KR102209249B1 - 발효 산양삼 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 발효 산양삼 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 발효 산양삼은 진세노사이드의 함량이 증진될 뿐만 아니라, L-카르니틴이 생성되어 항산화, 항염증 및 항당뇨 활성을 나타냄으로써, 상기 발효 산양삼은 항산화, 항염증 및 항당뇨의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

발효 산양삼 제조방법{MANUFACTURING METHOD OF WOOD-CULTIVATED GINSENG}
본 발명은 발효 산양삼 제조방법에 관한 것이다.
산양삼(wood-cultivated ginseng)은 인삼의 씨를 산에 뿌려 야생상태로 재배한 것으로, 장뇌삼, 장뇌산삼 또는 산양산삼이라고 부른다. 장뇌라는 이름은 삼의 줄기와 뿌리를 잇는 뇌부분이 길기 때문에 붙여진 이름이나, 일반인은 이를 구분하기 어렵다. 야생에 뿌려진 인삼의 종자는 7년 이상 같은 자리에서 자연 상태로 재배되기 때문에 생육속도가 느리다. 산양삼의 재배지로서는 여름 기온이 20 내지 25℃, 80 내지 90%가 20년 이상된 나무로 우거진 음지, 유기질이 풍부하고 배수가 좋은 약산성 사질양토, 및 동향, 북향 또는 서북향 산능선이 아닌 곳을 확보해야 하므로 생육 조건이 까다롭다.
일반적으로 인삼은 인공적으로 만들어진 밭에서 비가림 시설을 설치하여 재배하고, 재배기간에 따라서 4, 5 및 6년근으로 구분한다. 재배시에 수량을 증대시시키 위해 적당한 비료와 퇴비, 농약 등을 사용하여 크고 굵다. 반면에, 산양삼은 산 속에 재배지를 두고 7 내지 11년 가량 재배하여 수확할 수 있고, 11년 이상 재배한 것은 야생삼 또는 산삼으로 구분된다. 삼은 생육년수에 따라 인삼 사포닌의 종류와 생체조직 구성성분이 달라진다고 알려져 있다.
삼에 포함된 사포닌을 진세노사이드(ginsenoside)라고 하는데, 이는 동양의학에서 강심제, 이뇨제로 사용되었다. 뿐만 아니라, 삼에는 폴리아세틸렌(polyacetylene), 산성 다당체, 인삼 단백질, 페놀성 물질 등의 성분이 포함되어 있어, 항당뇨, 항암, 항산화, 동맥경화 및 고혈압의 예방, 간기능 촉진, 숙취해소, 항피로, 항스트레스, 항노화, 두뇌활동 촉진, 항염증 등과 같은 다양한 약리학적 활성이 확인되었다.
이에, 최근에는 삼에 포함된 약리학적 활성 성분을 미생물이 분비하는 효소 등의 생촉매 기능을 활용한 생물전환반응(bioconversion)을 이용하여 인체에 흡수가 용이하도록 하거나, 특정 성분을 강화시킴으로써 신소재로서의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1832387호는 락토바실러스 플란타륨 균주를 이용하여 Rd, Rg3, Rh1, Rh2 및 컴파운드 K(compound K)의 함량이 증진된 산양삼 발효물을 제조하는 방법을 개시하고 있다.
대한민국 등록특허 제10-1832387호
본 발명의 목적은 라이조푸스 올리고스포루스(Rhizopus oligosporus) 균주를 이용하여 발효 산양삼을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 발효 산양삼을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 라이조푸스 올리고스포루스 균주를 이용하여 발효 산양삼에서 L-카르니틴을 생성하거나, 진세노사이드 함량을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라이조푸스 올리고스포루스 균주를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 발효 산양삼 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 발효 산양삼을 제공한다.
또한, 본 발명은 라이조푸스 올리고스포루스 균주를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 발효 산양삼에서의 L-카르니틴 생성방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 라이조푸스 올리고스포루스 균주를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 발효 산양삼에서의 진세노사이드 함량 증진방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 발효 산양삼은 진세노사이드의 함량이 증진될 뿐만 아니라, L-카르니틴이 생성되어 항산화, 항염증 및 항당뇨 활성을 나타냄으로써, 상기 발효 산양삼은 항산화, 항염증 및 항당뇨의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 액체발효 발효 산양삼 시료에 포함된 L-카르니틴 함량을 확인한 결과 그래프이다.
도 2는 대조군인 L-카르니틴을 UPLC 분석한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 고체발효 산양삼의 항염증 활성을 확인한 결과 그래프이다(G1: 일반 산양삼, G2: 멸균된 산양삼, G3: 1일차 고체발효 산양삼, G4: 3일차 고체발효 산양삼, G5: 5일차 고체발효 산양삼, G6: 7일차 고체발효 산양삼, G7: 10일차 고체발효 산양삼, G8: 14일차 고체발효 산양삼).
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 고체발효 산양삼의 인슐린 분해효소 저해 활성을 확인한 결과 그래프이다(G1: 일반 산양삼, G2: 멸균된 산양삼, G3: 1일차 고체발효 산양삼, G4: 3일차 고체발효 산양삼, G5: 5일차 고체발효 산양삼, G6: 7일차 고체발효 산양삼, G7: 10일차 고체발효 산양삼, G8: 14일차 고체발효 산양삼).
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 고체발효 산양삼의 인슐린 분해효소를 저해하는 IC50 값을 나타낸 그래프이다(G1: 일반 산양삼, G2: 멸균된 산양삼, G3: 1일차 고체발효 산양삼, G4: 3일차 고체발효 산양삼, G5: 5일차 고체발효 산양삼, G6: 7일차 고체발효 산양삼, G7: 10일차 고체발효 산양삼, G8: 14일차 고체발효 산양삼).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 라이조푸스 올리고스포루스 균주를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 발효 산양삼 제조방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "라이조푸스 올리고스포루스(Rhizopus oligosporus)" 균주는 인체에 유해한 독소를 생산하지 않는 것이 규명된 안전한 곰팡이로서, 주로 종균 배양에 사용되는 균주이다. 상기 라이조푸스 올리고스포루스 균주는 통상의 기술분야에 라이조푸스 올리고스포루스 균주라고 알려진 것이면 모두 사용가능하다. 구체적으로, 상기 라이조푸스 올리고스포루스 균주는 기탁번호 KCCM11948P로 수탁된 라이조푸스 올리고스포루스 DK1 균주일 수 있다.
상기 라이조푸스 올리고스포루스 균주는 통상의 기술자에 의해 적절한 양으로 접종될 수 있다. 구체적으로, 상기 라이조푸스 올리고스포러스 균주는 배양액 1 ㎖ 당 1.0×104 내지 1.0×108 포자수, 5.0×104 내지 1.0×108 포자수, 1.0×105 내지 1.0×108 포자수, 1.0×104 내지 5.0×107 포자수, 5.0×104 내지 5.0×107 포자수, 1.0×105 내지 5.0×107 포자수, 1.0×104 내지 1.0×107 포자수, 5.0×104 내지 1.0×107 포자수, 1.0×105 내지 1.0×107 포자수로 접종될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어, "산양삼(wood-cultivated ginseng)"은 인삼의 씨를 산에 뿌려 야생상태로 재배한 삼을 의미하는 것으로, 장뇌삼, 장뇌산삼 또는 산양산삼이라고도 불린다. 인삼에는 진세노사이드, 알칼로이드(alkaloid), 폴리아세틸렌(polyacetylen), 페놀화합물(phenolic compound) 등을 함유하고 있으며, 이와 같은 성분에 의해 항노화, 항산화, 항암, 항염증, 항당뇨, 항스트레스 등을 포함하는 다양한 생리활성을 나타낸다.
본 발명에 따른 발효 산양삼 제조방법에서, 상기 발효는 고체발효, 액체발효 또는 이의 혼합으로 수행될 수 있다. 이때, 발효 온도 및 기간은 통상의 기술자에 의해 적절히 선택되어 수행될 수 있다. 구체적으로, 발효는 23 내지 40℃, 23 내지 37℃, 23 내지 33℃, 25 내지 40℃, 25 내지 37℃, 25 내지 33℃, 28 내지 40℃, 28 내지 37℃ 또는 28 내지 33℃의 온도로 0.5 내지 25일, 0.5 내지 20일, 0.5 내지 16일, 1 내지 25일, 1 내지 20일 또는 1 내지 16일 동안 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 발효 산양삼은 L-카르니틴이 생성되고, 진세노사이드 함량이 증가될 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 발효 산양삼은 발효되지 않은 산양삼에는 포함되지 않는 성분인 L-카르니틴이 생성됨으로써, L-카르니틴에 의한 약리활성을 나타낼 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 발효 산양삼은 발효되지 않은 산양삼에 비해 진세노사이드의 함량이 증진됨으로써, 그에 따른 약리활성 증진 또는 변화를 나타낼 수 있다. 상기 진세노사이드는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2, Ro, 컴파운드 K(compound K), R1, F1 및 F2로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 발효 산양삼을 제공한다.
상기 발효 산양삼은 상술한 바와 같은 방법으로 제조될 수 있다. 일례로, 상기 발효 산양삼은 라이조푸스 올리고스포루스 균주를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. 상기 라이조푸스 올리고스포루스 균주는 기탁번호 KCCM11948P로 수탁된 라이조푸스 올리고스포루스 DK1 균주일 수 있다. 또한, 상기 라이조푸스 올리고스포루스 균주는 통상의 기술자에 의해 적절한 양으로 접종되어 발효될 수 있다.
한편, 상기 방법에서, 상기 발효는 고체발효, 액체발효 또는 이의 혼합으로 수행될 수 있고, 발효 온도 및 시간은 통상의 기술자에 의해 적절히 선택되어 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 발효 산양삼은 L-카르니틴이 생성되고, 진세노사이드 함량이 증가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 라이조푸스 올리고스포루스 균주를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 발효 산양삼에서의 L-카르니틴 생성방법을 제공한다.
본 발명에 따른 L-카르니틴 생성방법은 상술한 바와 같은 발효 산양삼 제조방법과 동일한 기술적 특징을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 라이조푸스 올리고스포루스 균주는 기탁번호 KCCM11948P로 수탁된 라이조푸스 올리고스포루스 DK1 균주일 수 있다. 또한, 상기 라이조푸스 올리고스포루스 균주는 통상의 기술자에 의해 적절한 양으로 접종되어 발효될 수 있다. 또한, 상기 발효는 고체발효, 액체발효 또는 이의 혼합으로 수행될 수 있고, 발효 온도 및 시간은 통상의 기술자에 의해 적절히 선택되어 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 발효 산양삼은 발효되지 않은 산양삼에는 포함되지 않는 성분인 L-카르니틴이 생성됨으로써, L-카르니틴에 의한 약리활성을 나타낼 수 있다.
나아가, 본 발명은 라이조푸스 올리고스포루스 균주를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 발효 산양삼에서의 진세노사이드 함량 증진방법을 제공한다.
본 발명에 따른 진세노사이드 함량 증진방법은 상술한 바와 같은 발효 산양삼 제조방법과 동일한 기술적 특징을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 라이조푸스 올리고스포루스 균주는 기탁번호 KCCM11948P로 수탁된 라이조푸스 올리고스포루스 DK1 균주일 수 있다. 또한, 상기 라이조푸스 올리고스포루스 균주는 통상의 기술자에 의해 적절한 양으로 접종되어 발효될 수 있다. 또한, 상기 발효는 고체발효, 액체발효 또는 이의 혼합으로 수행될 수 있고, 발효 온도 및 시간은 통상의 기술자에 의해 적절히 선택되어 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 발효 산양삼은 발효되지 않은 산양삼에 비해 진세노사이드의 함량이 증진됨으로써, 그에 따른 약리활성 증진 또는 변화를 나타낼 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. 액체발효를 이용한 발효 산양삼의 제조
액체발효를 이용하여 발효 산양삼을 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
산양삼(강원도 평창군)을 흐르는 물에 가볍게 수세하고, 12시간 동안 초저온냉동고에서 동결하였다. 동결된 산양삼을 3일 동안 동결 건조기를 이용하여 건조시키고, 이를 믹서기로 분말화하였다. 제조된 산양삼 분말을 삼각 플라스크에 증류수와 함께 1:100(w/v)의 비율로 혼합하고, 121℃에서 15분 동안 멸균하여 산양삼 멸균액을 제조하였다. 제조된 산양삼 멸균액에 3.0×106/㎖의 포자 수를 갖는 리조푸스 올리고스포러스 DK1(Rhyzopus oligosporus, KCCM11948P) 균을 산양삼 멸균액 대비 1%(v/v)의 양으로 접종하였다. 접종 후, 삼각 플라스크의 입구를 면전으로 막고 30℃ 배양기에서 3 또는 7일 동안 발효시켜 발효 산양삼을 수득하였다.
실시예 2. 고체발효를 이용한 발효 산양삼의 제조
고체발효를 이용하여 발효 산양삼을 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
먼저, 산양삼은 실시예 1에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법을 이용하여 분말화하고, 수득된 산양삼 분말을 121℃에서 15분 동안 멸균한 뒤, 상온에서 식혔다. 멸균된 산양삼 분말에 8.0×105/㎖의 포자 수를 갖는 리조푸스 올리고스포러스 균을 산양삼 분말의 건조중량 대비 200%(v/w)의 양으로 접종하고, 용기 표면을 랩으로 밀봉하여 30℃ 배양기에서 1, 3, 5, 7, 10 또는 14일 동안 발효시켰다. 발효된 산양삼을 다시 동결건조하여 분말의 형태로 준비하였다.
실험예 1. 발효 산양삼의 진세노사이드 함량 분석
상기에서 수득된 액체 또는 고체 발효된 발효 산양삼에 포함된 진세노사이드의 함량을 UPLC(ultra performance liquid chromatograph) 방법으로 분석하였다.
1-1. 액체발효된 발효 산양삼 시료의 준비
실시예 1의 액체발효된 발효 산양삼(3 또는 7일 배양)을 50 ㎖의 튜브에 넣고, 7,220×g의 속도로 10분 동안 원심분리한 뒤, 그 상등액을 0.2 ㎛의 공극크기를 갖는 멤브레인 실린지 필터(membrane syringe filter, ANOW, 중국)를 이용하여 여과하여 준비하였다.
1-2. 고체발효된 발효 산양삼 시료의 준비
1.5 g의 실시예 2에 따른 고체발효된 발효 산양삼 가루(1, 3, 5, 7, 10 또는 14일 배양)를 30 ㎖의 60% 에탄올에 넣고, 200 rpm, 40℃의 조건하에서 1시간 동안 진탕배양하여 발효 산양삼 에탄올 추출액을 수득하였다. 수득된 발효 산양삼 에탄올 추출액을 7,220×g의 속도로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리를 3회 반복하여 수득된 추출액을 와트만 No.1 여과지(Whatman, 미국)를 이용하여 여과하고, 농축 및 동결건조하여 에탄올 추출액의 가루를 얻었다. 500 ㎎의 에탄올 추출액의 가루를 5 ㎖의 100% 메탄올에 녹이고, 이를 0.2 ㎛의 공극크기를 갖는 GHP 멤브레인 실린지 필터(Pall, 미국)를 이용하여 다시 여과하여 준비하였다.
1-3. LC 분석
실험예 1-1 및 1-2에서 준비된 액체발효된 발효 산양삼 시료 및 고체발효된 발효 산양삼 시료를 이용하여 UPLC를 수행함으로써, 발효 산양삼 내에 포함된 진세노사이드의 함량을 확인하였다. 이때, 대조군으로서 발효시키지 않은 일반 산양삼을 사용하였다. 분석은 1 ㎕의 발효 산양삼 시료를 UPLC의 시스템에 주입하여 수행되었고, 이때 분석 조건 하기 표 1에, 이동상은 표 2에 나타낸 바와 같다.
조건
시스템 워터스 H-클래스(Waters H-class)
검출기 QDa 검출기(detector)
컬럼 애쿼티(acquity) HPLC BEH C18 컬럼(1.7 ㎛, 2.1×100 ㎜)
유량 0.3 ㎖/분
용매 A: 3차 증류수(0.1% 포름산)
B: 아세토니트릴(0.1% 포름산)
MS(mass spectrometry)
조건		 진세노사이드 Rb1: ESI+, 1132 m/z, CE: 1.5 ㎸, CV: 10 V
진세노사이드 Rb2: ESI+, 1101.6 m/z, CE: 1.5 ㎸, CV: 15 V
진세노사이드 Rb3: ESI+, 1101.6 m/z, CE: 1.5 ㎸, CV: 15 V
진세노사이드 Rc: ESI+, 1101.6 m/z, CE: 1.5 ㎸, CV: 35 V
진세노사이드 Rd: ESI+, 969.7 m/z, CE: 1.5 ㎸, CV: 20 V
진세노사이드 Re: ESI-, 945.6 m/z, CE: 0.8 ㎸, CV: 45 V
진세노사이드 Rf: ESI+, 823.6 m/z, CE: 1.5 ㎸, CV: 10 V
진세노사이드 Rg1: ESI+, 823.6 m/z, CE: 1.5 ㎸, CV: 25 V
진세노사이드 Rg2: ESI-, 783.6 m/z, CE: 0.8 ㎸, CV: 25 V
진세노사이드 Rg3: ESI-, 807.6 m/z, CE: 0.8 ㎸, CV: 50 V
진세노사이드 Rh1: ESI-, 638.5 m/z, CE: 0.8 ㎸, CV: 20 V
진세노사이드 Rh2: ESI-, 667.5 m/z, CE: 0.8 ㎸, CV: 15 V
진세노사이드 Ro: ESI-, 955.5 m/z, CE: 0.8 ㎸, CV: 30 V
진세노사이드 컴파운드 K: ESI+, 645.5 m/z, CE: 0.8 ㎸, CV: 45 V
진세노사이드 R1: ESI-, 931.7 m/z, CE: 0.8 ㎸, CV: 45 V
진세노사이드 F1: ESI+, 661.6 m/z, CE: 0.8 ㎸, CV: 25 V
진세노사이드 F2: ESI+, 829.7 m/z, CE: 0.8 ㎸, CV: 10 V
시간(분) 용매 A(%) 용매 B(%)
0-0.5 95 5
0.5-1 90 10
1-2 90 10
2.1-4 85 15
4-10 77 23
10-12 50 50
12-15 40 60
15-16 0 100
16.1-20 95 5
그 결과, 액체발효된 발효 산양삼 시료의 진세노사이드 함량을 하기 표 3에, 고체발효된 발효 산양삼 시료의 진세노사이드 함량을 하기 표 4에 나타내었다.
총 진세노사이드
(g/㎏)		 진세노사이드 Rd
(g/㎏)		 진세노사이드 Rg3
(g/㎏)
일반 산양삼 20.78±0.94 1.67±0.19 0.69±0.03
액체발효 산양삼(3일) 21.08±0.23 2.11±0.09 0.64±0.03
액체발효 산양삼(7일) 24.96±0.40 6.06±0.20 0.95±0.01
총 진세노사이드(g/㎏)
일반 산양삼 85.77±8.10
고체발효 산양삼(1일) 123.77±6.14
고체발효 산양삼(3일) 93.81±5.66
고체발효 산양삼(5일) 111.23±4.90
고체발효 산양삼(7일) 121.71±5.86
고체발효 산양삼(10일) 110.63±4.79
고체발효 산양삼(14일) 141.01±5.75
표 3에 나타난 바와 같이, 액체발효된 발효 산양삼이, 발효 3일차에는 일반 산양삼과 비슷한 총 진세노사이드 함량을 보였으나, 발효 7일차에는 총 24.96 g/㎏의 진세노사이드를 포함하여 총 진세노사이드의 함량이 증가하였다. 특히, 진세노사이드 Rd는 일반 산양삼에 비해 발효 7일차 액체발효 산양삼에서 3.6배 증가하였다. 또한, 진세노사이드 Rg3는 일반 산양삼에 비해 발효 7일차 액체발효 산양삼에서 1.4배 증가하였다.
한편, 표 4에 나타난 바와 같이, 고체발효된 발효 산양삼의 총 진세노사이드의 함량은 발효 기간에 비례하여 증가하였다. 특히, 일반 산양삼에 비해 액체발효 산양삼(14일)에서 1.6배 증가하였다.
따라서, 상기로부터 리조푸스 올리고스포러스 DK1 균주에 의한 액체발효 및 고체발효에 의해, 발효 산양삼 내의 진세노사이드 함량이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.
실험예 2. 발효 산양삼의 L-카르니틴 함량 분석
상기에서 수득된 액체 또는 고체 발효된 발효 산양삼에 포함된 L-카르니틴의 함량을 UPLC 방법으로 분석하였다. 먼저, 실시예 1의 액체발효된 발효 산양삼(3 또는 7일 배양)과 실시예 2에 따른 고체발효된 발효 산양삼 가루(1, 3, 5, 7, 10 또는 14일 배양)는 실험예 1-1 및 1-2와 동일한 방법 및 조건으로 준비하였다. 이때, 대조군으로서 발효시키지 않은 일반 산양삼을 사용하였다. 한편, 분석은 1 ㎕의 발효 산양삼 시료를 UPLC의 시스템에 주입하여 수행되었고, 이때 분석 조건 하기 표 5에, 이동상은 표 6에 나타낸 바와 같다.
조건
시스템 워터스 H-클래스
검출기 QDa 검출기
컬럼 애쿼티 HPLC BEH HILIC 컬럼(1.7 ㎛, 2.1×100 ㎜)
유량 0.4 ㎖/분
용매 A: 3차 증류수(15 mM 포름산암모늄 및 0.1% 포름산)
B: 아세토니트릴(0.1% 포름산)
MS(mass spectrometry)
조건		 ESI+(with SIR(selective ion recording), 162 m/z, CE: 1.5 ㎸, CV: 10 V
시간(분) 용매 A(%) 용매 B(%)
0-3 10 90
3.1-5 10-30 90-70
5.1-6 30-60 70-40
6.1-10 10 90
그 결과, 액체발효된 발효 산양삼 시료의 L-카르니틴 함량을 도 1에, 고체발효된 발효 산양삼 시료의 진세노사이드 함량을 하기 표 7에 나타내었다.
L-카르니틴(g/㎏)
일반 산양삼 ND
고체발효 산양삼(1일) 5.74±0.27
고체발효 산양삼(3일) 22.91±0.22
고체발효 산양삼(5일) 31.41±0.20
고체발효 산양삼(7일) 43.74±0.44
고체발효 산양삼(10일) 49.98±0.45
고체발효 산양삼(14일) 62.83±0.47
ND: not detected
도 1에 나타난 바와 같이, L-카르니틴은 일반 산양삼에서는 검출되지 않았으나, 액체발효된 발효 산양삼의 발효 기간에 비례하여 그 양이 증가하였다.
한편, 표 7에 나타난 바와 같이, 고체발효된 발효 산양삼에서도 L-카르니틴이 발효 기간에 비례하여 그 양이 증가하였고, 이는 일반 산양삼에서 검출되지 않았다. 구체적으로, 발효 1일차의 고체발효 산양삼에 비해 발효 14일차의 고체발효 산양삼에서 L-카르니틴의 양이 약 11배 증가하였다.
따라서, 상기로부터 리조푸스 올리고스포러스 DK1 균주에 의한 액체발효 및 고체발효에 의해, 발효 산양삼 내에 L-카르니틴이 생성되었고, 그 양은 발효 기간에 비례하여 증가함을 알 수 있었다.
실험예 3. 발효 산양삼의 항산화 활성 확인
상기 제조된 고체발효 산양삼의 항산화 활성을 라디칼 스캐빈저(radical scavenger) 방법을 이용하여 다음과 같이 확인하였다. 먼저, 실시예 2에서 제조된 고체발효 산양삼으로부터 실험예 1-2에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 에탄올 추출액의 가루를 얻었다. 상기 에탄올 추출액의 가루를 100% 메탄올에 녹이고, 0.2 ㎛ GHP 멤브레인 실린지 필터(Pall, 미국)를 이용하여 여과하였다. 95웰 플레이트에 40 ㎕의 여과된 여과액과 100 μM의 DPPH 시약을 첨가하고 빛이 차단된 상태로 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 상기 96웰 플레이트를 마이크로플레이트 리더기(Molecular Device, Syunnyvale, 미국)를 이용하여 517 ㎚의 파장하에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 표준물로는 트로록스(trolox)를 이용하여 측정된 결과를 정량하였다. 그 결과, 고체발효 산양삼의 항산화 활성(TE: trolox equivalent)을 하기 표 8에 나타내었다.
항산화 활성(g TE/㎏)
일반 산양삼 1.78±0.20
고체발효 산양삼(1일) 6.35±0.22
고체발효 산양삼(3일) 4.71±0.13
고체발효 산양삼(5일) 4.63±0.23
고체발효 산양삼(7일) 6.11±0.18
고체발효 산양삼(10일) 5.07±0.21
고체발효 산양삼(14일) 5.78±0.33
상기 표 8에 나타난 바와 같이, 고체발효 산양삼은 발효 기간에 비의존적으로 모두 높은 항산화 활성을 나타내었고, 특히 발효 1일차의 고체발효 산양삼이 일반 산양삼에 비해 3.5배 증가한 항산화 활성을 보였다.
실험예 4. 발효 산양삼의 항염증 활성 확인
상기 제조된 고체발효 산양삼의 항염증 활성을 Raw264.7 세포주를 사용하여 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, Raw264.7 세포주는 10%의 FBS(fetal bovine serum), 100 U/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배양 배지를 이용하여, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하여 준비하였다. 한편, 실시예 2에서 제조된 고체발효 산양삼으로부터 실험예 1-2에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 에탄올 추출액의 가루를 얻었다. 상기 에탄올 추출액의 가루를 100% 메탄올에 녹이고, 0.2 ㎛ GHP 멤브레인 실린지 필터(Pall, 미국)로 여과하여 여과액을 얻었다. 준비된 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 2×105 cells/well이 되도록 분주하고 상기와 동일한 조건으로 배양하였다. 24시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 상기 고체발효 여과액을 0.005, 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.15 또는 0.2 ㎍/㎖의 농도로 처리함과 동시에 1 ㎍/㎖의 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 24시간을 더 배양하였다. 배양이 끝난 후, 80 ㎕의 세포 배양액에 80 ㎕의 그리스 시약(griess reagent)을 혼합하고 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 96웰을 540 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 산화질소(NO)의 생성을 확인하였다. 이때, 대조군으로서는 일반 산양삼과 멸균된 산양삼 시료를, 양성 대조군으로서 100 mM의 인도메타신(indomethacin)을 사용하였다. 한편, 표준물질로서는 아질산 나트륨(sodium nitrite)을 사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 일반적으로 발효 산양삼의 처리 농도에 의존적으로 NO 생성이 억제되었다. 한편, 발효 산양삼의 발효 기간과 NO 생성 억제는 밀접한 상관관계가 확인되지 않았으며, 0.1 ㎍/㎖의 고체발효 산양삼을 처리한 경우에는 1일차 발효 산양삼이 일반 산양삼에 비해 약 3배 높은 항염증 활성을 나타낸 반면, 0.02 ㎍/㎖의 고체발효 산양삼을 처리한 경우에는 1일차 발효 산양삼이 일반 산양삼에 비해 약 1.3배 높은 항염증 활성을 나타내었다.
상기 결과로부터 발효 산양삼은 항염증 활성이 있음을 알 수 있었다.
실험예 5. 발효 산양삼의 인슐린 분해효소 저해 활성 확인
상기 제조된 고체발효 산양삼의 인슐린 분해효소 저해 활성을 CHO 세포주를 사용하여 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, CHO 세포주를 이용하여 통상적인 방법으로 인슐린 분해효소를 생산하고, 실시예 2에서 제조된 고체발효 산양삼은 실험예 4에 기재된 방법 및 조건으로 준비하였다. 이후, 고체발효 산양삼, 100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 10 μM의 ZnCl2 및 15 ㎕의 인슐린 분해효소를 혼합한 혼합물에 최종 농도가 26.4 μM이 되도록 기질인(Mca-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys(Dnp)-OH 트리플루오로아세테이트 솔트(trifluoroacetate salt))를 첨가하였다. 이때, 고체발효 산양삼은 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5 또는 5.0 ㎍/㎖의 농도로 첨가되었으며, 대조군으로서는 일반 산양삼과 멸균된 산양삼 시료를 사용하였다. 상기 혼합물을 이용하여 320 내지 405 ㎚의 파장에서 형광도를 측정하여 인슐린 분해효소 저해 활성을 특정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 고체발효 산양삼은 그 처리 농도 및 발효 기간에 의존적으로 인슐린 분해효소 저해 활성을 나타내었다. 또한, 이들 고체발효 산양삼의 인슐린 분해효소 저해 활성을 나타내는 IC50 농도를 정하여 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 특히 발효 10일차 이후의 고체발효 산양삼이 0.4 ㎎/㎖ 이하의 IC50 값을 나타냄으로써 우수한 인슐린 분해효소 저해 활성을 나타내었다.

Claims (9)

  1. 기탁번호 KCCM11948P로 수탁된 라이조푸스 올리고스포루스(Rhizopus oligosporus) DK1 균주를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 발효 산양삼 제조방법으로서,
    상기 발효 산양삼은 L-카르니틴이 생성되고, 진세노사이드 함량이 증진된 발효 산양삼 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 발효는 고체발효, 액체발효 또는 이의 혼합인, 발효 산양삼 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 발효는 0.5 내지 25일 동안 수행되는, 발효 산양삼 제조방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 따른 제조방법으로 제조된 발효 산양삼.
  8. 기탁번호 KCCM11948P로 수탁된 라이조푸스 올리고스포루스 DK1 균주를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 발효 산양삼에서의 L-카르니틴 생성방법.
  9. 기탁번호 KCCM11948P로 수탁된 라이조푸스 올리고스포루스 DK1 균주를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 발효 산양삼에서의 진세노사이드 함량 증진방법.
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