KR102207858B1

KR102207858B1 - 유해 임신 결과를 예측하기 위한 박테리아 분류군의 검출

Info

Publication number: KR102207858B1
Application number: KR1020207002520A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 시우-청 침; 치-인 청; 완-치 청; 멍 멍; 탁-영 렁; 근영 이
Original assignee: 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2015-06-23
Publication date: 2021-01-26
Also published as: JP6539721B2; EP3161167A1; KR20170020382A; WO2016000539A1; EP3161167B1; JP2017519514A; JP2019068853A; EP3161167A4; KR20200011617A; US20170114396A1; ES2767527T3; US10683557B2

Abstract

본 발명은 하나 이상의 선택된 박테리아 분류군 (예를 들어, 속 또는 종)으로부터 박테리아의 향상된 수준을 검출함으로써, 임신한 피험체에 대해서 유해 임신 또는 신생아 결과의 위험을 예측하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 유용한 키트가 또한 제공된다. 또한, 본 발명은 차별적으로 풍부한 박테리아 분류군에 기반하여 진행성 자궁경부 확장 및/또는 조기 자궁경부 단축을 가질 위험을 결정하는 방법을 제공한다.

Description

유해 임신 결과를 예측하기 위한 박테리아 분류군의 검출{DETECTING BACTERIAL TAXA FOR PREDICTING ADVERSE PREGNANCY OUTCOMES}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2014년 6월 30일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/018,920호에 대한 우선권을 주장하며, 이 가출원의 전체 내용은 모든 목적을 위해 참조로 본원에 포함된다.

정상의 합병증을 수반하지 않은 임신에서, 자궁경부 (cervix)는 만기 제3 석달 (third trimester)까지 길고 닫혀 있다가, 태아가 완전히 성장하고, 출산할 준비가 되면 상기 자궁경부가 결국 짧아지고, 확장될 것이다. 대조적으로, 자궁경부의 단축 (cervical shortening) 또는 진행성 자궁경부 확장 (advanced cervical dilation)에 의한 합병증이 있는 임신에서, 상기 자궁경부가 상기 정상 스케줄에 앞서서 각각 단축되거나 또는 확장이 진행된다. 따라서, 이러한 상태를 가진 여성은 임신 37주차 보다 더 빨리 출산을 하게 되어, 태아의 성장이 불완전할 수 있다. 그러므로, 이는 신생아 사망 (mortality) 및 이환 (morbidity)에 이를 수 있다. 이러한 임신을 연장하기 위해서, 임상의는 원형결찰 (cerclage) 또는 자궁경부 페서리 (cervical pessary)를 사용하여, 상기 자궁경부를 유지시킬 수 있다. 무엇보다도 먼저 합의와 전문적 의견에 기반하여, 양막내 감염 (intra-amniotic infection)이 배제되는 경우, 원형결찰 장착이 유익할 수 있다고 추천된다. 유사한 가이드라인이 페서리 장착에도 제시된다. 효과적으로 감염원을 배제하기 위해서, 고감도 검출 방법이 요구된다.

현재, 시료 중 박테리아 검출 방법은 배양, 현미경검사 및 박테리아종-특이적 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 분석에 의지하며, 낮음 (low)에서 중간 (moderate)의 감수성 (sensitivity)만을 제공한다. 이러한 감수성은, 본 발명자들이 상기 비정상 (즉, 단축/확장) 자궁경부에서 차별적으로 풍부하지만, "정상" 자궁경부에 있는 "정상" 세균총 (flora)의 일부는 아닌 박테리아 분류군 (bacterial taxa)을 특별히 표적으로 할 수 있다면 향상될 수 있다. 그러나, 지금까지 상기 분류군에 대한 한정된 데이터가 있었으며, 이는 상기 비정상 자궁경부에서 박테리아 분류군이 체계적으로 프로파일되지 않았고, 적당하게-매칭된 여성으로부터 "정상" 자궁경부에서의 것과 비교되지 않았기 때문이다. 조기 출산 (premature birth)의 유병률 (prevalence) 및 영향 (implication)을 고려하여, 여성에서 유해 임신 결과의 증가된 위험을 더 정확하게 검출하기 위한 신규한 방법의 필요성이 존재하며, 조기 출산 또는 신생아 합병증의 기회를 감소시키거나 또는 제거하기 위한 예방적 조치를 조속히 취할 수 있다. 본 발명은 상기 및 다른 관련 요구들을 충족한다.

본 발명은 여성의 자궁경부에서 박테리아 분류군 (예를 들어, 박테리아 종 또는 속)의 특정 그룹에 속하는 박테리아의 수준이, 유해 임신 결과, 예를 들어 임신 주수 34주 미만 또는 37주 미만에서 조기 출산, 또는 유해 신생아 상태, 예를 들어 1분 또는 5분에 아프가 점수 (Apgar score)가 7 미만, 융모양막염 (chorioamnionitis), 호흡 곤란 증후군 (respiratory distress syndrome), 기관지폐형성이상 (bronchopulmonary dysplasia), 뇌실내 출혈 (intraventricular hemorrhage), 신생아 패혈증 (neonatal sepsis) 및 출산 후 7일내 신생아 사망의 가능성과 관련하여 증가된다는 발견에 일부 기초한다. 상기에서와 같이, 제1 양태에서, 본 발명은 피험체, 예를 들어 임신한 여성 또는 비-임신한 여성에 대해서 유해 임신 또는 신생아 결과의 위험을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 메가스패라 세레비지애 (Megasphaera cerevisiae), 알로스카르도비아 옴니콜렌스 (Alloscardovia omnicolens), 우레아플라스마 우레아리티쿰 (Ureaplasma urealyticum), 우레아플라스마 파르붐 (Ureaplasma parvum), 아토포비움 바기내 (Atopobium vaginae), 파르비박터 새시콜라 (Parvibacter caecicola), 락토바실루스 카제이 (Lactobacillus casei), 베일로넬라 몬트펠리에렌시스 (Veillonella montpellierensis), 아내로코쿠스 세네갈렌시스 (Anaerococcus senegalensis), 불레이디아 엑스트룩타 (Bulleidia extructa), 미코플라스마 호미니스 (Mycoplasma hominis), 프로피오니미크로비움 림포필룸 (Propionimicrobium lymphophilum), GenBank 수탁번호 제JQ781443.1호의 뉴클레오티드 서열에 대한 적어도 92 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 코리네박테리움 피루비시프로듀센스 (Corynebacterium pyruviciproducens), 메가스패라 세레비지애, 아시디필라 로세아 (Acidipila rosea), 무르도시엘라 아사카로리티카 (Murdochiella asaccharolytica), GenBank 수탁번호 제JF295520.1호의 뉴클레오티드 서열에 대한 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 호와르델라 우레일리티카 (Howardella ureilytica), 악티노바쿨룸 사알리이 (Actinobaculum schaalii), 펩토니필루스 두에르데니이 (Peptoniphilus duerdenii), 파스티디오시필라 산구이니스 (Fastidiosipila sanguinis), 스내티아 산구이네겐스 (Sneathia sanguinegens), 파르비모나스 미크라 (Parvimonas micra), 펩토니필루스 라크리말리스 (Peptoniphilus lacrimalis), 표 4A, 4C 및 8에서 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 의해서 특정된 박테리아 분류군 (bacterial taxon), 및 표 4E, 4G 및 9에서 BLAST 뉴클레오티드 정렬 (nucleotide alignment)에 기반한 가장 가까운 종 분류에 의해서 특정된 박테리아 분류군으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 분류군으로부터 박테리아의 수준을, 피험체로부터 채취한 생물학적 시료에서 검출하는 단계; 및 (b) 상기 적어도 하나의 박테리아 속으로부터 박테리아의 수준이 표준 대조군 수준 보다 더 크다면, 상기 피험체가 유해 임신 또는 신생아 결과에 대해 증가된 위험을 갖는다고 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 스내티아 산구이네겐스, 파르비모나스 미크라, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 펩토니필루스 라크리말리스, 메가스패라 세레비지애, 파르비박터 새시콜라의 수준을, 상기 피험체로부터 채취한 생물학적 시료에서 검출하는 단계; 및 상기 박테리아의 전체 수준이 표준 대조군 수준과 비교하여 증가된다면, 상기 피험체는 유해 임신 결과의 증가된 위험을 갖는다고 결정하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 유해 임신 또는 신생아 결과는 < 34주에서 조기 출산 (preterm birth), < 37주에서 조기 출산, 상기 생물학적 시료가 채취된 후 약 1-196일내 분만, 임상적 중재시술 (clinical intervention)이 실시된 후 약 1-196일내 분만, 1분에 아프가 점수 <7, 5분에 아프가 점수 <7, 융모양막염, 호흡 곤란 증후군, 기관지폐형성이상, 뇌실내 출혈, 출산 후 7일내에 신생아 사망 또는 신생아 패혈증을 포함한다. 일부 사례에서, 상기 방법은, 상기 적어도 하나의 박테리아 분류군에 속하는 박테리아의 수준이 표준 대조군 수준보다 더 큰 경우, 상기 피험체는 진행성 자궁경부 확장 또는 조기 자궁경부 단축의 위험을 갖는다고 결정하는 단계를 포함한다.

다른 구현예에서, 상기 방법은 파르비모나스 미크라, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 펩토니필루스 라크리말리스, 메가스패라 세레비지애, 파르비박터 새시콜라의 수준을, 상기 피험체로부터 채취된 생물학적 시료에서 검출하는 단계; 및 상기 박테리아의 전체 수준이 표준 대조군 수준과 비교하여 증가된 경우, 상기 피험체는 예를 들어 자궁경부 중재시술 (즉, 원형결찰/페서리 중재시술) 후 7일내 분만과 같은 유해 임신 결과의 증가된 위험을 갖는다고 결정하는 단계를 포함한다. 일부 사례에서, 상기 방법은 또한 상기 피험체가, 양막공간 (amniotic cavity), 자궁강 (uterine cavity), 자궁경부 또는 질 (vagina)에 감염될 위험이 있다고 결정하는 단계를 포함한다.

메가스패라 세레비지애의 일 부류가 GenBank 수탁번호 제NR_113307.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 메가스패라 세레비지애의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_113307.1호의 서열과 적어도 93 % 또는 94 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 메가스패라 세레비지애의 박테리아가 서열번호: 5에 개시된 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

알로스카르도비아 옴니콜렌스 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_042583.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 알로스카르도비아 옴니콜렌스의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_042583.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 게놈 서열 (genomic sequence)을 갖는 것으로 검출된다.

우레아플라스마 우레아리티쿰 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_102836.1호의 16S rRNA 게놈 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 우레아플라스마 우레아리티쿰의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_102836.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다. 우레아플라스마 파르붐 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_074176.1호의 16S rRNA 게놈 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 우레아플라스마 파르붐의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_074176.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 게놈 서열을 갖는 것으로 검출된다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 우레아플라스마 파르붐의 박테리아가 서열번호: 7에 개시된 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

아토포비움 바기내 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_117757.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 아토포비움 바기내의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_117757.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 97 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 아토포비움 바기내의 박테리아가 서열번호: 8에 개시된 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

파르비박터 새시콜라 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_117374.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 파르비박터 새시콜라의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_117374.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 92 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 파르비박터 새시콜라의 박테리아가 서열번호: 9에 개시된 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

락토바실루스 카제이 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_075032.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 락토바실루스 카제이의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_075032.1호의 뉴클레오티드 서열에 대한 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

베일로넬라 몬트펠리에렌시스 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_028839.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 베일로넬라 몬트펠리에렌시스의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_028839.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

아내로코쿠스 세네갈렌시스 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_118220.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 아내로코쿠스 세네갈렌시스의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_118220.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

불레이디아 엑스트룩타 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_028773.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 불레이디아 엑스트룩타의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_028773.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 97 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

미코플라스마 호미니스 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_113679.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 미코플라스마 호미니스의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_113679.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 게놈 서열을 갖는 것으로 검출된다.

프로피오니미크로비움 림포필룸 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_114337.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 프로피오니미크로비움 림포필룸의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_114337.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

본 명세서와 관련된 배양되지 않은 박테리아의 일 부류가 GenBank 수탁번호 제JQ781443.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제JQ781443.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 92 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

코리네박테리움 피루비시프로듀센스 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_116569.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 코리네박테리움 피루비시프로듀센스의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_116569.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

메가스패라 세레비지애의 다른 부류가 GenBank 수탁번호 제NR_113307.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 메가스패라 세레비지애의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_113307.1호의 서열에 대해 적어도 93 % 또는 94 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 메가스패라 세레비지애의 박테리아가 서열번호: 29에 개시된 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

아시디필라 로세아 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_113179.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 아시디필라 로세아의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_113179.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 97 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

무르도시엘라 아사카로리티카 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_116331.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 무르도시엘라 아사카로리티카의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_116331.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 99 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

본 명세서와 관련된 배양되지 않은 박테리아의 다른 부류가 GenBank 수탁번호 제JF295520.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제JF295520.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 90 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

호와르델라 우레일리티카 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_044022.2호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 호와르델라 우레일리티카의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_044022.2호의 뉴클레오티드 서열에 대해 93 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

악티노바쿨룸 사알리이 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_116869.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 악티노바쿨룸 사알리이의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_116869.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

펩토니필루스 두에르데니이 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_116346.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 펩토니필루스 두에르데니이의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_116346.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

파스티디오시필라 산구이니스 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_042186.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 파스티디오시필라 산구이니스의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_042186.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

스내티아 산구이네겐스가 GenBank 수탁번호 제AJ344093.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 스내티아 산구이네겐스의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제AJ344093.1호의 서열에 대해 적어도 93 % 또는 94 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

파르비모나스 미크라가 GenBank 수탁번호 제NR_114338.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 파르비모나스 미크라의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제NR_114338.1호의 서열에 대해 적어도 93 %, 예를 들어, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 파르비모나스 미크라의 박테리아가 서열번호: 43에 개시된 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다.

펩토니필루스 라크리말리스가 GenBank 수탁번호 제AB971812.1호 및 제NR_041938.1호의 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %, 예를 들어, 적어도 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 펩토니필루스 라크리말리스의 박테리아가 GenBank 수탁번호 제AB971812.1호 및 제NR_041938.1호의 서열에 대해 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다. 일부 구현예에서, 상기 분류군 펩토니필루스 라크리말리스의 박테리아가 서열번호: 44에 개시된 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 검출된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 상이한 박테리아 분류군을 검출하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 피험체는 임신 약 13주차 내지 약 37주차의 임신한 여성이다. 다른 구현예에서, 상기 임신한 여성은 임신 약 13주차 내지 약 25주차이다. 일부 사례에서, 상기 임신한 여성은 조기에 자궁경부가 열렸다. 상기 여성은 양막공간, 자궁강, 자궁경부 또는 질에서 감염의 위험이 높을 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 피험체는 비-임신한 여성이다. 일부 구현예에서, 상기 비-임신한 여성은 그녀의 미래에 임신할 계획을 가지고 있다. 일부 사례에서, 상기 피험체는 조기 출산, 사산 (stillbirth) 또는 유산 (miscarriage)의 병력을 가졌다. 일부 사례에서, 상기 피험체는 임신 전 또는 임신 후에, 임상적 중재시술, 예를 들어 원형결찰 중재시술 또는 프로게스테론 보충 시술을 받을 계획을 가지고 있다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 또한 상기 단계 (a)를 실시하기 이전에 상기 피험체로부터 채취된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시료는 자궁경부 면봉법 (외경구 (external os)의 면봉 시료를 포함함), 질 면봉법 (질천장 (fornix)의 면봉 시료를 포함함), 소변 시료, 양수 (amniotic fluid) 시료, 모체 혈액 시료 (모체 전혈 시료), 모체 혈청 시료, 모체 혈장 시료, 또는 자궁경부 점액 (cervical mucus) 시료이다. 일부 구현예에서, 상기 시료는 태반 면봉법 (placental swab), 탯줄 면봉법 (umbilical swab) 또는 생식계로부터 직접 또는 간접적으로 채취된 임의의 시료이다. 상기는 찰과 (scraping), 절단 (cutting), 플러싱 (flushing), 질 세척 (douching), 기체, 액체, 진공, 흡인력 (suction force), 에너지 형태 (예를 들어, 정전기장, LASER) 또는 화학약품의 농도 구배 (예를 들어, 화학주성을 유도하는 화학유인물질)의 적용을 통해 상기 여성 생식관의 표면으로부터 임의의 시료 채취 (sampling) 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시료가 상기 임신한 피험체의 위장관계로부터 직접 또는 간접적으로 채취되며, 볼 면봉법 (buccal swab), 인후 면봉법 (throat swab), 항문 면봉법 (anal swab), 직장 면봉법 (rectal swab) 또는 대변 시료를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 검출 단계는 폴리뉴클레오티드 증폭 분석을 포함한다. 일부 예에서, 상기 증폭 분석은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 분석이다. 선택적으로, 상기 PCR 분석은 정량적 PCR 분석일 수 있다. 일부 사례에서, 상기 검출 단계는 서열-특이적 프로브/프라이머 혼성화 (hybridization)를 포함하며, 이는 폴리뉴클레오티드 증폭의 부재하에 실시할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 검출 단계는 폴리뉴클레오티드 서열 결정, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만 대규모 병렬 시퀀싱 (massive parallel sequencing)을 포함한다.

예를 들면, 메가스패라 세레비지애, 알로스카르도비아 옴니콜렌스, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 파르비박터 새시콜라, 락토바실루스 카제이, 베일로넬라 몬트펠리에렌시스, 아내로코쿠스 세네갈렌시스, 불레이디아 엑스트룩타, 미코플라스마 호미니스, 프로피오니미크로비움 림포필룸, GenBank 수탁번호 제JQ781443.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 92 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 코리네박테리움 피루비시프로듀센스, 메가스패라 세레비지애, 아시디필라 로세아, 무르도시엘라 아사카로리티카, GenBank 수탁번호 제JF295520.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 호와르델라 우레일리티카, 악티노바쿨룸 사알리이, 펩토니필루스 두에르데니이, 파스티디오시필라 산구이니스, 스내티아 산구이네겐스, 파르비모나스 미크라, 펩토니필루스 라크리말리스, 표 4A, 4C 및 8에서 16S rRNA 게놈 서열에 의해서 특정된 박테리아 분류군, 및 표 4E, 4G 및 9에서 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한 가장 가까운 종 분류에 의해서 특정된 박테리아 분류군 또는 그 임의의 조합을 포함하는 박테리아 분류군에 속하는 박테리아의 수준이 표준 대조군과 비교하여 증가된다면, 상기 임신한 피험체는 유해 임신 또는 신생아 결과를 가질 위험이 있다. 상기 표준 대조군과 비교하여 선택된 박테리아 분류군의 하나 이상의 박테리아의 수준에서 증가가 측정되는 경우, 상기 여성은 조기 출산 또는 신생아 합병증을 가진 어린이의 분만의 증가된 위험을 갖는 것을 나타낸다. 예를 들어, 임신한 여성으로부터의 자궁경부 또는 질 면봉법 시료에서, 메가스패라 세레비지애, 알로스카르도비아 옴니콜렌스, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 파르비박터 새시콜라, 락토바실루스 카제이, 베일로넬라 몬트펠리에렌시스, 아내로코쿠스 세네갈렌시스, 불레이디아 엑스트룩타, 미코플라스마 호미니스, 프로피오니미크로비움 림포필룸, GenBank 수탁번호 제JQ781443.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 92 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 코리네박테리움 피루비시프로듀센스, 메가스패라 세레비지애, 아시디필라 로세아, 무르도시엘라 아사카로리티카, GenBank 수탁번호 제JF295520.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 호와르델라 우레일리티카, 악티노바쿨룸 사알리이, 펩토니필루스 두에르데니이, 파스티디오시필라 산구이니스, 스내티아 산구이네겐스, 파르비모나스 미크라, 펩토니필루스 라크리말리스, 표 4A, 4C 및 8에서 16S rRNA 게놈 서열에 의해서 특정된 박테리아 분류군, 및 표 4E, 4G 및 9에서 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한 가장 가까운 종 분류에 의해서 특정된 박테리아 분류군과 같은 상기 분류군의 하나 이상으로부터 박테리아의 수준이 상기 표준 대조군과 비교하여 더 높게 검출되는 경우, 상기 여성은 유해 임신 및/또는 신생아 결과를 가질 증가된 가능성을 갖는다. 가능한 유해 임신 또는 신생아 결과는, 이에 한정되는 것은 아니지만, < 34주에 조기 출산, < 37주에 조기 출산, 1분에 아프가 점수 < 7, 5분에 아프가 점수 < 7, 융모양막염, 호흡 곤란 증후군, 기관지폐형성이상, 뇌실내 출혈, 출산 후 7일내 신생아 사망 및/또는 신생아 패혈증을 포함한다. 또한, 상기 피험체가 임신한 여성이라면, 상기 가능한 유해 임신 또는 신생아 결과는 상기 생물학적 시료가 채취된 후 약 1-196 일 기간내 (예를 들어, 1 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일, 56 일, 84 일, 112 일, 140 일, 168 일, 또는 196 일) 분만과, 임상적 중재시술이 실시된 후 약 1-196 일 기간내 (예를 들어, 1 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일, 56 일, 84 일, 112 일, 140 일, 168 일, 또는 196 일) 분만을 더 포함한다.

본원에 제공된 방법은 상기 임신한 여성이 진행성 자궁경부 확장 또는 진행성 자궁경부 단축의 위험을 갖는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 메가스패라 세레비지애, 알로스카르도비아 옴니콜렌스, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 파르비박터 새시콜라, 락토바실루스 카제이, 베일로넬라 몬트펠리에렌시스, 아내로코쿠스 세네갈렌시스, 불레이디아 엑스트룩타, 미코플라스마 호미니스, 프로피오니미크로비움 림포필룸, GenBank 수탁번호 제JQ781443.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 92 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 코리네박테리움 피루비시프로듀센스, 메가스패라 세레비지애, 아시디필라 로세아, 무르도시엘라 아사카로리티카, GenBank 수탁번호 제JF295520.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 호와르델라 우레일리티카, 악티노바쿨룸 사알리이, 펩토니필루스 두에르데니이, 파스티디오시필라 산구이니스, 스내티아 산구이네겐스, 파르비모나스 미크라, 펩토니필루스 라크리말리스, 표 4A, 4C 및 8에서 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 의해서 특정된 박테리아 분류군, 및 표 4E, 4G 및 9에서 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한 가장 가까운 종 분류에 의해서 특정된 박테리아 분류군과 같은 적어도 하나의 박테리아 분류군으로부터 박테리아의 수준이 표준 대조군 수준보다 더 큰 경우, 상기 여성은 진행성 자궁경부 확장 또는 조기 자궁경부 단축을 가질 증가된 가능성을 갖는다. 이러한 피험체가 임신 13주차에서 37주차까지의 사이에 능동적인 가진통 (active labor)없이 예를 들면 ≥ 2 cm의 자궁경부 확장, 또는 전체 기간의 가진통 및 분만 이전에 자궁경부 단축을 나타낼 것으로 예측된다.

일부 예에서, 상기 방법은 존퀘텔라 안트로피 (Jonquetella anthropi), 아에로코쿠스 우리내 (Aerococcus urinae), 표 4B 및 4D에서 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 의해서 특정된 박테리아 분류군, 및 표 4F 및 4H에서 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한 가장 가까운 종 분류에 의해서 특정된 박테리아 분류군으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 분류군으로부터 박테리아의 수준을, 생물학적 시료에서 검출하는 단계; 및 상기 적어도 하나의 박테리아 분류군으로부터 상기 박테리아의 수준이 표준 대조군 수준보다 더 적은 경우, 상기 피험체는 유해 임신 결과에 대한 증가된 위험을 갖는다고 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 임신한 여성이 유해 임신 또는 신생아 결과를 가질 것으로 예측되는 경우, 상기 방법은 상기 피험체로부터의 생물학적 시료의 시료 형태를 사용하여 이후에 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계를 포함할 수 있으며, 원래 단계 (a)에서 측정된 수준과 비교하여, 이후에 적어도 하나의 박테리아 분류군으로부터 박테리아의 수준에서의 증가는 유해 임신 또는 신생아 결과의 증가된 위험을 나타낸다. 또한, 일단 임신한 여성이 유해 임신 또는 신생아 결과를 경험할 위험이 증가되는 것으로 나타나면, 의사는 상기 여성에게 상기 유해 결과의 위험을 최소화하기 위한 치료를 제공할 수 있다. 예를 들면, 상기 여성은 임신 기간내내 긴밀하게 모니터링될 수 있거나, 또는 신생아 집중 치료를 갖춘 3차 기관으로 조속히 이송될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 피험체에서 유해 임신 또는 신생아 결과를 가질 위험을 결정하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 (a) 임신한 여성으로부터 채취된 생물학적 시료를 제공하고, 메가스패라 세레비지애, 알로스카르도비아 옴니콜렌스, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 파르비박터 새시콜라, 락토바실루스 카제이, 베일로넬라 몬트펠리에렌시스, 아내로코쿠스 세네갈렌시스, 불레이디아 엑스트룩타, 미코플라스마 호미니스, 프로피오니미크로비움 림포필룸, GenBank 수탁번호 제JQ781443.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 92 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 코리네박테리움 피루비시프로듀센스, 메가스패라 세레비지애, 아시디필라 로세아, 무르도시엘라 아사카로리티카, GenBank 수탁번호 제JF295520.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 호와르델라 우레일리티카, 악티노바쿨룸 사알리이, 펩토니필루스 두에르데니이, 파스티디오시필라 산구이니스, 스내티아 산구이네겐스, 파르비모나스 미크라, 펩토니필루스 라크리말리스, 표 4A, 4C 및 8에서 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 의해서 특정된 박테리아 분류군; 및 표 4E, 4G 및 9에서 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한 가장 가까운 종 분류에 의해서 특정된 박테리아 분류군으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 분류군에 속하는 박테리아를 포함하는 표준 대조군 (standard control); 및 (b) 메가스패라 세레비지애, 알로스카르도비아 옴니콜렌스, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 파르비박터 새시콜라, 락토바실루스 카제이, 베일로넬라 몬트펠리에렌시스, 아내로코쿠스 세네갈렌시스, 불레이디아 엑스트룩타, 미코플라스마 호미니스, 프로피오니미크로비움 림포필룸, GenBank 수탁번호 제JQ781443.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 92 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 코리네박테리움 피루비시프로듀센스, 메가스패라 세레비지애, 아시디필라 로세아, 무르도시엘라 아사카로리티카, GenBank 수탁번호 제JF295520.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 호와르델라 우레일리티카, 악티노바쿨룸 사알리이, 펩토니필루스 두에르데니이, 파스티디오시필라 산구이니스, 스내티아 산구이네겐스, 파르비모나스 미크라, 펩토니필루스 라크리말리스, 표 4A, 4C 및 8에서 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 의해서 특정된 박테리아 분류군, 및 표 4E, 4G 및 9에서 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한 가장 가까운 종 분류에 의해서 특정된 박테리아 분류군으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 분류군을 특이적 및 정량적으로 동정하는 하나 이상의 제제 (agents)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 증폭 분석에서 상기 적어도 하나의 박테리아 속의 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화되어서 증폭시키는, 하나 이상의 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 제제는 상기 적어도 하나의 박테리아 분류군의 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 프로브를 더 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상기 키트는 지시 매뉴얼을 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 임신한 여성이 진행성 자궁경부 확장 또는 조기 자궁경부 단축의 증가된 위험을 갖는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 상기 피험체로부터 채취된 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계; (b) 메가스패라 세레비지애, 알로스카르도비아 옴니콜렌스, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 파르비박터 새시콜라, 락토바실루스 카제이, 베일로넬라 몬트펠리에렌시스, 아내로코쿠스 세네갈렌시스, 불레이디아 엑스트룩타, 미코플라스마 호미니스, 프로피오니미크로비움 림포필룸, GenBank 수탁번호 제JQ781443.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 92 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 코리네박테리움 피루비시프로듀센스, 메가스패라 세레비지애, 아시디필라 로세아, 무르도시엘라 아사카로리티카, GenBank 수탁번호 제JF295520.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 호와르델라 우레일리티카, 악티노바쿨룸 사알리이, 펩토니필루스 두에르데니이, 파스티디오시필라 산구이니스, 스내티아 산구이네겐스, 파르비모나스 미크라, 펩토니필루스 라크리말리스, 표 4A, 4C 및 8에서 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 의해서 특정된 박테리아 분류군, 및 표 4E, 4G 및 9에서 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한 가장 가까운 종 분류에 의해서 특정된 박테리아 분류군으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 박테리아 분류군의 수준을, 상기 핵산에서 검출하는 단계; 및 (c) 상기 적어도 하나의 박테리아 분류군의 수준이 표준 대조군 수준보다 더 큰 경우, 상기 피험체는 진행성 자궁경부 확장 또는 조기 자궁경부 단축의 증가된 위험을 갖는다고 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 임신한 여성이 그녀의 자궁경부 또는 질에서 상기 선택된 박테리아 분류군의 하나 이상으로부터 박테리아의 증가된 수준을 갖는다고 측정되는 경우, 상기 임신한 여성은 조기 확장된 자궁경부 및/또는 조기 단축된 자궁경부를 가질 위험이 있다고 예측된다. 여성이 그녀의 자궁경부 또는 질에서, 예를 들면 임신 약 13주차 내지 약 25주차에, 메가스패라 세레비지애, 알로스카르도비아 옴니콜렌스, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 파르비박터 새시콜라, 락토바실루스 카제이, 베일로넬라 몬트펠리에렌시스, 아내로코쿠스 세네갈렌시스, 불레이디아 엑스트룩타, 미코플라스마 호미니스, 프로피오니미크로비움 림포필룸, GenBank 수탁번호 제JQ781443.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 92 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 코리네박테리움 피루비시프로듀센스, 메가스패라 세레비지애, 아시디필라 로세아, 무르도시엘라 아사카로리티카, GenBank 수탁번호 제JF295520.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 호와르델라 우레일리티카, 악티노바쿨룸 사알리이, 펩토니필루스 두에르데니이, 파스티디오시필라 산구이니스, 스내티아 산구이네겐스, 파르비모나스 미크라, 펩토니필루스 라크리말리스, 표 4A, 4C 및 8에서 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 의해서 특정된 박테리아 분류군, 및 표 4E, 4G 및 9에서 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한 가장 가까운 종 분류에 의해서 특정된 박테리아 분류군 또는 그 임의의 조합과 같은 군으로부터 하나 이상의 박테리아를 갖는 경우, 상기 여성은 임신 약 34주차 내지 약 37주차 이전에 자궁경부가 확장되거나 또는 자궁경부가 단축될 가능성이 있다. 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 상이한 박테리아 분류군이 상기 시료에서 검출될 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 자궁경부 면봉법, 질 면봉법, 소변 시료, 양수 시료, 모체 혈액 시료, 모체 혈청 시료, 모체 혈장 시료, 자궁경부 점액 시료, 태반 면봉법, 탯줄 면봉법 또는 생식계 또는 위장관계로부터 직접 또는 간접적으로 채취된 임의의 시료이다. 상기 검출 단계는 폴리뉴클레오티드 증폭 분석, 폴리뉴클레오티드 서열 측정을 포함하는 분석, 또는 서열-특이적 프로브/프라이머 혼성화를 포함하는 분석일 수 있다. 일부 예에서, 상기 증폭 분석은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 분석이다. 선택적으로, 상기 PCR 분석은 정량적 PCR 분석 또는 역전사효소 (reverse-transcriptase) PCR 분석이다.

도 1a 내지 도 1e는 중재시술 후 자연 조기 출산 (spontaneous preterm birth: sPTB) 및 중재시술 후 만기 출산 (term birth: TB)과 같은 임상적 결과와, 박테리아 분류군 사이의 연관성을 나타내었다. 도 1a는 중재시술 후 25명의 자궁경부 부전 (cervical insufficiency: CI) 환자의 임상적 결과를 나타내었다. 각 컬럼은 환자 (P1-P25)를 분만시 임신 주수 (GA)의 오름차순으로 나타내었다. 검정색으로 음영된 사각형: P1-P10은 "중재시술 후 < 34주의 자연 조기 출산 (sPTB)"을 나타내었다. 흰색 사각형: P11-P25는 "중재시술 후 ≥ 37주의 만기 출산 (TB)"을 나타내었다. 잠재기 (latency)는 치료와 분만 사이의 구간이다. RDS는 호흡 곤란 증후군이다. BPD는 기관지폐형성이상이다. IVH는 뇌실내 출혈이다. ROP는 미숙아의 망막병증 (retinopathy of prematurity)이다. 신생아 사망, 분만 후 28일내 사망. Y는 예 (Yes)이고; N은 아니오 (no)이며; -는 측정되지 않음이다. 도 1b 및 도 1c는 상기 "중재시술 후 sPTB" CI 자궁경부 및 상기 "중재시술 후 TB" CI 자궁경부에서 각각 10개의 가장 풍부한 박테리아 분류군을 나타내었다. 개시된 값들은 각 환자의 자궁경부 면봉법 시료 (컬럼)에서 각 박테리아 분류군의 풍도(abundance) 값의 log 10 (정규화 시퀀싱 판독 계수 (normalized sequencing read counts), 누적합 스케일링 (Cumulative Sum Scaling: CSS) 방법) (열)이다. 정규화 판독 계수가 도 1e에 나타낸 바와 같이 로그 (풍도)로 변환된다. 각 열은 ≥ 97 % 동일성의 서열을 클러스터링 (clustering)하여 형성된 조작분류단위 (operational taxonomic unit: Otu)를 나타낸다. 각 Otu는 리보좀 데이터베이스 프로젝트 (Ribosomal Database Project: RDP) 나이브 베이지안 rRNA 분류기 (Naive Bayesian rRNA Classifier, Version 2.9, September 2014, RDP 16S rRNA 트레이닝 세트 (training set) 10)를 사용하여 분류학상으로 속 (genus) 수준으로 분류된다. 락토바실루스가 종 정보를 유도하기 위해서 BLAST (최고 점수) 및 MOLE-BLAST (BLAST 매치의 최선의 다중-정렬)를 사용하여 16S rRNA 데이터베이스 (GenBank)에 대해 추가로 매칭된다. 도 1d는 "중재시술후 sPTB" (n=10) 그룹과 "중재시술후 TB" (n=15) 그룹 사이의 차별적으로 풍부한 박테리아 분류군을 나타낸다 (Mann-Whitney rank sum test). 오류 발견율 (False Discovery Rate: FDR) 방법 (별표에서 p <0.05 및 q 값 <0.05, 즉, FDR <5 %)에 의한 다중 검정을 위한 조정 후 7 개의 분류군이 차별적으로 풍부하게 남아 있다. p < 0.01인 후자의 6개의 분류군은 각 자궁경부 면봉법 시료에 대해서 요약 점수, 즉 6 개의 선택된 분류군 (LA6) 값의 로그 (기수 10) 총 풍도를 산출하기 위해서 추가로 선택된다. 총 풍도는 공통적인 (선형) 규모에서 선택된 분류군의 풍도의 산술 합계이다.
도 2a 내지 도 2c는 상기 2개의 그룹, 예를 들어, 중재시술후 자연 조기 출산 (sPTB) 환자 및 중재시술 후 만기 출산 (TB) 환자에 대해서 통계적 분석 및 LA6 값을 제공한다. 도 2a는 임상적 중재시술을 받았지만, 상이한 결과를 나타내는, 자궁경부 부전 (CI) 환자들의 2개의 그룹에서 LA6 값 (로그 (기수 10) 규모로 상기 6개의 선택된 박테리아 분류군의 총 풍도)을 제공한다. 상기 LA6을 측정하기 위한 자궁경부 면봉법 시료가 원형결찰/페서리 중재시술 전에 CI 환자들로부터 수집된다. 치료 후에, 10명의 환자는 < 34주의 자연 조기 출산 ("중재시술후 sPTB" 그룹, 동그라미)을 겪었고, 15명의 환자는 ≥ 37주의 만기 출산 ("치료 후 TB" 그룹, 삼각형)을 겪었다. 상기 6개의 분류군이 대규모 병렬 시퀀싱 데이터에서 상기 2개의 그룹들 사이에서 이들 현저하게 상이한 풍도 (p<0.01)에 근거하여 선택된다 (도 1d). 상기 오차 막대 (error bar)의 장 및 단 수평선은 각각 중앙값 및 사분위수 범위로 그려진다. 도 2b는 LA6 > 1.15를 갖는 CI 환자 (LA6-양성) 대 LA6 ≤ 1.15를 갖는 CI 환자 (LA6-음성)에서 상이한 임신 기간에서 분만하지 않은 임신의 비율을 나타낸다. LA6-양성 환자는 임상적 중재시술 후에, 상기 LA6-양성 환자들보다 조기에 분만하였다 (23.7주 대 38.4주의 분만시 중앙 임신 주수; 95 % 신뢰도 구간, 20.6주 - 25.4주 대 38.0주 - 38.7주; Chi-squared, 32.352; df, 1; Logrank test, p < 0.0001; 위험 비율 (hazard ratio), 6.24; 95 % 신뢰도 구간, 1.50 대 25.9). LA6-양성 환자 및 LA6-음성 환자에 대해서 분만하지 않은 임신의 백분율의 95 % 신뢰도 구간은 각각 굵은 직선과 굵은 점선 주위의 가는선으로 도시하였다. 도 2c는 LA6-양성 CI 환자 대 LA6-음성 CI 환자에서 치료 후에 상이한 일수에서 분만하지 않은 임신의 비율을 도시하였다. LA6-양성 환자는 중재시술 후에 LA6-음성 환자보다 더 짧은 기간 동안 분만하였다 (중재시술과 분만 사이의 중간값 일수, 10 일 대 126 일; 95 % 신뢰도 구간, 8일 - 32일 대 112일 - 134일; Chi-squared, 32.520; df, 1; Logrank test, p < 0.00001; 위험 비율, 6.34; 95 % 신뢰도 구간, 1.51 대 26.6).

정의

본 명세서에서, 용어 "또는 (or)"는 내용이 명확하게 다르게 지시하지 않는 한, "및/또는 (and/or)"을 포함하는 의미로 일반적으로 사용된다.

용어 "유해 임신 또는 신생아 결과 (adverse pregnancy or neonatal outcome)"는 건강한 아이를 분만/출산할 가능성을 감소시키는 상태를 나타낸다. 유해 임신 결과의 비제한적인 예로는 다수의 제1 석달 유산 (first trimester miscarriages), 제2 석달 임신 손실 (second trimester pregnancy loss), 조기 출산 (예를 들어, 자연 또는 지시), 조기 자간전증 (preterm pre-clampsia), 조기 자간증 (preterm clampsia), 태아 성장 제한 (fetal growth restriction), 태반조기박리 (abruption placenta), 태아 사망/사산, 출산 결손 (birth defects), 1분에 아프가 점수 <7, 5분에 아프가 점수 <7, 임상적 융모양막염, 병리적 융모양막염 (pathological chorioamnioitis), 신생아 호흡 곤란 증후군, 신생아 기관지폐형성이상, 신생아 패혈증, 신생아 뇌실내 출혈 등을 포함한다.

용어 "자궁경부 부전 (cervical insufficiency)"은 자궁경부의 상태, 예를 들면 제2 석달 임신 손실 또는 출산을 유도할 수 있는 자궁경부의 약해짐 또는 진행성 확장을 나타낸다. 자궁경부 약화, 조기 자궁경부 단축, 조기 또는 진행성 자궁경부 확장, 자궁경부 외상, 상기 자궁경부의 구조적 이상 또는 그 임의의 조합이 자궁경부 부전을 일으킬 수 있다. 자궁경부 부전을 관리하기 위한 임상적 중재시술은 이에 한정되는 것은 아니지만, 프로게스테론 보충, 자궁경부 원형결찰 및 자궁경부 페서리를 포함한다.

용어 "박테리아 분류군 (bacterial taxon)"은 분류체계를 나타내며, 즉 박테리아의 순위-기반 분류를 나타낸다. 상기 계층적 생물학적 분류에는 생물, 영역, 계, 문, 강, 목, 과, 속 및 종을 포함한다.

용어 "생물학적 시료 (biological sample)" 또는 "시료 (sample)"는 조직의 절편, 예를 들어 생검 및 부검 시료와, 조직학적 목적을 위해 채취한 동결된 절편, 또는 이러한 시료들 중 어느 것의 가공된 형태를 포함한다. 생물학적 시료는 자궁경부 면봉법, 질 면봉법, 자궁 면봉법, 혈액 및 혈액 분획물 또는 산물 (예를 들어, 혈청, 혈장, 혈소판, 적혈구 세포 등), 객담 또는 타액, 림프 및 혀 조직, 배양된 세포, 예를 들어 1차 배양, 이식편, 및 형질전환된 세포, 대변, 소변, 생검 조직 등을 포함한다. 생물학적 시료는 통상적으로 진핵 생물체로부터 수득되며, 포유류일 수 있고, 영장류일 수 있으며, 또한 인간 대상일 수 있다.

용어 "생검 (biopsy)"은 진단 또는 예후 평가를 위해 조직 시료를 제거하는 방법, 및 그 조직 검체를 나타낸다. 당분야에 알려져 있는 임의의 생검 기법은 본 발명의 진단 및 예후 방법에 적용될 수 있다. 적용된 생검 기법은 다른 요소들 사이에서 평가될 조직의 형태 (예를 들어, 자궁경부, 질, 혀, 결장, 전립선, 신장, 방광, 림프절, 간, 골수, 혈액 세포, 위 조직 등)에 따라 다를 것이다. 대표적인 생검 기법은 이에 한정되는 것은 아니지만, 면봉 생검, 절제 생검, 절개 생검, 바늘 생검, 수술 생검 및 골수 생검을 포함하며, 대장내시경검사 (colonoscopy)가 포함될 수 있다. 광범위한 생검 기법이 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있으며, 상기와 최소의 실험으로 이를 실시하는 것 사이에서 선택할 것이다.

본 명세서에서, 용어 "분리된 (isolated)" 핵산 분자는 상기 분리된 핵산 분자와 통상적으로 결합된 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자를 의미한다. 그러므로, "분리된" 핵산 분자는, 그에 제한 없이, 분리된 핵산 분자가 유래한 생물체의 게놈 중 상기 핵산의 하나의 또는 양 말단에 자연적으로 플랭크 (flank)되는 뉴클레오티드 서열이 없는 핵산 분자를 포함한다 (예를 들어, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 분해 (restriction endonuclease digestion)에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편). 이러한 분리된 핵산 분자는 조작의 편이를 위해 또는 융합 핵산 분자의 생성을 위해 벡터 (예를 들면, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)에 도입될 수 있다. 또한, 분리된 핵산 분자는 조작된 핵산 분자, 예를 들면, 재조합 또는 합성 핵산 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 핵산 라이브러리 (예를 들면, cDNA 또는 게놈 라이브러리) 또는 겔(예를 들면, 아가로스, 또는 폴리아크릴아민) 함유 제한-분해 (restriction-digested) 게놈 DNA 내의 수백 내지 수백만의 다른 핵산 분자들 사이에 존재하는 핵산 분자는 "분리된" 핵산 분자가 아니다.

용어 "핵산 (nucleic acid)", "뉴클레오티드 (nucleotide)" 또는 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acids: DNA) 또는 리보핵산 (ribonucleic acids: RNA) 및 그 폴리머를 나타낸다. 특별히 제한되지 않는 한, 용어는 참조 핵산으로서 유사한 결합 특성을 갖고, 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방법으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 알려진 유사체 (analogs)를 포함하는 핵산을 포괄한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명백하게 지시된 서열뿐만 아니라, 내재적으로 그 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축퇴 코돈 치환 (degenerate codon substitution), 대립 형질 (alleles), 이종 상동 (orthologs), 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs), 및 상보적인 서열을 포함한다. 상세하게는 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 3번째 위치가 혼합된-염기 (mixed-base) 및/또는 데옥시이노신 (deoxyinosine) 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로서 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem . 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol . Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA, 및 유전자에 의해 인코딩된 mRNA와 호환적으로 사용된다.

용어 "폴리펩티드 (polypeptide)", "펩티드 (peptide)" 및 "단백질 (protein)"은 본 명세서에서 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해서 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 자연적으로 발생하는 아미노산 폴리머 및 비-자연적으로 발생하는 아미노산 폴리머 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응되는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공 화학적 모방체 (artificial chemical mimetic)인 아미노산 중합체에 적용된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 전장 단백질 (즉, 항원)을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함하고, 여기서 상기 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결된다.

용어 "아미노산 (amino acid)"은 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방법으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체 뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 아미노산 및 합성 아미노산을 의미한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 나중에 변형된 아미노산, 예를 들면, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린 뿐만 아니라, 유전 코드에 의해 인코딩된 것들이다. 본 명세서의 목적을 위해서, 아미노산 유사체는 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기에 결합되는 탄소, 및 R 기, 예를 들어, 호모세린, 노르루신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 갖는 화합물을 의미한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들면, 노르루신) 또는 변형된 펩티드 주사슬을 갖지만, 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는다. 본 명세서의 목적을 위해서, 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이하지만, 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방법으로 작용하는 구조를 갖는 화학적 화합물을 의미한다.

아미노산은 WO01/12654에 개시된 바와 같이, D-아미노산의 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드의 안정성 (예를 들어, 반감기), 생체이용률, 및 다른 특성을 개선시킬 수 있는, 비-자연적으로 발생하는 D-키랄성 (D-chirality)을 갖는 것을 포함할 수 있다. 일부 사례에 있어서, 치료적 폴리펩티드의 하나 이상, 및 잠재적으로 전부의 아미노산은 D-키랄성을 갖는다.

아미노산은 본 명세서에서 통상적으로 알려진 세 개의 글자 심볼 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회 (Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 추천되는 한 글자 심볼에 의해 언급될 수 있다. 이와 같이, 뉴클레오티드는 그들의 통상적으로 인정된 단일-글자 코드에 의해 언급될 수 있다.

두 개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 서술하는 문맥에서, 용어 "동일한 (identical)", 또는 퍼센트 "동일성 (identity)"은 다음의 서열 비교 알고리즘 중의 하나를 사용하거나, 또는 수동 정렬 (manual alignment) 및 시각 검사 (visual inspection)에 의해 측정된, 비교 윈도우, 또는 지정된 영역 (designated region)에 대한 최대 일치를 위해 비교되고, 정렬될 때, 동일하거나 또는 동일한 것인 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 퍼센트를 갖는 두 개 이상의 서열 또는 서브서열 (subsequences)을 의미한다 (예를 들어, (가령, 유해 임신 결과를 예측하기 위해) 본 발명의 방법에 사용되는 박테리아 단백질의 변이체 또는 관심있는 변이체는 참조 서열, 예를 들면, 상응하는 관심있는 야생형 박테리아 단백질에 대해 적어도 80 % 서열 동일성, 바람직하게는 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 동일성을 갖는다). 이러한 서열은 이후에 "실질적으로 동일한 (substantially identical)"으로 불려진다. 폴리뉴클레오티드 서열에 있어서, 이 정의는 또한 검정 서열의 상보체 (complement)를 의미한다. 바람직하게는 상기 동일성은 길이로 적어도 약 50개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 대해서, 또는 더 바람직하게는 길이로 75-100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 영역에 대해서 존재한다.

서열 비교를 위해서, 통상적으로 하나의 서열이 검정 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참조 서열이 컴퓨터로 들어가고, 서브 서열 좌표가 지정되고, 필요하다면, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정될 수 있다. 디폴트 (default) 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 그 후, 상기 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기반하여, 참조 서열 대비 검정 서열에 대한 퍼센트 서열 동일성을 산출한다. 핵산 및 단백질의 서열 비교를 위해, 하기에서 논의되는 BLAST, 및 BLAST 2.0 알고리즘, 및 디폴트 파라미터가 사용된다.

본 명세서에서 사용된 "비교 윈도우 (comparison window)"는 두 개의 서열이 최적으로 정렬된 후, 서열이 연속된 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교될 수 있는, 20 내지 600, 통상적으로 약 50 내지 약 200, 더욱 통상적으로 약 100 내지 약 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 연속된 위치의 수의 어느 하나의 세그먼트에 대한 참조 (reference)를 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬의 방법은 기술 분야에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, local homology algorithm of Smith & Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482 (1981), the homology alignment algorithm of Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443 (1970), the search for similarity method of Pearson & Lipman, Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 85:2444 (1988), computerized implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 manual alignment and visual inspection (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement) 참조)에 의해 수행될 수 있다.

퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 적합한 알고리즘의 예는 Altschul et al., (1990) J. Mol . Biol . 215: 403-410 및 Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402에 각각 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립생물정보센터 웹사이트, ncbi.nlm.nih.gov에서 공개적으로 이용 가능하다. 알고리즘은 의문의 서열 중 길이 W의 짧은 단어를 식별함으로써, 고 점수 서열쌍 (HSPs)을 제1 식별하는 단계를 포함하고, 이것은 데이터베이스 서열 중 동일한 길이의 단어와 정렬될 때, 일부 양의 값의 역치 점수 T (positive-valued threshold score T)와 매칭되거나 또는 이를 만족한다. T는 이웃 단어 점수 역치 (neighborhood word score threshold)를 의미한다 (Altschul et al., supra). 이들 초기 이웃 단어 히트는 그들을 포함하는 더 긴 HSP를 찾기 위해 초기 서치를 시작하기 위한 씨앗으로서 작용한다. 그 후, 단어 히트는 각 서열의 양 방향을 따라 축적 정렬 점수 (cumulative alignment score)가 증가될 수 있을 만큼 확장된다. 축적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대하여 파라미터 M (매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 벌칙 점수; 항상 < 0)을 사용하여 산출된다. 아미노산 서열에 대하여, 점수 매트릭스는 축점 점수를 산출하는데 사용된다. 각 방향으로의 단어 히트의 확장은: 축적 정렬 점수가 그의 최대 달성된 값으로부터 양 (quantity) X로 떨어질 때; 축적 점수가 하나 이상의 음-점수 잔기 정렬의 축적에 의해 0 이하로 갈 때; 또는 각 서열의 말단에 도달했을 때 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 감수성 및 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열을 위한) BLASTN 프로그램은 28의 단어 크기(W), 10의 기대값 (expectation)(E), M = 1, N = -2, 및 양 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열에 대하여, BLASTP 프로그램은 3의 단어 크기(W), 10의 기대값(E), 및 BLOSUM62 점수 매트릭스를 디폴트로서 사용한다 (예를 들어, Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 89:10915 (1989) 참조).

BLAST 알고리즘은 또한 두 개의 서열들 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다 (예를 들어, Karlin and Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 하나의 측정은 가장 작은 합계 확률 (sum probability) (P(N))이고, 이것은 두 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이의 매치가 우연에 의해 일어날 수 있는 확률의 표시를 제공한다. 예를 들면, 만약 검정 핵산 대 참조 핵산의 비교에서 가장 작은 합계 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면, 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.

2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 표시는 제1 핵산에 의해서 인코딩된 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해서 인코딩된 폴리펩티드에 대해 증가되는 항체와의 면역학적 교차 반응하는 것이며, 이는 하기에 개시된다. 그러므로, 폴리펩티드는 통상적으로 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하며, 예를 들면, 상기 2개의 펩티드는 보존적 치환에 의해서만 다르다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 상기 2개의 분자 또는 그 상보체가 엄격한 조건 (stringent conditions) 하에 서로 혼성화되는 것이며, 이는 하기에 개시되었다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 동일한 프라이머가 상기 서열을 증폭시키기 위해 사용될 수 있다는 것이다.

용어 "엄격한 혼성화 조건 (stringent hybridization conditions)" 및 "고 엄격성 (high stringency)"은 프로브가 그 표적 서브서열에, 통상적으로 핵산의 복합 혼합물에서 혼성화되지만, 그러나 다른 서열과는 혼성화되지 않는 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 서열-의존성이며, 다른 환경에서 달라질 것이다. 더 긴 서열은 특별히 더 높은 온도에서 혼성화한다. 핵산 혼성화에 대한 광범위한 가이드가 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)에서 찾을 수 있고, 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 이해할 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 pH에서 상기 특정 서열에 대해서 열 융점 (thermal melting point: Tm) 보다 약 5-1O ℃ 더 낮은 온도가 되도록 선택된다. 상기 Tm은 (규정된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도하) 평형상태에서 표적에 상보적인 프로브의 50%가 표적 서열에 혼성화하는 온도이다 (상기 표적 서열이 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서, 상기 프로브의 50%가 평형상태를 점하게 됨). 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가에 의해서 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화의 경우, 양 (positive)의 신호는 백그라운드의 적어도 2배, 바람직하게는 10배의 백그라운드 혼성화이다. 엄격한 혼성화 조건의 예시는 다음과 같을 수 있다: 50 % 포름아미드, 5x SSC, 및 1 % SDS, 42 ℃에서 배양, 또는, 5x SSC, 1 % SDS, 65 ℃에서 배양, 65 ℃에서 0.2 x SSC, 및 0.1 % SDS로 세척.

엄격한 조건하에 서로에게 혼성화되지 않는 핵산은, 핵산이 인코딩하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다면, 여전히 실질적으로 동일하다. 예를 들면, 핵산의 복제물이 유전자 코드상 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 활용하여 제작될 때, 이러한 경우가 발생한다. 이 경우, 상기 핵산은 통상적으로 적당히 엄격한 혼성화 조건하에서 혼성화된다. 예시적인 "적당히 엄격한 혼성화 조건"은 37 ℃에서 40 % 포름아미드, 1 M NaCl, 1 % SDS의 완충액 중에서 혼성화, 및 45 ℃에서 1X SSC 세척을 포함한다. 양성 (positive) 혼성화는 적어도 2배의 백그라운드가 된다. 통상의 지식을 가진 자라면 유사한 엄격 조건을 제공하기 위하여 대안적인 혼성화 및 세척 조건을 이용할 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다. 혼성화 파라미터를 결정하는 부가적인 가이드라인은 다수의 참조, 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.에 제공된다.

다른 폴리뉴클레오티드 서열과 이중-가닥 복합체를 형성하는 폴리뉴클레오티드 서열을 언급하는 문맥에서 사용되는, 문구 "특이적으로 결합한다 (specifically binds)"는 용어 "폴리뉴클레오티드 혼성화 방법"에 대한 정의에서 제공된 바와 같이, 왓슨-크릭 염기-쌍에 기반한 "폴리뉴클레오티드 혼성화"를 서술한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "증가 (increase)" 또는 "감소 (decrease)"는 비교 대조군, 예를 들면, 확립된 표준 대조군 (예를 들면, 임신한 대조군 피험체로부터 나온 정상 자궁경부 또는 질 조직에서 발견되는 박테리아 mRNA 또는 단백질의 평균 발현 수준)으로부터 정량 (quantity)으로 검출가능한 양 (positive) 또는 음 (negative)의 변화를 의미한다. 증가는 통상적으로 적어도 10 %, 또는 적어도 20 %, 또는 50 %, 또는 100 %인 양의 변화이고, 대조군 값의 적어도 2-배, 또는 적어도 5-배, 또는 심지어 10-배만큼 높을 수 있다. 유사하게, 감소는 통상적으로 적어도 10 %, 또는 적어도 20 %, 30 %, 또는 50 %인 음의 변화이고, 대조군 값의 적어도 80 %, 또는 90 %이다. 비교 기준으로부터의 양적인 변화 또는 차이를 나타내는 다른 용어, 예를 들면, "더 (more)", "덜 (less)", "더 높은 (higher)", 더 낮은 (lower)"은 본 명세서에서 전술된 바와 같이 동일한 방법으로 사용된다. 대조적으로, 용어 "실질적으로 동일 (substantially same)", 또는 "실질적으로 변화 없는 ( substantiallly lack of change)"는 통상적으로, 표준 대조군의 ± 10 % 이내, 또는 ± 5 %, 2 % 이내, 또는 심지어 표준 대조군으로부터 더 작은 변화인, 표준 대조군 값으로부터 값의 변화가 거의 없거나 없는 것을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 "폴리뉴클레오티드 혼성화 방법 ( polynucleotide hybridization method)"는 적절한 혼성화 조건 하에서, 알려진 서열의 폴리뉴클레오티드 프로브와 왓슨-크릭 염기-쌍을 형성할 수 있는 능력에 기반한 미리-결정된 폴리뉴클레오티드 서열의 존재 및/또는 양을 검출하는 방법을 의미한다. 이러한 혼성화 방법의 예는 서던 블랏, 노던 블랏, 인 시투(in situ) 혼성화를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "프라이머 (primers)"는 특정 박테리아 유전자 또는 그 일부에 대해서 관심있는 유전자, 예를 들어 cDNA 또는 게놈 서열에 대응되는 폴리뉴클레오티드 서열에 기반한 뉴클레오티드 서열을 증폭하기 위해서, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)과 같은 증폭 반응에 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 통상적으로, 폴리뉴클레오티드 서열의 증폭을 위한 PCR 프라이머의 적어도 하나는 그 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 서열-특이적이다. 상기 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 소스, 및 사용되는 방법을 포함하는 많은 요소에 의존할 것이다. 예를 들면, 진단 및 예후 적용을 위해, 표적 서열의 복잡성에 의존하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 비록 더 적은 뉴클레오티드 또는 더 많은 뉴클레오티드를 포함할 수 있을지라도, 통상적으로 적어도 10, 또는 15, 또는 20, 또는 25 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 프라이머의 적절한 길이를 결정하는 것과 관련된 요인은 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 용이하게 알려져 있다. 본 명세서에서, 용어 "프라이머 쌍 (primer pair)"은 반대 가닥 표적 DNA 분자, 또는 증폭될 뉴클레오티드 서열에 플랭크되는 표적 DNA의 영역에 혼성화하는 프라이머의 쌍을 의미한다. 본 명세서에서, 용어 "프라이머 부위 (primer site)"는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA 또는 다른 핵산의 영역을 의미한다.

"표지 (label)", "검출가능한 표지 (detectable label)", 또는 "검출가능한 모이어티 (detectable moiety)"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적, 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출가능한 조성물이다. 예를 들면, 유용한 표지는 ³²P, 형광 염료, 전자-밀도 시약 (electron-dense reagents), 효소 (예를 들어, ELISA에서 통상적으로 사용되는), 비오틴, 디곡시제닌 (digoxigenin), 또는 합텐 (haptens) 및 예를 들면, 펩티드에 방사성 물질을 도입함으로써, 또는 펩티드와 특이적으로 반응하는 항체를 검출하기 위해 사용되는, 검출 가능하게 만들어진 단백질을 포함한다. 통상적으로 검출 가능한 표지는 프로브의 존재 (및 그러므로 그의 결합 표적)를 용이하게 검출 가능하게 하기 위해, 정의된 결합 특성을 갖는 프로브 또는 분자 (예를 들면, 알려진 결합 특이성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)에 부착된다.

본 명세서에서 사용된 "표준 대조군 (standard control)"은 확립된 정상 조직 시료, 예를 들어 정상 자궁경부 조직 시료에 존재하는 특정 박테리아속, 박테리아 폴리뉴클레오티드 또는 박테리아 폴리펩티드에 속하는 박테리아의 미리 결정된 양 또는 농도를 나타낸다. 상기 표준 대조군 값은 본 발명의 방법의 사용에 적당하며, 검정 시료에 존재하는 특정 박테리아 속, mRNA 또는 단백질의 양을 비교하기 위한 기준으로 제공된다. 표준 대조군으로서 제공되는 확립된 시료는 통상적으로 정의된 바와 같이, 예를 들면 닫혀진 자궁경부 또는 정상 길이의 자궁경부를 갖는 평균의 건강하고 임신한 사람의 자궁경부 조직 시료에 대해 통상적인 상기 박테리아 속, mRNA 또는 단백질의 평균 양을 제공한다. 표준 대조군 값은 상기 시료의 특성, 시료 수집 방식, 뿐만 아니라 이러한 대조군 값의 확립에 기초가 된 상기 피험체의 성별, 연령, 인종과 같은 기타 요인 (임신한 여성의 경우에, 임신 주수)에 따라서 다양할 수 있다.

종래에 정의된 바와 같이, 임신하였지만, 유해 임신 또는 신생아 결과를 가질 위험을 갖지 않는 사람을 서술하는 문맥에서 사용된 용어 "평균 (average)"은 유해 임신 또는 신생아 결과를 가질 임의의 위험을 갖지 않는 임신한 사람의 무작위적으로 선택된 그룹을 대표하는, 상기 사람의 자궁경부에서 발견되는 특정 특성, 특히 하나 이상의 특정 박테리아 분류군의 양을 의미한다. 상기 선택된 그룹은, 상기 개체들 중 자궁경부내 특정 분류군의 박테리아의 평균 양이 합리적인 정확성으로, 건강하고, 정상적인 임신한 사람의 일반적인 개체 중 상기 분류군의 박테리아의 상응하는 양을 반영하도록 충분한 사람의 수를 포함해야 한다. 또한, 임신한 사람의 선택된 그룹은 일반적으로 유해 임신 또는 신생아 결과를 가질 위험의 지시로 자궁경부 조직 시료가 시험되는 피험체와 유사한 임신 주수를 갖는다. 더욱이, 연령, 동일하거나 또는 유사한 종류의 중재시술을 받은 상태 (예를 들어, 페서리/원형결찰 중재시술), 인종, 병력과 같은 기타 요인이 또한 고려되고, 바람직하게, 시험 피험체와 "평균" 값을 확립하는 개체의 선택된 그룹의 프로파일들 사이에 긴밀하게 매칭된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "양 (amount)" 또는 "수준 (level)"은 시료 중에 존재하는 관심있는 박테리아 분류군, 관심있는 박테리아 폴리뉴클레오티드 또는 관심있는 박테리아 폴리펩티드의 정량(quantity)을 의미한다. 이러한 정량은 절대적인 용어, 즉, 상기 시료 중 상기 박테리아 분류군, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 총 정량, 또는 상대적인 용어, 즉, 상기 시료 중 상기 박테리아 분류군, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 농도로 표현될 수 있다.

용어 "피험체 (subject)"는 유해 임신 결과 또는 신생아 결과를 가질 가능한 위험에 의해서 의학적 집중이 요구되는 개체, 예를 들어 임의의 임신한 개체를 포함한다. 피험체는 또한 이전 임신 중에 유해 임신 또는 신생아 결과를 가졌던 개체를 포함한다.

발명의 상세한 설명

I. 도입

본 발명은 진행성 자궁경부 확장/자궁경부 단축을 가진 여성의 자궁경부 면봉법 시료 중 차별적으로 풍부한 박테리아 분류군을, 상기 해당하는 증상을 갖지 않는 적당하게-매칭된 여성으로부터 적당하게-제어된 시료에서의 박테리아 분류군과 비교하여 발견된 것에 일부 기반한다. 특정 박테리아 분류군 (예를 들어, 메가스패라 세레비지애, 알로스카르도비아 옴니콜렌스, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 파르비박터 새시콜라, 락토바실루스 카제이, 베일로넬라 몬트펠리에렌시스, 아내로코쿠스 세네갈렌시스, 불레이디아 엑스트룩타, 미코플라스마 호미니스, 프로피오니미크로비움 림포필룸, GenBank 수탁번호 제JQ781443.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 92 %의 서열 동일성을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 코리네박테리움 피루비시프로듀센스, 메가스패라 세레비지애, 아시디필라 로세아, 무르도시엘라 아사카로리티카, GenBank 수탁번호 제JF295520.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 호와르델라 우레일리티카, 악티노바쿨룸 사알리이, 펩토니필루스 두에르데니이, 파스티디오시필라 산구이니스, 스내티아 산구이네겐스, 파르비모나스 미크라, 펩토니필루스 라크리말리스, 표 4A, 4C 및 8에서 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 의해서 특정된 박테리아 분류군, 및 표 4E, 4G 및 9에서 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한 가장 가까운 종 분류에 의해서 특정된 박테리아 분류군)으로부터 박테리아의 증가된 수준은 또한 유해 임신 또는 신생아 결과, 예를 들어, < 34주의 조기 출산 (예를 들어, 자연 조기 출산), < 37주의 조기 출산 (예를 들어, 자연 조기 출산), 생물학적 시료가 채취된 후에 기간내에 분만 (예를 들어, 1 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일, 56 일, 84 일, 112 일, 140 일, 168 일, 196 일), 임상적 중재시술이 실시된 후 기간내 분만 (예를 들어, 1 일, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일, 56 일, 84 일, 112 일, 140 일, 168 일, 196 일), 1분에 아프가 점수 <7, 5분에 아프가 점수 <7, 융모양막염 (예를 들어, 임상적 또는 병리적), 호흡 곤란 증후군, 기관지폐형성이상, 뇌실내 출혈, 출산 후 7일내 신생아 사망, 및 신생아 패혈증의 위험을 예측한다.

II. 일반적 방법론

본 발명을 실시하는 것은 분자 생물학 분야의 통상적인 기법을 활용한다. 본 발명에서 일반적 사용 방법을 개시하는 기본적인 교과서는 Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))를 포함한다.

핵산에 대해서, 크기는 킬로베이스 (kb) 또는 염기쌍 (bp)으로 제시된다. 이들은 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동으로부터, 시퀀싱된 핵산으로부터, 또는 공개된 DNA 서열로부터 유래된 추정치이다. 단백질에 대하여, 크기는 킬로달톤 (kDa) 또는 아미노산 잔기 수로 제시된다. 단백질 크기는 겔 전기영동으로부터, 시퀀싱된 단백질로부터, 유래된 아미노산 서열로부터, 또는 공개된 단백질 서열로부터 추정된다.

상업적으로 이용가능하지 않은 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett . 22:1859-1862 (1981)에 의해 처음으로 서술된 고체상 포스포아미디트 트리에스테르법 (phosphoramidite triester method)에 따라, Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)에 서술된 바와 같이 자동화된 합성기(synthesizer)를 사용하여, 화학적으로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 정제는 기술분야에 인식된 전략, 예를 들어, Pearson and Reanier, J. Chrom . 255: 137-149 (1983)에 기술된 바와 같이 네이티브 아크릴아미드 겔 전기 영동 또는 음이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 수행된다.

III. 조직 시료의 획득 및 박테리아 분류군의 분석

본 발명은 유해 임신 결과 또는 신생아 결과, 예를 들어 조기 산통 및 조기 분만을 가질 위험을 평가하는 수단으로 임신한 여성의 자궁경부 또는 질, 특히 자궁경부 면봉법 또는 질 면봉법 시료에서 발견되는 특정 박테리아 분류군의 박테리아의 양을 측정하는 것에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명을 실시하기 위한 제1 단계는 시험 피험체로부터 자궁경부 또는 질 조직 시료를 수득하여, 상기 시료 중 포함된 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA가 분석될 수 있다. 일부 구현예에서, 임신한 여성의 자궁경부 또는 질에서 발견되는 특정 박테리아 분류군의 박테리아의 양이 자궁경부 또는 질에서 유래되지 않은 생물학적 시료 중 특정 박테리아의 양에 의해서 나타낼 수 있다.

A. 생물학적 시료의 획득 및 제조

생물학적 시료, 예를 들어, 자궁경부 또는 질 조직, 자궁경부 점액, 양수 또는 모체 혈액이 본 발명의 방법을 사용하여 시험되고 모니터될 사람으로부터 입수된다. 개체로부터 자궁경부 또는 질 상피 세포, 자궁경부 점액, 양수 또는 모체 혈액 (예를 들어, 모체 전혈, 모체 혈청 및/또는 모체 혈장)의 수집은 표준 프로토콜 병원 또는 진료소에 따라서 실시되고, 일반적으로 자궁경부 스크리닝 도중에 실시된다. 자궁경부 또는 질 상피, 긁어낸 세포 (scraped cells), 점액, 및/또는 생체액의 적당한 양이 수집되고, 부가적인 제조 이전에 표준 절차에 따라 보관될 수 있다.

본 발명에 따라 임신한 환자의 시료에서 발견되는 박테리아의 분석은 시료에서 발견된 예를 들어 세포, 조직, 점액 또는 체액을 사용하여 실시될 수 있다. 핵산 추출을 위한 세포, 조직, 또는 체액 시료의 제조 방법은 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 피험체의 자궁경부 또는 질 점액 시료가 상기 시료 중 박테리아 DNA 또는 RNA가 분석될 수 있도록 처리될 수 있다.

B. DNA의 추출 및 정량화

생물학적 시료로부터 박테리아 DNA를 추출하는 수많은 방법이 있다. 생물학적 시료로부터 DNA를 추출하는 방법은 잘 알려져 있으며, 분자 생물학 분야에서 일반적으로 실시될 수 있고, 예를 들어 Sambrook and Russell, supra를 참조한다. RNA 오염은 DNA 분석을 방해하는 것을 피하기 위해서 제거되어야 한다. 용해 완충액 (lysis buffer) 및 뮤타노리신 (mutanolysin) 및 프로테이나제 K (proteinase K)를 포함하는 효소에 의한 생물학적 시료의 사전 처리가 또한 추출 전에 사용될 수 있다. 표적 DNA를 검출하는 방법은 PCR 분석, 형광 표지에 의한 정량적 분석 또는 서든 블랏 (Southern blot) 분석을 포함한다. 상기 표적 DNA는 16S 리보좀 RNA (16S rRNA 유전자)를 인코딩하는 유전자, 또는 특정 박테리아 분류군에 의해서 소유된 관심있는 기타 유전자 또는 게놈 서열일 수 있다.

다양한 폴리뉴클레오티드 증폭 방법이 잘 확립되고, 종종 연구에 사용된다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 증폭을 위한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)의 일반적 방법은 당분야에 잘 알려져 있으므로, 본원에서 상세하게 서술하지 않았다. PCR 방법, 프로토콜 및 프라이머를 디자인하는 원리의 검토를 위해서, 예를 들어 Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990을 참조한다. PCR 시약 및 프로토콜은 또한 상업적 판매자 (commercial vendors), 예를 들어 Roche Molecular Systems로부터 이용가능하다.

비록 PCR 증폭이 통상적으로 본 발명을 실시하는데 사용될지라도, 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면 관련 게놈 서열의 증폭이 임의의 알려져 있는 방법, 예를 들어 리가제 연쇄 반응 (LCR), 전사-매개 증폭, 및 자가-유지 서열 복제 또는 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA)에 의해서 실시될 수 있고, 상기 각각은 충분한 증폭을 제공한다는 것을 인식할 것이다. 더 최근에 개발된 가지-DNA 기법 (branched-DNA techonology)이 또한 특정 박테리아 mRNA 마커의 양을 정량적으로 측정하기 위해서 사용될 수 있다. 임상 시료 중 핵산 서열의 직접적인 정량화를 위한 가지-DNA 신호 증폭의 상세한 서술을 위해, 예를 들어, Nolte, Adv . Clin . Chem . 33:201-235, 1998를 참조한다.

폴리뉴클레오티드 서열 측정을 위한 기법이 또한 관련 연구 분야에서 잘 확립되고 널리 실시된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 시퀀싱에 대한 기본적 원리 및 일반적 기법이 분자 생물학 및 재조합 유전학에 대한 다양한 연구 보고서 및 논문에 개시되었고, 예를 들어 Wallace et al., supra; Sambrook and Russell, supra, and Ausubel et al., supra 가 있다. DNA 시퀀싱 방법은 일상적으로 연구 실험실에서 수동 또는 자동으로 실시될 수 있으며, 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 실시하기 위한 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는데 적당한 부가적인 수단은, 이에 한정되는 것은 아니지만 질량 분석법, 프라이머 신장반응 (primer extension), 폴리뉴클레오티드 혼성화, 실시간 PCR, 용융 곡선 분석 (melting curve analysis), 고해상도 용융 분석 (high resolution melting analysis), 헤테로듀플렉스 분석 (heteroduplex analysis), 대규모 병렬 시퀀싱 (예를 들어, 차세대 시퀀싱 (next-gen sequencing)), 및 전기영동을 포함한다.

C. RNA의 추출 및 정량화

당분야의 통상의 지식을 가진 자라면 생물학적 시료로부터 박테리아 RNA를 추출하기 위한 다수의 방법이 있다는 것을 알고 있다. RNA 제조의 일반적인 방법 (예를 들어, Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., 2001에 개시됨)은 다음과 같을 수 있다; 다양한 상업적으로 이용가능한 시약 또는 키트, 예를 들면, 티리졸 (Trizol) 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA), Oligotex Direct mRNA 키트 (Qiagen, Valencia, CA), RNeasy Mini 키트 (Qiagen, Hilden, Germany), 및 PolyATtract® Series 9600™ (Promega, Madison, WI)가 또한 시험 피험체의 생물학적 시료로부터 mRNA를 입수하기 위해 사용될 수 있다. 이들 방법들의 하나 이상의 조합이 또한 사용될 수 있다.

모든 오염된 DNA가 RNA 조제로부터 제거되는 것이 필수적이다. 그러므로, 증폭 및 정량화 단계에서 DNase의 처리를 통한, 시료의 주의 깊은 조작, 및 적절한 음성 대조군이 사용되어야 한다.

D. RNA 수준의 PCR -기반 정량화 측정

일단 RNA가 시료로부터 추출되면, 특정 박테리아 분류군의 박테리아에 의해서 발현되는 관심있는 임의의 RNA 전사물의 양이 정량화될 수 있다. 예를 들면, 특정 박테리아 분류군, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만, 메가스패라 세레비지애, 알로스카르도비아 옴니콜렌스, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 파르비박터 새시콜라, 락토바실루스 카제이, 베일로넬라 몬트펠리에렌시스, 아내로코쿠스 세네갈렌시스, 불레이디아 엑스트룩타, 미코플라스마 호미니스, 프로피오니미크로비움 림포필룸, GenBank 수탁번호 제JQ781443.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 92 %의 서열 동일성을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 코리네박테리움 피루비시프로듀센스, 메가스패라 세레비지애, 아시디필라 로세아, 무르도시엘라 아사카로리티카, GenBank 수탁번호 제JF295520.1호의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90 %의 서열 동일성을 갖는 배양되지 않은 박테리아, 호와르델라 우레일리티카, 악티노바쿨룸 사알리이, 펩토니필루스 두에르데니이, 파스티디오시필라 산구이니스, 스내티아 산구이네겐스, 파르비모나스 미크라, 펩토니필루스 라크리말리스, 표 4A, 4C 및 8에서 16S rRNA 뉴클레오티드 서열에 의해서 특정된 박테리아 분류군, 및 표 4E, 4G 및 9에서 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한 가장 가까운 종 분류에 의해서 특정된 박테리아 분류군에 대한 16S 리보좀 RNA (rRNA)의 양이 검출되고, 또한 측정될 수 있다. RNA 전사물 수준을 측정하기 위한 바람직한 방법은 증폭-기반 방법, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 특히 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)이 있다.

증폭 단계 이전에, 관심있는 박테리아 RNA 전사물의 DNA 사본 (cDNA)가 합성되어야 한다. 상기는 역전사에 의해 달성될 수 있으며, 이는 개별 단계로서, 또는 균질한 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)에서 RNA를 증폭하기 위한 폴리머라제 연쇄 반응의 변형을 실시할 수 있다. 리보핵산의 PCR 증폭을 위해 적합한 방법은 Romero and Rotbart in Diagnostic Molecular Biology: Principles and Applications pp.401-406; Persing et al., eds., Mayo Foundation, Rochester, MN, 1993; Egger et al., J. Clin . Microbiol . 33:1442-1447, 1995; 및 미국특허 제5,075,212호에 의해 개시된다.

PCR의 일반적 방법이 기술분야에 잘 알려져 있으므로, 본 명세서에서 상세하게 개시하지 않는다. PCR 방법, 프로토콜, 및 프라이머를 디자인하는 원리의 검토를 위해, 예를 들면, Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990를 참조한다. PCR 시약 및 프로토콜이 또한 상업적 판매사인, 예를 들면, Roche molecular systems으로부터 이용가능하다.

PCR은 열안정성 효소 (thermostable enzyme)로 자동화된 과정으로 가장 일반적으로 수행된다. 이 과정에 있어서, 반응 혼합물의 온도는 변성 영역, 프라이머 어닐링 영역, 및 신장 반응 영역을 통해 자동적으로 순환된다. 상기 목적을 위해 특이적으로 적용된 장치는 상업적으로 이용가능하다.

표적 RNA의 PCR 증폭이 통상적으로 본 발명의 실시에 사용될지라도, 당 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 상기 시료 중 이들 박테리아 RNA 종의 증폭이 임의의 알려진 방법, 예를 들면, 리가제 연쇄 반응 (LCR), 전사-매개 증폭, 및 자가-유지 서열 복제 또는 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA)에 의해서 달성될 수 있고, 각각은 충분한 증폭을 제공한다는 것을 인식할 것이다. 더 최근에 개발된 가지-DNA 기법이 또한 특정 박테리아 RNA 마커의 양을 정량적으로 측정하는데 사용될 수 있다. 임상 시료 중 핵산 서열의 직접적인 정량화를 위한 가지-DNA 신호 증폭의 검토를 위해 Nolte, Adv . Clin . Chem . 33:201-235, 1998를 참조한다.

E. DNA 및 RNA에 대한 기타 정량화 방법

관심있는 박테리아 DNA 또는 RNA 전사물이 또한 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는 다른 표준 기법을 사용하여 검출될 수 있다. 검출 단계가 통상적으로 증폭 단계 이후에 진행되나, 증폭 단계는 본 발명의 방법에서 요구되지 않는다. 예를 들면, 상기 DNA 또는 RNA는 증폭 단계가 선행되는지 여부에 상관없이, 크기 분획법 (size fractionation) (예를 들어, 겔 전기영동)에 의해 확인될 수 있다. 잘 알려진 기법 (예를 들면, Sambrook and Russell, supra)에 따라 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 중, 에티디움 브로미드 (ethidium bromide)로 표지된 시료를 작동시킨 후에, 표준 비교로서 동일한 크기의 밴드의 존재는 표적 DNA 또는 RNA의 존재의 지시가 되고, 이것의 양은 이후에 밴드의 강도에 기반하여 대조군과 비교될 수 있다. 대안으로서, 관심있는 상기 DNA 또는 RNA에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브가 이러한 DNA 또는 RNA 종의 존재를 검출하고, 프로브에 의해 주어진 신호의 강도에 기반하여, 표준 비교 대비 DNA 또는 RNA의 양을 나타내는데 사용될 수 있다.

서열-특이적 프로브 혼성화는 핵산의 다른 종을 포함하는 특정 핵산의 검출의 잘 알려진 방법이다. 충분하게 엄격한 혼성화 조건 하에서, 프로브는 실질적으로 상보적인 서열과만 특이적으로 혼성화한다. 상기 혼성화 조건의 엄격성은 서열 미스매치의 다양한 양을 용인하기 위해 완화될 수 있다.

용액상, 고체상, 또는 혼합상 혼성화 분석을 포함하나 그에 한정되지 않는 다수의 혼성화 방식이 기술 분야에 잘 알려졌다. 다음의 문헌은 다양한 혼성화 분석 방식의 개괄을 제공한다: Singer et al., Biotechniques 4:230, 1986; Haase et al., Methods in Virology, pp. 189-226, 1984; Wilkinson, In situ Hybridization, Wilkinson ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford; 및 Hames and Higgins eds., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, 1987.

상기 혼성화 복합체는 잘 알려진 기법에 따라 검출된다. 표적 핵산, 즉, RNA 또는 증폭된 DNA에 특이적으로 혼성화할 수 있는 핵산 프로브가 혼성화된 핵산의 존재를 검출하는데 통상적으로 사용되는 다수의 방법 중 어느 하나에 의해 표지될 수 있다. 하나의 통상적인 검출 방법은 ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, 또는 ³²P 등으로 표지된 프로브를 사용하는 자동방사선 (autoradiography)의 사용이다. 방사성 동위원소의 선택은 선택된 동위원소의 합성의 용이성, 안정성, 및 반감기에 의한 연구 선호도에 의존한다. 다른 표지는, 형광단 (fluorophore), 화학 발광제, 및 효소로 표지된 항리간드 또는 항체에 결합하는 화합물 (예를 들어, 비오틴 및 디곡시제닌)을 포함한다. 대안으로서, 프로브가 표지, 예를 들면, 형광단, 화학 발광제, 또는 효소와 직접적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 표지의 선택은 요구된는 감수성, 프로브와 컨쥬게이션의 용이성, 안정성 요건, 및 이용가능한 장치에 의존한다.

본 발명을 실시하기 위해 필요한 프로브 및 프라이머가 잘 알려진 기법을 사용하여 합성되고 표지될 수 있다. 프로브 및 프라이머로 사용된 올리고뉴클레오티드는 Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168, 1984에 개시된 바와 같은 자동화된 합성기를 사용하여, Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts., 22:1859-1862, 1981에 의해 처음 서술된 고체상 포스포아미디트 트리에스테르법에 따라 화학적으로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 정제는 Pearson and Regnier, J. Chrom ., 255:137-149, 1983에 개시된 바와 같이, 네이티브 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 음이온-교환 HPLC에 의한 것이다.

F. 증폭 및 서열 분석

증폭 반응이 서열 분석 이전에 실시될 수 있다. 다양한 폴리뉴클레오티드 증폭 방법이 잘 확립되었고, 종종 연구에 사용된다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 증폭에 대한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)의 일반적인 방법이 당분야에 잘 알려져 있으므로, 본원에서는 상세하게 서술하지 않았다. PCR 방법, 프로토콜 및 프라이머를 디자인하는 원리의 검토를 위해서, 예를 들어, Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990을 참조한다. PCR 시약 및 프로토콜이 또한 상업적 판매자인, 예를 들어 Roche Molecular Systems으로부터 이용가능하다.

폴리뉴클레오티드 서열 측정을 위한 기법이 또한 관련 연구 분야에서 잘 확립되고 널리 실시된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 시퀀싱에 대한 상기 기본적 원리 및 일반적 기법이 분자 생물학 및 재조합 유전학에 대한 다양한 연구 보고서 및 논문에 개시되었고, 예를 들어 Wallace et al., supra; Sambrook and Russell, supra, and Ausubel et al., supra 가 있다. DNA 시퀀싱 방법은 일상적으로 연구 실험실에서 수동 또는 자동으로 실시될 수 있으며, 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 실시하기 위해 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 적당한 부가적인 수단은, 이에 한정되는 것은 아니지만 질량 분석법, 프라이머 신장 반응, 폴리뉴클레오티드 혼성화, 실시간 PCR, 용융 곡선 분석, 고해상도 용융 분석, 헤테로듀플렉스 분석, 대규모 병렬 시퀀싱 및 전기영동을 포함한다.

IV. 표준 대조군의 확립

본 발명의 방법을 실시하기 위해 특정 시료 형태 (예를 들어, 자궁경부 면봉법 또는 질 면봉법)에 대한 표준 대조군을 확립하기 위해서, 건강한 임신한 여성, 유해 임신 결과 또는 신생아 결과의 위험을 갖지 않은 임신한 여성, 또는 그 임신의 정상 시간 프레임내에 분만한 것으로 나중에 확인된 임신한 여성의 그룹이 종래에 정의된 바와 같이, 먼저 선택된다. 예를 들면, 상기 그룹은 만기 진통 및 분만한 임신한 여성의 그룹을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 임신한 여성의 그룹은 임상적 중재시술, 예를 들어 원형결찰 또는 페서리 이후에 만기 진통 및 분만을 가질 수 있다. 이들 개체는 본 발명의 방법을 사용하여 유해 임신 결과의 위험을 스크리닝 및/또는 모니터하기 위해 이용가능하다면 적당한 파라미터내에 있다. 예를 들어, 상기 개체들은 유사한 임신 주수 및 비슷한 건강한 상태를 가질 수 있다. 선택적으로 상기 개체는 유사한 나이 또는 유사한 인종 배경을 갖는다.

선택된 개체의 정상 분만 시간은 나중에 확인될 것이고, 정상 분만 시간 프레임보다 이르게 또는 늦게 출산을 한 것으로 판명된 선택된 개체들 중 어느 개체는 "표준 대조군"으로서 데이터를 제공하기 위한 그룹으로부터 배제될 것이다.

선택된 개체의 건강 상태는 잘 확립되고, 일상적으로 사용되는 방법으로, 이에 한정되는 것은 아니지만, 개체의 일반 신체 검사 및 이들 병력의 일반적 검토에 의해서 확인된다.

또한, 상기 건강한 개체의 선택된 그룹은 상기 그룹으로부터 입수된 자궁경부 조직 시료 중 하나 이상의 박테리아 분류군의 박테리아의 평균 양/농도가 건강한 임신한 여성의 일반적인 집단 중 정상 또는 평균 수준의 대표로서 합리적으로 간주될 수 있도록 합리적인 크기를 가져야 한다. 바람직하게, 상기 선택된 그룹은 적어도 10명의 임신한 인간 피험체를 포함한다.

일단 하나 이상의 분류군의 박테리아에 대한 평균 값이 상기 선택된 건강한 대조군의 각 피험체에서 발견된 개별 값에 기반하여 확립되고 나면, 상기 평균 또는 중간값 또는 대표값 또는 프로파일이 표준 대조군으로 간주된다. 표준 편차가 또한 동일한 과정 중에 결정된다. 일부 사례에 있어서, 개별 표준 대조군이 구별된 특성, 예를 들어, 연령, 임신 주수, 또는 인종 배경을 갖는 개별적으로 정의된 그룹에 대하여 확립될 수 있다.

V. 자궁경부 미생물총 점수 ( microbiome score)에 기반하여 유해 임신 또는 신생아 결과의 위험 예측

*본원에 개시된 방법을 사용하여, 임신한 피험체가 유해 임신 결과, 예를 들어, 현재 임신에서 34주 이전 자연 조기 출산 또는 출산을 가질 가능성을 갖는지 여부를 예측할 수 있다. 마찬가지로, 비-임신한 피험체가 미래 임신에서 유해 임신 결과를 가질 가능성을 갖는지 여부를 예측할 수 있다. 일부 구현예에서, 각 피험체에 있어서, 적어도 1, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 박테리아 분류군에 속하는 박테리아의 풍도 수준이 자궁경부 미생물총 점수를 산출하기 위해 사용될 수 있다. 상기 피험체의 점수는 상기 표준 대조군의 점수에 의해서 확립된 절단값 (cut-off value)과 비교될 수 있고, 상기 임신한 피험체가 유해 임신 결과를 갖는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 박테리아는 적어도 3, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 박테리아 분류군에 속한다. 일부 사례에서, 상기 박테리아는 스내티아 산구이네겐스, 파르비모나스 미크라, 우레아플라스마 우레아리티쿰 (또는 우레아플라스마 파르붐), 아토포비움 바기내, 펩토니필루스 라크리말리스, 메가스패라 세레비지애 및 파르비박터 새시콜라를 포함한다. 다른 사례에서, 파르비모나스 미크라, 우레아플라스마 우레아리티쿰 (또는 우레아플라스마 파르붐), 아토포비움 바기내, 펩토니필루스 라크리말리스, 메가스패라 세레비지애 및 파르비박터 새시콜라의 풍도 수준이 상기 피험체에 대해 자궁경부 미생물총 점수를 산출하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 선택된 박테리아 분류군에 대한 각 log₁₀(풍도) 값이 선형 스케일로 변환될 수 있고, 그 후 함께 부가되고, 이후에 상기 전체 값이 log-변환되고, 상기 log₁₀ 스케일로 자궁경부 미생물총 점수로 표시된다. 일부 예에서, 1.15 초과의 자궁경부 미생물총 점수는 상기 임신한 피험체가 자연 조기 출산의 위험에 있다는 것을 나타낸다. 일부 사례에서, 상기 임신한 피험체는 중재시술, 예를 들어 원형결찰 또는 페서리 이후에 자연 조기 출산의 위험에 있다. 일부 구현예에서, 1.15 초과의 자궁경부 점수는 상기 임신한 피험체가 약 37.0 주 미만, 예를 들어 약 36.5 주, 약 36.0 주, 약 35.0 주, 약 34.0 주, 약 33.0 주, 약 32.0 주, 약 31.0 주, 약 30.0 주, 약 29.0 주, 약 28.0 주, 약 27.0 주, 약 26.0 주, 약 25.0 주, 약 24.0 주, 약 23.0 주, 약 22.0 주, 약 21.0 주, 또는 그 미만에서 분만의 증가된 가능성을 갖는 것을 나타낼 수 있다.

일부 구현예에서, 각 생물학적 시료에 있어서, 박테리아 분류군의 풍도 수준은 관련 분류군에 대해 특이적인 폴리뉴클레오티드 서열을 표적으로 하는 정량적 PCR 분석 또는 서열-특이적 혼성화 분석에 의해서 측정된다. 다른 구현예에서, 각 생물학적 시료에 있어서, 박테리아 분류군의 풍도 수준이 개별적 분류군의 프록시 (proxy)로 제공되는 마커 유전자 서열의 대규모 병렬 시퀀싱에 의해서 측정된다. 일부 예에서, 시료 중 박테리아 분류군의 풍도 수준은 관련 분류군을 나타내는 16S 리보좀 RNA (rRNA) 유전자 서열의 정규화 판독 계수이다. 일부 사례에서, 상기 정규화 판독 계수가 시료들 사이의 기술적 변수, 예를 들어 시료당 상이한 시퀀싱 깊이, 또는 시료당 상이한 라이브러리 크기를 최소화하기 위해서 확립된 정규화 방법을 사용하여 원 판독 계수 (raw read counts)로부터 산출된다. 일부 사례에서, 박테리아 분류군의 풍도 수준이 log₁₀ 스케일로 표시된다.

일부 구현예에서, 박테리아 분류군의 선택된 그룹의 풍도 (예를 들어, 닫혀진 자궁경부에서보다 확장된 자궁경부에서 현저하게 더 풍부한 분류군)가 덧셈 또는 곱셈에 의해서 조합되어, 자궁경부 미생물총 점수를 제공하며, 이는 실시예 2에서 LA6 값으로 개시된다. 다른 구현예에서, 상기 점수는 3단계로 산출된다: (a) 박테리아 분류군의 하나의 서브-선택된 그룹의 풍도 수준 (예를 들어, 닫혀진 자궁경부에서보다 확장된 자궁경부에서 현저하게 더 풍부한 분류군)이 덧셈 또는 곱셈에 의해서 조합되는 단계; (b) 분류군의 다른 서브-선택된 그룹의 풍도 수준 (예를 들어, 확장된 자궁경부에서보다 닫혀진 자궁경부에서 현저하게 더 풍부한 분류군)이 덧셈 또는 곱셈에 의해서 조합되는 단계; 및 (c) 상기 자궁경부 미생물총 점수가, 분류군의 제1 선택된 그룹의 합계 또는 곱과, 분류군의 제2 서브-선택된 그룹의 합계 또는 곱 사이에서 뺄셈 또는 나눗셈에 의해서 산출된다. 다른 구현예에서, 상기 자궁경부 미생물총 점수가 시료 중에 존재하는 선택된 박테리아 분류군의 종류의 수에 근거하여 산출되며, 실시예 1에서 DIBT1 시험, DIBT2 시험 및 DIBT3 시험으로 개시된다. 상기 DIBT1, DIBT2 및 DIBT3 시험에서, 상기 자궁경부 미생물총 점수는 선택된 박테리아 분류군의 수이며, 1 이상의 점수를 갖는 피험체는 유해 임신 또는 신생아 결과의 증가된 위험을 나타낸다. 다른 구현예에서, 상기 자궁경부 미생물총 점수는 시료에서 검출된 모든 분류군 중 선택된 박테리아 분류군의 순위에 기반하여 산출된다.

VI. 키트

본 발명은 본원에 기술된 방법을 실시하기 위한 조성물 및 키트를 제공하여, 임신한 피험체에서 하나 이상의 특정 분류군으로부터 박테리아의 수준을 평가하였고, 예를 들어 유해 임신 또는 신생아 결과를 가질 위험을 결정하는 것과 같은 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다.

관심있는 박테리아 분류군의 박테리아의 RNA 수준을 측정하기 위한 분석을 실시하기 위한 키트는 통상적으로 관심있는 코딩 서열의 적어도 하나의 세그먼트 또는 그 상보 서열과 특이적 혼성화에 유용한 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 선택적으로, 상기 올리고뉴클레오티드가 검출가능한 모이어티로 표지된다. 일부 사례에서, 상기 키트는 PCR, 특히 RT-PCR에 의해 관심있는 박테리아 DNA 또는 RNA 전사물의 적어도 하나의 세그먼트의 증폭에 사용될 수 있는 적어도 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있다.

관심있는 박테리아 분류군의 박테리아의 단백질 수준을 측정하기 위해 분석을 실시하기 위한 키트는 통상적으로 상기 표적 단백질 아미노산 서열에 특이적 결합에 유용한 적어도 하나의 항체를 포함한다. 선택적으로, 상기 항체가 검출가능한 모이어티로 표지된다. 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 일부 사례에서, 상기 키트는 적어도 2개의 상이한 항체를 포함할 수 있으며, 하나는 표적 단백질 (즉, 1차 항체)에 특이적 결합하고, 다른 것은 상기 1차 항체를 검출하며 (즉, 2차 항체), 이는 종종 검출가능한 모이어티에 부착된다.

통상적으로, 상기 키트는 또한 적당한 표준 대조군을 포함한다. 상기 표준 대조군은, 유해 임신 또는 신생아 결과를 가질 위험이 없는 건강한 임신한 피험체의 자궁경부 상피에서 특정 박테리아 분류군으로부터 박테리아에 의해서 발현되는 표적 단백질 또는 표적 mRNA의 평균값을 나타낸다. 일부 사례에서, 이러한 표준 대조군은 세트 값 (set value)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 시험 시료를 분석하고, 시험 피험체에서 유해 임신 사례, 예를 들어 조기 분만을 가질 위험을 평가하는 것에 대해 사용자에게 안내하기 위한 지시 매뉴얼을 제공할 수 있다.

실시예

다음의 실시예는 설명의 형태로 제공되는 것이고, 제한의 형태로 제공되는 것이 아니다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면 기본적으로 동일하거나 또는 유사한 결과를 산출하기 위해 변경되거나 또는 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 용이하게 인식할 것이다.

실시예 1. 임신-관련 합병증을 가진 여성의 자궁경부에서 차별적으로 풍부한 박테리아 분류군

배경

진행성 자궁경부 확장 또는 조기 자궁경부 단축을 가진 여성의 임신을 연장하기 위한 시도로 상기 자궁경부를 유지하기 위해서, 임상의는 원형결찰 (Owen, Hankins et al. 2009) 또는 자궁경부 페서리를 실시할 수 있다. 그러나, 원형결찰의 시술에도 불구하고, 양막내 감염과 같은 감염을 가진 여성은 유산, 조기 출산, 막의 파열을 포함하는 유해 임신 결과와 관련된 것을 보였다 (Romero, Gonzalez et al., 1992). 특히, > 또는 = 2 cm의 자궁경부 확장, 손상되지 않은 막을 가지면서, 임신 14주 내지 24주 사이의 능동 진통이 없는 33명의 여성 중, 17명 (51.5 %)이 양막 공간에 미생물이 침투한 것이 발견되었다. 양막 공간에 미생물이 침투한 모든 환자들은 합병증을 가졌다. 양성 양수 배양의 존재하에 자궁경부 원형결찰을 실시한 환자는 양막 파열, 임상적 융모양막염 또는 유산을 겪었다 (Romero, Gonzalez et al., 1992). 그러므로, 원형결찰은 진행성 자궁경부 확장을 갖는 환자의 서브셋 (subset)에 유익하지 않을 수 있다. 일차적으로 전문가의 동의와 의견에 근거하여, 원형결찰 시술은 양막내 감염이 배제된다면 유익할 수 있다고 추천되었다 (American College of Obstetricians and Gynecologists. 2014. Cerclage for the management of cervical insufficiency. Practice Bulletin No. 142. Obstet Gynecol 2014;123:372-9). 유사하게, 페서리 실시 이전에 감염을 배제하는 것이 제안되었으며, 이는 고도 감염 또는 염증 환경 안에 태아가 잡혀서 (trapping), 태아의 뇌성마비 또는 뇌 손상을 포함하는 유해 신생아 결과를 유도할 수 있기 때문이다.

현재, 시료 중 박테리아의 검출은 배양, 현미경검사 및 박테리아종-특이적 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 분석에 의지하며, 낮음에서 중간 감수성만을 제공하므로, 감염을 배제시키는 것에는 좋지 않다. 예를 들면, 호기성 및 혐기성 박테리아 뿐만 아니라 생식기의 미코플라스마에 대한 양수 배양 및 우레아플라스마 우레아리티쿰 및 우레아플라스마 파르붐을 표적으로 하는 PCR을 사용하여, 진행성 자궁경부 확장을 가진 모두 58명의 환자들 중 44명의 환자 (76 %)가 배양과 PCR 모두에 대해서 박테리아의 음성으로 검정되었다 (Oh, Lee et al., 2010). 그러나, 결국 박테리아 음성으로 검정된 상기 여성들 중에, 63 % (15/24)가 융모양막염에 대해 양성이고, 30 % (7/23)가 양막염 (amnionitis)에 대해 양성이며, 25 % (6/24)가 제대염 (funisitis)에 대해 양성이고, 62 % (24/39)가 1분에 아프가 점수가 < 4인 신생아를 분만하였으며, 41 % (18/44)가 출산하고 1일내 사망한 신생아를 분만하였다 (Oh, Lee et al., 2010). 음성 배양 및 PCR 결과에 의해 상기 44명의 환자들 중 염증 및 불량한 신생아 결과의 유병률은, 박테리아에 대해 상기 음성 시험 결과의 다수는 거짓 음성일 수 있다는 것을 제시하였다.

더욱이, 우레아플라스마가 정상의 합병증이 없는 결과의 임신에서도 또한 검출되었다 (Gray, Robinson et al., 1992, Gerber, Vial et al., 2003, Perni, Vardhana et al., 2004). 우레아플라스마는 여성의 생식관에 살고 있는 공생하는 박테리아 또는 정상의 균상 (flora)의 일부이며, 만기 임신 및 정상의 신생아를 생산할 수 있다. 상기는 이전의 많은 연구에서 후보 접근에 의해서 선택된 오직 몇개의 박테리아 종에 대한 검출 한계를 강조한다.

반대로, 본 발명자들은 진행성 자궁경부 확장/단축을 가진 여성과, 이러한 증상을 갖지 않는 여성으로부터 입수된 자궁경부 면봉법 시료들의 각각에서 기본적으로 모든 (> 9,500 종류/알려진 게놈 서열을 갖는 박테리아의 분류군) 존재 및 상대적 풍도를, 16S 리보좀 RNA (rRNA)-기반 대규모 병렬 게놈 시퀀싱을 사용하여 체계적으로 프로파일링하였다. 본 접근법은 이전 연구의 몇가지 한계를 극복하였다. 첫째, 본 접근법은 선택된 후보 목록 뿐만 아니라 기본적으로 모든 박테리아 분류군을 보편적으로 검출할 수 있다. 둘째, 본 접근법은 배양과 독립적이므로, 까다로운 박테리아도 또한 검출될 수 있다. 셋째, 본 접근법은 살아있는 박테리아를 요구하지 않으며, 이는 죽어있거나 또는 살아있는 박테리아로부터 게놈 DNA 단편을 증폭시킬 수 있는 PCR에 기반하기 때문이다. 넷째, 본 접근법은 비-침입성 시료 형태인 자궁경부 면봉법으로 조사하였고, 합병증을 가지고 있거나 또는 갖고 있지 않은 임의의 임신한 여성으로부터 용이하게 입수할 수 있다. 상기는 정상 대조군과 적당하게 매칭시키는 것과, 상기 질환과 대조군 사이의 데이터 비교를 용이하게 하며, 반면에 양수는 태아 손상의 위험이 있는 침입 과정이 필요하므로, 달리 지시하지 않는 한 정상 임신에 대해서 추천되지 않는다. 다섯째, 본 접근법은 임의의 임신 주수에서 임의의 임신한 여성으로부터 용이하게 입수가능한 상기 자궁경부 면봉법을 조사한다. 이는 대조군과의 매칭 뿐만 아니라 가능한 조기에 시료채취가 용이하므로, 검출과 치료를 용이하게 하며, 반면에 양수 또는 태반은 각각 임신 14주차 또는 37주차 이후에 보통 입수된다.

합병증이 없는 "정상 및 건강한" 인간으로부터 많은 해부학적 부위에서 박테리아 커뮤니티를 프로파일링하기 위해서 16S 리보좀 RNA (rRNA)-기반 대규모 병렬 게놈 시퀀싱을 사용하는 많은 공보가 있다. 상기는 비임신 여성 또는 "정상 및 건강한" 임신 여성의 질 면봉법 시료에서 박테리아 커뮤니티에 대한 공보를 포함한다 (Ravel, Gajer et al., 2011; Aagaard, Riehle et al., 2012, Gajer, Brotman et al., 2012). 그러나, 임신 합병증을 가진 여성의 시료는 거의 분석되지 않았다 (Hummelen, Fernandes et al., 2010).

특히, HIV-양성 여성의 질에서 박테리아 커뮤니티에 대한 연구가 하나 있으며, HIV를 갖지 않는 주요 산과 모집단 (obstetric population)에 적용가능한 데이터세트는 제공되지 않았다 (Hummelen, Fernandes et al., 2010). 또 다른 연구로 37주 이전 또는 37주 이후에 분만된 태반 시료에서 박테리아 커뮤니티에 대한 연구가 있으며, 명백하게 임신 주수-매칭된 비교가 용이하지 않으므로, 임신 주수 차이에 의해서 반박되는 데이터세트가 포함되지 않았다 (Aagaard, Ma et al., 2014). 그러므로, 최근까지 이러한 유해 결과를 가진 여성의 자궁경부에서 박테리아 분류군을 체계적으로 프로파일링하고, 또한 이러한 합병증을 갖지 않는 임신 주수-매칭된 여성의 자궁경부에서 박테리아 분류군과 비교하는 공보는 없었다.

본 현재의 연구는 합병증 (진행성 자궁경부 확장 또는 단축)을 가진 임신한 여성의 자궁경부 면봉법 시료에서 박테리아 커뮤니티에 대한 첫번째 체계적이고 상대적으로 포괄적인 프로파일을 제공한다. 더욱이, 처음으로, 본 발명자들은 합병증을 가진 여성에서 박테리아 커뮤니티의 프로파일과, 이러한 합병증을 갖지 않은 임신 주수-매칭된 여성의 프로파일을 체계적으로 비교하였다. 또한, 처음으로, 본 발명자들은 이러한 합병증을 가진 여성의 자궁경부에서 차별적으로 풍부한 박테리아 분류군의 목록을, 이러한 합병증을 갖지 않은 여성의 것과 비교하여, 제공하였다. 이러한 목록의 제공은 임신 자궁경부 (gravid cervix)에서 "정상 균상" 이 아닌, "비정상 균상"을 특별히 표적으로 하기 위한 PCR 분석을 디자인하기 위한 중요한 기본연구이다. 그러므로, 본 발명자들이 본 연구는 진행성 자궁경부 확장-관련 박테리아의 검출을 개선하기 위한 데이터를 제공하는 이유이다.

특히, 임신 13주차 내지 25주차 사이의 박테리아 분류군의 목록의 선택된 멤버의 존재는, 34주 이전 출산 및 뇌실내 출혈을 포함하는 유해 결과와 관련성이 있거나 또는 예측할 수 있다. 그러므로, 또한 본 발명자의 박테리아 분류군의 목록이 상기 유해 결과의 조기 예후를 제공할 수 있어서, 초기에 긴밀한 모니터를 용이하게 하거나 또는 적절한 신생아 치료를 가진 3차 병원으로 이송시킬 수 있다.

본원에 개시된 연구의 목적은 모든 박테리아를 체계적으로 프로파일하고, 진행성 자궁경부 확장 또는 자궁경부 단축을 가진 여성의 자궁경부에서 차별적으로 풍부한 박테리아 분류군의 목록과 그 일부 게놈 서열을 동정하였다. 특히, 본 연구는 (i) 진행성 자궁경부 확장을 가진 여성의 자궁경부 ("확장된 자궁경부")에서 박테리아 분류군을 체계적으로 프로파일링하고, 상기 증상을 갖지 않은 적당하게-매칭된 여성의 자궁경부 ("닫혀진 자궁경부")에서의 박테리아 분류군과 비교하는 단계; (ii) 자궁경부 단축을 가진 여성의 자궁경부 ("단축된 자궁경부")에서 박테리아 분류군을 체계적으로 프로파일링하고, 상기 증상을 갖지 않는 적당하게-매칭된 여성의 자궁경부 ("정상-길이 자궁경부")에서 박테리아 분류군과 비교하는 단계; (iii) 상기 단계 (i)에서 상기 데이터를 사용하여 닫혀진 자궁경부에서 박테리아 분류군에 대해, 확장된 자궁경부에서 차별적으로 풍부한 박테리아 분류군의 목록을 체계적으로 확인하는 단계; 및 (iv) 상기 단계 (ii)에서 상기 데이터를 사용하여 정상-길이의 자궁경부에서 박테리아 분류군에 대해, 단축된 자궁경부에서 차별적으로 풍부한 박테리아 분류군의 목록을 체계적으로 확인하는 단계로 디자인되었다.

본 발명자들은 상기 확장된 자궁경부에 콜로니를 이룬 박테리아 커뮤니티가 정상의 닫혀진 자궁경부에 콜로니를 이룬 박테리아 커뮤니티와 상이하다는 가설을 세웠다. 이러한 가설을 시험하기 위해서, 본 발명자들은 진행성 확장된 자궁경부에서 박테리아 분류군 ("확장된 자궁경부", n=19)과, 정상의 닫혀진 자궁경부에서 박테리아 분류군 ("닫혀진 자궁경부", n=13)을, 16S 리보좀 RNA (rRNA)-기반 대규모 병렬 게놈 시퀀싱을 사용하여 체계적으로 프로파일링하였다. 상기 2개의 그룹들 사이에 차별적으로 풍부한 분류군에 대해 체계적으로 시험하기 위해서, 본 발명자들은 상기 확장된 자궁경부 그룹에서 모든 프로파일된 분류군의 상대 풍도와, 상기 닫혀진 자궁경부 그룹에서 분류군의 상대적 풍도를, 적절한 통계적 절차를 사용하여 비교하였다. 상기 박테리아 분류군의 목록의 멤버가 임의의 유해 임신 또는 신생아 결과를 예측할 수 있는지 여부를 시험하기 위해서, 본 발명자들은 상기 연구를 위한 모집으로부터 출산 후 28일까지 상기 임신을 더 조사하고, 이들이 이용가능할 때마다 상기 결과를 예측하기 위해 감수성, 특이성, 양성 예측값, 음성 예측값을 산출하였다.

유사하게, 본 발명자들은 상기 단축된 자궁경부에서 박테리아 분류군을 체계적으로 프로파일링하고 (n=11), 또한 정상-길이 자궁경부를 가진 임신 주수-매칭된 대조군으로부터의 박테리아 분류군 (n=11)과 비교하였다. 본 발명자들은 또한 상기 단축된 자궁경부와, 정상-길이 그룹 사이의 차별적으로 풍부한 분류군의 목록을 통계적 절차를 사용하여 확인하였고, 상기 임상적 결과를 더 조사하였다. 상기 결과가 이용가능할 때마다. 본 발명자들은 또한 상기 목록의 선택된 멤버에 의해서 예측 성능 (predictive performance)을 평가하였다.

방법 및 결과

참가자의 모집. 본 연구는 각 기관의 검토 위원회로부터 윤리적 승인하에 실시되었고, 시료는 임신한 여성으로부터 수집하였고, 주지된 동의가 있었다. 상기 시험 그룹에서 (확장된 자궁경부 그룹, n = 19), 무통증 진행성 자궁경부 확장 > 0.8 cm 인 임신한 여성만이 모집되었다.

반면에, 참조 그룹에서 (닫혀진 자궁경부 그룹, n = 13), 무통증 진행성 자궁경부 확장 > 0.8 cm 이 없는 임신한 여성만이 모집되었다. 또한, 결과와 임상적 결과의 공정한 비교를 위해서, 상기 시험 그룹과 참조 그룹 모두에서, (i) 임신 34주차 이전에 규칙적이지 않고 빈번하고, 또한 (ii) 자궁경부 원형결찰 시술을 받도록 지시를 받은 여성이 모집되었다. 이러한 32명의 참가자 (상기 확장된 자궁경부 그룹: 19명, 및 닫혀진 자궁경부 그룹: 13명)의 중요 특성이 표 1에 기재되었다.

시험 그룹과 참조 그룹 모두에서, 상기 표현형 (즉, 진행성 자궁경부 확장)을 복잡하게 하는 것을 피하기 위해서, 시료 수집시에 자간전증, 다태아 임신, 태아가사 (fetal distress), 발육 부전 (growth restriction), 염색체 또는 구조적 이상을 포함하는 임신은 제외시켰다. 상기 자궁경부에서 상기 박테리아 커뮤니티에 영향을 주는 일부의 주된 혼란을 주는 요인을 최소화하기 위해서, 시료 수집하기 48 시간 전에 성행위나 임의의 기타 질 용품을 사용한 참가자 (예를 들어, 질 약제 또는 좌약, 질세척), 시료 수집 30일 전에 항생제 또는 항진균제를 사용한 참가자, 또는 난소 종양이 있는 참가자가 또한 제외되었다. 이전에 유산 또는 14주 내지 36주 사이에 출산한 경험이 있는 참가자 (n=3, 모두 확장된 자궁경부 그룹, Fisher 정확도 검정 (exact test, p=0.253), 이전 외과적 유산 또는 임신중절한 참가자 (n=16, 9명의 확장 및 7명의 닫혀짐, p=1.00), 자궁경부 수술한 참가자 (n=6, 2명 확장 및 4명 닫혀짐, p=0.194), 자궁 이상인 참가자 (n=6, 3명 확장 및 3명 닫혀짐, p=0.666), 최근 비정상적인 질분비물이 있는 참가자 (n=5, 4명 확장된 자궁경부 및 1명 닫혀짐, p=0.625)는 우리의 데이터베이스에서 분명하게 기록되었다. 이러한 요인들은 상기 2개의 그룹들 사이에 통계적 유의성이 없지만, 상기 데이터를 해석하기 위해서 포함될 수 있다.

자궁경부 면봉법 시료의 수집 및 DNA 추출: 환경, 상기 임상 스태프, 또는 여성 생식관의 다른 부분에 의한 오염될 기회를 최소화하기 위해서, 상기 자궁경부 면봉법 시료가 Calgiswab Type III (Puritan, Guilford, Maine, USA)를 사용하여, 여성 생식관을 검경 (speculum)에 의해 오픈한 직후 임의의 다른 조치 이전에 수집되었다. 동일한 해부학적 위치에서 시료를 채취하고 비교하기 위해서, 각 자궁경부 면봉법 시료가 외경구의 주변부에서 고정된 위치 (임상의를 대면하는 12시 방향)로부터 수집되었다. 모든 시료에 대해서 공정한 비교를 위한 일관성을 유지하기 위해서, 한명의 임상의가 상기 확장된 자궁경부 그룹과 닫혀진 자궁경부 그룹으로부터 모든 시료를 수집하였다. 상기 수집에 있어서 변화를 최소화하기 위해서, 각 면봉은 360도 한번 회전함으로써 수집되었다. 참가자 또는 그녀의 자궁내 태아 감염의 임의의 증가된 위험을 최소화하기 위해서, 상기 면봉은 상기 자궁경부 점액 플러그 (cervical mucus plug)를 접촉하지 않고 수집되었고, 멸균되었다. 면봉법 시료의 수집 도중에, 외경구 이외에 여성의 생식관의 음순 또는 임의의 부분을 접촉하지 않기 위한 추가의 조치를 취했다. 수술실, 상기 시약 및 수집 절차에서 박테리아의 오염에 대해서 모니터하기 위해서, 다른 음성 대조군 면봉이 상기 환자를 접촉하지 않은 각 자궁경부 면봉과 함께 수집되었다.

상기 자궁경부 면봉 및 음성 대조군 면봉이 멸균되고, 또한 뉴클레아제가 존재하지 않는 물에 침지시키고, - 80 ℃에서 추출때까지 보관하였다. 상기 면봉이 확립된 방법 (Yuan, Cohen et al., 2012의 방법 1)을 사용하여 게놈 DNA에 대해 추출되었고, 여성 생식관에서 일반적으로 발견되는 박테리아 커뮤니티의 공정한 표시로 나타내었다. 상기 방법은 상기 뮤타노리신 (Sigma-Aldrich) 및 컬럼-기반 DNA 추출 방법 (QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen)에 의한 시료의 사전처리를 포함한다. 임의의 배치 변화 (batch variation)를 최소화하기 위해서, 모든 시료가 동일한 날에 추출되었다.

PCR 증폭 및 대규모 병렬 시퀀싱: 상기 자궁경부 면봉법 시료가 박테리아 게놈 DNA 중 인간의 게놈 DNA를 필수적으로 포함하기 때문에, 본 발명자들은 일반적으로 모든 박테리아에 의해서 포함되지만, 인간에 의해서는 포함되지 않는 16S rRNA 유전자를 특별히 증폭시켰다. 기본적인 모든 박테리아의 게놈 DNA 서열의 증폭을 촉진하기 위해서, 본 발명자들은 한쌍의 PCR 프라이머, 즉 V4 및 V5을 사용하기 위해서 선택하였고, 상기는 고도로 보존된 영역 16S rRNA 유전자에 상보적이다 (Claesson, Wang et al. 2010). 본 발명자들은 리보좀 데이터베이스 프로젝트 (RDP) (Wang, Garrity et al. 2007)로, 16S rRNA 서열을 포함하는 가장 큰 공익 데이터베이스 (public database)를 사용하여, 우리가 선택한 한 쌍의 PCR 프라이머가 이론적으로 알려져 있는 16S rRNA 게놈 서열의 > 9,200 타입 (확립된) 박테리아 분류군 중 > 97 %로 이론적으로 증폭될 수 있는지 확인하였다. 그러므로, 상기 한쌍의 PCR 프라이머가 본 연구에서 박테리아 커뮤니티의 체계적이고 편향되지 않은 프로파일링에 적용가능하다.

본 발명자는 각 면봉법 시료로부터 추출된 게놈 DNA를 V4-V5 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 증폭하였고 (Claesson, Wang et al. 2010), 이는 상기 16S rRNA 유전자의 과가변 영역 (hypervariable regions) V4 및 V5에 플랭크 (flank)되었다. 상기 포워드 및 리버스 프라이머의 서열은 각각 5'- [프라이머 A 중요 서열] [MID 서열] AYT GGG YDT AAA GNG-3’ (서열번호: 1) , 및 5'- [프라이머 B-중요 서열] CCG TCA ATT YYT TTR AGT TT-3’(서열번호: 2)이고, 여기서 프라이머 A 중요 서열, 프라이머 B 중요 서열 및 MID 서열은 "454 Sequencing System Guidelines for Amplicon Experimental Design July 2011"에서 대규모 병렬 시퀀싱 플랫폼 GX-FLX 454 티타늄 (Roche)에 대해 개시되었다. 각 PCR이 2.5 유닛의 FastStart Taq DNA 폴리머라제 (FastStart HiFi PCR System dNTPack, Roche), 4 mM의 MgCl₂, 100 nM의 각 프라이머 및 200 μM의 dNTPs와 50-μL 반응으로 실시되었다. 모든 PCR은 PTC-100 서멀 사이클러 (thermal cycler, Bio-Rad)에서 하기의 열순환 조건 (thermocycling conditions)을 사용하여 실시되었다: 2분 동안 95 ℃, 30초 동안 95 ℃에서 33회 순환, 30초 동안 40 ℃, 및 1분 동안 72 ℃이고, 최종 신장 (final extension)은 5분 동안 72 ℃ 및 5분 동안 25 ℃이다. 그 후, 본 발명자들은 상기 PCR 산물을 전기영동하였다. 본 발명자들은 모두 32개의 자궁경부 면봉법 시료에 대해서 기대된 크기의 단일 PCR 앰플리콘 (amplicon)을 확인하였고, 모두 32개의 대응하는 음성 시약 대조군에 대한 PCR 앰플리콘을 없다고 확인되었다. 그러므로, 상기 환경, 시약 및 절차는 원치않는 박테리아 16S rRNA 게놈 서열의 임의의 오염은 없었다.

이후에, 본 발명자들은 32개의 자궁경부 면봉법 시료로부터 유래되었고, Roche의 추천된 지시에 따라 MID (multiplex identifier) 서열 및 상기 PCR 프라이머의 5' 말단을 통해서 포함되는 어댑터 (adaptor) 서열에 의해 부착된 모두 32개의 PCR 산물을 정제하였다. 상기 정제된 산물이 제조사의 지시에 따라서 GX-FLX 454 티타늄 (Roche)을 사용하여, 시료당 약 10,000개의 원 시퀀싱 판독 (raw sequencing reads)의 평균을 타켓으로 대규모 병렬 게놈 시퀀싱 처리되었다.

각 시료에 있어서, 원 (raw) 시퀀싱 데이터가 마더 (mothur) 상에 Pyronoise의 실행을 사용하여 (Quince, Lanzen et al., 2011) 플로우그램 수준 (flowgram level)으로 디노이즈 (denoised)되었다 (Schloss, Westcott et al., 2009). 원 판독 (raw reads)이 플로우그램-디노이즈 (flowgram-denoised)되고, 품질 및 길이가 필터되었으며, 키메라 (chimera)가 제거되고, 정렬되었으며, 프리-클러스터 (pre-clustered)되고, 운영분류단위 (operational taxonomic units)로 클러스트되었으며, 이는 그 후 리보좀 데이터베이스 프로젝트 (RDP) 트레이닝 세트 (v9, 2012)에 기반하여 분류학적으로 분류되었다.

상기 확장된 자궁경부 그룹 (n=19) 및 닫혀진 자궁경부 그룹 (n=13) 사이의 차별적으로 풍부한 박테리아 분류군의 체계적인 동정: 모든 상기 분석 단계 이후에, 본 발명자들은 32개의 자궁경부 면봉법 시료에서 342개의 박테리아 분류군을 관찰하였다. 상이한 시료들에 대해서 가변하는 판독 계수를 정규화하기 위해서, 본 발명자들은 마더를 사용하여 무작위 서브샘플링을 실시하여 (Schloss, Westcott et al. 2009), 상기 32개의 시료 각각은 추가 분석을 위한 7,594개의 처리된 판독을 포함하였다. 대안으로서, 본 발명자들은 상기 시료로부터 전체 판독 계수의 비율로서 시료 중 각 분류군의 판독 계수를 나타냄으로써 정규화시켰다.

상기 확장된 자궁경부 그룹과 상기 닫혀진 자궁경부 그룹 사이에 차별적으로 풍부한 분류군을 동정하기 위해서, 본 발명자들은 통계적 시험, 즉 Metastats를 실시하였고, 이는 특별히 상기 시퀀싱 데이터의 타입을 위해 고안되었다 (White, Nagarajan et al. 2009). 기본적으로, Metastats는 특정 분류군이 시료당 1 미만의 판독의 평균으로 나타내는지를 비모수적 (non-parametric) T-검정 및 Fisher 정확도 검정을 사용하기 위해서 발견적 방법 (heuristic)을 특징으로 한다 (상기 데이터 타입에서 현저한 변경을 검출하는데 어려움을 겪는 소위 희소 계수 문제 (sparse count problem)).

한번만 나타나는 분류군의 서열 (단일 서열)을 제거하고, 또한 FDR < 5 %에서 오류 발견율 (FDR) 방법을 사용하는 다중 검정을 조정한 후에 (Storey and Tibshirani, 2003), 16개의 분류군이 통계적 현저한 차이로서 남았다 (q <0.05). 상기 닫혀진 자궁경부 그룹에 비해서 상기 확장된 자궁경부 그룹에서, 이들 중 9개의 분류군 (표 2A)이 현저하게 증가되었고, 7개의 분류군 (표 2B)이 현저하게 감소되었다. 계부터 속까지의 수준에서 상기 16개의 게놈 서열의 가장 근접한 분류학적 분류가 표 3A 및 표 3B에 개시되었다. 상기 16S rRNA 게놈 서열이 표 4A 및 4B에 개시되었다. 상기 16S 리보좀 RNA 데이터베이스에 대한 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한 상기 16개의 게놈 서열의 가장 근접한 종 분류 (2014년 6월 NCBI BLAST 웹사이트를 사용하여 실시됨)가 표 4E 및 4F에 개시되었다.

시료 수집 시에 가장 근접한 임신 주수에 의해서 1:1로 매칭된, 상기 확장된 자궁경부 그룹 (n=10)과 상기 닫혀진 자궁경부 그룹 (n=10) 사이에, 차별적으로 풍부한 박테리아 분류군의 체계적 동정: 상기 2개의 그룹들 사이에 시료 수집시에 임신 주수가 통계적으로 현저하게 다르지 않았다. 그러나, 본 분석에 있어서 임신 주수의 임의의 영향을 최소화하기 위해서, 본 발명자들은 상기 확장된 자궁경부 그룹의 각 여성을, 상기 닫혀진 자궁경부 그룹의 다른 여성과, 시료 수집 시에 가장 근접한 임신 주수 (2주내)에 의해서 매칭시켰다. 더욱이, 상기 2개의 그룹의 상이한 시료 크기의 임의의 효과를 최소화하기 위해서, 본 발명자들은 1:1 비율로 상기 매칭을 실시하였다. 마침내, 본 발명자들은 상기 확장된 자궁경부 그룹에서 10명의 여성을, 상기 닫혀진 자궁경부 그룹에서 10명의 여성과, 시료 수집시 상기 임신 주수에 대해서 매칭할 수 있었다.

FDR < 5 %에서 오류 발견율 (FDR) 방법을 사용하는 다중 검정에 대한 조정 이후에 (Storey and Tibshirani, 2003), 20개의 분류군이 통계적으로 현저한 차이로 남았다 (q <0.05). 상기 닫혀진 자궁경부 그룹과 비교하여, 상기 확장된 자궁경부 그룹에서, 이들 중 15개의 분류군 (표 2C)이 현저하게 증가되었고, 5개의 분류군 (표 2D)이 현저하게 감소되었다. 계부터 속까지의 수준에서 상기 20개의 게놈 서열의 가장 근접한 분류학적 분류가 표 3D 및 표 3C에 개시되었다. 상기 16S rRNA 게놈 서열이 표 4C 및 4D에 개시되었다. 상기 16S 리보좀 RNA 데이터베이스에 대한 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한, 상기 16개의 게놈 서열의 가장 근접한 종 분류 (2014년 6월 NCBI BLAST 웹사이트를 사용하여 실시됨)가 표 4G 및 4H에 개시되었다.

다양한 결과에 있어서 차별적으로 풍부한 박테리아 분류군의 목록들의 선택된 멤버들에 의한 예측 성능. 본 발명자들은 2개의 시험, 즉 차별적으로 증가된 박테리아 시험 (Differentially Increased Bacteria Test: DIBT) 1 및 DIBT2 각각을 구성하기 위해서 표 2A에서 모두 9개의 분류군과, 표 2C로부터의 모두 15개의 분류군을 선택했다.

DIBT1 및 DIBT2는 고려된 박테리아 분류군의 존재를 검출하기 위해서 대규모 병렬 게놈 시퀀싱 데이터, 또는 더 바람직하게는 종-특이적 PCR로부터 데이터를 사용할 수 있다. 상기 9개 또는 15개의 차별적으로 증가된 분류군 중 어느 것이 상기 시료 중에 존재하는 경우, 본 발명자들은 이를 각각 DIBT1 양성 또는 DIBT2 양성으로 정의하였다. 그렇지 않으면, 상기 9개 또는 15개의 분류군 모두가 시료 중에 존재하지 않는다면, 본 발명자들은 이를 각각 DIBT1 음성 또는 DIBT2 음성이라고 정의하였다.

DIBT1 또는 DIBT2와, 유해 임신 또는 신생아 결과 사이의 관련성을 탐색하기 위해서, 본 발명자들은 상기 Fisher 정확도 검정을 실시하였다. 중요 임신 및 신생아 결과를 예측하는데 DIBT1 또는 DIBT2의 가능성을 탐색하기 위해서, 본 발명자들은 상기 결과를 예측하기 위해 DIBT1 또는 DIBT2의 참 (true) 양성, 거짓 (false) 양성, 거짓 음성 및 참 음성을 산출하였다 (각각, 표 5A 및 표 5B). 또한, 상기 결과를 예측하는데 DIBT1 또는 DIBT2의 감수성, 특이성, 양성 및 음성 예측값을 산출하였다 (각각 표 5A 및 표 5B).

DIBT1과, 진행성 자궁경부 확장 (Fisher 정확도 검정, p = 0.028), < 28주의 자연 조기 출산 (p = 0.0023), < 34주의 자연 조기 출산 (p = 0.00065), < 28주의 조기 출산 (p = 0.0057), < 34주의 조기 출산 (p = 3.2 x 10^-6) 및 뇌실내 출혈 (p = 0.01) 사이의 현저한 관련성이 있다. 중요하게, 자연 조기 출산의 모두 7건의 사례가 DIBT1 양성 (거짓 음성 없음)으로 검출되었다. 또한, 중요하게, DIBT1 양성으로 분류된 모두 13건의 사례들 중에, 모두 < 34주에서 조기 출산을 겪었다 (거짓 양성 없음). 상기 모든 조기 출산은 자간전증, 자궁내 성장 제한, 태아 염색체 이상에 의한 것은 아니다. 그러므로, 본 발명자들은 상기 13건의 조기 출산이 본 연구에 의해서 동정되고, DIBT1 중 포함을 위해 선택된 상기 "비정상적인 균상"의 하나 이상의 감염에 의해서 유발될 수 있다고 추측했다.

DIBT2에 있어서, 중요한 관련성이 상기와, < 28주 자연 조기 출산 (p = 0.0023), < 34주 자연 조기 출산 (p = 0.00065), < 28주 조기 출산 (p = 0.0057), < 34주 조기 출산 (p = 0.0032) 사이에서 관찰되었다. 중요하게, < 34주 자연 조기 출산의 모두 7건의 사례가 DIBT2에 의해서 양성으로 검출되었다 (거짓 음성 없음).

다른 연구 (연구 B)에서, 본 발명자들은 단축 자궁경부를 갖거나 또는 정상 길이 자궁경부를 갖는 여성으로부터 매칭된 임신 주수에서 수집된 자궁경부 면봉법 시료에서 유사한 분석을 실시하였다. 각 시료에 있어서, DNA가 추출되고, V4V5 프라이머에 의해 PCR-증폭되고, GS-FLX 454 분석을 실시하였다. FDR < 5 %에서 오류 발견율 (FDR) 방법을 사용하여 다중 검정에 대해 조정한 후에 (Storey and Tibshirani, 2003), 24개의 분류군이 통계적 현저한 차이로 남았다 (q < 0.05). 정상-길이 자궁경부 그룹에 비해서 단축된 자궁경부 그룹에서, 이들 중 17개의 분류군 (표 7)이 현저하게 증가되었고, 7개의 분류군 (도시되지 않음)이 현저하게 감소되었다. 상기 16S rRNA 게놈 서열이 표 8에 기재되었다. 16S 리보좀 RNA 데이터베이스에 대해서 BLAST 뉴클레오티드 정렬에 기반한 상기 17개의 게놈 서열의 가장 근접한 종 분류 (2014년 6월 NCBI BLAST 웹사이트를 사용하여 실시함)가 표 9에 개시되었다.

다양한 결과에서 차별적으로 풍부한 박테리아 분류군의 목록의 선택된 멤버에 의한 예측 성능. 본 발명자들은 다른 시험, 즉 차별적으로 증가된 박테리아 시험 (DIBT) 3을 구성하기 위해서 표 7로부터 모두 17개의 분류군을 선택하였다.

DIBT3은 고려된 박테리아 분류군의 존재를 검출하기 위해서 대규모 병렬 게놈 시퀀싱 데이터, 또는 더 바람직하게는 종-특이적 PCR로부터의 데이터를 사용할 수 있다. 이들 17개의 차별적으로 증가된 분류군 중 어느 것이 상기 시료 중에 존재한다면, 본 발명자들은 이를 DIBT3 양성으로 정의하였다. 그렇지 않다면, 상기 17개의 분류군 모두가 시료 중에 존재하지 않는다면, 본 발명자들은 이를 DIBT3 음성으로 정의하였다. 상기 DIBT3 양성 결과와, 유해 임신 또는 신생아 결과의 관련성이 표 10에 개시되었다.

DIBT3과, 조기 자궁경부 확장 (Fisher 정확도 검정, p = 0.00022), < 34주 자연 조기 출산 (p = 0.049), < 34주 조기 출산 (p = 0.049) 사이의 상당한 관련성이 있었다. 중요하게, 자연 조기 출산의 모두 3건의 사례가 DIBT3 양성으로 검출되었다 (거짓 음성 없음).

본원에서 제공된 상기 박테리아 마커가 임신 13주차보다 빠르게 실시된 분자 시험 (molecular test)에 근거하여 유해 임신 결과 및 신생아 결과를 정확하게 예측하는데 사용된다 (표 5A, 5B 및 10). 본원에 기술된 방법은 조기 중재시술을 가능하게 하여, 예를 들어 긴밀하게 모니터링되거나 또는 신생아 집중 치료를 갖춘 3차 치료 기관으로 조속한 이송을 가능하게 한다.

실시예 2: 임상적 중재시술 후에 자연 조기 출산을 일으키는 자궁경부 부전 환자의 확인을 위한 자궁경부 미생물총 시그니쳐 (cervical microbiome signature)

임상적 중재시술 (원형결찰/페서리)에 상이하게 반응하는 자궁경부 부전 (CI) 환자의 자궁경부에 콜로니를 이룬 박테리아 분류군이 체계적으로 조사되지 않았다. 대규모 병렬 시퀀싱을 사용하여, 본 발명자들은 일련의-모집된 단일아-임신 CI 환자 및 CI를 갖지 않는 적당하게-매칭된 여성으로부터 중재시술 이전에 입수된 자궁경부 면봉법 시료에 대해서 9,600 이상의 분류군의 풍도를 조사하였다. 본 발명자들은 비-CI 대조군과 비교하여, CI 환자에서 상기 자궁경부 미생물총이 변경된 것을 관찰하였다. 중요하게, 본 발명자들은 "중재시술 후 만기 분만 (≥ 37 주)"을 야기하는 것과 비교하여, "중재시술 후 자연 조기 출산 (< 34주, sPTB)"을 야기하는, 환자에서 6개의 차별적으로 풍부한 분류군을 동정하였다. 상기 log₁₀ (상기 6개의 분류군의 전체 풍도), LA6, 양성 결과를 정의하기 위한 > 1.15를 사용하여, 본 발명자들은 모두 올바르게 분류되었지만, 한 명의 환자가 "중재시술 후 sPTB"를 나타내었고 (9/10 = 90 %), 거짓 양성은 없었다 (0/15 = 0 %). LA6-음성 환자와 비교하여, LA6-양성 환자가 중재시술 후 단기간 동안 분만하지 않았다 [중재시술과 분만 사이의 중간 일수, 10일 대 126일; Logrank 검정, p < 0.00001; 위험 비율, 6.34; 95 % 신뢰도 구간, 1.51 대 26.6]. 더욱이, LA6-양성 환자는 LA6-음성 대조군보다 조기에 분만했다 [23.7주 대 38.4주의 분만시 중간 임신 주수; Logrank 검정, p < 0.0001; 위험 비율, 6.24; 95 % 신뢰도 구간, 1.50 내지 25.9]. 본 연구는 원형결찰/페서리 중재시술 후 임신의 예후 정보를 제공하기 위해 사용되는 중재시술 전 자궁경부 미생물총의 가능한 용도를 강조하였다.

도입

자궁경부 부전 (CI)은 조기 출산 (PTB)에 대한 위험 인자이며, 이는 신생아 이환율 및 출산전후 사망 (perinatal death)과 관련이 있다. 이는 감염된 여성에서 제3 석달 대신에, 제2 석달에서 조기 확장되거나 (자궁경부 확장, 1 cm - 5 cm) 또는 단축된 자궁경부 (자궁경부 길이 < 25 mm)를 갖는 것으로 나타났다. CI 환자의 약화된 자궁경부에서 외과적 원형결찰 또는 자궁경부 페서리를 실시하는 임상적 중재시술 (Shirodkar, Antiseptic, 52, 299-300 (1955); Cross, Lancet, 274, 127 (1959))은 PTB < 28주 (Pereira et al., Am J Obstet Gynecol 197, 483 e481-488 (2007)) 또는 PTB < 34주 (Althuisius et al., Am J Obstet Gynecol 189, 907-910 (2003); Goya et al., Lancet 379, 1800-1806 (2012))의 비율이 감소되는 것을 나타내고, 신생아 생존율 (3)의 증가를 나타내며, 태위 (presentation)와 분만 사이의 간격이 증가되는 것을 나타낸다 (Pereira et al., Am J Obstet Gynecol 197, 483 e481-488 (2007)).

그럼에도 불구하고, 상기 자궁경부 중재시술은 모든 CI 환자에서 유익한 것은 아니다. 특히, 양막내 감염 (IAI)을 가진 CI 환자는 원형결찰 중재시술 후에 PTB < 34주의 4배 더 높은 비율을 나타내며 (Romero et al., Am J Obstet Gynecol 167, 1086-1091 (1992)), 이는 동일한 중재시술을 받았지만 IAI는 아닌 환자와 비교되었다. IAI를 배제시키고 원형결찰 중재시술을 받은 환자는 IAI에 대한 검정 없이 중재시술을 받은 사람과 비교하여 PTB < 34 주의 더 낮은 비율을 나타냈다 (Mays et al., Obstet Gynecol 95, 652-655 (2000)). IAI가 CI 환자에서 매우 우세 (38 % - 51 %)하기 때문에 (Romero et al., Am J Obstet Gynecol 167, 1086-1091 (1992); Mays et al., Obstet Gynecol 95, 652-655 (2000)), 전문가들은 미생물을 검출하기 위해 원형결찰 전 양수천자 (amniocentesis)를 사용하여 IAI를 배제하는 것을 고려하도록 임상의에게 제안하였다 (Berghella et al., Am J Obstet Gynecol 209, 181-192 (2013); Airoldi et al., Am J Perinatol 26, 63-68 (2009)). 그러나, 양수천자는 침습성이며, 작지만 유한한 태아 손실의 가능성과 관련이 있을 수 있다. 그러므로, 본 발명자들은 CI 환자에서 자궁경부 콜로니화를 조사하고, 미생물총의 발현을 상기 자궁경부 중재시술의 결과와 관련지었다. 상기 결과는 자궁경부 면봉법 시료채취가 CI 환자에 있어서 양수천자에 대안으로서 상대적으로 비침습성일 수 있음을 나타낸다.

대규모 병렬 시퀀싱 (MPS)은 배양과 독립적이므로, 다른 신체 부위에 콜로니를 이룬 미생물에 대해 더 민감하고 포괄적인 견해를 제공하였다. 종래에, 상기 양막공간내에 위치한 태반은 멸균되었다고 생각되었다. 이와는 반대로, 상기 저널에서 공개된 MPS-계 미생물총 및 메타게놈 (metagenomic) 연구에 의해서 상기 태반에는 모계 산전 감염 및 조기 출산의 예전 병력 (remote history)과 관련성에 있어서 가변하는 낮은 생물량의 미생물총이 있다는 것을 나타내었다 (Aagaard et al., Sci Transl Med 6, 237ra265 (2014)). 본 연구는 산전 자궁경부 미생물총과 CI 환자로부터의 조기 출산 결과 사이의 관련성을 조사하기 위해서 실시되었다.

MPS에 의해서 생성된 고해상도 데이터 및 상기로부터 추론될 수 있는 정량적 정보에 의해서 여성 건강에 있어서 미생물에 대한 우리의 지식을 또한 넓힐 수 있다. 박테리아 커뮤니티의 5개의 주된 부류 (커뮤니티 그룹)가 가임-연령의 비-임신한 여성의 질에서 관찰되었다. 커뮤니티 그룹 IV에서 통상적으로 발견되는 비(非)-락토바실루스 종 (non-Lactobacillus sp .)의 질 분비물이 증가된 여성에서, 박테리아 질증 (vaginosis)을 가진 여성을 확인하기 위해서 주로 사용되는 진단 인자인, 누젠트 점수 (Nugent scores)가 또한 증가되었다 (Ravel et al., Proc Natl Acad Sci U S A 108, 4680-4687 (2011)). 특히, 박테리아 질증을 가진 여성은 확장된 자궁경부를 가질 가능성이 높다 (조정된 교차비 (odds ratio), 4.9; 95 % 신뢰도 구간 2.2 - 10.9) (Kilpatrick et al., Am J Obstet Gynecol 194, 1168-1176 (2006)). 비-임신한 여성 중 질 미생물총의 추적 연구 (longitudinal study)에서 일부 박테리아 커뮤니티가 단기간에 대해서 현저하게 변경되었지만, 반면에 다른 것은 상대적으로 안정한 것을 나타냈다 (Gajer et al., Sci Transl Med 4, 132ra152 (2012)). 이는 덜 안정한 커뮤니티들이 병원성 미생물에 의한 침습에 더 감수성이 있다는 생태학적 이론으로부터 추론된다 (Dunstan et al., Ecology 87, 2842-2850 (2006)). 상기 연구에서, CI 환자에서 상기 자궁경부 미생물총이 CI가 없는 적절하게-매칭된 여성의 것과 비교되었다.

결과

본 발명자들은 34명의 자궁경부 부전 (CI) 환자를 모집하였고, 각각으로부터 자궁경부 면봉법 시료를 원형결찰/페서리 치료 이전에 입수하였다. 본 연구에 참여하는 제2 석달 단일아-임신 여성은 모두, 자궁경부 면봉법 시료채취시 중에 하기를 갖는다: (i) 무통 진행성 자궁경부 확장 (1.5 cm - 5.0 cm) 및/또는 자궁경부 단축 (자궁경부 길이 < 25 mm), 및; (ii) 무손상 막, 및; (iii) 산통 수축 없음.

상기 CI 환자 모두는 각각 조기 확장/단축된 자궁경부에 의해서 원형결찰/페서리 중재시술을 받았다. 상기 환자들은 분만후 한달까지 후속조치되었다. 자간전증, 태아 가사, 성장 제한, 태아 염색체 또는 구조적 이상으로 인한 의인성 (iatrogenic) PTB에 의한 합병증을 갖는 9명의 임산부는 배제되었다. CI 환자로 남아 있는 25명 중에, 15명의 여성은 중재시술 이후에 만기 출산 (TB, 임신 37주차 이후에 분만)하였고, 10명은 중재시술 이후에 자연 조기 출산 (sPTB, 34주 미만에서 분만)하였다 (도 1a). 이 중에서, 7명은 호흡 곤란 증후군 (RDS), 기관지폐 이형성증 (BPD), 뇌실내 출혈 (IVH) 및 미숙아 망막병증 (ROP) 또는 출생전후 사망을 포함하는 신생아 이환율과 관련이 있다 (도 1a).

대규모 병렬에 의한 박테리아 분류군의 프로파일링

임상적 중재시술 이전에 수집된 각 자궁경부 면봉법 시료에서 박테리아 DNA의 추출, 상기 16S 리보좀 RNA (rRNA) 유전자의 PCR 증폭 및 상기 앰플리콘의 대규모 병렬 시퀀싱을 실시하였다 (Titanium, GS-FLX 454, Roche). 상기 16S rRNA 유전자의 V4 및 V5 영역을 표적으로 하는 PCR 프라이머는, 분석을 위해서 알려져 있는 16S rRNA 서열의 9,600 이상의 잘 확립된 박테리아에 대해 증폭할 수 있다 (Claesson et al., Nucleic Acids Res 38, e200 (2010)). 상기 범위는 상기 여성 생식관의 대부분의 공개된 미생물총 연구보다 더 넓었다.

시퀀싱 에러로부터 나오는 "신규한" 분류군의 비논리적인 검출을 최소화하기 위해서, 상기 원 시퀀싱 판독 (680,000 판독)이 디노이즈되고, 잘-확립된 방법을 사용하여 처리된 판독 (540,000 판독)으로 품질이 필터되었다 (Schloss et al., Appl Environ Microbiol 75, 7537-7541 (2009); Quince et al., Nat Methods 6, 639-641 (2009)). 평균적으로, 상기 25개의 시료의 각각이 22,000 처리된 고품질 판독의 심도로 시퀀싱되었다. 이러한 시퀀싱 심도 (sequencing depth)는 여성 생식관의 대부분의 공개된 미생물총 연구에서보다 더 크다.

또한, 적어도 97 %의 서열 동일성을 갖는 모든 시료로부터 처리된 판독은 하나의 운영분류단위 (Otu, 즉, 박테리아 분류군)로서 클러스트되었다. 전체적으로 152개의 박테리아 분류군이 모두 25개의 자궁경부에서 검출되었다. 상이한 판독 계수에서 시퀀싱된 시료에 대해 명확한 비교를 위해서, 본 발명자들은 누적합 스케일링 (CSS) 정규화를 실시하였고 (Paulson et al., Nat Methods 10, 1200-1202 (2013)), 각 분류군에 대한 풍도 값 (단위: 판독 계수)을 나타내었고, 이의 CSS-정규화 판독 계수는 log₁₀ 규모 (즉, log(풍도) 값)로 나타내었다.

자궁경부 부전 환자에서 매우 풍부한 박테리아 분류군

도 1b는 10건의 "중재시술 후 sPTB" 자궁경부에서 관찰된 10개의 가장 풍부한 박테리아 분류군을 나타낸다. 락토바실리가 우세한 건강에 여성 생식관에 대하여, 상기 가드네렐라 (Gardnerella) 속의 멤버 (Otu 4)가 "치료후 sPTB" 자궁경부에서 가장 풍부한 박테리아 분류군으로 동정되었다 [도 1b, 열 #1, 즉, 10건의 "중재시술후 sPTB" 자궁경부에서 가장 큰 전체 log (풍도) 값을 갖는 분류군]. 사실상, 상기 그룹에서 10개의 가장 풍부한 박테리아 분류군 중 7개가 비-락토바실루스 (non-Lactobacillus) 속으로서: 가드네렐라, 2개의 스내티아스, 아에로코쿠스, 메가스패라, 슈도모나스 (Pseudomonas) 및 아내로코쿠스로 분류되었다 (도 1b, 열 #1 내지 #10 및 행 "sPTB").

비교로서, 상기 "치료 후 TB" 자궁경부에서 10개의 가장 풍부한 박테리아 분류군 중 오직 5개만이 비-락토바실루스 속으로 분류되었다 (도 1c, 열 #1 내지 #10 및 행 "TB"). 특히, 상기 3개의 가장 풍부한 박테리아가 락토바실루스 크리스파투스 (Lactobacillus crispatus), 엘. 이너스 (L. iners) 및 엘. 젠세니이 (L. jensenii)로서 동정되었으며, 이는 건강한 여성의 생식관에 우세한 것으로 알려져 있다 (Ravel et al., Proc Natl Acad Sci U S A 108, 4680-4687 (2011)).

중재시술에 대해 상이한 반응을 갖는 환자에서 차별적으로 풍부한 분류군

중요하게, 본 발명자들은 "치료후 sPTB" 그룹과 "치료후 TB" 그룹 사이의 차별적으로 풍부한 7개의 박테리아 분류군을 동정하였다 (도 1d). 상기 7개의 분류군, 즉 스내티아 (Otu 11), 파르비모나스 (Otu 16), 우레아플라스마 (Otu 56), 아토포비움 (Otu 42), 펩토니필루스 (Otu 28), 메가스패라 (Otu 47) 및 파래그거텔라 (Paraeggerthella) (Otu 40)의 상기 log (풍도) 값은 이전 그룹에서 더 높다 (Mann-Whitney rank sum test, p < 0.05; 다중 검정 보정이 오류 발견율 (FDR) 방법을 사용하여 실시되었음, FDR < 5 %) (도 1d, 열 #1 내지 #7, 마지막 행). 현저하게, 이들 중, 상기 후자 6개의 분류군이 "치료후 sPTB"에서만 배타적으로 관찰되었고, "치료후 TB" 그룹에서는 관찰되지 않았다 [도 1d, 열 #2 내지 #7, "sPTB" 행하에서 다수의 log(풍도) 값은 ≥ 0 이지만, 상기 "TB" 컬럼하에서 모든 log(풍도) 값은 0임].

중재시술 후에 차별적으로 풍부한 분류군 및 결과

상기 후자 6개의 차별적으로 풍부한 분류군의 풍도를 요약하기 위해서 (Mann-Whitney, p < 0.01; 표 11), 본 발명자들은 각 자궁경부 면봉법 시료에 대해서 LA6 값을 산출하여, log 10 (6개의 차별적으로 풍부한 분류군의 전체 풍도)을 나타낸다. 간단하게, 각 시료에 있어서, 본 발명자들은 파르비모나스 (Otu 16), 우레아플라스마 (Otu 56), 아토포비움 (Otu 42), 펩토니필루스 (Otu 28), 메가스패라 (Otu 47) 및 파래그거텔라 (Otu 40)에 대한 그 log (풍도) 값들의 각각을 공통의 선형 스케일로 변환시켰다. 상기 공통 스케일에서 6개의 풍도 값을 추가한 후에, 본 발명자들은 상기 전체 풍도를 log-변환시켰고, log₁₀ 스케일로 LA6 값을 나타냈다.

LA6의 중간값은 "치료후 sPTB" 그룹 및 "치료후 TB" 그룹, 각각에서 2.61 및 0.78이었다 (도 2a). 상기 중간 LA6 값은 상기 이전 그룹에서 3.36배까지 증가된 것을 보여준다 (Mann-Whitney, p <0.0001). 치료를 받은 CI 환자들 중 "치료후 sPTB"를 확인하기 위한 최적 역치를 찾기 위해서, 본 발명자들은 수신자-조작 특성 (receiver-operating characteristics: ROC) 곡선을 플로팅하였다 [ROC 곡선하 면적 (95 % 신뢰도 구간), 0.95 (0.84-1.06); p = 0.0002]. 양성 결과를 나타내는 역치로서 LA6 > 1.15를 사용하여, 본 발명자들은 모두를 확인되었지만, 한명의 "중재시술 후 sPTB" CI 환자가 확인되었으며 (9/10=90% 감수성), 거짓 양성은 없었다 (1 - 0/15 = 100 % 특이성).

중요하게, LA6-양성 환자는 LA6-양성 환자보다 임상적 중재시술후 조기에 분만하였다 (도 2b, 23.7주 대 38.4주의 분만시 중간 임신 주수; 95 % 신뢰도 구간, 20.6 주 - 25.4 주 대. 38.0 주 - 38.7 주; Chi-squared, 32.352; df, 1; Logrank test, p < 0.0001; 위험 비율, 6.24; 95 % 신뢰도 구간, 1.50 내지 25.9; MedCalc, version 14.12). 또한, 중요하게, LA6-양성 환자는 그 LA6-음성 대조군보다 중재시술 후에 더 짧은 기간동안 분만하였다 (도 2c 중재시술과 분만 사이의 중간 일수, 10 일 대 126 일; 95 % 신뢰도 구간, 8 일 - 32 일 대 112 일 - 134 일; Chi-squared, 32.520; df, 1; Logrank test, p < 0.00001; 위험 비율, 6.34; 95 % 신뢰도 구간, 1.51 내지 26.6).

토의

본 연구에서 동정된 자궁경부 미생물총 시그니쳐

본 발명자들은 CI 환자에서 7개의 박테리아 분류군의 풍도가 여성에서 현저하게 증가되면, "임상적 중재시술 후 sPTB"가 야기된다는 것을 "임상적 중재시술 후 TB"가 야기되는 것과 비교하여 개시하였다. 또한, 본 발명자들은 각 CI 환자에 대해서 6개의 가장 현저하게 증가된 분류군의 전체 풍도 값을 나타내는 LA6 값을 산출하였다. 원형결찰/페서리 중재시술 이전에 수득된 25개의 자궁경부 면봉법 시료의 LA6 값에 근거하여, 본 발명자들은 상기 15명의 "중재시술후 TB" 환자에서 임의의 거짓 양성 없이 (1 - 0/15 = 100 % 특이성), 11명의 "중재시술 후 sPTB" CI 환자 중 10명 (9/10 = 90 % 감수성)을 정확하게 확인하였다.

본 연구는 아시아계 임신한 여성의 그 시료 크기에 한정되었고, 소급되는 디자인이 포함되었다. 그럼에도 불구하고, 이는 조기 출산에 대한 중요한 위험인자인 CI와 관련된 박테리아 분류군을 명확하고, 집중적으로 제공하지 못했다. 본 연구에서 동정된 상기 자궁경부 미생물총 시그니쳐, 즉 LA6가 원형결찰/페서리 중재시술 후에 예후 정보를 제공하기 위해서 개시되었다. 명백하게, LA6에 대해서 양성으로 검정된 CI 환자는 임상적 중재시술 후에, 음성으로 검정된 환자와 비교하여, 현저하게 빠른 임신 주수에서 분만할 위험이 증가되었다 (23.7 주 대 38.4 주; 위험 비율, 6.24; 95 % 신뢰도 구간, 1.50 내지 25.9). 상기 뿐만 아니라, LA6-양성 환자는 LA6-음성 환자보다, 중재시술 후 훨씬 빨리 분만할 위험이 또한 증가되었다 (10 일 대 126 일; 위험 비율, 6.34; 95 % 신뢰도 구간, 1.51 내지 26.6).

물질 및 방법

참가자의 모집

상기 연구를 실시하기 위해서 윤리적 승인이 각 임상시험 심사 위원회 (Institutional Review Board)로부터 얻어졌다. The Chinese University of Hong Kong의 Prince of Wales Hospital의 산과 (Obstetrics) 및 부인과 (Gynaecology), 또는 한국 서울의 한림 대학교의 산과 및 부인과에 다니며, 하기 포함 기준을 충족시키는 아시아계 임신한 여성으로부터 주지된 동의가 얻어졌다: (i) 제2 석달에서 무통 자궁경부 확장 (1.0 cm - 5.0 cm); 및 (ii) 무손상 막; 및 (iii) 무산통 수축 (10분당 한번). 본 연구에 참여하는 여성이: (a) 다태아 임신 (≥2 태아); 또는 (b) 자궁경부 면봉법 시료를 수집하기 48시간 전에 성행위 또는 임의의 질 처치 (application)를 받았거나; 또는 (c) 상기 자궁경부 면봉법 시료의 수집 30일 전에 항생제/항진균제 약물을 사용한 사람은 배제되었다.

자궁경부 면봉법 수집

원형결찰 치료 이전에, 자궁경부 면봉법 시료가 CI 환자로부터, 멸균된 Dacron 면봉을 외경구에서 한번 360°회전하여 수집되었다. 확장된 자궁경부에 대해서, 상기 면봉이 임상의가 마주보는 12시 방향에서 외경구로부터 입수되었다. 상기 면봉 시료가 임의의 다른 조치를 취하기 전에, 질경에 의해서 생식관을 열자마자 즉시 수집되었다. 방부 기법이 적용되었다. 상기 면봉이 상기 자궁경부의 지정된 위치 이외에, 상기 생식관의 임의의 부분 (예를 들어, 질, 음순)와 접촉하는 것을 피하기 위해서 특별한 조치가 취해졌다.

박테리아 DNA 추출

본 발명자들은 시료에서 박테리아 분류군의 양호한 표현을 유지하기 위해서 최적화된 공개된 프로토콜에 따라서 각 시료에서 박테리아 게놈 DNA를 추출하였다 (Yuan et al., PLoS One 7, e33865 (2012)).

분류학적 분류

각 Otu는 속 수준으로 리보좀 데이터베이스 프로젝트 (RDP) 나이브 베이지안 rRNA 분류기 (버젼 2.9, 2014년 9월, RDP 16S rRNA 트레이닝 세트 10)를 사용하여 분류학적으로 분류되었다. 락토바실루스가 종 정보를 유도하기 위해서 BLAST (최대 점수) 및 MOLE-BLAST (BLAST 매치의 최선의 다중-정렬)을 사용하여 16S rRNA 데이터베이스 (GenBank)에 대해서 부가적으로 매칭되었다.

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본 출원에서 인용된 GenBank 수탁 번호에 언급된 서열을 포함하는 모든 특허, 특허 출원 및 기타 공보는 모든 목적을 위해서 전문이 참조로 포함된다.

전술한 발명은 이해의 명료성을 위해 예시 및 예로서 일부 상세하게 서술되었지만, 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 첨부된 청구 범위의 범위 내에서 특정 변경 및 변형이 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본원에 제공된 각 참조 문헌은, 각 참조 문헌이 개별적으로 참조로 포함되는 것과 동일한 정도로 그 전문이 참조로 포함된다.

[표 1]

[표 2A]

19건의 확장된 자궁경부 대 13건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 342개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 증가된) 박테리아 분류군의 시퀀싱 데이터 (무작위 서브샘플링에 의해서 정규화됨)

* 오류 발견율 방법에 의해 다중 검정을 위해서 조정됨

[표 2B]

19건의 확장된 자궁경부 대 13건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 342개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 감소된) 박테리아 분류군의 시퀀싱 데이터 (무작위 서브샘플링에 의해서 정규화됨)

* 오류 발견율 방법에 의해 다중 검정을 위해서 조정됨

[표 2C]

10건의 확장된 자궁경부 대 10건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 349개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 증가된) 박테리아 분류군의 시퀀싱 데이터 (시료 수집시 임신 주수에 의해서 1:1 매칭됨, < 2주로 매칭됨, 각 시료에 대해서 전체 판독 계수의 비율로서 정규화됨)

* 오류 발견율 방법에 의해 다중 검정을 위해서 조정됨

[표 3A]

19건의 확장된 자궁경부 대 13건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 342개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 증가된) 박테리아 분류군의 속 수준의 분류 (무작위 서브샘플링에 의해서 정규화됨)

주: "분류되지 않음" 속은 분류학적 분류에 대해 사용된 데이터베이스에 이전에 기록되지 않았지만, 본 연구에서 시퀀싱에 의해서 새롭게 동정된 신규한 속을 나타냄.

[표 3B]

19건의 확장된 자궁경부 대 13건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 342개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 감소된) 박테리아 분류군의 속 수준의 분류

[표 3C]

10건의 확장된 자궁경부 대 10건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 349개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 증가된) 박테리아 분류군의 속 수준의 분류 데이터 (시료 수집시 임신 주수에 의해서 1:1 매칭됨, < 2주로 매칭됨, 각 시료에 대해서 전체 판독 계수의 비율로서 정규화됨)

[표 3D]

10건의 확장된 자궁경부 대 10건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 349개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 감소된) 박테리아 분류군의 속 수준의 분류 (시료 수집시 임신 주수에 의해서 1:1 매칭됨, < 2주로 매칭됨, 각 시료에 대해서 전체 판독 계수의 비율로서 정규화됨)

[표 4A]

19건의 확장된 자궁경부 대 13건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 342개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 증가된) 박테리아 분류군의 박테리아 분류군의 16S rRNA 유전자의 서열 (무작위 서브샘플링에 의해서 정규화됨)

[표 4B]

19건의 확장된 자궁경부 대 13건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 342개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 감소된) 박테리아 분류군의 박테리아 분류군의 16S rRNA 유전자의 서열

[표 4C]

10건의 확장된 자궁경부 대 10건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 349개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 증가된) 박테리아 분류군의 박테리아 분류군의 16S rRNA 유전자의 서열 (시료 수집시 임신 주수에 의해서 1:1 매칭됨, < 2주로 매칭됨, 각 시료에 대해서 전체 판독 계수의 비율로서 정규화됨)

[표 4D]

10건의 확장된 자궁경부 대 10건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 349개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 감소된) 박테리아 분류군의 박테리아 분류군의 16S rRNA 유전자의 서열 (시료 수집시 임신 주수에 의해서 1:1 매칭됨, < 2주로 매칭됨, 각 시료에 대해서 전체 판독 계수의 비율로서 정규화됨)

[표 4E]

NCBI의 16S rRNA 데이터베이스에 대해 BLAST 정렬에 의한 종 수준 분류. 19건의 확장된 자궁경부 대 13건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 342개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 증가된) 박테리아 분류군 (무작위 서브샘플링에 의해서 정규화됨)이 정렬됨.

주:

* 임의의 알려져 있는 종과 < 97 %의 서열 동일성을 갖는 분류군을 나타내며, 이전에 보고된 종이 아닌, 본 연구에서 시퀀싱에 의해서 새롭게 동정된 신규한 종을 나타낼 수 있음.

[표 4F]

NCBI의 16S rRNA 데이터베이스에 대해 BLAST 정렬에 의한 종 수준 분류. 19건의 확장된 자궁경부 대 13건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 342개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 감소된) 박테리아 분류군.

주:

* 임의의 알려져 있는 종과 < 97 %의 서열 동일성을 갖는 분류군을 나타내고, 이전에 보고되지 않은 본 연구에서 시퀀싱에 의해서 새롭게 동정된 신규한 종을 나타낼 수 있음.

[표 4G]

NCBI의 16S rRNA 데이터베이스에 대해 BLAST 정렬에 의한 종 수준 분류. 10건의 확장된 자궁경부 대 10건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 349개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 증가된) 박테리아 분류군 (시료 수집시 임신 주수에 의해서 1:1 매칭됨, < 2주로 매칭됨, 각 시료에 대해서 전체 판독 계수의 비율로서 정규화됨)이 정렬됨.

주:

[표 4H]

NCBI의 16S rRNA 데이터베이스에 대해 BLAST 정렬에 의한 종 수준 분류. 10건의 확장된 자궁경부 대 10건의 닫혀진 자궁경부에서 모두 349개의 분류군을 비교함으로써 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 감소된) 박테리아 분류군 (시료 수집시 임신 주수에 의해서 1:1 매칭됨, < 2주로 매칭됨, 각 시료에 대해서 전체 판독 계수의 비율로서 정규화됨)이 정렬됨.

주:

NA는 상기 16S 리보좀 RNA 데이터베이스에서 현저한 BLAST 매치를 나타내지 않고, 이전에 보고되지 않은 본 연구에서 시퀀싱에 의해서 새롭게 동정된 신규한 종을 나타낼 수 있음.

* < 97 % 동일성을 갖는 분류군을 나타내고, 이전에 보고되지 않은 본 연구에서 시퀀싱에 의해서 새롭게 동정된 신규한 종을 나타낼 수 있음.

[표 5A]

제시된 시험, DIBT1과, 유해 임신 또는 신생아 결과 사이의 관련성. 상기 DIBT1에서 하나 이상의 선택된 분류군을 갖는 시료가 검정된 양성으로 간주됨.

[표 5B]

제시된 시험, DIBT2와, 유해 임신 또는 신생아 결과 사이의 관련성. 상기 DIBT2에서 하나 이상의 선택된 분류군을 갖는 시료가 검정된 양성으로 감주됨.

[표 6]

연구 B에서 참가자의 특성

* 연속 및 비연속 변수들 각각에 대해서 T-검정 및 Fisher 정확도 검정.

[표 7]

정상-길이 자궁경부 그룹과 비교하여, 단축된 자궁경부 그룹에서 차별적으로 풍부한 (현저하게 증가된) 박테리아 분류군. (무작위 서브샘플링에 의해서 정규화됨). P-값은 오류 발견율 방법에 의해 다중 검정을 위해서 조정됨.

[표 8a]

정상-길이 자궁경부 그룹과 비교하여, 단축 자궁경부 그룹에서 차별적으로 풍부한 (현저하게 증가된) 박테리아 분류군에서 16S rRNA 유전자의 게놈 서열. (무작위 서브샘플링에 의해서 정규화됨).

[표 8b]

[표 9]

NCBI에서 16S rRNA 데이터베이스에 대한 BLAST 정렬에 의한 종 수준 분류. 정상-길이 자궁경부 그룹과 비교하여, 단축된 자궁경부 그룹에서 차별적으로 풍부한 (현저하게 증가된) 박테리아 분류군에서 16S rRNA 유전자가 정렬됨. *는 알려져 있는 서열과 < 97 % 뉴클레오티드 동일성을 가진 분류군을 나타내고, 이전에 보고되지 않은 신규한 분류군을 나타낼 수 있음.

[표 10]

연구 B에서 동정된 차별적으로 풍부한 (현저하게 증가된) 분류군과, 유해 임신 또는 신생아 결과 사이의 관련성. DIBT1에서 하나 이상의 선택된 분류군을 갖는 시료가 검정된 양성으로 간주됨.

[표 11]

LA6을 포함하는 박테리아 분류군

* 본 연구에서 동정된 박테리아 분류군의 16S rRNA 유전자 뉴클레오티드 서열과, NCBI GenBank 수탁번호에 의해서 표시되는 가장 근접한 BLAST 매치의 것과의 사이에 동일성 백분율.

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cattgagcca 60 tggatactgg cagactagag tattggagag gcaagcggaa ttccatgtgt agcggtaaaa 120 tgcgtagata tatggaggaa caccggtggc gaaggcggct tgctagccaa agactgacgc 180 t 181 <210> 12 <211> 181 <212> DNA <213> Bacteroides coagulans <400> 12 ggtgcgcagg cggctttaca agttggatgt gaaatattgt ggctcaacca caaacgtgca 60 tccaaaactg caaagcttga gttaaggaga ggtaagtgga attcctggtg tagcggtgga 120 atgcgtagat atcaggagga ataccggtgg cgaaggcgac ttactggact taaactgacg 180 c 181 <210> 13 <211> 182 <212> DNA <213> Jonquetella anthropi <400> 13 ggcgcgtagg cggaatggca agtcagcaag tgaaagcgtg gggctcaacc ccatgatgcg 60 gctgaaactg ttattctaga ggcatggaga ggcaaacgga attcccggtg tagcggtgaa 120 atgcgtagat atcgggaaga acaccagtgg cgaaggcggt ttgctggcca tgaactgacg 180 ct 182 <210> 14 <211> 182 <212> DNA <213> Aerocccus urinae <400> 14 tgggcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagcccac ggcttaaccg tggaagtgca 60 ttggaaactg gggaacttga gtacagaaga ggaaagtgga actccatgtg tagcggtgga 120 atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcgac tttctggtct gtcactgacg 180 ct 182 <210> 15 <211> 181 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Eubacterium aggregans strain SR12, Acetobacterium bakii strain DSM 8239, Eubacterium barkeri strain ATCC 25849 <400> 15 cgttcgcagg cggcaatgca agtctcgtgt gaaaggcaag ggctcaaccc ttgtaagcac 60 aagaaactgc atagcttgag tagtggagag gcaagtggaa ttcctagtgt agcggtgaaa 120 tgcgtagata ttaggaggaa taccggtggc gaaggcgact tgctggacac aaactgacgc 180 t 181 <210> 16 <211> 183 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Corynebacterium lactis, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium freneyi, Corynebacterium xerosis <400> 16 ggctcgtagg tggtttgtcg cgtcgtctgt gaaattccgg ggcttaactc cgggcgtgca 60 ggcgatacgg gcataacttg agtactgtag gggagactgg aattcctggt gtagcggtga 120 aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg gcgaaggcgg gtctctgggc agtaactgac 180 gct 183 <210> 17 <211> 182 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Desulfococcus oleovorans Hx d3 strain Hxd3, Desulfosalsimonas propionicica strain PropA <400> 17 cgcgtgtagg cggattctca agttggatgt gaaacccctt ggctaaactg agggcttgca 60 ttcaaaactg aggaccttga gtatcagagg ggaaagtgga attcctggtg gagcggtaaa 120 atgcgtagag atcaggagga acaccggtgg cgaaggcgac tttctggctg acaactgacg 180 ct 182 <210> 18 <211> 182 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Uncultured bacterium clone F64Q2U401BWA69 <400> 18 tgtgtgtagg tggcgtgatt agtcgtttgt gaaagatccg agcttaactt ggaaaacgcg 60 aacgaaacgg tcatgcttga gtatgtgaga ggtaagcaga actcatggtg taggggtgaa 120 atccgttgat atcatgggga ataccaaaag cgaaggcagc ttactggcac attactgaca 180 ct 182 <210> 19 <211> 181 <212> DNA <213> Mycoplasma hominis <400> 19 ggttcgtagg ctgtttgtta agtctggagt taaatcccgg ggctcaaccc cggctcgctt 60 tggatactag caaactagag ttagatagag gtaagcggaa ttccatgtga agcggtgaaa 120 tgcgtagata tatggaagaa caccaaaggc gaaggcagct tactgggtct atactgacgc 180 t 181 <210> 20 <211> 181 <212> DNA <213> Veillonella montpellierensis <400> 20 cgcgcgcagg cggactagcc agtcagtctt aaaagttcgg ggcttaaccc cgtgatggga 60 ttgaaactac tagtctagag tatcggagag gaaagtggaa ttcctagtgt agcggtgaaa 120 tgcgtagata ttaggaagaa caccagtggc gaaggcgact ttctggacga acactgacgc 180 t 181 <210> 21 <211> 183 <212> DNA <213> Alloscardovia omnicolens <400> 21 agatgagatg gcggtttgtc gcgtctggtg tgaaagtcca tcgcttaacg gtggattggc 60 gctgggtacg ggcaggctag agtgtagtag gggagactgg aattctcggt gtaacggtgg 120 aatgtgtaga tatcgggaag aacaccaatg gcgaaggcag gtctctgggc tattactgac 180 gct 183 <210> 22 <211> 181 <212> DNA <213> Anaerococcus senegalensis <400> 22 agtacgtagg cggcctagta agttagaagt gaaagaatat agctcaacta tataaagctt 60 ttaaaactgt taggcttgag agatgaaagg gaaagtggaa ttcctagtgt agcggtgaaa 120 tgcgcagata ttaggaagaa taccggtggc gaaggcgact ttctggtcat catctgacgc 180 t 181 <210> 23 <211> 181 <212> DNA <213> Propionimicrobium lymphophilum <400> 23 ggcttgtagg cggtttgtcg cgtcgaaagt gtaaactcag tgcttaacgc tgagcctgct 60 ttcgatacgg gctgactaga ggaaggtagg ggagaatgga attcccggtg gagcggtgga 120 atgcgcagat atcgggagga acaccagtgg cgaaggcggt tctctggacc tttcctgacg 180 c 181 <210> 24 <211> 181 <212> DNA <213> Corynebacterium pyruviciproducens <400> 24 cgctcgtagg tggtgtgttg cgtcgtctgt gtaatccagg ggcttaactt ttggttggca 60 ggcgatacgg gcattgcttg agtgctgtag gggagactgg aattcctggt gtagcggtga 120 aatgcgcaga tatcaggagg aacaccgatg gcgaaggcag gtctctgggc agttactgac 180 g 181 <210> 25 <211> 182 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Howardella ureilytica strain GPC 589 <400> 25 tgagcgtagg cggcagtaca agtcgggagt gaaaactcgg ggctcaaccc cgagactgct 60 ctcgaaactg tacagctaga gtgcaggatg ggcaggcgga attcctggtg tagcggtgaa 120 atgcgtagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcggc ctgctggact gtaactgacg 180 ct 182 <210> 26 <211> 182 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Actinobaculum schaalii strain CCUG 27420, Actinobaculum schaalii strain B 5329 <400> 26 ggcttgtagg cggcttgttg cgcctgctgt gaaaacgcgg ggcttaactt cgcgcgtgca 60 gtgggtacgg gcaggcttga gtgtggtagg ggtgactgga attccaggtg tagcggtgga 120 atgcgcagat atctggagga acaccgatgg cgaaggcagg tcactgggcc attactgacg 180 ct 182 <210> 27 <211> 181 <212> DNA <213> Murdochiella asaccharolytica <400> 27 ggtacgtagg cggtttgtta agtttggcgt taaatcacgg ggctcaaccc cgttcagcgt 60 tgaaaactgg caaacttgag tagtagaggg gacagtggaa ttcctagtgt agcggtgaaa 120 tgcgtagaga ttaggaagaa taccggtggc gaaggcgact gtctggatac atactgacgc 180 t 181 <210> 28 <211> 182 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Uncultured bacterium clone MTS53 <400> 28 ggtgtgtagg cggttatatt agtcatttgt taaatcctcg ggcttaaccc gagaatcgcg 60 agcgaaacgg tataactaga aagtgtgagg ggtgtacaga actcatggtg taggggtgaa 120 atccgttgat atcatgggga ataccaaaag cgaaggcagt acactggcac atatttgacg 180 ct 182 <210> 29 <211> 181 <212> DNA <213> Megasphaera cerevisiae <400> 29 tgcgcgcagg cggttcggta agtctgtctt aaaagtgcgg ggcttaaccc cgtgagggga 60 cggaaactgt cgaacttgag tgtcggagag gaaagcggaa ttcctagtgt agcggtgaaa 120 tgcgtagata ttaggaggaa caccggtggc gaaagcggct ttctggacga caactgacgc 180 t 181 <210> 30 <211> 182 <212> DNA <213> Peptinophilus duerdenii <400> 30 ggttcgcagg cggaataaca agtcagatgt gaaaggcatg ggctcaaccc atgtaagcat 60 ttgaaactgt aattcttgag aagtggagag gtaagtggaa ttcctagtgt agcggtgaaa 120 tgcgtagata ttaggaggaa tacctgtggc gaaggcgact tactggacac aaatctgacg 180 ct 182 <210> 31 <211> 182 <212> DNA <213> Fastidiosipila sanguinis <400> 31 cgcgtgtagg cggcactgta agtcagatgt gaaatctccc ggctcaaccg ggagcgtgca 60 tctgatactg caatgcttga gtgatagagg ggaaagcgga attcctagtg tagcggtaaa 120 atgcgtagat attaggagga acaccagtgg cgaaggcggc tttctggcta ttaactgacg 180 ct 182 <210> 32 <211> 182 <212> DNA <213> Acidipila rosea <400> 32 ggtgcgtagg cggttcggta agtcttgtgt gaaatcttca ggctcaactt gaagtctgca 60 cgagaaactg ccgggcttga gtgtgggaga ggtgagtgga atttccggtg tagcggtgaa 120 atgcgtagat atcggaagga acacctgtgg cgaaagcggc tcactggacc acaactgacg 180 ct 182 <210> 33 <211> 183 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Uncultured bacterium clone Ovdat63c11, Uncultured bacterium clone GASP-WB2W3_D02, Uncultured candidate division OD1 bacterium clone AKYH1067 <400> 33 ggtgtgtagg tggttatgtt agtctccttt caaagctccc ggcctaaccg ggaaaaggga 60 ggggaaacgg cacaactaga ggatgcgagg ggtctgtgga actcatggag taggggtgaa 120 atccgttgat atcatgggga acaccaaaaa gcgaaggcag cagactggcg cattcctgac 180 act 183 <210> 34 <211> 182 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus fermentum IFO 3956 strain IFO 3956, Lactobacillus fermentum strain CIP 102980, Lactobacillus fermentum strain NBRC 15885 <400> 34 cgagtgcagg cggttttcta agtctgatgt gaaagccttc ggcttaaccg gagaagtgca 60 tcggaaactg gataacttga gtgcagaaga gggtagtgga actccatgtg tagcggtgga 120 atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tacctggtct gcaactgacg 180 ct 182 <210> 35 <211> 182 <212> DNA <213> Aerococcus urinae <400> 35 tgggcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagcccac ggcttaaccg tggaagtgca 60 ttggaaactg gggaacttga gtacagaaga ggaaagtgga actccatgtg tagcggtgga 120 atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcgac tttctggtct gtcactgacg 180 ct 182 <210> 36 <211> 181 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Eubacterium aggregans strain SR12, Acetobacterium bakii strain DSM 8239, Eubacterium barkeri strain ATCC 25849 <400> 36 cgttcgcagg cggcaatgca agtctcgtgt gaaaggcaag ggctcaaccc ttgtaagcac 60 aagaaactgc atagcttgag tagtggagag gcaagtggaa ttcctagtgt agcggtgaaa 120 tgcgtagata ttaggaggaa taccggtggc gaaggcgact tgctggacac aaactgacgc 180 t 181 <210> 37 <211> 182 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus brevis ATCC 367 strain ATCC 367, Lactobacillus senmaizukei strain NBRC 103853, Lactobacillus brevis strain ATCC 14869 <400> 37 tgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt gaaagccttc ggcttaaccg gagaagtgca 60 tcggaaactg ggagacttga gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg tagcggtgga 120 atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tgtctagtct gtaactgacg 180 ct 182 <210> 38 <211> 183 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Corynebacterium lactis, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium freneyi, Corynebacterium xerosis <400> 38 ggctcgtagg tggtttgtcg cgtcgtctgt gaaattccgg ggcttaactc cgggcgtgca 60 ggcgatacgg gcataacttg agtactgtag gggagactgg aattcctggt gtagcggtga 120 aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg gcgaaggcgg gtctctgggc agtaactgac 180 gct 183 <210> 39 <211> 184 <212> DNA <213> Aerococcus christensenii <400> 39 agggcgcagg ctgtttctta agtctgatgt gaaagcccac ggcttaaccg tggaagtgca 60 ttggaaactg ggaagcttga gtacagaaga ggaaagtgga actccatgtg tagcggtgga 120 atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaagcgac tttctggtct gtcactgacg 180 ctga 184 <210> 40 <211> 184 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium choerinum <400> 40 cgctcgtagg cggttcgtcg cgtccggtgt gaaagtccat cgcttaacgg tggatccgcg 60 ccgggtacgg gcgggcttga gtgcggtagg ggagactgga attcccggtg taacggtgga 120 atgtgtagat atcgggaaga acaccaatgg cgaaggcagg tctctgggcc gttactgacg 180 ctga 184 <210> 41 <211> 183 <212> DNA <213> Saccharofermentans acetigenes <400> 41 cgcgtgtagg cggctagata agtgtgatgt ttaaatccaa ggcttaacct tggggttcat 60 tacaaactgt ttagcttgag tgctggagag gatagtggaa ttcctagtgt agcggtaaaa 120 tgcgtagata ttaggaggaa caccggtggc gaaggcggct atctggacag taactgacgc 180 tga 183 <210> 42 <211> 184 <212> DNA <213> Prevotella amnii <400> 42 cgagcgtagg ctgtttgtta agcgtgttgt gaaatgtagg agctcaactt ttagattgca 60 gcgcgaactg gcagacttga gtgcgcacaa cgtaggcgga attcatggtg tagcggtgaa 120 atgcttagat atcatgacga actccgattg cgaaggcagc ttacgggagc gcaactgacg 180 ctaa 184 <210> 43 <211> 182 <212> DNA <213> Parvimonas micra <400> 43 ggtacgtagg cggtttttaa gtcaggtgtc aaagcgtgga gcttaactcc attaagcact 60 tgaaactgaa agacttgagt gaaggagagg aaagtggaat tcctagtgta gcggtgaaat 120 gcgtagatat taggaggaat accggtggcg aaggcgactt tctggacttt tactgacgct 180 ca 182 <210> 44 <211> 183 <212> DNA <213> Peptoniphilus lacrimalis <400> 44 tgttcgcagg cggcaatgca agtcagatgt aaaaggcaaa ggctcaacct ttgtaagcat 60 ctgaaactgt atagcttgag aagtgtagag gcaagtggaa tttttagtgt agcggtgaaa 120 tgcgtagata ttaaaaagaa taccggtggc gaaggcgact tgctgggcac aatctgacgc 180 tga 183 <210> 45 <211> 183 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Anaerococcus prevotii, Anaerococcus tetradius <400> 45 agtacgtagg cggataagca agttagaagt gaaatcctat agctcaacta tagtaagctt 60 ttaaaactgc tcatcttgag gtatggaagg gaaagtggaa ttcctagtgt agcggtgaaa 120 tgcgcagata ttaggaggaa taccggtggc gaaggcgact ttctggccat aaactgacgc 180 tga 183 <210> 46 <211> 183 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Megasphaera elsdenii <400> 46 ggcgcgcagg cggtttttta agtcggtctt aaaagtgcgg ggcttaaccc cgtgagggga 60 ccgaaactgg aagacttgag tgtcggagag gaaagcggaa ttcctagtgt agcggtgaaa 120 tgcgtagata ttaggaggaa caccggtggc gaaagcggct ttctggacga caactgacgc 180 tga 183 <210> 47 <211> 183 <212> DNA <213> Dialister micraerophilus <400> 47 ggcgcgcagg cggtcactta agtccatctt agaagtgcgg ggcttaaccc cgtgatggga 60 tggaaactgg gagactggag tatcggagag gaaagtggaa ttcctagtgt agcggtgaaa 120 tgcgtagata ttaggaagaa caccggtggc gaaggcgact ttctggacga aaactgacgc 180 tga 183 <210> 48 <211> 183 <212> DNA <213> Peptostreptococcus anaerobius <400> 48 ggtgcgtagg tggtctttca agtcggtggt taaaggctac ggctcaaccg tagttagcct 60 ccgaaactgg aagacttgag tgcaggagag gaaagtggaa ttcccagtgt agcggtgaaa 120 tgcgtagata ttgggaggaa caccagtagc gaaggcggct ttctggactg caactgacac 180 tga 183 <210> 49 <211> 184 <212> DNA <213> Saccarofermentans acetigenes <400> 49 ggcgtgtagg cggctagata agtgtgatgt ttaaatccaa ggcttaaacc ttggggttca 60 ttacaaactg tttagcttga gtgctggaga ggatagtgga attcctagtg tagcggtaaa 120 atgcgtagat attaggagga acaccggtgg cgaaggcggc tatctggaca gtaactgacg 180 ctga 184 <210> 50 <211> 183 <212> DNA <213> Atopobium vaginae <400> 50 ggcgcgtagg cggtctgtta ggtcaggagt caaatctggg ggctcaaccc ctatccgctc 60 ctgataccgg caggcttgag tctggtatgg gaaggtggaa ttccaagtgt agcggtgaaa 120 tgcgcagata tttggaagaa caccagtggc gaaggcggcc ttctgggcca tgactgacgc 180 tga 183 <210> 51 <211> 184 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium choerinum <400> 51 gatgagatgg cggttcgtcg cgtccggtgt gaaagtccat cgcttaacgg tggatccgcg 60 ccgggtacgg gcgggcttga gtgcggtagg ggagactgga attcccggtg taacggtgga 120 atgtgtagat atcgggaaga acaccaatgg cgaaggcagg tctctgggcc gttactgacg 180 ctga 184 <210> 52 <211> 185 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Spiribacter salinus <400> 52 ggcaggtagg tggtctgatt agtcaatagg tgaaatcctc gggcttaacc cgagaagtgc 60 ctttgaaacg gtcagactgg agtactctag agggtcgtgg aattcccggt gtagcggtga 120 aatgcgtaga gatcgggagg aacaccagag gcgaaggcgg cgacctgggg agtgactgac 180 actca 185 <210> 53 <211> 184 <212> DNA <213> Sphingobacterium spiritivorum <400> 53 cgtgcgtagg cggttcttta agtcagaggt gaaagacggc agcttaactg tcgcagtgcc 60 tttgatactg aagaacttga attgggttga ggaatgcgga atgagacaag tagcggtgaa 120 atgcatagat atgtctcaga accccgattg cgaaggcagc attccaagcc tatattgacg 180 ctga 184 <210> 54 <211> 184 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Ochrobactrum pseudogrignonense <400> 54 ggcaggtagg ctgttttgta agtccggcgt gaaatcccag agctcaactc tggaactgcg 60 ttggaaacta catgacttga gtatcggaga ggttagggga attctcggtg taagggtgaa 120 atctgtagat atcgagagga acaccagtgg cgaaggcgcc taactggccg attactgacg 180 ctga 184 <210> 55 <211> 184 <212> DNA <213> Vagococus fluvialis <400> 55 agagcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccctc ggctcaaccg aggaaggtca 60 ttggaaactg gggaacttga atgcagaaga ggagagtgga attccatgtg tagcggtgaa 120 atgcgtagat atatggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaattgacg 180 ctga 184 <210> 56 <211> 127 <212> DNA <213> Sneathia sanguinegens <400> 56 cgcatctagg cggtaagaca agttgaaggt gaaaacctgt ggctcaacca taggcttgcc 60 tacaaaactg ttgaactaga gtactggaaa ggtgggtgga actacacgag tagaggtgaa 120 attcgta 127

Claims

피험체에 있어서 유해 임신 또는 신생아 결과의 위험을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 박테리아 분류군 파르비모나스 미크라 (Parvimonas micra), 우레아플라스마 우레아리티쿰 (Ureaplasma urealyticum) 또는 우레아플라스마 파르붐 (Ureaplasma parvum), 아토포비움 바기내 (Atopobium vaginae), 펩토니필루스 라크리말리스 (Peptoniphilus lacrimalis), 메가스패라 세레비지애 (Mesasphaera cerevisiae), 및 파르비박터 새시콜라 (Parvibacter caecicola) 에 속하는 박테리아의 수준을, 상기 피험체로부터 채취한 생물학적 시료에서 검출하는 단계; 및
(b) 상기 각각의 박테리아 분류군에 속하는 박테리아의 수준이 표준 대조군 수준보다 더 크다면, 상기 피험체는 유해 임신 또는 신생아 결과에 대해 증가된 위험을 갖는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 방법.
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청구항 1에 있어서, 생물학적 시료는 자궁경부 면봉법, 질 면봉법, 소변 시료, 양수 (amniotic fluid) 시료, 모체 혈액 시료, 모체 혈청 시료, 모체 혈장 시료, 자궁경부 점액 (cervical mucus) 시료, 태반 면봉법 (placental swab), 탯줄 면봉법 (umbilical cord swab), 또는 생식계 또는 위장관계로부터 직접 또는 간접적으로 채취된 임의의 시료인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 검출하는 단계는 폴리뉴클레오티드 증폭 분석, 폴리뉴클레오티드 서열 결정을 포함하는 분석, 또는 서열-특이적 프로브/프라이머 혼성화 (hybridization)를 포함하는 분석을 포함하는 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 증폭 분석은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 분석인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 PCR 분석은 정량적 PCR 분석 또는 역전사효소 (reverse-transcriptase) PCR 분석인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 유해 임신 또는 신생아 결과는 < 34주에서 조기 출산 (preterm birth), < 37주에서 조기 출산, 상기 생물학적 시료 채취 후 약 1-196 일내에 분만, 임상적 중재시술 (clinical intervention)이 실시된 후 약 1-196일내에 분만, 1분에 아프가 점수 (Apgar score) < 7, 5분에 아프가 점수 < 7, 융모양막염 (chorioamnionitis), 호흡 곤란 증후군 (respiratory distress syndrome), 기관지폐형성이상 (bronchopulmonary dysplasia), 뇌실내 출혈 (intraventricular hemorrhage), 출산 후 7일내 신생아 사망, 또는 신생아 패혈증 (neonatal sepsis)을 포함하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 각각의 박테리아 분류군에 속하는 박테리아의 수준이 표준 대조군 수준보다 더 크다면, 상기 피험체는 진행성 자궁경부 확장 (advanced cervical dilation) 또는 조기 자궁경부 단축 (premature cervical shortening)의 위험을 갖는 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 피험체는 양막공간 (amniotic cavity), 자궁강 (uterine cavity), 자궁경부 또는 질 (vagina)에 감염을 가질 위험이 있다고 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 단계 (a) 이전에, 상기 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계를 더 포함하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 피험체가 유해 임신 또는 신생아 결과를 가질 것으로 예측되는 경우, 상기 피험체로부터 상기 시료 형태의 다른 생물학적 시료를 사용하여 이후에 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계를 더 포함하고, 상기 원래 단계 (a)에서 측정된 수준과 비교하여, 나중 시점에서 상기 각각의 박테리아 분류군에 속하는 박테리아의 수준에서의 증가는 유해 임신 또는 신생아 결과의 증가된 위험을 나타내는 방법.
임신한 여성 또는 비-임신한 여성인 피험체에서 유해 임신 또는 신생아 결과를 가질 위험을 결정하기 위한 키트 (kit)로서,
(a) 박테리아 분류군 파르비모나스 미크라, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 펩토니필루스 라크리말리스, 메가스패라 세레비지애, 및 파르비박터 새시콜라 에 속하는 박테리아를 함유하는 임신한 피험체로부터 채취된 생물학적 시료를 제공하는 표준 대조군 (standard control); 및
(b) 박테리아 분류군 파르비모나스 미크라, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 펩토니필루스 라크리말리스, 메가스패라 세레비지애, 및 파르비박터 새시콜라 에 속하는 박테리아를 특이적 및 정량적으로 동정하는 하나 이상의 제제 (agents)를 포함하는 키트.
청구항 13에 있어서, 상기 제제는 증폭 분석에서 상기 각각의 박테리아 분류군의 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화되고, 이를 증폭시키는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (oligonucleotide primers)인 키트.
청구항 13에 있어서, 상기 제제는 상기 각각의 박테리아 분류군의 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 프로브 (polynucleotide probe)인 키트.
청구항 13에 있어서, 지시 매뉴얼 (instruction manual)을 더 포함하는 키트.
임신한 피험체가 진행성 자궁경부 확장 또는 조기 자궁경부 단축의 위험이 높은지 여부를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 박테리아 분류군 파르비모나스 미크라, 우레아플라스마 우레아리티쿰 또는 우레아플라스마 파르붐, 아토포비움 바기내, 펩토니필루스 라크리말리스, 메가스패라 세레비지애, 및 파르비박터 새시콜라 에 속하는 박테리아의 수준을, 상기 피험체로부터 채취된 생물학적 시료에서 검출하는 단계; 및
(b) 상기 각각의 박테리아 분류군에 속하는 박테리아의 수준이 표준 대조군 수준보다 더 크다면, 상기 피험체는 진행성 자궁경부 확장 또는 조기 자궁경부 단축의 증가된 위험을 갖는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 단계 (a)를 실시하기 이전에, 상기 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 단계를 더 포함하는 방법.
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청구항 17에 있어서, 생물학적 시료는 자궁경부 면봉법, 질 면봉법, 소변 시료, 양수 시료, 모체 혈액 시료, 모체 혈청 시료, 모체 혈장 시료, 자궁경부 점액 시료, 태반 면봉법, 탯줄 면봉법, 또는 생식계 또는 위장관계로부터 직접 또는 간접적으로 채취된 임의의 시료인 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 검출 단계는 폴리뉴클레오티드 증폭 분석, 폴리뉴클레오티드 서열 결정을 포함하는 분석, 또는 서열-특이적 프로브/프라이머 혼성화를 포함하는 분석을 포함하는 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 증폭 분석은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 분석인 방법.
청구항 22에 있어서, 상기 PCR 분석은 정량적 PCR 분석 또는 역전사효소 PCR 분석인 방법.