KR102236857B1 - 시프로헵타딘 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 식욕 촉진용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시프로헵타딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 포유동물의 식욕 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 시프로헵타딘 유도체는 mHypoE 세포주에서 시프로헵타딘과 유사하거나 더 낮은 AgRP 발현량을 나타내어 우수한 식욕 촉진 효과를 나타내고, 육계 및 자돈에서 우수한 증체 효과를 나타내므로, 본 발명의 시프로헵타딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 포유동물의 식욕 촉진용 조성물은 동물 의약품 및 사료 첨가제 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 시프로헵타딘 유도체는 mHypoE 세포주에서 시프로헵타딘과 유사하거나 더 낮은 AgRP 발현량을 나타내어 우수한 식욕 촉진 효과를 나타내고, 육계 및 자돈에서 우수한 증체 효과를 나타내므로, 본 발명의 시프로헵타딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 포유동물의 식욕 촉진용 조성물은 동물 의약품 및 사료 첨가제 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 시프로헵타딘 유도체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신규한 시프로헵타딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 포유동물의 식욕 촉진용 조성물에 관한 것이다.
산업 동물 분야에서 식욕 저하는 생산성 및 면역력 저하로 인한 2차 감염 발생 확률 증가로 이어진다. 따라서, 생산성 증가뿐만 아니라 면역력 증강 및 감염 예방을 위하여 산업 동물의 식욕 촉진을 위한 방안이 개발되고 있다.
국내에 시판 중인 산업동물의 식욕촉진제는 대부분 주사제로서 투여 경로에서의 불편함이 있으므로, 식욕중추신경 작용을 통한 경구용 사료 첨가제의 개발이 필요한 실정이다.
기존 사료 첨가용 제품으로는 향미제, 감미제 등의 기호물질을 첨가하여 간접적인 효과를 유도하는 기전을 채용하고 있으나, 이러한 제품은 식욕부진 개선 효과가 미비하다는 문제점이 있다.
본 발명의 발명자들은 식욕증진 동물의약품의 개발을 위해 연구하던 중, 정신병 치료제(psychotic drugs) 중에서 높은 히스타민 H1 수용체 친화력을 갖는 약물이 현저한 체중 증가 효과를 나타냄에 착안하여, 분자 모델링 활성 예측을 통한 히스타민 H1 수용체 친화력을 갖는 시프로헵타딘(cyproheptadine) 유도체를 설계하고, 분자모델링과 바이오활성 실험 및 동물실험을 통하여 이들의 식욕 촉진 효과를 평가함으로써, 본 발명에 따른 신규한 구조의 시프로헵타딘 유도체가 포유동물의 식욕 촉진 용도로 사용될 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 신규한 시프로헵타딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 포유동물의 식욕 촉진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따라, 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 제공된다.
<화학식 1>
상기 식에서, X는 R1, R2, COR3, 또는 COR4이고,
R1은 벤질, 페닐알킬, 신나밀, 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알케닐, 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알키닐, 또는 디옥솔라닐알킬이고,
R2는 알콕시벤질 또는 알킬피리딘이고,
R3는 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬아세틸, 디하이드록시페닐, 페닐케토닐, 또는 페닐알키닐이고,
R4는 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알킬, 톨릴, 또는 벤질이다.
일 구현예에서, 상기 R1은 벤질, 페닐프로필, 신나밀, 노닐, 알릴, 부테닐, 메틸부테닐, 프로피닐, 또는 디옥솔라닐메틸일 수 있으며, 상기 R2는 메톡시벤질 또는 메틸피리딘일 수 있으며, 상기 R3는 시클로펜틸, 시클로헥세닐, 에틸아세틸, 디하이드록시페닐, 메틸페닐케토닐, 또는 페닐에티닐일 수 있으며, 상기 R4는 헵실, 톨릴, 또는 벤질일 수 있다.
본 발명에 따른 화합물로서 바람직한 화합물의 구체적인 예는 다음과 같다:
(1) 1-벤질-4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘
(2) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)-1-(3-페닐프로필)피페리딘
(3) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘]
(4) 1-신나밀-4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘
(5) 3-((4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)메틸)피리딘
(6) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)-1-노닐피페리딘
(7) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)-1-(프로프-2-아인-1-일)피페리딘
(8) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)-1-(3-메틸부트-2-엔-1-일)피페리딘
(9) 1-알릴-4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘
(10) (E)-1-(부트-2-엔-1-일)-4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘
(11) 1-((1,3-디옥솔란-2-일)메틸)-4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘
(12) (4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)(시클로펜틸)메탄온
(13) 1-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)옥탄-1-온
(14) (4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)(시클로헥스-1-엔-1-일)메탄온
(15) 에틸 3-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)-3-옥소프로파노에이트
(16) (4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)(3,5-디하이드록시페닐)메탄온
(17) 1-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)-2-페닐에탄-1,2-디온
(18) (4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)(p-톨릴)메타논
(19) 1-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리닐-1-일)-2-페닐에탄-1-온
(20) 1-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)-3-페닐프로프-2-아인-1-온
본 발명의 다른 측면에 따라, (a) 시프로헵타딘에서 메틸기를 제거하여 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘을 합성하는 단계; 및 (b) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 R1-Br, R2-Cl, R3-COOH 및 R4-COCl로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종을 반응시키는 단계(이 때, R1은 벤질, 페닐알킬, 신나밀, 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알케닐, 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알키닐, 또는 디옥솔라닐알킬이고; R2는 알콕시벤질 또는 알킬피리딘이고; R3는 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬아세틸, 디하이드록시페닐, 페닐케토닐, 또는 페닐알키닐이고; R4는 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알킬, 톨릴, 또는 벤질이다)를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법이 제공된다.
일 구현예에서, 단계(b)에서 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 R1-Br을 반응시킬 수 있으며, 혹은 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 R2-Cl을 반응시킬 수 있으며, 혹은 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 R3-COOH을 반응반응시킬 수 있으며, 혹은 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 R4-COCl을 반응시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 포유동물의 식욕 촉진용 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 식욕 촉진용 조성물은 동물 의약품 또는 사료 첨가제일 수 있다.
본 발명에서 설계된 신규한 시프로헵타딘 유도체가 mHypoE 세포주에서 시프로헵타딘과 유사하거나 더 낮은 AgRP 발현량을 나타내어 우수한 식욕 촉진 효과를 나타내고, 육계 및 자돈에서 우수한 증체량 개선 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물 즉, 시프로헵타딘 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 포유동물의 식욕 촉진용 조성물은 동물 의약품 및 사료 첨가제 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 CYP001(실시예 1)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 2는 CYP002(실시예 2)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 3은 CYP003(실시예 3)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 4는 CYP004(실시예 4)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 5는 CYP005(실시예 5)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 6은 CYP006(실시예 6)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 7은 CYP007(실시예 7)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 8은 CYP008(실시예 8)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 9는 CYP009(실시예 9)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 10은 CYP010(실시예 10)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 11은 CYP011(실시예 11)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 12는 CYP013(실시예 12)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 13은 CYP014(실시예 13)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 14는 CYP015(실시예 14)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 15는 CYP016(실시예 15)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 16은 CYP018(실시예 16)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 17은 CYP019(실시예 17)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 18은 CYP020(실시예 18)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 19는 CYP021(실시예 19)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 20은 CYP022(실시예 20)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 21은 시프로헵타딘의 AgRP(Agouti-related peptide) 발현량 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 22는 시프로헵타딘 유도체들의 AgRP 발현량 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 23은 선별된 5개의 후보물질(CYP002, CYP006, CYP008, CYP014, CYP022)의 AgRP 발현량 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 24는 확립된 HPLC 조건으로 시프로헵타딘을 분석한 결과이다.
도 25는 확립된 HPLC 조건으로 CYP002을 분석한 결과이다.
도 26은 확립된 HPLC 조건으로 CYP006을 분석한 결과이다.
도 27은 확립된 HPLC 조건으로 CYP022을 분석한 결과이다.
도 28은 육계 증체실험을 수행한 신규화합물 사료첨가제의 사진이다[Cyproheptadine(a), CYP 002(b), CYP 006(c), CYP 022(d)].
도 29는 육계 증체실험을 수행한 시험군의 구성 사진이다.
도 30은 각 시험 물질을 첨가한 사료를 먹인 각 군 육계의 평균 체중 증가 곡선이다[* p<0.05, 음성 대조군과 유의한 차이가 있음].
도 31은 각 시험 물질을 첨가한 사료를 먹인 각 군 육계의 평균 주별 체중 변화이다[* p<0.05, 음성 대조군과 유의한 차이가 있음].
도 32는 사료 첨가제를 통한 각 시험 물질의 처리 후 28일째의 혈청 코티솔 농도이다.
도 33은 시험군의 구성을 나타낸 사진으로서, (a)는 음성 투여군, (b)는 CYP022 투여군(좌측) 및 양성 대조군(우측)이다.
도 2는 CYP002(실시예 2)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 3은 CYP003(실시예 3)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 4는 CYP004(실시예 4)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 5는 CYP005(실시예 5)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 6은 CYP006(실시예 6)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 7은 CYP007(실시예 7)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 8은 CYP008(실시예 8)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 9는 CYP009(실시예 9)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 10은 CYP010(실시예 10)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 11은 CYP011(실시예 11)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 12는 CYP013(실시예 12)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 13은 CYP014(실시예 13)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 14는 CYP015(실시예 14)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 15는 CYP016(실시예 15)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 16은 CYP018(실시예 16)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 17은 CYP019(실시예 17)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 18은 CYP020(실시예 18)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 19는 CYP021(실시예 19)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 20은 CYP022(실시예 20)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 21은 시프로헵타딘의 AgRP(Agouti-related peptide) 발현량 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 22는 시프로헵타딘 유도체들의 AgRP 발현량 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 23은 선별된 5개의 후보물질(CYP002, CYP006, CYP008, CYP014, CYP022)의 AgRP 발현량 감소 효과를 나타낸 결과이다.
도 24는 확립된 HPLC 조건으로 시프로헵타딘을 분석한 결과이다.
도 25는 확립된 HPLC 조건으로 CYP002을 분석한 결과이다.
도 26은 확립된 HPLC 조건으로 CYP006을 분석한 결과이다.
도 27은 확립된 HPLC 조건으로 CYP022을 분석한 결과이다.
도 28은 육계 증체실험을 수행한 신규화합물 사료첨가제의 사진이다[Cyproheptadine(a), CYP 002(b), CYP 006(c), CYP 022(d)].
도 29는 육계 증체실험을 수행한 시험군의 구성 사진이다.
도 30은 각 시험 물질을 첨가한 사료를 먹인 각 군 육계의 평균 체중 증가 곡선이다[* p<0.05, 음성 대조군과 유의한 차이가 있음].
도 31은 각 시험 물질을 첨가한 사료를 먹인 각 군 육계의 평균 주별 체중 변화이다[* p<0.05, 음성 대조군과 유의한 차이가 있음].
도 32는 사료 첨가제를 통한 각 시험 물질의 처리 후 28일째의 혈청 코티솔 농도이다.
도 33은 시험군의 구성을 나타낸 사진으로서, (a)는 음성 투여군, (b)는 CYP022 투여군(좌측) 및 양성 대조군(우측)이다.
본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
<화학식 1>
상기 식에서, X는 R1, R2, COR3, 또는 COR4이고,
R1은 벤질, 페닐알킬, 신나밀, 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알케닐, 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알키닐, 또는 디옥솔라닐알킬이고,
R2는 알콕시벤질 또는 알킬피리딘이고,
R3는 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬아세틸, 디하이드록시페닐, 페닐케토닐, 또는 페닐알키닐이고,
R4는 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알킬, 톨릴, 또는 벤질이다.
일 구현예에서, 상기 R1은 벤질, 페닐프로필, 신나밀, 노닐, 알릴, 부테닐, 메틸부테닐, 프로피닐, 또는 디옥솔라닐메틸일 수 있으며, 상기 R2는 메톡시벤질 또는 메틸피리딘일 수 있으며, 상기 R3는 시클로펜틸, 시클로헥세닐, 에틸아세틸, 디하이드록시페닐, 메틸페닐케토닐, 또는 페닐에티닐일 수 있으며, 상기 R4는 헵실, 톨릴, 또는 벤질일 수 있다.
본 발명에 따른 화합물로서 바람직한 화합물의 구체적인 예는 다음과 같다:
(1) 1-벤질-4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘 [1-Benzyl-4-(5H-dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidine]
(2) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)-1-(3-페닐프로필)피페리딘 [4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)-1-(3-phenylpropyl)piperidine]
(3) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)-1-(4-메톡시벤질)피페리딘 [4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)-1-(4-methoxybenzyl)piperidine]
(4) 1-신나밀-4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘 [1-Cinnamyl-4-(5H-dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidine]
(5) 3-((4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)메틸)피리딘 [3-((4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidin-1-yl)methyl)pyridine]
(6) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)-1-노닐피페리딘 [4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)-1-nonylpiperidine]
(7) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)-1-(프로프-2-아인-1-일)피페리딘 [4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)-1-(prop-2-yn-1-yl)piperidine]
(8) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)-1-(3-메틸부트-2-엔-1-일)피페리딘 [4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)-1-(3-methylbut-2-en-1-yl)piperidine]
(9) 1-알릴-4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘 [1-Allyl-4-(5H-dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidine]
(10) (E)-1-(부트-2-엔-1-일)-4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘 [(E)-1-(But-2-en-1-yl)-4-(5H-dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidine]
(11) 1-((1,3-디옥솔란-2-일)메틸)-4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘 [1-((1,3-Dioxolan-2-yl)methyl)-4-(5H-dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidine]
(12) (4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)(시클로펜틸)메탄온 [(4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidin-1-yl)(cyclopentyl)methanone]
(13) 1-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)옥탄-1-온 [1-(4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidin-1-yl)octan-1-one]
(14) (4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)(시클로헥스-1-엔-1-일)메탄온 [(4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidin-1-yl)(cyclohex-1-en-1-yl)methanone]
(15) 에틸 3-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)-3-옥소프로파노에이트 [Ethyl 3-(4-(5H-dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidin-1-yl)-3-oxopropanoate]
(16) (4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)(3,5-디하이드록시페닐)메탄온 [(4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidin-1-yl)(3,5-dihydroxyphenyl)methanone]
(17) 1-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)-2-페닐에탄-1,2-디온 [1-(4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidin-1-yl)-2-phenylethane-1,2-dione]
(18) (4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)(p-톨릴)메타논 [(4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidin-1-yl)(p-tolyl)methanone]
(19) 1-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리닐-1-일)-2-페닐에탄-1-온 [1-(4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidin-1-yl)-2-phenylethan-1-one]
(20) 1-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)-3-페닐프로프-2-아인-1-온 [1-(4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidin-1-yl)-3-phenylprop-2-yn-1-one]
본 발명은 또한, (a) 시프로헵타딘에서 메틸기를 제거하여 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘을 합성하는 단계; 및 (b) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 R1-Br, R2-Cl, R3-COOH 및 R4-COCl로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종을 반응시키는 단계(이 때, R1은 벤질, 페닐알킬, 신나밀, 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알킬, 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알케닐, 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알키닐, 또는 디옥솔라닐알킬이고; R2는 알콕시벤질 또는 알킬피리딘이고; R3는 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬아세틸, 디하이드록시페닐, 페닐케토닐, 또는 페닐알키닐이고; R4는 치환되거나 치환되지 않은 C3 ~ C9 알킬, 톨릴, 또는 벤질이다)를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에서, 단계(a)는 시프로헵타딘에서 메틸기를 제거하여 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘을 합성하는 단계이다. 시프로헵타딘 염 화합물을 pH를 조절하여 염 상태가 아닌 유리 시프로헵타딘을 수득한 후, 에틸클로로포르메이트를 유기 용매(예를 들어, 톨루엔) 중에서 반응시켜, 메틸제거반응의 중간 단계 화합물인 에틸 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-카르복실레이트를 얻을 수 있다. 얻어진 에틸 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-카르복실레이트를 염기성 환경(예를 들어, KOH 수용액)에서 반응시켜 시프로헵타딘에서 메틸기가 제거된 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘을 얻을 수 있다.
단계(b)는 목적하는 치환기에 따라 단계(a)에서 얻어진 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘에 R1-Br, R2-Cl, R3-COOH 또는 R4-COCl을 반응시키는 단계이다.
화학식 1에서 X가 R1인 경우에는 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 알킬 브롬화물인 R1-Br을 친핵성 치환반응시킨다. 즉, 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘, 알킬 브로마이드(알킬 브롬화물) 및 K2CO3를 유기 용매(예를 들어, THF)에 용해시켜 반응시킴으로써 목적 화합물을 얻을 수 있다.
화학식 1에서 X가 R2인 경우에는 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 알킬 염화물인 R2-Cl을 친핵성 치환반응시킨다. 즉, 탄산칼륨, 요오드화 나트륨 및 알킬 클로라이드(알킬 염화물)를 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘의 유기 용매(예를 들어, DMF) 용액에 첨가하여 반응시킴으로써 목적 화합물을 얻을 수 있다.
화학식 1에서 X가 COR3인 경우에는 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 카르복실산인 R3-COOH를 아미드 커플링 반응시킨다. 즉, 카르복실산, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카르보디이미드 (EDC), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP) 및 트리에틸아민을 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘의 유기 용매(예를 들어, 디클로로메탄) 용액에 첨가하여 반응시킴으로써 목적 화합물을 얻을 수 있다.
화학식 1에서 X가 COR4인 경우에는 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 산 염화물(카르복실산 클로라이드)인 R4-COCl을 친핵성 치환 반응시킨다. 즉, 카르복실산 클로라이드 및 트리에틸아민을 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘의 유기 용매(예를 들어, 디클로로메탄) 용액에 첨가하여 반응시킴으로써 목적 화합물을 얻을 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 포유동물의 식욕 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 시프로헵타딘 유도체를 Kroe mHypoE 세포주에 처리한 결과, 시프로헵타딘과 유사하거나 더 낮은 AgRP(Agouti-related peptide) 발현량을 나타내어 우수한 식욕 촉진 효과를 나타낼 것으로 예상된다. 또한, 상기 화합물은 육계 및 자돈에서 우수한 증체량 개선 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
일 구현예에서, 상기 식욕 촉진용 조성물은 약학 조성물, 동물 의약품 또는 사료 첨가제일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 함유되는 시프로헵타딘 유도체의 투여량은 환자 또는 동물의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 해당 분야 전문가에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 시프로헵타딘 유도체는 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 1000 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 시프로헵타딘 유도체를 0.001 내지 50 % 중량백분율로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 화합물의 포유동물에 있어서의 식욕 촉진 용도 및 포유동물의 식욕 부진의 치료방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 시프로헵타딘 유도체의 구조 설계
본 발명에서는 히스타민 H1 수용체 친화력을 갖는 시프로헵타딘 유도체를 컴퓨터 분자 모델링을 통해 설계하고 합성을 통해 후보물질을 도출하였다(실시예 1 ~ 실시예 20). 설계된 프로헵타딘 유도체(20개)에 대하여, 컴퓨터 분자모델링을 위한 프로그램으로 슈뢰딩거(Schordinger) 사의 마에스트로 2017-1(Maestro 2017-1)를 사용하였고, 단백질 5-HT2B 리셉터 (Code No. 5TVN)를 이용하여 도킹(docking)을 시도하였다.
하기 표 1은 분자모델링을 통한 화합물과 히스타민 H1 수용체간의 친화력 분석 결과이다.
| 실시예 | 화합물 코드 | 결합 스코어 | 구조 |
| 1 | CYP001 | -7.286 |
 |
| 2 | CYP002 | -8.196 |
 |
| 3 | CYP003 | -7.486 |
 |
| 4 | CYP004 | -7.992 |
 |
| 5 | CYP005 | -6.949 |
 |
| 6 | CYP006 | -7.773 |
 |
| 7 | CYP007 | -4.902 |
 |
| 8 | CYP008 | -6.169 |
 |
| 9 | CYP009 | -5.725 |
 |
| 10 | CYP010 | -6.386 |
 |
| 11 | CYP011 | -5.686 |
 |
| 12 | CYP013 | -6.627 |
 |
| 13 | CYP014 | - |
 |
| 14 | CYP015 | -5.806 |
 |
| 15 | CYP016 | -4.450 |
 |
| 16 | CYP018 | -6.135 |
 |
| 17 | CYP019 | - |
 |
| 18 | CYP020 | -6.413 |
 |
| 19 | CYP021 | -5,557 |
 |
| 20 | CYP022 | -5.875 |
 |
분자모델링 결과 화합물 CYP002, CYP006, CYP022가 히스타민 H1 수용체에 대한 가장 높은 친화력을 나타낼 것으로 예측되었다.
2. 시프로헵타딘 유도체의 합성
시프로헵타딘 유도체로 질소의 메틸(methyl)기 대신 다양한 치환기를 도입하기 위해 메틸제거반응(demethylation)과 N-알킬화반응(alkylation)을 시도하였다.
(1) 메틸제거반응(demethylation)
[1 단계]
방법: 시프로헵타딘 염산염 세스퀴하이드레이트 (5 g, 15.44 mmol, 1.0 당량)를 50 mL EtOAc로 취하고 10 % aq. NaOH (20 mL)로 염기성화시켰다. 유기층을 물로 세척하고 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 농축시켜 유리 시프로헵타딘을 수득하였다. 에틸클로로포르메이트 (4.8 mL, 51.1 mmol, 3 당량)를 톨루엔 (100 mL) 중의 유리 시프로헵타딘 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 3 시간 동안 환류시켰다. 반응의 진행은 디클로로메탄 중 10% 메탄올을 이동상으로 사용하여 TLC로 모니터링하였다. 용매를 진공 하에서 농축시켜 오일상의 잔류물을 수득하고 이를 EtOAc에 용해시켰다. 유기층을 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 황산 마그네슘상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에서 농축시켜 목적 화합물을 백색 고체 (4.8 g, 90 %)로 수득하였다.
[2 단계]
방법: 에탄올 (80 mL) 중의 에틸 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-카르복실레이트[ethyl 4-(5H-dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidine-1-carboxylate] (4.8 g, 13.9 mmol, 1 당량) 및 KOH (12.9 g을 H2O 20 mL에 용해함, 208 mmol, 15 당량)를 혼합하였다. 혼합물을 48 시간 동안 환류시켰다. 반응의 진행은 이동상으로서 디클로로메탄 중 10 % 메탄올을 사용하여 TLC로 모니터링하였다. 용매를 농축시키고, 수득된 잔류물을 에틸아세테이트 (EtOAc)에 용해시켰다. 이 후 적량의 H2O 및 염수로 세척하였다. 최종적으로, 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에서 농축시켜 목적 화합물을 백색 고체 (3.5g, 92 %)로 수득하였다.
(2) 알킬 브롬화물(Alkyl bromide)의 친핵성 치환반응
방법: 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘 [4-(5H-Dibenzo[a,d][7]annulen-5-ylidene)piperidine](100 mg, 0.366 mmol, 1.2 당량), 알킬 브로마이드(알킬 브롬화물) (0.305 mmol, 1.0 당량) 및 K2CO3 (84 mg, 0.610 mmol, 2.0 당량)를 THF (3 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 용매를 농축시키고, 수득된 잔류물을 에틸아세테이트 (EtOAc)에 용해시켰다. 이 후 적량의 H2O 및 염수로 세척하였다. 최종적으로, 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에서 농축시켜 조 화합물(crude compound)을 수득하고, 이를 용리제로서 EtOAc/헥산 (1/2)을 사용하는 플래시 칼럼 크로마토 그래피(flash column chromatography)로 정제하였다. 목적 분획을 수집하고 용매를 회전 증발기에서 증발시켜 생성물을 수득하였다.
하기 표 2에 알킬 브롬화물을 사용한 시프로헵타딘 유도체의 구조 및 수율을 나타내었다.
(3) 알킬 염화물(Alkyl chloride)의 친핵성 치환반응
방법: 탄산칼륨 (101 mg, 0.732 mmol, 2.0 당량), 요오드화 나트륨 (82 mg, 0.549 mmol, 1.5 당량) 및 알킬 클로라이드(알킬 염화물) (0.366 mmol, 1.0 당량)을 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘 (100 mg, 0.366 mmol, 1.0 당량)의 DMF(3.0 mL) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 100 ℃에서 밤새 교반하였다. 용매를 농축시키고, 수득된 잔류물을 에틸 아세테이트 (EtOAc)에 용해시켰다. 이 후 적량의 H2O 및 염수로 세척하였다. 최종적으로, 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에서 농축시켜 조 화합물을 수득하고, 이를 용리제로서 EtOAc/헥산 (1/2)을 사용하는 플래시 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적 분획을 수집하고 용매를 회전 증발기에서 증발시켜 생성물을 수득하였다.
하기 표 3에 알킬 염화물을 사용한 시프로헵타딘 유도체의 구조 및 수율을 나타내었다.
(4) 아미드 커플링 반응
방법 : 카르복실산 (0.439 mmol, 1.2 당량), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카르보디이미드[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide] (EDC, 105 mg, 0.549 mmol, 1.5 당량), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 4.5 mg, 0.037 mmol, 0.1 당량) 및 트리에틸아민 (TEA, 74 mg, 0.732 mmol, 2.0 당량)을 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘 (100 mg, 0.366 mmol, 1.0 당량)의 디클로로메탄 (3.0 mL) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 100 ℃에서 밤새 교반하였다. 용매를 농축시키고 수득된 잔류물을 디클로로메탄에 용해시켰다. 이 후 적량의 H2O 및 염수로 세척하였다. 최종적으로, 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에서 농축시켜 조 화합물을 수득하고, 이를 용리제로서 EtOAc/헥산 (1/2)을 사용하는 플래시 칼럼 크로마토 그래피로 정제하였다. 목적 분획을 수집하고 용매를 회전 증발기에서 증발시켜 생성물을 수득하였다.
하기 표 4에 카르복실산을 사용한 시프로헵타딘 유도체의 구조 및 수율을 나타내었다.
(5) 산 염화물의 친핵성 치환 반응
방법: 카르복실산 클로라이드 (0.333 mmol, 1.0 당량) 및 트리에틸아민 (TEA, 42 ㎎, 0.416 mmol, 1.25 당량)을 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘 (100 mg, 0.366 mmol, 1.1 당량)의 디클로로메탄 (3.0 mL) 용액에 첨가 하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 농축시키고 수득된 잔류물을 디클로로 메탄에 용해시켰다. 이를 1N HCl로 세척하였다. 최종적으로, 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에서 농축시켜 조 화합물을 수득하고, 이를 용리제로서 EtOAc/헥산 (1/2)을 사용하는 플래시 칼럼 크로마토 그래피로 정제하였다. 목적 분획을 수집하고 용매를 회전 증발기에서 증발시켜 생성물을 수득하였다.
하기 표 5에 산 염화물을 사용한 시프로헵타딘 유도체의 구조 및 수율을 나타내었다.
3. 시프로헵타딘 유도체의 구조 분석
분석에 사용한 핵자기공명분광기(NMR)는 “Bruker”사의 “ADVANCE III 400 NMR spectrometer”를 이용하였으며, 기준물질로 TMS (tetramethylsilane)가 포 함된 CDCl3 용매를 사용하여 분석하였다. 분석 결과를 도 1 내지 도 20에 나타내었다.
4. 시프로헵타딘 유도체의 활성 평가 (시험예 1)
(1) mHypoE 세포주에서 시프로헵타딘에 의한 AgRP 발현량 변화 확인
Kroe mHypoE 세포주(cellutions biosystems Inc.)에 시프로헵타딘을 처리하여 대조군과 비교하였을 때, AgRP(Agouti-related peptide) 발현량을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다(도 21 참조).
(2) mHypoE 세포주에서 시프로헵타딘(CYP) 유도체들에 대한 AgRP 발현량 변화 평가
1차적인 스크리닝 결과, CYP 유도체들 중 대조군과 비교하였을 때에 배수값(fold값)이 0.5 이하인 후보군은 10개(CYP001, CYP002, CYP003, CYP006, CYP008, CYP009, CYP010, CYP014, CYP015, CYP022)로 나타났으며, 이 후보군들 중 5개의 후보물질(CYP002, CYP006, CYP008, CYP014, CYP022)을 선택하여 반복실험을 수행하였다(도 22 참조).
(3) mHypoE 세포주에서 선발된 시프로헵타딘(CYP) 유도체 5개 화합물에 대한 AgRP 발현량 반복 실험
선별된 5개의 후보물질(CYP002, CYP006, CYP008, CYP014, CYP022)을 사용하여 반복실험한 결과, CYP008, CYP022를 처리한 세포는 비교군보다 낮은 AgRP 발현량을 나타냄을 확인하였다(도 23 참조).
화합물의 구조적 다양성과 물성(고체)을 고려하여 동물실험을 위한 선도물질로 CYP002, CYP006, CYP022을 선정하였다. 이들 3종은 분자모델링 예측 결과에서도 타겟 단백질과의 좋은 친화력을 나타내었다.
5. 선도물질 3종(CYP002, CYP006, CYP022)의 스케일업(scale-up) 합성
(1) CYP002
방법: 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘 (10 g, 36.58 mmol, 1.2 당량), 1-브로모-3-페닐프로판 (6.17 g, 31.0 mmol, 1.0 당량) 및 K2CO3 (8.57 g, 62.0 mmol, 2.0 당량)을 THF (120 mL) 중에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 용매를 농축시키고, 수득된 잔류물을 에틸아세테이트 (EtOAc)에 용해시켰다. 이 후 적량의 H2O 및 염수로 세척하였다. 최종적으로, 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켜 조 화합물을 수득하고, 이를 용리제로서 EtOAc/헥산 (1/3)을 사용하는 플래시 칼럼 크로마토 그래피로 정제하였다. 목적 분획을 수집하고 용매를 회전 증발기상에서 증발시켜 생성물 (7.0 g, 60 %)을 수득하였다.
(2) CYP006
방법: 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘 (8.20 g, 30.0 mmol, 1.2 당량), 1-브로모-노난[1-Bromo-nonane] (5.20 g, 25.0 mmol, 1.0 당량) 및 K2CO3 (6.90 g, 50.0 mmol, 2.0 당량)을 THF (120 mL) 중에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 용매를 농축시키고, 수득된 잔류물을 에틸 아세테이트 (EtOAc)에 용해시켰다. 이 후 적량의 H2O 및 염수로 세척하였다. 최종적으로, 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에서 농축시켜 조 화합물을 수득하고, 이를 용리제로서 EtOAc/헥산 (1/2)을 사용하는 플래시 칼럼 크로마토 그래피로 정제하였다. 목적 분획을 수집하고 용매를 회전 증발기상에서 증발시켜 생성물 (5.7 g, 48 %)을 수득하였다.
(3) CYP022
방법: 페닐프로피올산(Phenylpropiolic acid) (2.06 g, 14.08 mmol, 1.1 당량), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC, 3.68g, 19.21 mmol, 1.5 당량), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 0.16 g, 1.28 mmol, 0.1 당량) 및 트리에틸아민 (TEA, 2.59 g, 25.61 mmol, 2.0 당량)을 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘(3.50 g, 12.80 mmol, 1.0 당량)의 디클로로메탄 (17.0 mL) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 농축시키고 수득된 잔류물을 디클로로메탄에 용해시켰다. 이 후 적량의 H2O 및 염수로 세척하였다. 최종적으로, 유기층을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켜 조 화합물을 수득하고, 이를 용리제로서 EtOAc/헥산 (1/2)을 사용하는 플래시 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적 분획을 수집하고, 용매를 회전 증발기상에서 증발시켜 생성물 (3.19 g, 62 %)을 수득하였다.
6. 선도물질 3종(CYP002, CYP006, CYP022)에 대한 정성분석법
하기 장치 및 조건을 이용하여 선도물질 3종의 분석 조건을 확립하였다.
(ⅰ) 장치: 고성능액체크로마토그래프(HPLC), YL-9100(영린기기)
(ⅱ) 분석조건
- 컬럼(Column): TC-C18(Agilent, 4.6 mm × 250 mm, 5.0 μm)
- 이동상: A (0.1% Formic acid solution) / B (MeOH)
- 유속: 1.0 mL/분
- 컬럼 온도: 40 ℃
- 검출기(Detector): UV 254 nm
- 주입량: 5 μL
상기 확립된 조건으로 각 물질을 분석한 결과가 도 24 내지 도 27에 나타나 있다.
<시험예 2> 시프로헵타딘(Cyproheptadine) 유도체의 육계 증체실험
1. 요약
본 시험은 신규화합물의 육계 증체 효과를 확인하기 위하여 수행하였다.
1) 체중 변화
사료 톤 당 Cyproheptatine(양성대조), CYP002, CYP006 및 CYP022를 각각 1kg씩 혼합하여 28일간 공급하면서 각 시험군의 증체량 변화를 확인하였다.
약물 투여 전 음성대조군, 양성대조군, CYP002, CYP006 및 CYP022 투여군의 28일간 총 증체량은 1129.40±112.64 g/bird, 1219.20±62.06 g/bird, 1147.40±91.88 g/bird, 1150.20±106.51 g/bird 및 1256.80±101.35 g/bird 이었으며, 일일증체량은 40.34±4.02 g/bird/day, 43.54±2.22 g/bird/day, 40.98±3.28 g/bird/day, 41.08±3.80 g/bird/day 및 44.89±3.62 g/bird/day 이었다.
총 증체량과 일일증체량에 있어 각 시험군간의 유의적인 차이는 없었지만, CYP022군의 증체량은 음성대조군에 비하여 약 11% 증가하였고, 양성대조군의 증체량은 음성대조군 보다 약 8% 증가하였다. CYP002투여군과 CYP006 투여군의 증체량은 음성대조군과 차이가 없었다.
주간 증체량에서도 양성대조군, CYP022군의 1주차 증체량이 각각 14.09±2.35 g/bird/week 및 14.34±0.87 g/bird/week으로 무처치군(11.11±2.87 g/bird/week)에 비하여 유의하게 높았으며, 양성대조군과 CYP022군의 4주차 주간 증체량은 음성대조군에 비하여 약 12% 증가하였다.
2) 사료 섭취량 및 사료 전환율(FCR)
28일간 음성대조군, 양성대조군, CYP002, CYP006 및 CYP022 투여군의 사료섭취량을 확인한 결과, 각각 1876.07 g/bird, 1860.64 g/bird, 1886.69 g/bird, 1871.40 g/bird 및 1866.86 g/bird 이었으며, 생산성 지표를 나타내는 사료 전환율(FCR)은 각각 1.67±0.17, 1.53±0.08, 1.65±0.13, 1.64±0.15 및 1.49±0.12이었다. 사료섭취량과 사료 전환율의 각 시험군간의 유의성은 나타나지 않았으나 양성대조군, CYP022 투여군의 사료 전환율은 음성대조군, CYP002 투여군과 CYP006 투여군 보다 낮은 경향을 보였다.
3) 혈중 코티졸(Cortisol) 농도 변화
신규화합물질의 혈중 cortisol에 대한 영향을 확인하기 위하여 투여종료일 혈중 cortisol 농도를 측정 한 결과 음성대조군, 양성대조군, CYP002, CYP006 및 CYP022 투여군의 혈중 cortisol 농도는 각각 4.14±0.58 ng/mL, 3.76±0.64 ng/mL 3.86±0.40 ng/mL, 3.88±0.54 ng/mL 및 3.58±0.37 ng/mL 이었으며, 각 군간의 유의성은 관찰되지 않았다. 그러나 공시물질을 투여한 모든 시험군의 혈중 cortisol 농도가 음성대조군 보다 낮은 경향을 보였다.
시프로헵타딘과 유사한 화학구조를 가지고 있는 신규화합물 중 CYP022의 28일간 증체량은 양성대조군과 유사하였고, 음성대조군에 비해서는 각각 11% 증가하였으며, 혈중 coritosol 농도도 음성대조군에 비하여 낮은 것으로 확인되어 육계 증체량 개선에 효과적으로 작용할 것으로 판단되었다.
2. 목적
본 시험은 신규화합물 사료첨가제의 육계 증체효과를 확인하고자 수행하였다.
3. 재료
1) Cyproheptadine (양성대조군) [도 28의 (a)]
2) CYP 002 : Cyproheptadine 유도체 [도 28의 (b)]
3) CYP 006 : Cyproheptadine 유도체 [도 28의 (c)]
4) CYP 022 : Cyproheptadine 유도체 [도 28의 (d)]
4. 시험 방법
호서대학교 동물실험윤리위원회의 심의절차를 거쳐 승인을 득한 후 동물실험을 수행하였다(승인번호: HSIACUC-18-167(1)).
1) 시험계
- 계통 종: 육계, 로스(1일령)
- 공급업체: 주식회사 하나바이오(경기도 수원시 팔달구 화서동 646)
- 사육환경: 온도 22 ± 3℃, 환기횟수 20 회/시간, 조명주기 12 시간, 조도 30~40 Lux의 환경조건으로 설정된 호서대학교 안전성평가센터 동물실험실을 이용하여 사육하였다.
2) 시험군의 구성
시프로헵다딘 제제 사료첨가제의 육계에서의 증체 효과를 확인하기 위하여 시험군은 표 8과 같이 구성하였다. 시험군당 육계 15 ~ 20 마리씩을 입식 하였으며, 입식 당일 무작위로 5마리씩을 선별하여 증체 효과 실험에 사용하였다.
3) 증체 효과 지표
- 체중 측정: 시프로헵타딘 제제의 증체효과를 확인하기 위하여 주 2회 체중을 측정하였다. 일일증체량은 시험종료 시점의 체중에서 백신투여 개시시점의 체중을 뺀 값에 실험일수를 나눈 값으로 하였다.
- 사료 섭취량 측정: 사료는 두당 110g씩 제공하였으며, 매일 공급량과 잔량을 측정하여 사료섭취량을 측정하였다. 사료 전환율은(Feed conversion ratio, FCR)은 총 사료섭취량을 총 증체량으로 나눠 구하였다.
- 혈중 Cortisol 농도 분석: 혈중 Cortisol 함량에 대한 공시물질의 영향을 분석하기 위하여 ELISA kit (Bioassay Technology Laboratory)를 사용하여 혈청 내 Cortisol 함량을 분석하였다. 즉, Chicken cortisol antibody가 부착된 well에 혈청 40 μL, Anti-cortisol antibody 10μL, streptavidin-HRP 50 μL를 분주하여 혼합한 후 37℃에서 60분간 반응시켰으며, 반응이 끝난 후 washing buffer로 5회 세척하였다. Substrate A와 B를 각각 50μL씩 첨가한 후 37℃에서 10분간 반응시켰으며, 반응정지 용액(stop solution)을 50μL씩 첨가하여 발색반응을 멈춘 후 UV spectrophotometer를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
5. 결과
1) 체중 변화
약물 투여 전 음성대조군, 양성대조군, CYP002, CYP006 및 CYP022 투여군의 시험 개시 체중은 각각 43.80±2.49 g, 44.60±3.91 g, 45.40±4.62 g, 44.00±2.24 g 및 45.00±3.94 g 이었고, 투여종료일(Day 28)의 체중은 각각 1173.20±114.87 g, 1263.80±61.99 g, 1192.80±92.94 g, 1194.20±108.14 g 및 1301.80±99.39 g 이었다. 28일간 각 시험군의 총 증체량은 각각 1129.40±112.64 g/bird, 1219.20±62.06 g/bird, 1147.40±91.88 g/bird, 1150.20±106.51 g/bird 및 1256.80±101.35g/bird 이었으며, 일일증체량은 40.34±4.02 g/bird/day,43.54±2.22 g/bird/day, 40.98±3.28 g/bird/day, 41.08±3.80 g/bird/day 및 44.89±3.62 g/bird/day 이었다. 총 증체량과 일일증체량에 있어 각 시험군간의 유의적인 차이는 없었지만, CYP022군의 증체량이 음성대조군에 비하여 약 11% 증가하였고, 양성대조군의 증체량은 음성대조군 보다 약 8% 증가하였다(표 9, 도 30).
또한, 각 시험군의 주간 증체량을 확인한 결과, 양성대조군 및 CYP022군의 1주차 증체량이 각각 14.09±2.35 g/bird/week 및 14.34±0.87 g/bird/week으로 무처치군(11.11±2.87 g/bird/week)에 비하여 유의하게 높았다. 그러나 2주에서 4주차까지의 주간 증체량에 있어서는 각 시험군간의 유의성은 관찰되지 않았으나, 4주차 주간 증체량에 있어서, 양성대조군과 CYP022군의 4주차 주간 증체량은 음성대조군에 비하여 약 12% 증가하였다(표 9, 도 31).
하기 표 9에 각 시험군의 체중, 주간 증체량 및 일일증체량이 나타나 있다.
2) 사료섭취량 및 사료 전환율(FCR)
각 시험물질을 사료 톤당 1kg씩 혼합하여 28일간 자유급여 하면서 사료섭취량 및 사료효율을 확인하였다.
음성대조군, 양성대조군, CYP002, CYP006 및 CYP022 투여군의 총 사료섭취량은 각각 1876.07 g/bird, 1860.64 g/bird, 1886.69 g/bird, 1871.40 g/bird 및 1866.86 g/bird으로 각 군의 사료섭취량은 유사하였다(표 10).
각 시험군의 생산성 지표를 나타내는 사료 전환율(FCR)은 각각 1.67±0.17, 1.53±0.08, 1.65±0.13, 1.64±0.15 및 1.49±0.12이었으며, 시험군간의 유의성은 나타나지 않았다. 그러나 양성대조군과 CYP022 투여군의 사료 전환율(FCR)은 음성대조군, CYP002 투여군과 CYP006 투여군 보다 낮은 경향을 보였다(표 10). 하기 표 10에 각 시험군의 사료섭취량 및 사료 전환율이 나타나 있다.
3) 혈중 Cortisol 농도
혈중 cortisol 함량에 대한 신규화합물질의 영향을 분석하기 위하여 투여종료일 혈액을 채취하여 혈중 cortisol 농도를 측정 한 결과 음성대조군, 양성대조군, CYP002, CYP006 및 CYP022 투여군의 혈중 cortisol 농도는 각각 4.14±0.58 ng/mL, 3.76±0.64 ng/mL, 3.86±0.40 ng/mL, 3.88±0.54 ng/mL 및 3.58±0.37 ng/mL 이었으며, 각 군간의 유의성은 관찰되지 않았다. 그러나 공시물질을 투여한 모든 시험군의 혈중 cortisol 농도가 음성대조군 보다 낮은 경향을 보였다(표 11, 도 32).
하기 표 11에 각 시험군의 혈중 cortisol 농도가 나타나 있다.
6. 고찰
시프로헵타딘은 1세대 H1 수용체 길항제이면서 비특이적으로 5-HT1A,5-HT2A수용체 길항제로 작용하여 위장관계 질환, 낭포성 섬유증 등 여러 질환에 의해 식욕이 감소 된 사람에서 식욕자극제로 사용되고 있으며, 경구적용 시 빠르게 흡수되어 3~4시간안에 혈중 최고농도에 도달하고 작용지속시간은 6~12시간으로 알려져 있으며, BBB를 쉽게 통과하여 중추신경계에 작용하여 항콜린성, 항세로토닌, 항히스타민, 항도파민 및 진정효과를 나타낸다.
이에 본 발명에서는 시프로헵타딘과 유사한 구조를 가지고 있는 신규화합물의 육계 증체 효과를 확인하기 위하여 본 시험을 수행하였다.
약물 투여 전 음성대조군, 양성대조군, CYP002, CYP006 및 CYP022 투여군의 28일간 총 증체량은 1129.40±112.64 g/bird, 1219.20±62.06 g/bird, 1147.40±91.88 g/bird, 1150.20±106.51 g/bird 및 1256.80±101.35g/bird으로 각 시험군간의 유의적인 차이는 없었지만, CYP022군의 증체량은 음성대조군에 비하여 약 11% 증가하였고, 양성대조군의 증체량은 음성대조군 보다 약 8% 증가하였다. 28일간 각 시험군의 사료섭취량이 유사하였지만, 생산성 지표를 나타내는 사료 전환율(FCR)이 각각 1.67±0.17, 1.53±0.08, 1.65±0.13, 1.64±0.15 및 1.49±0.12으로 양성대조군, CYP022 투여군의 사료 전환율은 음성대조군, CYP002 투여군과 CYP006 투여군 보다 낮은 경향을 보였다.
음성대조군, 양성대조군, CYP002, CYP006 및 CYP022 투여군의 혈중 cortisol 농도는 각각 4.14±0.58 ng/mL, 3.76±0.64 ng/mL, 3.86±0.40 ng/mL, 3.88±0.54 ng/mL 및 3.58±0.37 ng/mL이었으며, 공시물질을 투여한 모든 시험군의 혈중 cortisol 농도가 음성대조군 보다 낮은 경향을 보였다.
결론적으로 CYP022를 사료 톤 당 1kg씩 혼합하여 육계에 매일 급여 시 육계 증체량 개선 등의 효과를 얻을 수 있는 것으로 판단되었다.
<시험예 3> 시프로헵타딘(Cyproheptadine) 유도체의 자돈 증체실험
1. 요약
본 시험은 신규화합물의 양돈 증체 효과를 확인하기 위하여 수행하였다. 신규 합성한 유도체 20여종 중 실험실 내에서 3종을 선별한 후 자돈을 대상으로 실험하였다. 사료첨가제 제형으로 시험제조된 제품으로 사료 톤당 1kg을 4주간 자돈의 사료에 첨가하였다.
선별된 신규화합물 3종(CYP002, CYP006, CYP022) 중 CYP022의 대조군 대비 총종료증체율이 8.7%로 양성대조군인 Cyproheptadine의 4.8% 보다 우수한 증체효과를 나타내었다. 이는 양성대조군인 기존물질보다 우수한 증체효과가 있음을 확인하였다.
2. 목적
본 시험은 신규화합물 3종을 이용한 사료첨가제가 자돈의 증체효과가 있는지 확인하고자 수행하였다.
3. 재료
1) Cyproheptadine (양성대조군)
2) CYP 002 : Cyproheptadine 유도체
3) CYP 006 : Cyproheptadine 유도체
4) CYP 022 : Cyproheptadine 유도체
4. 시험 방법
시험농장의 여건을 고려하여 두번에 걸쳐 실험을 진행하였다.
강원대학교 동물실험윤리위원회의 심의절차를 거쳐 승인을 득한 후 동물실험을 수행하였다(승인번호: KW-180822-1).
1) 시험자돈
- 자돈 종: 이유자돈(약 28일령)
- 분류: 각 10두씩 7군 편성(암70두), 평체 5.0 - 6.0kg 정도의 평균 자돈으로 편성함.
- 사육조건 및 환경: 사육밀도는 초기돈사 (두/0.16 m2), 후기돈사(두/0.31 m2) 였으며, 2주 후 후기돈사로 이동되어 동일한 조건으로 배치되었다. 돈방 온도 셋팅은 28도에서 매주 1도씩 내리고 23도에서 멈추었고, 보온 등은 1-4주차까지 켜주었다(센서가 돈방온도 셋팅과 동일하게 적용되어 ON,OFF 작동됨).
2) 시험군의 구성
시프로헵다딘 제제 사료첨가제의 증체 효과를 확인하기 위하여 시험군은 표 12 및 표 13과 같이 구성하였다. 하기 표 12에 1차 실험(2018년 7월 26일 - 8월 23일)의 시험군 구성이, 하기 표 13에 2차 실험(2018년 8월 30일 - 9월 27일)의 시험군 구성이 나타나 있다.
3) 증체 효과 지표
- 체중 측정: 시프로헵타딘과 유도체 3종의 증체효과를 확인하기 위하여 체중을 측정하였다. 각 시험군별로 시작일과 종료일에 체중을 측정하였다.
- 사료 섭취량 측정: 사료는 1주차는 1+2호로 급여(1:1 비율로 혼합), 2주차는 2호 급여. 3.4주차는 3호사료를 급여하였으며, 매일 공급량과 잔량을 측정하여 사료섭취량을 측정하였다. 사료 요구율은(Feed conversion ratio, FCR)은 총 사료섭취량을 총 증체량으로 나눠 구하였다.
- 시험군별 종료증체율: 시험군별로 종료일 총증체량을 시작일 총체중으로 나눈 비율로 구하였다.
- 대조군대비 종료총증체율: 상기 시험군별 종료총증체율의 항목의 값에서 1차시험과 2차시험의 대조군 시험군별총종료증체율의 차이로 구하였다.
5. 결과
1) 체중 변화
1차 시험(2018년 7월 26일 - 8월 23일) 결과 약물 투여 전 음성대조군, 양성대조군, CYP022 투여군의 시험개시일 총체중은 각각 60.3±0.4kg, 60.3±0.5kg 및 48.5±0.5kg이었고, 투여 종료일(28일차)의 체중은 149.3±1.4kg, 152.2±1.6kg 및 124.3±1.2kg이었다. 대조군, CYP군, CYP022군의 시험군별 종료증체율의 경우 147.6%, 152.4% 및 156.3%이었다. 대조군대비 종료증체율은 양성대조구(CYP)는 4.8%, CYP022구는 8.7%를 나타내었다(표 14). 하기 표 14에 1차 실험(2018년 7월 26일 - 8월 23일) 결과가 나타나 있다.
2차 시험 (2018년 8월 30일 - 9월 27일) 결과 약물 투여 전 대조구, CYP002 및 CYP006 투여군의 시험개시일 총체중은 각각 54.0±0.5kg, 54.0±0.4kg 및 54.1±0.4kg이었고, 투여종료일(28일차)의 체중은 138.8±2.5kg, 144.5±1.9kg 및 137.3±2.0kg이었다. 대조군, CYP002군 및 CYP006군의 시험군별 종료증체율의 경우 157.0%, 167.6% 및 154%이었다. 대조군대비 종료증체율은 CYP002군은 10.6%, CYP006군은 -3.2%를 나타내었다(표 15). 하기 표 15에 2차 실험(2018년 8월 30일 - 9월 27일) 결과가 나타나 있다.
2) 사료섭취량 및 사료 전환율(FCR)
각 시험물질을 사료 톤당 1kg씩 혼합하여 28일간 자유급여 하면서 사료섭취량 및 사료효율을 확인하였다.
1차 시험의 경우 음성대조군, 양성대조군(CYP) 및 CYP022군의 총사료섭취량은 각각 117.0kg, 122.2kg 및 93.8kg이었다(표 16).
2차 시험의 경우 음성대조군, CYP002 및 CYP006 투여군의 총사료섭취량은 각각 110.4kg, 111.9kg 및 103.6kg이었다.
각 시험군의 생산성 지표를 나타내는 사료요구율은 1차시험에서 1.31, 1.33 및 1.33이었으며, 2차시험의 경우 1.30, 1.24 및 1.25로 시험군이 대조구 보다 낮은 경향을 보였다(표 16). 하기 표 16에 각 시험군의 사료섭취량 및 사료 전환율이 나타나 있다.
하기 표 17에 사료섭취량 및 증체량 비교 결과가 나타나 있다.
주차별로 대조구 대비 투여구의 사료섭취량을 비교한 결과 CYP구는 1주차에 15% 증가, CYP022구는 13% 증가하였다. 2주차에는 CYP구는 9% 증가, CYP022구는 0% 증가하였다(표 17). 기존물질인 Cyproheptadine과 CYP022는 1주차에 비슷한 양상을 보였으나 2주차에 들어서는 농장장의 보고내용에서 보듯이 CYP022구에 위축돈이 4두 발생(다른 시험구는 2두 발생)하였다. 결국 제대허니아 및 고관절탈구로 인하여 CYP022구에서 2두를 제외하여 나머지 기간 실험을 종료하였다. 1차 실험이 진행된 기간은 하절기 폭염 등으로 인해 전체적인 실험결과가 2차실험보다는 저조한 결과를 나타내었다.
6. 고찰
시프로헵타딘은 1세대 H1 수용체 길항제이면서 비특이적으로 5-HT1A, 5-HT2A 수용체 길항제로 작용하여 위장관계 질환, 낭포성 섬유증 등 여러 질환에 의해 식욕이 감소 된 사람에서 식욕자극제로 사용되고 있으며, 경구적용 시 빠르게 흡수되어 3~4시간안에 혈중 최고농도에 도달하고 작용지속시간은 6~12시간으로 알려져 있으며, BBB를 쉽게 통과하여 중추신경계에 작용하여 항콜린성, 항세로토닌, 항히스타민, 항도파민 및 진정효과를 나타낸다.
이에 본 발명에서는 시프로헵타딘과 유사한 구조를 가지고 있는 신규유도체의 자돈의 증체 효과를 확인하기 위하여 본 시험을 수행하였다.
실험농장의 여건상 2차로 나누어 실험을 실시하였다. 1차 실험 기간(2018년 7월 26일부터 8월 23일) 무더위로 인해 실험실 내 실험의 기대효과보다 CYP022의 증체효과가 저조했으나 결과적으로는 기존화합물인 Cyproheptadine 보다 우수한 증체효과가 있음을 확인하였다. 또한 사료섭취량도 대조구 대비 1주차에서는 CYP구, CYP022구는 각 각 15%, 13% 증가하였다.
결론적으로 CYP022를 사료 톤 당 1kg씩 혼합하여 자돈에 매일 급여 시 자돈의 증체량 개선 등의 효과를 얻을 수 있는 것으로 확인되었다.
Claims (13)
- 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
<화학식 1>
상기 식에서, X는 R1, COR3, 또는 COR4이고,
R1은 C3 ~ C9 알키닐 또는 디옥솔라닐알킬이고,
R3는 시클로알케닐, 알킬아세틸, 디하이드록시페닐, 페닐케토닐, 또는 페닐알키닐이고,
R4는 톨릴 또는 벤질이다. - 제1항에 있어서, 상기 R1이 프로피닐 또는 디옥솔라닐메틸인 것을 특징으로 하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 R3가 시클로헥세닐, 에틸아세틸, 디하이드록시페닐, 메틸페닐케토닐, 또는 페닐에티닐인 것을 특징으로 하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
- 제1항에 있어서, 상기 R4가 톨릴 또는 벤질인 것을 특징으로 하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
- 제1항에 있어서, 상기 화합물이
(7) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)-1-(프로프-2-아인-1-일)피페리딘
(11) 1-((1,3-디옥솔란-2-일)메틸)-4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘
(14) (4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)(시클로헥스-1-엔-1-일)메탄온
(15) 에틸 3-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)-3-옥소프로파노에이트
(16) (4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)(3,5-디하이드록시페닐)메탄온
(17) 1-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)-2-페닐에탄-1,2-디온
(18) (4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)(p-톨릴)메타논
(19) 1-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리닐-1-일)-2-페닐에탄-1-온
(20) 1-(4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘-1-일)-3-페닐프로프-2-아인-1-온
으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염. - (a) 시프로헵타딘에서 메틸기를 제거하여 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘을 합성하는 단계; 및
(b) 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 R1-Br, R3-COOH 및 R4-COCl로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종을 반응시키는 단계(이 때, R1은 C3 ~ C9 알키닐, 또는 디옥솔라닐알킬이고; R3는 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬아세틸, 디하이드록시페닐, 페닐케토닐, 또는 페닐알키닐이고; R4는 톨릴 또는 벤질이다)를 포함하는, 제1항의 화합물의 제조방법. - 제7항에 있어서, 단계(b)에서 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 R1-Br을 반응시키는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
- 삭제
- 제7항에 있어서, 단계(b)에서 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 R3-COOH을 반응시키는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
- 제7항에 있어서, 단계(b)에서 4-(5H-디벤조[a,d][7]아눌렌-5-일리덴)피페리딘과 R4-COCl을 반응시키는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
- 제1항, 제2항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물을 유효성분으로 포함하는 포유동물의 식욕 촉진용 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 식욕 촉진용 조성물이 동물 의약품 또는 사료 첨가제인 것을 특징으로 하는 포유동물의 식욕 촉진용 조성물.
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