KR102241973B1

KR102241973B1 - 종양의 분자 서브타이핑을 위한 방법 및 키트

Info

Publication number: KR102241973B1
Application number: KR1020167007289A
Authority: KR
Inventors: 랄프 비르츠; 크리스토프 크나이프
Original assignee: 비온테크 디아그노스틱스 게엠베하; 스트라티파이어 몰레큘라 파톨로기 게엠베하
Priority date: 2013-08-19
Filing date: 2014-08-19
Publication date: 2021-04-19
Also published as: CN110468205A; JP6691864B2; WO2015024942A1; DK2959021T3; KR20160044033A; IL243430B; IL243430A0; AU2014310606A1; AU2014310606B2; CN105473735A; HUE040066T2; HK1218313A1; ES2951470T3; US10808283B2; PT2959021T; RU2016109976A; US20160201137A1; RU2690241C2; RU2016109976A3; US20200340065A1

Abstract

본 발명은 암 환자에 있어서 종양의 분자 아형을 동정하는 시험관 내 방법 및 종양 치료를 위해 암 환자를 계층화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암 환자에 있어서 종양의 분자 아형을 동정하는데 유용한 키트에 관계된 것이기도 하다.

Description

종양의 분자 서브타이핑을 위한 방법 및 키트{METHODS AND KITS FOR THE MOLECULAR SUBTYPING OF TUMORS}

본 발명은 암 환자에 있어서 종양의 분자 서브타입(subtype: 이하 '아형'이라 함)을 동정하는 시험관 내 (in vitro) 방법 및 종양 치료를 위해 암 환자를 계층화(stratifying)하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암 환자에 있어서 종양의 분자 아형을 동정하는데 유용한 키트에 관한 것이기도 하다.

종양 예후와 치료 반응의 예측은 종양의 분자 아형과 밀접하게 연관되어 있다. 예컨대 유방암과 같은 암의 수용체 현황 검색을 위해 현재 전세계적으로 이용되는 표준 방법론은 포르말린-고정 및 파라핀-포매된 (FFPE) 생검물 또는 절제 조직을 대상으로 한 면역조직화학(IHC)이다. 현재 내분비 치료제 또는 표적화된 전신 치료제 (즉 트라스투주맙)의 투여는 대개 IHC에 기반하고 있다.

FFPE 샘플 제조 및 특이 항체를 이용한 후속적인 면역조직화학은 현재 병리학 실험실에서만 행해지는 기술이다. 염색 결과의 해석 외에 FFPE 종양 조직의 현미경 검사로부터, 병리학자들은 종양 생물학 및 종양 확산에 관하여 임상적으로 필수적인 정보들을 얻어낸다. 뿐만 아니라, FFPE 조직 검사에 대한 병리학자의 해석은 임상적인 결정을 내리는데 있어서 중요한 컬럼으로 간주될 수 있다. 많은 나라에서, 병리학자들은 유방암 관리 결정과 관련한 소위 사례 연구회의 본질적인 중요한 역할을 담당한다. 비록 IHC가 중추적인 세팅에 있어 용이하게 실시될 수 있기는 하지만, 연구 병리학자들의 개개인의 의견과 경험은 매 케이스에서 중요한 결정을 내릴때마다 비중있게 참고된다.

그러나, 몇몇 연구결과, 면역조직화학 결과의 최대 40%에서 관찰자 간의 유의차와 기술적 다양성이 입증되었다. 더욱이, 면역조직화학은 각 수용체 현황과 관련하여, 정성적이거나, 또는 몇몇 경우, 반정량적인 설명만을 해 줄 뿐이다.

따라서, 적절한 종양 치료요법을 선택하는 것을 용이하게 해주고 (환자 계층화), 환자의 원격 전이 위험성 평가 및 치료 성공의 예측 및 예후를 가능케 해주는, 예컨대 유방 종양과 같은 종양의 분자 아형 결정을 위한 신뢰할 수 있고 객관적이며 정량적이고 재현가능한 검사 시스템이 요구되고 있다. 나아가, 이러한 검사 시스템은 암 환자의 상당수에 있어 적합한 분산 검사도 가능케 해준다.

발명의 개요

일 측면에서, 본 발명은 암 환자에 있어서 종양의 분자 아형을 동정하는 시험관 내 (in vitro) 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

(a) 종양 샘플 중 인간 표피성장인자 수용체 2 (HER2)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계;

(b) 종양 샘플 중 에스트로겐 수용체 (ESR1)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계;

(c) 종양 샘플 중 프로게스테론 수용체 (PGR)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계; 및

(d) 종양 샘플 중 증식 항원 Ki-67 (Ki67)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계; 및/또는

(e) 종양 샘플 중 RacGTPase-활성화 단백질 1 (RACGAP1)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계

를 포함한다.

일 구체예에서, HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 및/또는 RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 것은 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 및/또는 RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준이 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 및/또는 RACGAP1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치(a defined expression threshold)보다 낮은지 또는 높은지를 결정하는 것을 포함한다.

일 구체예에서, 단계 (a)는 단계 (b), (c) 및 (d) 및/또는 (e) 전에 수행된다.

일 구체예에서, 단계 (d) 및/또는 단계 (e)는 단계 (a), (b) 및 (c) 후에 수행된다.

일 구체예에서, 단계 (a)는 단계 (b) 전에 수행되고, 단계 (b)는 단계 (c) 전에 수행되며, 단계 (c)는 단계 (d) 및/또는 단계 (e) 전에 수행된다.

일 구체예에서, 분자 아형(molecular subtype)은 HER2-양성, 삼중-음성(triple-negative), 루미날 A 및 루미날 B를 포함하는 군으로부터 선택된다.

일 구체예에서, HER2의 RNA 전사체의 발현 수준이 HER2의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높으면 그 종양의 분자 아형은 HER2-양성으로 동정된다.

일 구체예에서,

- HER2의 RNA 전사체의 발현 수준이 HER2의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고;

- ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준이 ESR1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮으며;

- PGR의 RNA 전사체의 발현 수준이 PGR의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고; 및

- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮거나 높으면,

그 종양의 분자 아형은 삼중-음성인 것으로 동정된다.

일 구체예에서, 분자 아형은 루미날 A 또는 루미날 B이다.

일 구체예에서,

- ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준은 ESR1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높으며;

- PGR의 RNA 전사체의 발현 수준이 PGR의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높고; 및

- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준은 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높으면

그 종양의 분자 아형은 루미날 B인 것으로 동정된다.

일 구체예에서,

- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준은 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮으면,

그 종양의 분자 아형은 루미날 A인 것으로 동정된다.

일 구체예에서,

- HER2의 RNA 전사체의 발현 수준은 HER2의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고;

- ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준이 ESR1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높으며;

- PGR의 RNA 전사체의 발현 수준은 PGR의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고; 및

그 종양의 분자 아형은 루미날 B인 것으로 동정된다.

일 구체예에서,

- PGR의 RNA 전사체의 발현 수준은 PGR의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높고; 및

- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높으면

그 종양의 분자 아형은 루미날 B인 것으로 동정된다.

일 구체예에서,

- ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준은 ESR1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮으며;

그 종양의 분자 아형은 루미날 A인 것으로 동정된다.

일 구체예에서,

그 종양의 분자 아형은 루미날 B인 것으로 동정된다.

일 구체예에서, 분자 아형 루미날 A는 치료 후 원격 재발 없는 5년 생존 확률이 분자 아형 루미날 B와 연관된 치료 후 원격 재발 없는 5년 생존 확률보다 적어도 11%, 좋기로는 적어도 13% 더 높은 것과 연관이 있고 및/또는 치료 후 5년 생존 확률이 분자 아형 루미날 B와 연관된 치료 후 5년 생존 확률보다 적어도 7%, 좋기로는 적어도 9% 더 높은 것과 연관이 있다.

일 구체예에서, 상기 방법은 단계 (d)를 포함하며,

- ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준이 ESR1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높고

그 암 환자의 임상 결과가 불량할 위험성이 증가함을, 특히 원격 전이의 위험성이 증가함을 가리키는 것이다.

일 구체예에서, 이 방법은 단계 (e)를 포함하고, 및 RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준이 RACGAP1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높으면 그 암 환자의 임상 결과가 불량할 위험성이 증가함을 가리키는 것이다.

일 구체예에서, 이 방법은 단계 (d) 및 (e)를 포함하고,

- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고

- RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준이 RACGAP1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높으면

그 암 환자의 임상 결과가 불량할 위험성이 증가함을 가리키는 것이다.

일 구체예에서, 이 방법은 단계 (d) 및 (e)를 포함하고,

- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높고

그 암 환자의 임상 결과가 불량할 위험성이 더 증가함을 가리키는 것이다.

일 구체예에서, 임상 결과가 불량하다는 것은 생존율, 무재발 생존율 및 원격 재발 없는 생존율 중 하나 이상이 상대적으로 감소한 것을 포함한다.

일 구체예에서, 종양은 고형 종양이다.

일 구체예에서, 종양은 유방 종양이거나 또는 유방 종양으로부터 유도된 것이다.

일 구체예에서, 암은 유방암이다.

일 구체예에서, 샘플은 종양으로부터 추출된 RNA이다.

일 구체예에서, RNA 전사체의 발현 수준은 역전사(reverse transcription: RT) 정량 PCR에 의해 결정된다.

일 구체예에서, 정량 PCR은 형광-기반 정량 실시간 PCR이다.

일 구체예에서, 이 방법은 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NOs: 1 및 2의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드(contiguous nucleotides)를 포함하는 ESR1-특이 프라이머, 및/또는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NOs: 4 및 5의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 HER2-특이 프라이머, 및/또는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NOs: 7 및 8의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 Ki67-특이 프라이머, 및/또는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NOs: 10 및 11의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 PGR-특이 프라이머, 및/또는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NOs: 13 및 14의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 RACGAP1-특이 프라이머를 이용하는 것을 포함한다.

일 구체예에서, 이 방법은 길이가 20 내지 35개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NO: 3의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 ESR1-특이 프로브, 및/또는 길이가 20 내지 35개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NO: 6의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 HER2-특이 프로브, 및/또는 길이가 20 내지 35개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NO: 9의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 Ki67-특이 프로브, 및/또는 길이가 20 내지 35개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NO: 12의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 PGR-특이 프로브, 및/또는 길이가 20 내지 35개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NO: 15의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 RACGAP1-특이 프로브를 이용하는 것을 포함한다.

일 구체예에서, 발현 수준은 종양 샘플 중의 하나 이상의 레퍼런스 유전자의 (평균) 발현 수준에 대해 정규화된다.

일 구체예에서, 하나 이상의 레퍼런스 유전자는 CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 및 GAPDH를 포함하는 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 치료를 위해 암 환자를 계층화하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 제1 단계로서, 상기 정의한 바와 같은 시험관 내 방법을 이용하여 암 환자의 종양의 분자 아형을 동정하고, 제2 단계로서, 상기 시험관내 방법에 의해 동정된 분자 아형에 기초하여 종양 치료요법을 선택하는 것을 포함한다.

일 구체예에서, 분자 아형은 HER2-양성, 삼중-음성, 루미날 A 및 루미날 B를 포함하는 군으로부터 선택된다.

일 구체예에서,

- 분자 아형은 HER2-양성이고, 종양 치료요법은 항-HER2 항체 및 화학요법제의 투여를 포함하며;

- 분자 아형은 삼중-음성이고, 종양 치료요법은 화학요법제의 투여를 포함하며;

- 분자 아형은 루미날 A이고, 종양 치료요법은 내분비요법(endocrine therapy)을 포함하며; 또는

- 분자 아형은 루미날 B이고, 종양 치료요법은 내분비요법 및 임의로, 화학요법제의 투여를 포함한다.

일 구체예에서, 분자 아형은 루미날 B이고, 종양 치료요법은 화학요법제의 투여를 포함한다.

일 구체예에서, 분자 아형은 루미날 B이고, 종양 치료요법은 탁산, 좋기로는 도세탁셀의 투여를 포함한다.

일 구체예에서, 탁산은 플루오로우라실, 에피루비신 및 사이클로포스파미드 (FEC)와 조합하여 투여된다.

일 구체예에서, 종양은 고형 종양이다.

일 구체예에서, 종양은 유방 종양이거나 유방 종양으로부터 유래한다.

일 구체예에서, 암은 유방암이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암의 치료방법에 관한 것으로, 상기 방법은 제1 단계로서, 상기 정의된 바와 같은 시험관내 방법을 이용하여 종양 치료를 위해 암 환자를 계층화하고, 제2 단계로서, 선택된 종양 치료요법을 암 환자에게 제공하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 역전사(RT) 정량 PCR 수단에 의해 암 환자에 있어서 종양의 분자 아형을 동정하는데 유용한 키트에 관한 것으로서, 상기 키트는:

- 적어도 한 쌍의 HER2-특이 프라이머 및 적어도 한개의 HER2-특이 프로브;

- 적어도 한 쌍의 ESR1-특이 프라이머 및 적어도 한개의 ESR1-특이 프로브;

- 적어도 한 쌍의 PGR-특이 프라이머 및 적어도 한개의 PGR-특이 프로브; 및

- 적어도 한 쌍의 Ki67-특이 프라이머 및 적어도 한개의 Ki67-특이 프로브; 및/또는

- 적어도 한 쌍의 RACGAP1-특이 프라이머 및 적어도 한개의 RACGAP1-특이 프로브

를 포함한다.

일 구체예에서, 정량 PCR은 형광-기반 정량 실시간 PCR이다.

일 구체예에서, 프로브의 검색은 증폭-매개된 프로브 변위(displacement)이다.

일 구체예에서, 프로브는 형광 리포터 모이어티 및 형광 소광(flurescence quencher) 모이어티를 포함하는 이중-트라스투주맙(dual-label) 프로브이다.

일 구체예에서, 키트는 역전사효소 및 DNA 폴리머라제를 더 포함한다.

일 구체예에서, 역전사효소 및 폴리머라제는 1단계(one-step) 역전사(RT) 정량 PCR을 가능케 하는 효소-믹스 형태로 제공된다.

일 구체예에서, 키트는 적어도 한 쌍의 레퍼런스 유전자-특이 프라이머 및 적어도 한개의 레퍼런스 유전자-특이 프로브를 더 포함한다.

일 구체예에서, 레퍼런스 유전자는 CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 및 GAPDH를 포함하는 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.

일 구체예에서, 키트는 적어도 한개의 대조군 RNA 샘플을 더 포함한다.

일 구체예에서, 프라이머는 120 bp 미만의 암플리콘(amplicon) 크기를 제공한다.

일 구체예에서, ESR1-특이 프라이머는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NOs: 1 및 2의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하고, 및/또는 HER2-특이 프라이머는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NOs: 4 및 5의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며, 및/또는 Ki67-특이 프라이머는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NOs: 7 및 8의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하고, 및/또는 PGR-특이 프라이머는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NOs: 10 및 11의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며, 및/또는 RACGAP1-특이 프라이머는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NOs: 13 및 14의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다.

일 구체예에서, ESR1-특이 프로브는 길이가 20 내지 35개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NO: 3의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하고, 및/또는 HER2-특이 프로브는 길이가 20 내지 35개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NO: 6의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며, 및/또는 Ki67-특이 프로브는 길이가 20 내지 35개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NO: 9의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하고, 및/또는 PGR-특이 프로브는 길이가 20 내지 35개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NO: 12의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며, 및/또는 RACGAP1-특이 프로브는 길이가 20 내지 35개 뉴클레오타이드이고 SEQ ID NO: 15의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다.

일 구체예에서, 종양은 고형 종양이다.

일 구체예에서, 종양은 유방 종양이거나 또는 유방 종양으로부터 유래된 것이다.

일 구체예에서, 암은 유방암이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 키트의, 암 환자에 있어서 종양의 분자 아형을 동정하기 위한 용도에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 키트의, 암 환자의 원격 전이 위험성을 평가하기 위한 용도에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 방법을 종래의 서브타입 분류법(예컨대 IHC)의 백업으로서 또는 종래의 환자 계층화 방법에 대한 보강법으로서 사용하는 것을 개략 설명한 도면이다.
도 2는 유방암 환자의 5년 생존률에 있어서 HER2, ESR1, PGR, Ki67 및 RACGAP1 mRNA의 발현 수준의 예후값 및 예측값을 평가하기 위한 분배 검사를 설명한 도면이다. 먼저 855종의 종양으로부터 입수가능한 데이터를 HER2 mRNA 발현 수준에 의해 계층화하여 HER2-양성 종양을 동정하였다 (> 컷-오프값 38). 추가로 HER2-음성 종양을 ESR1 mRNA 발현 수준에 의해 계층화하였다. A: ESR1-양성 종양(> 컷-오프값 34)을 Ki67 mRNA 발현 수준 (컷-오프값 31.7)에 의해, 이어서 PGR mRNA 발현 수준 (컷-오프값 30.2)에 의해 추가로 계층화하였다. B: 별법으로, ESR1-양성 종양 (> 컷-오프값 34)을 PGR mRNA 발현 수준 (컷-오프값 30.2) 이어서 Ki67 mRNA 발현 수준 (컷-오프값 31.7)에 의해 추가로 계층화하였다. 이들 데이터의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석을 도 3 및 4에 나타내었다. C: Ki67-양성 및 Ki67-음성 종양을 RACGAP1 mRNA 발현 수준 (컷-오프값 34.2)에 의해 계층화하였다. RACGAP1의 추가 분석을 위한 환자 수를 증가시키기 위해, 이 도면에는 PGR에 대한 데이터가 주어지지 않는다. PGR의 추가 고려는 RACGAP1과 관련된 전체적인 결과를 변경하지 않는다. 데이터(표 3 참조)는 소정의 역치를 상회 또는 하회하는 RACGAP1 mRNA 발현 수준이 특히 5년 생존율의 유의차와 연관되어 있음을 나타낸다.
도 3은 HER2-양성 (HER2), 루미날 A (LumA), 루미날 B (LumB) 또는 삼중-음성 (TNT) 종양을 갖는 유방암 환자들의 생존율을 카플란 마이어 분석한 도면으로서, 여기서 종양의 분자 아형은 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67의 mRNA 발현 수준에 기반하여, 본 발명의 방법으로 동정하였다. 본 발명자들에 의해 정의된 바와 같은 루미날 A 아형은 5년 후 97%의 전체 생존율과 연관되어 있다 (vs. 루미날 B 및 HER2-양성 종양은 87%, 그리고 삼중-음성 종양은 84%).
도 4는 HER2-양성 (HER2), 루미날 A (LumA), 루미날 B (LumB) 또는 삼중-음성 (TNT) 종양을 갖는 유방암 환자들의 원격 전이 없는 생존율(distant metastasis free survival ("DMFS"); 수술 X년 후 원격 재발)의 카플란 마이어 분석을 설명한 도면으로서, 이들 종양의 분자 아형들은 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67의 mRNA 발현 수준에 기초하여 본 발명의 방법에 따라 동정하였다. 본 발명자들에 의해 정의된 바와 같은 루미날 A 아형은 5년 후 92%의 DMFS와 연관되어 있다 (vs. 루미날 B, HER2-양성 및 삼중-음성 종양의 경우 78%).
도 5는 면역조직화학에 의한 분자 아형 결정법(Sotiriou et al. (2009), N Engl J Med, 360(8):790-800)을 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67의 mRNA 발현 수준에 기초한 본 발명의 방법을 이용한 분자 아형 결정법과 비교한, DMFS의 다변량 Cox 회귀분석 결과를 나타낸 도면이다. 이 분석 결과는, 본 발명의 방법으로 얻은 결과를 Cox 비례위험 모델에 포함시킨 경우, 면역조직화학 아형 결정법이 그의 유의성을 잃는 것으로부터, 본 발명의 방법이 더 우수함을 명백히 보여준다.
도 6 내지 9는 환자 샘플 1 내지 6 및 로트 1 내지 3에 대하여 RT-qPCR에 의해 결정된 바와 같은 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 마커들의 40-ΔΔCT 값을 나타낸다.
도 10은 루미날 B 종양이 있는 환자들의 전체 생존율을 카플란 마이어 분석한 결과를 나타낸 도면이다. A: RT-qPCR에 의해 정의할 경우, 도세탁셀-FEC로 처리된 루미날 B 암 환자들은 비노렐빈-FEC로 처리된 경우보다 훨씬 더 오래 생존한다 (각각 97% vs. 89%, 위험비 [Hazard Ration: HR] 0.241; CI: 0.090-0.642). B: 종양 아형을 IHC에 의해 정의한 경우, 루미날 B 환자에 있어서 도세탁셀의 잇점은 나타나지 못하였다 (95% vs. 92%, HR 0.617; CI 0.235-1.623).
도 11은 SAP에 명시된 바와 같은 Cox 회귀에 의해 종양 조직 유형에 대해 조정된, 루미날 B 종양이 있는 환자들의 전체 생존율을 카플란 마이어법으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다. A: RT-qPCR 키트에 의해 도세탁셀이 더 유리할 것이라는 예측은 여전히 유의적이다 (97% vs. 88%, HR 0.232; CI 0.087-0.624). B: IHC에 의한 아형 결정은 도세탁셀이 더 유리할 것이라는 것을 예측하지 못한다 (96% vs. 92%, HR 0.510; CI 0.184-1.414).
도 12는 루미날 B 종양 환자들의 원격 전이 없는 생존율(DMFS)에 대한 카플란 마이어 분석 결과를 나타낸 도면이다. A: RT-qPCR에 의해 정의할 경우, 루미날 B 환자들은 도세탁셀-FEC로 처리될 경우 비노렐빈-FEC에 비해 원격 전이 없이 유지될 확률이 더 높다 (각각 89% vs. 78%, HR 0.471; CI 0.263-0.843). B: 루미날 B 종이 IHC에 의해 정의될 경우, 상이한 치료법들 간에 생존율 차이는 관찰되지 않는다 (87% vs. 86%, HR 0.938 CI 0.474-1.856).
도 13은 SAP에 명시된 바와 같이 Cox 회귀법에 의해 전이 림프절의 수, 종양 크기 및 조직유형에 대해 조정된, 루미날 B 종양을 갖는 환자들의 원격 전이 없는 생존율의 카플란 마이어 분석 결과를 나타낸 도면이다. A: 본 발명의 아형 결정 분석법을 이용하면 효과가 유의적으로 유지된다 (90 vs. 78%, HR 0.409; CI 0.219-0.764). B: 이와 대조적으로 IHC에 의해 종양 아형 결정을 실시한 경우 효과가 없다 (89% vs. 85%, HR 0.674; CI 0.307-1.481).
도 14는 HER2-양성 종양 환자들의 전체 생존율을 카플란 마이어 분석한 결과를 나타낸 도면이다. A: RT-qPCR에 의해 정의시, HER2-양성 환자들은, 도세탁셀로 처리될 경우 비노렐빈으로 처리되는 경우에 비해, 더 우수한 전체 생존율을 나타내지는 않는다(87 vs. 91%, HR 1.320; CI 0.556-3.132). B: IHC에 의한 종양 아형 결정의 경우 유사한 결과가 나타났다 (86% vs. 89%, HR 1.175; CI 0.518-2.663).
도 15는 HER2-양성 종양의 원격 전이 없는 생존율을 카플란 마이어 분석한 결과를 나타낸 도면이다. A: 본 발명의 방법으로 정의시, HER2-양성 환자들은 도세탁셀로 처리될 경우 비노렐빈으로 처리되는 경우에 비해 원격 전이없는 생존율에 있어 차이를 나타내지 않았다(80 vs. 81%, HR 1.070; CI 0.551-2.076). B: 마찬가지로, IHC로 정의시, 상이하게 처리된 HER2-양성 환자들은 생존율에 있어 차이를 나타내지 않았다(78% vs. 77%, HR 0.975; CI 0.516-1.843).
도 16은 루미날 A 종양의 전체적인 생존율을 카플란 마이어 분석한 결과를 나타낸 도면이다. A: RT-qPCR에 의해 정의시, 루미날 A 환자들은 도세탁셀로 처리된 경우 비노렐빈으로 처리된 경우에 비해 전체적인 생존율이 더 낮은 경향이 있다 (95% vs. 98%, HR 2.471; CI 0.477-12.809). B: 이와 대조적으로, IHC에 의해 정의시, 루미날 A 환자들은 도세탁셀로 처리된 경우 비노렐빈에 비해 약하고 비유의적인, 보다 긴 전체 생존율을 나타냈다 (97 vs. 93% HR 0.443; CI 0.114-1.716).
도 17은 루미날 A 종양 환자들의 원격 전이 없는 생존율의 카플란 마이어 분석 결과를 설명한 도면이다. A: RT-qPCR에 의해 정의시, 루미날 A 환자들은 도세탁셀이나 비노렐빈으로 처리될 경우 원격 전이 없는 생존율에 있어 차이를 나타내지 않는다(92% vs. 90%, HR 0.826; CI 0.336-2.033) B: 도세탁셀로 처리된 IHC-아형 결정된 환자들의 경우 비노렐빈으로 처리된 경우에 비해 약하고 비유의적인, 보다 긴, 원격 전이 없는 생존율을 나타낸다(93% vs. 88%, HR 0.553; CI 0.221-1.386).
도 18은 TNBC 종양 환자들의 전체적인 생존율의 카플란 마이어 분석 결과를 나타낸 도면이다. A: RT-qPCR에 의해 정의시, TNBC를 갖는 환자들은 도세탁셀 또는 비노렐빈으로 치료시 전체 생존률에 아무런 차이를 나타내지 않았다 (84% vs. 83%, HR 0.949; CI 0.338-2.665). B: IHC에 의해 정의시, TNBC 환자들은 보다 긴 생존율에 대해 약하고 비유의적인 경향을 나타낸다 (88% vs. 80%, HR 0.552; CI 0.207-1.472).
도 19는 TNBC 종양 환자들의 원격 전이 없는 생존율의 카플란 마이어 분석 결과를 나타낸 도면이다. A: 상이하게 처리된 RT-qPCR-정의된 TNBC 환자들은 원격 전이 없는 생존율에 있어서 유의차를 나타내지 않는다(74% vs. 78%, HR 1.211; CI 0.523-2.802). B: IHC-정의된 TNBC 환자들은 도세탁셀과 비노렐빈으로 처리 비교시 원격 전이 없는 보다 긴 생존율에 대해 약하고 비유의적인 경향을 나타낸다 (82% vs. 72%, HR 0.615; CI 0.284-1.333).
도 20 A는 IHC (y-축 상의 % 양성 세포로 표시됨) 및 RT-qPCR (x-축 상의 40-ΔΔCT로 표시됨)에 의한 연속적인 Ki67 평가값의 산포도를 나타낸다. 선들은 통계 분석 플랜의 소정의 컷-오프값을 나타낸다 (수평선: IHC 20%; 수직선: RT-qPCR 34.8 40-ΔΔCT). B는 RT-qPCR와 IHC 기반 분류 간의 일치와 불일치를 나타낸다 (양[pos] vs. 음[neg]). C는 고도로 유의적인 상관관계(p<0.0001)를 드러내지만 방법들 간에 어느 정도 일치성을 보이는 카파 통계를 나타낸다. D는 RT-qPCR vs. IHC에 의해 Ki67을 검사시, 양의 백분율 일치도 및 음의 백분율 일치도(각각 PPA (Positive Percent Agreement) 및 NPA (Negative Percent Agreement)를 나타낸다.
도 21은 RT-qPCR 및 IHC 간의, 에스트로겐 수용체 양성 종양을 갖는 환자들의 원격 전이 없는 생존율과 불일치 Ki67 결과의 카플란 마이어 분석 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명의 그 밖의 목적, 장점 및 특징들은 특히 첨부된 도면을 참조로, 다음의 상세한 설명으로부터 명확히 이해될 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명을 이하에 상세히 설명하지만, 이하에 설명된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약들에는 얼마든지 변화를 가할 수 있으므로 본 발명이 이하의 설명으로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용된 용어들은 특정 구체예의 설명 목적을 위해 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며 본 발명의 범위는 어디까지나 첨부된 청구범위에 의해 제한된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술용어 및 과학용어들은 통상의 기술자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

이하에서, 본 발명의 요소들을 설명한다. 이들 요소들은 특정 구체예와 함께 수록되지만, 추가 구체예를 만들기 위해 이들을 여하한 방식으로, 여하한 수로 이용할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

다양하게 설명된 실시예와 바람직한 구체예들은 본 발명을 특정적으로 설명된 구체예로 한정하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 이 설명은 개시된 및/또는 바람직한 여하한 요소들과 조합된 명시적으로 설명된 구체예들을 보충 및 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 이 출원의 설명된 모든 요소들의 순서와 조합은 달리 지시되지 않는 한 본 발명의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.

바람직하게는, 본 발명에 설명된 용어들은 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)" [H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, 및 H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)]에 설명된 정의를 갖는다.

본 발명은 달리 지시되지 않는 한, 본 발명이 속한 기술 분야의 문헌 [참조, 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989)]에 설명된 재조합 DNA 기술, 화학, 생화학, 세포생물학, 및 면역학의 통상적인 방법을 이용하여 수행된다.

본 명세서와 첨부된 청구범위 전반에 걸쳐, 달리 요구되지 않는 한, "포함하다(comprise)"라는 용어와 이의 파생어들 "comprises" 및 "comprising"은 언급된 구성요소, 구성요소의 정수 또는 갯수 또는 그룹, 정수 또는 갯수를 포괄하는 것으로 이해되어야 하며, 설령 몇몇 구체예에서 다른 구성요소, 구성요소의 정수 또는 갯수 또는 그룹, 정수 또는 갯수가 배제될 수 있다 해도, 다른 구성요소, 구성요소의 정수 또는 갯수 또는 그룹, 정수 또는 갯수가 배제되는 것으로 이해되어서는 아니된다. 즉, 본 발명은 명시된 구성요소, 정수 또는 단계 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하여 구성된다. 관사 "a" 및 "an" 그리고 "the" 및 본 발명을 설명하는 관점에서 사용된 유사한 참조 표현들(특히 청구범위에서)은 달리 언급하거나 명백히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 두 가지 의미를 모두 포괄하는 것이다. 개시된 값들의 인용 범위는 단지 해당 범위에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 칭하는 단축법 역할을 하게 하려는 의도이다. 달리 언급되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본 명세서에 개별적으로 인용된 것처럼 본 명세서에 통합된다. 본 명세서에 설명된 모든 방법들은 달리 지시되거나, 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 여하한 적절한 순서로 수행되어도 무방하다. 본 명세서에 제시된 모든 실시예 또는 예시적인 표현 (예컨대 "과 같은..")은 본 발명을 더욱 잘 묘사하기 위한 것일 뿐, 달리 청구되지 않은 본 발명의 범위를 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니다. 명세서 내의 어떠한 표현도 본 발명을 실시함에 있어 필수적이지만 청구되지는 않은 여하한 구성요소를 가리키는 것으로 이해되어서는 아니된다.

명세서 전반에 걸쳐 몇몇 문헌들이 인용되었다. 전술 또는 후술되는 인용된 각 문헌들 (특허, 특허출원, 과학 간행물, 제조자 명세표, 지침서 등을 모두 포함한다)은 그 내용 전체가 본 명세서에 참고 통합된다. 이들 문헌을 종래 기술로 언급했다 하며, 본원발명의 개시가 이들 문헌의 개시보다 선행되지 못함을 인정하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

일 측면에서, 본 발명은 암 환자에 있어서 종양의 분자 아형을 동정하기 위한 시험관 내 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은:

(a) 종양 샘플 내 인간 표피성장인자 수용체 2 (HER2)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계;

(b) 에스트로겐 수용체 (ESR1)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계;

(c) 종양 샘플 내 프로게스테론 수용체 (PGR)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계; 및

(d) 종양 샘플 내 증식 항원 Ki-67 (Ki67)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계; 및/또는

(e) 종양 샘플 내 RacGTPase-활성화 단백질 1 (RACGAP1)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계

를 포함한다.

일 구체예에서, 상기 방법은 1종 이상의 부가적인 비-레퍼런스 유전자의 발현 수준, 특히 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 것은 포함하지 않는다. 달리 설명하면, HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 및/또는 RACGAP1 및 1종 이상의 레퍼런스 유전자가 아닌 다른 유전자의 발현 수준, 특히 RNA 전사체의 발현 수준은 결정 대상이 아니다.

일 구체예에서, 상기 방법은 림프절 상태를 조직학적 등급매기기 또는 결정하는 것과 같은 여타의 진단 단계는 포함하지 않는다.

본 발명에서 "종양"이라는 용어는 악성이건 양성이건, 그리고 전암성 및 암성 세포와 조직을 망라하여 모든 신생 조직 세포 성장 및 증식을 가리킨다. 본 발명의 일 구체예에서, 종양은 고형 종양이다. 일 구체예에서, 종양은 유방 종양이거나 또는 유방 종양으로부터 유래한다 (예컨대 전이에 의해).

본 발명에서 "암"에는 비정상적으로 조절되는 세포 성장, 증식, 분화, 부착 및/또는 이동에 의해 특징지어지는 질병이 포함된다. 본 발명에서 "암"이라는 용어에는 백혈병, 고환종, 흑색종, 기형종, 림프종, 신경모세포종, 신경아교종, 신장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌의 암, 자궁경부암, 장암(intestinal cancer), 간암, 결장암, 위암, 장암(intestine cancer), 두경부암, 위장관암, 림프절암, 식도암, 대장암, 췌장암, 이비인후과(ENT)암, 유방암, 전립선암, 자궁의 암, 난소암, 폐암 및 이의 전이암이 포함된다. 이들의 예로는 폐암종, 유방암종, 전립선암종, 결장암종, 신장세포 암종, 자궁경부암종 또는 전술한 암 종류 또는 종양의 전이를 들 수 있다. 본 발명에서 암이라는 용어에는 암 전이도 포함된다. 일 구체예에서, 암은 유방암이다.

용어 "유방암"은 유방 조직, 가장 흔하게는 유선에 젖을 공급하는 유방 소엽(lobules) 또는 유선의 내측 라이닝에 기원하는 암의 유형이다. 유선으로부터 기원하는 암은 관상암종(ductal carcinomas)이라 알려진 반면, 소엽으로부터 유래하는 암은 소엽암종(lobular carcinomas)으로 알려져 있다. 때로, 유방암은 전이 질환으로 나타난다. 흔한 전위 부위에는 뼈, 간, 폐 및 뇌가 포함된다. 유방암은 인간 및 다른 포유동물에서 발생한다. 인간의 경우 압도적인 다수는 여성에게서 발생하지만, 남성 유방암도 발생할 수 있다. 유방암의 치료법에는 외과수술, 약물치료(호르몬요법 및 화학요법), 방사선 치료 및/또는 면역요법/표적화요법이 포함된다.

본 발명에서 "환자"라는 용어을 인간 및 기타 포유동물 예컨대 설치류, 토끼 또는 원숭이 등의 동물과 같은 모든 생물을 망라한다. 설치류는 마우스, 래트, 햄스터, 기니픽 또는 친칠라일 수있다. 좋기로는, 환자가 사람인 것이 바람직하다.

본 발명에서, "RNA 전사체(RNA transcript)"라는 용어는 좋기로는 "메신저 RNA"를 의미하는 "mRNA"가 포함 및 관계되며, 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 "전사체"에 관한 것이다. mRNA는 일반적으로 5' 비번역 영역(5'-UTR), 단백질 또는 펩타이드 코딩 영역 및 3' 비번역 영역(3'-UTR)을 포함한다. mRNA는 세포 및 시험관 내에서 제한된 반감기를 갖는다.

유전자 HER2 (ERBB2라고도 칭해짐; 위치: 17q12, 설명: 염색체: 17; NC_000017.10)은 수용체 티로신 키나아제의 표피성장인자(EGF) 수용체 패밀리의 일 멤버를 인코딩한다. 이 유전자의 증폭 및/또는 과발현은 유방 종양 및 난소 종양을 비롯한 많은 암에서 보고된 바 있다. NCBI 데이터베이스에는, 2가지 단백질 버젼을 코딩하는 HER2에 대한 2 가지 mRNA 변이체가 포함되어 있다. 단백질 및 mRNA 서열이 NM_001005862.1 (수용체 티로신-단백질 키나아제 erbB-2 아이소폼 b) 및 NM_004448.2 (수용체 티로신-단백질 키나아제 erbB-2 아이소폼 전구체)라는 명칭으로 기록되어 있다. HER2 유전자 증폭은 원발 유방암종의 약 10-20%에서 일어난다.

유전자 ESR1 (위치: 6q25, 설명: 염색체 6, NC_000006.11)은 호르몬 결합, DNA 결합 및 전사 활성화에 중요한 몇 가지 도메인들로 이루어진 리간드-활성화된 전사 인자인 에스트로겐 수용체 (ER)을 인코딩한다. 에스트로겐 수용체는 유방암, 자궁내막암 및 골다공증을 비롯한 병리학적 프로세스와 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 4종의 ESR1 mRNA 변이체들이 알려져 있는데, 이들 전사 변이체들은 5' UTR에서 차이가 나거나 및/또는 프로모터 용도에서 차이가 나지만, 각 변이체들은 동일한 단백질을 코딩한다. 모든 유방암의 70-80%는 ER 양성이다.

유전자 PGR (PR이라고도 칭함; 위치: 11q22-q23, 설명: 염색체: 11; NC_000011.9)은 프로게스테론 수용체를 인코딩한다. 스테로이드계 호르몬 예컨대 프로게스테론 및 이들의 수용체들은 진핵생물 유전자 발현의 조절과 연관이 있고 표적 조직에서 세포 증식 및 분화에 영향을 미친다. 이 유전자는 2개의 mRNA 아이소폼 A 및 B의 생산을 위해 첫 번째 엑손에서 2개의 특징적인 프로모터 및 번역 개시 자리를 이용한다. 이 두 개의 아이소폼들은 아이소폼 B의 N-말단에 부가적인 165 아미노산이 발견되는 것을 제외하고 상호 동일하다. 유방 종양의 40%는 PGR에 양성이다.

유전자 Ki-67 (Ki67; 위치: 10q26.2, 설명: 염색체: 10; NC_000010.10)은 세포 증식과 연관이 있고 세포 증식에 필요할 수 있는 핵 단백질을 인코딩한다. 2종의 mRNA 변이체가 설명된 바 있다. 관련된 거짓유전자가 10번 염색체 상에 존재한다. 유방 종양의 약 25%는 Ki67에 양성이다.

유전자 RACGAP1 (위치: 12q13.12, 설명: 염색체: 12; NC_000012.11)는 RacGTPase-활성화 단백질 1을 인코딩한다. 세 가지 스플라이스 변이체들이 설명된 바 있는데, 이들 모두 동일한 단백질을 인코딩한다. RACGAP1은 중심 방추 복합체의 일 성분이며 성장-관련 프로세스 및 분화를 제어하는데 있어 중요한 역할을 한다.

본 발명에서 "발현 수준"이라는 용어는 전사체 및/또는 단백질 생산을 위한 특정 유전자 (즉 HER2, ESR1, PGR, Ki67 또는 RACGAP1)의 발현을 가리킨다. 본 발명에서, 발현 수준은 RNA 전사체 수준, 특히 mRNA 수준(전사 수준)에서, 예컨대 전사된 mRNA를 (예컨대 노던 블랏에 의해) 측정하거나, 역전사(RT) 정량 PCR에 의하거나 또는 mRNA를 직접 염색(예컨대 인 시투 하이브리다이제이션을 통해)함으로써 결정된다.

일 구체예에서, 용어 "종양의 샘플"은 암 환자로부터 분리된 종양 조직 샘플을 가리킨다 (예컨대 생검물 또는 종양의 절제 조직). 바람직한 구체예에서, 종양 조직 샘플은 종양 조직 샘플의 냉동-절편(cryo-section)이거나 화학적으로 고정된 종양 조직 샘플이다. 바람직한 일 구체예에서, 종양 조직 샘플은 포르말린-고정 및 파라핀-포매된 (FFPE) 종양 조직 샘플이다. 일 구체예에서, 종양 샘플은 종양 조직 샘플로부터 추출된 (총) RNA이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 종양 샘플은 FFPE 종양 조직 샘플로부터 추출된 (총)RNA이다. 통상의 기술자라면 RNA 추출 공정을 실시할 수 있을 것이다. 예를 들어, FFPE 종양 조직의 5 내지 10 μm 커얼(curl)로부터의 총 RNA를 고순도 RNA 파라핀 키트(High Pure RNA Paraffin Kit: Roche, Basel, Switzerland) 또는 좋기로는 XTRAKT RNA Extraction Kit XL (Stratifyer Molecular Pathology, Cologne, Germany)을 이용하여 추출할 수 있다. 또한 사용될/검사될 샘플 물질을 냉동기에 보관하다가 적절한 시점에서 이를 해동시켜본 발명의 방법을 실시할 수도 있다. 샘플은 치료적 처치의 개시 전, 치료적 처치 동안 및/또는 치료적 처치 후에, 즉, 암치료제의 투여 전, 투여 중 또는 투여 후에 암 환자로부터 수득가능하다.

본 발명에서 "종양의 분자 아형"이라는 용어는 특징적인 원격 분자 프로파일, 예컨대 파일유전자 발현 프로파일에 의해 특징지어지는 종양의 아형을 가리킨다. 일 구체예에서, 분자 아형은 HER2-양성, 삼중-음성("기저-유사형(basal-like)"라고도 칭해짐), 루미날 A 및 루미날 B를 포함하는 군으로부터 선택된다. "기저-유사형"이라는 용어는 이러한 종양이 기저 상피세포의 그것과 유전자 발현에서 어떤 유사성을 갖는다는 사실을 가리킨다. "루미날"이라는 용어는 종양과 루미날 상피 간의 유전자 발현의 유사성으로부터 유래한 용어이다.

분자 아형은 임상 결과 및 치료법에 대한 반응에 있어 현저히 차이가 난다. 일 구체예에서, 본 발명에서 정의된 바와 같은 분자 아형 루미날 A는 치료 후 원격 재발 없는 5년 생존 확률이 분자 아형 루미날 B와 연관된 치료 후 원격 재발 없는 5년 생존 확률보다 적어도 11%, 좋기로는 적어도 13% 더 높거나 및/또는 치료 후 5년 생존 확률이 분자 아형 루미날 B와 연관된 치료 후 5년 생존 확률보다 적어도 7%, 좋기로는 적어도 9% 더 높은 것과 연관이 있다.

특히 본 발명에서 사용된 암의 치료와 연관된 "(치료적) 처치"라는 용어는 환자의 건강 상태를 개선 및/또는 환자 수명을 연장(증가)시키는 모든 치료법과 관련이 있다. 상기 치료는 암을 제거, 환자 내 종양의 크기를 감소 또는 종양 수를 감소, 환자 내 종양의 진행을 중단 또는 둔화, 환자 내 새로운 암의 진행을 억제 또는 둔화, 환자의 증상의 빈도나 위중도를 감소, 및/또는 이미 암에 걸린 적이 있거나 현재 걸려있는 환자들에서 암의 재발을 감소시키는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 용어 "치료" 및 "치료적 처치"는 원발 종양의 수술적 제거, 화학요법, 호르몬요법, 방사선치료 및 면역요법/표적화요법 중 1종 이상을 가리키는 것으로 의도된다.

보조요법은 일차 치료, 주치료, 또는 최초 치료에 부가적으로 주어진다. 암 치료에 이용되는 외과수술 및 복합 치료법은 주로 보조 암 치료를 설명하기 위해 사용될 용어가 되었다. 보조요법의 일례는 검색가능한 질병이 모두 제거되었으나, 오컬트 질병으로 인해 통계적 재발 위험성이 여전히 남아있는 경우, 대개 수술 후에(외과수술후) 행해지는 부가적인 치료법(예컨대 화학요법)이다. 비보조요법(nonadjuvant therapy)은 일차, 주요 또는 최초 치료에 앞서 행해지는 치료이다 (예컨대 외과수술전 화학요법).

본 발명에서, "RNA 전사체의 발현 수준 결정" 단계는 (i) RNA 전사체의 발현 수준을 측정하는 단계 및 (ii) 측정된 RNA 전사체의 발현 수준을 분석 (예컨대, 소정의 발현 역치와 같은 레퍼런스 발현 수준과의 비교에 의함)하는 단계를 포함하되, 여기서 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 및/또는 RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준 측정 순서는 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 및/또는 RACGAP1의 측정된 RNA 전사체의 발현 수준의 분석 순서와는 독립적이다.

일 구체예에서, HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 및/또는 RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 것은 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 및/또는 RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준이 ESR1, PGR 및 Ki67 및/또는 RACGAP1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮은지 또는 높은지를 결정하는 것을 포함한다. 그 발현 수준이 소정의 발현 역치와 동등하면, 그 발현 수준은 소정의 발현 역치보다높은 발현 수준 그룹에 속하는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명에서 "소정의 발현 역치보다 높다"라는 표현은 소정의 발현 역치와 동등하거나 더 높은 발현 수준을 포함한다. :소정의 발현 역치보다 높은" 발현 수준은 "발현-양성"으로 칭해질 수 있는 반면, "소정의 발현 역치보다 낮은" 발현 수준은 "발현-음성"으로 칭해질 수도 있다.

본 발명에서, "RNA 전사체의 소정의 발현 역치"라는 표현은 샘플 수로부터 계산된 평균 컷-오프값(줄여서, 컷-오프)를 가리키는 것일 수 있으며, 상기 샘플 수는 몇몇 대상자, 특히 암에 걸린 대상자의 수로부터 얻어진다. 역치를 얻기 위해서, 대상자의 수는 상이한 분자 아형의 종양을 갖는 대상자, 예컨대 HER2-양성 종양이 있는 대상자 및/또는 삼중-음성 종양이 있는 대상자 및/또는 루미날 A 종양이 있는 대상자 및/또는 루미날 B 종양이 있는 대상자를 포함할 수 있다.

역치는 RNA 전사체의 양 또는 농도를 나타낼 수 있다. 일 구체예에서, 역치는 CT (사이클 역치)값 (하기 내용 참조)로서 주어진다. 일 구체예에서, (상대적) 발현 수준 및 발현 역치는 40-ΔCT 또는 40-ΔΔCT 값 (하기 내용 참조)으로서 주어진다.

본 발명에서 "대상자"라는 용어는 인간 및 기타 포유동물, 예컨대 설치류, 토끼 또는 원숭이 양자를 모두 포함하여 척추동물, 특히 포유동물과 같은 모든 종류의 생물일 수 있다. 설치류는 마우스, 래트, 햄스터, 기니픽 또는 친칠라일 수 있다. 좋기로는 대상자는 인간인 것이 바람직하다. 일 구체예에서, 대상자는 질병, 특히 암에 걸려있거나 걸린 것으로 의심되는 대상자이며, 본 발명에서 "환자"라고도 칭해진다. 평균 컷-오프 값을 결정하기 위해, 적어도 2명의 대상자, 좋기로는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 적어도 1500, 또는 적어도 2000명의 대상자를 검사하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라 사용되는 유전자 마커들에 대해서는 이미 다양한 임상 연구가 수행된 바 있으므로, 정량 결과를 "발현-양성" 또는 "발현-음성"으로 양분하기 위한 임상 컷-오프/역치의 검정 및 정의를 위한 트레이닝-테스팅 세팅의 일치 연구만으로 충분할 것이다. 따라서, 일 구체예에서, 컷-오프/역치는 한 가지 이상의 이전의 임상연구에 기초하여 정의된다. 또한, 컷-오프/역치의 평가 및 검정을 위해 부가적인 임상 연구가 수행될 수도 있다. 컷-오프/역치는 기술 분야의 공지 기술에 의해 결정/정의될 수 있다.

일 구체예에서, 컷-오프/역치는 예컨대 IHC-ISH와 같은 임상-병리학적 파라미터 및/또는 예컨대 FinHER 연구의 FFPE 조직 샘플 (Joensuu et al. (2006), N Engl J Med, 354: 809-820)에서 검정된 독립적인 임상시험 코호트 및 포셔닝 테스트 (예컨대 SAS Software JMP

9.0.0)에 의해 트레이닝 코호트 (예컨대, HE10-97, Pentheroudakis et al. (2009), Breast Cancer Res Treat, 116: 131-143)에서 예컨대 전체 생존율(OS), 무질병 생존율(DFS) 및 원격 전이 없는 생존율(DMFS), 및 질병-특이적 생존율(DSS)에 대한 데이터에 기초하여 결정/정의된다.

일 구체예에서, 40-ΔCT 값은 다음과 같이 산출된다: 40 - [환자 샘플의 대응하는 바이오마커 (즉 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 및/또는 RACGAP1)의 CT - 환자 샘플의 레퍼런스 유전자(예컨대, CALM2)의 CT] (= 계산방법 1). 만일 두 개 이상의 레퍼런스 유전자가 사용될 경우, 40-ΔCT 값은 다음과 같이 계산된다: 40 - (환자 샘플의 대응하는 바이오마커의 CT - 환자 샘플의 선택된 레퍼런스 유전자의 평균 CT) (= 계산방법 2). 별법으로, 40-ΔΔCT 값을 이용할 수 있는데, 여기서 40-ΔΔCT는 다음과 같이 계산할 수 있다: ΔΔCT = 40 - [(CT 환자 샘플의 바이오마커 - 레퍼런스 샘플의 CT 바이오마커) - (환자 샘플의 CT 레퍼런스 유전자 - 레퍼런스 샘플의 CT 레퍼런스 유전자)] (= 계산방법 3); 예컨대, 40-ΔΔCT = 40 - [(CT Ki67 환자 샘플 - CT Ki67 레퍼런스 샘플) - (환자 샘플의 CT CALM2 - 레퍼런스 샘플의 CT CALM2)]. 일 구체예에서, CALM2는 레퍼런스 유전자로서 사용된다.

예시적인 일 구체예에서, 평균 컷-오프값은 계산방법 2에 따른 40-ΔCT 값이며, 여기서 HER2에 대한 평균 컷-오프값은 40-ΔCT 값인 38, ESR1에 대한 평균 컷-오프값은 40-ΔCT 값인 34, PGR의 평균 컷-오프값은 40-ΔCT 값인 30.2, 그리고 Ki67의 평균 컷-오프값은 40-ΔCT 값인 31.7이고, RACGAP1에 대한 평균 컷-오프값은 40-ΔCT 값인 34.2이다.

또 다른 구체예에서, 바이오마커들의 상대적인 발현 수준은 40-ΔΔCT 값으로 주어지되, 이 값은 다음과 같이 계산된다: 40 - [(환자 샘플의 CT 바이오마커 - 환자 샘플의 CT 레퍼런스 유전자) - (대조군 샘플의 CT 바이오마커 - 대조군 샘플의 CT 레퍼런스 유전자)] (= 계산방법 4); 예컨대, 40-ΔΔCT = 40 - [(CT Ki67 환자 샘플 - CT 평균 CombRef 환자 샘플) - (CT Ki67 대조군 샘플 - CT 평균 CombRef 대조군 샘플)]. 일 구체예에서, CT는 메디안(median) CT이다. 레퍼런스 유전자의 CT는 단일 레퍼런스 유전자의 CT 또는 2개 이상의 레퍼런스 유전자의 평균 CT일 수 있다 (평균 CombRef라 칭함). 좋기로는 모든 분석시 동일한 대조군 샘플(칼리브레이터라고도 칭함)을 사용하여 동일한 RT-qPCR 또는 qPCR 결과를 얻는 것이다. 일 구체예에서, 대조군 샘플은 세포주 RNA, 시험관 내 전사된 인공 RNA 또는 일정 비의 바이오마커 mRNA 또는 cDNA 또는 바이오마커 앰플리콘 또는 바이오마커 앰플리콘의 일부를 나타내는 DNA 올리고뉴클레오타이em의 동몰(equimolar) 혼합물이다. 일 구체예에서, CALM2 및 B2M은 레퍼런스 유전자으로서 사용되며 양성 대조군(예컨대, 시험관 내 전사된 인공 RNA)는 대조군 샘플(칼리브레이터)로서 사용된다.

예시적인 구체예에서, 평균 컷-오프값은 계산방법 4에 따른 40-ΔΔCT 값으로서 주어지는데, 여기서 HER2에 대한 평균 컷-오프값은 40-ΔΔCT 값인 40.90, ESR1의 평균 컷-오프값은 40-ΔΔCT 값인 38.20, PGR에 대한 평균 컷-오프값은 40-ΔΔCT 값인 34.90이고 Ki67에 대한 평균 컷-오프값은 40-ΔΔCT 값인 34.80이다 (Versant kPCR Instrument AD module (Siemens) 기준).

또 다른 예시적인 구체예에서, 평균 컷-오프값은 계산방법 4에 따라 40-ΔΔCT 값으로서 주어지는데, HER2에 대한 평균 컷-오프값은 40-ΔΔCT 값인 41.1, ESR1에 대한 컷-오프값은 40-ΔΔCT 값인 38.00, PGR에 대한 컷-오프값은 40-ΔΔCT 값인 35.50이고 Ki67에 대한 컷-오프값은 40-ΔΔCT 값인 35.50이다 ( LightCycler

480 instrument II (Roche)기준).

일 구체예에서, 단계 (a), (b), (c) 및 (d) 및/또는 (e)는 무작위 순서로 수행된다. 일 구체예에서, 단계 (a)는 단계 (b), (c) 및 (d) 및/또는 (e)에 앞서서 수행된다. 일 구체예에서, 단계 (d) 및/또는 단계 (e)는 단계 (a), (b) 및 (c) 후에 수행된다. 일 구체예에서, 단계 (a)는 단계 (b) 전에 수행되며, 단계 (b)는 단계 (c) 전에 수행되고, 단계 (c)는 단계 (d) 및/또는 단계 (e) 전에 수행된다.

일 구체예에서, HER2의 RNA 전사체의 발현 수준이 HER2의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높으면 그 종양의 분자 아형은 HER2-양성으로서 동정된다.

일 구체예에서,

- HER2의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮은 HER2의 RNA 전사체의 발현 수준;

- ESR1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮은 ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준;

- PGR의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮은 PGR의 RNA 전사체의 발현 수준; 및

- Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮은 Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준

은 그 종양의 분자 아형이 삼중-음성임을 동정하는 것이다.

일 구체예에서, 분자 아형은 루미날 A 또는 루미날 B이다.

일 구체예에서,

- ESR1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높은 ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준;

- PGR의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높은 PGR의 RNA 전사체의 발현 수준; 및

- Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높은 Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준

은 그 종양의 분자 아형을 루미날 B로 동정하는 것이다.

일 구체예에서,

은 그 종양의 분자 아형을 루미날 A로 동정하는 것이다.

일 구체예에서,

은 그 종양의 분자 아형이 루미날 B임을 동정하는 것이다.

일 구체예에서,

은 그 종양의 분자 아형을 루미날 B로서 동정하는 것이다.

일 구체예에서,

은 그 종양의 분자 아형을 루미날 A로서 동정하는 것이다.

일 구체예에서,

은 그 종양의 분자 아형을 루미날 B로서 동정하는 것이다.

일 구체예에서, 이 방법은 단계 (d)를 포함하되,

- ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준이 ESR1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높고 및

암 환자의 불량한 임상 결과의 위험성 증가, 특히 원격 전이의 위험성 증가를 가리키는 것이다.

일 구체예에서, 이 방법은 단계 (e)를 포함하되, RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준이 RACGAP1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높으면 그 암 환자의 불량한 임상 결과의 위험성 증가를 가리킨다 (RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준이 RACGAP1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮은 암 환자의 위험성에 비해).

Ki67 및 RACGAP1 양자 모두의 RNA 전사체의 발현 수준 결정은 암 환자의 임상 결과와 관련하여 보다 정확한 정보를 제공해주는데, 여기서 Ki67이나 RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준이 증가하면 그 암 환자에 대한 불량한 임상 결과가 나올 위험성이 증가함을 가리키는 것이다 (Ki67 또는 RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67 또는 RACGAP1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮은 종양을 갖는 암 환자의 위험성에 비해).

일 구체예에서, 이 방법은 단계 (d) 및 (e)를 포함하되, 및

암 환자에 대한 불량한 임상 결과 위험성이 증가함을 가리킨다.

일 구체예에서, 이 방법은 단계 (d) 및 (e)를 포함하되, 및

그 암 환자에 대한 불량한 임상 결과의 위험성이 추가로 증가함을 가리킨다 (Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고 RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준이 RACGAP1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높은 종양을 갖는 암 환자의 증가된 위험에 비해서. 여기서 추가로 증가함이란 적어도 5% 증가, 더욱 좋기로는 적어도 10% 증가를 가리킨다).

"임상 결과(clinical outcome)"라는 용어는 질병의 임상 결과, 특히 예컨대 증상의 경감 또는 완화와 같이, 치료 후의 질병의 임상 결과로서 정의된다. 일 구체예에서, 불량한 임상 결과에는 생존, 무재발 생존 및 원격 재발 없는 생존 중 한 가지 이상의 상대적 감소가 포함된다. 암과 관련하여 "재발(recurrence)"라는 용어는 본래의 질병과 동일한 장기 및 장소에서 종양 세포의 재발생, 암의 초기 진단 및 치료로부터 많은 시간이 경과한 후인데도 나타나는 전이, 또는 부위 림프절 내로의 종양 세포의 침윤과 같은 국소적 이벤트를 포함한다. "원격 재발(Distant recurrence)"이라 함은 암세포가 부위 림프절을 넘어 신체의 먼 부분 (즉 다른 장기)까지 확산(전이)된 시나리오를 가리킨다. 무재발 생존은 일반적으로 무작위화(randomization)로부터 최초 재발, 관해, 두 번째 암 또는 사망에 이르는 기간으로 정의된다.

"전이(metastasis)"라는 용어는 암 세포가 그의 본래 위치로부터 신체의 다른 부위로 퍼지는 것을 의미한다. 전이암의 형성은 매우 복잡한 과정이며 원발 종양으로부터 악성 세포의 탈락(detachment), 세포외 매트릭스의 침습, 내피기저막의 체강 및 혈관으로의 침투 및 이어서 혈액에 의해 이동 후, 표적 장기의 침윤에 의존한다. 마지막으로, 표적 부위에서의 새로운 종양의 성장은 혈관신생에 의존한다. 종양 세포 또는 성분은 그대로 유지되면서 전이 가능성을 발달시킬 수 있기 때문에, 종양 전이는 종종 원발 종양이 제거된 후에도 일어날 수 있다.

일 구체예에서, "불량한 임상 결과의 위험성 증가"라는 표현은 치료 후 5년 생존 확률이,

- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고 및

- RACGAP1의 RNA 전사체의 발현 수준이 RACGAP1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮은

종양을 갖는 암환자의 치료 후 5년 생존 확률보다 적어도 20% 더 낮은, 좋기로는 적어도 25% 더 낮은 것을 가리킨다.

일 구체예에서, "불량한 임상 결과의 추가적인 위험성 증가"라는 표현은 치료 후 5년 생존 확률이,

종양을 갖는 암 환자의 치료 후 5년 생존 확률보다 적어도 30% 더 낮은, 좋기로는 적어도 35% 더 낮은 것을 가리킨다.

일 구체예에서, RNA 전사체의 발현 수준은 역전사(RT) 정량 PCR (RT-qPCR)에 의해 정해진다. RNA는 PCR에서 직접 증폭될 수 없기 때문에, 역전사효소를 이용하여 cDNA로 역전사시켜야 한다. 이를 위해, 동일 반응으로 역전사 반응을 PCR에 의한 DNA 증폭과 조합시켜주는, 원-스텝 RT-qPCR을 이용할 수 있다. 원-스텝 RT-qPCR에서는, RNA 주형(template)을 역전사효소, DNA 폴리머라제, 프라이머 및 프로브, dNTPs, 염 및 세제(detergents)를 함유하는 반응 믹스에 혼합시킨다.

PCR 첫 단계에서, 표적 RNA는 표적 특이적인 역프라이머를 이용하는 역전사효소에 의해 역전사된다. 이어서, 프라이머/프로브 및 DNA 폴리머라제를 이용하여 cDNA를 증폭시킨다.

일 구체예에서, 정량 PCR은 형광-기반 정량 실시간 PCR이다. 형광-기반 정량 실시간 PCR은 형광 표지된 프로브를 사용하는 것을 포함한다. 좋기로는, 형광 표지된 프로브는 형광 리포터 염료와 소광 염료(= 이중-트라스투주맙 프로브) 양자 모두로 표지된 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 것이 바람직하다. 적절한 형광 리포터 및 소광 염료/모이어티는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며 이들의 예로 리포터 염료/모이어티 6-FAM^TM, JOE^TM, Cy5

, Cy3

및 소광 염료/모이어티 dabcyl, TAMRA^TM, BHQ^TM-1, -2 또는 -3을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 프로브-특이적인 생성물의 증폭은 프로브의 절단(=증폭-매개된 프로브 변위(displacement))을 야기하고, 이에 의해 리포터 형광이 증가된다. 반응 중 형광의 증가는 표적 증폭 증가와 정비례한다. LightCycler 480 II 시스템 (Roche) 또는 Versant kPCR 시스템 (Siemens) 또는 Mx3005P 시스템 (Agilent Technologies) 또는 이들과 동등한, 프로브로부터 나오는 실시간 형광 검출 기기를 이용함으로써, 실시간으로 형광 증가를 측정할 수 있다. 분석 아웃풋은 각 표적의 CT 값이다. CT (사이클 역치) 값은 프로브의 형광시그널이 특정 배경 시그널을 초과한 때의 PCR 증폭 사이클 횟수에 의해 결정되는데, 여기서 CT 값은 PCR 증폭 전 샘플 내 표적 분자들의 양의 척도가 된다. 좋기로는, CT-값을 적절한 소프트웨어(예컨대, Microsoft Excel™) 또는 통계 소프트웨어 패키지(예컨대, SAS JMP

9.0.0, GraphPad Prism4, Genedata Expressionist™)에 의해 추가 분석하는 것이 바람직하다. CT 값은 기지의 표적 농도를 갖는 표준 곡선의 CT 결과에 기초하여 절대 표적 분자의 양(예컨대, ng/μl 또는 분자/μl)으로 변환될 수도 있다. 별법으로, 표적의 양은 레퍼런스에 기초하여 x배 감소 또는 증가된 양으로서 보고될 수도 있다(= ΔCT). 낮은 ΔCT 값 (작은 차이)는 높은 ΔCT (큰 차이)에 비해 레퍼런스에 대해 상대적인 표적의 양이 더 많음을 가리킨다. 고정값 (예컨대 PCR 사이클 횟수, 예컨대 40)으로부터 그것을 뺌으로써 ΔCT를 재계산하는 것이 적합하다. 그 결과는 표적량과 직접 연관성이 있는 값 (높은 값 = 많은 양)이며 40-ΔCT 값으로서 표시되는데, 여기서 정수 1개(one integer)는 표적량의 배가를 가리킨다 (예컨대, 34라는 값은 33이라는 값의 2배를 가리킨다). 목적하는 재생성과 시스템의 정밀도에 기초하여, 다중 레퍼런스 분석을 패널하거나 또는 샘플의 ΔCT를 칼리브레이터의 ΔCT로 재계산/정규화시키는 것이 가능하다 (1 포인트 보정; Pfaffl (2001), Nucleic Acid Res., 29(9):e45). 특이 프로브에 대해 상이한 플루오로포어를 이용함으로써 동일 반응에서 상이한 표적 분석을 다중화(multiplex)할 수도 있다. PCR 동안, 멀티플렉스 내의 각 표적은 병렬 증폭되지만, 상이한 형관 방출을 이용하여 개별적으로 검색된다.

좋기로는, 본 발명에 따라 사용되는 프라이머들은 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드, 특히, 데옥시리보뉴클레오타이드인 것이 바람직하다. 일 구체예에서, 프라이머들은 표적 mRNA-서열 (즉 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 및/또는 RACGAP1)에 특이적이고, (2) 120 bp 미만 (좋기로는 100 bp 미만)의 앰플리콘 크기를 제공하며 (3) 공지의 모든 단백질-인코딩 스플라이싱 변이체를 검출하고, (4) 공지의 다형성(예컨대 단일염기다형성, SNP)은 포함하지 않으며, (5) mRNA-특이적이고 (엑손/인트론을 감안하여; 좋기로는 DNA 증폭 없이), (6) 이량화(dimerize) 하는 경향이 없고 및/또는 (7) 융점 T_m이 58℃ 내지 62℃ (좋기로는, T_m이 약 60℃)가 되도록 설계된다.

본 발명에서, 용어 "뉴클레오타이드"는 아데닌(A), 티미딘(T), 시토신(C), 구아닌(G) 및 우라실(U)로 이루어진 군으로부터 선택되는 질소계 염기, 리보스, 아라비노스, 자일로스 및 피라노스 및 데옥시리보스의 군으로부터 선택되는 당(염기와 당의 조합은 일반적으로 "뉴클레오사이드"라 칭해짐), 그리고 1 내지 3개의 포스페이트기를 포함하고 포스포디에스테르 인터뉴클레오시딜 결합을 형성할 수 있는 본래의(자연발생적인) 뉴클레오타이드를 포함한다. 또한, 본 발명에서 "뉴클레오타이드"라 함은 뉴클레오타이드 유사체를 가리킨다. 본 발명에서, "뉴클레오타이드 유사체(nucleotide analogue)"는 DNA 폴리머라제 또는 RNA 폴리머라제 (어느 것이건 적용가능한 것)에 의해 인식되어 DNA 또는 RNA(어느 것이건 적용가능한 것) 가닥 내로 통합되는, A, G, C, T 또는 U의 유사체 (즉, 염기 A, G, C, T 또는 U를 포함하는 뉴클레오타이드의 유사체)를 의미하는 것이다. 이러한 뉴클레오타이드 유사체의 예로는, 5-프로피닐 피리미딘 (즉, 5-프로피닐-dTTP 및 5-프로피닐-dCTP), 7-데아자 퓨린(즉, 7-데아자-dATP 및 7-데아자-dGTP), 아미노알릴-dNTPs, 바이오틴-AA-dNTPs, 2-아미노-dATP, 5-메틸-dCTP, 5-요오도-dUTP, 5-브로모-dUTP, 5-플루오로-dUTP, N4-메틸-dCTP, 2-티오-dTTP, 4-티오-dTTP 및 알파-티오-dNTPs를 들 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 표지된 유사체, 예컨대 DEAC-프로필렌디아민 (PDA)-ATP, 모르폴리노 뉴클레오사이드 유사체에 기반한 유사체, 및 잠금 핵산(locked nucleic acid: LNA) 유사체도 포함된다.

본 발명에서 사용가능한 프라이머와 관련하여, "표적 mRNA-서열에 특이적인"이라는 단어는 적절한 온도 및 용액 이온 강도 조건, 특히 PCR 조건 하에서 표적 mRNA-서열의 cDNA에 혼성화(즉 어닐)하는 프라이머의 능력을 가리킨다. 온도 및 용액 이온 강도 조건은 혼성화의 스트린젠시(stringency of hybridization)를 결정한다. 비록 혼성화의 스트린젠시에 따라, 염기들간의 미스맷치가 일어날 가능성이 있기는 하지만, 혼상화는 2개의 핵산 (즉 프라이머와 cDNA)이 상보적인 서열을 함유할 것을 요구한다. 일 구체예에서, "온도 및 용액 이온 강도의 적절한 조건"이라 함은 58℃ 내지 62℃의 온도 범위 (좋기로는 약 60℃의 온도) 및 PCR 반응 혼합물에 공통적으로 사용되는 용액 이온 강도를 가리킨다. 일 구체예에서, 프라이머의 서열은 기술분야에 공지인 서열비교 알고리듬으로 결정시, 표적 mRNA-서열의 cDNA의 대응 서열에 대해 80%, 좋기로는 85%, 더욱 좋기로는 90%, 더더욱 좋기로는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보적인 것이 바람직하다.

일 구체예에서, 프라이머는 스트린젠트 혼성화 조건 또는 온화한 스트린젠트 혼성화조건 하에서 표적 mRNA-서열의 cDNA에 혼성화한다. 본 발명에서 "스트린젠트 혼성화 조건(Stringent hybridization conditions)"이라 함은 68℃, 5x SSC/5x Denhardt's 용액/1.0% SDS, 및 실온에서 0.2x SSC/0.1 % SDS 세척 또는, 기술분야에 널리 알려진 이와 동등한 조건을 가리킨다 (예컨대 60℃, 2.5 x SSC 완충액에서 혼성화를 수행한 후, 37℃, 저농도 완충액에서 수회 세척 및 안정하게 유지). 또한 본 발명에서 "온화한 스트린젠트 혼성화 조건(Moderately stringent hybridization conditions)"이라 함은, 42℃, 3x SSC에서 세척 또는 기술분야에서 그와 동등한 것으로 알려진 조건을 가리킨다. 염 농도 및 온도 파라미터들에 변화를 주어 프라이머와 표적 핵산 간에 최적의 동일성 수준을 달성할 수 있다. 이런 조건에 관한 안내 지침은 예컨대 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; 및 Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley 및 Sons, N.Y.)] 등에 기재된 것과 같이 기술분야에 알려져 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고, SEQ ID NOs: 1 및 2의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 ESR1-특이 프라이머, 및/또는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고, SEQ ID NOs: 4 및 5의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 HER2-특이 프라이머, 및/또는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고, SEQ ID NOs: 7 및 8의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 Ki67-특이 프라이머, 및/또는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고, SEQ ID NOs: 10 및 11의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 PGR-특이 프라이머, 및/또는 길이가 15 내지 30개 뉴클레오타이드이고, SEQ ID NOs: 13 및 14의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 RACGAP1-특이 프라이머의 사용을 포함한다. 일 구체예에서, 특이 프라이머는 전술한 서열들의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 SEQ ID NOs: 1 및 2의 서열을 갖는 ESR1-특이 프라이머, 및/또는 SEQ ID NOs: 4 및 5의 서열을 갖는 HER2-특이 프라이머, 및/또는 SEQ ID NOs: 7 및 8의 서열을 갖는 Ki67-특이 프라이머, 및/또는 SEQ ID NOs: 10 및 11의 서열을 갖는 PGR-특이 프라이머, 및/또는 SEQ ID NOs: 13 및 14의 서열을 갖는 RACGAP1-특이 프라이머의 사용을 포함한다.

좋기로는, 본 발명에서 사용되기 위한 프로브들은 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드, 특히 데옥시리보뉴클레오타이드이다. 일 구체예에서, 프로브는

(1) 표적 mRNA-서열 (즉 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 및/또는 RACGAP1)에 대해 특이적이고, (2) 공지의 다형성 (예컨대 단일염기다형성, SNP)은 포함하지 않고 및/또는

(5) mRNA-특이적이고 (엑손/인트론을 감안하여; 좋기로는 DNA 증폭 없이), (6) 이량화(dimerize) 하는 경향이 없고 및/또는 (7) 대응하는 프라이머(들)의 융점보다 5℃ 내지 8℃ 더 높은 융점 T_m을 갖도록 설계된다.

본 발명에 따라 사용되는 프로브와 관련하여 "표적 mRNA-서열에 특이적"이라는 표현은, 그 프로브가 적절한 온도 및 용액 이온 강도 조건, 특히 PCR 조건 하에서 표적 mRNA-서열의 (증폭된) cDNA에 혼성화(즉 어닐)하는 능력을 가리킨다. 온도 및 용액 이온 강도 조건은 혼성화의 스트린젠시를 결정한다. 혼성화는 2개의 핵산(즉 프로브 및 cDNA)이 비록, 혼성화의 스트린젠시에 따라, 염기들 간에 미스맷치가 일어날 가능성은 있으나, 상보적인 서열들을 함유할 것을 필요로 한다. 일 구체예에서, "온도 및 용액 이온 강도의 적절한 조건"이라는 표현은 온도 범위가 63℃ 내지 70℃이고, PCR 반응 혼합물에서 흔히 사용되는 용액 이온 강도를 의미한다. 일 구체예에서, 프로브의 서열은 기술분야에 공지인 서열비교 알고리듬으로 결정시, 표적 mRNA-서열의 (증폭된) cDNA의 대응하는 서열에 대해 80%, 좋기로는 85%, 더욱 좋기로는 90%, 더더욱 좋기로는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보적이다.

일 구체예에서, 프로브는 상기 정의된 바와 같은 스트린젠트 또는 온화한 스트린젠트 혼성화 조건 하에서 표적 mRNA-서열의 (증폭된) cDNA와 혼성화한다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 3의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 ESR1-특이 프로브, 및/또는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 6의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 HER2-특이 프로브, 및/또는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 9의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 Ki67-특이 프로브, 및/또는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 12의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 PGR-특이 프로브, 및/또는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 15의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 RACGAP1-특이 프로브의 사용을 포함한다. 일 구체예에서, 특이 프로브들은 상기한 서열들의 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드들을 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 SEQ ID NO: 3의 서열을 갖는 ESR1-특이 프로브, 및/또는 SEQ ID NO: 6의 서열을 갖는 HER2-특이 프로브, 및/또는 SEQ ID NO: 9의 서열을 갖는 Ki67-특이 프로브, 및/또는 SEQ ID NO: 12의 서열을 갖는 PGR-특이 프로브, 및/또는 SEQ ID NO: 15의 서열을 갖는 RACGAP1-특이 프로브의 사용을 포함한다.

좋기로는, 상기 정의된 프로브들은 형광 리포터 모이어티 및 형광 소광 모이어티를 포함하는 이중-트라스투주맙 프로브들이다.

일 구체예에서, 발현 수준은 종양 샘플 내의 1종 이상의 레퍼런스 유전자의 (평균) 발현 수준에 대해 정규화된다. 본 발명에서 "레퍼런스 유전자"라는 용어는, 검사 대상 시스템, 즉 암에서 RNA 전사체/mRNA 수준에 대한 상대적으로 불변인 발현 수준을 갖는 유전자를 가리키는 것으로 의도된다. 이러한 유전자는 하우스키핑 유전자라 칭할 수 있다. 일 구체예에서, 1종 이상의 레퍼런스 유전자들은 CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 및 GAPDH를 포함하는 군, 좋기로는 CALM2 및/또는 B2M으로부터 선택된다.

본 발명에서, CALM2는 칼모듈린-2, 포스포릴라제 키나제, 델타 (Ref.Seq. (mRNA): NM_001743)를 가리키고, B2M은 베타-2 마이크로글로불린 (Ref.Seq. (mRNA): NM_004048)을 가리키며, RPL37A는 60S 리보좀 단백질 L37a (Ref.Seq. (mRNA): NM_000998)를 가리키고, GUSB는 베타-글루쿠로니다제 (Ref.Seq. (mRNA): NM_000181)를 가리키며, HPRT1은 하이포잔틴-포스포리보실-트랜스퍼라제 1 (Ref.Seq. (mRNA)을 가리키고: NM_000194) 및 GAPDH는 글리세린알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제 (Ref.Seq. (mRNA): NM_002046)를 가리킨다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 치료를 위해 암 환자를 계층화하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 그 첫 단계로서, 상기 정의된 바와 같은 시험관 내 방법을 이용하여 암 환자 내의 종양의 분자 아형을 동정하고, 그 두 번째 단계로서, 시험관 내 방법에 의해 동정된 분자 아형에 기초하여 종양 치료요법을 선택하는 것을 포함한다.

본 발명에서 "종양 치료를 위해 암 환자를 계층화하다"라는 것은 암 환자를 특정 분자 종양 아형을 갖는 환자 그룹에 할당한 다음, 임상의로 하여금 가장 적합한 종양 치료요법을 선택하도록 하는 것을 포함한다.

일 구체예에서, 종양 치료를 위해 암 환자를 계층화하는 상기 방법은 상기 정의된 바와 같은 시험관 내 방법을 이용하여 암 환자에서 종양의 분자 아형을 동정하는 단계 외에, 림프절 상태를 결정하거나 조직학적 등급화와 같은, 기타 진단 단계는 일절 포함하지 않는다.

일 구체예에서,

- 분자 아형은 HER2-양성이고, 종양 치료요법은 항-HER2 항체 및 화학요법제의 투여를 포함하거나;

- 분자 아형은 삼중-음성이고, 종양 치료요법은 화학요법제의 투여를 포함하거나;

- 분자 아형은 루미날 A이고, 종양 치료요법은 내분비요법을 포함하거나 또는

- 분자 아형은 루미날 B이고, 종양 치료요법은 내분비요법 및 임의로 화학요법제의 투여를 포함한다.

모노클로날 항-HER2 항체에는 트라스투주맙 (Herceptin

) 및 퍼투주맙 (Perjeta

)이 포함되며, 이들은 단독으로 또는 조합하여 투여될 수 있다. 트라스투주맙은 HER2가 과발현되는 암에서만 효과가 있다. 에르투막소맙 (Rexomun

)과 같은 기타 모노클로날 항체들이 현재 임상 시험 중에 있다. 항-HER2 항체는 또한 치료 모이어티/물질, 예컨대, 세포독성제, 약물(예컨대 면역억제제), 화학요법제 또는 방사성핵종, 또는 방사성 동위원소를 포함하도록 추가로 변형될 수도 있다. 세포독소 또는 세포독성제에는 세포에 치명적이거나, 특히 세포를 사멸시키는 물질이 포함된다. 그 예로는 머탄신(DM1), 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시안트라신, 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 아마니틴, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체를 들 수 있다. 항체 컨쥬게이트를 형성하는데 적합한 기타치료제의 비제한적인 예로는, 항대사물질(예컨대, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예컨대, 메클로레타민, 티오에파클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예컨대 다우노루비신 (이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 항유사분열제 (예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 들 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 치료제는 세포독성제 또는 방사능독성제인 것이 좋다. 또 다른 구체예에서, 치료제는 면역억제제이다. 또 다른 구체예에서, 치료제는 GM-CSF이다. 바람직한 일 구체예에서, 치료제는 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 설페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드 또는 리신 A이다. 또 다른 치료 모이어티에는 mRNA 및/또는 단백질 합성에 작용하는 치료 모이어티가 포함된다. 몇몇 전사 억제제들이 알려져 있다. 예를 들어, 전사 억제제인 동시에 DNA 손상제인 악티노마이신 D는, DNA 내로 인터컬레이트하여 전사의 초기 단계를 저해한다. 플라보피리돌은 전사의 연장 단계를 표적으로 한다. α-아르나니틴은 RNA 폴리머라제 II에 직접 결합하여, 개시 단계와 연장 단계 두 가지 모두를 저해한다. 항-HER2 항체는 또한 방사성 동위원소, 예컨대 요오드-131, 이트륨-90 또는 인듐-111에 컨쥬게이트하여 세포독성 방사능약품을 생성한다. 항-HER2 항체의 투여를 대신하는 한 가지 대안은 라파티닙(Tykerb

또는 Tyverb

)과 같은, HER2를 표적화하는 작은 화합물을 투여하는 것이다.

본 발명에 따른 화학요법제에는 세포증식억제 화합물 및 세포독성 화합물이 포함된다. 전통적인 화학요법제는 대부분의 암 세포의 가장 두드러진 특징 중 하나인 급속히 분열하는 세포를 살해함으로써 작용한다. 본 발명에서, "화학요법제"에는 탁산, 백금 화합물, 뉴클레오사이드 유사체, 캄토테신 유사체, 안트라사이클린 및 안트라사이클린 유사체, 에토포사이드, 블레오마이신, 비노렐빈, 사이클로포스파미드, 항대사물질, 항유사분열제 및 알킬화제가 포함되며, 항체 컨쥬게이트와 관련하여 전술된 물질 및 이들의 조합이 포함된다. 본 발명에서 화학요법제에는 에스테르, 염 또는 상기 화학요법제의 컨쥬게이트와 같은 유도체가 포함된다. 그 예로는 상기 제제와 캐리어 물질과의 컨쥬게이트, 예컨대 알부민-결합된 파클리탁셀과 같은 단백질-결합된 파클리탁셀을 들 수 있다. 좋기로는, 상기 제제의 여은 약학적으로 허용가능하나 것이 바람직하다. 화학요법제는 종종 조합물로서, 대개 3-6개월 동안 주어진다. 가장 흔한 치료 중 하나는 사이클로포스파미드 플러스 독소루비신 (아드리아마이신; 안트라사이클린 및 안트라사이클린 유사체 군에 속함)이다, AC로 알려짐. 때로, 도세탁셀과 같은 탁산 약물이 첨가되며, 이 경우 요법은 CAT로 알려진다; 탁산은 암 세포 내의 미세관(microtubules)을 공격한다. 동등한 결과를 내는 또 다른 흔한 치료법은 항대사물질인 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트와 뉴클레오사이드 유사체인 플루오로우라실 (CMF)이다. 또 다른 표준 화학요법 치료는 플루오로우라실, 에피루비신 및 사이클로포스파미드 (FEC)를 포함하는데, 여기에 도세탁셀 또는 비노렐빈을 보강할 수 있다.

내분비요법 (항-호르몬 치료)은 예컨대 타목시펜(Nolvadex

) 또는 풀베스트란트(Faslodex

)와 같이, 에스트로겐 및/또는 프로게스테론 수용체를 차단/하향조절하는 약물을 투여하거나, 또는 아나스트로졸(Arimidex

) 또는 레트로졸(Femara

)과 같은 아로마타제 저해제에 의해 에스트로겐의 생성을 차단함으로써, 계속적인 증식을 위해 에스트로겐을 필요로 하는 암을 표적으로 한다. 그러나, 아로마타제 저해제는 폐경기 환자에게만 적합하다. 이것은 폐경기 여성의 활성 아로마타제가 폐경전 여성의 대다수 형태와 다르고, 그에 따라 이들 제제가 폐경전 여성의 대다수 아로마타제를 억제하는데 효과가 없기 때문이다.

일 구체예에서, 탁산은 플루오로우라실, 에피루비신 및 사이클로포스파미드 (FEC)과 조합하여 투여된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암 치료 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 그 첫 단계로서, 상기 정의된 시험관 내 방법을 이용하여 종양 치료를 위해 암 환자를 계층화하고, 그 두 번째 단계로서, 그 암 환자에게 선택된 종양 치료요법을 제공하는 것을 포함한다. 종양 치료요법은 상기 정의된 바와 같은 시험관 내 방법에 의해 동정된 분자 아형에 기초하여 선택된다.

일 구체예에서, 상기 방법은 상기 정의된 바와 같은 시험관 내 방법으로 얻어진 정량 결과를 보조/신보조 화학요법의 편에서 또는 그에 반해서 직접적인 결정을 하는데 이용하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 역전사(RT) 정량 PCR에 의해 암 환자에 있어서 종양의 분자 아형을 동정하는데 유용한 키트에 관한 것으로서, 상기 키트는:

- 적어도 한 쌍의 HER2-특이 프라이머 및 적어도 한 개의 HER2-특이 프로브;

- 적어도 한 쌍의 ESR1-특이 프라이머 및 적어도 한 개의 ESR1-특이 프로브;

- 적어도 한 쌍의 PGR-특이 프라이머 및 적어도 한 개의 PGR-특이 프로브; 및

- 적어도 한 쌍의 Ki67-특이 프라이머 및 적어도 한 개의 Ki67-특이 프로브; 및/또는

- 적어도 한 쌍의 RACGAP1-특이 프라이머 및 적어도 한 개의 RACGAP1-특이 프로브

를 포함한다.

일 구체예에서, 정량 PCR은 형광-기반 정량 실시간 PCR이다.

일 구체예에서, 프로브의 검출은 증폭-매개된 프로브 변위에 기초한다.

일 구체예에서, 프로브는 형광 리포터 모이어티 및 형광 소광 모이어티을 포함하는 이중-라벨 프로브이다.

일 구체예에서, 키트는 추가로 역전사효소 및 DNA 폴리머라제를 더 포함한다.

일 구체예에서, 역전사효소와 폴리머라제는 원-스텝 역전사(RT) 정량 PCR을 가능케 하는 효소-믹스 형태로 제공된다.

일 구체예에서, 키트는 추가로 적어도 한 쌍의 레퍼런스 유전자-특이 프라이머 및 적어도 한 개의 레퍼런스 유전자-특이 프로브를 더 포함한다. 일 구체예에서, 레퍼런스 유전자는 CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 및 GAPDH를 포함하는 군, 좋기로는 CALM2 및/또는 B2M을 포함하는 군으로부터 선택된 한 개 이상의 유전자이다.

일 구체예에서, 키트는 추가로 적어도 한 개의 대조군 RNA 샘플을 더 포함한다. 일 구체예에서, 적어도 한 개의 대조군 RNA 샘플은 양성 대조군 및/또는 대조군 샘플 (칼리브레이터)로서 사용되며, 여기서, 좋기로는 적어도 한 개의 대조군 RNA 샘플은 HER2, ESR1, PGR, Ki67, RACGAP1 및 1종 이상의 레퍼런스 유전자들을 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자들의 1종 이상의 유전자 산물(또는 그의 일부)을 코딩하는 합성 mRNA를 포함하는 것이 바람직하다. 일 구체예에서, 1종 이상의 레퍼런스 유전자들은 CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 및 GAPDH를 포함하는 군, 좋기로는 CALM2 및/또는 B2M을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

일 구체예에서, 키트는 DNase 및 DNase 반응 완충액을 추가로 포함할 수 있다.

좋기로는, 프라이머와 프로브는 본 발명의 시험관 내 방법과 관련하여 상기 정의된 것이 바람직하다.

일 구체예에서, 프라이머는 120 bp 미만, 좋기로는 100 bp 미만의 앰플리콘 크기를 제공한다.

일 구체예에서, ESR1-특이 프라이머는 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 1 및 2의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하고, 및/또는 HER2-특이 프라이머는 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 4 및 5의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며, 및/또는 Ki67-특이 프라이머는 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 7 및 8의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하고, 및/또는 PGR-특이 프라이머는 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 10 및 11의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며, 및/또는 RACGAP1-특이 프라이머는 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 13 및 14의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구체예에서, 특이 프라이머들은 상기 표시된 서열들의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드들을 포함한다.

일 구체예에서, ESR1-특이 프라이머는 SEQ ID NOs: 1 및 2의 서열을 갖고, 및/또는 HER2-특이 프라이머는 SEQ ID NOs: 4 및 5의 서열을 가지며, 및/또는 Ki67-특이 프라이머는 SEQ ID NOs: 7 및 8의 서열을 갖고, 및/또는 PGR-특이 프라이머는 SEQ ID NOs: 10 및 11의 서열을 가지며, 및/또는 RACGAP1-특이 프라이머는 SEQ ID NOs: 13 및 14의 서열을 갖는다.

일 구체예에서, ESR1-특이 프로브는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고, SEQ ID NO: 3의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하고, 및/또는 HER2-특이 프로브는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고, SEQ ID NO: 6의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며, 및/또는 Ki67-특이 프로브는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고, SEQ ID NO: 9의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하고, 및/또는 PGR-특이 프로브는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고, SEQ ID NO: 12의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며, 및/또는 RACGAP1-특이 프로브는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고, SEQ ID NO: 15의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구체예에서, 특이 프로브는 상기 표시된 서열들의 적어도 20개의 인접 뉴클레오타이드들을 포함한다.

일 구체예에서, ESR1-특이 프로브는 SEQ ID NO: 3의 서열을 갖고, 및/또는 HER2-특이 프로브는 SEQ ID NO: 6의 서열을 가지며, 및/또는 Ki67-특이 프로브는 SEQ ID NO: 9의 서열을 갖고, 및/또는 PGR-특이 프로브는 SEQ ID NO: 12의 서열을 가지며, 및/또는 RACGAP1-특이 프로브는 SEQ ID NO: 15의 서열을 갖는다.

좋기로는, 상기 정의된 바와 같은 프로브들은 형광 리포터 모이어티 및 형광 소광 모이어티를 포함하는 이중-라벨 프로브인 것이 바람직하다.

일 구체예에서, 종양은 고형 종양이다. 일 구체예에서, 종양은 유방 종양이거나 또는 유방 종양으로부터 유래한 것이다 (예컨대 전이에 의함). 일 구체예에서, 암은 유방암이다.

본 발명에서, "키트 오브 파츠("kit of parts (약칭: 키트)"라는 표현은 한 개 이상의 용기 및, 임의로 데이터 캐리어를 포함하는 제조 물품을 가리킨다. 상기 한 개 이상의 용기들에는 전술한 1종 이상 수단 또는 시약이 채워질 수 있다. 부가적인 용기들이 키트에 포함될 수 있으며, 이러한 부가 용기에는 에컨대 희석제, 완충액 및 dNTPs와 같은 추가 시약이 함유된다. 상기 데이터 캐리어는 비전자식 데이터 캐리어, 예컨대 그래프식 데이터 캐리어 예컨대 인포메이션 리플렛, 인포메이션 시트, 바코드 또는 억세스 코드, 또는 전자 데이터 예컨대 플로피 디스크, 컴팩트 디스크(CD), 디지털 만능 디스크(DVD), 마이크로칩 또는 기타 반도체-기반 전자 데이터 캐리어일 수 있다. 억세스 코드는 예컨대 인터넷 데이터베이스, 중앙형 또는 분산형 데이터베이스와 같은 데이터베이스에 접근할 수 있게 해준다. 상기 데이터 캐리어는 본 발명의 방법에 상기 키트를 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 데이터 캐리어는 예컨대 mRNA와 같은 RNA 전사체의 레퍼런스 수준 또는 역치 수준을 포함할 수 있다. 데이터 캐리어가 데이터베이스에 대한 접근을 허용하는 억세스 코드를 포함하는 경우, 상기 역치 값 또는 레퍼런스 수준이 이 데이터베이스에 디포짓된다. 또한, 데이터 캐리어는 본 발명의 방법을 어떻게 수행할지에 대한 인포메이션 또는 지침을 포할할 수도 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암 환자에 있어서 종양의 분자 아형을 동정하기 위한 상기 정의된 바와 같은 키트의 용도에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암 환자의 원격 전이 위험성을 평가하기 위한, 키트의 용도에 관한 것이기도 하다.

본 발명은 현행 표준 및 종래 기술에 따른 진단법인 면역조직화학 및 보다 최근의 방법들의 단점을 극복한다.

본 발명은 종양, 특히 유방 종양에 있어서 신뢰할만한 분자 아형 결정을 가능케 하며, 이에 따라, 담당 의사가 가장 적합한 종양 치료요법을 선택할 수 있도록 해준다.

4개 또는 5개의 마커의 선호되는 평가 순서(좋기로는 HER2의 RNA 전사체의 발현 수준을 먼저 결정하는 것이 바람직함)에 의해, 아형 결정이 위계적 군집화(hierarchal cluster) 분석 또는 상관분석법에 기초하여 이루어질 경우 흔히 발생하는 문제점인 HER2-양성이 루미날 A 및 B 아형으로 잘못 분류되는 오류가 일어나지 않는다 (Perou et al. (2000), Nature, 406:747-752; TCGA (Cancer Genome Atlas Network) (2012), Nature, 490:61-70). 뿐만 아니라, Perou 등에 의하면, 이러한 사례의 최대 30%까지 발생할 수 있는, 거짓-양성 및 임상적인 HEr2-음성 종양의 오분류도 일어나지 않는다.

본 발명은 특히 IHC에 의해 동정된 다음의 유방암 환자 그룹에서, 면역화학 분석의 분명치 않거나 모순적인 결과를 확인/재평가하기 위한 방법 및 키트를 제공한다: ESR1/PGR 음성(모든 유방암 환자의 약 30%), ESR1/PGR 약한 양성(모든 유방암 환자의 약 15%), HER2 3+ (종양 생검 IHC, 절제 종양 IHC에 의해 확인되지는 않음; 모든 유방암 환자의 약 15%) 및 HER 2+ (모든 유방암 환자의 약 20%).

본 발명의 방법 및 키트는 Ki67- 및/또는 RACGAP1 RNA 전사체의 신뢰할만함 검출에 의해 루미날 A 및 루미날 B 아형을 구별하기 때문에 루미날 유방암에서 보조/신보조 화학요법의 편에서 또는 이에 대항하여 직접 결정을 내리는 것을 용이하게 해준다. 이것은 특히 ESR1/PGR 양성이고 2기 이하의 종양 (모든 유방암 환자의 약 50%)을 갖는 환자에서 유용하다.

본 발명에 따라, 명백히 차이가 나는 전체 생존율 및 원격 전이없는 생존율을 갖는 루미날 A 및 루미날 B 종양을 구별하는 것이 가능하다. 루미날 B 환자들은 특히 치료 (예컨대 외과수술) 후 최초 5년 동안 끊임없이 높은 전이 위험성을 갖는 반면, 루미날 A 환자들의 위험성은 일정하고 명백히 더 낮다. 따라서, 본 발명의 방법과 키트는 원격 전이에 대한 환자의 위험성을 평가하는 것도 가능케 한다.

본 발명의 방법을 이용함으로써, FinHER 연구 (Joensuu et al. (2006), N Engl J Med, 354:809-820)에서 루미날 종양의 약 77%가 저위험 그룹 루미날 A로 할당되며, 개재 위험 그룹(intermediate risk groups)은 없다. 또한, 루미날 A 및 루미날 B로의 분류는 종양 예후에 있어 일반적으로 매우 중요한 두 가지 파라미터인 조직학적 등급 및 결절 상태의 유의성을 감소시킨다. 따라서, 2급 (grade 2) 종양의 치료와 관련한 불확실성이 임상적으로 합리적인 방식으로 해소된다.

본 발명의 방법 및 키트는 또한 ESR1, HER2, Ki67 및, 임의로, RACGAP1의 RNA 전사체 발현 수준의 정량적 결정 덕분에, 전신 요법에 대한 반응의 예측도 가능케 해준다. 이것은 특히 불확실한 IHC를 갖는, > 1 cm의 침습적 유방암을 갖는 환자들 (전체 유방암 환자의 약 40%)에 있어 특히 유용하다.

본 발명의 신규성은 유방암 바이오마커들의 mRNA-기반 평가 뿐만 아니라, 아형들의 알고리듬 정의에도 기인한다. 낮은 Ki67에 더해 루미날 A 정의에 대한 강제적인 PGR 양성을 포함시킨 것은 본 발명 당시 2011년 St. Gallen 임상 가이드라인에 포함되지 않은, 오리지날 기준이다. 이에 더해, 소정의 컷-오프를 초과한 HER2 mRNA 발현을 나타낸 종양은, 여전히 유효한 채 남아있는 2011 국제 가이드라인으로부터 벗어난 ESR1/PGR 상태와 관계없이 HER2-양성으로 분류된다. 이들 모든 새로운 측면들은 본 발명의 RT-qPCR-기반 접근법 및 키트의 예측 값에 기여한다. 사실상, 이들 RT-qPCR-기반 바이오마커의 평가 측면의 기술적 신규성과 분류 알고리듬 측면의 이론적 신규성은 FinHer 임상 시험에서 환자들에 대한 보다 정확하고 의미있는 아형 결정방식을 제공하므로, 결국, 보조요법 셋팅에 있어서 도세탁셀의 장점에 대한 예측 도구(tool)을 제공해주는 것이다.

본 발명은 모든 유방암 환자들의 적어도 50%에서 신뢰할 수 있고, 재현가능하며, 정량적인 예후 평가 및 치료 성공 예측 가능성에 대한 기대를 만족하지 못하는 현행의 임상적 요구를 만족한다 (도 1도 참조할 것).

이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 역전사 (RT) PCR (RT- qPCR )에 의한 mRNA 발현 수준의 결정

파라핀-포매, 포르말린-고정된 조직(=FFPE 조직)으로부터 RNA를 분리하였다. 보다 구체적으로, 고순도 RNA 파라핀 키트(High Pure RNA Paraffin Kit: Roche, Basel, Switzerland) 또는 XTRAKT RNA 추출 키트 (XTRAKT RNA Extraction Kit XL: Stratifyer Molecular Pathology, Cologne, Germany)을 이용하여, FFPE 종양 조직의 5 내지 10 μm 컬(curl)로부터 총 RNA를 추출하고, 레퍼런스 유전자 RPL37A의 단편에 대해 실시간 형광 RT-PCR에 의해 정성분석 및 Ribogreen RNA Quantitation Assay (Molecular Probes, Eugene, OR)에 의해 정량 분석하였다. 서로 다른 방법론에 의해, 순차적인 슬라이스들의 표적 유전자의 정량적 데이터를 비교하자, 서로 다른 추출 기술들 간에 차이가 존재하는 것으로 나타났다. 본 발명의 목적 상, XTRAKT RNA Extraction Kit XL를 사용하는 것이 선호되었다. 일반적으로, 각각의 유자격(qualified) 추출물 2.5 μl RNA (약 50-100 ng)를 qRT-PCR에 의해 후술하는 바와 같이 분석하였다.

정량 RT-PCR법에 의해 유전자 발현을 상세히 분석하기 위해, 대상 영역을 플랭킹하는 프라이머 및 그 사이에 혼성화하는 형광 표지된 프로브들을 이용하였다. 표적 특이 프라이머와 프로브들을 NCBI 프라임 설계 도구(www.ncbi.nlm.nih.go)를 이용하여 선발하였다. RNA 특이 프라이머/프로브 서열들을 이용하여 엑손/엑손 경계에 걸쳐 프라이머/프로브 서열들을 위치시킴으로써 RNA 특이 측정을 가능하게 하였다. 또한, 프라이머/프로브들은 공지의 다형성(SNPs)를 갖는 서열 영역에 결합하지 않도록 선택하였다. 동일 유전자의 아이소폼이 복수개 존재할 경우, 관련된 모든 스플라이스 변이체들이 증폭되도록 프라이머들을 선택하였다. 모든 프라이머 쌍을 통상적인 PCR 반응에 의해 특이성에 대해 검토하였다. 프라이머/프로브들의 추가 최적화 후, 표 1에 수록된 프라이머와 프로브들이 최상의 결과를 나타내었다. 이들 프라이머/프로브들은 예컨대 특이성 및 증폭 효율 관점에서 종래기술에서 알려진 프라이머/프로브들보다 더 우수하였다. 샘플 RNA의 양을 표준화하기 위해, 유전자 CALM2 및 B2M을 레퍼런스 유전자로서 선택하였는데, 이는 이들이 분석된 샘플에서 달리 구별되게 조절되지 않았기 때문이다.

TaqMan

검정 실험을 수행하자 표적 및 대조군 증폭 효율이 대략 동등한 것으로 나타났는데 이것은 대조 ΔCT 방법에 의한 유전자 발현의 상대적 정량에 이어 전제 조건이다. 생물학적 샘플 내에 대상 유전자의 발현 분석을 실시하기 위해, 2가지 특이 분석법의 대응하는 프라이머/프로브들을 혼합함으로써 4 x 듀플렉스 분석-혼합물을 준비하였다. CT 값의 별도 검색을 위해, 분석 프로브들을 상이한 형광 프로브들을 이용하여 변형시켰다. 각각의 4 x 분석-믹스는 2 μM의 비변형 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 그리고 1.2 μM의 프로브를 함유하였다. 각 반응을 위해, FFPE 섹션(상기 참조)으로부터 추출된 2.5 μl 총 RNA를 96-웰-Optiocal Reaction Plate의 1개 웰에서 2.5 μl 분석-믹스, 2.5 μl 효소-믹스 및 2.5 μl 물과 함께 혼합하였다. 적절한 조건(5분 50℃, 20초 95℃, 15초 95℃, 1분 60℃; 40 사이클) 하에서 Versant kPCR Cycler (Siemens) 또는 Light Cycler 480 (Roche)을 이용하여 제조자 지침에 따라 PCR 반응의 측정을 수행하였다. 실험 조건의 표준화를 위해, 이제까지 분류되지 않았던 생물학적 샘플 대조군의 측정에 앞서, 예컨대 세포주, 건강한 대조군 샘플, 정의된 분자 종양 아형 샘플에 대한 실험을 이용할 수 있다.

실시예 2: HER2 , ESR1 , PGR , Ki67 및 임의로 RACGAP1 의 mRNA 발현 수준에 기초한 종양의 분자 아형 결정

유방 종양을 평가하기 위해, FinHER 연구 (Joensuu et al. (2006), N Engl J Med, 354:809-820)의 1010명의 유방암 환자들 중 855명을 이용할 수 있었다. 평균 컷-오프값 (40-ΔCT 값으로서 주어짐)은 다음과 같았다: HER2: 38; ESR1: 34; PGR: 30.2; Ki67: 31.7; 및 RACGAP1: 34.2. HER2 및 ESR1에 대한 컷-오프값은 268개의 샘플을 이용하여 이전의 연구(Koutras et al. (2008), Brit. J. of Canc., 99:1775-1785; Pentheroudakis et al. (2009), Breast Cancer Res Treat 2009, 116:131-143)의 평가 결과에 기초하여 결정하고 이를 FinHER 연구 (비례위험 모델 검정)에 적용하였다. CALM2를 레퍼런스 유전자로 삼았다.

HER2, ESR1, PGR 및 Ki67의 mRNA 발현 수준에 기초하여 (음/낮음(neg/low))는 소정의 발현 역치보다 발현 수준이 낮다는 것을 가리키고; (양/증가됨(pos/increased))는 소정의 발현 역치보다 발현 수준이 더 높음을 가리킨다) 종양을 분자 아형들인 HER2-양성 (HER2), 루미날 A (LumA), 루미날 B (LumB) 및 삼중-음성 (TNT)로 분류하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 종양의 분자 아형 결정은 종래 기술에 따른 방법 예컨대 면역조직화학법 (Goldhirsch et al. (2011), Annals of Oncology, 22:1736-1747, St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011) 및 오직 3종의 유전자 마커를 이용한 분석법 (Sotiriou et al. (2009), N Engl J Med, 360(8):790-800)것과 다르다.

도 2는 유방암 환자들의 5년 생존률에 있어서 HER2, ESR1, PGR, Ki67 및 RACGAP1 mRNA의 발현 수준의 예후 및 예측 값을 평가하기 위한 분할 검사(partitioning test)를 나타낸다. 이들 데이터는 소정의 역치를 하회 또는 상회하는 RACGAP1 mRNA 발현 수준이 5년 생존율에 있어서 특히 유의적인 차이와 연관되어 있음을 보여준다. 더욱 구체적으로, RACGAP1 mRNA 발현의 증가된 수준은 생존 확률을 유의적으로 감소시킨다. 만일 RACGAP1의 mRNA 발현이 증가하고 Ki67 mRNA 발현이 낮으면 생존 확률은 더 감소한다 (표 3 참조). 현행의 분석 방법으로는, 이들 위험 환자들 (특정 영상화 방법을 이용한 검사 등, 상이한 종류의 팔로우-업 조치를 필요로 하는 환자들)은 발견되지 않은 채로 남아있게 된다.

카플란 마이어 분석법을 이용하여 본 발명자들은 HER2-양성, 루미날 A, 루미날 B 및 삼중-음성 종양을 갖는 환자들의 생존율을 각각 분석하였는데, 여기서 종양의 분자 아형은 본 발명에 따라, 즉, HER2, ESR1, PGR 및 Ki67의 mRNA 발현 수준에 기초하여 동정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명자에 의해 정의된 루미날 A 아형은, 5년 후 97%의 전체 생존율과 연관되어 있다 (vs. 루미날 B 및 HER2-양성 종양의 경우 87% 및 삼중-음성 종양의 경우 84%).

본 발명자들은 또한 HER2-양성, 루미날 A, 루미날 B 및 삼중-음성 종양을 갖는 환자들의 원격 전이 없는 생존율 ("DMFS"; 외과수술 X년 후의 원격 재발)도 각각 분석하였는데, 여기서 종양의 분자 아형은 본 발명에 따라 동정하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명자들에 의해 동정된 루미날 A 아형은 5년 후 92%의 원격 전이 없는 생존율과 연관되어 있다 (vs. 루미날 B, HER2-양성 및 삼중-음성 종양의 의 경우 78%).

가장 중요한 조직병리학적 표준 파라미터들(종양 크기, 결절 상태 및 조직학적 등급)을 이용한 전체 생존율의 다변량 분석 결과, 본 발명에 따른 분자 아형 결정법은 가장 유의적으로 밝혀진 반면, 조직학적 등급화법 및 결절 상태는 그의 유의성을 상실한 것으로 나타났다.

마지막으로, 면역조직화학법(Sotiriou et al. (2009), N Engl J Med, 360(8):790-800)에 의한 분자 아형 결정법과 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67의 mRNA 발현 수준에 기반한 본 발명의 방법에 의한 분자 아형 결정법을 비교하는 DMFS의 다변량 Cox 회귀 분석법을 실시하였다 (도 5). 분석 결과, 본 발명의 방법으로 얻은 결과는 Cox 비례위험 모델에 포함된 반면 면역조직화학에 의한 아형 결정은 그의 유의성을 상실한 것으로부터 알 수 있듯이, 본 발명의 방법의 우월성이 명백히 드러났다.

실시예 3: 역전사 (RT) 정량 PCR (RT- qPCR ) 및 분자 아형 결정에 의한 바이오 마커 HER2, ESR1 , PGR , Ki67 의 mRNA 발현 수준 측정

FFPE 조직으로부터 RNA를 분리하였다. 보다 구체적으로, XTRAKT RNA Extraction Kit (Stratifyer Molecular Pathology, Cologne, Germany)를 이용하여 FFPE 유방 종양 조직의 10 μm 섹션으로부터 총 RNA를 추출하였다. RNA 용출액(eluates)을 농도 결정 없이 직접 사용하였다. 후술하는 바와 같이 RT-qPCR에 의해 각 추출물의 2.5 μl RNA를 분석하였다.

RT-qPCR에 있어서, 각 표적에 대해 대상 영역을 플랭킹하는 프라이머 및 3'-TAMRA 또는-Dabcyl Quencher가 구비된 5'-형광 표지된 가수분해 프로브들을 이용하였다. 사용된 프라이머 및 프로브들의 목록은 표 1에 수록되어 있다. 샘플 RNA의 양의 차이를 보정하기 위해, 발현 결과의 정규화에 CALM2 및 B2M 유전자를 레퍼런스 유전자로서 이용하였다. 다음의 조합, 즉 HER2/ESR1, Ki67/B2M 및 PGR/CALM2을 이용하여, RT-qPCR을 이중으로 수행하였다. 3종의 4x 분석 믹스 각각은 2 μM의 비변형 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 그리고 1.2 μM의 프로브를 함유하였다. 각 분석을 위해, 반응 당 2.5 μl 분석-믹스, 2.5 μl 4x 효소-믹스 (TaqManFast Virus 1-Step MasterMix, Life Technologies), 및 2.5 μl 물을 갖는 마스터 믹스를 제조하고 각 마스터 믹스 7.5 μl를 kPCR 96-웰 반응 플레이트 내로 삼회 분포시켰다. FFPE 절편으로부터 추출된 2.5 μl 총 RNA (상기 참조) 또는, 별법으로 양성 대조군(IVT RNA) 또는 음성 대조군(물)을 각 웰에 첨가하였다. 3명의 환자 샘플로부터 유래된 RNA 용출물을 3개 로트의 분석 믹스 및 효소 믹스를 이용하여 분석하였다. 다음의 열 프로파일에 따라, Versant kPCR Cycler (Siemens)을 이용하여 제조업자 지침대로, 1-스텝 RT-qPCR 반응 측정을 실시하였다: 5분 50℃, 20초 95℃ 각 1 사이클씩 및 15초 95℃, 1분 60℃을 40 사이클 실시.

6명의 환자 샘플들을 양성 및 음성 대조군들과 함께 3 로트 분석 믹스와 함께 분석하였다. 상기 설명에 따라 40-ΔΔCT 값을 구하였다 (계산방법 4). 도 6 내지 도 9는 각 마커, 각 샘플 및 각 로트에 대한 40-ΔΔCT 값을 나타낸다. 양 및 음의 바이오마커 분류와 관련한 컷-오프값 (40-ΔΔCT 값으로 주어짐)은 다음과 같았다: HER2: 40.90; ESR1: 38.20; PGR: 34.90; Ki67: 34.80. 분자 아형을 표 4에 나타내었다.

서로 다른 시약 로트 간의 결과는 오직 약간만 차이가 남을 관찰할 수 있다. 모든 마커에 있어서 분석 성능은 매우 양호하였고 재현가능하였다. 표 5 내지 표 7은 각 마커에 있어서 40-ΔΔCT 값 및 양성 또는 음성 결과 그리고 표 4에 정의된 각각의 아형으로의 번역을 나타낸다 (표 2도 참조할 것). 마커 결과 (양/음) 아형은 3가지 서로 다른 시약 로트를 이용하여 측정된 6종의 샘플 모두에서 일치하였다.

실시예4 : 임상 결과 관점에서 RT- qPCR 및 IHC에 의한 유방암 아형 결정 비교

도 10 내지 도 19는 상이한 화학요법제들(도세탁셀 또는 비노렐빈)으로 처리된 상이한 종양 아형들 (루미날 B, HER2-양성, 루미날 A, 및 삼중-음성 유방암 [TNBC])에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸 도면이다. 본 발명에 따라 RT-qPCR에 의해 정의된 아형들은 패널 A에 나타냈고, IHC에 의해 정의된 아형들은 패널 B에 나타내었다. 점선은 결과 계산과 관련하여 5년 시점을 표시한 것이다.

도 10 내지 도 19에 제시된 데이터는 종래의 단백질-기반 IHC에 비해 RT-qPCR에 의한 유방암의 신규한 RNA-기반 분류법이 우월함을 집합적으로 강조해주고 있다. 이들 데이터는 루미날 B 종양에 대한 도세탁셀 치료의 유의적인 장점을 가리킨다. 이와 대조적으로, IHC-기반 아형 결정은 루미날 A, 루미날 B 및 삼중-음성 유방암 환자들에 있어서 어떤 아형이 어떤 추세에서 유의적인 장점을 갖는지를 나타내지 못하였다. 그러나, 이들 3 가지 아형은 모든 환자의 ~80%를 차지하므로, IHC-기반 아형 결정은 임상적으로 어떠한 유용한 예측 정보도 제공하지 못하였다.

중요한 것은, 루미날 B 종양으로 RT-qPCR-정의된 환자들이 플루오로우라실, 에피루비신 및 사이클로포스파미드 (FEC)에 의한 조합 치료시, 비노렐빈에 비해 도세탁셀의 경우 통계적으로 유의적이면서 독점적인 장점을 유도하였다는 것이다. 이들 환자들은 도세탁셀로 치료시 전이 없이 유지되고 유의적으로 더 오래 생존한 반면, 비노렐빈으로 치료받은 경우에는 치료 결과가 명백히 더 나쁘다. 두 가지 화학치료 요법 간의 이러한 결과 차이는 루미날 B를 제외한 다른 아형에서는 관찰되지 않는다. 흥미롭게도, 도세탁셀은 루미날 A 종양의 경우 비노렐빈보다도 더 나쁜 것으로 나타났다. 이 효과가 통계적 유의성에 미치지는 않지만, RT-qPCR에 의해 동정된 루미날 B 환자에서 관찰된 것과 같은 도세탁셀의 가능한 이로운 치료 효과가 루미날 A 환자 환자에서는 배제됨이 분명하다.

이와 대조적으로, IHC에 의해 환자들의 아형을 결정한 경우, 부정확한 분류로 인해, 치료법 유형에 의한 임상 결과에 따른 효과가 모호하다. 이것은 다시 임상적인 결정을 내릴 정도로 신뢰될 수 없고, 결정을 내리지 못하게 하는 다양한 경향으로 이어진다. 결국, 본 발명은 도세탁셀에는 잘 반응하지만 비노렐빈에는 그렇지 못한 유방암 환자들의 특정 그룹을 재론의 여지없이 정확하게 동정해주며, 따라서 이 특정 세팅에서 루미날 B 종양에 대한 예측력을 나타내는 것이다. 이것은 예정된 개시 투여량 감소를 필요하게 만들었던 사실인, FinHER 임상 연구에서 보여졌던 바와 같이, 비노렐빈에 비해 도세탁셀이 부작용에 더 흔하게 연관되었던 것을 감안하면, 진단 분석에 있어서 매우 중요한 특징이다.

따라서, 본 발명은 유방암에서 적당한 치료법을 할당하는데 도움이 될 수 있다. 특히, 무작위화 임상 시험 관점에서 최초로 나타난 바와 같이, RT-qPCR에 의한 유방암 아형 결정은 도세탁셀-함유 치료법을, 도세탁셀 처리에 보다 반응성인, 루미날 B 종양을 산생하는 환자들로 한정하게 해주고, 다른 종양 아형을 갖는 환자들에 있어 대안적인 화학치료법을 고려할 수 있게 해준다.

실시예 5: RT- qPCR 과 통상적인 IHC 염색을 Ki67 에 대한 이들의 감수성 측면에서 비교

상당한 수의 사례(16.58%)가 IHC에 의해서는 Ki67 음성이지만 RT-qPCR에 의해서는 Ki67 양성이다. 이것은 종래기술의 단백질-기반 평가에 비해 본 발명에 의한 mRNA 결정법의 보다 높은 감수성 및 강건성을 입증하는 것이다. 부분적으로, 이것은 아마도 IHC 방법의 여러가지 기술적 제약 (예컨대, 항원 복구 이슈 및/또는 고정으로 인한 단백질 보존능 결여, 조직 절단 후 분석 시간, 등)이나 염색 해석과 관련된 문제 (예컨대, 희미한 핵 염색의 해석)에 기인한 것일 수 있다.

RT-qPCR에 의한 Ki67의 RNA-기반 평가의 보다 높은 감수성으로 인해, Ki67의 IHC 평가와의 일치성은 중간 정도에 그친다 (도 20 A, C 참조). 더욱이, 이것은 레퍼런스 방법으로 로컬 IHC 평가가 이용될 경우 본 발명에 있어 낮은 NPA를 야기한다 (53.82%) (도 20 D). 이와 대조적으로 RT-qPCR는 양성 IHC 사례의 대다수를 동정하므로, PPA는 높다(94.2%). 결국, 두 가지 방법 모다 유의적으로 연관되어 있지만 (p<0.0001), 단지 중간 정도만 일치 (moedrately concordant)할 뿐이다.

표 8은 FinHer 연구 모집단에서 (여기서 N은 관찰횟수, % (세포)는 16가지 잠재적인 아형 조합의 전체 빈도, % (col.)은 IHC 아형 내에서 RT-qCR 아형의 분포, 및 % (row)는 본 발명에 의해 정의된 아형 내에서 IHC 아형의 분포를 나타냄) RT-qPCR-기반 아형 및 IHC-기반 아형 간의 상호 연관성을 나타내는 분할표(contingency table)이다. IHC 아형을 "레퍼런스 표준"으로 설정하면, TNBCs (85.71%) 및 HER2-양성 (79.43%)에서 일치성이 가장 높고 루미날 A (65.38%) 및 루미날 B (61.22%) 종양에서 일치성이 가장 낮다.

실시예 6: RT- qPCR -기반 아형 결정과 IHC-기반 아형 결정은 루미날 B 평가에서 주로 차이가 난다

Ki67의 RT-qPCR-기반 평가 감수성이 더 높음으로 해서, 아형 결정을 위해 ESR1, PGR, HER2 및 Ki67을 조합시키기 위해 동일한 알고리듬을 사용하는 한편, IHC_기반 평가에 비해, 루미날 A 환자와 루미날 B 환자를 결정하는데 있어 실질적인 차이가 야기된다.

IHC 방법에 의해 루미날 A로 분류된 189명의 유방암 환자들 중 오직 53.97%만이 RT-qPCR에 의해서도 루미날 A로 분류된 반면, 39.68%는 루미날 B 환자로 밝혀졌다. 이와 대조적으로, 오직 6.35%만이 HER2-양성으로 분류되고 삼중-음성으로 분류된 것은 0%였다. 뿐만 아니라, IHC 방법에 의해 루미날 B로 분류된 251명의 환자들 중, 71.71%가 RT-qPCR에 의해서도 루미날 B로 분류된 반면, 19.12%는 루미날 A 환자로 분류되었다. 이와 대조적으로, 6.77%는 HER2-양성으로 재분류되고 2.39%는 삼중-음성으로 밝혀졌다. 반대로, RT-qPCR에 의해 루미날 B로 분류된 종양의 61.22%만이 통상적인 IHC에 의해 루미날 B로 분류되었다.

이러한 데이터는 도세탁셀-민감성 루미날 B 종양을 결정하기 위한 2 가지 분석법들 간에 관찰된 약간의 일치성(modest concordance)을 나타내는데, 이는 IHC에 의한 Ki67의 반정량적 평가의 제한된 민감성 및/또는 강건성(robustness)에 주로 기인하는 것이다.

실시예 7: RT-qPCR에서는 높은 High Ki67로 결정되나, IHC에 의해서는 낮은 Ki67로 결정되는 것은 원격 전이 위험성이 더 높은 것과 연관이 있다

본 발명의 접근법은 IHC에 의해 오직 ER-양성 사례만을 포함하는 집단을 대상으로 할 경우 부가적인 구별 능력을 입증한다. 이 경우, Ki67은 IHC-기반 분석과 RT-qPCR-기반 분석 간에 차이가 있는 것으로 밝혀졌다. RT-qPCR 및 IHC에 의한 Ki의 결정은 686개의 입수가능한 데이터 세트 중 514개에서 일치하였으므로 (74.92%), mRNA 기반 평가의 우월성을 입증하기 위한 샘플 수가 제한된다 (n=172).

그러나, 샘플 수가 작음에도 불구하고, RT-qPCR에 의한 Ki67 양성은 불일치 사례에서 원격 전이가 일어날 위험성이 증가함을 가리킨다. 도 21 A에 도시된 바와 같이, 낮은 Ki67 mRNA 발현을 나타낸 ER-양성 환자들은 5년 후 5%에서 원격 전이가 발생한 반면, 높은 Ki67 mRNA 발현을 나타낸 환자들에서는 15%가 원격 전이가 일어났다 (HR 3.315). 이러한 추세는 다변량 분석에 의해 영향을 받지 않았다 (도 21 B).

이것은 본 발명의 접근법의 Ki67 평가와 관련하여 감수성이 높을수록 종래의 IHC 염색법에 비해 부가적인 예후 정보를 더 제공해 준다는 것을 입증하는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Theracode GmbH Stratifyer Molecular Pathology GmbH <120> Methods and kits for the molecular subtyping of tumors <130> 674-116 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR_F <400> 1 agagggtgcc aggctttgt 19 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR_R <400> 2 aggatctcta gccaggcaca tt 22 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR_P <400> 3 tttgaccctc catgatcagg tccacct 27 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2_F <400> 4 gaactcacct acctgcccac c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2_R <400> 5 gacctgcctc acttggttgt g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2_P <400> 6 ccaggaggtg cagggctacg tg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KI67_F <400> 7 cgagacgcct ggttactatc aa 22 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KI67_R <400> 8 ggatacggat gtcacattca atacc 25 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KI67_P <400> 9 acggtcccca ctttcccctg agc 23 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGR_F <400> 10 aaacttcttg ataacttgca tgatctt 27 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGR_R <400> 11 caataacttc agacatcatt tctgg 25 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGR_P <400> 12 cgggactgga taaatgtatt caagcagtac 30 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAC_F <400> 13 gaatgtgcgg aatctgtttg ag 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAC_R <400> 14 tcgccaactg gataaattgg a 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAC_P <400> 15 actgagaatc tccacccggc gca 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M_F <400> 16 gtatgcctgc cgtgtgaacc 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M_R <400> 17 ggcatcttca aacctccatg at 22 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M_P <400> 18 agtgggatcg agacatgtaa gcagc 25 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALM2_F <400> 19 aggaggcgaa ttagtccga 19 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALM2_R <400> 20 gctcttcagt cagttggtca 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALM2_P <400> 21 tcgcgtctcg gaaaccggta gc 22

Claims

보조 화학요법을 위해 유방암 환자를 계층화하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
상기 방법은, 제1 단계로서 유방암 환자에서 유방 종양의 분자 아형을 동정하는 단계, 및 제2 단계로서 상기 분자 아형에 기초하여 보조 화학요법에 찬성인지 (in favor of) 또는 반대인지 (against)를 결정하는 단계를 포함하고,
상기 분자 아형은 하기 단계를 포함하는 시험관 내 (in vitro) 방법을 이용하여 동정되고:
(a) 상기 종양의 샘플 내의 인간 표피성장인자 수용체 2 (HER2)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계;
(b) 상기 종양 샘플 내의 에스트로겐 수용체 (ESR1)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계;
(c) 상기 종양 샘플 내의 프로게스테론 수용체 (PGR)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계; 및
(d) 상기 종양 샘플 내의 증식 항원 Ki-67 (Ki67)의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 단계,
상기 샘플은 상기 종양으로부터 추출된 것이고,
상기 RNA 전사체의 발현 수준은 역전사 정량 PCR에 의하여 측정되고,
HER2, ESR1, PGR, Ki67, 및 1종 이상의 레퍼런스 유전자 이외의 어떠한 RNA 전사체의 발현 수준도 측정되지 않으며,
상기 분자 아형은 루미날 A 및 루미날 B를 포함하는 군으로부터 선택되고, 및
상기 분자 아형이 루미날 B이면 보조 화학요법에 찬성인 것으로 결정되거나, 또는 상기 분자 아형이 루미날 A이면 보조 화학요법에 반대하는 것으로 결정되는 것인 방법.
제1항에 있어서, HER2, ESR1, PGR 및 Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준을 결정하는 것은 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67의 RNA의 전사체의 발현 수준이 HER2, ESR1, PGR 및 Ki67 각각의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮은지 또는 높은지를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (a)는 단계 (b), (c) 및 (d)에 앞서서 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (d)는 단계 (a), (b) 및 (c) 후에 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (a)는 단계 (b) 전에 수행되고, 단계 (b)는 단계 (c) 전에 수행되며, 및 단계 (c)는 단계 (d) 전에 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서,
- HER2의 RNA 전사체의 발현 수준이 HER2의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치 보다 낮고;
- ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준이 ESR1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높으며;
- PGR의 RNA 전사체의 발현 수준이 PGR의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높고; 및
- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높은 것은
상기 종양의 분자 아형을 루미날 B로 동정하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
- HER2의 RNA 전사체의 발현 수준이 HER2의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고;
- ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준이 ESR1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높으며;
- PGR의 RNA 전사체의 발현 수준이 PGR의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높고; 및
- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮은 것은
상기 종양의 분자 아형을 루미날 A로 동정하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
- HER2의 RNA 전사체의 발현 수준이 HER2의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고;
- ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준이 ESR1의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높으며;
- PGR의 RNA 전사체의 발현 수준이 PGR의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고; 및
- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮거나 높은 것은
상기 종양의 분자 아형을 루미날 B로 동정하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
- HER2의 RNA 전사체의 발현 수준이 HER2의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고;
- ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준이 ESR1의 RNA 전사체 소정의 발현 역치보다 낮으며;
- PGR의 RNA 전사체의 발현 수준이 PGR의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높고; 및
- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높은 것은
상기 종양의 분자 아형을 루미날 B로 동정하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
- HER2의 RNA 전사체의 발현 수준이 HER2의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고;
- ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준이 ESR1의 RNA 전사체 소정의 발현 역치보다 낮으며;
- PGR의 RNA 전사체의 발현 수준이 PGR의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높고; 및
- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮은 것은
상기 종양의 분자 아형을 루미날 A로 동정하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
- HER2의 RNA 전사체의 발현 수준이 HER2의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고;
- ESR1의 RNA 전사체의 발현 수준이 ESR1의 RNA 전사체 소정의 발현 역치보다 높으며;
- PGR의 RNA 전사체의 발현 수준이 PGR의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 낮고; 및
- Ki67의 RNA 전사체의 발현 수준이 Ki67의 RNA 전사체의 소정의 발현 역치보다 높은 것은
상기 종양의 분자 아형을 루미날 B 동정하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 분자 아형 루미날 A는 치료 후 원격 재발 없는 5년 생존 확률이 분자 아형 루미날 B와 연관된 치료 후 원격 재발 없는 5년 생존 확률보다 적어도 11%, 또는 적어도 13% 더 높은 것과 연관이 있고 및/또는 치료 후 5년 생존 확률이 분자 아형 루미날 B와 연관된 치료 후 5년 생존 확률보다 적어도 7%, 또는 적어도 9% 더 높은 것과 연관이 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 유방 종양은 고형 종양인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 정량 PCR은 형광-기반 정량 실시간 PCR인 것인 방법.
제1항에 있어서, 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 1 및 2의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 ESR1-특이 프라이머, 또는 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 4 및 5의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 HER2-특이 프라이머, 또는 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 7 및 8의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 Ki67-특이 프라이머, 또는 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 10 및 11의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 PGR-특이 프라이머의 사용을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 3의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 ESR1-특이 프로브, 또는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 6의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 HER2-특이 프로브, 또는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 9의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 Ki67-특이 프로브, 또는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 12의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 PGR-특이 프로브의 사용을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 발현 수준은 종양의 샘플 내의 1종 이상의 레퍼런스 유전자들의 발현 수준 또는 평균 발현 수준에 대해 정규화되는 것인 방법.
제17항에 있어서, 1종 이상의 레퍼런스 유전자는 CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 및 GAPDH를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 분자 아형은 루미날 B이고, 상기 보조 화학요법은 탁산의 투여를 포함하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 상기 탁산은 도세탁셀인 것인 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 탁산은 플루오로우라실, 에피루비신 및 사이클로포스파미드(FEC)와 조합하여 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 따른 보조 화학요법을 위한 유방암 환자의 계층화에 사용하기 위한 키트로서, 상기 키트는:
-적어도 한 쌍의 HER2-특이 프라이머 및 적어도 한 개의 HER2-특이 프로브;
-적어도 한 쌍의 ESR1-특이 프라이머 및 적어도 한 개의 ESR1-특이 프로브;
-적어도 한 쌍의 PGR-특이 프라이머 및 적어도 한 개의 PGR-특이 프로브; 및
-적어도 한 쌍의 Ki67-특이 프라이머 및 적어도 한 개의 Ki67-특이 프로브
를 포함하는 것인 키트.
제22항에 있어서, 상기 프로브의 검출은 증폭-매개된 프로브 변위에 기반한 것인 키트.
제23항에 있어서, 상기 프로브는 형광 리포터 모이어티 및 형광 소광 모이어티를 포함하는 이중-표지된 프로브인 것인 키트.
제22항에 있어서, 역전사효소 및 DNA 폴리머라제를 더 포함하는 것인 키트.
제25항에 있어서, 상기 역전사효소 및 상기 폴리머라제는 원-스텝 역전사(RT) 정량 PCR을 가능케 하는 효소-믹스 형태로 제공되는 것인 키트.
제22항에 있어서, 적어도 한 쌍의 레퍼런스 유전자-특이 프라이머 및 적어도 한 개의 레퍼런스 유전자-특이 프로브를 더 포함하는 것인 키트.
제27항에 있어서, 상기 레퍼런스 유전자는 CALM2, B2M, RPL37A, GUSB, HPRT1 및 GAPDH을 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인 키트.
제22항에 있어서, 적어도 한 개의 대조군 RNA 샘플을 더 포함하는 것인 키트.
제22항에 있어서, 상기 프라이머는 120 bp 미만의 앰플리콘 크기를 제공하는 것인 키트.
제22항에 있어서, ESR1-특이 프라이머는 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 1 및 2의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 HER2-특이 프라이머는 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 4 및 5의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 Ki67-특이 프라이머는 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 7 및 8의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 PGR-특이 프라이머는 15 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NOs: 10 및 11의 서열의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 키트.
제22항에 있어서, ESR1-특이 프로브는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 3의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 HER2-특이 프로브는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 6의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 Ki67-특이 프로브는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 9의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 PGR-특이 프로브는 20 내지 35개 길이의 뉴클레오타이드를 갖고 SEQ ID NO: 12의 서열의 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 키트.
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