KR102250380B1 - 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 조성물 - Google Patents
꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 조성물에 관한 것으로, 꾸지뽕나무 캘러스 추출물이 자외선 조사에 의해 유발되는 세포 사멸을 억제하고, 자외선 조사에 의해 감소된 프로-콜라겐 타입 Ⅰ 및 Ⅲ(pro-collagen type Ⅰ, Ⅲ)의 발현을 증가시키며, 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1, 2 및 3의 합성을 현저히 감소시키는 효과가 있으므로, 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 자외선에 의한 피부 손상을 예방 및 개선하기 위한 기능성 화장품 또는 건강기능식품의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 조성물에 관한 것이다.
현대 사회에 크게 영향을 주고 있는 '웰빙' 추구 현상은 '잘 먹고 잘 살자'라는 일차적인 의미뿐만 아니라 '신체의 건강함이 피부의 아름다움으로 표현된다'라는 의미까지 내포하고 있다. 이러한 현상은 피부미용 분야에도 많이 나타나고 있으며, 피부미용을 위한 접근은 이제 단편적인 효능을 추구하는 것에서 벗어나 복합적인 기능과 과학적인 접근을 필요로 하고 있다.
피부노화는 크게 두 종류로 나눌 수 있다. 그 중 하나는 내인성 노화(intrinsic aging)로서 세월이 흘러감에 따라 피할 수 없는 노화 현상을 말한다. 두 번째는 광노화(photoaging)로서 오랫동안 햇빛에 노출된 얼굴, 손등, 목 뒤 등의 피부에서 관찰되는 노화현상을 말하는 것으로, 내인성 노화 현상과 자외선에 의한 영향이 합쳐진 결과로 발생한다.
모공은 얼굴 피부에 전체적으로 분포하나, 특히 코와 볼 부위는 육안으로 식별할 수 있고, 모공의 양상은 성별, 유전적, 노화, 여드름, 만성 자외선 노출 등의 내인성과 외인성 요인에 의해 개인차가 있다. 모공이 넓어지는 이유는 피지가 과도하게 분비되거나 피부노화가 시작되면서 모공 벽을 지지하고 있던 콜라겐 섬유와 탄력 섬유가 변성, 감소함에 따라 피부 탄력이 없어지고 쳐지기 때문이다.
이러한 피부 노화의 원인은 콜라겐 및 탄력섬유 등의 기질 단백질이 손상되어 피부 내 콜라겐의 양이 부족해지고, 탄력 섬유가 변성되어 나타난다고 알려져 있다. 또한, 피부 노화가 진행되는 과정 중에는 다양한 신호전달 경로를 거쳐 콜라겐의 합성이 감소되고, 콜라겐을 비롯한 세포 외 기질 단백질의 분해 효소인 매트릭스 메탈로프로테아나제(matrix metalloproteinases: MMPs)의 발현이 증가된다고 알려졌다. 이와 같이 콜라겐은 피부노화와 관련된 주요 인자로 인식되어져 있으며, 콜라겐의 합성 증진 및 분해 억제는 피부노화 억제 및 피부미용과 관련하여 중요한 지표가 되고 있다.
이렇듯 콜라겐 합성을 증진하고, 그 분해를 억제하여 피부 미용을 개선하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있으며, 특히, 화합물에 비하여 상대적으로 피부에 대한 안정성이 뛰어난 천연물이 관심을 받고 있다.
한편, 꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata)는 뽕나무과에 속하는 낙엽성 소교목 또는 관목으로서 우리나라의 전라도, 경상도, 충남지방과 중국, 일본 등지에 자생하는 식물이다. 꾸지뽕나무는 높이가 약 6m로 자라며 열매는 식용이고 뽕나무와 닮은 모양을 가진다. 동의보감에 따르면 꾸지뽕나무는 신경통, 피부질환, 습진 및 타박상을 치료하는데 사용되어졌다.
천연물 유래 성분의 자외선에 대한 피부 보호 효과와 관련된 선행기술로는 한국등록특허 제0734040호에 진저롤을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1718190호에 줄의관말 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 세포 보호용 또는 치료용 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 조성물에 관해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 제공하고, 상기 꾸지뽕나무 캘러스 추출물의 자외선 손상에 의한 세포 보호 효과 및 주름개선 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 손상 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 조성물에 관한 것으로, 꾸지뽕나무 캘러스 추출물은 자외선 조사에 의해 유발되는 세포 사멸을 억제하고, 자외선 조사에 의해 감소된 프로-콜라겐 타입 Ⅰ 및 Ⅲ(pro-collagen type Ⅰ, Ⅲ)의 발현을 증가시키며, 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1, 2 및 3의 합성을 현저히 감소시키는 효과가 있다.
도 1은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물의 세포 독성을 확인한 결과이다. Blank는 무처리 대조군이고, NAC(아세틸시스테인, N-Acetyl-L-Cysteine)는 양성대조군이다.
도 2는 꾸지뽕나무 캘러스 추출물의 자외선 조사에 의한 세포 사멸 억제능을 확인한 결과이다. Blank는 무처리 대조군이고, CON은 자외선 조사 후 아무것도 처리하지 않은 대조군이며, NAC(아세틸시스테인, N-Acetyl-L-Cysteine)는 자외선 조사 후 NAC를 처리한 양성대조군이다. ***은 Blank에 비해 CON의 세포 생존율이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다. ###은 CON에 비해 NAC 또는 꾸지뽕나무 캘러스 추출물 처리군의 세포 생존율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
도 3은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물 처리시, 자외선 조사에 의해 유도된 프로-콜라겐 타입 Ⅰ(A) 및 MMP-1(B)의 발현 변화를 확인한 결과이다. Blank는 무처리 대조군이고, CON은 자외선 조사 후 아무것도 처리하지 않은 대조군이고, NAC(아세틸시스테인, N-Acetyl-L-Cysteine)는 자외선 조사 후 NAC를 처리한 양성대조군이다. ***은 Blank에 비해 CON의 프로-콜라겐 타입 Ⅰ의 발현이 통계적으로 유의미하게 감소 또는 MMP-1의 발현이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다. ###은 CON에 비해 NAC 또는 꾸지뽕나무 캘러스 추출물 처리군의 프로-콜라겐 타입 Ⅰ의 발현이 통계적으로 유의미하게 증가 또는 MMP-1의 발현이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
도 4는 꾸지뽕나무 캘러스 추출물 처리시, 자외선 조사에 의해 유도된 프로-콜라겐 타입 Ⅰ(COL-1), Ⅲ(COL-3)(A) 및 MMP-1, 2, 3(B) 단백질의 발현 정도를 확인한 결과이다. Blank는 무처리 대조군이고, CON은 자외선 조사 후 아무것도 처리하지 않은 대조군이고, NAC(아세틸시스테인, N-Acetyl-L-Cysteine)는 자외선 조사 후 NAC를 처리한 양성대조군이다.
도 2는 꾸지뽕나무 캘러스 추출물의 자외선 조사에 의한 세포 사멸 억제능을 확인한 결과이다. Blank는 무처리 대조군이고, CON은 자외선 조사 후 아무것도 처리하지 않은 대조군이며, NAC(아세틸시스테인, N-Acetyl-L-Cysteine)는 자외선 조사 후 NAC를 처리한 양성대조군이다. ***은 Blank에 비해 CON의 세포 생존율이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다. ###은 CON에 비해 NAC 또는 꾸지뽕나무 캘러스 추출물 처리군의 세포 생존율이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
도 3은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물 처리시, 자외선 조사에 의해 유도된 프로-콜라겐 타입 Ⅰ(A) 및 MMP-1(B)의 발현 변화를 확인한 결과이다. Blank는 무처리 대조군이고, CON은 자외선 조사 후 아무것도 처리하지 않은 대조군이고, NAC(아세틸시스테인, N-Acetyl-L-Cysteine)는 자외선 조사 후 NAC를 처리한 양성대조군이다. ***은 Blank에 비해 CON의 프로-콜라겐 타입 Ⅰ의 발현이 통계적으로 유의미하게 감소 또는 MMP-1의 발현이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다. ###은 CON에 비해 NAC 또는 꾸지뽕나무 캘러스 추출물 처리군의 프로-콜라겐 타입 Ⅰ의 발현이 통계적으로 유의미하게 증가 또는 MMP-1의 발현이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 의미하며, p<0.001이다.
도 4는 꾸지뽕나무 캘러스 추출물 처리시, 자외선 조사에 의해 유도된 프로-콜라겐 타입 Ⅰ(COL-1), Ⅲ(COL-3)(A) 및 MMP-1, 2, 3(B) 단백질의 발현 정도를 확인한 결과이다. Blank는 무처리 대조군이고, CON은 자외선 조사 후 아무것도 처리하지 않은 대조군이고, NAC(아세틸시스테인, N-Acetyl-L-Cysteine)는 자외선 조사 후 NAC를 처리한 양성대조군이다.
본 발명은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 꾸지뽕나무 캘러스는 꾸지뽕나무 잎, 줄기, 엽병, 뿌리, 접합자배 등으로부터 형성시킬 수 있고, 캘러스 형성 부위에 특별한 제한은 없으나, 꾸지뽕나무 접합자배 절편을 사용하여 캘러스를 형성하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 꾸지뽕나무 접합자배 절편을 1~5%(w/v) 수크로스(sucrose), 0.2~0.6%(w/v) 겔라이트(gelrite), 3~7mg/L 티아민(thiamine), 3~7mg/L 니코틴산(nicotinic acid), 0.2~0.7mg/L 피리독신염산염(pyridoxine HCl), 800~1200mg/L 미오이노시톨(myo-inositol) 및 식물생장조절제로 0.3~0.7mg/L 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), 1~3mg/L 4-CPA(4-Cholorophenoxy Acetic Acid) 및 0.05~0.15mg/L의 키네틴(kinetin)이 첨가된 SH(Schenk & Hidebrandt) 배지를 이용하여 형성시킬 수 있으며, 더욱더 바람직하게는 꾸지뽕나무 접합자배 절편을 3%(w/v) 수크로스(sucrose), 0.4%(w/v) 겔라이트(gelrite), 5mg/L 티아민(thiamine), 5mg/L 니코틴산(nicotinic acid), 0.5mg/L 피리독신염산염(pyridoxine HCl), 1000mg/L 미오이노시톨(myo-inositol) 및 식물생장조절제로 0.5mg/L 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), 2mg/L 4-CPA 및 0.1mg/L의 키네틴(kinetin)이 첨가된 SH 배지를 이용하여 형성시키는 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 용어 '접합자배'는 유성생식에서 암수 배우자의 접합에 의해 형성되는 배를 의미한다.
상기 꾸지뽕나무 캘러스 추출물의 추출 용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있고, 바람직하게는 에탄올인 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 자외선에 의한 섬유아세포의 사멸을 억제하고, 자외선에 의해 감소된 프로-콜라겐 타입 Ⅰ 및 Ⅲ의 발현을 증가시키고, 자외선에 의해 증가된 MMP-1, 2 및 3의 발현을 감소시킨다.
상기 자외선에 대한 피부 보호는 보습, 주름개선 및 탄력증진 중에서 선택된 하나 이상의 작용에 의해 피부 보호 효과가 나타나고, 자외선에 대한 피부 손상으로부터 피부를 보호함으로써, 자외선에 의한 피부 노화인 광노화를 예방 또는 개선할 수 있다.
본 발명의 용어 '광노화'는 많은 양의 자외선을 자주, 오랜 기간 쪼여서 피부에 주름이 생기는 현상으로, 피부가 거칠어지고, 탄력이 떨어지며 건조해져 두꺼운 가죽과 같이 된다. 더불어 주근깨, 기미, 잡티와 같은 색소침착이 일어나기도 하며, 피부의 모세 혈관이 늘어나 피부가 붉어지기도 한다.
본 발명의 일 구현 예에서, 본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있고, 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
또한, 본 발명은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 손상 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 장기간 섭취하는 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없는 범위 내에서 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1. 꾸지뽕나무 캘러스 추출물의 제조
꾸지뽕나무 식물체의 기내 배양 체계 확립을 통한 식물세포주 개발을 위하여 국내에서 채집한 꾸지뽕나무 시료를 준비하였다. 기내 배양을 위한 무균 시료를 확보하기 위해 채집한 꾸지뽕나무 식물체의 오염 물질을 제거 후 흐르는 물에서 30분~1시간 동안 세척한 후 물기를 제거하고 접합자배(zygotic embryo)를 자른 후, 유리 배양병에 넣고, 70%(v/v) 에탄올 용액에서 1분 동안 흔들어 주면서 소독한 후, 멸균수로 1~2회 세척하고 상업용 하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 0.4~0.8%(v/v)로 희석한 용액에 넣고 잘 흔들어 주면서 20분 동안 표면살균을 실시하여 무균 시료를 준비하였다.
표면살균이 이루어진 꾸지뽕나무 시료는 살균된 여과지로 남아 있는 수분을 제거한 다음 무균작업대 내에서 가로 세로 1cm 내외의 적절한 크기로 절취하여 절편들을 준비한 다음 미리 준비한 배양 배지에 10개 씩 3반복으로 치상하여 25℃, 암조건에서 배양하였다.
배양 배지는 사전 실험 결과, 캘러스 유도 효율이 우수한 SH 배지(Schenk and Hildebrandt, 1972)에 3%(w/v) 수크로스(sucrose), 0.4%(w/v) 겔라이트(gelrite), 5mg/L 티아민(thiamine), 5mg/L 니코틴산(nicotinic acid), 0.5mg/L 피리독신염산염(pyridoxine HCl), 1000mg/L 미오이노시톨(myo-inositol) 및 식물생장조절제로 0.5mg/L 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), 2mg/L 4-CPA 및 0.1mg/L의 키네틴(kinetin)이 첨가된 배지를 120℃에서 15분간 멸균 후 배양에 사용하였다.
꾸지뽕나무 식물체 절편 시료들은 배양개시 2주후부터 조직 절단면에서 팽창이 이루어지면서 백색의 캘러스가 형성되기 시작하였다. 4주 배양 후에는 백색 캘러스의 증식과 함께 구조물의 크기 신장이 이루어지면서 크기가 약 1mm 정도에 이르렀다. 6주 후에는 형성된 다수의 캘러스들이 더욱 증식이 활발해지는 것을 관찰하였다. 상기 캘러스는 동일 조성의 새로운 배지에 4주 주기로 계대배양하여 꾸지뽕나무 접합자배 유래 식물세포주(BP1345726, 이하, 꾸지뽕나무 캘러스라 칭함)를 확보하였다(KCTC No. PC4367).
그 후, 꾸지뽕나무 캘러스를 건조한 후 분말화한 다음, 상기 꾸지뽕나무 캘러스 건조분말 50mg에 100% 에탄올 3.5mL을 첨가한 후, 실온(25±5℃)에서 1시간 동안 초음파 처리하여 추출하였다. 꾸지뽕나무 캘러스 에탄올 추출물은 5,000rpm으로 10℃에서 5분 동안 원심분리하였고, 상등액을 취해 질소농축기를 이용하여 농축한 다음 시료로 사용하였다.
실시예 1. 꾸지뽕나무 캘러스 추출물의 세포 독성 및 자외선 조사에 의한 세포 보호효과 확인
인간 섬유아세포주인 Hs68(CRL-1635) 세포는 ATCC(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Gibco, Grand Isaland, NY)에 10%(v/v) 소 태아 혈청(fetal bovine serum, Gibco, Grand Isaland, NY)과 1%(v/v) 페니실린(penicillin)을 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
상기 배양된 Hs68 세포에서 꾸지뽕나무 캘러스 에탄올 추출물의 세포 독성 및 자외선 조사에 의한 세포 보호효과를 확인하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-biphenyl tetrazolium bromide) 분석을 진행하였다.
세포를 1×104 cells/mL로 96 웰 세포 배양 용기에 분주한 후 24시간 동안 배양하여 안정화한 후, 혈청이 결핍된 DMEM 배지로 교체한 다음 24시간 동안 배양하여 세포주기를 동일화하였다. 그 후, 꾸지뽕나무 캘러스 에탄올 추출물을 농도별(100, 250, 500 및 1000㎍/mL)로 24시간 동안 처리한 후, PBS로 두 번 세척한 다음 소량의 PBS를 넣고 UV 크로스링커(crosslinker, Analytik Jena AG, Jena, Germany)를 이용하여 UVB 100mJ/㎠를 조사하였다. 자외선 조사 직후 농도별 꾸지뽕나무 캘러스 에탄올 추출물을 함유한 혈청이 결핍된 DMEM 배지를 넣어 주고 24시간 동안 배양시켰다. 대조군 세포는 UVB 조사 없이 혈청이 결핍된 동일 조건의 배지를 적용하였다. 그 후, 5mg/mL 농도의 MTT 시약을 각 웰에 넣고 4시간 동안 배양한 다음 상등액을 제거하고, 100㎕ DMSO(dimethyl sulfoxide)를 넣어 포르마잔(formazan) 결정체를 용해 후, 마이크로플레이트 리더기(microplate reader, Multiskan Go, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 590nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 1000㎍/mL의 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 처리하였을 경우에도 세포 독성이 나타나지 않았다.
세포 독성이 나타나지 않는 범위 내에서 자외선 조사에 의한 세포 보호 효과를 확인한 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 자외선 조사에 의해 감소된 세포 생존율은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물 처리시 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 꾸지뽕나무 캘러스 추출물은 자외선 조사에 의한 세포 손상으로부터 피부 세포를 보호할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 꾸지뽕나무 캘러스 추출물의 주름개선 효과(프로-콜라겐 타입 Ⅰ 및 MMP-1 발현 변화)
피부 결합력 및 탄력성에 연관이 있는 프로-콜라겐(pro-collagen)은 콜라겐의 구성성분으로 섬유아세포(fibroblast)에서 합성된다. 자외선 노출로 인한 피부 광노화의 경우 타입 Ⅰ과 Ⅲ 콜라겐의 감소가 가속화되고, 콜라겐의 파괴는 MMPs에 의해 일어나며, 피부노화와 직접적인 관련이 있는 MMP-1(matrix metalloproteinases-1) 및 MMP-3은 자외선에 의해 증가하는 것으로 보고되었다.
따라서 본 발명에서 자외선에 의한 피부 손상으로부터 유도된 프로-콜라겐 타입 I과 MMP-1의 발현이 어떻게 변화하는지를 섬유아세포 상등액에서 인간 MMP-1 및 인간 프로-콜라겐 타입 Ⅰ ELISA kit(Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여 측정하였다. 섬유아세포 상등액은 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리 하였으며, 실험은 제조사의 지침에 준하여 진행하였다.
그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 UVB 조사에 의해 억제된 프로-콜라겐 타입 Ⅰ의 함량은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 처리시 농도 의존적으로 증가하였다. 한편, 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1의 발현은 꾸지뽕나무 캘러스 에탄올 추출물의 처리에 의해 효과적으로 억제되었다.
실시예 3. 꾸지뽕나무 캘러스 추출물의 주름개선 효과(세포내 프로-콜라겐 및 MMPs 단백질 발현 변화)
자외선에 의해 유도되는 세포내 신호전달 과정에 관련된 프로-콜라겐 단백질과 MMP 효소들을 웨스턴 블랏 분석을 진행하였다.
세포에 차가운 RIPA 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1%(v/v) NP-40, 0.5%(w/v) sodium deoxycholate, 0.1%(w/v) SDS, 1mM sodium orthovandate, 120mM sodium chloride, 1mM phenylmethylsulfonyl floride, 10㎍/mL leupeptin, 1㎍/mL aprotonin)를 넣어 용해시킨 후 10,000Xg에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하였다.
단백질 정량 후, 동일한 양의 단백질(20㎍/mL)을 SDS-폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel)을 사용하여 전기영동 후 PVDF 멤브레인(Bio-Rad Lab., Hercules, CA, USA)에 트랜스퍼(transfer)하였다. 0.1%(v/v) Tween 20을 함유하는 5%(w/v) 탈지유(skim milk, PBST) 용액에서 1시간 동안 비특이적 결합 부위(non-specific binding site)를 블로킹(blocking)한 뒤, 1차 항체[MMPs, COLs (Cell Signaling, Beverly, MA)]로 16시간 이상(overnight) 반응시키고, 1차 항체에 상응하는 2차 항체로 상온에서 2시간 반응시킨 후, ECL 솔루션을 이용하여 단백질 발현량을 측정하였다(amersham imager 600; GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 UVB 조사에 의해 억제된 프로-콜라겐 타입 Ⅰ 및 Ⅲ의 단백질 함량은 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 100~500㎍/mL의 농도로 처리시 농도 의존적으로 증가하였다. 한편, 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1, 2 및 3의 발현은 꾸지뽕나무 캘러스 에탄올 추출물의 처리에 의해 효과적으로 억제되었다.
따라서 상기 결과로부터 꾸지뽕나무 캘러스 에탄올 추출물에 의해 MMP 단백질 발현이 감소되며, 콜라겐 섬유가 보호되는 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
Claims (6)
- 꾸지뽕나무 접합자배 절편을 1~5%(w/v) 수크로스(sucrose), 0.2~0.6%(w/v) 겔라이트(gelrite), 3~7mg/L 티아민(thiamine), 3~7mg/L 니코틴산(nicotinic acid), 0.2~0.7mg/L 피리독신염산염(pyridoxine HCl), 800~1200mg/L 미오이노시톨(myo-inositol) 및 식물생장조절제로 0.3~0.7mg/L 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), 1~3mg/L 4-CPA 및 0.05~0.15mg/L의 키네틴(kinetin)이 첨가된 SH 배지를 이용하여 형성시킨 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 꾸지뽕나무 캘러스 추출물의 추출 용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 자외선에 의한 섬유아세포의 사멸을 억제하고, 프로-콜라겐 타입 Ⅰ 및 Ⅲ의 발현을 증진시키며, MMP-1, 2 및 3의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 피부 보호는 보습, 주름개선 및 탄력증진 중에서 선택된 하나 이상의 효과에 의해 나타나는 것을 특징으로 하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물.
- 꾸지뽕나무 접합자배 절편을 1~5%(w/v) 수크로스(sucrose), 0.2~0.6%(w/v) 겔라이트(gelrite), 3~7mg/L 티아민(thiamine), 3~7mg/L 니코틴산(nicotinic acid), 0.2~0.7mg/L 피리독신염산염(pyridoxine HCl), 800~1200mg/L 미오이노시톨(myo-inositol) 및 식물생장조절제로 0.3~0.7mg/L 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), 1~3mg/L 4-CPA 및 0.05~0.15mg/L의 키네틴(kinetin)이 첨가된 SH 배지를 이용하여 형성시킨 꾸지뽕나무 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부 손상 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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