KR102244546B1 - 미생물 콘크리트 기술에서 미생물 음압 고정화 기술 - Google Patents

미생물 콘크리트 기술에서 미생물 음압 고정화 기술 Download PDF

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Abstract

미생물 생장환경을 조성할 수 있는 다공성 재료에 음압환경을 조성하여 미생물을 고정하는 방법으로서, 본 발명자들의 선행특허 대비 짧은 시간에 다공성 재료에 흡착되는 미생물의 농도를 향상시키고, 대량 생산 측면에서 미생물의 흡착 시간을 단축시켜 효율성을 향상시킨 미생물 음압 고정화 방법이 개시된다. 본 발명은 다공성 재료를 미생물 배양액에 침지시키는 단계를 포함하고, 상기 단계는 음압 조건에서 수행되는 미생물을 이용한 콘크리트 배합 시 미생물 생장환경 조성을 위한 미생물 음압 고정화 방법을 제공하고자 한다.

Description

미생물 콘크리트 기술에서 미생물 음압 고정화 기술{Immobilization technology of microbial negative pressure in microbial concrete technology}
본 발명은 미생물 콘크리트 기술에서 미생물을 고정하기 위한 기술에 관련된 것으로, 보다 상세게하게는 미생물 콘크리트 기술에서 미생물 고정 시 음압을 이용하여 고정하는 방법에 관한 것이다.
최근 경제수준이 향상됨에 따라 환경에 대한 관심이 높아지면서 콘크리트 배합에 있어서도 미생물을 활용한 친환경 콘크리트 제조에 관한 논의가 활발해지고 있다.
종래 콘크리트 배합 시 미생물 투입을 위해서는 콘크리트 배합 과정에서 배합수의 일정 부분 또는 전체를 미생물 배양액으로 대체하는 방법을 활용하여 투입하는 단순한 방법이었다. 이 방법에서는 배합과정에서 믹서기와 골재 등의 마찰과 충격으로 인해 미생물의 생존이 불리하다. 콘크리트 배합 이후 경화 과정에서 시멘트 페이스트 수화에 따른 콘크리트 내 수분의 감소로 건조 환경이 되며 부피 팽창의 영향으로 미생물의 영양분 및 생장처가 감소하게 된다. 특히, 콘크리트는 경화 시 수화열에 의해 내부 온도가 40℃ 이상으로 되며 콘크리트의 수화생성물(Ca(OH)2)에 의한 강알칼리성 환경(pH 11~12)은 미생물의 최적 생장환경(pH 4~9)조성에 있어 가장 큰 저해 요소가 된다. 더불어 경화된 콘크리트의 내부 공극의 크기는 대부분 미생물 크기보다 작은 1 마이크로미터로서 콘크리트 공극 내에서 미생물이 생존하기는 불가능하다. 이러한 영향으로 콘크리트 내부에서 미생물의 생장활동은 저해되고, 약 30일 이후에는 콘크리트 내부에서 미생물들은 대부분 사멸하게 된다.
본 발명자들은 이러한 문제점을 등록특허 제1859211호에서 다공성 재료가 투입 된 망사형 흡착패드를 미생물 배양액에 침지하여 미생물 흡착을 유도하는 방법이 이용하여 해결하고 있으나, 이러한 방법은 미생물의 흡착 농도 향상을 위하여 72시간 동안 지속해야 하며, 또한 미생물 흡착을 위해 이용되는 재료는 비중이 1.0 이하로서 배양액 침지 시 부유 방지를 위해 망사형 흡착패드를 필수적으로 이용하여야하기 때문에 침지 배양액 부피 대비 고정화 재료의 투입량이 매우 적어 대량생산 측면에서 효율성이 매우 낮은 문제점이 있었다.
[선행특허문헌]
- 한국등록특허 제10-1859211호(2018.05.11.)
- 한국등록특허 제10-0948556호(2010.03.12.)
따라서, 본 발명은 상기 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 미생물 생장환경을 조성할 수 있는 다공성 재료에 음압환경을 조성하여 미생물을 고정하는 방법으로서, 본 발명자들의 선행특허 대비 짧은 시간에 다공성 재료에 흡착되는 미생물의 농도를 향상시키고, 대량 생산 측면에서 미생물의 흡착 시간을 단축시켜 효율성을 향상시킨 미생물 음압 고정화 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 다공성 재료를 미생물 배양액에 침지시키는 단계를 포함하고, 상기 단계는 음압 조건에서 수행되는 미생물을 이용한 콘크리트 배합 시 미생물 생장환경 조성을 위한 미생물 음압 고정화 방법을 제공한다.
또한, 상기 다공성 재료는 팽창질석, 우레탄 및 히드로겔로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미생물 음압 고정화 방법을 제공한다.
또한, 상기 음압 조건은 10~120분 동안 50torr 이하를 유지하는 것을 특징으로 하는 미생물 음압 고정화 방법을 제공한다.
또한, 상기 미생물은 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 지오바실러스 칼도실로실리티쿠스(Geobacillus caldoxylosilyticus), 아네우리니바실러스 써모아에로필러스(Aneurinibacillus thermoaerophilus), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodoseudomonas palustris), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus)는 정제수 1ℓ 기준으로 효모 추출물(Yeast extract) 0.05~1g, 디소듐 숙시네이트(Di-sodium succinate) 0.1~5g, 구연산철 용액(Ferric citrate solution)(100㎖당 0.1g 포함) 2~10㎖, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.1~1g, 황산마그네슘 7수화물(MgSO4.7H2O) 0.1~1g, 염화나트륨(NaCl) 0.1~1g, 염화암모늄(NH4Cl) 0.1~1g 및 염화칼슘이수화물(CaCl2.2H2O) 20~100㎖를 포함하는 배지에서 pH 5~7 조건으로 배양된 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus)는 정제수 1ℓ 기준으로 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5~5g, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5~5g, 펩톤(Peptone) 1~10g, 염화나트륨 1~10g 및 세스퀴탄산나트륨 용액(Na-sesquicarbonate solution)(정제수 100㎖당 탄산수소나트륨(NaHCO3) 2~6g 및 무수탄산나트륨(Na2CO3 anhydrous) 3~7g 포함) 20~200㎖를 포함하는 배지에서 pH 8~11 조건으로 배양된 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 지오바실러스 칼도실로실리티쿠스(Geobacillus caldoxylosilyticus) 및 아네우리니바실러스 써모아에로필러스(Aneurinibacillus thermoaerophilus)는 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5~5g/ℓ, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5~5g/ℓ, 펩톤(Peptone) 1~10g/ℓ, 염화나트륨(Sodium chloride) 1~10g/ℓ 및 한천(agar) 5~25g/ℓ를 포함하는 영양 한천 배지에서 pH 4~10 및 37~80℃ 조건으로 배양된 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodoseudomonas palustris)는 정제수 1ℓ 기준으로 효모 추출물(Yeast extract) 0.1~5g, 디소듐 숙시네이트 헥사-하이드레이트(Disodium succinate hexa-hydrate) 0.1~5g, 무수에탄올(Absolute ethanol) 0.1~1㎖, 구연산철 용액(Ferric citrate solution) 0.1~5㎖, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.1~1g, 황산마그네슘 7수화물(MgSO4.7H2O) 0.1~1g, 염화나트륨(NaCl) 0.1~1g, 염화암모늄(NH4Cl) 0.1~1g 및 염화칼슘이수화물(CaCl2.2H2O) 0.02~0.1g를 포함하는 배지에서 pH 5~7 조건으로 배양된 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 정제수 1ℓ 기준으로 동물 조직의 펩신 소화물(Peptic digest of animal tissue) 1~10g, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5~3g, 염화나트륨(Sodium chloride) 1~10g 및 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5~3g을 포함하는 배지에서 pH 4~10 조건으로 배양된 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 다공성 재료에 미생물 고정 시 음압 환경을 조성함으로써, 미생물 고정시 음압 환경을 조성함으로써 다공성 재료에 미생물이 고정되는 시간을 단축시킴과 동시에 미생물을 다공성 재료에 고농도로 고정시킬 수 있어 미생물 고정 효율을 향상시킬 수 있고, 콘크리트 경화 이후 미생물의 사멸을 방지하고 지속적인 생장환경을 조성할 수 있으며, 콘크리트에서 미생물이 생장함으로써 미생물의 효과가 지속될 수 있다.
도 1a는 본 발명에 따른 미생물 음압 고정화가 수행되는 멸균 컨테이너의 정면을 예시적으로 나타낸 도면,
도 1b는 본 발명에 따른 미생물 음압 고정화가 수행되는 멸균 컨테이너의 측면을 예시적으로 나타낸 도면,
도 1c는 본 발명에 따른 미생물 음압 고정화가 수행되는 멸균 컨테이너의 윗면을 예시적으로 나타낸 도면,
도 1d는 본 발명에 따른 미생물 음압 고정화가 수행되는 멸균 컨테이너의 뒷면을 예시적으로 나타낸 도면,
도 1e는 본 발명에 따른 미생물 음압 고정화가 수행되는 멸균 컨테이너에 다공성 재료가 침지된 배양액 통이 설치된 모습을 예시적으로 나타낸 도면,
도 2는 종래 발명에 따라 흡착재가 침지된 통을 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명자들은 미생물을 이용한 콘크리트 제조에 있어 콘크리트 경화 이후 미생물의 사멸을 방지하고 지속적인 생장환경을 조성하기 위하여 등록특허 제1859211호에서 소정 규격의 망사형의 흡착 패드에 흡착재를 미생물 배양액에 침지시킴으로써 지속적인 생장환경을 조성하였으나, 이러한 방법은 미생물의 흡착 농도 향상을 위하여 72시간 동안 지속해야 하며, 또한 미생물 흡착을 위해 이용되는 재료는 비중이 1.0 이하로서 배양액 침지 시 부유 방지를 위해 망사형 흡착패드를 필수적으로 이용하여야 하기 때문에 침지 배양액 부피 대비 고정화 재료의 투입량이 매우 적어 대량생산 측면에서 효율성이 매우 낮은 문제점이 있다는 사실을 직시하고, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과 미생물 고정 시 음압 환경을 조성함으로써 다공성 재료에 미생물이 고정되는 시간을 단축시킴과 동시에 미생물을 다공성 재료에 고농도로 고정시킬 수 있어 미생물 고정 효율을 향상시킬 수 있고, 콘크리트 경화 이후 미생물의 사멸을 방지하고 지속적인 생장환경을 조성할 수 있음을 발견하고 본 발명에 이르게 되었고, 상기 한국등록특허 제1859211호에 개시된 내용은 모두 본 발명을 위한 참고자료가 될 수 있다.
따라서 본 발명은 다공성 재료를 미생물 배양액에 침지시키는 단계를 포함하고, 상기 단계는 음압 조건에서 수행되는 미생물을 이용한 콘크리트 배합 시 미생물 생장환경 조성을 위한 미생물 음압 고정화 방법을 개시한다.
본 발명에서 미생물 고정을 위한 재료로서는 다공성의 양이온 교환능력이 우수한 다공성 재료가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 팽창질석, 우레탄 및 히드로겔로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있다.
미생물을 이용한 콘크리트 제조 시 미생물을 단순 투입하게 되면 콘크리트 경화 후 수분이 없기 때문에 생장이 둔화되거나 사멸하게 된다. 경화된 콘크리트 내부에서도 미생물이 생장할 수 있는 환경을 조성하기 위하여, 본 발명에서는 무수한 기공에 의한 다공질 구조(유효 수분율 40부피% 이상 및 공극률 50% 이상)를 가져 뛰어난 수분 흡수력과 보습력을 지닌 상기 다공성 재료를 이용하여 콘크리트 투입 전에 미생물을 흡착시키도록 한다.
본 발명에 제시된 상기 미생물 고정을 위한 재료들은 재료 표면에 존재하는 교환성 양이온(Mg2 +, Ca2 + 등)에 의하여 유기물을 흡착하는 성질이 있어 미생물 및 미생물 생장에 필요한 유기성 영양분(배지 성분)을 흡수한다. 또한 pH가 6~9로서 미생물이 생장하기 위한 최적 환경 조성에 가장 이상적인 재료이다. 한편, 다공성의 코르크 등은 양이온 교환능력이 없어 본 발명에서의 미생물 흡착재로는 바람직하지 않다.
상기 다공성 재료를 이용한 미생물의 흡착에는 침지 공정이 이용되며, 상기 침지 공정에서 미생물의 최적 흡수 효율을 위한 침지 조건은 미생물 배양액 100중량부에 대하여 1~30중량부 함량으로 다공성 재료가 완전히 침지되도록 침지시켜 수행되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 침지 공정은 음압 조건에서 수행되며, 상기 음압 조건은 10~120분 동안 50torr이하를 유지하는 것일 수 있고, 바람직하게는 15~60분 동안 1~20torr를 유지하는 것일 수 있다. 또한, 습도 40~80% 및 온도 5~40℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 습도 50~70% 및 온도 10~30℃를 유지하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 미생물을 상기 다공성 재료에 고정하는 과정은 음압 조건에서 수행되므로, 상기 음압 조건을 위하여 상기 과정은 음압 환경을 조성할 수 있는 멸균 컨테이너 내에서 수행될 수 있다.
도 1a는 본 발명에 따른 미생물 음압 고정화가 수행되는 멸균 컨테이너의 정면을 예시적으로 나타낸 도면이고, 도 1b는 본 발명에 따른 미생물 음압 고정화가 수행되는 멸균 컨테이너의 측면을 예시적으로 나타낸 도면이고, 도 1c는 본 발명에 따른 미생물 음압 고정화가 수행되는 멸균 컨테이너의 윗면을 예시적으로 나타낸 도면이고, 도 1d는 본 발명에 따른 미생물 음압 고정화가 수행되는 멸균 컨테이너의 뒷면을 예시적으로 나타낸 도면이고, 도 1e는 본 발명에 따른 미생물 음압 고정화가 수행되는 멸균 컨테이너에 다공성 재료가 침지된 배양액 통이 설치된 모습을 예시적으로 나타낸 도면이다.
도 1a 내지 도 1e를 참조하면, 본 발명에서 사용되는 멸균 컨테이너(100)는 미생물이 다공성 재료에 고정될 수 있도록 음압 환경 내에서도 압력의 누출 없어야 하며, 이를 위하여 상기 멸균 컨테이너(100)의 윗면에는 압력 조절 펌프와 연결되어 압력이 조절되는 압력 조절 밸브(110) 및 상기 멸균 컨테이너(100) 내부의 압력을 확인할 수 있는 압력 지시계(120)가 설치될 수 있다.
또한, 상기 멸균 컨테이너(100)의 좌우측면에는 멸균 환경 내에서 재료의 이동 및 조작을 위한 밀폐형 글로브(130)가 설치될 수 있고, 상기 밀폐형 글로브(130)는 원형 형상일 수 있다. 또한, 상기 멸균 컨테이너(100) 정면에는 다공성 재료 등을 넣을 수 있는 개폐형 도어(140)가 설치될 수 있고, 상기 개폐형 도어(140)에는 압력의 누수를 막기 위해 상기 도어를 밀착시킬 수 있는 잠금장치가 설치되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 멸균 컨테이너(100) 내부에는 미생물 배양액이 담기는 통(200)이 설치될 수 있다.
또한, 상기 멸균 컨테이너(100)의 크기는 예컨대, 실내 실험실 등 소규모 환경에서 활용되기 위하여 L3 및 L4가 각각 390mm 및 340mm일 수 있고, 상기 도어(14)의 크기는 다공성 재료 및 통(200)을 용이하게 넣기 위하여 L1 및 L2가 각각 250mm일 수 있고, 또한 상기 글로브(130)의 직경(φ)은 재료의 이동 및 조작을 용이하게 하기 위하여 120mm일 수 있다. 다만, 상기 멸균컨테이너(100), 도어(140) 및 글로브(130)의 길이(L3, L4, L1 및 L2) 및 직경(φ)은 실내 실험실 등 소규모 환경에서 활용되기 위한 하나의 예시이며, 이에 한정되지 않고 사용처의 환경에 따라 다양하게 조절할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에서 음압 환경을 이용하여 다공성 재료에 미생물을 고정하는 방법은 다공성 재료를 미생물의 배양액에 완전히 침지시킨 후 음압 환경을 조성함으로써 미생물 및 유기성 영양분(배지 성분)이 상기 다공성 재료에 빠르고 고르게 흡착되도록 할 수 있다.
본 발명에서, 미생물이 고정된 다공성 재료를 콘크리트 배합, 즉 골재, 시멘트 및 물을 포함하는 배합물에 투입하여 수행할 경우 골재 사이에 미생물이 생장할 수 있도록 하게 되며, 이때 미생물이 흡착된 다공성 재료의 투입은 콘크리트의 소요 휨 강도를 확보할 수 있도록 상기 시멘트 100중량부에 대하여 1~30중량부 함량으로 투입될 수 있고, 바람직하게는 5~20중량부 함량으로 투입될 수 있다.
본 발명에 따른 미생물 음압 고정화 방법에 사용되는 미생물로서 상기 음압 조건에서 상기 다공성 재료를 이용한 침지 과정에 적합한 미생물이라면 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 콘크리트에 자기정화 및 자기생육 능력 부여가 가능한 호열성 및 호염기 미생물로서 고온의 환경(40~50℃) 및 알칼리성 환경(pH 4~10)에서 생장이 가능하며 수질정화 및 질소고정에 의한 유기농법도 가능한 종이 사용될 수 있다.
본 발명에서는 미생물 중 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), 지오바실러스 칼도실로실리티쿠스(Geobacillus caldoxylosilyticus), 아네우리니바실러스 써모아에로필러스(Aneurinibacillus thermoaerophilus), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodoseudomonas palustris), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 선택된 미생물이 음압 조건에서 다공성 재료를 이용한 침지 과정에 사용될 경우 이를 이용한 콘크리트 배합 및 경화 후 콘크리트 내에 투입된 미생물의 사멸을 방지하고 지속적인 생장환경을 조성할 수 있음을 확인하였다.
여기서, 본 발명에서는 상기 미생물의 최적 배양환경을 조성하기 위하여 특수한 배지 조성에 대해 연구한 결과를 토대로 각 미생물의 특성에 따라 접종 배양 시 효율이 우수한 최적의 배지 조성과 배양 조건을 제시한다.
구체적으로, 상기 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus)는 정제수 1ℓ 기준으로 효모 추출물(Yeast extract) 0.05~1g, 디소듐 숙시네이트(Di-sodium succinate) 0.1~5g, 구연산철 용액(Ferric citrate solution)(100㎖ 당 0.1g 포함) 2~10㎖, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.1~1g, 황산마그네슘 7수화물(MgSO4.7H2O) 0.1~1g, 염화나트륨(NaCl) 0.1~1g, 염화암모늄(NH4Cl) 0.1~1g 및 염화칼슘이수화물(CaCl2.2H2O) 20~100㎖를 포함하는 배지에서 pH 5~7 조건으로 배양되는 것이 바람직하고, 효모 추출물(Yeast extract) 0.1~0.3g, 디소듐 숙시네이트(Di-sodium succinate) 0.5~2g, 구연산철 용액(Ferric citrate solution)(100㎖ 당 0.1g 포함) 3~7㎖, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.3~0.7g, 황산마그네슘 7수화물(MgSO4.7H2O) 0.2~0.6g, 염화나트륨(NaCl) 0.2~0.6g, 염화암모늄(NH4Cl) 0.2~0.6g 및 염화칼슘이수화물(CaCl2.2H2O) 40~60㎖를 포함하는 배지에서 pH 5.5~6 조건으로 배양되는 것이 더욱 바람직하다.
또한 상기 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus)는 정제수 1ℓ 기준으로 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5~5g, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5~5g, 펩톤(Peptone) 1~10g, 염화나트륨 1~10g 및 세스퀴탄산나트륨 용액(Na-sesquicarbonate solution)(정제수 100㎖ 당 탄산수소나트륨(NaHCO3) 2~6g 및 무수탄산나트륨(Na2CO3 anhydrous) 3~7g 포함) 20~200㎖를 포함하는 배지에서 pH 8~11 조건으로 배양되는 것이 바람직하고, 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5~2g, 효모 추출물(Yeast extract) 1~3g, 펩톤(Peptone) 3~7g, 염화나트륨 3~7g 및 세스퀴탄산나트륨 용액(Na-sesquicarbonate solution)(정제수 100㎖ 당 탄산수소나트륨(NaHCO3) 2~6g 및 무수탄산나트륨(Na2CO3 anhydrous) 3~7g 포함) 80~120㎖를 포함하는 배지에서 pH 9~10 조건으로 배양되는 것이 더욱 바람직하다.
또한 상기 지오바실러스 칼도실로실리티쿠스(Geobacillus caldoxylosilyticus) 및 아네우리니바실러스 써모아에로필러스(Aneurinibacillus thermoaerophilus)는 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5~5g/ℓ, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5~5g/ℓ, 펩톤(Peptone) 1~10g/ℓ, 염화나트륨(Sodium chloride) 1~10g/ℓ 및 한천(agar) 5~25g/ℓ를 포함하는 영양 한천 배지에서 pH 4~10 및 37~80℃ 조건으로 배양된 것이 바람직하고, 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5~2g/ℓ, 효모 추출물(Yeast extract) 1~3g/ℓ, 펩톤(Peptone) 3~7g/ℓ, 염화나트륨(Sodium chloride) 3~7g/ℓ 및 한천(agar) 10~20g/ℓ를 포함하는 영양 한천 배지에서 pH 5~9 및 40~60℃ 조건으로 배양된 것이 더욱 바람직하다.
또한 광합성계 박테리아인 상기 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodoseudomonas palustris)는 정제수 1ℓ 기준으로 효모 추출물(Yeast extract) 0.1~5g, 디소듐 숙시네이트 헥사-하이드레이트(Disodium succinate hexa-hydrate) 0.1~5g, 무수에탄올(Absolute ethanol) 0.1~1㎖, 구연산철 용액(Ferric citrate solution) 0.1~5㎖, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.1~1g, 황산마그네슘 7수화물(MgSO4.7H2O) 0.1~1g, 염화나트륨(NaCl) 0.1~1g, 염화암모늄(NH4Cl) 0.1~1g 및 염화칼슘이수화물(CaCl2.2H2O) 0.02~0.1g를 포함하는 배지에서 pH 5~7 조건으로 배양된 것이 바람직하고, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5~2g, 디소듐 숙시네이트 헥사-하이드레이트(Disodium succinate hexa-hydrate) 0.5~2g, 무수에탄올(Absolute ethanol) 0.3~0.7㎖, 구연산철 용액(Ferric citrate solution) 0.5~1.5㎖, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.3~0.7g, 황산마그네슘 7수화물(MgSO4.7H2O) 0.2~0.6g, 염화나트륨(NaCl) 0.2~0.6g, 염화암모늄(NH4Cl) 0.2~0.6g 및 염화칼슘이수화물(CaCl2.2H2O) 0.03~0.07g를 포함하는 배지에서 pH 5.5~6.5 조건으로 배양된 것이 더욱 바람직하다.
또한 상기 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 정제수 1ℓ 기준으로 동물 조직의 펩신 소화물(Peptic digest of animal tissue) 1~10g, 효모 추출물(Yeast extract) 0.5~3g, 염화나트륨(Sodium chloride) 1~10g 및 쇠고기 추출물(Beef extract) 0.5~3g을 포함하는 배지에서 pH 4~10 조건으로 배양된 것이 바람직하고, 동물 조직의 펩신 소화물(Peptic digest of animal tissue) 3~7g, 효모 추출물(Yeast extract) 1~2g, 염화나트륨(Sodium chloride) 3~7g 및 쇠고기 추출물(Beef extract) 1~2g을 포함하는 배지에서 pH 6~8 조건으로 배양된 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서 상기 미생물에 대해서는 각 배지에 접종 후 상기 배양 조건의 인큐베이터에서 103~1011cell/ml의 농도가 될 수 있도록 3~12일간 배양이 수행될 수 있고, 바람직하게는 5~9일간 배양이 수행될 수 있다.
이상과 같이, 본 발명은 미생물 생장처로 활용되는 다공성 재료에 미생물 고정 시 음압 조건을 이용함으로써 기존 콘크리트 배합 시 미생물 적용 방법의 심각한 문제점인 미생물 사멸 문제를 해결할 수 있고, 미생물이 흡착재에 흡착되는 시간을 획기적으로 단축할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
미생물 분리 및 배양
경기도 여주 소재 나대지 토양에서 채취된 시료 50g을 멸균 증류수 400㎖에 넣고 교반한 후 10㎖를 취하여 TSA 배지(트립톤 15g, 소이톤 5g, 염화나트륨 5g 및 아가 15g을 증류수 1ℓ에 녹여 pH 7로 조정한 후 120℃에서 15분간 오토클레이브 멸균 처리하고 60℃로 냉각 후 멸균된 배양 접시에 분주하여 사용)에 가하고 도말법으로 접종하였다. 접종한 미생물을 16S rDNA 염기서열 분석법으로 분리하고 동정하였으며, 동정된 미생물은 각각 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus)(수탁번호 KEMB(환경미생물은행(Korea Environmental Microorganisms Bank)9000-009 참조), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus)(수탁번호 KEMB9000-002 참조), 지오바실러스 칼도실로실리티쿠스(Geobacillus caldoxylosilyticus)(수탁번호 KEMB563-529 참조), 아네우리니바실러스 써모아에로필러스(Aneurinibacillus thermoaerophilus)(수탁번호 KEMB563-526 참조), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus)(수탁번호 KEMB1-2 참조), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodoseudomonas palustris)(수탁번호 KEMB1-6 참조), 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis)(수탁번호 KEMB4-215 참조) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(수탁번호 KEMB4-218 참조)인 것을 확인하였다.
상기 분리된 미생물 각각에 대해 다양한 조성의 배지를 이용하여 배양을 수행하였으며, 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus)의 경우 각각 하기 표 1(pH 5.5~6.0) 및 표 2(pH 9.7)에 나타낸 배지 조성 및 배양 조건에서 가장 우수한 증식을 보였고, 지오바실러스 칼도실로실리티쿠스(Geobacillus caldoxylosilyticus) 및 아네우리니바실러스 써모아에로필러스(Aneurinibacillus thermoaerophilus)의 경우 하기 표 3(pH 6)에 나타낸 배지 조성 및 배양 조건에서 가장 우수한 증식을 보였고, 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus) 및 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodoseudomonas palustris)의 경우 하기 표 4(pH 6)에 나타낸 배지 조성 및 배양 조건에서 가장 우수한 증식을 보였고, 바실러스 터린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 경우 하기 표 5(pH 6)에 나타낸 배지 조성 및 배양 조건에서 가장 우수한 증식을 보여, 이후 실험에서는 상기 조건에서 배양된 미생물 배양액을 사용하였다.
Figure 112019110804154-pat00001
Figure 112019110804154-pat00002
Figure 112019110804154-pat00003
Figure 112019110804154-pat00004
Figure 112019110804154-pat00005
제조예 : 미생물이 고정된 다공성 재료 제조
로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus)의 경우, 도 1e를 참조하여, 멸균 컨테이너 내부에 설치된 배양액 통에 상기 제조된 미생물 배양액을 농도 105cell/㎖로 넣고, 미생물 배양액 100중량에 대하여 10중량부 함량의 팽창질석을 상기 배양액에 침지시킨 후 도어를 닫고, 벨브를 조절하여 약 15 torr의 음압환경에서 0.5시간, 24시간, 48시간 및 72시간 동안 흡착을 실시하였으며, 이후 각각 배양액 통으로부터 미생물이 고정된 팽창질석을 회수하였다.
비교 제조예 : 미생물이 흡착된 흡착재 제조
로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus)의 경우 종래 발명인 등록특허 제1859211호에 따라 흡착재가 침지된 통을 나타낸 도면인 도 2를 참조하여, 배양액 통에 상기 각 제조된 미생물 배양액을 농도를 105cell/㎖로 넣고, 미생물 배양액 100중량에 대하여 10중량부 함량의 팽창질석을 흡착 패드(망사눈의 크기 700×700㎛, 패드 두께 5mm, 5단 연결)에 투입하고 배양액 통에 침지 및 부유시킨 후 뚜껑을 닫아 습도 60% 및 온도 20℃의 환경에서 72시간 동안 보관하였다. 이후 각각 0.5시간, 24시간, 48시간 및 72시간이 지난 후 각각, 배양액 통으로부터 흡착 패드를 꺼내어 개폐형 클립을 통해 미생물이 흡착된 흡착재를 회수하였다.
실험예
상기 제조예에서 제조된 미생물이 고정된 팽창질석 및 상기 비교 제조예에서 제조된 미생물이 흡착된 흡착재에서의 흡착 생균수를 다음과 같은 방법으로 측정하였고 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
측정방법
생균수의 측정은 생균수 측정방법(Viable cell count method)을 이용하였다.
팽창질석 및 흡착재를 30℃ 환경의 교반기에서 투입하여 3시간동안 균을 탈착하고, 균주가 탈착 된 배양액을 10-6 비율로 희석한 후 한천배지에 접종하여 3일 동안 배양하였다. 배양이 완료된 한천 배지의 박테리아 군락 형성 개수를 계수하였으며, 흡착 생균수를 도출하였다.
Figure 112019110804154-pat00006
상기 표 6을 참조하면 본 발명에 따른 음압 고정화 방법(제조예)을 이용하는 경우 생균수가 30분 이내에 미생물이 다공성 재료에 1.2X109cell/ml 고정되는 것을 알 수 있다. 그러나 흡착재를 이용하는 방법의 경우(비교제조예)에는 72시간이 경과된 후에도 흡착재에 흡착된 미생물의 생균수는 8.2X108cell/ml로 낮은 것을 알 수 있고, 이로부터 본 발명에 따른 음압을 이용하여 미생물을 다공성 재료에 고정하는 것이 매우 효율적임을 확인할 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
100 : 멸균컨테이너 110 : 압력 조절벨브
120 : 압력 지시계 130 : 밀폐형 글로브
140 : 개폐형 도어
200 : 미생물 배양액이 담긴 통 φ: 글로브 직경
L1 : 개폐형 도어 가로길이 L2 : 개폐형 도어 세로길이
L3 : 멸균컨테이너 가로길이 L4 : 멸균컨테이너 세로길이
환경미생물은행 KEMB9000-009 20160509 환경미생물은행 KEMB9000-002 20110608 환경미생물은행 KEMB563-529 20160204 환경미생물은행 KEMB563-526 20160204 환경미생물은행 KEMB1-2 20101124 환경미생물은행 KEMB1-6 20101124 환경미생물은행 KEMB4-215 20080228 환경미생물은행 KEMB4-218 20080228

Claims (9)

  1. 다공성 재료를 미생물 배양액에 침지시키는 단계를 포함하고, 상기 단계는 음압 조건에서 수행되는 미생물을 이용한 콘크리트 배합 시 미생물 생장환경 조성을 위한 미생물 음압 고정화 방법으로서,
    상기 다공성 재료는 팽창질석이며, 상기 팽창질석의 함량은 상기 미생물 배양액 100 중량부에 대하여 1 내지 30 중량부이고,
    상기 음압 조건은 15~30분 동안 압력 1~15torr, 습도 50~70% 및 온도 10~30℃를 유지하고,
    상기 미생물은 로도블라스터스 아시도필러스(Rhodoblastus acidophilus)이고, 상기 로도블라스터스 아시도필러스는 정제수 1ℓ 기준으로 효모 추출물(Yeast extract) 0.05~1g, 디소듐 숙시네이트(Di-sodium succinate) 0.1~5g, 구연산철용액(Ferric citrate solution)(100㎖당 0.1g 포함) 2~10㎖, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.1~1g, 황산마그네슘 7수화물(MgSO4.7H2O) 0.1~1g, 염화나트륨(NaCl) 0.1~1g, 염화암모늄(NH4Cl) 0.1~1g 및 염화칼슘이수화물(CaCl2.2H2O) 20~100㎖를 포함하는 배지에서 pH 5~7 조건으로 배양된 것을 특징으로 하는 미생물 음압 고정화 방법.
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