ES2767527T3 - Detección de taxones bacterianos para predecir resultados adversos del embarazo - Google Patents

Abstract

Un método para determinar el riesgo de un embarazo o un resultado neonatal adverso para un sujeto femenino, comprendiendo dicho método: (a) detectar en una muestra biológica tomada del sujeto femenino el nivel de bacterias de Parvimonas micra,Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Peptoniphilus lacrimalis, Megasphaera cerevisiae y Parvibacter caecicola; y b) determinar que el sujeto femenino tiene un mayor riesgo de un embarazo o un resultado neonatal adverso si el nivel de cada una de las bacterias es mayor que un nivel de control estándar.

Description

DESCRIPCIÓN

Detección de taxones bacterianos para predecir resultados adversos del embarazo

Antecedentes de la invención

En un embarazo normal sin complicaciones, el cuello uterino es largo y cerrado hasta el final del tercer trimestre, cuando eventualmente se acortará y se dilatará cuando el feto se desarrolle completamente y esté listo para el nacimiento. Por el contrario, en un embarazo complicado por acortamiento cervical o dilatación cervical avanzada, el cuello uterino progresa a acortamiento o dilatación, respectivamente, muy por delante del ritmo normal anterior. En consecuencia, ciertas mujeres con estas afecciones darán lugar a un parto antes de las treinta y siete semanas de gestación, cuando el desarrollo fetal es incompleto. Por lo tanto, esto puede conducir a mortalidad y morbilidad neonatal. Para prolongar dicho embarazo, los médicos pueden colocar un cerclaje o un pesario cervical para sostener el cuello uterino. Con base principalmente en el consenso y la opinión de expertos, se recomienda que la colocación del cerclaje pueda ser beneficiosa si se descarta la infección intraamniótica. Se sugieren pautas similares para la colocación de pesarios. Para descartar una infección efectiva, se requiere un método de detección altamente sensible.

En la actualidad, la detección de bacterias en una muestra se basa en ensayos de cultivo, microscopía y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica de especies bacterianas, que solo ofrecen sensibilidad de baja a moderada. Dicha sensibilidad podría mejorarse si podemos enfocarnos específicamente en los taxones bacterianos que son diferencialmente abundantes en el cuello uterino anormal (es decir, corto/dilatado), pero no en aquellos que son solo parte de la flora "normal" que reside en un cuello uterino "normal". Sin embargo, hasta la fecha, hay datos limitados sobre esos taxones, porque los taxones bacterianos en el cuello uterino anormal no se han perfilado sistemáticamente y se han comparado con aquellos en el cuello uterino "normal" de mujeres con parejas adecuadas. Dada la prevalencia y las implicaciones del parto prematuro, existe la necesidad de nuevos métodos para detectar con mayor precisión un mayor riesgo de un resultado adverso del embarazo en las mujeres, de modo que se puedan tomar medidas preventivas a tiempo para reducir o eliminar las posibilidades de parto prematuro o complicaciones neonatales. Esta invención satisface esta y otras necesidades relacionadas.

Breve resumen de la invención

La presente descripción se basa, en parte, en el descubrimiento de que el nivel de bacterias que pertenecen a un grupo específico de taxones bacterianos (por ejemplo, una especie o géneros bacterianos) en el cuello uterino de una mujer aumenta en correlación con la probabilidad de un resultado adverso del embarazo, como un parto prematuro a menos de 34 semanas o 37 semanas de edad gestacional, o una afección neonatal adversa, como un puntaje de Apgar de menos de 7 a 1 o 5 minutos, corioamnionitis, síndrome de dificultad respiratoria, displasia broncopulmonar, hemorragia intraventricular, sepsis neonatal y muerte neonatal dentro de los 7 días posteriores al nacimiento. Como tal, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar el riesgo de un embarazo o un resultado neonatal adverso para un sujeto femenino, por ejemplo, una mujer embarazada o una mujer no embarazada. El método de esta divulgación incluye los pasos de (a) detectar en una muestra biológica tomada del sujeto femenino el nivel de bacterias de al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo que consiste en Megasphaera cerevisiae, Alloscardovia omnicolens, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Parvibacter caecicola, Lactobacillus casei, Veillonella montpellierensis, Anaerococcus senegalensis, Bulleidia extructa, Mycoplasma hominis, Propionimicrobium lymphophilum, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 92% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos del número de acceso de GenBank No. JQ781443.1, Corynebacterium pyruviciproducens, Megasphaera cerevisiae, Acidipila rosea, Murdochiella asaccharolytica, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos ARNr 16S con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank Accession No. JF295520.1, Howardella ureilytica, Actinobaculum schaalii, Peptoniphilus duerdenii, Fastidiosipila sanguinis, Sneathia sanguinegens, Parvimonas micra, Peptoniphilus lacrimalis, un taxón bacteriano especificado por una secuencia de nucleótidos ARNr 16S en las Tablas 4A, 4C y 8, y un taxón bacteriano especificado por la clasificación de especies más cercana basada en la alineación de nucleótidos BLAST en las Tablas 4E, 4G y 9; y (b) determinar que el sujeto femenino tiene un mayor riesgo de un embarazo o un resultado neonatal adverso si el nivel de bacterias de al menos un género bacteriano es mayor que el de un nivel de control estándar.

En algunas realizaciones, el embarazo o el resultado neonatal adverso incluyen parto prematuro a <34 semanas, parto prematuro a <37 semanas, parto dentro de aproximadamente 1-196 días después de la toma de la muestra biológica, parto dentro de aproximadamente 1-196 días después de que se realiza una intervención clínica, una puntuación de Apgar a 1 minuto de <7, una puntuación de Apgar a 5 minutos de <7, corioamnionitis, síndrome de dificultad respiratoria, displasia broncopulmonar, hemorragia intraventricular, muerte neonatal dentro de los 7 días posteriores al nacimiento o sepsis neonatal. En algunos casos, el método incluye determinar que el sujeto femenino tiene un riesgo de dilatación cervical avanzada o acortamiento cervical prematuro si el nivel de bacterias que pertenecen al al menos un taxón bacteriano es mayor que un nivel de control estándar.

En las realizaciones de la invención, el método incluye detectar el nivel de Parvimonas micra, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Peptoniphilus lacrimalis, Megasphaera cerevisiae, Parvibacter caecicola en una muestra biológica tomada del sujeto femenino, y determinar que el sujeto femenino tiene un mayor riesgo de un resultado adverso del embarazo, como el parto dentro de los 7 días posteriores a la intervención cervical (es decir, intervención de cerclaje/pesario), si el nivel total de la bacteria aumenta en comparación con un nivel de control estándar. En algunos casos, el método también incluye determinar que el sujeto femenino está en riesgo de tener una infección en la cavidad amniótica, la cavidad uterina, el cuello uterino o la vagina.

Se puede identificar una clase de Megasphaera cerevisiae que tiene una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del número de acceso de GenBank NR_113307.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Megasphaera cerevisiae tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos un 93% o 94% de identidad de secuencia con la secuencia del número de acceso GenBank NR_113307.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Megasphaera cerevisiae tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S que se muestra en la SEQ ID NO: 5.

La bacteria Alloscardovia omnicolens puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del No. de acceso GenBank NR_042583.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Alloscardovia omnicolens tienen una secuencia genómica 16S ARNr con un 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos del número de acceso GenBank NR_042583.1.

La bacteria Ureaplasma urealyticum puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia genómica 16S ARNrdel No. de acceso GenBank NR_102836.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Ureaplasma urealyticum tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de nucleótidos del número de acceso GenBank NR_102836.1. La bacteria Ureaplasma parvum puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia genómica 16S ARNrdel No. de acceso GenBankNR_074176.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Ureaplasma parvum tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de nucleótidos del No. de acceso GenBank NR_074176.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Ureaplasma parvum tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S que se muestra en la SEQ ID NO: 7.

La bacteria Atopobium vaginae puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del número de acceso GenBank NR_117757.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Atopobium vaginae tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con un 97% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos del número de acceso GenBank NR_117757.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Atopobium vaginae tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S que se muestra en la SEQ ID NO: 8.

La bacteria Parvibacter caecicola puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del No. de acceso de GenBank NR_117374.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Parvibacter caecicola tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 92% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos del No. de acceso GenBank NR_117374.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Parvibacter caecicola tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S que se muestra en la SEQ ID NO: 9.

La bacteria Lactobacillus casei puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del No. de acceso GenBank NR_075032.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Lactobacillus casei tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de nucleótidos del número de acceso GenBank NR 075032.1.

La bacteria Veillonella montpellierensis puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del No. de acceso GenBank NR 028839.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Veillonella montpellierensis tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de nucleótidos del No. de acceso GenBank NR 028839.1.

La bacteria Anaerococcus senegalensis puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del No. de acceso de GenBank NR_118220.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Anaerococcus senegalensis tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de nucleótidos del No. de acceso GenBank NR_118220.1.

Las bacterias Bulleidia extructa pueden identificarse al tenern una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del No. de acceso de GenBank NR_028773.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Bulleidia extructa tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con un 97% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos del No. de acceso GenBank NR_028773.1.

La bacteria Mycoplasma hominis puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos 16S ARNr del número de acceso GenBank NR_113679.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Mycoplasma hominis tienen una secuencia genómica de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de nucleótidos del número de acceso GenBank NR_ 113679.1.

La bacteria Propionimicrobium lymphophilum puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del No. de acceso GenBank NR_114337.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Propionimicrobium lymphophilum tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de nucleótidos del No. de acceso GenBank NR_114337.1.

Una clase de bacterias no cultivadas relevantes para la presente descripción puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del No. de acceso de GenBank JQ781443.1. En algunas realizaciones, las bacterias de este taxón tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 92% con respecto a la secuencia de nucleótidos del No. de acceso de GenBank JQ781443.1.

Las bacterias Corynebacterium pyruviciproducens pueden identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del No. de acceso GenBank NR_116569.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Corynebacterium pyruviciproducens tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de nucleótidos del No. de acceso GenBank NR_116569.1.

Se puede identificar otra clase de Megasphaera cerevisiae que tiene una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del número de acceso de GenBank NR_113307.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Megasphaera cerevisiae tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos un 93% o 94% de identidad de secuencia con la secuencia del número de acceso GenBank NR_113307.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Megasphaera cerevisiae tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S que se muestra en la SEQ ID NO: 29.

La bacteria Acidipila rosea puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos 16S ARNr del número de acceso GenBank NR_113179.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Acidipila rosea tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con un 97% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos del número de acceso GenBank NR_113179.1.

La bacteria Murdochiella asaccharolytica puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del número de acceso GenBank NR_116331.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Murdochiella asaccharolytica tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 99% con respecto a la secuencia de nucleótidos del número de acceso GenBank NR_116331.1.

Se puede identificar otra clase de bacterias no cultivadas relevantes para la presente descripción que tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del número de acceso de GenBank JF295520.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias de este taxón tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 90% con respecto a la secuencia de nucleótidos del número de acceso de GenBank JF295520.1.

La bacteria Howardella ureilytica puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del número de acceso de GenBank NR_044022.2. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Howardella ureilytica tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 93% con respecto a la secuencia de nucleótidos del número de acceso GenBank NR_044022.2.

Las bacterias Actinobaculum schaalii pueden identificarse al tenern una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos 16S ARNr del número de acceso GenBank NR_116869.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Actinobaculum schaalii tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de nucleótidos del número de acceso GenBank NR_116869.1.

La bacteria Peptoniphilus duerdenii puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del número de acceso GenBank NR_116346.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Peptoniphilus duerdenii tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de nucleótidos del número de acceso GenBank NR_116346.1.

La bacteria Fastidiosipila sanguinis puede identificarse al tener una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del número de acceso GenBank NR_042186.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Fastidiosipila sanguinis tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de nucleótidos del número de acceso de GenBank NR_042186.1.

Se puede identificar que Sneathia sanguinegens tiene una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del número de acceso de GenBank AJ344093.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Sneathia sanguinegens tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 93% o 94% de identidad de secuencia con la secuencia de GenBank No. de acceso AJ344093.1.

Se puede identificar que Parvimonas micra tiene una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de ARNr 16S del número de acceso de GenBank NR_114338.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Parvimonas micra tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos el 93%, por ejemplo, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% o más, identidad de secuencia con la secuencia de GenBank Accession No. NR_114338.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Parvimonas micra tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S que se muestra en la SEQ ID NO: 43.

Se puede identificar que Peptoniphilus lacrimalis tiene una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90%, por ejemplo, al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos 16S ARNrde los números de acceso de GenBank AB971812.1 y NR 041938.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Peptoniphilus lacrimalis tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de los números de acceso a GenBank AB971812.1 y NR_041938.1. En algunas realizaciones, se detecta que las bacterias del taxón Peptoniphilus lacrimalis tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S que se muestra en SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, el método incluye detectar al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 taxones bacterianos diferentes.

En algunas realizaciones, el sujeto femenino es una mujer embarazada de aproximadamente 13 semanas a aproximadamente 37 semanas de gestación. En otras realizaciones, la mujer embarazada tiene entre aproximadamente 13 y aproximadamente 25 semanas de gestación. En algunos casos, la mujer embarazada tiene un cuello uterino abierto prematuramente. La mujer puede correr el riesgo de tener una infección en la cavidad amniótica, la cavidad uterina, el cuello uterino o la vagina. En otras realizaciones, el sujeto femenino es una mujer no embarazada. En algunas realizaciones, la mujer no embarazada está planeando su futuro embarazo. En algunos casos, el sujeto femenino tiene antecedentes de parto prematuro, muerte fetal o aborto espontáneo. En algunos casos, el sujeto femenino planea recibir una intervención clínica, como una intervención de cerlclage o suplementos de progesterona antes o después del embarazo.

En algunas realizaciones, el método también incluye extraer ácidos nucleicos de la muestra biológica tomada del sujeto femenino antes de realizar la etapa (a). En algunas realizaciones, la muestra es un hisopo cervical (que incluye una muestra de hisopo del orificio externo), un hisopo vaginal (que incluye una muestra de hisopo del fórnix), una muestra de orina, una muestra de líquido amniótico, una muestra de sangre materna (muestra de sangre entera materna), una muestra de suero materno, una muestra de plasma materno o una muestra de moco cervical. En algunas realizaciones, la muestra es un hisopo placentario, un hisopo umbilical o cualquier muestra tomada directa o indirectamente del sistema reproductivo. Esto incluye cualquier muestreo de la superficie del tracto reproductivo femenino a través de raspado, corte, enjuague, ducha vaginal, aplicación de una corriente de gas, un líquido, un vacío, una fuerza de succión, una forma de energía (por ejemplo, campo electrostático, LÁSER) o un gradiente de productos químicos (por ejemplo, quimioatrayentes para inducir la quimiotaxis). En alguna realización, la muestra se toma directa o indirectamente del sistema gastrointestinal de la mujer embarazada, incluyendo un hisopo bucal, un hisopo de garganta, un hisopo anal, un hisopo rectal o una muestra de heces.

En algunas realizaciones, la etapa de detección incluye un ensayo de amplificación de polinucleótidos. En algunos casos, el ensayo de amplificación es un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Opcionalmente, el ensayo de PCR puede ser un ensayo de PCR cuantitativo. En algunos casos, el paso de detección incluye la hibridación sonda/cebador específica de secuencia, que puede ocurrir en ausencia de amplificación de polinucleótidos. En otras realizaciones, la etapa de detección incluye la determinación de la secuencia de polinucleótidos, tal como, pero sin limitación, secuenciación paralela masiva.

Por ejemplo, si el nivel de bacterias que pertenecen a un taxón bacteriano que incluye Megasphaera cerevisiae, Alloscardovia omnicolens, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Parvibacter caecicola, Lactobacillus casei, Veillonella montpellierecus, Anaerococcus senegalensis, Bulleidia extructa, Mycoplasma hominis, Propionimicrobium lymphophilum, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos 16S ARNr con al menos 92% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank No. de acceso JQ781443.1, Corynebacterium pyruviciproducens, Megasphaera cerevisiae, Acidipila rosea, Murdochiella asaccharolytica, secuencia de bacterias no cultivadas con un nucleótido de secuencia 16S ARNr con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank No. De acceso JF295520.1, Howardella ureilytica, Actinobaculum schaalii, Peptoniphilus duerdenii, Fastidiosipila sanguinis, Sneathia sanguinegens, Parvimonas micra, Peptoniphilus lacrimalis, un taxón bacteriano especificado por una secuencia genómica 16S ARNr en las Tablas 4A, 4C y 8, un taxón bacteriano especificado por la clasificación de especies más cercana basada en la alineación de nucleótidos BLAST en las Tablas 4E, 4G y 9, o cualquier combinación de las mismas está elevada en comparación con un control estándar, la embarazada está en riesgo de tener un embarazo o un resultado neonatal adverso. Cuando se determina un aumento en el nivel de bacterias de uno o más de los taxones bacterianos seleccionados en comparación con el control estándar, indica que la mujer tiene un mayor riesgo de parto prematuro o de dar a luz a un niño con una complicación neonatal. Por ejemplo, cuando el nivel de bacterias de uno o más de los taxones, tales como Megasphaera cerevisiae, Alloscardovia omnicolens, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Parvibacter caecicola, Lactobacillus casei, Veillonella montpelliereis, Anaerococcus senegalensis, Bulleidia extructa, Mycoplasma hominis, Propionimicrobium lymphophilum, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos un 92% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank No. de acceso JQ781443.1, Corynebacterium pyruviciproducens, Megasphaera cerevisiae, Acidipila rosea, Murdochiella asaccharolytica, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos del número de acceso de GenBank JF295520, Howardella ureilytica, Actinobaculum schaalii, Peptoniphilus duerdenii, Fastidiosipila sanguinis, Sneathia sanguinegens, Parvimonas micra, Peptoniphilus lacrimalis, un taxón bacteriano especificado por una secuencia genómica 16S ARNr en las Tablas 4A, 4C y 8, y un taxón bacteriano especificado por la clasificación de especies más cercana basada en la alineación de nucleótidos BLAST en las Tablas 4E, 4G y 9, en una muestra de hisopo cervical o vaginal de una mujer embarazada se detecta que es más alta en comparación según el control estándar, la mujer tiene una mayor probabilidad de tener un embarazo adverso y/o un resultado neonatal. Los posibles embarazos adversos o resultados neonatales incluyen, entre otros, parto prematuro a <34 semanas, parto prematuro a <37 semanas, puntaje de Apgar a 1 minuto de <7, puntaje de Apgar a 5 minutos de <7, corioamnionitis, síndrome de dificultad respiratoria, displasia broncopulmonar, hemorragia intraventricular, muerte neonatal dentro de los 7 días posteriores al nacimiento y/o sepsis neonatal. Además, si el sujeto femenino es una mujer embarazada, el posible embarazo adverso o los resultados neonatales incluyen además el parto dentro de un período de aproximadamente 1-196 días (por ejemplo, 1 día, 7 días, 14 días, 21 días, 28 días, 56 días, 84 días, 112 días, 140 días, 168 días o 196 días) después de la toma de la muestra biológica, parto dentro de un período de aproximadamente 1-196 días (por ejemplo, 1 día, 7 días, 14 días, 21 días, 28 días, 56 días, 84 días, 112 días, 140 días, 168 días o 196 días) después de que se realiza la intervención clínica.

El método proporcionado en este documento puede usarse para determinar que la mujer embarazada tiene un riesgo de tener dilatación cervical avanzada o acortamiento cervical avanzado. Por ejemplo, si el nivel de bacterias de al menos un taxón bacteriano, tales como Megasphaera cerevisiae, Alloscardovia omnicolens, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Parvibacter caecicola, Lactobacillus casei, Veillonella montpelliereis, Anaerococcus senegalensis, Bulleidia extructa, Mycoplasma hominis, Propionimicrobium lymphophilum, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos un 92% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank Accession No. JQ781443.1, Corynebacterium pyruviciproducens, Megasphaera cerevisiae, Acidipila rosea, Murdochiella asaccharolytica, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank No. de acceso JF295520.1, Howardella ureilytica, Actinobaculum schaalii, Peptoniphilus duerdenii, Fastidiosipila sanguinis, Sneathia sanguinegens, Parvimonas micra, Peptoniphilus lacrimalis, un taxón bacteriano especificado por una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S en las Tablas 4A, 4C y 8, y un taxón bacteriano especificado por la clasificación de especies más cercana basada en la alineación de nucleótidos BLAST en las Tablas 4E, 4G y 9 es mayor que la de un nivel de control estándar, la mujer tiene una mayor probabilidad de tener dilatación cervical avanzada o acortamiento cervical prematuro. Se predice que dicho sujeto exhibirá dilatación cervical de, por ejemplo, > 2 cm, sin trabajo de parto activo entre 13 semanas y hasta 37 semanas de gestación, o acortamiento cervical antes del trabajo de parto a término completo y el parto.

En algunos casos, el método puede incluir además detectar en la muestra biológica el nivel de bacterias de al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo que consiste en Jonquetella anthropi, Aerococcus urinae, un taxón bacteriano especificado por una secuencia de nucleótidos de 16S ARNr en Tablas 4B y 4D, y un taxón bacteriano especificado por la clasificación de especies más cercana basada en la alineación de nucleótidos BLAST en las Tablas 4F y 4H; y determinar que el sujeto femenino tiene un mayor riesgo de un resultado adverso del embarazo si el nivel de bacterias del al menos un taxón bacteriano es más bajo que el de un nivel de control estándar.

Si se predice que la mujer embarazada tendrá un embarazo o un resultado neonatal adverso, el método puede incluir repetir los pasos (a) y (b) en un momento posterior usando un tipo de muestra de la muestra biológica del sujeto femenino, en donde un aumento en el nivel de bacterias del al menos un taxón bacteriano en el momento posterior en comparación con el nivel determinado en el paso original (a) indica un mayor riesgo de tener un embarazo o un resultado neonatal adverso. Además, una vez que se indica que una mujer embarazada tiene un mayor riesgo de experimentar un embarazo o un resultado neonatal adverso, un médico puede proporcionar tratamiento para que la mujer minimice el riesgo de dicho resultado adverso. Por ejemplo, la mujer puede ser monitorizada de cerca durante el embarazo o ser transferida oportunamente a una unidad terciaria con cuidados intensivos neonatales.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit para determinar el riesgo de tener un embarazo o un resultado neonatal adverso en un sujeto femenino. El kit de esta divulgación puede incluir (a) un control estándar que proporciona una muestra biológica tomada de una mujer embarazada y que contiene bacterias que pertenecen a al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo que consiste en Megasphaera cerevisiae, Alloscardovia omnicolens, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Parvibacter caecicola, Lactobacillus casei, Veillonella montpellierensis, Anaerococcus senegalensis, Bulleidia extructa, Mycoplasma hominis, Propionimicrobium lymphophilum, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 92% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank No. de acceso JQ781443.1, Corynebacterium pyruviciproducens, Megasphaera cerevisiae, Acidipila rosea, Murdochiella asaccharolytica, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos ARNr 16S con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank Accession No. JF295520.1, Howardella ureilytica, Actinobaculum schaalii, Peptoniphilus duerdenii, Fastidiosipila sanguinis, Sneathia sanguinegens, Parvimonas micra, Peptoniphilus lacrimalis, un taxón bacteriano especificado por una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S en las Tablas 4A, 4C y 8; y un taxón bacteriano especificado por la clasificación de especies más cercana basada en la alineación de nucleótidos BLAST en las Tablas 4E, 4G y 9 y (b) uno o más agentes que identifican específica y cuantitativamente al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo que consiste en Megasphaera cerevisiae, Alloscardovia omnicolens , Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Parvibacter caecicola, Lactobacillus casei, Veillonella montpellierensis, Anaerococcus senegalensis, Bulleidia extructa, Mycoplasma hominis, Propionimicrobium lymphophilum, bacteria no cultivada que tiene una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos 92% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank No. de acceso JQ781443.1, Corynebacterium pyruviciproducens, Megasphaera cerevisiae, Acidipila rosea, Murdochiella asaccharolytica, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos ARNr 16S con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank Accession No. JF295520.1, Howardella ureilytica, Actinobaculum schaalii, Peptoniphilus duerdenii, Fastidiosipila sanguinis, Sneathia sanguinegens, Parvimonas micra, Peptoniphilus lacrimalis y un taxón bacteriano especificado por una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S en las Tablas 4A, 4C y 8, y un taxón bacteriano especificado por la clasificación de especies más cercana basada en la alineación de nucleótidos BLAST en las Tablas 4E, 4G y 9. En algunas realizaciones, el uno o más agentes pueden incluir uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos que hibridan específicamente y amplifican un polinucleótido del al menos un género bacteriano en un ensayo de amplificación. En algunas realizaciones, el uno o más agentes pueden incluir además una sonda polinucleotídica que hibrida específicamente con una secuencia polinucleotídica del al menos un taxón bacteriano. En algunos casos, el kit incluye un manual de instrucciones.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar si una mujer embarazada tiene un mayor riesgo de tener dilatación cervical avanzada o acortamiento cervical prematuro. El método de esta divulgación incluye los pasos de (a) extraer ácidos nucleicos de una muestra biológica tomada del sujeto femenino; (b) detectar en los ácidos nucleicos el nivel de al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo que consiste en Megasphaera cerevisiae, Alloscardovia omnicolens, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Parvibacter caecicola, Lactobacillus casei, Veillonella montpellierensis, Anaerococcus senegalensis, Bulleidia extructa, Mycoplasma hominis, Propionimicrobium lymphophilum, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos 16S ARNr con al menos un 92% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank Accession No JQ781443.1, Corynebacterium pyruviciproducens, Megasphaera cerevisiae, Acidipila rosea, Murdochiella asaccharolytica, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos del número de acceso de GenBank JF295520.1, Howardella ureilytica, Actinobaculum schaalii, Peptoniphilus duerdenii, Fastidiosipila sanguinis, Sneathia sanguinegens, Parvimonas micra, Peptoniphilus lacrimalis, un taxón especificado por una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S en las Tablas 4A, 4C y 8, y un taxón bacteriano especificado por la clasificación de especies más cercana basada en la alineación de nucleótidos BLAST en las Tablas 4E, 4G y 9; y (c) determinar que el sujeto femenino tiene un mayor riesgo de tener dilatación cervical avanzada o acortamiento cervical prematuro si el nivel del al menos un taxón bacteriano es mayor que el de un nivel de control estándar. Por ejemplo, se predice que una mujer embarazada corre el riesgo de tener un cérvix dilatada prematuramente y/o un cuello uterino acortado prematuramente, si se determina que tiene un mayor nivel de bacterias de uno o más de los taxones bacterianos seleccionados en su cuello uterino o vagina. Si ella tiene más bacterias del grupo, como Megasphaera cerevisiae, Alloscardovia omnicolens, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Parvibacter caecicola, Lactobacillus casei, Veillonella montpellierensis, Anaerococcus senegalensis, Bulleidia extructa, Mycoplasma hominis, Propionimicrobium lymphophilum, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos 16S ARNr con al menos 92% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank Accession No. JQ781443.1, Corynebacterium pyruviciproducens, Megasphaera cerevisiae, Acidipila rosea, Murdochiella asaccharolytica, bacterias no cultivadas que tienen una secuencia de nucleótidos 16S ARNr con al menos 90% de secuencia de nucleótidos ARNr con Identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank No. de acceso JF295520.1, Howardella ureilytica, Actinobaculum schaalii, Peptoniphilus duerdenii, Fastidiosipila sanguinis, Sneathia sanguinegens, Parvimonas micra, Peptoniphilus lacrimalis, un taxón bacteriano especificado por una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S en las Tablas 4A, 4C y 8, un taxón bacteriano especificado por la clasificación de especies más cercana basada en la alineación de nucleótidos BLAST en las Tablas 4E, 4G y 9, o cualquier combinación de las mismas en su cuello uterino o vagina en, por ejemplo, aproximadamente 13 a aproximadamente 25 semanas de gestación,. es probable que ella tenga un cérvix dilatada o un cuello uterino acortado antes de aproximadamente 34 a aproximadamente 37 semanas de gestación. Se pueden detectar al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 taxones bacterianos diferentes en la muestra.

En algunas realizaciones, la muestra biológica es un hisopo cervical, un hisopo vaginal, una muestra de orina, una muestra de líquido amniótico, una muestra de sangre materna, una muestra de suero materno, una muestra de plasma materno, una muestra de moco cervical, un hisopo de placenta, un hisopo del cordón umbilical o cualquier muestra tomada directa o indirectamente del sistema reproductivo o del sistema gastrointestinal. El paso de detección puede ser un ensayo de amplificación de polinucleótidos, un ensayo que implica la determinación de la secuencia de polinucleótidos o un ensayo que implica la hibridación sonda/cebador específico de la secuencia. En algunos casos, el ensayo de amplificación es un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Opcionalmente, el ensayo de PCR es un ensayo de PCR cuantitativo o un ensayo de PCR de transcriptasa reversa.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1E muestran la asociación entre los resultados clínicos, como el parto prematuro espontáneo (sPTB) después de la intervención y el parto a término (TB) después de la intervención, y los taxones bacterianos. La Figura 1A muestra los resultados clínicos de 25 pacientes con insuficiencia cervical (IC) después de la intervención. Cada columna representa a un paciente (P1-P25) en orden ascendente de edad gestacional (GA) al momento del parto. Rectángulos negros: P1-P10 que resultan en "parto prematuro espontáneo (sPTB) <34 semanas después de la intervención". Rectángulos blancos: P11-P25 resultando en "parto a término (TB) >37 semanas después de la intervención". Latencia, el intervalo entre el tratamiento y el parto. SDR, síndrome de dificultad respiratoria. DBP, displasia broncopulmonar. VIH, hemorragia intraventricular. ROP, retinopatía del prematuro. Muerte neonatal, muerte dentro de los 28 días posteriores al parto. Y Sí n, no; -, no determinado. Las Figuras 1B y 1C muestran los 10 taxones bacterianos más abundantes en los cérvices CI "sPTB después de la intervención" y "TB después de la intervención", respectivamente. Los valores mostrados son el log10 de los valores de abundancia (recuentos de lectura de secuenciación normalizada, el método de Escala de suma acumulativa (CSS)) de cada taxón bacteriano (fila) en la muestra de hisopo cervical de cada paciente (columna). Los recuentos de lectura normalizados se transforman en log (abundancia) como se indica en la Figura IE. Cada fila representa una unidad taxonómica operativa (Otu) formada por secuencias de agrupamiento de identidad >97%. Cada Otu se clasifica taxonómicamente a nivel de género utilizando el Clasificador de ARNr Bayesiano Naive del Ribosomal Database Project (RDP) (Versión 2.9, septiembre de 2014, RDP 16S ARNr conjunto de entrenamiento 10). Los Lactobacillus se comparan con la base de datos 16S ARNr (GenBank) utilizando BLAST (puntaje más alto) y MOLE-BLAST (la mejor alineación múltiple de coincidencias BLAST) para obtener la información de la especie. La Figura ID muestra los taxones bacterianos diferencialmente abundantes entre los grupos "sPTB después de la intervención" (n=10) y "TB después de la intervención" (n=15) (prueba de suma de rango de Mann-Whitney). Siete taxones permanecen como diferencialmente abundantes después del ajuste para múltiples pruebas por el método de False Discovery Rate (FDR) (p <0.05 y valor q <0.05, es decir, FDR <5%, en asterisco). Los últimos 6 taxones con p <0.01 se seleccionan adicionalmente para calcular una puntuación resumida, es decir, la abundancia total log (base 10) del valor de 6 taxones seleccionados (LA6) para cada muestra de hisopo cervical. La abundancia total es la suma aritmética de las abundancias de los taxones seleccionados en escala común (lineal).

Las figuras 2A-2C proporcionan análisis estadístico y valores de LA6 para los dos grupos, por ejemplo, pacientes con parto prematuro espontáneo (sPTB) después de la intervención y pacientes con parto a término (TB) después de la intervención. La figura 2A proporciona valores LA6 (la abundancia total de los 6 taxones bacterianos seleccionados en escala logarítmica (base 10)) en dos grupos de pacientes con insuficiencia cervical (IC) que reciben intervención clínica pero que dan como resultado resultados diferentes. Se tomaron muestras de hisopo cervical para medir el LA6 de pacientes con IC antes de la intervención de cerclaje/pesario. Después del tratamiento, 10 pacientes resultaron en parto prematuro espontáneo <34 semanas (el grupo "sPTB después de la intervención", círculos), y 15 pacientes resultaron en parto a término >37 semanas (el grupo "TB después del tratamiento", triángulos). Los 6 taxones se seleccionaron en función de sus abundancias significativamente diferentes (p <0.01) entre estos dos grupos en los datos de secuenciación masivamente paralelos (Figura ID). Las líneas horizontales largas y cortas de la barra de error se dibujan en el rango medio e intercuartil, respectivamente. La figura 2B muestra la proporción de embarazos no culminados en parto en diferentes períodos de gestación en pacientes con IC con LA6 >1.15 (LA6-positivo) versus aquellas con LA6 < 1.15 (LA6-negativo). Pacientes con LA6 positivos entregados antes de la intervención clínica que los pacientes con LA6 (edad gestacional media al parto de 23.7 semanas vs. 38.4 semanas; intervalo de confianza del 95%, 20.6 semanas - 25.4 semanas vs. 38.0 semanas - 38.7 semanas; Chi-cuadrado, 32.352; df, 1; prueba de Logrank, p <0.0001; razón de riesgo, 6.24; intervalo de confianza del 95%, 1.50 a 25.9). Los intervalos de confianza del 95% de los porcentajes de embarazos no culminados en parto para pacientes LA6-positivas y LA6-negativas se muestran como líneas alrededor de la línea continua en negrita y la línea de puntos en negrita, respectivamente. La figura 2C muestra la proporción de embarazos no culminados en parto en diferentes días después del tratamiento en pacientes con IC LA6 positivo versus LA6 negativo. Pacientes con LA6 positivos entregados por un período más corto después de la intervención que sus homólogos con LA6 negativos (mediana número de días entre la intervención y el parto, 10 días frente a 126 días; intervalo de confianza del 95%, 8 días - 32 días frente a 112 días - 134 días; Chicuadrado, 32.520; df, 1; Prueba de Logrank, p <0.00001; razón de riesgo, 6.34; intervalo de confianza del 95%, 1.51 a 26.6).

Definiciones

En esta divulgación, el término "o" se emplea generalmente en su sentido que incluye "y/o" a menos que el contenido indique claramente lo contrario.

El término "embarazo adverso o resultado neonatal" se refiere a una afección que reduce la posibilidad de dar a luz/dar a luz a un bebé sano. Ejemplos no limitantes de un resultado adverso del embarazo incluyen abortos espontáneos múltiples en el primer trimestre, pérdida del embarazo en el segundo trimestre, parto prematuro (por ejemplo, espontáneo o indicado), preclampsia prematura, clampsia prematura, restricción del crecimiento fetal, desprendimiento de placenta, muerte fetal/muerte fetal , defectos de nacimiento, puntaje de Apgar a 1 minuto de <7, puntaje de Apgar a 5 minutos de <7, corioamnioitis clínica, corioamnioitis patológica, síndrome de dificultad respiratoria neonatal, displasia broncopulmonar neonatal, sepsis neonatal, hemorragia intraventricular neonatal, etc.

El término "insuficiencia cervical" se refiere a una afección del cuello uterino, tal como debilitamiento o dilatación avanzada del cuello uterino que puede conducir a la pérdida del embarazo o al nacimiento en el segundo trimestre. La debilidad cervical, el acortamiento cervical prematuro, la dilatación cervical prematura o avanzada, el traumatismo cervical, una anomalía estructural del cuello uterino o cualquier combinación de estos pueden contribuir a la insuficiencia cervical. Las intervenciones clínicas para controlar la insuficiencia cervical incluyen, pero no se limitan a, suplementos de progesterona, cerclaje cervical y pesario cervical.

El término "taxón bacteriano" se refiere a la taxonomía, es decir, la clasificación de bacterias basada en el rango. La clasificación biológica jerárquica incluye vida, dominio, reino, filum, clase, orden, familia, género y especie.

El término "muestra biológica" o "muestra" incluye secciones de tejidos tales como muestras de biopsia y autopsia, y secciones congeladas tomadas con fines histológicos, o formas procesadas de cualquiera de tales muestras. Las muestras biológicas incluyen un hisopo cervical, un hisopo vaginal, un hisopo uterino, fracciones de sangre y sangre o productos (por ejemplo, suero, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y similares), esputo o saliva, tejido linfático y de la lengua, células cultivadas, por ejemplo, cultivos primarios, explantes y células transformadas, heces, orina, un tejido de biopsia, etc. Una muestra biológica se obtiene típicamente de un organismo eucariota, que puede ser un mamífero, un primate y un sujeto femenino humano.

El término "biopsia" se refiere al proceso de extracción de una muestra de tejido para evaluación diagnóstica o pronóstica, y a la muestra de tejido en sí. Cualquier técnica de biopsia conocida en la técnica se puede aplicar a los métodos de diagnóstico y pronóstico de la presente descripción. La técnica de biopsia aplicada dependerá del tipo de tejido a evaluar (por ejemplo, cuello uterino, vagina, lengua, colon, próstata, riñón, vejiga, ganglios linfáticos, hígado, médula ósea, células sanguíneas, tejido estomacal, etc.) entre otros factores. Las técnicas representativas de biopsia incluyen, pero no se limitan a, una biopsia con hisopo, biopsia por escisión, biopsia por incisión, biopsia con aguja, biopsia quirúrgica y biopsia de médula ósea y pueden comprender colonoscopia. Los expertos en la materia conocen una amplia gama de técnicas de biopsia que elegirán entre ellas y las implementarán con una mínima experimentación.

En esta divulgación, el término molécula de ácido nucleico "aislada" significa una molécula de ácido nucleico que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que normalmente están asociadas con la molécula de ácido nucleico aislada. Por lo tanto, una molécula de ácido nucleico "aislada" incluye, sin limitación, una molécula de ácido nucleico que está libre de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente uno o ambos extremos del ácido nucleico en el genoma del organismo del que se deriva el ácido nucleico aislado (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o digestión con endonucleasa de restricción). Dicha molécula de ácido nucleico aislada se puede introducir en un vector (por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión) por conveniencia de manipulación o para generar una molécula de ácido nucleico de fusión. Además, una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir una molécula de ácido nucleico diseñada, tal como una molécula de ácido nucleico recombinante o sintética. Una molécula de ácido nucleico que existe entre cientos y millones de otras moléculas de ácido nucleico dentro de, por ejemplo, una biblioteca de ácido nucleico (por ejemplo, una biblioteca de ADNc o genómica) o un gel (por ejemplo, agarosa o poliacrilamina) que contiene ADN genómico digerido por restricción, no es un ácido nucleico "aislado".

El término "ácido nucleico", "nucleótido o" polinucleótido "se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y sus polímeros en forma monocatenaria o bicatenaria. A menos que esté específicamente limitado, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácido nucleico también abarca implícitamente variantes modificadas de manera conservadora (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem 260: 2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Célula. Probes 8: 91-98 (1994)). El término ácido nucleico se usa indistintamente con gen, ADNc y ARNm codificado por un gen.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos naturales y a los polímeros de aminoácidos no naturales. Como se usa en el presente documento, los términos abarcan cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluidas proteínas de longitud completa (es decir, antígenos), en donde los residuos de aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos covalentes.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que luego se modifican, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Para los fines de esta solicitud, los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil sulfonio. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos de péptidos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Para los propósitos de esta solicitud, los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido natural.

Los aminoácidos pueden incluir aquellos que tienen D-quiralidad no natural, como se describe en el documento WO01/12654, que puede mejorar la estabilidad (por ejemplo, vida media), biodisponibilidad y otras características de un polipéptido que comprende uno o más de tales D-aminoácidos. En algunos casos, uno o más, y potencialmente todos los aminoácidos de un polipéptido terapéutico tienen D-quiralidad.

Se puede hacer referencia a los aminoácidos en este documento por los símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Los nucleótidos, del mismo modo, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.

Los términos "idéntoco" o porcentaje de identidad, en el contexto de la descripción de dos o más secuencias de polinucleótidos o aminoácidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o los nucleótidos que son iguales (por ejemplo, una variante de una proteína bacteriana o interés utilizado en el método de esta invención (por ejemplo, para predecir resultados adversos del embarazo) tiene al menos 80% de identidad de secuencia, preferiblemente 85%, 90%, 91%, 92%, 93, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad, a una secuencia de referencia, por ejemplo, una proteína bacteriana de interés de tipo salvaje correspondiente), cuando se compara y se alinea para obtener una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada o medida, usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante alineación manual e inspección visual. Dichas secuencias se dice que son "sustancialmente idénticas". Con respecto a las secuencias de polinucleótidos, esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. Preferiblemente, la identidad existe sobre una región que tiene al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o más preferiblemente sobre una región que tiene una longitud de 75-100 aminoácidos o nucleótidos.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y referencia se ingresan en una computadora, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Se pueden usar los parámetros predeterminados del programa o se pueden designar parámetros alternativos. Luego, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, en función de los parámetros del programa. Para la comparación de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas, se utilizan los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 y los parámetros predeterminados que se analizan a continuación.

Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, incluye referencia a un segmento de cualquiera de la cantidad de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de 20 a 600, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en donde se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de manera óptima. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Matemáticas. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspecció visual (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds.

1995 supplement)).

Ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLa St 2.0, que se describen en Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403­ 410 and Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente en el sitio web del National Center for Biotechnology Information, ncbi.nlm.nih.gov. El algoritmo implica primero identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen una puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se conoce como el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al., supra). Estas coincidencias iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Luego, las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulativa. Los puntajes acumulativos se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntaje de penalización para residuos que no coinciden; siempre <0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; el puntaje acumulativo va a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto un tamaño de palabra (W) de 28, una expectativa (E) de 10, M=1, N=-2 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto un tamaño de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver, por ejemplo, Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89: 10915 (1989)).

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin and Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.2, más preferiblemente menor que aproximadamente 0.01, y lo más preferiblemente menor que aproximadamente 0.001.

Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es reactivo cruzado inmunológicamente con los anticuerpos generados contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por lo tanto, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, donde los dos péptidos difieren solo por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en condiciones estrictas, como se describe a continuación. Otra indicación más de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que pueden usarse los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

Los términos "condiciones de hibridación restrictivas" y "alta restricción" se refieren a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará con su subsecuencia diana, típicamente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero no con otras secuencias. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) y será fácilmente comprendido por los expertos en la materia. Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean aproximadamente 5-10°C más bajas que el punto de fusión térmica (T^m) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definido. La T^m es la temperatura (bajo una fuerza iónica definida, pH y concentración nucleica) a la que el 50% de las sondas complementarias al objetivo se hibridan con la secuencia objetivo en equilibrio (ya que las secuencias objetivo están presentes en exceso, a T^m , 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). También se pueden lograr condiciones estrictas con la adición de agentes desestabilizadores como la formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces el fondo, preferiblemente 10 veces la hibridación de fondo. Las condiciones de hibridación estrictas ejemplares pueden ser las siguientes: 50% de formamida, 5 x SSC y 1% de SDS, incubando a 42°C, o 5 x SSC, 1% de SDS, incubando a 65°C, con lavado en 0.2 x SSC y SDS al 0.1% a 65°C.

Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones restrictivas siguen siendo sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético. En tales casos, los ácidos nucleicos típicamente hibridan en condiciones de hibridación moderadamente estrictas. Ejemplos de "condiciones de hibridación moderadamente estrictas" incluyen una hibridación en un regulador de formamida al 40%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 1x SSC a 45°C. Una hibridación positiva es al menos dos veces de fondo. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente que pueden utilizarse condiciones de hibridación y lavado alternativas para proporcionar condiciones de restrictividad similar. Se proporcionan pautas adicionales para determinar los parámetros de hibridación en numerosas referencias, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al.

La expresión "se une específicamente" cuando se usa en el contexto de referirse a una secuencia polinucleotídica que forma un complejo bicatenario con otra secuencia polinucleotídica describe la "hibridación polinucleotídica" basada en el emparejamiento de bases de Watson-Crick, como se proporciona en la definición para el término "método de hibridación de polinucleótidos".

Como se usa en esta solicitud, un "aumento" o una "disminución" se refiere a un cambio detectable positivo o negativo en la cantidad de un control de comparación, por ejemplo, un control estándar establecido (tal como un nivel de expresión promedio de un ARNm bacteriano o proteína que se encuentra en el tejido cervical o vaginal normal de un sujeto femenino de control embarazada). Un aumento es un cambio positivo que generalmente es al menos 10%, o al menos 20%, o 50%, o 100%, y puede ser tan alto como al menos 2 veces o al menos 5 veces o incluso 10 veces del valor de control. De manera similar, una disminución es un cambio negativo que típicamente es al menos 10%, o al menos 20%, 30% o 50%, o incluso tan alto como al menos 80% o 90% del valor de control. Otros términos que indican cambios cuantitativos o diferencias desde una base comparativa, como "más", "menos", "más alto" y "más bajo", se usan en esta solicitud de la misma manera que se describe anteriormente. En contraste, el término "sustancialmente igual" o "sustancialmente falta de cambio" indica poco o ningún cambio en la cantidad del valor de control estándar, típicamente dentro de ±10% del control estándar, o dentro de ±5%, 2%, o incluso menos variación del control estándar.

Un "método de hibridación de polinucleótidos", como se usa en el presente documento, se refiere a un método para detectar la presencia y/o cantidad de una secuencia de polinucleótidos predeterminada basada en su capacidad para formar pares de bases Watson-Crick, en condiciones de hibridación apropiadas, con una sonda polinucleotídica de una secuencia conocida. Ejemplos de tales métodos de hibridación incluyen transferencia Southern, transferencia Northern e hibridación in situ.

Los "cebadores", como se usan en el presente documento, se refieren a oligonucleótidos que se pueden usar en un método de amplificación, tal como una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para amplificar una secuencia de nucleótidos basada en la secuencia de polinucleótidos correspondiente a un gen de interés, por ejemplo, el ADNc o secuencia genómica para un gen bacteriano específico o una porción del mismo. Típicamente, al menos uno de los cebadores de PCR para la amplificación de una secuencia de polinucleótidos es específico de secuencia para esa secuencia de polinucleótidos. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluida la temperatura, la fuente del cebador y el método utilizado. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico y pronóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotídico generalmente contiene al menos 10, 15, 20, 25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos o más nucleótidos. Los factores implicados en la determinación de la longitud apropiada del cebador son fácilmente conocidos por un experto en la materia. En esta divulgación, el término "par de cebadores" significa un par de cebadores que hibridan con cadenas opuestas de una molécula de ADN diana o con regiones del ADN diana que flanquean una secuencia de nucleótidos para amplificar. En esta divulgación, el término "sitio de cebador" significa el área del ADN objetivo u otro ácido nucleico con el que se hibrida un cebador.

Una "etiqueta", "etiqueta detectable" o "unidad estructural detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios físicos. Por ejemplo, las etiquetas útiles incluyen 32P, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usan comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas que pueden hacerse detectables, por ejemplo, incorporando un componente radiactivo en el péptido o usado para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido. Normalmente, un marcador detectable se une a una sonda o una molécula con características de unión definidas (por ejemplo, un polipéptido con una especificidad de unión conocida o un polinucleótido), para permitir la presencia de la sonda (y por lo tanto su objetivo de unión) a ser fácilmente detectable.

El "control estándar" tal como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad o concentración predeterminada de bacterias que pertenecen a un género bacteriano específico, un polinucleótido bacteriano o un polipéptido bacteriano que está presente en una muestra de tejido normal establecida, por ejemplo, una muestra de tejido cervical normal. El valor de control estándar es adecuado para el uso de un método de la presente invención, para servir como base para comparar la cantidad de un género bacteriano específico, ARNm o proteína que está presente en una muestra de prueba. Una muestra establecida que sirve como control estándar proporciona una cantidad promedio del género bacteriano, ARNm o proteína que es típica para una muestra de tejido cervical de un ser humano promedio y sano con, por ejemplo, un cuello uterino cerrado o un cuello uterino de longitud normal, como se define convencionalmente. Un valor de control estándar puede variar dependiendo de la naturaleza de la muestra, la forma de recolección de la muestra y otros factores como el sexo, la edad, el origen étnico de los sujetos (y en el caso de las mujeres embarazadas, la edad gestacional) según a quien se establece dicho valor de control.

El término "promedio", como se usa en el contexto de la descripción de una humana que está embarazada y no está en riesgo de tener un embarazo o un resultado neonatal adverso, como se define convencionalmente, se refiere a ciertas características, especialmente la cantidad de bacterias de uno o taxones bacterianos más específicos, encontrados en el cuello uterino de la persona que son representativos de un grupo de humanos embarazadas seleccionados al azar que están libres de cualquier riesgo de tener un embarazo o un resultado neonatal adverso. Este grupo seleccionado debe comprender un número suficiente de humanos de modo que la cantidad promedio de bacterias de los taxones específicos en el cuello uterino entre estos individuos refleje, con una precisión razonable, la cantidad correspondiente de bacterias de los taxones en la población general de humanas sanas, normales, embarazadas. Además, el grupo seleccionado de humanos embarazadas generalmente tiene una edad gestacional similar a la de un sujeto femenino cuya muestra de tejido cervical se analiza para indicar un riesgo de tener un embarazo o un resultado neonatal adverso. Además, también se consideran otros factores como la edad, el estado de recibir el mismo tipo de intervención o similar (por ejemplo, intervención de pesario/cerclaje), origen étnico, historial médico y, de preferencia, coinciden estrechamente entre los perfiles del sujeto femenino de prueba y el grupo seleccionado. de individuos que establecen el valor "promedio".

El término "cantidad" o "nivel" como se usa en esta solicitud se refiere a la cantidad de un taxón bacteriano de interés, un polinucleótido bacteriano de interés o un polipéptido bacteriano de interés presente en una muestra. Dicha cantidad puede expresarse en términos absolutos, es decir, la cantidad total del taxón, polinucleótido o polipéptido bacteriano en la muestra, o en términos relativos, es decir, la concentración del taxón, polinucleótido o polipéptido bacteriano en la muestra.

El término "sujeto" incluye individuos que buscan atención médica debido a un riesgo potencial de tener un resultado adverso del embarazo o un resultado neonatal, por ejemplo, cualquier persona embarazada. Los sujetos también incluyen individuos que han tenido un embarazo o un resultado neonatal adverso durante un embarazo anterior.

Descripción detallada de la invención

I. Introducción

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de taxones bacterianos diferencialmente abundantes en las muestras de hisopo cervical de mujeres con dilatación cervical avanzada/acortamiento cervical, en comparación con aquellas en muestras apropiadamente controladas de mujeres emparejadas apropiadamente sin la correspondiente condición. El nivel elevado de bacterias de taxones particulares (por ejemplo, Megasphaera cerevisiae, Alloscardovia omnicolens, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Parvibacter ciecicola, Lactobacillus casei, Veillonella montpellierens, Anaerococcus senegalensis, Bulleidia extructa, Mycoplasma hominis, Propionimicrobium lymphophilum, bacterias no cultivadas que tienen al menos 92% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank Accession No. JQ781443.1, Corynebacterium pyruviciproducens, Megasphaera cerevisiae, Acidipila rosea, Murdochiella asaccharolytica, bacterias no cultivadas que tienen al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank Accession No. JF295520.1, Howardella ureilytica, Actinobaculum schaalii, Peptoniphilus duerdenii, Fastidiosipila sanguinis, Sneathia sanguinegens, Parvimonas micra, Peptoniphilus lacrimalis, un taxón bacteriano especificado por una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S en las Tablas 4A, 4C y 8, y un taxón bacteriano especificado por la clasificación de especies más cercana basada en la alineación de nucleótidos BLAST en las Tablas 4E, 4G y 9) también es predictivo de un riesgo de tener un embarazo adverso o resultado neonatal, como parto prematuro (por ejemplo, parto prematuro espontáneo) <34 semanas, parto prematuro (por ejemplo, parto prematuro espontáneo) <37 semanas, parto dentro de un período posterior a la toma de la muestra biológica (por ejemplo, 1 día, 7 días, 14 días, 21 días, 28 días, 56 días, 84 días, 112 días, 140 días, 168 días, 196 días), parto dentro de un período posterior a la realización de la intervención clínica (por ejemplo, 1 día, 7 días, 14 días, 21 días, 28 días, 56 días, 84 días, 112 días, 140 días, 168 días, 196 días), una puntuación de Apgar a I minuto <7, una puntuación de Apgar a 5 minutos <7, corioamnionitis (por ejemplo, clínica o patológica), síndrome de dificultad respiratoria, displasia broncopulmonar, hemorragia intraventricular, muerte neonatal dentro de los 7 días posteriores al nacimiento y sepsis neonatal .

II Metodología general

La práctica de esta invención utiliza técnicas de rutina en el campo de la biología molecular. Los textos básicos que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).

Para los ácidos nucleicos, los tamaños se dan en kilobases (kb) o pares de bases (pb). Estas son estimaciones derivadas de electroforesis en gel de agarosa o acrilamida, de ácidos nucleicos secuenciados o de secuencias de ADN publicadas. Para las proteínas, los tamaños se dan en kilodaltons (kDa) o números de residuos de aminoácidos. Los tamaños de las proteínas se estiman a partir de la electroforesis en gel, de proteínas secuenciadas, de secuencias de aminoácidos derivadas o de secuencias de proteínas publicadas.

Los oligonucleótidos que no están disponibles comercialmente pueden sintetizarse químicamente, por ejemplo, de acuerdo con el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981), usando un sintetizador automatizado, como se describe en Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984). La purificación de oligonucleótidos se realiza utilizando cualquier estrategia reconocida en la técnica, por ejemplo, electroforesis en gel de acrilamida nativa o cromatografía líquida de alto rendimiento de intercambio aniónico (HPLC) como se describe en Pearson and Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983).

III. Adquisición de muestras de tejido y análisis de taxones bacterianos

La presente invención se refiere a medir la cantidad de bacterias de un taxón bacteriano específico que se encuentra en el cuello uterino o la vagina de una mujer embarazada, especialmente en una muestra de hisopo cervical o vaginal, como un medio para evaluar el riesgo de tener un resultado adverso del embarazo. o resultado neonatal, tal como la labor de parto prematuro y el alumbramiento prematuro. Por lo tanto, los primeros pasos antes de practicar esta invención son obtener una muestra de tejido cervical o vaginal de un sujeto femenino de prueba, de tal manera que se puedan analizar los ácidos nucleicos, por ejemplo, ARN o ADN, contenidos en la muestra. En algunas realizaciones, la cantidad de bacterias de un taxón de bacterias específico encontradas en el cuello uterino o la vagina de una mujer embarazada puede representarse por la cantidad de bacterias específicas en una muestra biológica que no proviene del cuello uterino o la vagina.

A. Adquisición y preparación de muestras biológicas.

Una muestra biológica, tal como tejido cervical o vaginal, moco cervical, líquido amniótico o sangre materna se obtiene de una persona para ser analizada o controlada usando un método de la presente invención. La recolección de células epiteliales cervicales o vaginales, moco cervical, líquido amniótico o sangre materna (por ejemplo, sangre entera, suero materno y/o plasma materno) de un individuo se realiza de acuerdo con el protocolo estándar que generalmente siguen los hospitales o clínicas, como durante un examen cervical. Se recolecta una cantidad apropiada de epitelio cervical o vaginal, células raspadas, moco y/o líquido biológico y se puede almacenar de acuerdo con los procedimientos estándar antes de la preparación posterior.

El análisis de las bacterias encontradas en la muestra de una paciente embarazada según la presente invención puede realizarse usando, por ejemplo, células, tejidos, mucosas o fluidos encontrados en la muestra. Los métodos para preparar muestras de células, tejidos o fluidos para la extracción de ácido nucleico son bien conocidos entre los expertos en la materia. Por ejemplo, la muestra de mucosa cervical o vaginal de un sujeto femenino puede tratarse de tal manera que se pueda analizar el ADN o ARN bacteriano en la muestra.

B. Extracción y cuantificación de ADN.

Existen numerosos métodos para extraer ADN bacteriano de una muestra biológica. Los métodos para extraer ADN de una muestra biológica son bien conocidos y se practican habitualmente en el arte de la biología molecular, véase, por ejemplo, Sambrook and Russell, supra. La contaminación por ARN debe eliminarse para evitar interferencias con el análisis de ADN. El tratamiento previo de la muestra biológica con regulador de lisis y enzimas, incluidas la mutanolisina y la proteinasa K, también se puede utilizar antes de la extracción. Los métodos para detectar el ADN objetivo incluyen análisis por PCR, análisis cuantitativo con marcado de fluorescencia o análisis de transferencia Southern. El ADN objetivo puede ser el gen que codifica el ARN ribosómico 16S (el gen 16S ARNr) u otros genes o secuencias genómicas de interés que posee un taxón bacteriano específico.

Una variedad de métodos de amplificación de polinucleótidos están bien establecidos y se usan con frecuencia en la investigación. Por ejemplo, los métodos generales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación de la secuencia de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica y, por lo tanto, no se describen en detalle aquí. Para una revisión de los métodos, protocolos y principios de PCR en el diseño de cebadores, ver, por ejemplo, Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. NY, 1990. Los reactivos y protocolos de PCR también son disponible de proveedores comerciales, como Roche Molecular Systems.

Aunque la amplificación por PCR se usa típicamente en la práctica de la presente invención, un experto en la materia reconocerá que la amplificación de la secuencia genómica relevante puede lograrse mediante cualquier método conocido, tal como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la transcripción. amplificación mediada y replicación de secuencia autosostenida o amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), cada una de las cuales proporciona amplificación suficiente. La tecnología de ADN ramificado desarrollada más recientemente también puede usarse para determinar cuantitativamente la cantidad de marcadores de ARNm bacterianos específicos. Para una descripción detallada de la amplificación de la señal de ADN ramificado para la cuantificación directa de secuencias de ácido nucleico en muestras clínicas, véase, por ejemplo, Nolte, Adv. Clin. Chem 33: 201-235, 1998.

Las técnicas para la determinación de la secuencia de polinucleótidos también están bien establecidas y se practican ampliamente en el campo de investigación relevante. Por ejemplo, los principios básicos y las técnicas generales para la secuenciación de polinucleótidos se describen en varios informes de investigación y tratados sobre biología molecular y genética recombinante, como Wallace et al., Supra; Sambrook and Russell, supra, y Ausubel et al., supra. Los métodos de secuenciación de ADN practicados rutinariamente en laboratorios de investigación, ya sean manuales o automatizados, pueden usarse para practicar la presente invención. Los medios adicionales adecuados para detectar una secuencia de polinucleótidos para practicar los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, espectrometría de masas, extensión de cebadores, hibridación de polinucleótidos, PCR en tiempo real, análisis de curvas de fusión, análisis de fusión de alta resolución, análisis de heterodúplex, secuenciación en paralelos masiva (por ejemplo, secuenciación de próxima generación) y electroforesis.

C. Extracción y cuantificación de ARN

Un experto en la materia reconoce que existen numerosos métodos para extraer ARN bacteriano de una muestra biológica. Se pueden seguir los métodos generales de preparación de ARN (por ejemplo, descritos por Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., 2001); diversos reactivos o kits disponibles comercialmente, como el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), los kits de ARNm directo Oligotex (Qiagen, Valencia, CA), los minikits RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) y PolyATtract® Series 9600™ (Promega , Madison, WI), también se puede utilizar para obtener ARNm de una muestra biológica de un sujeto femenino de prueba. También se pueden usar combinaciones de más de uno de estos métodos.

Es esencial que todo el ADN contaminante se elimine de las preparaciones de ARN. Por lo tanto, se debe utilizar un manejo cuidadoso de las muestras, un tratamiento exhaustivo con DNasa y controles negativos adecuados en los pasos de amplificación y cuantificación.

D. Determinación cuantitativa basada en PCR del nivel de ARN

Una vez que se extrae el ARN de una muestra, se puede cuantificar la cantidad de cualquier transcripción de ARN de interés que expresen las bacterias de un taxón bacteriano específico. Por ejemplo, la cantidad de ARN ribosómico 16S (ARNr) para un taxón bacteriano en particular, como, entre otros, Megasphaera cerevisiae, Alloscardovia omnicolens, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Parvibacter caecicola, Lactobacillus casei, Veillonella montpellierensis, Anaerococcus senegalensis, Bulleidia extructa, Mycoplasma hominis, Propionimicrobium lymphophilum, bacterias no cultivadas que tienen al menos un 92% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de GenBank Accession No. JQ781443.1, Corynebacterium pyruviciproducens, Megasphaera cerevisiae, Acidipila rosea, Murdochiella asaccharolytica, bacterias no cultivadas que tienen al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos del número de acceso de GenBank JF295520.1,Howardella ureilytica, Actinobaculum schaalii, Peptoniphilus duerdenii, Fastidiosipila sanguinis, Sneathia sanguinegens, Parvimonas micra, Peptoniphilus lacrimalis, un taxón bacteriano especificado por un secuencia de nucleótidos Tablas 4A, 4C y 8, y se puede detectar y medir un taxón bacteriano especificado por la clasificación de especies más cercana basada en la alineación de nucleótidos BLAST en las Tablas 4E, 4G y 9. El método preferido para determinar el nivel de transcripción de ARN es un método basado en la amplificación, por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), especialmente la reacción en cadena de la polimerasa por transcripción reversa (RT-PCR).

Antes de la etapa de amplificación, se debe sintetizar una copia de ADN (ADNc) de una transcripción de ARN bacteriano de interés. Esto se logra mediante la transcripción reversa, que puede llevarse a cabo como un paso separado, o en una reacción en cadena homogénea de la polimerasa de la transcripción reversa (RT-PCR), una modificación de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el ARN. Romero y Rotbart describen los métodos adecuados para la amplificación por PCR de ácidos ribonucleicos en Diagnostic Molecular Biology: Principles and Applications págs. 401-406; Persing et al., Eds., Mayo Foundation, Rochester, MN, 1993; Egger et al., J. Clin. Microbiol 33: 1442-1447, 1995; y Patente de los Estados Unidos No. 5.075.212.

Los métodos generales de PCR son bien conocidos en la técnica y, por lo tanto, no se describen en detalle aquí. Para una revisión de los métodos, protocolos y principios de PCR en el diseño de cebadores, ver, por ejemplo, Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990. Los reactivos y protocolos de PCR también son disponible de proveedores comerciales, como Roche Molecular Systems.

La PCR se lleva a cabo generalmente como un proceso automatizado con una enzima termoestable. En este proceso, la temperatura de la mezcla de reacción se cicliza a través de una región desnaturalizante, una región de fusión de cebador y una región de reacción de extensión automáticamente. Las máquinas específicamente adaptadas para este propósito están disponibles comercialmente.

Aunque la amplificación por PCR del ARN objetivo se usa típicamente en la práctica de la presente invención. Sin embargo, un experto en la materia reconocerá que la amplificación de estas especies de ARN bacterianas en la muestra se puede lograr mediante cualquier método conocido, como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación mediada por la transcripción y la replicación de secuencia autosostenida o amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), cada una de las cuales proporciona amplificación suficiente. La tecnología de ADN ramificado desarrollada más recientemente también se puede utilizar para determinar cuantitativamente la cantidad de marcadores de ARN bacterianos específicos. Para una revisión de la amplificación de la señal de ADN ramificado para la cuantificación directa de secuencias de ácido nucleico en muestras clínicas, ver Nolte, Adv. Clin. Chem 33: 201-235, 1998.

E. Otros métodos cuantitativos para ADN y ARN

Las transcripciones bacterianas de ADN o ARN de interés también se pueden detectar utilizando otras técnicas estándar, bien conocidas por los expertos en la materia. Aunque la etapa de detección está precedida típicamente por una etapa de amplificación, la amplificación no es necesaria en los métodos de la invención. Por ejemplo, el ADN o el ARN pueden identificarse por fraccionamiento de tamaño (por ejemplo, electroforesis en gel), ya sea que se proceda o no por una etapa de amplificación. Después de analizar una muestra en un gel de agarosa o poliacrilamida y marcar con bromuro de etidio de acuerdo con técnicas bien conocidas (ver, por ejemplo, Sambrook and Russell, supra), la presencia de una banda del mismo tamaño que la comparación estándar es una indicación de la presencia de un ADN o ARN objetivo, cuya cantidad puede compararse con el control en función de la intensidad de la banda. Alternativamente, las sondas de oligonucleótidos específicas para el ADN o ARN de interés pueden usarse para detectar la presencia de tales especies de ADN o ARN e indicar la cantidad de ADN o ARN en comparación con la comparación estándar, en función de la intensidad de la señal impartida por la sonda.

La hibridación de sonda específica de secuencia es un método bien conocido para detectar un ácido nucleico particular que comprende otras especies de ácidos nucleicos. En condiciones de hibridación suficientemente estrictas, las sondas hibridan específicamente solo con secuencias sustancialmente complementarias. La restrictividad de las condiciones de hibridación se puede relajar para tolerar cantidades variables de desajuste de secuencia.

Una serie de formatos de hibridación bien conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, ensayos de hibridación en fase de solución, fase sólida o en fase mixta. Los siguientes artículos proporcionan una visión general de los diversos formatos de ensayo de hibridación: Singer et al., Biotechniques, 4: 230, 1986; Haase et al., Methods in Virology, pp. 189-226, 1984; Wilkinson, Hibridación in situ, Ed. Wilkinson, IRL Press, Oxford University Press, Oxford; y Hames and Higgins eds., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, 1987.

Los complejos de hibridación se detectan según técnicas bien conocidas. Las sondas de ácido nucleico capaces de hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana, es decir, el ARN o el ADN amplificado, pueden marcarse mediante cualquiera de los varios métodos utilizados típicamente para detectar la presencia de ácidos nucleicos hibridados. Un método común de detección es el uso de autorradiografía usando sondas etiquetadas con 3H, 125I, 35S, 14C o 32P, o similares. La elección del isótopo radiactivo depende de las preferencias de investigación debido a la facilidad de síntesis, la estabilidad y la vida media de los isótopos seleccionados. Otros marcadores incluyen compuestos (por ejemplo, biotina y digoxigenina), que se unen a antiligandos o anticuerpos marcados con fluoróforos, agentes quimioluminiscentes y enzimas. Alternativamente, las sondas se pueden conjugar directamente con marcadores tales como fluoróforos, agentes quimioluminiscentes o enzimas. La elección de la etiqueta depende de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con la sonda, los requisitos de estabilidad y la instrumentación disponible.

Las sondas y los cebadores necesarios para practicar la presente invención pueden sintetizarse y marcarse usando técnicas bien conocidas. Los oligonucleótidos utilizados como sondas y cebadores pueden sintetizarse químicamente de acuerdo con el método del triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts., 22: 1859-1862, 1981, utilizando un sintetizador automático, como se describe en Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168, 1984. La purificación de oligonucleótidos es por electroforesis en gel de acrilamida nativa o por HPLC de intercambio aniónico como se describe en Pearson and Regnier, J. Chrom., 255: 137-149, 1983.

F. Amplificación y análisis de secuencia

Se puede realizar una reacción de amplificación antes del análisis de secuencia. Una variedad de métodos de amplificación de polinucleótidos están bien establecidos y se utilizan con frecuencia en la investigación. Por ejemplo, los métodos generales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación de la secuencia de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica y, por lo tanto, no se describen en detalle aquí. Para una revisión de los métodos, protocolos y principios de PCR en el diseño de cebadores, ver, por ejemplo, Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. NY, 1990. Los reactivos y protocolos de PCR también son disponible de proveedores comerciales, como Roche Molecular Systems.

Las técnicas para la determinación de la secuencia de polinucleótidos también están bien establecidas y se practican ampliamente en el campo de investigación relevante. Por ejemplo, los principios básicos y las técnicas generales para la secuenciación de polinucleótidos se describen en varios informes de investigación y tratados sobre biología molecular y genética recombinante, como Wallace et al., supra; Sambrook and Russell, supra, and Ausubel et al., supra. Los métodos de secuenciación de ADN practicados rutinariamente en laboratorios de investigación, ya sean manuales o automatizados, pueden usarse para practicar la presente invención. Los medios adicionales adecuados para detectar una secuencia de polinucleótidos para practicar los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, espectrometría de masas, extensión de cebadores, hibridación de polinucleótidos, PCR en tiempo real, análisis de curvas de fusión, análisis de fusión de alta resolución, análisis de heterodúplex, secuenciación en paralelos masiva y electroforesis.

IV. Establecer un control estándar

Para establecer un control estándar para un tipo de muestra particular (por ejemplo, hisopo cervical o hisopo vaginal) para practicar el método de esta invención, se selecciona primero un grupo de mujeres embarazadas sanas, mujeres embarazadas que no corren el riesgo de tener un efecto adverso en el resultado del embarazo o el resultado neonatal, o las mujeres embarazadas que luego se confirman que dan a luz dentro del marco de tiempo normal de su embarazo, como se define convencionalmente,. Por ejemplo, el grupo puede incluir un grupo de mujeres embarazadas que han tenido un parto y parto a término. En algunas realizaciones, el grupo de mujeres embarazadas puede haber tenido un parto y parto a término después de la intervención clínica, como cerclaje o pesario. Estas personas se encuentran dentro de los parámetros apropiados, si corresponde, con el fin de detectar y/o controlar el riesgo de resultados adversos del embarazo utilizando los métodos de la presente invención. Por ejemplo, los individuos pueden tener una edad gestacional similar y un estado de salud comparable. Opcionalmente, los individuos tienen una edad similar o un origen étnico similar.

El tiempo de parto normal de las personas seleccionadas se confirmará más adelante, y cualquiera de las personas seleccionadas que resulte dar a luz antes o después del plazo de parto normal será excluido del grupo para proporcionar datos como " control estándar".

El estado saludable de los individuos seleccionados se confirma mediante métodos bien establecidos y empleados habitualmente, que incluyen, pero no se limitan a, el examen físico general de los individuos y la revisión general de su historial médico.

Además, el grupo seleccionado de individuos sanos debe ser de un tamaño razonable, de modo que la cantidad/concentración promedio de bacterias de uno o más taxones bacterianos en la muestra de tejido cervical obtenida del grupo pueda considerarse razonablemente representativa de la nivel normal o promedio entre la población general de mujeres embarazadas sanas. Preferiblemente, el grupo seleccionado comprende al menos 10 sujetos humanos embarazadas.

Una vez que se establece un valor promedio para las bacterias de uno o más taxones en base a los valores individuales encontrados en cada sujeto del grupo de control saludable seleccionado, este valor o perfil promedio o medio o representativo se considera un control estándar. También se determina una desviación estándar durante el mismo proceso. En algunos casos, se pueden establecer controles estándar separados para grupos definidos por separado que tienen características distintas como edad, edad gestacional o origen étnico.

V. Predicción del riesgo de embarazo adverso o resultado neonatal según la puntuación del microbio cervical

Usando los métodos descritos en este documento, se puede predecir si una mujer embarazada tiene una probabilidad de tener un resultado adverso del embarazo, por ejemplo, un parto prematuro espontáneo o un parto antes de las 34 semanas en el embarazo actual. Del mismo modo, se puede predecir si un sujeto femenino no embarazada tiene una probabilidad de tener un resultado adverso del embarazo en el futuro embarazo. En algunas realizaciones, para cada sujeto, los niveles de abundancia de bacterias que pertenecen a al menos 1, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más taxones bacterianos se pueden utilizar para calcular una puntuación microbiana cervical. El puntaje del sujeto femenino puede compararse con un valor de corte establecido por los puntajes del grupo de control estándar, y usarse para determinar si es probable que la embarazada tenga un resultado adverso del embarazo. En algunas realizaciones, las bacterias pertenecen al menos a 3, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más taxones de bacterias. En algunos casos, las bacterias incluyen Sneathia sanguinegens, Parvimonas micra, Ureaplasma urealyticum (o Ureaplasma parvum), Atopobium vaginae, Peptoniphilus lacrimalis, Megasphaera cerevisiae y Paravibacter caecicola. En otros casos, los niveles de abundancia de Parvimonas micra, Ureaplasma urealyticum (o Ureaplasma parvum), Atopobium vaginae, Peptoniphilus lacrimalis, Megasphaera cerevisiae y Paravibacter caecicola se utilizan para calcular la puntuación de microbios cervicales para el sujeto femenino. En algunas realizaciones, cada valor de log-10 (abundancia) para el taxón bacteriano seleccionado puede transformarse en la escala lineal y luego sumarse, después de lo cual el valor total se transforma con log y se expresa como una puntuación de microbio cervical en la escala log-10. En algunos casos, una puntuación de microbios cervicales mayor de 1.15 puede indicar que la embarazada está en riesgo de tener un parto prematuro espontáneo. En algunos casos, la embarazada está en riesgo de tener un parto prematuro espontáneo después de la intervención, como cerclaje o pesario. En algunas realizaciones, una puntuación cervical de más de 1.15 puede indicar que el sujeto femenino embarazada tiene una mayor probabilidad de dar a luz en menos de aproximadamente 37.0 semanas, por ejemplo, aproximadamente 36.5 semanas, aproximadamente 36.0 semanas, aproximadamente 35.0 semanas, aproximadamente 34.0 semanas, aproximadamente 33.0 semanas, aproximadamente 32.0 semanas aproximadamente 31.0 semanas, aproximadamente 30.0 semanas, aproximadamente 29.0 semanas aproximadamente 28.0 semanas, aproximadamente 27.0 semanas, aproximadamente 26.0 semanas aproximadamente 25.0 semanas, aproximadamente 24.0 semanas, aproximadamente 23.0 semanas aproximadamente 22.0 semanas, aproximadamente 21.0 semanas, o menos.

En algunas realizaciones, para cada muestra biológica, el nivel de abundancia de un taxón bacteriano se determina mediante un ensayo de PCR cuantitativa o un ensayo de hibridación específico de secuencia dirigido a secuencias de polinucleótidos específicas para el taxón en cuestión. En otras realizaciones, para cada muestra biológica, el nivel de abundancia de un taxón bacteriano se determina mediante secuenciación paralela masiva de las secuencias del gen marcador que sirven como proxy del taxón respectivo. En algunos casos, el nivel de abundancia de un taxón bacteriano en una muestra son los recuentos de lectura normalizados de la secuencia del gen del ARN ribosómico 16S (ARNr) que representa el taxón en cuestión. En algunos casos, los recuentos de lectura normalizados se calculan a partir de los recuentos de lectura sin procesar utilizando métodos de normalización establecidos para minimizar la variación técnica entre muestras, como una profundidad de secuencia diferente por muestra o un tamaño de biblioteca diferente por muestra. En algunos casos, el nivel de abundancia de un taxón bacteriano se expresa en la escala log10.

En algunas realizaciones, la abundancia de un grupo seleccionado de taxones bacterianos (por ejemplo, taxones que son significativamente más abundantes en las cérvix dilatadas que las cérvix cerradas) se combinan por adición o multiplicación para dar la puntuación microbiana cervical, como se ilustra en el valor LA6 en el Ejemplo 2. En otras realizaciones, la puntuación se calcula en 3 pasos: (a) los niveles de abundancia de un grupo sub-seleccionado de taxones bacterianos (por ejemplo, taxones que son significativamente más abundantes en las cérvix dilatadas que los cerrados cervices) se combinan por adición o multiplicación; (b) los niveles de abundancia de otro grupo de taxones subseleccionados (por ejemplo, taxones que son significativamente más abundantes en las cérvix cerradas que en las cérvix dilatadas) también se combinan por adición o multiplicación; y (c) la puntuación del microbio cervical se calcula restando o dividiendo entre la suma o producto del primer grupo de taxones seleccionado y la suma o producto del segundo grupo de taxones subseleccionado. En otras realizaciones, la puntuación del microbio cervical se calcula en función del número de tipos de taxones bacterianos seleccionados que están presentes en una muestra, como se ilustra en la prueba DIBT1, la prueba DIBT2 y la prueba DIBT3 en el Ejemplo 1. En las pruebas DIBT1, DIBT2 y DIBT3, la puntuación del microbio cervical es el número de taxones bacterianos seleccionados, y un sujeto femenino con una puntuación mayor o igual a 1 indica un mayor riesgo de embarazo adverso o resultado neonatal. En otras realizaciones, la puntuación del microbioma cervical se calcula en base a la clasificación de taxones bacterianos seleccionados entre todos los taxones detectados en una muestra.

VI. Kits

La invención proporciona kits para practicar los métodos descritos en este documento para evaluar el nivel de bacterias de taxones específicos en una mujer embarazada, que pueden usarse para diversos fines, tales como determinar el riesgo de tener un embarazo o un resultado neonatal adverso.

Los kits para llevar a cabo ensayos para determinar el nivel de ARN de bacterias de un taxón bacteriano de interés incluyen típicamente al menos un oligonucleótido útil para la hibridación específica con al menos un segmento de una secuencia codificante de interés o su secuencia complementaria. Opcionalmente, este oligonucleótido se marca con un unidad estructural detectable. En algunos casos, los kits pueden incluir al menos dos cebadores de oligonucleótidos que pueden usarse en la amplificación de al menos un segmento de un transcrito de ADN o ARN bacteriano de interés por PCR, particularmente por RT-PCR.

Los kits para llevar a cabo ensayos para determinar el nivel de proteína de bacterias de un taxón bacteriano de interés incluyen típicamente al menos un anticuerpo útil para la unión específica a la secuencia de aminoácidos de la proteína diana. Opcionalmente, este anticuerpo está marcado con una unidad estructural detectable. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. En algunos casos, los kits pueden incluir al menos dos anticuerpos diferentes, uno para la unión específica a la proteína objetivo (es decir, el anticuerpo primario) y el otro para la detección del anticuerpo primario (es decir, el anticuerpo secundario), que a menudo se une a una unidad estructural detectable.

Típicamente, los kits también incluyen un control estándar apropiado. Los controles estándar indican el valor promedio de una proteína objetivo o un ARNm objetivo expresado por bacterias de un taxón bacteriano específico en el epitelio cervical de sujetos sanos y embarazadas que no corren el riesgo de tener un embarazo o un resultado neonatal adverso. En algunos casos, dicho control estándar puede proporcionarse en forma de un valor establecido. Además, los kits de esta invención pueden proporcionar manuales de instrucciones para guiar a los usuarios en el análisis de muestras de prueba y evaluar el riesgo de tener un evento adverso del embarazo, como el parto prematuro, en un sujeto femenino de prueba.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan solo a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían cambiarse o modificarse para producir esencialmente los mismos resultados o resultados similares.

Ejemplo 1. Taxones bacterianos diferencialmente abundantes en el cuello uterino de mujeres con complicaciones asociadas al embarazo

Antecedentes

Para apoyar el cuello uterino en un intento de prolongar el embarazo de mujeres con dilatación cervical avanzada o acortamiento cervical prematuro, los médicos pueden colocar un cerclaje (Owen, Hankins et al. 2009) o un pesario cervical. Sin embargo, se demostró que las mujeres con infección, como la infección intraamniótica, a pesar de la colocación del cerclaje, se asociaron con resultados adversos del embarazo, incluida la pérdida del embarazo, el parto prematuro, la ruptura de la membrana (Romero, Gonzalez et al., 1992). Específicamente, entre 33 mujeres con dilatación cervical > o = 2 cm, membrana intacta, y sin trabajo de parto activo entre las 14 y 24 semanas de gestación, 17 (51.5%) tenían invasión microbiana de la cavidad amniótica. Todos los pacientes con invasión microbiana de la cavidad amniótica tuvieron complicaciones. Los pacientes que se sometieron a cerclaje cervical en presencia de un cultivo de líquido amniótico positivo tuvieron ruptura de membranas, corioamnionitis clínica o pérdida del embarazo (Romero, Gonzalez et al., 1992). Por lo tanto, el cerclaje puede no ser beneficioso para este subconjunto de pacientes con dilatación cervical avanzada. Basado principalmente en el consenso y la opinión de expertos, se ha recomendado que la colocación de cerclaje puede ser beneficiosa solo si se descarta la infección intraamniótica (American College of Obstetricians and Gynecologists. 2014. Cerclage for the management of cervical insufficiency. Practice Bulletin No.

142. Obsteto Gynecol 2014; 123: 372-9). Del mismo modo, también se ha sugerido descartar infección antes de la colocación del pesario, ya que atrapar al feto dentro de un entorno altamente infeccioso o inflamatorio puede conducir a resultados neonatales adversos, incluida la parálisis cerebral o el daño cerebral del feto.

Actualmente, la detección de bacterias en una muestra se basa en cultivos, microscopía y ensayos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) específicos de especies bacterianas, que solo ofrecen sensibilidad baja a moderada y, por lo tanto, no son buenos para descartar infección. Por ejemplo, al usar un cultivo de líquido amniótico para bacterias aeróbicas y anaeróbicas, así como micoplasmas genitales y PCR dirigidos a Ureaplasma urealyticum y Ureaplasma parvum, 44 pacientes (76%) de los 58 pacientes con dilatación cervical avanzada obtuvieron resultados negativos de bacterias tanto para cultivo como para PCR (Oh, Lee et al., 201 0). Sin embargo, eventualmente, entre estas mujeres con resultado negativo de bacterias, 63% (15/24) dieron positivo para coriodeciduitis, 30% (7/23) positivo para amnionitis, 25% (6/24) positivo para funisitis, 62% (24/39) dio a luz a un recién nacido con una puntuación de Apgar de 1 min <4, 41% (18/44) dio a luz a un recién nacido que murió dentro de 1 día de nacimiento (Oh, Lee et al., 2010). La prevalencia de inflamación y el mal resultado neonatal en estos 44 pacientes con cultivo negativo y resultados de PCR sugirieron que muchos de estos resultados negativos para bacterias podrían ser falsamente negativos.

Además, también se detectaron ureaplasmas en embarazos de resultados normales sin complicaciones (Gray, Robinson et al., 1992, Gerber, Vial et al., 2003, Perni, Vardhana et al., 2004). Es posible que los Ureaplasmas sean solo parte de la bacteria comensal, o flora normal, que residen también en el tracto reproductivo de las mujeres, lo que resulta en un embarazo a término y un recién nacido normal. Esto resalta la limitación de detectar solo unas pocas especies bacterianas, seleccionadas por un enfoque candidato, en muchos de los estudios previos.

En contraste, se ha perfilado sistemáticamente la presencia y abundancia relativa de esencialmente todos (>9.500 tipos/taxones de bacterias con secuencias genómicas conocidas) en cada una de las muestras de hisopo cervical, obtenidas de mujeres con dilatación/acortamiento cervical avanzado y sin esas condiciones, usando 16S secuenciación genómica paralela masiva basada en ARN ribosómico (ARNr). La presente metodología ha superado varias limitaciones de esos estudios previos. Primero, la presente metodología puede detectar universalmente esencialmente todos los taxones bacterianos, pero no solo una lista seleccionada de candidatos. En segundo lugar, la presente metodología es independiente del cultivo y, por lo tanto, también se pueden detectar bacterias fastidiosas. En tercer lugar, la presente metodología no requiere bacterias vivas, ya que se basa en una PCR que puede amplificar los fragmentos de ADN genómico de bacterias vivas o muertas. Cuarto, la presente metodología investiga un tipo de muestra no invasiva, el hisopo cervical, que se puede obtener fácilmente de cualquier mujer embarazada con o sin complicaciones. Esto facilita el emparejamiento apropiado con un grupo de control normal y la comparación de datos entre la enfermedad y los grupos de control, a diferencia del líquido amniótico que requiere procedimientos invasivos con riesgo de pérdida fetal y no se recomienda para el embarazo normal a menos que haya una indicación. Quinto, la presente metodología investiga el hisopo cervical, que puede obtenerse fácilmente de cualquier mujer embarazada a cualquier edad gestacional. Esto facilita no solo el emparejamiento con un grupo de control, sino también un muestreo posiblemente temprano y, por lo tanto, la detección y el tratamiento, a diferencia del líquido amniótico o la placenta, que generalmente se obtienen después de 14 o 37 semanas de gestación, respectivamente.

Hay muchas publicaciones que utilizan secuenciación genómica paralela masiva basada en ARN ribosómico 16S (ARNr) para perfilar comunidades bacterianas en muchos sitios anatómicos de humanos "normales y sanos" sin complicaciones. Estos incluyen publicaciones sobre las comunidades bacterianas en muestras de frotes vaginales de mujeres no embarazadas o mujeres embarazadas "normales y sanas" (Ravel, Gajer et al., 2011; Aagaard, Riehle et al., 2012, Gajer, Brotman et al., 2012). Sin embargo, pocos han analizado muestras de mujeres con complicaciones del embarazo (Hummelen, Fernandes et al., 2010).

Específicamente, uno fue un estudio sobre las comunidades bacterianas en la vagina de mujeres VIH positivas, que no proporcionó un conjunto de datos aplicable a la población obstétrica principal sin VIH (Hummelen, Fernandes et al., 2010). Otro fue un estudio sobre las comunidades bacterianas en las muestras placentarias entregadas antes de las 37 semanas o después de las 37 semanas, lo que obviamente no facilitó una comparación gestacional por edad y, por lo tanto, implicó un conjunto de datos confundido por la diferencia de edad gestacional (Aagaard, Ma et al., 2014). Por lo tanto, hasta la fecha, no existe una publicación sobre el perfil sistemático de los taxones bacterianos en el cuello uterino de mujeres con tales resultados adversos y la comparación con aquellos en el cuello uterino de mujeres gestacionales de edad similar sin complicaciones.

El presente estudio actual proporciona el primer perfil sistemático y relativamente completo de las comunidades bacterianas en las muestras de hisopo cervical de mujeres embarazadas con complicaciones (dilatación o acortamiento cervical avanzado). Además, por primera vez, comparamos sistemáticamente ese perfil de comunidades bacterianas en las mujeres con complicaciones, con mujeres gestacionales de la misma edad sin tales complicaciones. Además, por primera vez, proporcionamos una lista de taxones bacterianos que son diferencialmente abundantes en el cuello uterino de las mujeres con tales complicaciones, en comparación con el de las mujeres sin tales complicaciones. La provisión de esta lista es una base importante para el diseño de ensayos de PCR para apuntar específicamente a la "flora anormal" en un cuello uterino grávido, pero no a la "flora normal". Por lo tanto, razonamos que el presente estudio proporciona datos para mejorar la detección de bacterias avanzadas asociadas a la dilatación cervical.

Notablemente, la presencia de miembros seleccionados de esta lista de taxones bacterianos entre 13 y 25 semanas de gestación está asociada o es predictiva de resultados adversos, incluyendo el nacimiento antes de las 34 semanas y la hemorragia intraventricular. Por lo tanto, también razonamos que nuestra lista de taxones bacterianos también puede proporcionar un pronóstico temprano de estos resultados adversos, a fin de facilitar una monitorización cercana temprana o la transferencia a un hospital terciario con la atención neonatal adecuada.

El propósito del estudio descrito en este documento era perfilar sistemáticamente todas las bacterias e identificar una lista de taxones bacterianos y sus secuencias genómicas parciales que abundan de manera diferencial en el cuello uterino de las mujeres con dilatación cervical avanzada o acortamiento cervical. Específicamente, el estudio fue diseñado para (i) perfilar sistemáticamente los taxones bacterianos en el cuello uterino de las mujeres con dilatación cervical avanzada ("el cuello uterino dilatado"), y compararlos con los del cuello uterino de mujeres con esta enfermedad ("el cuello uterino cerrado"); (ii) perfilar sistemáticamente los taxones bacterianos en el cuello uterino de las mujeres con acortamiento cervical ("el cuello uterino acortado"), y compararlos con los del cuello uterino de las mujeres con esta combinación ("el cuello uterino de longitud normal"); (iii) identificar sistemáticamente una lista de taxones bacterianos diferencialmente abundantes en el cérvix dilatada, en relación con los del cuello uterino cerrado utilizando los datos en (i); y (iv) identificar sistemáticamente una lista de taxones bacterianos diferencialmente abundantes en el cuello uterino acortado, en relación con los del cuello uterino de longitud normal utilizando los datos en (ii).

Se tiene aquí la hipótesis de que las comunidades bacterianas que colonizan el cérvix dilatada son diferentes de las que colonizan el cuello uterino normalmente cerrado. Para probar esta hipótesis, se ha perfilado sistemáticamente los taxones bacterianos en el cérvix dilatada avanzado ("el cérvix dilatada", n=19) y los del cuello uterino normalmente cerrado ("el cuello uterino cerrado", n=13) usando ARN ribosómico 16S secuenciación genómica paralela masiva basada en (ARNr). Para probar sistemáticamente taxones diferencialmente abundantes entre los dos grupos, se ha comparado la abundancia relativa de todos los taxones perfilados en el grupo de cérvix dilatada y aquellos en el grupo de cuello uterino cerrado utilizando procedimientos estadísticos apropiados. Para evaluar si los miembros de esta lista de taxones bacterianos pueden predecir cualquier embarazo adverso o resultados neonatales, se ha seguido estos embarazos desde el reclutamiento para este estudio hasta 28 días después del nacimiento, y se ha calculado la sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos, valores predictivos negativos. para predecir esos resultados siempre que estuvieran disponibles.

Del mismo modo, también se ha perfilado sistemáticamente los taxones bacterianos en el cuello uterino acortado (n=11), y en comparación con los de los controles gestacionales de edad similar con un cuello uterino de longitud normal (n=11). También se ha identificado una lista de taxones diferencialmente abundantes entre el cuello uterino acortado y los grupos de longitud normal mediante procedimientos estadísticos y se siguieron los resultados clínicos. Siempre que los resultados estuvieron disponibles, también se evaluó el desempeño predictivo de los miembros seleccionados de esa lista.

Métodos y Resultados

Contratación de participantes. Este estudio se realizó con la aprobación ética de la junta de revisión institucional respectiva y se obtuvieron muestras de mujeres embarazadas con consentimiento informado. En el grupo de prueba (el grupo de cérvix dilatada, n=19), solo se reclutaron mujeres embarazadas con dilatación cervical avanzada indolora >0.8 cm.

Mientras que, en el grupo de referencia (el grupo de cuello uterino cerrado, n=13), solo se reclutaron mujeres embarazadas sin dilatación cervical avanzada indolora >0.8 cm. Además, para permitir una comparación equitativa de los resultados y los resultados clínicos, tanto en el grupo de prueba como en el de referencia, solo se reclutaron mujeres (i) sin regular y frecuente antes de las 34 semanas de gestación y (ii) con una indicación de someterse a colocación de cerclaje cervical. Las características clave de estos 32 participantes (19 en el grupo de cérvix dilatada y 13 en el grupo de cuello uterino cerrado) se enumeran en la Tabla 1.

Para evitar complicar el fenotipo (es decir, dilatación cervical avanzada), tanto en la prueba como en los grupos de referencia, se excluyeron los embarazos que implicaban preeclampsia, embarazos múltiples, sufrimiento fetal, restricción del crecimiento, anomalías cromosómicas o estructurales en el momento de la recogida de muestras. Para minimizar algunos factores de confusión importantes que afectan a las comunidades bacterianas en el cuello uterino, los participantes que tuvieron actividades sexuales o aplicaron cualquier otra aplicación vaginal (por ejemplo, medicamentos o supositorios vaginales, ducha vaginal) 48 horas antes de la recolección de la muestra o con antibióticos o antimicóticos 30 días antes de la recolección de la muestra, también se excluyeron los tumores de ovario. Participantes que tuvieron un aborto espontáneo o un parto previo entre 14 y 36 semanas (n=3, todos en el grupo de cérvix dilatada, prueba exacta de Fisher, p=0.253), evacuación quirúrgica previa por aborto espontáneo o interrupción del embarazo (n=16, 9 dilatados y 7 cerrados, p=1.00), cirugía cervical (n=6, 2 dilatados y 4 cerrados, p=0.194), anormalidad uterina (n=6, 3 dilatados y 3 cerrados, p=0.666), flujo vaginal anormal reciente (n=5, 4 cérvix dilatada y 1 cerrado, p=0.625) se documentaron claramente en nuestra base de datos. Estos factores no fueron estadísticamente diferentes entre los dos grupos, pero se incluirían para interpretar los datos.

Recolección y extracción de ADN de muestras de hisopo cervical: para minimizar la posibilidad de contaminación por el medio ambiente, el personal clínico u otras partes del tracto reproductivo femenino, la muestra de hisopo cervical se recolectó utilizando un Calgiswab Tipo III (Puritan, Guilford, Maine, Estados Unidos) Antes de cualquier otro procedimiento inmediatamente después de la apertura del aparato reproductor femenino por el espéculo. Para asegurarse de que se muestrearon y compararon las mismas ubicaciones anatómicas, se recogió cada muestra de hisopo cervical desde una posición fija en el lado periférico (la posición de las 12 en punto frente al médico) del orificio externo. Para mantener la coherencia para una comparación equitativa entre todas las muestras, un solo clínico recolectó todas las muestras del cérvix dilatada y los grupos de cuello uterino cerrado. Para minimizar las variaciones en la recolección, cada hisopo se recogió girando 360 grados una vez. Para minimizar cualquier riesgo aumentado de infectar a las participantes o al feto en el útero, se recogieron los hisopos sin tocar el tapón de moco cervical y fueron estériles. Durante la recolección de la muestra de hisopo, también se tuvo especial cuidado de no tocar los labios ni ninguna parte del tracto reproductor femenino que no sea el orificio externo. Para controlar la contaminación de bacterias en la sala de operaciones, los reactivos y los procedimientos de recolección, se recogió otro hisopo de control negativo en paralelo con cada hisopo cervical, pero sin tocar a los pacientes.

El hisopo cervical y los hisopos de control negativo se sumergieron en agua estéril y libre de nucleasas y se almacenaron a -80°C hasta la extracción. Los hisopos se extrajeron para ADN genómico utilizando un método establecido (Método 1 en Yuan, Cohen et al., 2012), que garantizaría una representación equitativa de las comunidades bacterianas que se encuentran comúnmente en los tractos reproductivos femeninos. Este método implicaba el pretratamiento de la muestra mediante la mutanolisina (Sigma-Aldrich) y un método de extracción de ADN basado en columnas (QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen). Para minimizar cualquier variación de lote, todas las muestras se extrajeron el mismo día.

Amplificación por PCR y secuenciación en paralelo masiva: dado que las muestras de hisopo cervical inevitablemente comprenderían ADN genómico humano entre el ADN genómico bacteriano, se ha amplificado específicamente el gen 16S ARNr, que comúnmente poseen todas las bacterias, pero no los humanos. Para facilitar la amplificación de las secuencias de ADN genómico de esencialmente todas las bacterias, se ha optado por utilizar un par de cebadores de PCR, a saber, V4 y V5, que eran complementarios al gen 16S ARNr de regiones altamente conservadas (Claesson, Wang et al.2010). Se ha probado el uso del Ribosomal Database Project (RDP) (Wang, Garrity et al. 2007), la base de datos pública más grande que contiene secuencias de ARNr 16S, se ha comprobado que nuestro par elegido de cebadores de PCR podría amplificar teóricamente >97% de >9.200 tipificados (establecido) taxones bacterianos de secuencias genómicas de 16S ARNr conocidas. Por lo tanto, este par de cebadores de PCR es aplicable para un perfil sistemático y no sesgado de comunidades bacterianas en este estudio.

Se amplificó el ADN genómico extraído de cada muestra de hisopo usando el par de cebadores de PCR V4-V5 (Claesson, Wang et al. 2010), que flanquea las regiones hipervariables V4 y V5 del gen 16S ARNr. Las secuencias de los cebadores directo e inverso son 5'-[Secuencia clave del cebador A] [Secuencia MID] AYT GGG YDT AAA GNG-3' (SEQ NO ID: 1) y 5'-[Clave B del cebador] CCG TCA ATT YYT TTR AGT TT-3' (SEQ ID NO: 2), respectivamente, donde la secuencia de cebador A, la secuencia de cebador B y la secuencia MID se describen en las "454 Sequencing System Guidelines for Amplicon Experimental Design July 2011" plataforma de secuencia paralela GX-FLX 454 Titanium (Roche). Cada PCR se realizó como una reacción de 50 |jL con 2.5 unidades de la ADN polimerasa FastStart Taq (Sistema FastStart HiFi PCR dNTPack, Roche), MgCh 4 mM, 100 nM de cada cebador y dNTP 200 j M. Todas las PCR se realizaron en un termociclador PTC-100 (Bio-Rad) utilizando las siguientes condiciones de termociclado: 95°C durante 2 minutos, seguido de 33 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 40°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto, con una extensión final a 72°C durante 5 minutos y 25°C durante 5 minutos. Luego sometimos el producto de PCR a electroforesis. Confirmamos un solo amplicón de PCR del tamaño esperado para las 32 muestras de hisopo cervical, y ningún amplicón de PCR para los 32 controles de reactivos negativos correspondientes. Por lo tanto, el medio ambiente, los reactivos y los procedimientos estaban libres de cualquier contaminación de secuencias genómicas de ARNr 16S bacterianas no deseadas.

Posteriormente, purificamos todos los 32 productos de PCR, que se derivaron de las 32 muestras de hisopo cervical y que se unieron con las secuencias de identificador multiplex (MID) y secuencias de adaptador incorporadas a través de los extremos 5' de los cebadores de PCR anteriores, de acuerdo con las instrucciones recomendadas de Roche.

Los productos purificados se sometieron a una secuenciación genómica masivamente paralela utilizando el GX-FLX 454 Titanium (Roche), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, apuntando a un promedio de alrededor de 10.000 lecturas de secuenciación sin procesar por muestra.

Para cada muestra, los datos de secuenciación sin procesar se eliminaron a nivel de diagrama de flujo, utilizando una implementación de Pyronoise (Quince, Lanzen et al., 2011) en Mothur (Schloss, Westcott et al., 2009). Las lecturas sin procesar se desnovilizaron por flujograma, se filtraron por calidad y longitud, se eliminaron quimera, se alinearon, se pre-agruparon y se agruparon en unidades taxonómicas operativas, que luego se clasificaron taxonómicamente, según el conjunto de capacitación del Ribosomal Database Project (RDP) (v9, 2012).

Identificación sistemática de taxones bacterianos diferencialmente abundantes entre el grupo de cérvix dilatada (n=19) y el grupo cerrado de cuello uterino (n=13): después de todos los pasos analíticos anteriores, se ha observado 342 taxones bacterianos en las 32 muestras de hisopo cervical. Para normalizar los recuentos de lectura variables en diferentes muestras, se realizó submuestreo aleatorio utilizando Mothur (Schloss, Westcott et al. 2009) para que cada una de las 32 muestras contuviera 7.594 lecturas procesadas para su posterior análisis. Alternativamente, también se ha normalizado al representar los recuentos de lectura de cada taxón en una muestra como una relación de los recuentos de lectura totales de esa muestra.

Para identificar los taxones diferencialmente abundantes entre el grupo de cérvix dilatada y el grupo de cuello uterino cerrado, se realizó una prueba estadística, a saber, Metastats, que está especialmente diseñado para este tipo de datos de secuenciación (White, Nagarajan et al. 2009). En esencia, Metastats presenta una prueba T no paramétrica y una prueba heurística para usar la prueba exacta de Fisher si un determinado taxón aparece en un promedio de menos de 1 lectura por muestra (el llamado problema de conteo disperso que plantea un desafío para detectar cambios significativos en este tipo de datos).

Después de la eliminación de secuencias de taxones que aparecieron solo una vez (secuencias de un solo tono) y el ajuste para múltiples pruebas usando el método de la tasa de descubrimiento falso (FDR) a FDR <5% (Storey and Tibshirani, 2003), 16 taxones permanecieron como estadísticamente significativos diferente (q <0.05). Entre ellos, 9 taxones (Tabla 2A) aumentaron significativamente y 7 taxones (Tabla 2B) disminuyeron significativamente en el grupo de cérvix dilatada, en relación con el grupo de cuello uterino cerrado. La clasificación taxonómica más cercana de estas 16 secuencias genómicas a nivel de reino a género se enumeran en las Tablas 3A y 3B. Las secuencias genómicas de ARNr 16S se enumeran en las Tablas 4A y 4B. La clasificación de especies más cercana de estas 16 secuencias genómicas basada en la alineación de nucleótidos BLAST contra la base de datos de ARN ribosómico 16S (realizada utilizando el sitio web NCBI BLAST en junio de 2014) se enumeran en las Tablas 4E y 4F.

Identificación sistemática de taxones bacterianos diferencialmente abundantes entre el grupo de cérvix dilatada (n=10) y el grupo de cuello uterino cerrado (n=10) que fueron emparejados a 1:1 por la semana gestacional más cercana en la recolección de la muestra: La edad gestacional en la recolección de muestras entre los dos grupos no es estadísticamente significativamente diferente. Sin embargo, para minimizar cualquier efecto de la edad gestacional en nuestro análisis, se ha emparejado a cada mujer en el grupo de cérvix dilatada con otras mujeres en el grupo de cuello uterino cerrado en la semana de gestación más cercana (dentro de 2 semanas) en la recolección de la muestra. Además, para minimizar cualquier efecto de diferentes tamaños de muestra de los dos grupos, se ha realizado la coincidencia anterior en una proporción 1:1. Finalmente, se pudo unir a 10 mujeres en el grupo de cérvix dilatada con 10 mujeres en el grupo de cuello uterino cerrado para la semana de gestación en la recolección de muestras.

Después del ajuste para múltiples pruebas usando el método de la tasa de descubrimiento falso (FDR) a FDR <5% (Storey and Tibshirani, 2003), 20 taxones permanecieron como estadísticamente significativamente diferentes (q <0.05). Entre ellos, 15 taxones (Tabla 2C) aumentaron significativamente y 5 taxones (Tabla 2D) disminuyeron significativamente en el grupo de cérvix dilatada, en relación con el grupo de cuello uterino cerrado. La clasificación taxonómica más cercana de estas 20 secuencias genómicas a nivel de reino a género se enumeran en las Tablas 3D y 3C. Las secuencias genómicas de 16S ARNr se enumeran en las Tablas 4C y 4D. La clasificación de especies más cercana de estas 16 secuencias genómicas basada en la alineación de nucleótidos BLAST contra la base de datos de ARN ribosómico 16S (realizada utilizando el sitio web NCBI BLAST en junio de 2014) se enumeran en las Tablas 4G y 4H.

Rendimiento predictivo por miembros seleccionados de las listas de taxones bacterianos diferencialmente abundantes en diversos resultados. Se seleccionaron los 9 taxones de la Tabla 2A y los 15 taxones de la Tabla 2C para construir dos pruebas, a saber, la Prueba de Bacterias con Aumento Diferencial (DIBT) 1 y DIBT2, respectivamente.

DIBT1 y DIBT2 pueden usar datos de secuenciación genómica masivamente paralelos o, más preferiblemente, datos de PCR específica de especie para detectar la presencia de un taxón bacteriano dado. Si alguno de estos 9 o 15 taxones aumentados diferencialmente estaba presente en esa muestra, se define como DIBT1 positivo o DIBT2 positivo, respectivamente. De lo contrario, si todos estos 9 o 15 taxones están ausentes en una muestra, se define como DIBT1 negativo o DIBT2 negativo, respectivamente.

Para explorar la asociación entre DIBT1 o DIBT2 y el embarazo adverso o los resultados neonatales, se realizó la prueba exacta de Fisher. Para explorar el potencial de DIBT1 o DIBT2 en la predicción de resultados clave de embarazo y neonatal, se calcularon los verdaderos positivos, falsos positivos, falsos negativos y verdaderos negativos de DIBT1 o DIBT2 en la predicción de estos resultados (Tablas 5A y 5B, respectivamente). Además, se calculó la sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos y negativos de DIBT1 y DIBT2 para predecir estos resultados (Tablas 5A y 5B, respectivamente).

Existen asociaciones significativas entre DIBT1 y dilatación cervical avanzada (prueba exacta de Fisher, p=0.028), parto prematuro espontáneo <28 semanas (p=0.0023), parto prematuro espontáneo <34 semanas (p=0.00065), parto prematuro <28 semanas (p=0.0057), parto prematuro <34 semanas (p=3.2x10-6) y hemorragia intraventricular (p=0.01). Es de destacar que los 7 casos de parto prematuro espontáneo se detectaron como DIBT1 positivo (sin falsos negativos). También es de destacar que, entre los 13 casos clasificados como DIBT1 positivos, todos se sometieron a parto prematuro <34 semanas (sin falsos positivos). Todos estos nacimientos prematuros no se debieron a preeclampsia, restricción del crecimiento intrauterino, anormalidad cromosómica fetal). Por lo tanto, especulamos que estos 13 nacimientos prematuros pueden desencadenarse por la infección de una o más de estas "flora anormal" que se identificaron en este estudio y se seleccionaron para su inclusión en el DIBT1.

En cuanto a DIBT2, se observan asociaciones significativas entre este y el parto prematuro espontáneo <28 semanas (p=0.0023), el parto prematuro espontáneo <34 semanas (p=0.00065), el parto prematuro <28 semanas (p=0.0057), el parto prematuro nacimiento <34 semanas (p=0.0032). Es de destacar que los 7 casos de parto prematuro espontáneo <34 semanas fueron detectados por DIBT2 como positivos (sin falsos negativos).

En otro estudio (estudio B), se ha realizado un análisis similar en muestras de hisopo cervical recolectadas a una edad gestacional similar, pero de mujeres con un cuello uterino corto o con un cuello uterino de longitud normal (Tabla 6). Para cada muestra, se extrajo el ADN y se amplificó por PCR mediante los cebadores V4V5 y se sometió a análisis GS-FLX 454. Después del ajuste para múltiples pruebas usando el método de la tasa de descubrimiento falso (FDR) a FDR <5% (Storey and Tibshirani, 2003), 24 taxones permanecieron como estadísticamente significativamente diferentes (q<0.05). Entre ellos, 17 taxones (Tabla 7) aumentaron significativamente y 7 taxones (no mostrados) disminuyeron significativamente en el grupo de cuello uterino corto, en relación con el grupo de cuello uterino de longitud normal. Las secuencias genómicas de ARNr 16S se enumeran en la Tabla 8. La clasificación de especies más cercana de estas 17 secuencias genómicas basada en la alineación de nucleótidos BLAST contra la base de datos de ARN ribosómico 16S (realizada utilizando el sitio web NCBI BLAST en junio de 2014) se enumera en la Tabla 9.

Rendimiento predictivo de miembros seleccionados de las listas de taxones bacterianos diferencialmente abundantes en diversos resultados. Se seleccionaron los 17 taxones de la Tabla 7 para construir otra prueba, a saber, la Prueba de Bacterias con Aumento Diferencial (DIBT) 3.

DIBT3 puede usar datos de secuenciación genómica masivamente paralelos o, más preferiblemente, datos de PCR específica de especie para detectar la presencia de un taxón bacteriano dado. Si alguno de estos 17 taxones aumentados diferencialmente estaba presente en esa muestra, se define como DIBT3 positivo. De lo contrario, si todos estos 17 taxones están ausentes en una muestra, se define como DIBT3 negativo, respectivamente. La asociación de los resultados positivos DIBT3 y el embarazo o el resultado neonatal adverso se tabula en la Tabla 10.

Existen asociaciones significativas entre DIBT3 y dilatación cervical prematura (prueba exacta de Fisher, p=0.00022), parto prematuro espontáneo <34 semanas (p=0.049), parto prematuro <34 semanas (p=0.049). Es de destacar que los 3 casos de parto prematuro espontáneo se detectaron como DIBT3 positivo (sin falsos negativos).

Los marcadores bacterianos proporcionados en este documento se usaron para predecir con precisión los resultados adversos del embarazo y los resultados neonatales basados en una prueba molecular realizada tan pronto como 13 semanas de gestación (Tablas 5A, 5B y 10). El método descrito en este documento facilita la intervención temprana, como la monitorización cercana o la transferencia oportuna a una unidad de tratamiento terciario con cuidados intensivos neonatales.

Ejemplo 2: Firma de microbioma cervical para la identificación de pacientes con insuficiencia cervical que resulta en parto prematuro espontáneo después de la intervención clínica

No se han investigado sistemáticamente los taxones bacterianos que colonizan los cervices de pacientes con insuficiencia cervical (IC) que responden de manera diferente a la intervención clínica (cerclaje/pesario). Utilizando secuenciación paralela masiva, interrogamos las abundancias de más de 9.600 taxones por muestra de hisopo cervical obtenida antes de la intervención de pacientes con IC reclutadas en serie con embarazo único y mujeres con IC adecuadamente emparejadas. Se observó que los microbiomas cervicales estaban alterados en los pacientes con IC, en comparación con los de los controles sin IC. Notablemente, se identificaron 6 taxones diferencialmente abundantes en pacientes que resultaron en "parto prematuro espontáneo (<34 semanas, sPTB) después de la intervención", en comparación con los que resultaron en "parto a término (>37 semanas) después de la intervención". Usando el log-10 (abundancia total de estos 6 taxones), LA6, >1.15 para definir un resultado positivo, clasificamos correctamente a todos los pacientes menos uno que resultaron en "sPTB después de la intervención" (9/10=90%), sin falso positivo (0/15=0%). Los pacientes con LA6 positivo permanecieron sin recibir durante un período más corto después de la intervención [número medio de días entre la intervención y el parto, 10 días frente a 126 días; Prueba de Logrank, p <0.00001; cociente de riesgos, 6.34; Intervalo de confianza del 95%, 1.51 a 26.6], en comparación con pacientes con LA6 negativo. Además, los pacientes positivos para LA6 dieron a luz antes que sus contrapartes negativas para LA6 [edad gestacional media en el momento del parto de 23.7 semanas frente a 38.4 semanas; Prueba de Logrank, p <0.0001; cociente de riesgos, 6.24; Intervalo de confianza del 95%, 1.50 a 25.9]. El presente estudio destaca el uso potencial del microbioma cervical previo a la intervención para proporcionar información pronóstica del embarazo después de la intervención de cerclaje/pesario.

Introducción

La insuficiencia cervical (IC) es un factor de riesgo para el parto prematuro (PTB), que se asocia con la morbilidad neonatal y la muerte perinatal. Se manifiesta en las mujeres afectadas con un cérvix dilatada prematuramente (dilatación cervical, 1 cm-5 cm) o acortado (longitud cervical <25 mm) en el segundo trimestre, en lugar del tercero. Se ha demostrado que la intervención clínica mediante la colocación de cerclaje quirúrgico o pesario cervical (Shirodkar, Antiseptic, 52, 299-300 (1955); Cross, Lancet, 274, 127 (1959)) en el cuello uterino debilitado de pacientes con IC disminuye la tasa de PTB <28 semanas (Pereira et al., Am J Obstet Gynecol 197, 483 e481-488 (2007)) o PTB <34 semanas (Althuisius et al., Am J Obstet Gynecol 189, 907-910 (2003); Goya et al., Lancet 379, 1800-1806 (2012)), aumentan la tasa de supervivencia neonatal (3) y el intervalo entre la presentación y el parto (Pereira et al., Am J Obstet Gynecol 197, 483 e481-488 (2007)).

Sin embargo, la intervención cervical no beneficia a todos los pacientes con IC. En particular, los pacientes con IC con infección intraamniótica (IAI) resultaron en una tasa 4 veces mayor de PTB <34 semanas después de la intervención de cerclaje (Romero et al., Am J Obstet Gynecol 167, 1086-1091 (1992)), en comparación con aquellos recibiendo la misma intervención, pero sin IAI. Los pacientes que recibieron intervención de cerclaje solo si se descartó IAI resultaron en una tasa más baja de PTB <34 semanas, en comparación con aquellos que recibieron la intervención sin pruebas de IAI (Mays et al., Obstet Gynecol 95, 652-655 (2000)). Dado que el IAI es altamente prevalente (38% -51%) en pacientes con IC (Romero et al., Am J Obstet Gynecol 167, 1086-1091 (1992); Mays et al., Obstet Gynecol 95, 652­ 655 (2000)), los expertos han sugerido a los médicos que consideren descartar que el IAI use la amniocentesis previa al cerclaje para detectar microorganismos (Berghella et al., Am J Obstet Gynecol 209, 181-192 (2013); Airoldi et al., Am J Perinatol 26, 63-68 (2009)). Sin embargo, la amniocentesis es invasiva y se asocia con una posibilidad pequeña pero finita de pérdida fetal. Por lo tanto, investigamos la colonización cervical en pacientes con IC y se observó correlación la expresión del microbioma con los resultados de la intervención cervical. Los resultados muestran que el muestreo de hisopo cervical puede ser una alternativa relativamente no invasiva a la amniocentesis en pacientes con IC.

La secuenciación en paralelo masiva (MPS) ha facilitado una cultura independiente del cultivo y, por lo tanto, ha proporcionado una visión más sensible e integral de los microorganismos que colonizan diferentes sitios del cuerpo. Convencionalmente, se ha pensado que la placenta que se encuentra dentro de la cavidad amniótica es estéril. Contrariamente a esto, un estudio de microbioma y metagenómico basado en MPS publicado en esta revista ha revelado que la placenta alberga un microbioma de baja biomasa que varía en asociación con una historia remota de infección prenatal materna y parto prematuro (Aagaard et al., Sci Transl Med 6, 237ra265 (2014)). El presente estudio se realizó para investigar la asociación entre el microbioma cervical prenatal y el resultado del parto prematuro de pacientes con IC.

Los datos de alta resolución generados por MPS y la información cuantitativa que se puede inferir de ellos también han ampliado nuestro conocimiento sobre microorganismos en la salud de las mujeres. Se han observado cinco clases principales de comunidades bacterianas (grupos comunitarios) en el tracto vaginal de mujeres no embarazadas en edad reproductiva. En mujeres cuya proporción vaginal de no Lactobacillus sp. aumentó como se ve comúnmente en el grupo comunitario IV, sus puntajes Nugent, un factor de diagnóstico comúnmente utilizado para identificar a las mujeres con vaginosis bacteriana, también aumentaron (Ravel et al., Proc Natl Acad Sci USA 108, 4680-4687 (2011)). Notablemente, las mujeres con vaginosis bacteriana tenían más probabilidades de tener un cérvix dilatada (relación ajustada de probabilidades, 4.9; intervalo de confianza del 95% 2.2-10.9) (Kilpatrick et al., Am J Obstet Gynecol 194, 1168-1176 (2006)). El estudio longitudinal del microbioma vaginal en mujeres no embarazadas ha revelado que algunas comunidades bacterianas cambian notablemente en períodos cortos de tiempo, mientras que otras son relativamente estables (Gajer et al., Sci Transl Med 4, 132ra152 (2012)). Según la teoría ecológica, las comunidades menos estables son más susceptibles a la invasión de organismos patógenos (Dunstan et al., Ecology 87, 2842-2850 (2006)). En este estudio, los microbiomas cervicales en pacientes con IC se compararon con los de mujeres sin IC adecuadamente emparejadas.

Resultados

Reclutamos a 34 pacientes con insuficiencia cervical (IC) y se obtuvo una muestra de hisopo cervical de cada uno antes del tratamiento con cerclaje/pesario. Las mujeres de embarazo único en el segundo trimestre que participaron en este estudio tuvieron: (i) dilatación cervical avanzada indolora (1.5 cm-5.0 cm) y/o acortamiento cervical (longitud cervical <25 mm), y; (ii) membrana intacta, y; (iii) sin contracciones laborales; durante el tiempo del muestreo de hisopo cervical.

Todos estos pacientes con IC recibieron intervención de cerclaje/pesario debido al cérvix dilatada/acortado prematuramente, respectivamente. Los pacientes fueron seguidos hasta un mes después del parto. Se excluyeron nueve embarazos complicados por PTB iatrogénica debido a preeclampsia, sufrimiento fetal, restricción del crecimiento, cromosomas fetales o anomalías estructurales. Entre los 25 pacientes restantes con IC, 15 mujeres tuvieron partos a término (TB, entregados en o después de las 37 semanas de gestación) después de la intervención y 10 resultaron en nacimientos prematuros espontáneos (sPTB, entregados en menos de 34 semanas) después de la intervención (Figura 1A) De estos, 7 involucraron morbilidad neonatal, incluido el síndrome de dificultad respiratoria (SDR), displasia broncopulmonar (DBP), hemorragia intraventricular (IVH) y retinopatía del prematuro (ROP) o mortalidad perinatal (Figura 1A).

Perfilado de taxones bacterianos por paralelo masivo

Cada muestra de hisopo cervical recogida antes de la intervención clínica se sometió a extracción de ADN bacteriano, amplificación por PCR del gen de ARN ribosómico 16S (ARNr) y secuenciación masivamente paralela del amplicón (Titanio, GS-FLX 454, Roche). Los cebadores de PCR dirigidos a las regiones V4 y V5 del gen 16S ARNr podrían amplificar más de 9.600 bacterias bien establecidas de secuencias conocidas de 16S ARNr para su análisis (Claesson et al., Nucleic Acids Res 38, e200 (2010)). Este alcance fue más amplio que la mayoría de los estudios de microbioma publicados del tracto reproductivo femenino.

Para minimizar la detección espuria de "nuevos" taxones que surgen de errores de secuenciación, las lecturas de secuenciación sin procesar (0.68 millones de lecturas) fueron eliminadas y filtradas por calidad en lecturas procesadas (0.54 millones de lecturas) utilizando métodos bien establecidos (Schloss et al., Appl Environ Microbiol 75, 7537-7541 (2009); Quince et al., Nat Methods 6, 639-641 (2009)). En promedio, cada una de las 25 muestras fue secuenciada a una profundidad de 22.000 lecturas procesadas de alta calidad. Tal profundidad de secuenciación fue mayor que la mayoría de los estudios de microbioma publicados del tracto reproductivo femenino.

Además, las lecturas procesadas de todas las muestras con al menos un 97% de identidad de secuencia se agruparon como una unidad taxonómica operativa (Otu, es decir, un taxón bacteriano). En total, se detectaron 152 taxones bacterianos en las 25 cervices. Para permitir una comparación más justa entre las muestras secuenciadas en diferentes recuentos de lectura, se ha realizado la normalización de la Escala de suma acumulativa (CSS) (Paulson et al., Nat Methods 10, 1200-1202 (2013)) y expresamos el valor de abundancia (unidad: recuentos de lectura) para cada taxón como su recuento de lectura normalizado por CSS en la escala log-10 (es decir, el valor de registro (abundancia)).

Taxones bacterianos altamente abundantes en pacientes con insuficiencia cervical

La Figura 1B muestra los 10 taxones bacterianos más abundantes observados en las 10 cervices "sPTB después de la intervención". Contrariamente a un tracto reproductivo femenino sano predominante por Lactobacilli, un miembro del género Gardnerella (Otu 4) ha sido identificado como el taxón bacteriano más abundante en el cuello uterino "sPTB después del tratamiento" [Figura 1B, fila #1, es decir, el taxón con los mayores valores de log(abundancia) totales en los 10 cérvices "sPTB después de la intervención"]. De hecho, 7 de los 10 taxones bacterianos más abundantes en este grupo se han clasificado como géneros no Lactobacillus: Gardnerella, dos Sneathias, Aerococcus, Megasphaera, Pseudomonas y Anaerococcus (Figura1B, filas #1 a #10 y columnas debajo de " sPTB ").

En comparación, solo 5 de los 10 taxones bacterianos más abundantes en el cuello uterino "TB después del tratamiento" se han clasificado como géneros no Lactobacillus (Figura 1C, filas #1 a #10 y columnas bajo "TB"). En particular, las 3 bacterias más abundantes se han identificado como Lactobacillus crispatus, L. iners y L. jensenii, que se sabe que predominan en el tracto reproductivo femenino sano (Ravel et al., Proc Natl Acad Sci USA 108, 4680­ 4687 (2011)).

Taxones diferencialmente abundantes en pacientes con diferentes respuestas a la intervención

Es importante destacar que se ha identificado 7 taxones bacterianos que son diferencialmente abundantes entre los grupos "sPTB después del tratamiento" y "TB después del tratamiento" (Figura ID). Los valores logarítmicos (abundancia) de los 7 taxones, a saber, Sneathia (Otu 11), Parvimonas (Otu 16), Ureaplasma (Otu 56), Atopobium (Otu 42), Peptoniphilus (Otu 28), Megasphaera (Otu 47) y Paraeggerthella (Otu 40), fueron mayores en el primer grupo (prueba de suma de rango de Mann-Whitney, p <0.05; se realizó una corrección de prueba múltiple usando el método de la tasa de descubrimiento falso (FDR), f Dr <5%) Figura ID, filas #1 a #7, última columna). Sorprendentemente, de estos, los últimos 6 taxones se observaron exclusivamente en el grupo "sPTB después del tratamiento", pero no en el grupo "TB después del tratamiento" [Figura ID, filas #2 a #7, muchos valores de registro (abundancia) en las columnas "sPTB" son > 0, pero todos los valores de registro (abundancia) en las columnas "TB" son 0].

Taxones diferencialmente abundantes y resultado después de la intervención

Para resumir las abundancias de los últimos 6 taxones diferencialmente abundantes (Mann-Whitney, p <0.01; Tabla 11), se ha calculado para cada muestra de hisopo cervical un valor LA6, que se refiere al log-10 (abundancia total de los 6 taxones diferencialmente abundantes). En resumen, para cada muestra, transformamos cada uno de sus valores de log (abundancia) para Parvimonas (Otu 16), Ureaplasma (Otu 56), Atopobium (Otu 42), Peptoniphilus (Otu 28), Megasphaera (Otu 47) y Paraeggerthella (Otu 40) de vuelta a la escala lineal común. Después de agregar esos 6 valores de abundancia en la escala común, transformamos esa abundancia total y expresamos el valor LA6 en la escala log-10.

Los valores medios de LA6 fueron 2.61 y 0.78 en los grupos "sPTB después del tratamiento" y "TB después del tratamiento", respectivamente (Figura 2A). Se muestra que los valores medios de LA6 aumentan 3.36 veces en el primer grupo (Mann-Whitney, p<0.0001). Para encontrar el umbral óptimo para identificar el grupo "sPTB después del tratamiento" entre los pacientes con IC que reciben tratamiento, se ha trazado la curva de características operativas del receptor (ROC) [área bajo la curva r Oc (intervalo de confianza del 95%), 0.95 (0.84-1.06); p = 0.0002]. Usando el LA6 >1.15 como umbral para definir un resultado positivo, se pudo identificar a todos los pacientes con IC "sPTB después de la intervención" excepto uno (9/10 = 90% de sensibilidad) sin falsos positivos (1 - 0/15 = 100% de especificidad).

Es importante destacar que los pacientes positivos para LA6 dieron a luz antes de la intervención clínica que los pacientes positivos para LA6 (Figura 2B, mediana de edad gestacional en el momento del parto de 23.7 semanas frente a 38.4 semanas; intervalo de confianza del 95%, 20.6 semanas - 25,4 semanas frente a 38.0 semanas - 38.7 semanas; Chi-cuadrado, 32.352; df, 1; prueba de Logrank, p <0.0001; razón de riesgo, 6.24; intervalo de confianza del 95%, 1.50 a 25.9; MedCalc, versión 14.12). También es importante destacar que los pacientes LA6 positivos dieron a luz por un período más corto después de la intervención que sus contrapartes LA6 negativas (Figura 2C número medio de días entre la intervención y el parto, 10 días frente a 126 días; intervalo de confianza del 95%, 8 días - 32 días frente a 112 días -134 días; Chi-cuadrado, 32.520; df, 1; prueba de Logrank, p <0.00001; razón de riesgo, 6.34; intervalo de confianza del 95%, 1.51 a 26.6).

Discusión

Firma de microbioma cervical identificada en este estudio

Se ha demostrado que las abundancias de 7 taxones bacterianos en pacientes con IC aumentaron significativamente en las mujeres dando como resultado "sPTB después de la intervención clínica", en comparación con las que resultaron en "TB después de la intervención clínica". Además, se ha calculado el valor LA6, que representa los valores de abundancia total de los 6 taxones más significativamente incrementados, para cada paciente con IC. Con base en los valores LA6 de las 25 muestras de hisopo cervical obtenidas antes de la intervención de cerclaje/pesario, se identificaron correctamente 10 de 11 pacientes con IC "sPTB después de la intervención" (9/10 = 90% de sensibilidad) sin ningún falso positivo en la TB de 15 pacientes "después de la intervención" (1 - 0/15 = 100% de especificidad).

Este estudio estuvo limitado por el tamaño de la muestra de mujeres embarazadas asiáticas e implicó un diseño retrospectivo. Sin embargo, ha proporcionado un panel de taxones bacterianos no obvio y enfocado que está asociado con IC, un riesgo importante para el parto prematuro. La firma del microbioma cervical identificada en este estudio, concretamente LA6, se ha ilustrado para proporcionar información pronóstica después de la intervención de cerclaje/pesario. Aparentemente, los pacientes con IC que dieron positivo para LA6 tienen un mayor riesgo de parto a una edad gestacional significativamente más temprana después de la intervención clínica que los que dieron negativo (23.7 semanas versus 38.4 semanas; razón de riesgo, 6.24; intervalo de confianza del 95%, 1.50 a 25.9). No solo eso, los pacientes positivos para LA6 también tienen un mayor riesgo de parto mucho antes de la intervención que sus contrapartes negativas para LA6 (10 días frente a 126 días; razón de riesgo, 6,34; intervalo de confianza del 95%, 1,51 a 26,6).

Materiales y métodos

Reclutamiento de participantes.

La aprobación de ética para realizar este estudio se obtuvo de la Institutional Review Board respectiva. Se obtuvo el consentimiento informado de mujeres embarazadas asiáticas que asistieron al Department of Obstetrics and Gynaecology, Prince of Wales Hospital, The Chinese University de Hong Kong o the Department of Obstetrics and Gynaecology, Hallym University, Seúl, Corea del Sur, Corea del Sur y cumplieron los siguientes criterios de inclusión: (i) dilatación cervical indolora (1.0 cm-5.0 cm) en el segundo trimestre; y (ii) membrana intacta y; (iii) sin contracciones laborales (una vez cada 10 minutos). Las mujeres fueron excluidas de este estudio si tenían: (a) un embarazo múltiple (>2 fetos); o (b) coito o aplicación de cualquier aplicación vaginal 48 horas antes de la recolección de la muestra de hisopo cervical; o (c) usó antibióticos/antimicóticos 30 días antes de la recolección de la muestra de hisopo cervical.

Recolección de hisopos cervicales

Antes del tratamiento con cerclaje, se recolectó una muestra de hisopo cervical del paciente con IC girando una hisopo Dacron estéril 360° una vez en el orificio externo. Para el cérvix dilatada, el hisopo se obtuvo del sistema operativo en la posición de las 12 en punto frente al médico. La muestra de hisopo se recogió inmediatamente después de la apertura del tracto reproductivo por espéculo, y antes de cualquier otro procedimiento. Se aplicaron técnicas antisépticas. Se tuvo especial cuidado para evitar que el hisopo entre en contacto con cualquier parte del tracto reproductivo (por ejemplo, vagina, labios), que no sea la ubicación designada del cuello uterino.

Extracción de ADN bacteriano

Se extrajo el ADN genómico bacteriano en cada muestra de acuerdo con un protocolo publicado, que se optimizó para mantener una buena representación de taxones bacterianos en una muestra (Yuan et al., PLoS One 7, e33865 (2012)).

Clasificación taxonómica

Cada Otu se clasifica taxonómicamente a nivel de género utilizando Naive Bayesian ARNr Classifier del Ribosomal Database Project (RDP) (Versión 2.9, septiembre de 2014, RDP 16S ARNr conjunto de entrenamiento 10). Los Lactobacillus se comparan con la base de datos 16S ARNr (GenBank) utilizando b La ST (puntaje más alto) y MOLE-BLAST (la mejor alineación múltiple de coincidencias BLAST) para obtener la información de la especie.

Referencias

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Yuan, S., D. B. Cohen, J. Ravel, Z. Abdo and L. J. Forney (2012). "Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome." PLoS One 7(3):e33865.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad de comprensión, un experto en la materia apreciará que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Tabla 1. Características clave de todos los participantes.

Tabla 2A. Datos de secuenciación de los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente incrementados) identificados al comparar los 342 taxones en los 19 cervices dilatados versus los 13 cerrados (normalizados por submuestreo aleatorio).

Tabla 2B. Los datos de secuenciación de los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente disminuidos) identificados comparando los 342 taxones en los 19 cervices dilatados versus los 13 cerrados (normalizados por submuestreo aleatorio).

Tabla 2C. Datos de secuenciación de los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente incrementados) identificados al comparar los 349 taxones en las 10 cérvix dilatadas versus las 10 cerradas (1:1 emparejado por edad gestacional en la recolección de la muestra, emparejado a <2 semanas, normalizado como proporción de recuento de lectura total para cada muestra).

Tabla 3A. Clasificación a nivel de género de los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente incrementados) identificados al comparar los 342 taxones en los 19 cervices dilatados versus los 13 cerrados (normalizados por submuestreo aleatorio).

Tabla 3B. Clasificación a nivel de género de los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente disminuidos) identificados al comparar los 342 taxones en los 19 dilatados versus los 13 cerrados

Tabla 3C. Datos de clasificación a nivel de género de los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente incrementados) identificados al comparar los 349 taxones en las 10 cérvix dilatadas versus las 10 cerradas (1:1 emparejado por edad gestacional en la recolección de la muestra, emparejado a <2 semanas, normalizado como relación del recuento total de lecturas para cada muestra).

Tabla 3D. Clasificación a nivel de género de los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente disminuidos) identificados al comparar los 349 taxones en las 10 cérvix dilatadas frente a las 10 cerradas (1:1 emparejado por edad gestacional en la recolección de la muestra, emparejado a <2 semanas, normalizado como proporción del recuento total de lecturas para cada muestra).

Tabla 4A. Secuencias del gen 16S ARNr de taxones bacterianos de los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente incrementados) identificados al comparar los 342 taxones en los 19 cervices dilatados versus los 13 cerrados (normalizados por submuestreo aleatorio).

Tabla 4B. Secuencias del gen 16S ARNr de taxones bacterianos de los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente disminuidos) identificados al comparar los 342 taxones en los 19 cervices dilatados versus los 13 cerrados.

Tabla 4C. Secuencia del gen 16S ARNr de taxones bacterianos de los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (aumento significativo de taxones identificados al comparar los 349 taxones en las 10 cérvix dilatadas frente a las 10 cerradas (1:1 emparejado por edad gestacional en la recolección de la muestra, emparejado a <2 semanas, normalizado como proporción del recuento total de lecturas para cada muestra).

Tabla 4D. Secuencias del gen 16S ARNr de taxones bacterianos taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente disminuidos) identificados al comparar los 349 taxones en las 10 cérvix dilatadas frente a las 10 cerradas (1:1 emparejado por edad gestacional en la recolección de la muestra, emparejado a <2 semanas, normalizado como proporción del recuento total de lecturas para cada muestra).

Tabla 4E. Clasificación de nivel de especie por alineación BLAST a la base de datos 16S ARNr de NCBI. Los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente incrementados) identificados al comparar los 342 taxones en los 19 cervices dilatados versus los 13 cerrados (normalizados por submuestreo aleatorio) se alinearon.

Tabla 4F. Clasificación de nivel de especie por alineación BLAST a la base de datos 16S ARNr de NCBI. Taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente disminuidos) identificados comparando los 342 taxones en los 19 cervices dilatados versus los 13 cerrados.

Tabla 4G. Clasificación de nivel de especie por alineación BLAST a la base de datos 16S ARNr de NCBI. Se alinearon taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente incrementados) identificados al comparar los 349 taxones en las 10 cérvix dilatadas versus las 10 cerradas (1:1 emparejado por edad gestacional en la recolección de la muestra, emparejado a <2 semanas, normalizado como proporción del recuento total de lecturas para cada muestra).

Tabla 4H. Clasificación de nivel de especie por alineación BLAST a la base de datos 16S ARNr de NCBI. Se alienaron taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente disminuidos) identificados al comparar los 349 taxones en las 10 cérvix dilatadas versus las 10 cerradas (1:1 emparejado por edad gestacional en la recolección de la muestra, emparejado a <2 semanas, normalizado como proporción del recuento total de lecturas para cada muestra.).

Tabla 6. Características de los participantes en el estudio B.

Tabla 7. Taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente aumentados) en el grupo de cuello uterino corto, en comparación con el grupo de cuello uterino de longitud normal. (normalizado por submuestreo aleatorio). Los valores P se ajustan para múltiples pruebas mediante el método de False Discovery Rate

Tabla 8. Secuencia genómica del gen 16S ARNr en los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente aumentados) en el grupo de cuello uterino corto, en comparación con el grupo de cuello uterino de longitud normal. (normalizado por submuestreo aleatorio).

Tabla 9. Clasificación del nivel de especie por alineación BLAST a la base de datos 16S ARNr en NCBI. El gen 16S ARNr en los taxones bacterianos diferencialmente abundantes (significativamente incrementados) en el grupo de cuello uterino corto, comparado con el grupo de cuello uterino de longitud normal se alinearon. * indica taxón con <97% de identidad de nucleótidos con secuencias conocidas y puede representar un taxón novedoso, previamente no reportado.

Listado de secuencia informal

SEQ ID NO: 1

Cebador de avance de PCR V4-V5 (sin secuencia clave de cebador A y secuencia MID en el extremo 5' del cebador) AYT GGG YDT AAA GNG SEQ ID NO: 2

Cebador reverso de PCR V4-V5 (sin secuencia B del cebador B en el extremo 5' del cebador)

CCG TCA ATT YYT TTR AGT TT SEQ ID NO: 3

Taxón d-c-019 de la Tabla 4A - secuencia de ARNr 16S.

GGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCA T CGG AAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACT CCATGT GT AGCGGTG AAA TGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCT SEQ ID NO: 4

Taxón d-c-030 de la Tabla 4A - secuencia de ARNr 16S.

CGCGCG CAGGCGGACT AGCCAGT CAGTCTTAÁAAGTT CGGGGCTT AACCCCGT G ATGGGA TTGAAACTACTAGTCTAGAGTATCGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAAT GCGTAG ATATT AGG A AG AAC ACCAGTG G CG AAGG CG ACTTTCTGG ACG A ACACTG ACG CT SEQ ID NO: 5

Taxón d-c-037 (taxón OTU 47) de la Tabla 4A - secuencia de ARNr 16S.

GGCGCGCAGGCGGTTCGGTAAGTCTGTCTTAAAGTGCGGGCTÍAACCCCGTGAGGGACGG AAACT GT CGAACTTG AGTGTCGGAG AGG AA AGCGG AATT CCT AGTGTAGCGGT G AAAT G CG TAGATATTAGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGACGCT SEQ ID NO: 6

Taxón d-c-040 de la Tabla 4A - secuencia de ARNr 16S.

AGATGAGATGGCGGTTTGTCGCGTCTGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATTGGC GCTGGGTACGGGCAGGCTAGAGTGTAGTAGGGGAGACTGGAATTCTCGGTGTAACGGTGG AATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTATTACTGACG CT SEQ ID NO: 7

Taxón d-c-043 (taxón OTU 56) de la Tabla 4A - secuencia de ARNr 16S.

CG AGCGCAGGCGGGTTTGT AAGTTT GGT ATT AAATCT AGATGCTT AACGTCT AGCT GT ATCA AAAACT GT AAACCT AGAGTGT AGT AGGG AGTTGGGGAACTCC ATGTGG AGCGGT AAAAT GC GTAGATATATGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGCCAACTTGGACTATCACTGACGCT SEQ ID NO: 8

Taxón d-c-045 (taxón OTU 42) de la Tabla 4A - secuencia de ARNr 16S.

CGCGCGTAGGCGGTCTGTTAGGTCAGGAGTCAAATCTGGGGGCTCAACCCCTATCCGCTC CTGATACCGGCAGGCTTGAGTCTGGTATGGGAAGGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAAT GCGCAGATATTTGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCTTCTGGGCCATGACTGACGCT SEQ ID NO: 9

T a xó n d -c -038 (taxón O TU 40 ) de la T a b la 4 A - se cu e n c ia de A R N r 16S.

CGCGCGCAGGCGGTTGCTCAAGCGGAACCTCTAATCTCGGGGCTTAACCTCGAGCCGGGT T CCG AACTGG ACGACTCG AGTGCGGT AGAGGCAG AT GG AATTCCCGGT GT AGCGGTGG AA TGCGCAGATATCGGGAAGAACACCAACGGCGAAGGCAGTCTGCTGGGCCGTCACTGACGC T SEQ ID NO:10

Taxón d-c-047 de la Tabla 4A - secuencia de ARNr 16S.

AGTACGTAGGCGGCCTAGTAAGTTAGAAGTGÁAAGAATATAGCTCAACTATATAAAGCTTTT AAAACT GTTAG G CTT G AG AG AT G AA AGGG AAAGT GG AATT CCTAGT GT AGCGGT G AAAT G C GCAGATATTAGGAAGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCATCATCTGACGCT SEQ ID NO:11

Taxón d-c-054 de la Tabla 4A - secuencia de ARNr 16S.

GGTGCGTAGGCGGTCTGTTAAGTTCATGGTTAAATTTTGGGGCTCAACCCCATTGAGCCAT GGATACTGGCAG ACT AGAGT ATT GGAGAGGCAAGCGG AATT CCATGTGT AGCGGT AAAAT G CGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTAGCCAAAGACTGACGCT SEQ ID NO:12

Taxón d-c-067 de la Tabla 4B - secuencia de ARNr 16S.

G GTGCG CAGGCGGCTTT AC AAGTT GG ATGT G AAAT ATT GTG GCT CA ACC ACAAACGTGCAT CCAAAACTGCAAAGCTTGAGTTAAGGAGAGGTAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAAT GCGTAGATATCAGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTACTGGACTTAAACTGACGC SEQ ID NO:13

Taxón d-c-039 de la Tabla 4B - secuencia de ARNr 16S.

GGCGCGTAGGCGGAATGGCAAGTCAGCAAGTGAAAGCGTGGGGCTCAACCCCATGATGCG GCTGAAACTGTTATTCTAGAGGCATGGAGAGGCAAACGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAA TGCGTAGATATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGTTTGCTGGCCATGAACTGACGC

SEQ ID NO:14

Taxón d-c-052 de la Tabla 4B - secuencia de ARNr 16S.

TGGGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGGTTAACCGTGGAAGTGCAT TGGAAACTGGGGAACTTGAGTACAGAAGAGGAAAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAAT GCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTCACTGACGCT SEQ ID NO:15

Taxón d-c-074 de la Tabla 4B - secuencia de ARNr 16S.

CGTTCGCAGGCGGCAATGCAAGTCTCGTGTGAAAGGCAAGGGCTCAACCCTTGTAAGCAC AAGAAACTGCATAGCTTGAGTAGTGGAGAGGCAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAAT GCGTAGATATTAGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGACACAAACTGACGCT SEQ ID NO:16

Taxón d-c-082 de la Tabla 4B - secuencia de ARNr 16S.

GGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAATTCCGGGGCTTAACTCCGGGCGTGCA GGCGATACGGGCATAACTTGAGTACTGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGA AATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGAC GCT SEQ ID NO:17

T axón d -c -092 de la T a b la 4B - se cu e n c ia de A R N r 16S.

CGCGTGTAGGCGGATTCTCAAGTTGGATGTGAAACCCCTTGGCTAAACTGAGGGCTTGCAT TCAAAACTGAGGACCTTGAGTATCAGAGGGGAAAGTGGAATTCCTGGTGGAGCGGTAAAAT GCGTAGAGATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGCTGACAACTGACGCT

SEQ ID NO:18

Taxón d-c-098 de la Tabla 4B - secuencia de ARNr 16S.

TGTGTGTAGGTGGCGTGATTAGTCGTTTGTGAAAGATCCGAGCTTAACTTGGAAAACGCGA ACGAAACGGTCATGCTTGAGTATGTGAGAGGTAAGCAGAACTCATGGTGTAGGGGTGAAAT CCGTT GAT ATCAT GGGGAAT ACCAAAAGCG AAGGCAGCTTACTGGCAC ATT ACT G ACACT

SEQ ID NO:19

Taxón d-c-012 de la Tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

GGTTCGTAGGCTGTTTGTTAAGTCTGGAGTTAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGCTCGCTTT G G AT ACT AGC AAACT AG AGTT AG ATAG AGGT AAGCGG A ATT CCAT GTG A AGCGGTG AAAT G CGTAGATATATGGAAGAACACCAAAGGCGAAGGCAGCTTACTGGGTCTATACTGACGCT

SEQ ID NO:20

Taxón d-c-030 de la Tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

CGCGCGCAGGCGGACTAGCCAGTCAGTCTTAÁAAGTTCGGGGCTTAACCCCGTGATGGGA TTGAAACTACTAGTCTAGAGTATCGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAAT GCGTAGATATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACGAACACTGACGCT

SEQ ID NO:21

Taxón d-c-040 de la Tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

AGATGAGATGGCGGTTTGTCGCGTCTGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATTGGC GCTGGGTACGGGCAGGCTAGAGTGTAGTAGGGGAGACTGGAATTCTCGGTGTAACGGTGG AATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTATTACTGACG CT

SEQ ID NO:22

Taxón d-c-047 de la Tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

AGT ACGT AGGCGG CCTAGT AAGTTAG AAGT GAA AG AAT AT AG CT CAACT AT AT AA AGCTTTT AAAACTGTT AG G CTT G AG AG AT G AA AGGG AAAGT GG AATT CCTAGT GT AGCGGT G AAAT G C GCAG ATATT AG GAAGAAT ACCGGTGGCGAAGGCGACTTT CT GGT CAT CATCTG ACGCT

SEQ ID NO:23

Taxón d-c-050 de la Tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

GGCTTGT AGGCGGTTT GTCGCGTCGAAAGT GT AAACT CAGT GCTT AACGCTGAGCCTGCTT TCGATACGGGCTGACTAGAGGAAGGTAGGGGAGAATGGAATTCCCGGTGGAGCGGTGGAA TGCGCAGATATCGGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGACCTTTCCTGACGC

SEQ ID NO:24

Taxón d-c-053 de la Tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

CGCTCGTAGGTGGTGTGTTGCGTCGTCTGTGTAATCCAGGGGCTTAACTTTTGGTTGGCAG GCGATACGGGCATTGCTTGAGTGCTGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAA ATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCAGTTACTGACG

SEQ ID NO:25

T axón d -c -068 de la T a b la 4C - se cu e n c ia de A R N r 16S.

TGAGCGTAGGCGGCAGTACAAGTCGGGAGTGAAAACTCGGGGCTCAACCCCGAGACTGCT CTCGAAACTGTACAGCTAGAGTGCAGGATGGGCAGGCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAA ATGCGTAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCCTGCTGGACTGTAACTGACG CT

SEQ ID NO:26

Taxón d-c-071 de la Tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

GGCTTGTAGGCGGCTTGTTGCGCCTGCTGTGAAAACGCGGGGCTTAACTTCGCGCGTGCA GTGGGTACGGGCAGGCTTGAGTGTGGTAGGGGTGACTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGG AATGCGCAGATATCTGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCACTGGGCCATTACTGAC GCT

SEQ ID NO:27

Taxón d-c-072 de la Tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

GGTACGTAGGCGGTTTGTTAAGTTTGGCGTTAAATCACGGGGCTCAACCCCGTTCAGCGTT GAAAACTGGCAAACTTGAGTAGTAGAGGGGACAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATG CGT AGAG ATT AGG AAGAAT ACCG GTGGCG AAGG CG ACT GT CTGG AT AC AT ACT G ACGCT

SEQ ID NO:28

Taxón d-c-081 de la Tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

GGTGTGTAGGCGGTTATATTAGTCATTTGTTAAATCCTCGGGCTTAACCCGAGAATCGCGA GCGAAACGGTATAACTAGAAAGTGTGAGGGGTGTACAGAACTCATGGTGTAGGGGTGAAAT CCGTTGATATCATGGGGAATACCAAAAGCGAAGGCAGTACACTGGCACATATTTG ACGCT

SEQ ID NO:29

Taxón d-c-015 de la Tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

TGCGCGCAGGCGGTTCGGTAAGTCTGTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGA CGGAAACTGTCGAACTTGAGTGTCGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAAT GCGTAGATATTAGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGACGCT

SEQ ID NO:30

Taxón d-c-083 de la Tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

GGTTCGCAGGCGGAATAACAAGTCAGATGTGAAAGGCATGGGCTCAACCCATGTAAGCATT TGAAACTGTAATTCTTGAGAAGTGGAGAGGTAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATG CGT AGAT ATT AGG AGG AAT ACCTGTGGCGAAGGCG ACTT ACT GG ACACAAAT CTG ACGCT

SEQ ID NO:31

Taxón d-c-087 de la Tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

CGCGTGTAGGCGGCACTGTAAGTCAGATGTGAAATCTCCCGGCTCAACCGGGAGCGTGCA TCTGATACTGCAATGCTTGAGTGATAGAGGGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTAAAA TGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGCTATTAACTGACGCT

SEQ ID NO:32

Taxón d-c-088 de la tabla 4C - secuencia de ARNr 16S.

GGTGCGTAGGCGGTTCGGTAAGTCTTGTGTGAAATCTTCAGGCTCAACTTGAAGTCTGCAC GAGAAACTGCCGGGCTTGAGTGTGGGAGAGGTGAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAA TGCGTAGATATCGGAAGGAACACCTGTGGCGAAAGCGGCTCACTGGACCACAACTGACGC

SEQ ID NO:33

T a xó n d -c -105 de la T a b la 4C - se cu e n c ia de A R N r 16S.

GGTGTGTAGGTGGTTATGTTAGTCTCCTTTCAAAGCTCCCGGCCTAACCGGGAAAAGGGAG GGGAAACGGCACAACTAGAGGATGCGAGGGGTCTGTGGAACTCATGGAGTAGGGGTGAAA TCGGTTG AT ATCATGG GGAACACCAAAAAG CG AAGG CAG GAG ACTGGCGCATTCCTG ACAC T SEQ ID NO:34

Taxón d-c-018 de la Tabla 4D - secuencia de ARNr 16S.

CGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCAT CGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAAT GCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCT SEQ ID NO:35

Taxón d-c-052 de la Tabla 4D - secuencia de ARNr 16S.

TGGGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTTAACCGTGGAAGTGCAT TGGAAACTGGGGAACTTGAGTACAGAAGAGGAAAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAAT GCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTCACTGACGCT SEQ ID NO:36

Taxón d-c-074 de la Tabla 4D - secuencia de ARNr 16S.

CGTTCGCAGGCGGCAATGCAAGTCTCGTGTGAAAGGCAAGGGCTCAACCCTTGTAAGCAC AAGAAACTGCATAGCTTGAGTAGTGGAGAGGCAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAAT GCGTAGATATTAGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGACACAAACTGACGCT SEQ ID NO:37

Taxón d-c-076 de la Tabla 4D - secuencia de ARNr 16S.

TGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCAT CGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAA TGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTAGTCTGTAACTGACGCT SEQ ID NO:38

Taxón d-c-082 de la Tabla 4D - secuencia de ARNr 16S.

GGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAATTCCGGGGCTTAACTCCGGGCGTGCA GGCGATACGGGCATAACTTGAGTACTGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGA AATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGAC GCT SEQ ID NO:39

Taxón s-n-006 de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

AGGGCGCAGGCTGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTTAACCGTGGAA GTGCATT GG AAACTGGG AAGCTT GAGT ACAGAAG AGGAAAGTGG AACTCCATGT G T AGCGGTGG AATGCGT AG AT AT ATGGAAG AACACCAGTGGCG AAAGCG ACTTT CT GGTCTGTCACTGACGCTGA SEQ ID NO:40

Taxón s-n-007 de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

CGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGA TCCG CG CCG GGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCG GTGT AACG GTG G AAT GTGTAG ATAT CGGG A AG AAC ACCAAT G GCG A AGGCAG GT CTCTGGGCCGTTACTGACGCTGA S E Q ID NO:41

T a xó n s -n -008 de la T a b la 8 - se cu e n c ia de nu c le ó tid o s de l gen 16S A R N r.

CGCGTGTAGGCGGCTAGATAAGTGTGATGTTTAAATCCAAGGCTTAACCTTGGGG TT CATT ACA AACT GTTT AGCTT G AGTGCTG G AG AGG AT AGTG G AATTCCT AGTGTA GCGGTAAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTATCTG GACAGTAACTGACGCTGA SEQ ID NO:42

Taxón sn-012 de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

CGAGCGTAGGCTGTTTGTTAAGCGTGTTGTGAAATGTAGGAGCTCAACTTTTAGAT TGCAGCGCGAACTGGCAGACTTGAGTGCGCACAACGTAGGCGGAATTCATGGTG TAGCGGTGAAATGCTTAGATATCATGACGAACTCCGATTGCGAAGGCAGCTTACG GGAGCGCAACTGACGCTAA SEQ ID NO:43

Taxón s-n-014 (taxón OTU 16) de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

GGTACGTAGGCGGTTTTTAAGTCAGGTGTCAAAGCGTGGAGCTTAACTCCATTAA GCACTTGAAACTGAAAGACTTGAGTGAAGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTA GCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTTCTG G ACTTTT ACTG ACG CT C A SEQ ID NO:44

Taxón s-n-022 (taxón OTU 28) de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

T GTTCGCAGGCGGCAATGCAÁGT CAGAT GT AAAAGGCAAAGGCT CAACCTTTGTA ~ AGCATCT GAAACTGT AT AGCTT G AG AAGT GTAG AGG CAAGT GG AATTTTT AGT GT A GCGGTGAAATGCGTAGATATTAAAAAGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTGCTGG GCACAATCTGACGCTGA SEQ ID NO:45

Taxón s-n-024 de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

AGTACGTAGGCGGATAAGCAAGTTAGAAGTGAAATCCTATAGCTCAACTATAGTAA GCTTTTAAAACTGCTCATCTTGAGGTATGGAAGGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAG CGGTGAAATGCGCAGATATTAGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTTCTGG CCATAAACTGACGCTGA SEQ ID NO:46

Taxón s-n-025 de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

GGCGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCGGTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTG AGGGGACCGAAACTGGAAGACTTGAGTGTCGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGT GTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTTT CTGGACGACAACTGACGCTGA SEQ ID NO:47

Taxón s-n-027 de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

GGCGCGCAGGCGGTCACTTAAGTCCATCTTAGAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTG ATGGGATGGAAACTGGGAGACTGGAGTATCGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTAGT GTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGACTTTC TGGACGAAAAGTGACGCTGA S E Q ID N O :48

T a xó n s -n -028 de la T a b la 8 - se cu e n c ia de nu c le ó tid o s de l gen 16S A R N r.

GGTGCGTAGGTGGTCTTTCAAGTCGGTGGTTAAAGGCTACGGCTCAACCGTAGTT AGCCTCCGAAACTGGAAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAAAGTGGAATTCCCAGTGT AGCGGTGAAATGCGTAGATATTGGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTTCT G GACTG CAACTGACACTGA

SEQ ID NO:49

Taxón s-n-029 de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

GGCGTGTAGGCGGCTAGATAAGTGTGATGTTTAAATCCAAGGCTTAAACCTTGGG GTTCATTACAAACTGTTTAGCTTGAGTGCTGGAGAGGATAGTGGAATTCCTAGTGT AGCGGTAAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTATCT GGACAGTAACTGACGCTGA

SEQ ID NO:50

Taxón s-n-030 de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

GGCGCGT AGGCGGT CT GTT AGGTCAGG AGTCAAAT CTGGGGGCT CAACCCCT AT CCGCTCCTGATACCGGCAGGCTTGAGTCTGGTATGGGAAGGTGGAATTCCAAGT GTAGCGGTGAAATGCGCAGATATTTGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCTT CTGGGCCATGACTGACGCTGA

SEQ ID NO:51

Taxón s-n-046 de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

GATGAGATGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGA TCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCG GTGT AACG GTG G AAT GTGTAG ATAT CGGG A AG AAC ACCAAT G GCG A AGGCAG GT CTCTGGGCCGTTACTGACGCTGA

SEQ ID NO:52

Taxón s-n-054 de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

GGCAGGTAGGTGGTCTGATTAGTCAATAGGTGAAATCCTCGGGCTTAACCCGAGA AGTGCCTTTGAAACGGTCAGACTGGAGTACTCTAGAGGGTCGTGGAATTCCCGGT GTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAACACCAGAGGCGAAGGCGGCGA CCTG G GG AGTG ACT G AC ACT CA

SEQ ID NO:53

Taxón s-n-063 de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

CGTGCGTAGGCGGTTCTTTAAGTCAGAGGTGAAAGACGGCAGCTTAACTGTCGCA GTGCCTTTGATACTGAAGAACTTGAATTGGGTTGAGGAATGCGGAATGAGACAAG TAGCGGTGAAATGCATAGATATGTCTCAGAACCCCGATTGCGAAGGCAGCATTCC AAGCCTATATTGACGCTGA

SEQ ID NO:54

Taxón s-n-068 de la Tabla 8 - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

GGCAGGTAGGCTGTTTTGTAAGTCCGGCGTGAAATCCCAGAGCTCAACTCTGGAA CTGCGTTGGAAACTACATGACTTGAGTATCGGAGAGGTTAGGGGAATTCTCGGTG TAAGGGTGAAATCTGTAGATATCGAGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGCCTAACT GGCCGATTACTGACGCTGA

S E Q ID N O :55

T a xó n s-n-071 de la T a b la 8 - se cu e n c ia de nu c le ó tid o s de l gen 16S A R N r.

AGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTCAACCGAGGAA GGTC ATT GG AAACTGGGG AACTT GAATGCAGAAG AGGAG AGTGGAATTCCAT GTG TAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCT GGTCTGTAATTGACGCTGA

SEQ ID NO:56

OTU #11 taxón - Sneathia sanguinegens - secuencia de nucleótidos del gen 16S ARNr.

CGCATCTAGGCGGTAAGACAAGTTGAAGGTGAAAACCTGTGGCTCAACCATAGGCT TGCCTACAAAACTGTTGAACTAGAGTACTGGAAAGGTGGGTGGAACTACACGAGTA AGGT G A A ATTC GT A

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar el riesgo de un embarazo o un resultado neonatal adverso para un sujeto femenino, comprendiendo dicho método:

(a) detectar en una muestra biológica tomada del sujeto femenino el nivel de bacterias de Parvimonas micra, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Peptoniphilus lacrimalis, Megasphaera cerevisiae y Parvibacter caecicola; y

b) determinar que el sujeto femenino tiene un mayor riesgo de un embarazo o un resultado neonatal adverso si el nivel de cada una de las bacterias es mayor que un nivel de control estándar.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra biológica es un hisopo cervical, un hisopo vaginal, una muestra de orina, una muestra de líquido amniótico, una muestra de sangre materna, una muestra de suero materno, una muestra de plasma materno, una muestra de moco cervical, un hisopo placentario, un hisopo del cordón umbilical o cualquier muestra tomada directa o indirectamente del sistema reproductivo o del sistema gastrointestinal.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de detección comprende un ensayo de amplificación de polinucleótidos, un ensayo que implica la determinación de la secuencia de polinucleótidos, o un ensayo que implica hibridación de sonda/cebador específica de secuencia, en donde el ensayo de amplificación es preferiblemente un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y en donde el ensayo de PCR es más preferiblemente un ensayo de PCR cuantitativo o un ensayo de PCR de transcriptasa reversa.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el embarazo o el resultado neonatal adverso comprende parto prematuro a <34 semanas, parto prematuro a <37 semanas, parto dentro de aproximadamente 1-196 días después de la toma de la muestra biológica, parto dentro de aproximadamente 1-196 días después de que se realiza una intervención clínica, una puntuación de Apgar a 1 minuto de <7, una puntuación de Apgar a 5 minutos de <7, corioamnionitis, síndrome de dificultad respiratoria, displasia broncopulmonar, hemorragia intraventricular, muerte neonatal dentro de los 7 días posteriores al nacimiento o sepsis neonatal.

5. El método de la reivindicación 1, que comprende además determinar que el sujeto femenino tiene un riesgo de dilatación cervical avanzada o acortamiento cervical prematuro si el nivel de cada una de las bacterias es mayor que un nivel de control estándar.

6. El método de la reivindicación 1, que comprende además determinar que el sujeto femenino está en riesgo de tener una infección en la cavidad amniótica, la cavidad uterina, el cuello uterino o la vagina.

7. El método de la reivindicación 1, que comprende además extraer ácidos nucleicos de la muestra biológica antes del paso (a).

8. El método de la reivindicación 1, cuando se predice que el sujeto femenino tiene un embarazo o un resultado neonatal adverso, que comprende además repetir los pasos (a) y (b) en un momento posterior usando otra muestra biológica del tipo de muestra del sujeto femenino, en donde un aumento en el nivel de cada una de las bacterias en el momento posterior en comparación con el nivel determinado en el paso original (a) indica un mayor riesgo de tener un embarazo o un resultado neonatal adverso.

9. El método de la reivindicación 1, que comprende además:

detectar en la muestra biológica el nivel de bacterias que pertenecen a al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo que consiste en Jonquetella anthropi, Aerococcusurinae, un taxón bacteriano especificado por una secuencia de nucleótidos de ARNr 16S en las Tablas 4B y 4D; y

un taxón bacteriano especificado por la clasificación de especies más cercana basada en la alineación de nucleótidos BLAST en las Tablas 4F y 4H y

determinar que el sujeto femenino tiene un mayor riesgo de un embarazo o un resultado neonatal adverso si el nivel de bacterias que pertenecen al al menos uno de los taxones bacterianos adicionales es inferior al nivel de control estándar.

10. Un kit para determinar el riesgo de tener un embarazo o un resultado neonatal adverso en un sujeto femenino, que comprende

(a) un control estándar para determinar el nivel de cada una de las bacterias que proporciona una muestra biológica tomada de un sujeto femenino embarazado que contiene bacterias de Parvimonas micra, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Peptoniphilus lacrimalis, Megasphaera cerevisiae y Parvibacter caecicola; y

(b) uno o más agentes que identifican específica y cuantitativamente cada una de las bacterias de Parvimonas micra, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Peptoniphilus lacrimalis, Megasphaera cerevisiae y Parvibacter caecicola.

11. El kit de la reivindicación 10, en donde el agente es

uno o más cebadores oligonucleotídicos que híbrida específicamente a y amplifica un polinucleótido de la bacteria en un ensayo de amplificación, o

una sonda polinucleotídica que hibrida específicamente con una secuencia polinucleotídica de la bacteria.

12. Un método para determinar si una mujer embarazada tiene un mayor riesgo de tener dilatación cervical avanzada o acortamiento cervical prematuro, comprendiendo dicho método:

(a) detectar en una muestra biológica tomada del sujeto femenino el nivel de bacterias de Parvimonas micra, Ureaplasma urealyticum o Ureaplasma parvum, Atopobium vaginae, Peptoniphilus lacrimalis, Megasphaera cerevisiae y Parvibacter caecicola; y

(b) determinar que el sujeto femenino tiene un mayor riesgo de tener dilatación cervical avanzada o acortamiento cervical prematuro si el nivel de cada una de las bacterias es mayor que el de un nivel de control estándar.

13. El método de la reivindicación 12, que comprende además extraer ácidos nucleicos de la muestra biológica antes de realizar la etapa (a).

14. El método de la reivindicación 12, en donde la muestra biológica es un hisopo cervical, un hisopo vaginal, una muestra de orina, una muestra de líquido amniótico, una muestra de sangre materna, una muestra de suero materno, una muestra de plasma materno, una muestra de moco cervical, un hisopo placentario, un hisopo del cordón umbilical o cualquier muestra tomada directa o indirectamente del sistema reproductivo o del sistema gastrointestinal.

15. El método de la reivindicación 12, en donde la etapa de detección comprende un ensayo de amplificación de polinucleótidos, un ensayo que implica la determinación de la secuencia de polinucleótidos, o un ensayo que implica la hibridación sonda/cebador específica de la secuencia, en donde el ensayo de amplificación es preferiblemente un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y en donde el ensayo de PCR es más preferiblemente un ensayo de PCR cuantitativo o un ensayo de PCR de transcriptasa reversa.