soy peptone이 포함된 실용배지에서 배양된 EBN-KC23 균주 상등액과, 동일한 조건에서 배양된 GJ-A20 균주 상등액 및 라벤더추출물을 2:2:6으로 혼합된 조성물 5 mL을 암모니아 10 mL, 트리메틸아민 5 mL, 황화수소 20 mL, 메틸머캅탄 20 mL가 투입된 시험용기 11L에 분무 처리 후 EL608: 2017 시험방법(환경표지 대상제품 및 인증기준 중 '탈취제', 환경부 고시 제2016-134호, P.250~251)으로 암모니아, 트리메틸아민, 황화수소, 메틸머캅탄의 농도를 분석하였다.
그 결과, 도 5와 같이 본 발명 균주가 포함된 혼합 조성물(2:2:6)은 암모니아와 트리메틸아민의 악취를 저감하는데 탁월함을 확인할 수 있었다.
본 발명의 발명자들은 동정한 균주들에 대하여 국립농업과학원에 2020년 09월 23일자로 락토바실러스 플랜타룸(Bacillus subtilis) GJ-A20 (KACC 92311P)를 기탁하고, 2020년 09월 28일자로 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P)을 기탁하였다.
기탁기관명 : 국립농업과학원
수탁번호 : KACC92311
수탁일자 : 20200923
기탁기관명 : 국립농업과학원
수탁번호 : KACC92312
수탁일자 : 20200928
<110> Ecobiznet Inc.
Gwangju Agricultural Technology Center
<120> Lactobacillus plantarum GJ-A20 and Lactobacillus casei EBN-KC23
excellent in reducing ammonia odor of companion animals and
inhibiting the growth of pathogenic microorganisms
<130> YP-20-212
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1126
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
gatggagcac gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg taaaactctg ttgttaaaga 60
agaacatatc tgagagtaac tgttcaggta ttgacggtat ttaaccagaa agccacggct 120
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg 180
cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa agccttcggc tcaaccgaag 240
aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag 300
cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta 360
actgacgctg aggctcgaaa gtatgggtag caaacaggat tagataccct ggtagtccat 420
accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg 480
cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg 540
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc tacgcgaaga accttaccag 600
gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat tagacgttcc cttcggggac atggatacag 660
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 720
gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa gttgggcact ctggtgagac tgccggtgac 780
aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 840
acgtgctaca atggatggta caacgagttg cgaactcgcg agagtaagct aatctcttaa 900
agccattctc agttcggatt gtaggctgca ctcgcctaca tgaagtcgga atcgctagta 960
atcgcggatc agcatgccgc ggtgaataac gttccgggcc tgtacacacc gcccgttcac 1020
acaatgagag tttgtacacc aaagtcgtgg ggtaccttta ggacagcgga ctaggtggac 1080
agatgattaa ggggtgagtc gtacaacggc taacccgata aaagtc 1126
<210> 2
<211> 1131
<212> DNA
<213> Lactobacillus casei
<400> 2
acgagcagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag gctttcgggt cgtaaaactc 60
tgttgttgga gaagaatggt cggcagagta actgttgtcg gcgtgacggt atccaaccag 120
aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc 180
ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccctcg 240
gcttaaccga ggaagcgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa 300
ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct 360
gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc 420
ctggtagtcc atgccgtaaa cgatgaatgc taggtgttgg agggtttccg cccttcagtg 480
ccgcagctaa cgcattaagc attccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa 540
ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 600
gaaccttacc aggtcttgac atcttttgat cacctgagag atcaggtttc cccttcgggg 660
gcaaaatgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 720
cccgcaacga gcgcaaccct tatgactagt tgcacagcat tgagttgggc actctagtaa 780
gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 840
acctgggcta cacacgtgct acaatggatg gtacaacgag ttgcgagacc gcgaggtcaa 900
gctaatctct taaagccatt ctcagttcgg actgtaggct gcaactcgcc tacacgaagt 960
cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1020
acacgcccgt cacaccatga gagttgtaca cccgagcgtg cgtacccttt aggagcgagc 1080
gtctagtggg acaaatgatt aggtgaagtc gtaccaaggg taaccgttaa a 1131
Claims (6)
- 삭제
- 삭제
- 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P) 균주, 이의 배양액 또는 상등액;
락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P) 균주, 이의 배양액 또는 상등액; 및
라벤더 추출물을 포함하며,
암모니아 및 트리메틸아민 중 하나 이상의 암모니아성 악취 물질 분해 효과가 있는 것을 특징으로 하는 암모니아성 악취 물질 분해용 반려동물 탈취제.
- 삭제
- 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) GJ-A20 (KACC 92311P) 균주, 이의 배양액 또는 상등액; 및
락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) EBN-KC23 (KACC 92312P) 균주, 이의 배양액 또는 상등액;을 포함하며,
스타필로코커스 슐레페리(Staphylococcus schleiferi) 또는 스타필로코커스 인터미디어스(Staphylococcus intermedius) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 병원성 세균에 대해 방제효과가 있는 것을 특징으로 하는 농피증 예방 또는 치료용 조성물.
- 제5항에 있어서,
라벤더 추출물을 더욱 포함하며,
대장균(E.coli) 또는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 병원성 세균에 대해 방제효과가 더욱 있는 것을 특징으로 하는 농피증 예방 또는 치료용 조성물.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200189241A KR102268010B1 (ko) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 반려동물의 암모니아성 악취 저감능 및 병원성 세균 생장 저해능이 뛰어난 락토바실러스 플랜타룸 gj-a20 및 락토바실러스 카제이 ebn-kc23 |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020200189241A KR102268010B1 (ko) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 반려동물의 암모니아성 악취 저감능 및 병원성 세균 생장 저해능이 뛰어난 락토바실러스 플랜타룸 gj-a20 및 락토바실러스 카제이 ebn-kc23 |
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KR1020200189241A KR102268010B1 (ko) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 반려동물의 암모니아성 악취 저감능 및 병원성 세균 생장 저해능이 뛰어난 락토바실러스 플랜타룸 gj-a20 및 락토바실러스 카제이 ebn-kc23 |
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR101734140B1 (ko) * | 2016-10-04 | 2017-05-11 | 주식회사 엠투원 | 항균 효과를 갖는 탈취 조성물 및 그 제조방법 |
KR20190081655A (ko) | 2017-12-29 | 2019-07-09 | 주식회사 에코제로 | 반려동물로 인한 특이취의 근원을 제거하고 진정 및 완화효과가 있는 반려동물용 탈취제 |
-
2020
- 2020-12-31 KR KR1020200189241A patent/KR102268010B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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---|---|---|---|---|
KR101734140B1 (ko) * | 2016-10-04 | 2017-05-11 | 주식회사 엠투원 | 항균 효과를 갖는 탈취 조성물 및 그 제조방법 |
KR20190081655A (ko) | 2017-12-29 | 2019-07-09 | 주식회사 에코제로 | 반려동물로 인한 특이취의 근원을 제거하고 진정 및 완화효과가 있는 반려동물용 탈취제 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
대한민국 등록특허 제10-1806130호 (등록일자: 2017.12.08.)에는, 항균 및 항산화 활성이 있는 락토바실러스 카제이 아종 람노수스 에스엔티피 01(Lactobacillus casei subsp. rhamnosus SNTP01, 기탁번호: KACC 91057)과 로즈마리 추출물, 녹차 추출물로 구성되어지는 것을 특징으로 하는 돼지고기 가공 제품의 선도 유지용 보존료 조성물에 대해 기재되어 있다. |
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Legal Events
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E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |