WO2021112237A1 - 絨毛膜羊膜炎の発症予測方法 - Google Patents

絨毛膜羊膜炎の発症予測方法 Download PDF

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WO2021112237A1
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chorioamnionitis
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sequence shown
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新吾 宮本
大知 漆山
房典 四元
健一郎 秦
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学校法人福岡大学
国立研究開発法人国立成育医療研究センター
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting the onset of chorioamnionitis.
  • Chorioamnionitis is an inflammatory disease caused by bacterial infection of the egg membrane, which is a fetal appendage. Chorioamnionitis is a condition that causes premature birth and is said to be closely related to the prognosis of postnatal infants, for example, sequelae such as central nervous system disorders and chronic respiratory disorders.
  • the diagnosis of chorioamnionitis is confirmed by placental pathological examination after delivery, but during the course of pregnancy, the diagnosis is made using clinical diagnosis and preterm birth markers such as granulocyte elastase.
  • these methods have low sensitivity to detection of chorioamnionitis, and early detection is difficult.
  • an object of the present invention is to provide a method for predicting the onset of chorioamnionitis, which can predict the onset of chorioamnionitis with high specificity.
  • the first aspect is to quantify the abundance of at least one bacterium selected from the bacterial group shown in A below, which is contained in a sample derived from the subject's vagina, and based on the abundance of the bacterium. It is a method for predicting the onset of chorioamnionitis, which comprises associating a sample with the possibility of developing chorioamnionitis.
  • the second aspect is to quantify the abundance of at least one bacterium selected from the bacterial group shown in A above, which is contained in a sample derived from the target vagina, and based on the abundance of the bacterium.
  • a method of detecting chorioamnionitis which comprises associating a sample with the presence of chorioamnionitis.
  • a third aspect is a kit for predicting the onset of chorioamnionitis, which comprises at least one primer set selected from the following primer set group.
  • Primer set group A primer set for Finegoldia magna consisting of a primer having the sequence shown by SEQ ID NO: 1 and a primer having the sequence shown by SEQ ID NO: 2;
  • a primer set for Streptococcus anginosus consisting of a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • a primer set for Aerococcus christensenii which comprises a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the fourth aspect is a kit for diagnosing chorioamnionitis containing at least one primer set selected from the above primer set group.
  • the fifth aspect is to select chorioamnionitis-related bacteria in the target group to prepare the chorioamnionitis-related bacteria group, and from the chorioamnionitis-related bacteria group contained in the sample derived from the target vagina. Quantifying the abundance of at least one selected bacterium and associating the sample with the likelihood of developing chorioamnionitis or the sample with the presence of chorioamnionitis based on the abundance of said bacterium It is a method for predicting or detecting the onset of chorioamnionitis including.
  • the present invention it is possible to provide a method for predicting the onset of chorioamnionitis, which can predict the onset of chorioamnionitis with high specificity.
  • the term "process” is included in this term not only as an independent process but also as long as the intended purpose of the process is achieved even if it cannot be clearly distinguished from other processes. ..
  • embodiments of the present invention will be described in detail.
  • the embodiments shown below exemplify a method for predicting the onset of chorioamnionitis for embodying the technical idea of the present invention, and the present invention describes the onset of chorioamnionitis shown below. It is not limited to the prediction method.
  • the method for predicting the onset of chorioamnionitis is at least one type of bacterium (hereinafter, specific bacterium) selected from the bacterial group shown in A below, which is contained in a sample derived from the target vagina. It includes a first step of quantifying the abundance of (also referred to as) and a second step of associating the sample with the possibility of developing chorioamnionitis based on the abundance of bacteria.
  • specific bacterium selected from the bacterial group shown in A below
  • the possibility of developing chorioamnionitis can be predicted based on the abundance of specific bacteria contained in a sample derived from the target vagina.
  • the bacterial species to be detected is selected by associating a sample derived from the vagina with a definitive diagnosis by postpartum placental pathological examination, so that the possibility of developing chorioamnionitis is predicted with high sensitivity. be able to.
  • the abundance of a specific bacterium, which is at least one selected from the bacterial group shown in A above, contained in a sample derived from the target vagina is quantified.
  • the target in the method for predicting the onset of chorioamnionitis may be a pregnant human woman, for example, a pregnant woman in the perinatal period, or a pregnant woman in the perinatal period in which imminent preterm birth is a concern.
  • the vaginal-derived sample may be, for example, a vaginal swab, which is commonly used in commercially available kits such as Optiswab Transport System (Puritan), Catch-All Sample Collection Swab (Epicenter), etc. It can be collected by adopting the method.
  • the collected sample can be stored, for example, at ⁇ 80 ° C.
  • the abundance of specific bacteria contained in the sample may be a value obtained by absolute quantification or a value obtained by semi-quantification.
  • the abundance of the specific bacterium can be quantified as follows, for example.
  • an analytical method including extracting DNA from a sample and performing quantitative PCR using a primer set using the extracted DNA as a template and a base sequence specific to each specific bacterium as an amplification target region.
  • the abundance of specific bacteria can be quantified.
  • the abundance obtained by quantitative PCR may be, for example, the copy number of the amplified oligonucleotide.
  • Extraction of DNA from a sample can be carried out by a DNA extraction method commonly used in the art. For example, cells can be physically crushed and lysed by bead treatment using glass beads or the like, and DNA contained in a sample can be extracted using a commercially available DNA extraction kit or the like.
  • the primer set specific to each bacterial species is based on, for example, the standard sequence of the 16S ribosomal RNA gene for each bacterial species obtained from RDP (Ribosomal Database Project, http://rdp.cme.msu.edu). Can be created. Specifically, multiple alignment was performed using MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, http://www.megasoftware.net) to identify common and different nucleotide sequences within the 16S ribosomal RNA gene. To do. Next, by designing a primer set for the base sequence, a primer set specific to each bacterial species can be obtained. The specificity of the designed primer set may be confirmed by in-silico PCR or the like. Examples of specific primer sets include the following primer sets.
  • Quantitative PCR may be any method as long as it can quantitatively obtain a PCR amplification product, and known methods such as real-time PCR and digital PCR can be used.
  • the abundance of the specific bacterium may be a relative value corrected by the abundance of all bacterial species contained in the sample. This makes it possible to compensate for errors due to variations in the amount of bacteria contained in each sample.
  • the abundance of all bacterial species contained in the sample can be quantified by performing quantitative PCR using, for example, a universal primer set for the 16S ribosomal RNA gene.
  • the amplification target region of the universal primer set for the 16S ribosomal RNA gene may be any of all variable regions V1 to V9 of the 16S ribosomal RNA gene.
  • the storage region sandwiching the V1 region and the V2 region is the amplification target region. Can be.
  • the bacterial group is composed of, for example, a bacterial species selected by a method for selecting chorioamnionitis-related bacteria, which will be described later.
  • the bacterium group composed of the specific bacterium may be the bacterium group shown by B below or the bacterium group shown by C below, and is another bacterium group selected by the selection method of chorioamnionitis-related bacteria described later. You may.
  • By adopting another bacterial group selected by the selection method of chorioamnionitis-related bacteria described later it is possible to more appropriately respond to a target group having different races, lifestyles, diseases, complications, etc. ..
  • the sample and the subject from which the sample is derived are associated with the likelihood of developing chorioamnionitis, based on the abundance of the particular bacterium.
  • the predetermined value cutoff value
  • the detection of at least one specific bacterium selected from the bacterial group A in the sample may be associated with the likelihood of developing chorioamnionitis in the subject.
  • the case where at least one selected from the bacterial group B is detected in the sample may be associated with the possibility of developing chorioamnionitis in the subject, and the two selected from the bacterial group B may be associated.
  • the case where three species are detected in the sample may be associated with the likelihood of developing chorioamnionitis in the subject.
  • the method for detecting chorioamnionitis is a first step of quantifying the abundance of at least one bacterium selected from the above-mentioned bacterial group A contained in a sample derived from a target vagina. , Includes a third step of associating the sample with the presence of chorioamnionitis based on the abundance of the bacteria.
  • the presence of chorioamnionitis in the subject can be detected based on the abundance of specific bacteria contained in the sample derived from the vagina.
  • the presence of chorioamnionitis in the subject can be detected without waiting for a definitive diagnosis by placental pathological examination after delivery, and treatment intervention based on the diagnosis of developing chorioamnionitis can be performed.
  • the method for detecting chorioamnionitis may be a method for diagnosing chorioamnionitis in a subject.
  • the first step in the method for detecting chorioamnionitis is the same as the first step in the method for predicting the onset of chorioamnionitis.
  • the sample is associated with the presence of chorioamnionitis in the subject from which the sample is derived, based on the abundance of specific bacteria detected in the sample.
  • it is determined that the specific bacterium is detected in the sample when the abundance of the specific bacterium contained in the sample is equal to or more than the predetermined value, and when the abundance of the specific bacterium is less than the predetermined value, the specific bacterium is sampled. It may include determining that it is not detected from.
  • the detection of at least one specific bacterium selected from the bacterial group A in the sample may be associated with the presence of chorioamnionitis in the subject.
  • the case where at least one selected from the bacterial group B is detected in the sample may be associated with the presence of chorioamnionitis in the subject, and two or three selected from the bacterial group B may be associated.
  • the presence of chorioamnionitis in the subject may be associated with the case where the species is detected in the sample.
  • the presence of chorioamnionitis in the subject from which the sample was collected is detected with higher sensitivity. can do.
  • the treatment method for chorioamnionitis includes a first step of quantifying the abundance of at least one type of bacteria selected from the above-mentioned bacterial group A contained in a sample derived from the target vagina. A second step of associating the sample with the likelihood of developing chorioamnionitis based on the abundance of the bacteria and a fourth step of treating a subject at high risk of developing chorioamnionitis may be included.
  • preterm birth can be suppressed, pregnancy can be extended, maternal infection can be suppressed, neonatal infection can be suppressed, and fetal inflammatory reaction syndrome / neonatal meningitis / It has the effects of suppressing neonatal diseases such as neonatal chronic lung disease, periventricular white softness, cerebral palsy, and developmental delay, suppressing the occurrence of persons with disabilities, suppressing medical and social security costs, and promoting the social advancement of the child-rearing generation. be able to.
  • neonatal diseases such as neonatal chronic lung disease, periventricular white softness, cerebral palsy, and developmental delay
  • the treatment according to the subject may be any treatment performed for chorioamnionitis, for example, treatment, improvement, suppression of progression (prevention of deterioration), prevention, chorioamnionitis of chorioamnionitis.
  • Relief of symptoms caused by inflammation can be mentioned.
  • administration of antibacterial agent, administration of uterine contraction inhibitor, administration of steroid agent, administration of labor-promoting agent, induction of delivery, cesarean section, hysterotomy, dilation and curettage, hysterectomy, etc. Can be mentioned.
  • the method for selecting chorioamnionitis-related bacteria is a data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in a sample derived from the vagina of a target included in a target group consisting of a plurality of subjects.
  • the fifth step of obtaining the subject the sixth step of determining the Blanc classification in chorioamnionitis by the postpartum placental pathological examination of the subject, and the machine learning of the association between the data group of the target base sequence and the Blanc classification. It includes a seventh step of ranking the bacterial species associated with chorioamnionitis and an eighth step of selecting the chorioamnionitis-related bacteria based on the ranking.
  • Chorioamnionitis-related bacteria present in can be selected.
  • Chorioamnionitis-related bacteria By detecting selected chorioamnionitis-related bacteria from a sample derived from the vagina of any subject, the risk of developing chorioamnionitis in the subject can be evaluated. This makes it possible to suppress preterm birth associated with chorioamnionitis, prolong the gestation period, and suppress neonatal infection.
  • the target in the selection method is the same as the target in the prediction method described above.
  • the target group consisting of a plurality of subjects may be a group consisting of randomly selected subjects, and may be a group consisting of subjects having a tendency to have similar bacterial flora in the vagina.
  • the group consisting of subjects showing a tendency to have similar bacterial flora in the vagina may be any of a target group having a common race, a target group having a similar lifestyle, a target group having similar diseases, complications, etc. ..
  • the data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in the sample can be obtained by, for example, the following analysis method. Extracting DNA from a sample, amplifying the extracted DNA by PCR using a universal primer set for 16S ribosomal RNA gene to obtain an amplicon (PCR amplification product) of 16S ribosomal RNA gene, and including it in the amplicon
  • a data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene can be obtained by a method including randomly determining the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene.
  • Extraction of DNA from a sample can be carried out by a DNA extraction method commonly used in the art. For example, cells can be physically crushed and lysed by bead treatment using glass beads or the like, and DNA contained in a sample can be extracted using a commercially available DNA extraction kit or the like.
  • the amplification target region of the universal primer set for the 16S ribosomal RNA gene may be any of all variable regions V1 to V9 of the 16S ribosomal RNA gene.
  • the storage region sandwiching the V1 region and the V2 region is the amplification target region. Can be. This makes it easy to obtain effective phylogenetic information from the 16S ribosomal RNA gene.
  • the universal primer may include a so-called bar code sequence or the like, and the bar code sequence may be arranged at either the 5'end or the 3'end.
  • the nucleotide sequence data group can be obtained by randomly determining the nucleotide sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in the obtained amplicon.
  • the nucleotide sequence data group is composed of a combination of the nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene specific to a certain bacterial species and the abundance of oligonucleotides having the nucleotide sequence (for example, the number of reads).
  • randomly determined means as random as possible without selecting only a specific sequence or excluding a certain sequence from a mixture of DNA or the like whose base sequence should be determined. In addition, it means to determine an arbitrary base sequence contained in the mixture.
  • the base sequence When the base sequence is randomly determined in this way, DNA having a high concentration in the mixture such as the extracted DNA becomes more frequently subject to base sequence determination, and conversely, the concentration becomes higher. For DNA having a low base sequence, the frequency of base sequence determination is low.
  • the vaginal flora contained in the sample derived from the vagina contains a plurality of types of bacteria and has a base sequence peculiar to each type on the 16S ribosomal RNA gene. Therefore, in the base sequence data group obtained by randomly determining the base sequence of a mixture such as DNA prepared from a sample derived from the vagina, there is a base sequence (for example, there is) that matches the base sequence that can be arbitrarily selected.
  • the number of reads (which match the nucleotide sequence peculiar to a specific bacterial species) reflects the amount of bacteria that make up the vaginal flora. That is, the data group of the base sequence reflects the bacterial flora structure of the vaginal flora.
  • next-generation sequencer is a term that is contrasted with capillary sequencers that use the Sanger method.
  • Next-generation sequencers use sequencing principles such as synthetic sequencing, pyrosequencing, and ligase reaction sequencing.
  • Specific examples of the next-generation sequencer include a MiSeq (registered trademark) system (illmina), a HiSeq (registered trademark) system (illmina), and an IonPGM (registered trademark) system (Life Technology).
  • Amplicon sequencing by the next-generation sequencer can be performed according to the protocol recommended by the manufacturer. Further, in the sequencing analysis, low quality reads and the like can be deleted by quality control, and then randomly selected reads can be used as a base sequence data group.
  • the sixth step pathological examination is performed on the placenta obtained after delivery for each subject, a definitive diagnosis of chorioamnionitis is made, and the Blanc classification is determined.
  • the Blanc classification is an index indicating the degree of pathological inflammation of chorioamnionitis.
  • the bacterial species associated with chorioamnionitis are identified and the association with the Blanc classification is ranked by machine learning the relationship between the data group of the target base sequence and the Blanc classification. A method appropriately selected from known methods such as random forest can be applied to machine learning.
  • chorioamnionitis-related bacteria are selected based on the ranking. Bacterial species may be selected in descending order of association with chorioamnionitis based on ranking. The number of bacterial species selected may be, for example, 20 species, 15 species, 8 species, 3 species, or the like.
  • Chorioamnionitis Onset Prediction Kit or Diagnostic Kit The Chorioamnionitis Onset Prediction Kit or Diagnostic Kit includes at least one primer set selected from the following primer set group.
  • the kit may include two or three primer sets selected from the following primer set group.
  • Primer set group A primer set for Finegoldia magna consisting of a primer having the sequence shown by SEQ ID NO: 1 and a primer having the sequence shown by SEQ ID NO: 2;
  • a primer set for Streptococcus anginosus consisting of a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • a primer set for Aerococcus christensenii which comprises a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • Onset of chorioamnionitis by detecting specific bacteria by analyzing DNA extracted from a sample derived from the target vagina by quantitative PCR using a kit for predicting the onset of chorioamnionitis or a kit for diagnosis.
  • the risk can be predicted and the presence of chorioamnionitis can be diagnosed.
  • the kit for predicting the onset of chorioamnionitis or the kit for diagnosis is based on quantifying the abundance of specific bacteria contained in a sample derived from the target vagina in addition to the primer set and the quantified abundance.
  • An instruction manual stating that the sample is associated with the likelihood of developing chorioamnionitis in the subject or the presence of chorioamnionitis in the subject may be further included.
  • PCR amplification products (amplicon) of 66 samples obtained above were simultaneously subjected to 16S amplicon analysis according to the protocol recommended by the manufacturer using a next-generation sequencer (NGS: MiSeq (registered trademark) sequencer). Sequence data of PCR amplification products were obtained in Fastq file format. Low quality reads were removed from the obtained reads by quality control, adapter sequences and the like were deleted, and about 1,300 reads were randomly selected to obtain a base sequence data group.
  • NGS next-generation sequencer
  • the obtained data group was divided into a chorioamnionitis group and a non-chorioamnionitis group, and subjected to machine learning (random forest) to identify the top 20 bacterial species highly related to chorioamnionitis. ..
  • the identified bacterial species are shown below.
  • Primer set 1 for detecting Finegoldia magna which comprises a forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and shown by SEQ ID NO: 3.
  • Primer set 2 for detecting Streptococcus anginosus which consists of a forward primer having the base sequence shown in the above sequence and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 a primer set 3 for detecting Aerococcus christensenii was prepared.
  • a universal primer set consisting of a forward primer having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 7 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 8 for amplifying the 16S ribosomal RNA gene was prepared.
  • the copy number contained in the PCR amplification product corresponding to each bacterium was corrected by the copy number corresponding to all bacterial species according to the following formula, and the corrected value was calculated. When the correction value was 5 or more, it was judged to be positive (bacteria were detected).
  • Correction value copy number of each bacterium / copy number of all bacteria x 10000
  • the risk of developing chorioamnionitis could be evaluated with high specificity and positive predictive value regardless of which primer set was used.
  • Example 2 In Example 1, an ROC curve was drawn with the correction values of each primer set, and the value at which Youden Index was maximized was used as the cutoff value to evaluate the risk of onset. The results are shown in Table 10.

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Abstract

絨毛膜羊膜炎の発症を高い特異性で予測することができる絨毛膜羊膜炎の発症予測方法が提供される。絨毛膜羊膜炎の発症予測方法は、対象の膣に由来する試料に含まれる、下記Ａで示される細菌群から選択される少なくとも１種の細菌の存在量を定量することと、前記細菌の存在量に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付けることとを含む。 細菌群Ａ：Finegoldia magna;Streptococcus anginosus;Aerococcus christensenii;Lactobacillus jensenii;Ureaplasma parvum;Prevotella disiens;Lactobacillus vaginalis;Prevotella buccalis;Dialister micraerophilus;Atopobium vaginae;Prevotella bivia;Prevotella amnii;Anaerococcus lactolytcus;Streptococcus agalactiae;Anaerococcus tetradius

Description

絨毛膜羊膜炎の発症予測方法
　本発明は、絨毛膜羊膜炎の発症予測方法に関する。
　絨毛膜羊膜炎は、胎児付属物である卵膜に細菌が感染して生じる炎症性疾患である。絨毛膜羊膜炎は、早産を引き起こす病態であり、また出生後の児の予後、例えば、中枢神経系障害、慢性呼吸障害等の後遺症と密接に関わっているとされる。絨毛膜羊膜炎の診断は、分娩後の胎盤病理検査で確定されるが、妊娠経過中においては臨床的診断と、顆粒球エラスターゼ等の早産マーカーを用いて診断がおこなわれている。しかし、これらの方法では絨毛膜羊膜炎の検出に対する感度が低く、早期発見が困難である。
　上記に関連して、羊水から特定の微生物を検出することで絨毛膜羊膜炎の存在を検出する方法が提案されている（例えば、特開２０１７－２０９０６３号公報参照）。
　絨毛膜羊膜炎の発症後は短期間で早産に至る症例が多いため、対象における絨毛膜羊膜炎の発症を予測する方法が求められている。従って本発明は、絨毛膜羊膜炎の発症を高い特異性で予測することができる絨毛膜羊膜炎の発症予測方法を提供することを目的とする。
　第１の態様は、対象の膣に由来する試料に含まれる、下記Ａで示される細菌群から選択される少なくとも１種の細菌の存在量を定量することと、細菌の存在量に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付けることとを含む、絨毛膜羊膜炎の発症予測方法である。
細菌群Ａ
　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
　ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）；
　ウレアプラズマ・パルブム（Ureaplasma parvum）；
　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）；
　ディアリスタ・ミクラエロフィルス（Dialister micraerophilus）；
　アトポビウム・バギナエ（Atopobium vaginae）；
　プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；
　プレボテラ・アムニイ（Prevotella amnii）；
　アネロコッカス・ラクトリチクス（Anaerococcus lactolytcus）；
　ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）；
　アネロコッカス・テトラディウス（Anaerococcus tetradius）。
　第２の態様は、対象の膣に由来する試料に含まれる、上記Ａで示される細菌群から選択される少なくとも１種の細菌の存在量を定量することと、前記細菌の存在量に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けることとを含む、絨毛膜羊膜炎の検出方法である。
　第３の態様は、下記プライマーセット群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含む絨毛膜羊膜炎の発症予測用キットである。
プライマーセット群
　配列番号１で示される配列を有するプライマーおよび配列番号２で示される配列を有するプライマーからなるフィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）用プライマーセット；
　配列番号３で示される配列を有するプライマーおよび配列番号４で示される配列を有するプライマーからなるストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）用プライマーセット；
　配列番号５で示される配列を有するプライマーおよび配列番号６で示される配列を有するプライマーからなるアエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）用プライマーセット。
　第４の態様は、上記プライマーセット群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含む絨毛膜羊膜炎の診断用キットである。
　第５の態様は、対象群における絨毛膜羊膜炎関連細菌を選択して絨毛膜羊膜炎関連細菌群を準備することと、対象の膣に由来する試料に含まれる絨毛膜羊膜炎関連細菌群から選択される少なくとも１種の細菌の存在量を定量することと、前記細菌の存在量に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性、または試料と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けることと、を含む絨毛膜羊膜炎の発症予測方法または検出方法である。
　本発明によれば、絨毛膜羊膜炎の発症を高い特異性で予測することができる絨毛膜羊膜炎の発症予測方法を提供することができる。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、絨毛膜羊膜炎の発症予測方法を例示するものであって、本発明は、以下に示す絨毛膜羊膜炎の発症予測方法に限定されない。
絨毛膜羊膜炎の発症予測方法
　絨毛膜羊膜炎の発症予測方法は、対象の膣に由来する試料に含まれる、下記Ａで示される細菌群から選択される少なくとも１種の細菌（以下、特定細菌ともいう）の存在量を定量する第１工程と、細菌の存在量に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付ける第２工程とを含む。
細菌群Ａ
　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
　ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）；
　ウレアプラズマ・パルブム（Ureaplasma parvum）；
　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）；
　ディアリスタ・ミクラエロフィルス（Dialister micraerophilus）；
　アトポビウム・バギナエ（Atopobium vaginae）；
　プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；
　プレボテラ・アムニイ（Prevotella amnii）；
　アネロコッカス・ラクトリチクス（Anaerococcus lactolytcus）；
　ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）；
　アネロコッカス・テトラディウス（Anaerococcus tetradius）。
　羊水を試料として、羊水に含まれる細菌叢を分析する方法では、絨毛膜羊膜炎から羊水感染まで病態が進行していないと細菌を検出することができない。したがって、絨毛膜羊膜炎を発症している対象については絨毛膜羊膜炎の存在を出生前に検出することができるものの、絨毛膜羊膜炎を発症していない対象についての絨毛膜羊膜炎発症の可能性を予測することは困難であると考えられる。また、羊水採取は対象に対する侵襲を伴い、容易に実施することが困難であるし、複数回の羊水採取は更にリスクが高く、その実施は更に困難である。一方、絨毛膜羊膜炎の発症予測方法では、対象の膣に由来する試料に含まれる特定の細菌の存在量に基づいて絨毛膜羊膜炎の発症の可能性を予測することができる。検出対象となる細菌種は後述するように、膣に由来する試料と分娩後の胎盤病理検査による確定診断とを関連付けて選択されるため、高い感度で絨毛膜羊膜炎発症の可能性を予測することができる。
第１工程
　第１工程では、対象の膣に由来する試料に含まれる上記Ａで示される細菌群から選択される少なくとも１種である特定細菌の存在量を定量する。絨毛膜羊膜炎の発症予測方法における対象としては、ヒトの妊婦であればよく、例えば、周産期の妊婦であってよく、切迫早産が懸念される周産期の妊婦であってよい。膣に由来する試料は例えば、膣スワブであってよく、膣スワブは市販のキット、例えば、オプティスワブ　トランスポート・システム（Ｐｕｒｉｔａｎ社）、Ｃａｔｃｈ－Ａｌｌ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｓｗａｂ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）等の通常用いられる方法を採用して採取することができる。採取した試料は例えば、－８０℃で保存しておくことができる。
　試料に含まれる特定細菌の存在量は、絶対定量により得られる値であってよく、半定量により得られる値であってよい。特定細菌の存在量は、例えば以下のようにして定量することができる。試料からＤＮＡを抽出することと、抽出されたＤＮＡを鋳型とし、それぞれの特定細菌に特異的な塩基配列を増幅対象領域とするプライマーセットを用いて定量ＰＣＲを実施することとを含む分析方法により、特定細菌の存在量を定量することができる。定量ＰＣＲによって得られる存在量は、例えば増幅されたオリゴヌクレオチドのコピー数であってよい。
　試料からのＤＮＡの抽出は、当該技術分野で慣用されているＤＮＡ抽出方法によって実施することができる。例えば、ガラスビーズ等を用いるビーズ処理によって物理的に細胞を破砕して溶菌し、市販のＤＮＡ抽出キット等を用いて試料に含まれるＤＮＡを抽出することができる。
　それぞれの菌種に特異的なプライマーセットは、例えば、ＲＤＰ(Ribosomal Database Project, http://rdp.cme.msu.edu)から得られるそれぞれの細菌種についての１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の標準配列に基づいて作成することができる。具体的には、ＭＥＧＡ(Molecular Evolutionary Genetics Analysis, http://www.megasoftware.net)を用いてマルチプルアライメントし、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中における菌種内で共通かつ菌種間で異なる塩基配列を同定する。次いでその塩基配列に対するプライマーセットを設計することで、それぞれの菌種に特異的なプライマーセットを得ることができる。なお、設計したプライマーセットの特異性は、ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ　ＰＣＲ等で確認してもよい。具体的なプライマーセットの例としては、例えば、以下のプライマーセットが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　定量ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅産物を定量的に得られる手法であればよく、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ等の公知の手法を用いることができる。
　特定細菌の存在量は、試料に含まれる全菌種の存在量によって補正された相対値であってもよい。これにより、各試料に含まれる細菌量のばらつきによる誤差を補償することができる。試料に含まれる全菌種の存在量は、例えば１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマーセットを用いて定量ＰＣＲを実施することで、全菌種の存在量を定量することができる。１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマーセットの増幅対象領域は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ１からＶ９のすべての可変領域のいずれであってもよく、例えば、Ｖ１領域とＶ２領域を挟む保存領域を増幅対象領域とすることができる。
　前記細菌群は、例えば、後述する絨毛膜羊膜炎関連細菌の選択方法によって選択される細菌種から構成される。上記細菌群から選択される特定細菌を検出することで、絨毛膜羊膜炎の発症を高い感度で予測することができる。特定細菌が構成する細菌群は、下記Ｂで示される細菌群または下記Ｃで示される細菌群であってよし、後述する絨毛膜羊膜炎関連細菌の選択方法によって選択される別の細菌群であってもよい。後述する絨毛膜羊膜炎関連細菌の選択方法によって選択される別の細菌群を採用することで、人種、生活習慣、疾患、合併症等が異なる対象群に、より適切に対応することができる。
細菌群Ｂ
　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）。
細菌群Ｃ
　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）；
　ディアリスタ・ミクラエロフィルス（Dialister micraerophilus）；
　アトポビウム・バギナエ（Atopobium vaginae）；
　プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；
　プレボテラ・アムニイ（Prevotella amnii）；
　アネロコッカス・ラクトリチクス（Anaerococcus lactolytcus）；
　アネロコッカス・テトラディウス（Anaerococcus tetradius）。
第２工程
　第２工程では、特定細菌の存在量に基づいて、試料とその試料が由来する対象が絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付ける。第２工程は、試料に含まれる特定細菌の存在量が所定値（カットオフ値）以上の場合にその特定細菌が試料から検出されたと判断し、特定細菌の存在量が所定値未満の場合にその特定細菌が試料から検出されないと判断することを含んでいてよい。第２工程では、細菌群Ａから選択される特定細菌の少なくとも１種が試料から検出されたことと、対象における絨毛膜羊膜炎の発症可能性とを関連付けてよい。これにより高い特異度で対象における絨毛膜羊膜炎の発症リスクを予測することができる。第２工程では、上記細菌群Ｂから選択される少なくとも１種が試料から検出される場合と対象における絨毛膜羊膜炎の発症可能性とを関連付けてよく、上記細菌群Ｂから選択される２種または３種が試料から検出される場合と対象における絨毛膜羊膜炎の発症可能性とを関連付けてよい。
　絨毛膜羊膜炎の発症リスクが高いと予測される対象には、羊水検査等の追加検査を実施してもよく、必要に応じて経過観察、治療介入等の処置を実施してもよい。
絨毛膜羊膜炎の検出方法
　絨毛膜羊膜炎の検出方法は、対象の膣に由来する試料に含まれる、上記細菌群Ａから選択される少なくとも１種の細菌の存在量を定量する第１工程と、前記細菌の存在量に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付ける第３工程とを含む。
　膣に由来する試料に含まれる特定細菌の存在量に基づいて、対象における絨毛膜羊膜炎の存在を検出することができる。これにより、分娩後の胎盤病理検査による確定診断を待つことなく、対象における絨毛膜羊膜炎の存在を検出することができ、絨毛膜羊膜炎を発症しているとの診断に基づく治療介入等が可能になる。すなわち、絨毛膜羊膜炎の検出方法は、対象における絨毛膜羊膜炎の診断方法であってよい。
　絨毛膜羊膜炎の検出方法における第１工程は、絨毛膜羊膜炎の発症予測方法における第１工程と同様である。第３工程では、試料から検出される特定細菌の存在量に基づいて、試料と、その試料が由来する対象における絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付ける。第３工程は、試料に含まれる特定細菌の存在量が所定値以上の場合にその特定細菌が試料から検出されたと判断し、特定細菌の存在量が所定値未満の場合にその特定細菌が試料から検出されないと判断することを含んでいてよい。第３工程では、細菌群Ａから選択される特定細菌の少なくとも１種が試料から検出されたことと、対象における絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けてよい。第３工程では、上記細菌群Ｂから選択される少なくとも１種が試料から検出される場合と対象における絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けてよく、上記細菌群Ｂから選択される２種または３種が試料から検出される場合と対象における絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けてよい。細菌群Ｂに含まれる特定細菌が試料から３種検出される場合と対象における絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けると、試料が採取された対象における絨毛膜羊膜炎の存在をより高い感度で検出することができる。
絨毛膜羊膜炎の処置方法
　絨毛膜羊膜炎の処置方法は、対象の膣に由来する試料に含まれる上記細菌群Ａから選択される少なくとも１種の細菌の存在量を定量する第１工程と、前記細菌の存在量に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付ける第２工程と、絨毛膜羊膜炎の発症リスクが高い対象を処置する第４工程とを含んでよい。
　絨毛膜羊膜炎の発症リスクが高い対象に必要に応じた処置を施すことで、早産の抑制、妊娠期間の延長、母体感染の抑制、新生児感染の抑制、胎児炎症反応症候群・新生児髄膜炎・新生児慢性肺疾患・脳室周囲白質軟化症・脳性麻痺・発達遅滞などの新生児疾患の抑制、障がい者の発生抑制、医療費・社会保障費の抑制、子育て世代の社会進出促進等の効果を得ることができる。ここで対象に応じた処置とは、絨毛膜羊膜炎について施される何らかの処置であればよく、例えば、絨毛膜羊膜炎の治療、改善、進行の抑制（悪化の防止）、予防、絨毛膜羊膜炎に起因する症状の緩和等が挙げられる。具体的には、例えば、抗菌薬剤の投与、子宮収縮抑制薬剤の投与、ステロイド剤の投与、陣痛促進剤の投与、分娩誘発、帝王切開術、子宮切開術、子宮内容除去術、子宮摘出術などが挙げられる。
絨毛膜羊膜炎関連細菌の選択方法
　絨毛膜羊膜炎関連細菌の選択方法は、複数の対象からなる対象群に含まれる対象の膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得る第５工程と、対象の分娩後の胎盤病理検査によって絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類を決定する第６工程と、対象の塩基配列のデータ群とＢｌａｎｃ分類との関連付けを機械学習させて、絨毛膜羊膜炎と関連する細菌種をランク付けする第７工程と、ランク付けに基づいて絨毛膜羊膜炎関連細菌を選択する第８工程とを含む。
　対象群の膣に由来する試料に含まれる細菌の叢構造と胎盤病理検査による絨毛膜羊膜炎の診断結果との関係を機械学習させることで、対象群における絨毛膜羊膜炎と関連し、膣内に存在する絨毛膜羊膜炎関連細菌を選択することができる。選択される絨毛膜羊膜炎関連細菌を、任意の対象の膣に由来する試料から検出することで、対象における絨毛膜羊膜炎の発症リスクを評価することができる。これにより絨毛膜羊膜炎に関連する早産の抑制、妊娠期間の延長、新生児感染の抑制等が可能になる。
　選択方法における対象は、既述の予測方法における対象と同様である。また、複数の対象からなる対象群は、無作為に選択される対象からなる群であってよく、膣内の細菌叢が類似する傾向を示す対象からなる群であってよい。膣内の細菌叢が類似する傾向を示す対象からなる群は、人種が共通する対象群、生活習慣が類似する対象群、疾患、合併症等が類似する対象群等のいずれであってよい。
　試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群は、例えば以下のような分析方法で得ることができる。試料からＤＮＡを抽出することと、抽出したＤＮＡを１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅して１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のアンプリコン（ＰＣＲ増幅産物）を得ることと、アンプリコンに含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を無作為に決定することとを含む方法で、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得ることができる。
　試料からのＤＮＡの抽出は、当該技術分野で慣用されているＤＮＡ抽出方法によって実施することができる。例えば、ガラスビーズ等を用いるビーズ処理によって物理的に細胞を破砕して溶菌し、市販のＤＮＡ抽出キット等を用いて試料に含まれるＤＮＡを抽出することができる。
　抽出したＤＮＡを鋳型として、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅することで、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のアンプリコンを得ることができる。１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマーセットの増幅対象領域は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ１からＶ９のすべての可変領域のいずれであってもよく、例えば、Ｖ１領域とＶ２領域を挟む保存領域を増幅対象領域とすることができる。これにより、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子から有効な系統分類情報が容易に得られる。ここで、ユニバーサルプライマーは、いわゆるバーコード配列等を含んでいてよく、バーコード配列は５’末端および３’末端のいずれに配置されていてもよい。
　得られたアンプリコンに含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を無作為に決定することで塩基配列のデータ群が得られる。塩基配列のデータ群は、ある細菌種に特異的な１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と、その塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの存在量（例えば、リード数等）との組み合わせで構成される。ここで「無作為に決定する」とは、塩基配列を決定すべきＤＮＡ等の混合物中から、ある特定の配列のものだけ選択したり、ある配列のものを排除したりすることなく、できるだけランダムに、その混合物中に含まれる任意の塩基配列を決定するという意味である。そのようにして塩基配列を無作為に決定すると、抽出されたＤＮＡ等の混合物中での濃度が高い塩基配列を有するＤＮＡについては、塩基配列決定の対象となる頻度が高くなり、逆に濃度が低い塩基配列を有するＤＮＡについては、塩基配列決定の対象となる頻度が低くなる。一方、膣に由来する試料に含まれる膣内細菌叢は複数種類の細菌を含み、それぞれの菌種に特有の塩基配列を１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子上に有している。したがって、膣に由来する試料から調製したＤＮＡ等の混合物の塩基配列を無作為に決定することによって得られる塩基配列のデータ群中では、任意に選択され得る塩基配列に合致する塩基配列（例えばある特定の菌種に特有の塩基配列に合致するもの）のリード数が、膣内細菌叢を構成する細菌の存在量の多寡を反映することになる。すなわち、その塩基配列のデータ群が、膣内細菌叢の菌叢構造を反映することになる。
　アンプリコンに含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、いわゆる次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を用いて決定される。次世代シーケンサーとは、サンガー法を用いるキャピラリーシーケンサーと対比される用語である。次世代シーケンサーでは、合成シーケンシング法、パイロシーケンシング法、リガーゼ反応シーケンシング法等のシーケンシング原理が用いられる。次世代シーケンサーとして具体的には、ＭｉＳｅｑ（登録商標）システム（ｉｌｌｍｉｎａ社）、ＨｉＳｅｑ（登録商標）システム（ｉｌｌｍｉｎａ社）、ＩｏｎＰＧＭ（登録商標）システム（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）等が挙げられる。次世代シーケンサーによるアンプリコンシーケンシングは、メーカー推奨プロトコールに従って実施することができる。またシーケンシング解析では、クオリティコントロールにより、低クオリティリードなどを削除した上で、ランダムに選択されるリードを塩基配列のデータ群とすることができる。
　第６工程では、それぞれの対象について分娩後に得られる胎盤に病理検査を実施して、絨毛膜羊膜炎の確定診断を行い、Ｂｌａｎｃ分類を決定する。ここでＢｌａｎｃ分類とは絨毛膜羊膜炎の病理学的な炎症の程度を示す指標である。第７工程では、対象の塩基配列のデータ群とＢｌａｎｃ分類との関連を機械学習させることで、絨毛膜羊膜炎に関連する細菌種を特定し、Ｂｌａｎｃ分類との関連性をランク付けする。機械学習には、ランダムフォレスト等の公知の方法から適宜選択される方法が適用できる。第８工程では、ランク付けに基づいて絨毛膜羊膜炎関連細菌を選択する。細菌種の選択は、ランク付けに基づいて絨毛膜羊膜炎との関連性が高い順に行えばよい。選択される細菌種の数は、例えば２０種、１５種、８種又は３種等のいずれであってもよい。
絨毛膜羊膜炎の発症予測用キットまたは診断用キット
　絨毛膜羊膜炎の発症予測用キットまたは診断用キットは、下記プライマーセット群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含む。キットは、下記プライマーセット群から選択される２種または３種のプライマーセットを含んでいてもよい。
プライマーセット群
　配列番号１で示される配列を有するプライマーおよび配列番号２で示される配列を有するプライマーからなるフィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）用プライマーセット；
　配列番号３で示される配列を有するプライマーおよび配列番号４で示される配列を有するプライマーからなるストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）用プライマーセット；
　配列番号５で示される配列を有するプライマーおよび配列番号６で示される配列を有するプライマーからなるアエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）用プライマーセット。
　絨毛膜羊膜炎の発症予測用キットまたは診断用キットを用いて、対象の膣に由来する試料から抽出されるＤＮＡを定量ＰＣＲで分析して、特定細菌を検出することで絨毛膜羊膜炎の発症リスクを予測することができ、また、絨毛膜羊膜炎の存在を診断することができる。
　絨毛膜羊膜炎の発症予測用キットまたは診断用キットは、プライマーセットに加えて、対象の膣に由来する試料に含まれる特定細菌の存在量を定量することと、定量される存在量に基づいて、試料と、対象における絨毛膜羊膜炎を発症する可能性または対象における絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けることとが記載された取扱い説明書をさらに含んでもよい。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（参考例）
　２０１４年５月からの２年間で、福岡大学病院に切迫早産の診断で入院し、解析に十分な量の検体を採取できた未破水妊婦６４例と、切迫早産の診断を受けていない未破水妊婦４例を対象とした。対象からは書面でのインフォームドコンセントに同意を受けた。分娩後に胎盤の病理検査を実施して、絨毛膜羊膜炎群（Ｂｌａｎｃ分類ステージＩＩ以上）３９例と、非絨毛膜羊膜炎群（Ｂｌａｎｃ分類ステージＩ以下）２５例と、コントロール群４例の３群に分けた。入院時に対象から採取した膣スワブを検体として－８０℃で保存した。
　各検体に含まれる細菌を、Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｌｙｓｉｓ　Ｔｕｂｅ　Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ社）によりガラスビーズを用いて溶菌し、ＱＩＡａｍｐ　ＵＣＰ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により各検体に含まれるＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型とし、以下に示す１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ１及びＶ２領域に対するユニバーサルプライマーセットを用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行ってＰＣＲ増幅産物を得た。得られたＰＣＲ増幅産物は４℃で保存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記で得られた６６検体のＰＣＲ増幅産物（アンプリコン）を同時に、次世代シークエンサー（ＮＧＳ：ＭｉＳｅｑ（登録商標）シークエンサー）を用い、メーカー推奨のプロトコールに準じて１６Ｓアンプリコン解析を実施した。ＰＣＲ増幅産物のシークエンスデータをＦａｓｔｑファイル形式として得た。得られたリードからクオリティコントロールにより低クオリティのリードを除き、アダプター配列などを削除し、ランダムに約１，３００リードを選出して塩基配列のデータ群を得た。得られたデータ群を絨毛膜羊膜炎群と非絨毛膜羊膜炎群とに分けて、機械学習（ランダムフォレスト）に供して、絨毛膜羊膜炎との関連性が高い上位２０菌種を同定した。同定した菌種を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　これらの細菌のうち、絨毛膜羊膜炎群で多く検出された細菌は、Lactobacillus gasseriおよびEnterococcus avium以外の１８種であり、菌種名まで特定できた細菌は以下の１５種であった。以下、これらを細菌群Ａともいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（実施例１）
　配列番号１で示される塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号２で示される塩基配列を有するリバースプライマーとからなるフィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）検出用のプライマーセット１と、配列番号３で示される塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号４で示される塩基配列を有するリバースプライマーとからなるストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）検出用のプライマーセット２と、配列番号５で示される塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号６で示される塩基配列を有するリバースプライマーとからなるアエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）検出用プライマーセット３を準備した。また、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を増幅対象とする配列番号７で示される塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号８で示される塩基配列を有するリバースプライマーからなるユニバーサルプライマーセットを準備した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　各検体に含まれる細菌から抽出したＤＮＡを鋳型とし、上記ユニバーサルプライマーセットを用い、以下の条件で定量ＰＣＲを行って全菌種に対応するＰＣＲ増幅産物を得た。また、各細菌に特異的なプライマーセット１から３を用いて、同様に定量ＰＣＲを行ってそれぞれの細菌に対応するＰＣＲ増幅産物を得た。得られたＰＣＲ増幅産物は４℃で保存した。なお、定量ＰＣＲは、ドロップレットデジタルＰＣＲ（バイオラッド社製）を用いて、メーカー推奨のプロトコールに準じて行った。
　各細菌に対応するＰＣＲ増幅産物に含まれるコピー数を、下式に従って全菌種に対応するコピー数で補正して補正値を算出した。補正値が５以上の場合を陽性（細菌が検出された）と判断した。
　　補正値＝各細菌のコピー数／全細菌のコピー数×１００００
　プライマーセット１から３をそれぞれ単独で用いて、それぞれの細菌を検出して発症リスクを評価した場合と、プライマーセット１から３のいずれかで細菌を検出して発症リスクを評価した場合（プライマーセット全体）の診断精度の検討結果を以下に示す。なお、発症リスクのカットオフ値を５として評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表に示されるように、いずれのプライマーセットを用いた場合でも、高い特異度と陽性的中率で絨毛膜羊膜炎の発症リスクを評価することができた。また３種のプライマーセットを用いることで高い特異度と陽性的中率を維持しながら、高い感度で絨毛膜羊膜炎の発症リスクを評価することができた。
（実施例２）
　実施例１において、各プライマーセットの補正値でＲＯＣ曲線を描き、Ｙｏｕｄｅｎ　Ｉｎｄｅｘが最大となる値をカットオフ値として、発症リスクを評価した。結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　いずれのプライマーセットにおいても、特異度と陽性的中率がともに高かった（特異度７６％－９２％，陽性的中率７９％－８７％）。プライマーセット全体では、特異度と陽性的中率は７６％以上を保ったまま、感度が６２％まで高まった。以上から、高い確率（８０％－８７％）で絨毛膜羊膜炎であることを予測でき、絨毛膜羊膜炎例の約６割（６２％）を予測診断できる可能性が示された。
絨毛膜羊膜炎の発症予測陽性群と陰性群の比較
　プライマーセット全体を用いて絨毛膜羊膜炎の発症予測をした場合の陽性群と陰性群の特徴について以下に示す。数値は中央値であり、有意差検定にはMann-Witney U testとFisher's exact testを使用した。なお、３歳児における発達障害については、染色体を含めた異常症例は除いた発症数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　日本国特許出願２０１９－２２１５４３号（出願日：２０１９年１２月６日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (10)

  1. 　対象の膣に由来する試料に含まれる、下記Ａで示される細菌群から選択される少なくとも１種の細菌の存在量を定量することと、
    　前記細菌の存在量に基づいて、前記試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付けることと、
    　を含む、絨毛膜羊膜炎の発症予測方法。
    細菌群Ａ
    　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
    　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
    　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
    　ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）；
    　ウレアプラズマ・パルブム（Ureaplasma parvum）；
    　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
    　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
    　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）；
    　ディアリスタ・ミクラエロフィルス（Dialister micraerophilus）；
    　アトポビウム・バギナエ（Atopobium vaginae）；
    　プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；
    　プレボテラ・アムニイ（Prevotella amnii）；
    　アネロコッカス・ラクトリチクス（Anaerococcus lactolytcus）；
    　ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）；
    　アネロコッカス・テトラディウス（Anaerococcus tetradius）。
  2. 　前記存在量が定量される細菌が、下記Ｂで示される細菌群から選択される少なくとも１種である請求項１に記載の方法。
    細菌群Ｂ
    　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
    　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
    　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）。
  3. 　前記Ｂで示される細菌群から選択される少なくとも１種の細菌が検出される場合に、前記試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付けることを含む請求項２に記載の方法。
  4. 　対象の膣に由来する試料に含まれる、下記Ａで示される細菌群から選択される少なくとも１種の細菌の存在量を定量することと、
    　前記細菌の存在量に基づいて、前記試料と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けることと、
    　を含む、絨毛膜羊膜炎の検出方法。
    細菌群Ａ
    　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
    　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
    　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
    　ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）；
    　ウレアプラズマ・パルブム（Ureaplasma parvum）；
    　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
    　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
    　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）；
    　ディアリスタ・ミクラエロフィルス（Dialister micraerophilus）；
    　アトポビウム・バギナエ（Atopobium vaginae）；
    　プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；
    　プレボテラ・アムニイ（Prevotella amnii）；
    　アネロコッカス・ラクトリチクス（Anaerococcus lactolytcus）；
    　ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）；
    　アネロコッカス・テトラディウス（Anaerococcus tetradius）。
  5. 　前記存在量が定量される細菌が、下記Ｂで示される細菌群から選択される少なくとも１種である請求項４に記載の方法。
    細菌群Ｂ
    　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
    　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
    　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）。
  6. 　前記Ｂで示される細菌群から選択される少なくとも１種の細菌が検出される場合に、前記試料と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けることを含む請求項５に記載の方法。
  7. 　前記細菌の存在量は、定量ＰＣＲにより評価される請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記細菌の存在量は、下記プライマーセット群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを用いる定量ＰＣＲにより評価される請求項７に記載の方法。
    プライマーセット群
    　配列番号１で示される配列を有するプライマーおよび配列番号２で示される配列を有するプライマーからなるフィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）用プライマーセット；
    　配列番号３で示される配列を有するプライマーおよび配列番号４で示される配列を有するプライマーからなるストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）用プライマーセット；
    　配列番号５で示される配列を有するプライマーおよび配列番号６で示される配列を有するプライマーからなるアエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）用プライマーセット。
  9. 　下記プライマーセット群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含む絨毛膜羊膜炎の発症予測用キット。
    プライマーセット群
    　配列番号１で示される配列を有するプライマーおよび配列番号２で示される配列を有するプライマーからなるフィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）用プライマーセット；
    　配列番号３で示される配列を有するプライマーおよび配列番号４で示される配列を有するプライマーからなるストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）用プライマーセット；
    　配列番号５で示される配列を有するプライマーおよび配列番号６で示される配列を有するプライマーからなるアエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）用プライマーセット。
  10. 　下記プライマーセット群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含む絨毛膜羊膜炎の診断用キット。
    プライマーセット群
    　配列番号１で示される配列を有するプライマーおよび配列番号２で示される配列を有するプライマーからなるフィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）用プライマーセット；
    　配列番号３で示される配列を有するプライマーおよび配列番号４で示される配列を有するプライマーからなるストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）用プライマーセット；
    　配列番号５で示される配列を有するプライマーおよび配列番号６で示される配列を有するプライマーからなるアエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）用プライマーセット。
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