KR102265378B1

KR102265378B1 - 치과 조직 재생용 이식체의 제조방법

Info

Publication number: KR102265378B1
Application number: KR1020180121744A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 문호진; 이정환
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2021-06-16
Also published as: US20200138676A1; KR20200041558A

Abstract

본 발명은 트리칼슘 실리케이트 분말 및 디칼슘 실리케이트 분말을 포함하는 치과용 시멘트 조성물, 트리칼슘 실리케이트 분말 및 디칼슘 실리케이트 분말을 포함하는 조직 재생용 이식체의 제조방법 및 트리칼슘 실리케이트 분말 및 디칼슘 실리케이트 분말을 포함하는 치과용 시멘트 제조용 키트에 관한 것이다.

Description

치과 조직 재생용 이식체의 제조방법{Method of manufacturing an implant for regenerating dental tissue}

포틀랜드 시멘트를 기반으로 개발된 미네랄 트리옥사이드 골재 (Mineral trioxide aggregate; MTA)는 트리칼슘 실리케이트 (tricalcium silicate; C3S), 디칼슘 실리케이트 (dicalcium silicate; C2S) 및 트리칼슘 알루미네이트 (tricalcium aluminate; C3A)의 세 가지 주요 무기 성분으로 구성되어 있으며, 치과용 재생 시멘트로 유망한 재료이다. 칼슘 실리케이트계 시멘트인 MTA는 뛰어난 치과용 생체 재생 잠재력, 생체 활성, 밀폐 능력 및 생체 적합성으로 인해 치과 병원에서 널리 사용되었다.

MTA는 기본적으로 포틀랜드 시멘트로부터 독성 금속 복합체를 제거하여 제조되는 것이 일반적이므로, 포틀랜드 시멘트와 MTA의 세포 독성은 비스무트 산화물 (20 ~ 25 %)을 제외하고는 비슷한 조성으로 차이가 없다. 비소, 크롬 및 납과 같은 미량 원소는 포틀랜드 시멘트보다 MTA가 낮았으므로 MTA는 보다 우수한 증식 및 재생 능력을 나타내었다. 그러나 마그네슘, 철, 비소, 크롬 및 납과 같은 중금속 원소가 MTA의 독성의 원인으로 제기되었으며, 이러한 불필요한 요소를 배제하기 위해 많은 노력이 있었다.

다만, MTA에서 각 구성 요소의 정확한 역할에 대해서는 거의 알려지지 않았다. 특히, 알루미늄 이온을 방출할 수 있는 MTA의 주요 성분 중 하나인 C3A의 독성 효과에 대해서는 자세히 조사되지 않았다.

이러한 문제점을 해결하고자 노력한 결과, 본 발명의 발명자들은 기존과는 상이한 제조방법으로 이식체를 제조함으로써 경화 시간을 현저하게 감축시킬 수 있으며, 독성이 감소된 이식체를 고안하였다.

한국 등록특허 10-1829994

본 발명의 하나의 목적은 개별 입자가 평균 30 내지 60 ㎛의 직경을 갖는 트리칼슘 실리케이트(tricalcium silicate; C3S), 디칼슘 실리케이트(dicalcium silicate; C2S) 또는 둘 모두를 포함하는 치과용 시멘트 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 트리칼슘 실리케이트 분말을 준비하는 제1-1단계; 디칼슘 실리케이트 분말을 준비하는 제1-2단계; 상기 제1-1단계에서 준비한 분말, 제1-2단계에서 준비한 분말 또는 이들 혼합물에 수용성 용매를 첨가하여 경화시키는 제2단계;를 포함하는 조직 재생용 이식체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 트리칼슘 실리케이트 분말, 디칼슘 실리케이트 분말 또는 둘 모두를 포함하는 치과용 시멘트 제조용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 발명자들은 기존 MTA의 독성 문제를 해결하기 위하여 MTA의 3가지 성분을 개별적으로 합성한 다음, 다양한 조성으로 혼합한 조성물을 제조하고 이로부터 제조되는 이식체의 성질을 분석하여 각 성분의 함량에 따른 영향을 확인하였다. 그 결과, 특히 C3A가 경화 시간을 단축시키는 주된 인자이나, 시험관 내 및 생체 내에서 중대한 독성을 일으킨다는 것을 발견하였다. 이에 본 발명은 C3A의 함량을 최소화하면서 경화시간을 단축시킬 수 있는 조성 및/또는 이러한 조성물의 제조방법을 발굴하고자 고안된 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명의 제 1양태는 개별 입자가 평균 30 내지 60 ㎛의 직경을 갖는 트리칼슘 실리케이트(tricalcium silicate; C3S), 디칼슘 실리케이트(dicalcium silicate; C2S) 또는 둘 모두를 포함하는 치과용 시멘트 조성물을 제공한다.

본 발명의 치과용 시멘트 조성물은 트리칼슘 알루미네이트(tricalcium aluminate; C3A)를 추가로 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 트리칼슘 알루미네이트는 평균 30 내지 60 ㎛의 직경을 가질 수 있고, 상기 트리칼슘 알루미네이트는 총 조성물 중량의 0 초과 25 중량% 이하일 수 있다.

본 발명의 치과용 시멘트 조성물의 상기 트리칼슘 실리케이트는 구체적으로 총 조성물 중량의 45 내지 100 중량%일 수 있고, 더욱 구체적으로는 45 내지 85 중량%일 수 있다. 또한, 상기 디칼슘 실리케이트는 구체적으로 총 조성물 중량의 5 내지 100 중량%일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 5 내지 45 중량%일 수 있다.

본 발명의 치과용 시멘트 조성물의 총 조성물 중량 기준으로 더욱 바람직하게 상기 트리칼슘 실리케이트는 45 내지 85 중량% 및 상기 디칼슘 실리케이트는 5 내지 45 중량%일 수 있다.

본 발명의 치과용 시멘트 조성물은 치과 재생용 생체 재료로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "시멘트"란, 분말형 고체상 및 액상의 혼합으로 얻은 골 대체재로서 사용 가능한 페이스트의 경화체를 의미한다.

상기 시멘트의 "경화 또는 시멘테이션"은 실온 혹은 체온에서 인위적인 처리 없이 행해진 페이스트의 자발적 경화를 의미하며, 이때의 페이스트는 고체상과 액상을 혼합한 결과로 얻어진 것일 수 있다.

본 발명의 제2양태는 트리칼슘 실리케이트 분말을 준비하는 제1-1단계; 디칼슘 실리케이트 분말을 준비하는 제1-2단계; 상기 제1-1단계에서 준비한 분말, 제1-2단계에서 준비한 분말 또는 이들 혼합물에 수용성 용매를 첨가하여 경화시키는 제2단계;를 포함하는 조직 재생용 이식체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 조직 재생용 이식체의 제조방법에서 전체 분말을 기준으로 상기 트리칼슘 실리케이트 분말은 구체적으로 45 내지 100%중량일 수 있고, 더욱 구체적으로 45 내지 85 중량%일 수 있으며, 상기 디칼슘 실리케이트 분말은 구체적으로 5 내지 100 중량%일 수 있고, 더욱 구체적으로 5 내지 45 중량%일 수 있다.

본 발명의 조직 재생용 이식체의 제조방법에서 상기 제2단계에 앞서 트리칼슘 알루미네이트 분말을 준비하는 제1-3단계를 추가로 포함하고, 제2단계의 분말의 혼합물에 트리칼슘 알루미네이트 분말을 추가로 포함하여 제2단계를 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 트리칼슘 알루미네이트 분말은 전체 분말을 기준으로 0 초과 25 중량% 이하일 수 있다.

상기 트리칼슘 실리케이트 분말, 상기 디칼슘 실리케이트 분말 및 상기 트리칼슘 알루미네이트 분말은 졸-겔 공정에 의해 준비될 수 있으며, 본 발명에서는 졸-겔 공정, 소성 및 열-처리에 의해 제조되었다. 또한, 구체적으로 개별 분말의 입자는 평균 30 내지 60 ㎛의 직경일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 40 내지 50 ㎛일 수 있다.

본 발명의 조직 재생용 이식체의 제조방법의 제2단계에서 사용된 용매/분말 비율(L/P)은 구체적으로 0.2 내지 0.4일 수 있다. 이 때, L/P가 0.4 초과이면 혼합이 수행되지 않고, L/P가 0.2 미만이면 너무 묽어서 경화가 진행되지 않는다.

본 발명의 조직 재생용 이식체의 제조방법은 경화 시간이 단축되는 장점이 있고, 구체적으로 상기 이식체가 경화되는 시간은 1분 내지 50분일 수 있고, 더욱 구체적으로는 10분 내지 40분일 수 있다.

본 발명의 조직 재생용 이식체의 제조방법에서의 상기 이식체는 치과 재생용일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어 "조직 재생용 이식체"는 조직 결손 또는 손상부에 이식되어 이를 충진 또는 보충할 수 있는 것을 의미하며, 조직을 재생을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 제조방법은 종래의 제조방법과는 다르게 상기 트리칼슘 실리케이트 분말, 상기 디칼슘 실리케이트 분말 및 상기 트리칼슘 알루미네이트 분말을 각각 제조하여 혼합함으로써, 종래 치과 조직 재생용 시멘트 소재로 사용되는 MTA와 비교하여 기존의 물성은 유지하지만 경화 시간이 현저하게 단축되고, 부가적인 독성 물질이 없어 독성이 감소된 이식체를 제공할 수 있다.

본 발명의 제3양태는 트리칼슘 실리케이트 분말, 디칼슘 실리케이트 분말 또는 둘 모두를 포함하는, 치과용 시멘트 제조용 키트를 제공한다.

본 발명의 치과용 시멘트 제조용 키트는 트리칼슘 알루미네이트 분말, 수용성 용매 또는 둘 모두를 더 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 분말이 개별적으로 제공되거나, 전체 분말을 기준으로 구체적으로 45 내지 100중량%, 더욱 구체적으로는 45 내지 85 중량%의 상기 트리칼슘 실리케이트 분말, 구체적으로 5 내지 100중량%, 더욱 구체적으로는 5 내지 45 중량%의 상기 디칼슘 실리케이트 분말 및 0 초과 25 중량% 이하의 상기 트리칼슘 알루미네이트 분말의 혼합물로 제공될 수 있다.

상기 키트는 사용 직전에 액상에 분말상을 혼합하여 페이스트 형태로 시멘트 조성물을 제조한 후 원하는 시술 부위에 상기 페이스트를 주입하여 사용할 수 있다. 또는 상기 페이스트를 주입하여 원하는 형태로 시멘트를 제조한 후에 사용할 수도 있다.

상기 시술 시 주사기를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 생물학적 단백질, 약물 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 생물학적 단백질은 소혈청 알부민, 라이소자임, 성장인자 등이고 약물을 항생제, 염증제 등을 예로 들 수 있다.

본 발명의 치과용 시멘트 조성물은 빠른 시간 내에 경화 가능하며 치아형성 분화 및 혈관신생을 촉진하여 시술 후 빠른 치수조직 재생을 유도할 수 있는 특징을 갖는다.

본 발명의 키트는 조직공학에서 치수 조직의 수리 및 재생을 위한 주사 시스템에 응용되어 치수조직 결함의 치료와 관련되어 치과 치료 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 치과용 시멘트 조성물은 종래 치과 조직 재생용 시멘트 소재로 사용되는 MTA와 유사한 함량의 동일한 성분으로 된 조성물임에도 불구하고 이를 구성하는 3개 성분 즉, 트리칼슘 실리케이트 분말, 디칼슘 실리케이트 분말 및 트리칼슘 알루미네이트 분말을 개별입자로 제조하여 혼합하는 제조방법 상의 차이로 이식체 제조시 경화시간이 현저히 단축된 효과를 나타내며, 나아가 C3A를 불포함 또는 이의 함량을 최소화함으로써 물성은 유지하되 독성이 감소된 이식체를 제공할 수 있다.

도 1은 MTA, C3S, C2S 및 C3A 분말의 결정 구조, 형태 및 크기 분포를 분석하기 위해 수행한 (a) XRD, (b) SEM 및 (c) 레이저 회절 분석의 결과이다.
도 2는 본 발명에서 제조한 14종의 시멘트의 조성을 표로 나타낸 결과이다.
도 3은 시멘트 14종의 경화 시간을 나타낸 결과이다.
도 4는 DW에서 시멘트 14종의 배양 시간에 따른 pH 변화를 측정한 결과이다.
도 5는 PBS에서 시멘트 14종의 배양 시간에 따른 pH 변화를 측정한 결과이다.
도 6은 SBF 용액에서 압축 강도를 측정한 결과이다.
도 7은 SBF 용액에서 직경의 인장 강도를 측정한 결과이다.
도 8은 rMSCs에 대한 14 종의 시멘트 추출액의 세포 적합성을 나타낸 결과이다.
도 9의 (a)는 생체 내 실험을 위한 시멘트의 조성을 표로 나타낸 결과이고, (b)는 시멘트의 생체 적합성 평가를 위하여 시멘트로 뿌리-끝을 채운 후 래트의 앞니를 의도적으로 이식한 모식도를 나타낸 결과이며, (c)는 이식 4주 후 μCT의 이미지를 나타낸 결과이다.
도 10은 이식 4주 후의 H&E 염색 이미지를 나타낸 결과이고, 파선 사각형은 배율 부위 (C: 시멘트, AB: 치조골, T: 발달 치아)를 표시한 것이다.

이하，본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐，실시예 에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 칼슘 분말의 합성

C3S, C2S 및 C3A는 종래 기술에 따라 모두 졸-겔 공정, 하소 (calcination) 및 열-처리에 의해 각각 제조되었다.

C3S 분말의 제조를 위해, 0.3 M의 질산 칼슘 4수화물 (calcium nitrate tetrahydrate)을 70% 에탄올, 5% 폴리에틸렌 글리콜 (Mw 10000), 1% 1 M 염산, 및 0.1 M의 테트라에틸 오쏘실리케이트 (TEOS)로 이루어진 용액에 첨가하여 60 ℃에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합 용액이 겔화가 발생할 때까지 70 ℃에서 유지시키고, 1일 동안 120 ℃에서 건조시켰다. 500 ℃에서 1시간, 1200 ℃에서 3시간 동안 하소시킨 후, 분쇄하여 1450 ℃에서 8시간, 10시간 동안 열처리하였다. 수득한 분말을 분쇄한 후, 45-㎛ 체를 사용하여 체질하여 C3S 분말을 제조하였다.

C2S 분말의 경우, 0.2 M의 질산 칼슘 4수화물을 첨가한 점, 1000 ℃에서 열처리 한 점을 제외하고는 상기 C3S 분말의 제조와 동일한 방법으로 C2S 분말을 제조하였다.

C3A 분말의 제조를 위해, 0.2 M의 aluminium nitrate nonhydrate 및 0.3 M의 질산 칼슘 4수화물을 5 wt%의 폴리비닐 알코올(PVA)을 함유한 증류수(DW)에 첨가하고 5시간 동안 혼합하였다. 60 ℃에서 2일 동안 유지시켜 겔을 수득한 후, 120 ℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 이를 분쇄한 후, 500 ℃에서 1시간 동안 열-처리시키고 다시 분쇄하고 1350 ℃에서 열-처리하였다. 수득한 분말을 분쇄한 후, 45-㎛ 체를 사용하여 체질하여 C3A 분말을 제조하였다. ProRoot®MTA 및 산화 비스무트 (bismuth oxide)를 대조군으로 특성화하였다.

실험예 1: 제조된 분말의 분석

상기 제조된 C3S, C2S 및 C3A 분말의 결정 구조를 X-선 회절 (XRD,　Ultima　IV, Rigaku,　Japan)로 분석하였다. 2 kV와 40 mA에서 Cu Kα1 선을 사용하여 2θ=10~80°의 회절 범위에서 2° min^-1 의 속도와 0.02°의 스텝 폭으로 분말을 스캔하였다.

도 1의 (a)는 각 분말의 JCPDS 카드와 일치하는 각 분말 (C3S, C2S 및 C3A)과 산화 비스무스의 전형적인 XRD 피크를 보여주었고, MTA는 C3S, C2S, C3A 및 산화 비스무스로부터의 조합의 피크를 갖는 것으로 나타났다.

각 분말의 형태를 가속 전압 10 kV에서 SEM (JEOL-JSM 6510, Tokyo, Japan)에 의해 분석하였다. 또한, 입자 크기 분석기 (Malvern　Mastersizer　MS2000, Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 분말 크기 분포를 분석하였다. 50 ml의 에탄올과 50 ㎍의 C3S, C2S, C3A 및 ProRoot®MTA로 현탁액을 제조하였다. MTA, C3S, C2S 및 C3A의 D50 (누적 50%의 지름)을 분말의 대표적인 크기로 결정하였다.

SEM 결과는 모든 분말에서 수십 마이크로 미터의 불규칙 형상의 분말을 나타냈다(도 1의 (b)). 각각의 분말 (MTA, C3S, C2S 및 C3A)의 평균 크기 (D50, 직경의 누적 50 % 지점)는 레이저 회절에 의해 각각 9.0, 22.6, 8.4 및 12.0 ㎛로 결정되었고, 이들은 45 ㎛ 공극으로 분쇄 및 체질하기 때문에 서로 비교가 가능하다(도 1의(c)).

실시예 2 : 치과용 시멘트의 제조

상기 제조된 C3S 분말, C2S 분말 또는 C3A 분말에 수용성 용매인 DW (Distilled water)를 첨가한 후 교반하여 경화시켜 시멘트를 제조하였다. 이 때, 용매/분말 비율(L/P)을 0.3으로 하여 10종의 시멘트를 제조하였다.

C3S, C2S, C3A 및 ProRoot®MTA 각각의 단일 구성으로 제조하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 4종의 시멘트를 제조하였다.

상기 총 14종의 시멘트에 대한 구성 성분을 도 2에 3진의 그래프로 나타내었다.

실험예 2: 물리적 특성의 측정

경화 시간을 ISO 6876 (100 g, Ømm Gilmore needle)로 직경 10 mm, 높이 2 mm의 테플론 몰드를 사용하여 측정하였다. 혼합 후 2분 이내에 100% 습도 및 37 ℃에서 항온 수 욕조에 보관하였다. 1.0 mm/min의 속도로 5초 동안 시료를 유지시키고 중량 100 g 및 직경 2 mm의 길모어(Gilmore) 니들로 초기 경화 시간을 측정하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 초기 시간은 MTA 시멘트에서 가장 길었고(150 ± 5 분), C3A만으로 구성된 시멘트(13)에서 가장 짧았다(1 ± 0.2 분). 이는 C3A의 첨가가 C3S 및 C2S를 신속하게 경화시키기 때문인 것으로 판단된다. 3개의 파우더 혼합물 (0% C3A (1, 2, 3) > 10% C3A (4, 5, 6, 7) > 20% C3A (8,9,10))로 구성된 시멘트에서 C3A의 양이 증가함에 따라 경화 시간이 감소하는 것을 알 수 있었다. 이는 알루미늄 이온과 칼슘 실리카 분말 사이의 빠른 결합으로 인한 것이다.

혼합 후의 pH 변화를 측정하기 위하여, L/P 비가 0.3으로 혼합된 시료를 직경 6 mm 및 높이 2 mm로 제조하였고, 37 ℃의 온도 및 100% 습도에서 3시간 동안 보존시켰다. 각 시료를 10 ml의 DW와 10 ml의 인산염 완충액 (PBS: Phosphate buffered saline)에 넣었다. pH는 0, 20, 30, 60, 120, 240, 480, 1440, 2880 및 5760분에 pH-미터 (Orion 3 star, Thermo Scientific, Singapore)로 측정하였다.

3 시간 동안 혼합 한 후, 시료를 DW (pH 5.9) 또는 PBS (pH 7.3)에 넣고 최대 4 일 동안 pH의 변화를 측정하였다. DW에서 pH의 변화는 모든 시멘트에서 유사하였고, 20 분 이내에 pH 9 내지 10으로 급격한 증가를 보였으며, 8 시간 후에 pH 11 내지 12 정도의 플래토가 되었다(도 4). PBS에서 측정 된 각 샘플의 pH 변화는 DW의 pH 변화와는 다르게, pH가 크게 증가하지 않았고 시멘트(1)을 제외하고 2 시간까지 약 7.5 내지 8.5의 pH를 유지하였다(도 5). 2 일 후, 모든 시멘트는 시멘트(10)을 제외하고 PBS에서 pH 10을 초과하였다. 4 일째, MTA, C3S, C2S 및 C3A를 포함한 모든 시멘트는 시멘트(3) (C3S:C2S=60:40)을 제외하고 11 미만의 pH 값을 나타냈다. 분말 종류에 따른 시멘트의 수화 과정 중의 하이드록실 이온의 방출 및 분말과 추출 용액이 혼합된 액체로 인해 MTA 또는 3 가지 분말(C3S, C2S 및 C3A)의 혼합물의 pH 값이 8 내지 13의 범위를 나타내는 것을 알 수 있었다.

실험예 3: 기계적 특성의 측정

압축 강도 실험을 위해, 0.3의 L/P 비로 2분 동안 혼합하여 직경 4 mm 및 높이 6 mm의 원통형 시료를 제조하였다. 직경의 인장 강도 실험을 위해, 0.3의 L/P 비로 2분 동안 혼합하여 직경 6 mm 및 높이 4 mm의 디스크 시료를 제조하였다. 그 후, 이전 프로토콜에 따라 37 ℃의 온도 및 100% 상대 습도에서 1, 7, 14 및 28일 동안, 시료를 모의 채액 (SBF)에서 항온 처리 한 후에 범용 시험기 (Instron 3344; Instron Corp, Canton, MA, USA)를 0.5 mm/min의 교차 헤드 속도로 사용하여 압축 강도 및 직경의 인장 강도를 측정하였다.

모든 시멘트에서 배양 시간이 증가함에 따라 기계적 특성이 향상되었으며, 배양 1 일째와 비교하여 최대 강도는 2 내지 4 배가 증가하였다(도 6 및 도 7).

실험예 4: 세포 적합성 평가

래트 간엽 줄기 세포 (rMSC)를 5주령 수컷 쥐의 대퇴골과 경골 골수에서 수집하였다. rMSC를 3계대로 배양하였다. 총 1000개의 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 세포 부착을 위해 24시간 동안 배양하였다. 각각의 디스크로부터 용출된 용액 (50 % 및 100 %)을 10ml의 보충 배지 (10 % FBS 및 1 % Pen-Strep를 함유하는 DMEM)에 넣고 각 웰에 적용하고 37 ℃에서 3일 동안 배양하였다. 용리액 없이 배양 배지에서 배양된 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포 증식은 제조사 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.)의 지시에 따라 세포 계수 키트-8 (CCK-8)을 사용하여 측정하였다. 각 배양 시간의 끝에, 10 ㎕의 CCK-8 용액을 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 각 시료의 흡광도는 마이크로 플레이트 (iMark, BioRad)를 사용하여 파장 450 nm에서 측정하였다. 각 시료를 4번 반복하여 실험하였고, 결과를 대조군의 배양 배지 값으로 표준화하였다.

공-배양 24 시간 후, C3A만으로 된 시멘트(13)을 제외한 모든 시멘트에서 세포 대조군과 비교하여 120 % 이상의 세포 생존력이 관찰되었고, 이는 유의한 증가였다(도 8, P <0.05). 알루미늄을 함유한 C3A만으로 구성된 시멘트(13)는 유의하게 경미한 세포 독성(약 60 %, P <0.05)을 보였으나, 20 % C3A (시멘트(8), 시멘트(9), 시멘트(10))를 포함한 시멘트는 세포 독성을 나타내지 않고 세포 생존력을 증가시켰다.

실험예 5: 생체 내 이식 후 생체 적합성 평가

동물에 대한 모든 실험 과정은 단국대학교의 동물 관리 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았다(승인 DKU-13-031). 350 내지 400 g 무게의 총 36마리의 수컷인, 11 주령의 Sprague-Dawley 래트를 사용하였다. 각 래트에 80 mg/kg의 Zoletil과 10 mg/kg의 xylazine을 사용하여 오른쪽 대퇴 사두근에 근육 내 주사하였다. Lidocaine (0.5 %)을 상악골의 premaxilla 치은에 국소 주사하였다. 래트를 등 지느러미 위치에 놓고 수술 부위의 무균 수술을 위해 10 % 포비돈 요오드와 70 % 에틸 알코올로 소독하였다. 모든 도구는 수술 전에 멸균되었으며 4번의 모든 절차는 이전 의도적 주입 방법에 따라 무균적으로 수행하였다. 래트를 20 내지 24 ℃, 30 내지 70 %의 상대 습도에서 12 시간 낮과 12 시간 야간 주기로 방에 보관하였다. 쥐에게 분쇄된 펠렛 음식과 물로 구성된 표준식이를 먹였다. 주변 조직의 샘플링을 위해 수술 후 4주에 래트를 희생시켰다. 수술 후 4 주에 각 동물로부터 표본을 수확하고, 샘플을 10 % 중성 완충 포름알데하이드 용액에 적어도 24 내지 48 시간 동안 고정시켰다. 샘플은 조직 회복을 평가하기 위해 in vivo 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 시스템 (Skyscan 1176, Skyscan, Aartselaar, Belgium)과 NRecon μCT Skyscan 재구성 소프트웨어를 사용하여 재구성하였다. Exakt technique (Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany)을 사용하여 현장에서 시편의 절단되지 않은 절삭 및 절편을 준비하였다. 수지 블록 시편은 절치의 긴 축을 따라 2개 반으로 절단하였다. 200 ㎛의 초기 절단 단면은 약 25 ㎛까지 연마되었다. 광학 현미경 (IX71, Olympus, Tokyo, Japan) 및 MetaMorph®소프트웨어 (Molecular Devices, USA)를 사용하여 haematoxylin과 eosin (H & E) 염색 조직의 조직학을 평가하였다.

MTA의 생체 적합성에 대해 면밀히 조사하기 위해 기존의 MTA와 유사한 조성을 가진 시멘트와 MTA 조성물(C2S, C3S 또는 C3A)의 단일 성분을 시멘트로 뿌리 끝을 채운 후, 치아를 의도적으로 이식하는 데 사용하였다. 추출된 치아의 연속 가공, 근관의 정점 부분에서 근관의 전체 펄프 조직 제거, 각각의 시멘트를 비어있는 근관에 복강 충전하고 추출된 부위에 치아를 재주입하는 것을 시멘트(2), 시멘트(5), 시멘트(6), 시멘트(9), C3S, C2S, C3A 및 MTA 각각으로 구성된 시멘트를 사용하여 수행하였다(도 9의 (a)).

이 생체 내 모델은 MTA가 치아 뿌리의 정점 병변에 MTA의 임상 적용을 모방한 것으로, MTA는 조직 재생을 위해 조직을 직접 접촉한다. 도 9의 (c)의 μCT 그림에 따르면, C3A만으로 구성된 시멘트(13)에서 빨간색 화살표는 재료-조직 계면에서의 얇은 방사선 비투과성 선이 파괴되었음을 나타내고, 파선 직사각형은 치아 주변의 치조골을 나타내며 파손되었음을 알 수 있다. 즉, 치아 정점 아래의 치조골 (점 사각형)뿐만 아니라 근위 정점 (백색 화살표)의 경조직 층의 파괴를 보였으나, 다른 시멘트와 치조골은 방사선 비투과성 뼈와 같은 층에 의해 분리되었다. 시멘트와 생체 조직 계면의 얇은 경조직 층은 이식된 물질의 생체 활성을 나타냈다.

MTA는 시멘트와 치조골 사이의 계면에 보존된 얇은 방사선 비투과성 층으로 상당한 방사선 비투과성 (더 많은 흰색)을 나타내었다.

따라서 얇은 층의 조성 및 염증 반응을 확인하기 위해 H&E 염색을 수행하고, 조직 절편을 관찰하였다. MTA는 유의한 염증반응 없이 치조골 가까이에 위치하였다(도 10, MTT). 도 10에서 점선으로 표시된 검은 선은 심각한 염증 반응으로 치아 끝을 둘러싸고 있는 치조골의 파괴를 나타낸 결과이다. 즉, C3A으로만 구성된 시멘트(13)에서 정점의 염증 반응은 매우 심하여 재료와 손상되지 않은 치근단(peri-apical) 병변 및 이식된 재료 아래의 주변 치조골을 분리하는 얇은 경조직 층이 파괴되었다(도 10). 다른 시멘트는 계면에서 얇은 osteo-dentin과 같은 층을 발견하였고, 시멘트의 생체 활성을 확인할 수 있었다.

Claims

개별 입자가 평균 30 내지 60 ㎛의 직경을 갖는 트리칼슘 실리케이트(tricalcium silicate; C3S), 디칼슘 실리케이트(dicalcium silicate; C2S) 또는 둘 모두로 이루어진 분말; 및 용매를 포함하는, 치과용 시멘트 조성물로서, 상기 치과용 시멘트가 경화되는 시간은 10분 내지 40분이고,
상기 분말은 트리칼슘 알루미네이트(C3A)를 포함하지 않고,
상기 용매와 상기 분말에 대하여, 용매/분말 비율은 0.2 내지 0.4인, 치과용 시멘트 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 트리칼슘 실리케이트는 총 조성물 중량의 45 내지 100 중량%로 포함된 것인, 시멘트 조성물.
제1항에 있어서, 상기 디칼슘 실리케이트는 총 조성물 중량의 5 내지 100 중량%로 포함된 것인, 시멘트 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 치과 재생용 생체 재료로 사용되는 것인, 시멘트 조성물.
트리칼슘 실리케이트 분말을 준비하는 제1-1단계;
디칼슘 실리케이트 분말을 준비하는 제1-2단계;
상기 제1-1단계에서 준비한 분말, 제1-2단계에서 준비한 분말 또는 이들 혼합물에 수용성 용매를 첨가하여 경화시키는 제2단계;를 포함하고,
상기 제2단계에서 사용된 용매/분말 비율(L/P)은 0.2 내지 0.4이며,
상기 제2단계는 10분 내지 40분간 수행되고,
상기 트리칼슘 실리케이트 분말 및 상기 디칼슘 실리케이트 분말의 입자는 평균 30 내지 60 ㎛의 직경을 갖고,
상기 제2단계에서 사용되는 분말은 트리칼슘 알루미네이트(C3A)를 포함하지 않는, 조직 재생용 이식체의 제조방법.
제6항에 있어서, 전체 분말을 기준으로 상기 트리칼슘 실리케이트 분말은 45 내지 85 중량% 및 상기 디칼슘 실리케이트 분말은 5 내지 45 중량%인, 제조방법.
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제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 이식체는 치과 재생용인 것인, 제조방법.
트리칼슘 실리케이트 분말, 디칼슘 실리케이트 분말 또는 둘 모두로 이루어진 분말; 및 용매를 포함하는, 치과용 시멘트 제조용 키트로서, 상기 트리칼슘 실리케이트 분말 및 상기 디칼슘 실리케이트 분말의 입자는 평균 30 내지 60 ㎛의 직경이며, 상기 치과용 시멘트가 경화되는 시간은 10분 내지 40분이고, 트리칼슘 알루미네이트(C3A)를 포함하지 않고, 상기 용매와 상기 분말에 대하여 용매/분말 비율은 0.2 내지 0.4인, 키트.
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