KR102249424B1 - 미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미세조류 심바이오디니움 속(genus Symbiodinium spp.)으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물 및 그 제조방법을 제공한다.
본 발명의 실시 예에 따르면, 본 발명은 미세조류 심바이오디니움 속을 배양하여 대량 생산한 뒤 이를 이용하여 자외선 흡수 능력이 뛰어난 미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물을 확보함으로써, 피부에 무거운 느낌 또는 잔여물에 의한 이물감을 주지 않으면서 동시에 자극성 피부염, 접촉 피부염, 광 알레르기성 피부염 등의 피부 자극이나 알레르기 반응 및 독성 등과 같이 부작용이 없는 천연소재의 자외선 차단제 주요성분으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
또한, 자외선 차단 효과가 우수하고, 피부에 자극이 적어 일상생활에서의 자외선 차단 방지에 탁월한 효과가 있으며, 기능성 화장품 소재 및 신소재를 개발하고 고부가가치의 제품을 통하여 산업적으로 이용범위를 확대시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물 및 그 제조방법 {UV Protection Composition Containing An Active Ingredient Extracted From genus Symbiodinium spp. And Its Manufacturing Method}

본 발명은 미세조류 심바이오디니움 속(genus Symbiodinium spp.)으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 광독성이나 세포독성 등이 없고 자외선 흡수 능력이 뛰어나서 자외선 차단제의 주요 성분으로 이용될 수 있을 뿐만 아니라 산호초와 공생함으로써 산호초를 보호하는 미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 피부노화는 나이가 들면서 일어나는 내인성 노화와 환경요인에 장기간 노출되어 나타나는 광노화로 크게 나누어진다. 광노화의 환경적인 요인 중 가장 주요한 것은 자외선 노출에 의한 것이다. 그렇기에 자외선으로부터 피부를 보호하는 것은 광노화를 막는데 중요한 역할을 한다.

자외선 차단제의 종류로는 화학적 자외선 차단제(Chemical sunscreen agent)와 물리적 자외선 차단제(Physical sunscreen agent)가 있는데 화학적 자외선 차단제는 주로 일광의 흡수를 통해서, 물리적 자외선 차단제는 반사 및 산란을 통해 일광의 침투를 막는다.

물리적 또는 화학적 자외선 차단제품의 성능은 통상 자외선차단지수(Sun Protection Factor, SPF)로 표시된다. 구체적으로 자외선차단지수는 UV B에 대한 차단효과를 나타내는 지수로 자외선 차단제품을 도포하지 않은 부위에 UV B를 조사하여 얻은 최소홍반량(Minimum Erythemal Dose; MED)을 자외선 차단제품을 사용하여 얻은 최소홍반량으로 나눈 상대값이다. 최소홍반량은 UV B를 사람의 피부에 조사하여 1,624 시간 경과 후에 조사영역의 거의 대부분에 홍반이 나타나게 되는 최소한의 자외선량을 말한다.

반면, UV A를 조사하여 24 시간 경과 후 조사 영역의 전 영역에 기본적으로 희미한 흑화가 인식되는 최소 자외선 조사량을 최소 지속형즉시흑화량(Minial Persistent Pigment darkening Dose; MPPD)이라 한다. 이때 제품 도포부위와 무도포부위의 MPPD 비를 자외선 A 차단지수(Protection Factor of UV A; PFA)라 한다. 자외선 A 차단등급(PA)는 UV A 차단효과의 정도를 나타내는 지수이다.

화학적 자외선 차단제들은 자외선을 흡수하는 성분이 한 개 이상 함유되어 있는 데, 자외선 B를 주로 막는 PABA, PABA esters(Amyl dimethyl PABA, octyl dimethyl PABA), Cinnamates(Cinoxate), Salicylate(Homomenthyl salicylate), Camphor 등과, 자외선 A를 주로 막는 Benzophenone(Oxybenzone, Dioxybenzone, Suliso benzene), Dibenzoyl methane, Anthranilate 등이 알려져 있다. 이러한 화학적 자외선 차단제들은 자외선을 흡수 차단하는 효과를 얻을 수 있으나 피부나 눈에 자극이 되고 피부의 광과민성 반응하는 등의 문제점이 보고되었고 최근에는 산호의 백화현상의 원인으로 지적되어 하와이와 팔라우 등에서 사용이 금지되고 있다.

물리적 자외선 차단제는 자연에 존재하는 성분들로서 피부에 침투하는 자외선을 반사와 산란하여 피부를 보호한다. 이산화티탄(Titanium dioxide), 탈크(Talc; Magnesium silicate), 산화마그네슘(Magnesium oxide), 산화 아연(Zinz oxide), 카올린(Kaolin) 등이 있다. 물리적 자외선 차단제는 자외선 A와 B 모두의 자외선 차단 효과를 실현할 수 있고 접촉성 피부염 같은 부작용이 없고 물에 잘 지워지지 않는 장점도 있는 반면 원하는 제형을 실현하면서 유효한 함유량을 유지하기 어렵고, 피부에 도포 시에 백탁현상 등이 나타나는 단점이 있다.

기존의 유기 혹은 무기 자외선 차단소재들은 화장품 제형 내에서 일정량 이상 포함 시 안정성이 떨어진다거나 피부트러블이 생기는 등 다양한 문제를 안고 있으며, 자외선 차단제의 안전성 및 유효성 그리고 안정성은 화장품의 중요한 화두이다. 화장품의 특성상 자외선으로부터 피부를 보호하는 자외선 차단화장품의 경우, 자외선 차단역할을 할 수 있는 소재가 자연친화적이며, 친환경, 피부적합도가 높으면서 그리고 또한, 소비자의 감성을 자극시킬 수 있는 보다 다양한 형태의 소재개발이 필요한 실정이다. 자외선 차단 소재의 경우도 최근 자연친화적이면서 친환경적인 식물소재에서 찾고자하는 움직임이 활발하며, 특히 유럽에서 식물소재에서 추출된 성분들을 Eco-CERT같은 인증을 통해 소비자하게 Natural Cosmetics 혹은 Organic Cosmetics으로 소비자에게 친근히 다가가고자하는 노력이 돋보인다.

육상식물 중에 자외선 조사에 대한 방어기작의 일환으로 갈릭산, 카페익산 등의 Flavonoid 계통의 색소와 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판과 퓨린 및 피리미딘 계열의 방향족 화합물 합성을 유도하는 경우가 있는데, 해양식물은 육상식물에 비해 상대적으로 자외선의 직접적인 영향을 받으며, 그로 인해 해양생물은 자외선 보호 관련된 물질이 많이 함유되어 있다. 특히 자외선 빛에 대한 방어를 위해 자외선을 흡수시키는 마이코스포린-유사아미노산들(mycosporine-like amino acids; MAAs)이 알려져 있다. MAAs는 남조류, 균류, 미세조류 및 해조류 등 널리 분포되어 있으며, 특히, 미세조류와 해조류에서 그 함량이 높다. 자외선 흡수 스펙트럼을 연구한 결과 MAAs 물질이 310-360nm 영역의 파장을 효과적으로 흡수한다는 것이 알려졌다. MAAs는 cyclohexenone과 cyclohexenimine chromophore가 아미노산의 질소치환기 또는 imino alcohol과 결합되어 있는 구조이며, 아미노산과 imino alcohol기 종류에 따라 porphyra, shinorine, palythine, asterine 등 20여 종으로 나눠진다. 또한 MAAs는 색깔을 띠지 않고, 물에 잘 녹는 400Da 전후의 작은 분자량을 가지는 것으로 알려져 있다. 또한, 본 발명에 사용한 미세조류 심바이오디니움 속(genus Symbiodinium spp.)은 산호초류 뿐만 아니라 말미잘, 해파리, 조개, 해면, 원생동물 등 광범위한 해양생물들과 공생하기 때문에 최근 하와이 및 괌 등의 관광지의 해변에서 발생되는 해양환경과 생태계 파괴의 주요 요인인 자외선 차단제들에 함유된 선블록(Sun Block) 원료들을 대체할 수 있는 새로운 방안으로 제시되고 있다.

따라서 피부에 무거운 느낌 또는 잔여물에 의한 이물감을 주지 않으면서 동시에 자극성 피부염, 접촉 피부염, 광 알레르기성 피부염 등의 피부 자극이나 알레르기 반응 및 독성 등과 같이 부작용이 없는 친환경 자외선 차단제용 천연 소재의 개발이 절실히 요구되고 있다.

대한민국등록특허 제10-1552010호(등록일 2015.09.03) 대한민국등록특허 제10-1856480호(등록일 2018.05.03)

본 발명은 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서,

본 발명의 목적은 광독성이나 세포독성 등이 없고 자외선 흡수 능력이 뛰어나서 자외선 차단제의 주요 성분으로 이용될 수 있는 미세조류 심바이오디니움 속(genus Symbiodinium spp.)으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 제공되는 본 발명의 일 관점에 따른 자외선 차단용 조성물은 미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 미세조류 심바이오디니움 속은 f/2배지에서 일정기간 배양한 다음 광생물 반응기의 액체배지에서 일정기간 배양하여 건조된 것을 사용하거나, 건조 후 조세된 것을 사용하며, 추출용매를 이용하여 유효성분의 추출물을 추출하는 것을 특징으로 한다.

상기 추출용매는 물, 알코올, 물과 알코올의 혼합용매 중 선택되는 어느 하나가 사용되는 것을 특징으로 하고, 상기 물과 알코올의 혼합용매는 알코올 대 물의 부피비가 1 : 9 내지 9 : 1 인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 알코올 대 물의 부피비가 4 : 1 인 것을 특징으로 한다.

상기 유효성분의 추출물을 여과하고, 280 내지 400㎚의 자외선 파장을 흡수하는 추출 분획물을 수득한 다음 상기 추출 분획물을 소수성 상호 칼럼으로 1차 정제하고, 크기배제칼럼으로 2차 정제하여 농축 및 건조시킨 것을 특징으로 한다.

상기 농축 및 건조된 유효성분의 추출물을 마그네틱 비드가 분산된 콜로이드용액에 넣고 상기 유효성분 추출물의 특정성분이 비드와 결합하게 한 다음 자기장을 이용하여 비드를 분리시키는 ABT(Affinity Bid Technology) 기술을 적용시켜 유효성분을 추출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 관점에 따른 자외선 차단용 조성물 제조방법은 미세조류 심바이오디니움 속을 배양하는 S10단계; 상기 배양된 미세조류 심바이오디니움 속을 건조하여 조쇄하는 S20단계; 상기 조세된 미세조류 심바이오디니움 속에 추출용매를 첨가하고 소정의 온도를 유지하여 유효성분이 함유된 추출물 수용액을 제조하는 S30단계; 상기 추출물 수용액을 여과하여 유효성분이 함유된 상등액과 잔여 고형물을 분리하는 S40단계; 상기 분리된 상등액을 물-알코올 농도 구배로 전개시키고, 전개된 상등액 중 280∼400nm의 자외선 파장을 흡수하는 추출 분획물을 수득하는 S50단계; 상기 추출 분획물을 소수성 상호칼럼으로 1차 정제하고, 크기 배제 칼럼으로 2차 정제하는 S60단계; 상기 2차 정제 추출물을 농축하고 건조시켜 고형화된 정제 추출물을 수득하는 S70단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

이에 더하여, 상기 S70단계 이후에는 고형화된 정제 추출물을 마그네틱 비드가 분산된 콜로이드용액에 넣고 상기 정제 추출물의 특정성분이 비드와 결합하게 한 다음 자기장을 이용하여 비드를 분리시키는 ABT(Affinity Bid Technology) 기술을 적용시켜 유효성분을 추출하는 S80단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시 예에 따르면, 본 발명은 미세조류 심바이오디니움 속(genus Symbiodinium spp.)을 배양하여 대량 생산한 뒤 이를 이용하여 자외선 흡수 능력이 뛰어난 미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물을 확보함으로써, 피부에 무거운 느낌 또는 잔여물에 의한 이물감을 주지 않으면서 동시에 자극성 피부염, 접촉 피부염, 광 알레르기성 피부염 등의 피부 자극이나 알레르기 반응 및 독성 등과 같이 부작용이 없는 천연소재의 자외선 차단제 주요성분으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

또한, 자외선 차단 효과가 우수하고, 피부에 자극이 적어 일상생활에서의 자외선 차단 방지에 탁월한 효과가 있으며, 기능성 화장품 소재 및 신소재를 개발하고 고부가가치의 제품을 통하여 산업적으로 이용범위를 확대시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물의 제조 방법을 도시한 공정도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물에서 광생물 반응기에 심바이오디니움 속을 배양한 사진이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 미세조류 심바이오디니움 속의 유효성분을 ABT(Affinity Bid Technology)기술을 적용하여 추출하는 과정을 설명하기 위한 개념도를 나타낸다.
도 4는 인간 적혈구 세포를 이용한 광용혈 시험법에 따른 조추출물과 정제추출물의 광독성 실험 결과를 타나낸 그래프이다.
도 5는 자외선 차단용 조추출물의 농도가 500ug/ml 일 때의 인간 적혈구 세포를 이용한 광용혈 시험법에 따른 광독성 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 자외선 차단용 2차 정제추출물의 농도가 250ug/ml 일 때의 인간 적혈구 세포를 이용한 광용혈 시험법에 따른 광독성 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 자외선 차단용 추출물의 Hairless mouse를 이용한 자외선 차단성능을 나타낸 사진이다.
도 8은 자외선 감지 카메라로 촬영한 자외선 차단용 추출물이 함유된 크림 도포 전후 사진이다.

이하의 본 발명에 대한 상세한 설명들은 본 발명이 실시될 수 있는 실시 예이고 해당 실시 예에 대한 예시로써 도시된 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시 예는 당업자가 본 발명을 실시하기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시 예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일실시 예에 관련하여 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시 예로 구현될 수 있다. 또한 각각의 기재된 실시 예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다.

따라서 후술되는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 적절하게 설명된다면 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.

본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

발명의 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다. 또한 명세서에 기재된 "…부", "…모듈" 등의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미하며, 이는 하드웨어 또는 소프트웨어로 구현되거나 하드웨어와 소프트웨어의 결합으로 구현될 수 있다.

도 1을 참고로 하여 본 발명의 일실시예에 따른 미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물 및 그 제조방법을 설명한다.

본 발명의 일 관점에 따른 자외선 차단용 조성물은 미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유한다.

여기서, 미세조류 심바이오디니움 속은 f/2배지에서 일정기간 배양한 다음 광생물 반응기의 액체배지에서 일정기간 배양하여 건조된 것을 사용하거나, 건조 후 조세된 것을 사용하며, 추출용매를 이용하여 유효성분의 추출물을 추출한다.

<실시 예 1> 미세조류 심바이오디니움 속의 배양

도 2에 도시된 바와 같이 심바이오디니움 속은 한국해양연구원(KORDI)로부터 입수하였으며, 멸균된 해수(Seawater)를 이용하여 f/2 Medium (Guillard and Ryther 1962, Guillard 1975)를 제조하였다. 배양은 무균적으로 배양된 심바이오디니움 속을 f/2배지에서 2∼3주의 일정기간 간격으로 계대 배양하였다. 이후, 광생물 반응기를 이용하여 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 25℃, 공기공급량 0.1vvm 및 광조건 30 E/m/s (18h day, 6h night) 으로 일정하게 조절하며 14일 간격으로 대량 배양하였다.(S10단계)

배양된 미세조류 심바이오디니움 속은 바람직하게는 건조된 것을 사용하며, 보다 바람직하게는 조쇄된 것을 사용하는 것이 좋다. 조쇄된 미세조류 심바이오디니움 속은 표면적이 매우 커서 추출 용매에 의한 추출 속도 및 추출 수율을 향상시킨다. 막자사발 또는 분쇄 장치 등을 통해 조쇄될 수 있다.(S20단계)

추출용매는 물, 알코올, 물과 알코올의 혼합용매 중 선택되는 어느 하나가 사용된다. 그리고, 물과 알코올의 혼합용매는 알코올 대 물의 부피비가 1 : 9 내지 9 : 1 이며, 바람직하게는 알코올 대 물의 부피비가 4 : 1 인 것이 좋다.

여기서, 알코올 대 물의 부피비가 1 : 9보다 낮은 경우 알코올의 함량이 너무 작아서 추출 속도 및 추출 수율이 떨어지고, 알코올 대 물의 부피비가 9 : 1보다 큰 경우 알코올 함량의 증가에 따른 추출 속도 및 추출 수율의 증가율이 크지 않아서 경제성이 떨어지며, 알코올 대 물의 부피비가 4 : 1 인 경우 추출 속도, 추출 수율, 및 경제성이 최적이다.

또한, 알코올은 탄소수 1 내지 5인 것을 사용하는데, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 사용하고 보다 바람직하게는 메탄올은 사용한다. 메탄올을 사용하는 경우 추출 속도 및 추출 수율이 다른 알코올보다 높다.

또한, 추출 온도는 그 범위가 크게 제한되지 않으나, 바람직하게는 약 30∼60℃이다. 추출 온도가 30℃ 미만인 경우 추출 속도 및 추출 수율이 너무 낮고 추출 온도가 60℃를 초과하는 경우 알코올의 일부가 기화되어 추출에 이용되지 못한다.

즉, 조세된 미세조류 심바이오디니움 속에 추출용매를 첨가하고 소정의 온도를 유지하여 유효성분이 함유된 추출물 수용액을 제조한다.(S30단계)

그리고, 유효성분이 함유된 추출물 수용액(유효성분의 추출물)을 여과하여 유효성분이 함유된 상등액과 잔여 고형물을 분리한다.(S40단계) 이때, 여과에 사용되는 여과재로는 고형물을 분리할 효과적으로 분리할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 구체적으로 여과지(Filter paper), 또는 여과포 등이 있으며 기공 크기는 약 0.1 ㎛ ∼ 0.005 ㎜의 범위를 가진다.

한편, 1회 추출 후 여과에 의해 분리된 잔여 고형물에는 추출되지 않은 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)과 같은 유효 성분이 존재하는데, 최종 추출 수율을 높이기 위해 상기의 잔여 홍조류 고형물을 혼합 용매에 첨가하고 추출 후 여과에 의해 상등액과 잔여 고형물을 분리하는 과정을 1회 내지 3회 더 반복할 수 있다.

또한, 분리된 상등액을 멤브레인 필터(Membrane filter)에 통과시켜 불순물을 제거하는 단계를 선택적으로 더 포함할 수 있다. 여기서, 멤브레인 필터는 나노 사이즈의 기공 크기(약 100㎚ 미만)를 가지는 막으로서 여과된 상등액에 포함된 불순물이나 오염 물질 등을 상등액으로부터 제거하는 역할을 한다.

그리고, 여과 및 멤브레인 필터 처리를 거친 상등액을 물-알코올 농도 구배로 전개시키고, 전개된 추출물 수용액 중 280∼400㎚의 자외선 파장을 흡수하는 추출 분획물을 수득한다.(S50단계) 이때 알코올로는 탄소수 1 내지 5인 알코올을 사용하며, 바람직하게는 메탄올을 사용한다. 물-알코올 농도 구배의 전개는 구체적인 예로 물, 50 부피%의 알코올 수용액을 순차적으로 전개하는 방법이 있다. 한편, 전개된 추출물 수용액 또는 상등액 중 80∼400 ㎚의 자외선 파장을 흡수하는 분획 부분을 측정하기 위하여 UV디텍터가 사용되며, 보충적으로 RI(refractive index) 가 더 사용될 수 있다.

이어, 수득한 추출 분획물을 소수성 상호 칼럼에 통과시켜 1차 정제 추출물을 수득하고, 수득한 1차 정제 추출물을 크기 배제 칼럼(Size Exclusion Column)에 통과시켜 2차 정제 추출물을 수득한다.(S60단계)

이때 사용되는 소수성 상호칼럼으로는 그 종류가 제한되지 않으며, 구체적으로 아가로오스(agarose) 겔, 실리카 겔, 또는 유기 중합체 수지로 이루어진 베이스 입자 표면에 소수성 알킬기, 소수성 아릴기, 소수성 시아노기, 및 소수성 아민기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 소수성 관능기가 결합된 것으로 구성된다. 소수성 알킬기로는 부틸기, 옥틸기, 옥타데실(Octadecyl)기 등이 있으며, 소수성 아릴기로는 페닐에틸기가 있으며, 소수성 시아노기로는 시아노프로필기가 있으며, 소수성 아민기로는 아미노프로필기가 있다. 또한, 본 발명에 사용되는 소수성 상호 칼럼은 바람직하게는 실리카 겔 표면에 소수성 알킬기, 소수성 아릴기, 소수성 시아노기, 및 소수성 아민기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 소수성 관능기가 결합된 것을 특징으로 하며, 이러한 소수성 상호 칼럼으로는 상업적으로 일본 시세이도사의 CAPCELL PAK C8, CAPCEll PAk C18 등이 있다. 이중 CAPCELL PAK C18은 캘슐타입의 실리카 겔 표면에 실리콘(Silicone) 고분자를 증착하여 단층을 형성하고 단층 표면에 옥타데실기를 결합시킨 것이다. 특히 본 발명에서 소수성 상호 칼럼으로 CAPCELL PAK C18 UG120을 사용하는 경우 이동상으로는 아세트산 수용액을 사용한다.

또한, 크기 배제 칼럼은 수용성 시스템에 사용되는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 구체적으로 시세이도사의 실리카 베이스 수용계 크기 배제 칼럼(KW-800 시리즈, KW-400 시리즈), 폴리하이드록시메타크릴레이트베이스의 크기 배제 칼럼(OHpak 시리즈) 등이 있다.

이어, 수득한 2차 정제 추출물을 농축하고 건조시켜 고형화된 정제 추출물을 수득한다.(S70단계)

여기서, 2차 정제 추출물의 농축은 감압 농축이 바람직하고, 건조는 동결 건조시키는 것이 바람직하다. 감압 농축에 의할 경우 낮은 온도에서 물 등의 용매를 쉽게 증발시킬 수 있고, 동결 건조에 의할 때 낮은 온도에서 정제 추출물이 고형화되므로 정제 추출물의 유효 성분이 열에 의해 변성되는 것을 방지할 수 있다.

이어, 선택적으로 고형화된 정제 추출물을 마그네틱 비드가 분산된 콜로이드용액에 넣고, 정제 추출물의 특정성분이 비드와 결합하게 한 다음 자기장을 이용하여 비드를 분리시키는 ABT(Affinity Bid Technology) 기술을 적용시켜 유효성분을 추출할 수 있다.(S80단계)

도 3의 (A)와 같이 고형화된 정제 추출물을 마그네틱 비드가 분산된 콜로이드 용액에 넣고 정제 추출물의 특정 성분이 비드와 결합되게 한다. 여기서, 특정 성분은 피부에 유해한 성분을 포함한다. 이어, B와 같이 시험관에 자기장을 걸어 비드를 한곳에 모으고 상층액을 빼낸다. 이어, C와 같이 세정 버퍼액을 적가하고 세척한다. 이어, D와 같이 성분 물질이 분리되면 상등액을 빼낸다.

여기서, 비드의 특징을 간략히 설명하면, 비드는 원심분리, heat, 컬럼 필요없이 분리가 빠르고 수율이 높다. 보통 핵산(DNA/RNA), 단백질, 항체 등을 포획/정제하는데 사용된다. 비드사이즈는 수십㎚∼수㎛까지 추출물, 용도에 따라 다양하게 사용된다. 비드표면 리간드의 화학적 반응을 이용하여 친화력이 높다.

즉, ABT(Affinity Bid Technology) 기술을 적용시켜 피부에 유해한 성분을 정제시킴으로써 피부에 보다 안전한 자외선 차단용 조성물을 확보할 수 있게 된다.

<실험 예 1> 미세조류 심바이오디니움 속의 추출물에 대한 물성검사

심바이오디니움 속의 추출물에 대한 안정도 시험

심바이오디니움 속의 추출물을 실온, 40℃, 50℃, 냉장에서 보관하면서 외관성상의 변화를 관찰하였으며, 그 결과는 [표 1]에서 제시하였다. 일반적으로 화장품원료의 경우(미용성분)에는 실온(1~30℃) 또는 상온(15~25℃)에서 1년간 외관성상 등에 변화가 없이 유지되어야 하며, 실온이나 상온의 안정도가 떨어지는 경우라도 냉장의 조건에서 최소 6개월에서 1년간 유지가 되어져야 원료로서의 상품성이 있으나, 심바이오디니움 속의 추출물은 안정성에 크게 문제가 없는 것으로 보여진다.

심바이오디니움 속의 추출물에 대한 안전성 시험

Chlamydomonas hedleyi 추출물에 대한 안전성을 1차적으로 피부에 점검하기 위해 시험을 실시하였다. 본 실험은 20명을 대상으로 24시간동안 첩포하였으며, 판정기준은 Draize의 P.I.I법을 기준으로 판정하였고, 판정방법은 페치(patch) 제거 후 30분에 1차 판정, 페치(patch) 제거 후 2일 후에 2차 판정, 페치(patch) 제거 후 1일 후에 3차 판정, 페치(patch) 제거 후 3일 후에 4차 판정을 하였으며, 테스트 위치는 왼팔 안쪽부위에 페치(patch)를 감싸는 방식으로 하여 실행하였다(Haye's test Chamber). 인체 피부적합성 테스트 결과, 추출물을 2회에 걸쳐 시험하였으며, 20명 전원 자극 없음을 확인하였다.

심바이오디니움 속의 추출물에 대한 미생물검사

심바이오디니움 속의 추출물에 대하여 방부처리 후 원료 내 미생물 검출을 위해 식품의약품안전청 미생물 한도기준 및 시험방법 가이드라인에 준해 시험을 실시하였으며, 그 결과 모든 추출물에서 총 생균수 ≤ 100cfu/g 이하이며, 대장균 및 병원균은 불검출 되었다.

심바이오디니움 속의 추출물에 대한 중금속 분석

심바이오디니움 속의 추출물에 대한 중금속을 분석하기 위해 식품의약품안전청 기준 및 시험방법대로 실시하였으며, 그 결과 모든 추출물에서 분석 시 불검출로 확인되었다.

<실험 예 2> 미세조류 심바이오디니움 속의 추출물에 대한 광독성 실험

조추출물과 정제추출물에 대해 인체 광독성 결과와 양호한 일치를 보인다고 알려진 OECD의 화학물질의 평가법인 3T3 NRU 광독성 시험법(The 3T3 neutral red uptake photoxicity test,3T3 NRU PT)과 산소 의존적 세포막 손상을 효과적으로 검색하는 방법으로 알려진 광용혈 시험법(Photohemolysis Test)을 적용하여 광독성을 평가하였다. 3T3 NRU 광독성 시험법에는 마우스 유래의 섬유아세모(NIH/3T3)가 사용되었고, 광용혈 시험법에는 인간 적혈구(Human Erythrocyte)가 사용되었다.

3T3 NRU 광독성 시험법(The 3T3 neutral red uptake photoxicity test, 3T3 NRU PT)은 화장품의 광독성 평가에 대한 대체시험법으로 2004년 4월 OECD 독성시험 기준으로 채택되었으며, 마우스 유래의 섬유아세포인 3T3 cell을 이용하여 광조사한 것과 광조사하지 않은 세포와의 세포독성을 NRU 시험을 이용하여 그 정도를 비교하여 그 차이(PIF, photoirritation factor)가 5배 이상이 되면 광독성 물질로 분류하는 평가방법이다.

[표 2]는 3T3 NRU 광독성 시험법에 의한 조추출물과 정제추출물의 광독성 결과를 나타낸 것이다. 표 2에서 나타나는 바와 같이 정제 추출물은 평균 반수 치사량(IC

, 일반적으로 독성이 예상되는 물질 일정량을 동물에 투여해 실험에 사용된 동물의 수가 반수 이상 죽는 량을 말한다.) 농도가 자외선 조사 여부와 관계없이 1000㎎/㎖를 초과하고, PIF 값이 1을 나타내어 비광독성 물질(non-phototoxic substance)로 판정되었다. 또한, 조추출물의 경우 평균 반수 치사량의 농도가 정제추출물보다 낮게 나타나 상대적으로 독성 정도가 높았으나, PIF 값이 5 미만으로 나타나 비광독성 물질로 판정되었다.

3T3 NRU 광독성 시험 결과

추출물 종류	평균 IC 농도 (UV-, ㎎/㎖)	평균 IC 농도 (UV+, ㎎/㎖)	PIF [IC50(UV-)/IC50(UV+)]
조추출물	825.2	228.7	3.60
정제추출물	> 1000	> 1000	1

도 4는 인간 적혈구 세포을 이용한 광용혈 시험법에 따른 심바이오디니움 속으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 조추출물과 2차 정제 추출물의 광독성 결과를 나타낸 그래프이다.

또한, 도 5는 심바이오디니움 속으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 조추출물의 농도가 500㎍/㎖ 일 때의 인간 적혈구 세포을 이용한 광용혈 시험법에 따른 광독성 결과를 나타낸 사진이고, 도 6은 심바이오디니움 속으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 2차 정제 추출물의 농도가 250㎍/㎖ 일 때의 인간 적혈구 세포을 이용한 광용혈 시험법에 따른 광독성 결과를 나타낸 사진이다.

도 5 및 도 6에 나타난 광용혈 시험에서 사용된 자외선 조사량은 UVA 15 J/㎠ 이었다. 그리고, 인간 적혈구를 이용한 광용혈 시험법에 의한 광독성 결과는 3T3 NRU 광독성 시험법에 의한 광독성 시험 결과와 거의 동일하였다.

<실험 예 3> 미세조류 심바이오디니움 속의 추출물에 대한 세포독성 실험

조추출물과 정제추출물에 대해 사람의 각질세포(keratinocyte)인 HaCaT에 대한 세포독성 시험(cytotoxicity test)을 수행하였다. 세포독성의 평가는 Neutral red assay를 이용하였다.

[표 3]은 심바이오디니움 속으로부터 제조된 조추출물과 정제추출물의 사람의 각질세포(keratinocyte)인 HaCaT에 대한 세포독성 시험결과를 나타낸 것이다. [표 3]에서 나타나는 바와 같이 조추출물과 정제추출물의 HaCaT에 대한 반수 치사량 농도가 모두 5㎎/㎖ 이상으로 나타나 비세포독성 물질(non-cytotoxic substance)로 사료된다

심바이오디니움 속의 추출물에 대한 세포독성 시험 결과

추출물 종류	IC50 농도(㎎/㎖)
조추출물	> 5
정제추출물	> 5

<실험 예 4> 미세조류 심바이오디니움 속의 추출물에 대한 UV유도성 세포손상 보호능 측정 시험

HaCaT을 24well plate에

개의 세포를 분주하여 배양하였다. 24시간 후 FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고 24시간동안 starvation하고, 시료를 농도별로 처리하였다. 그 후 UVA(330-340nm) 조사 (10mJ/cm2)하여 24시간동안 배양하였다. 배지를 제거한 뒤 5mg/ml 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT, Sigma) 시약을 각 well당 40ㅅl씩 처리 후 4시간 동안 추가 배양하였다. 4시간 뒤 배지를 제거하고, dimethylsulfoxide(DMSO, Amresco)를 1ml씩 넣고 10분간 흔들어 준 다음 200ㅅl씩 96well에 취하여 spectrophotometer(Thermo)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

Cell viability(%)= (시험군의 흡광도 / 대조군의 흡광도)×100(%) <심바이오디니움 속의 추출물에 대한 UV유도성 세포손상 보호능 측정 결과>

<실험 예 5> 미세조류 심바이오디니움 속의 추출물에 대한 자외선 차단능 실험

미세조류 심바이오디니움 속의 수용성 추출물을 이용하여 자외선 노출에 따른 자외선 차단능을 확인하였다.

미세조류 심바이오디니움 속의 수용성 추출물은 UVB 파장(290-320nm)에서 자외선 흡수능을 나타내어 Hairless mouse를 이용한 동물실험을 수행하였다(도 7). 그 결과 등 부위에 시험물질을 도포한 다음 자외선 노출선을 노출한 후 24시간 뒤 홍반유무를 확인한 결과 심바이오디니움 속의 추출물을 도포한 부위에서 모두 홍반이 관찰되지 않았다. 따라서 심바이오디니움 속의 수용성 추출물은 자외선 차단능력을 가지는 유용성분을 함유하고 있는 것으로 예상된다.

<실험 예 6> 미세조류 심바이오디니움 속의 추출물에 대한 자외선 차단지수(SPF), 자외선 A 차단지수(PFA) 평가

심바이오디니움 속의 추출물이 15% 함유된 자외선 차단크림에 대하여 인체적용시험을 실시하였다.

미세조류 심바이오디니움 속의 추출물 함유 자외선차단제의 인체적용시험은 공인성을 인정받은 외부 임상연구센타에 의뢰하여 실시하였다. 시험자 모집, 최소 홍반량 측정, 제품의 자외선 차단효과 평가, 데이터 분석 및 결과보고서 작성 순서로 진행하였으며, 피시험자는 만 20∼50세 성인 남ㅇ여를 대상으로 20대, 30대 및 40대 각각 3∼5명으로 구성하였다. 시험자는 피부질환, 내분비 이상 및 간기능 이상 등이 없는 자를 대상으로 하였으며, 스테로이드 등 외용제를 도포하고 있거나, 화장품, 의약품 및 일상적인 광노출에 반응이 심하거나 알러지가 있는 자 또는 임부나 수유부도 제외하였다. 그 외의 시험방법은 자외선 차단 효과 측정방법 및 기준(식품의약품안전처고시 제2013-50호)에 따라 수행되었다.

자외선 차단지수(SPF) 평가

평가방법은 광적용부위의 흑화상태를 판정하는 기법을 사용하였다. 자외선 차단지수 평가를 위해서 자외선조사 16∼24시간 뒤 시험부위의 최소 홍반량을 숙련자 2인이 홍반 상태 판정기준표 [표 4]에 따라 판정하고 이 판정 값을 이용하여 자외선 차단지수를 계산하였다.

SPF산출 방법은 아래와 같다.

SPFi = MEDp/MEDu, SPF = ∑SPFi/n

MEDp는 제품 도포부위의 최소홍반량(mJ/cm

)이며, 최소홍반이 나타난 곳의 광세기(μw/cm

)×조사시간(sec)으로 계산된다. MEDu는 제품 무도포부위의 최소홍반량(mJ/cm

)이며, 최소홍반이 나타난 곳의 광세기(μw/cm

)×조사시간(sec)으로 계산된다. SPFi는 각 피험자의 자외선 차단지수이며, n은 표본수이다. 위의 공식에 따라 각 피험자별 자외선 차단지수를 산출하고, 10∼15명의 평균값으로 제품의 자외선 차단지수를 결정하였다.

심바이오디니움 속의 추출물에 대한 자외선 차단지수 측정 결과

제품	SPF 값	95% CI
낮은 SPF 표준시료	3.57 1.25	0.37
Symbiodinium spp. containing sunscreen	19.89 1.35	1.83

자외선 A 차단지수(PFA) 평가

자외선 A차단지수 평가를 위해서는 자외선 조사 2-4 시간 후 시험부위의 최소 흑화부위를 숙련자 2인이 [표 4]에 따라 판정하고, 그 판정값을 이용하여 자외선A 차단지수를 계산하였다. 2인의 결과 값이 서로 다를 경우 판정결과가 낮은 최소지속형 즉시 흑화량으로 채택하였다.

PFA 산출 방법은 아래와 같다.

PFAi = MPPDp/MPPDu, PFA = ∑PFAi/n

MPPDp는 제품 도포부위의 최소지속형 즉시흑화량(J/cm

)이며, 최소흑화가 나타난 곳의 광세기(mw/cm

) × 조사시간(sec)으로 계산된다. MPPDu는 제품 무도포부위의 최소지속형 즉시흑화량(J/cm

)이며, 최소흑화가 나타난 곳의 광세기(mw/cm

) × 조사시간(sec)으로 계산된다. PFAi는 각 피험자의 자외선 A차단지수이며, n은 표본수이다. 위의 공식에 따라 각 피험자별 자외선 A차단지수를 산출하고, 10∼15명의 평균값으로 제품의 자외선 A차단지수를 결정하였다.

심바이오디니움 속의 추출물에 대한 자외선A 차단지수 측정 결과

제품	PFA 값	95% CI
낮은 SPF 표준시료	3.13 0.28	0.41
Symbiodinium spp. containing sunscreen	5.27 0.31	1.22

<실험 예 7> 미세조류 심바이오디니움 속의 추출물에 대한 도포 전후 자외선 감지 카메라 촬영

심바이오디니움 속의 추출물이 15∼20% 함유된 자외선 차단크림에 대하여 인체적용시험을 실시하였다. 자외선 감지 카메라로 촬영한 결과 자외선 차단크림 도포 전에는 흰색으로 나타났으며 도포 후에는 검은색으로 나타나는 것으로 보아 [도 8] 심바이오디니움 속의 추출물은 자외선 차단능을 가지는 유용성분을 함유하고 있는 것으로 예상된다.

이와 같이 본 발명은 미세조류 심바이오디니움 속(genus Symbiodinium spp.)을 배양하여 대량 생산한 뒤 이를 이용하여 자외선 흡수 능력이 뛰어난 미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물을 확보함으로써, 피부에 무거운 느낌 또는 잔여물에 의한 이물감을 주지 않으면서 동시에 자극성 피부염, 접촉 피부염, 광 알레르기성 피부염 등의 피부 자극이나 알레르기 반응 및 독성 등과 같이 부작용이 없는 자외선 차단제의 주요성분으로 활용할 수 있게 된다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니한다. 즉, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범주를 일탈함이 없이 본 발명에 대한 다수의 변경 및 수정이 가능하며, 그러한 모든 적절한 변경 및 수정은 균등물들로 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주 되어야 할 것이다.

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 미세조류 심바이오디니움 속을 배양하는 S10단계;
   상기 배양된 미세조류 심바이오디니움 속을 건조하여 조쇄하는 S20단계;
   상기 조쇄된 미세조류 심바이오디니움 속에 추출용매를 첨가하고 소정의 온도를 유지하여 유효성분이 함유된 추출물 수용액을 제조하는 S30단계;
   상기 추출물 수용액을 여과하여 유효성분이 함유된 상등액과 잔여 고형물을 분리하는 S40단계;
   상기 분리된 상등액을 물-알코올 농도 구배로 전개시키고, 전개된 상등액 중 280∼400nm의 자외선 파장을 흡수하는 추출 분획물을 수득하는 S50단계;
   상기 추출 분획물을 소수성 상호칼럼으로 1차 정제하고, 크기 배제 칼럼으로 2차 정제하는 S60단계;
   상기 2차 정제 추출물을 농축하고 건조시켜 고형화된 정제 추출물을 수득하는 S70단계;
   상기 고형화된 정제 추출물을 마그네틱 비드가 분산된 콜로이드용액에 넣고 상기 정제 추출물의 특정성분이 비드와 결합하게 한 다음 자기장을 이용하여 비드를 분리시키는 ABT(Affinity Bid Technology) 기술을 적용시켜 유효성분을 추출하는 S80단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물 제조방법.
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 S30단계에서 상기 추출용매는 물과 알코올의 혼합용매를 사용하고,
   상기 물과 알코올의 혼합용매는 알코올 대 물의 부피비가 4 : 1 인 것을 특징으로 하는 미세조류 심바이오디니움 속으로부터 추출된 유효성분을 함유하는 자외선 차단용 조성물 제조방법.

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