WO2021112236A1 - 絨毛膜羊膜炎の発症予測方法 - Google Patents

絨毛膜羊膜炎の発症予測方法 Download PDF

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WO2021112236A1
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chorioamnionitis
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bacterial
prevotella
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新吾 宮本
大知 漆山
房典 四元
健一郎 秦
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学校法人福岡大学
国立研究開発法人国立成育医療研究センター
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Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting the onset of chorioamnionitis.
  • Chorioamnionitis is an inflammatory disease caused by bacterial infection of the egg membrane, which is a fetal appendage. Chorioamnionitis is a condition that causes premature birth and is said to be closely related to the prognosis of postnatal infants, for example, sequelae such as central nervous system disorders and chronic respiratory disorders.
  • the diagnosis of chorioamnionitis is confirmed by placental pathological examination after delivery, but during the course of pregnancy, the diagnosis is made using clinical diagnosis and preterm birth markers such as granulocyte elastase.
  • these methods have low sensitivity to detection of chorioamnionitis, and early detection is difficult.
  • an object of the present invention is to provide a method for predicting the onset of chorioamnionitis, which can predict the onset of chorioamnionitis with high sensitivity.
  • the first aspect is to obtain a data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in a sample derived from the target vagina, and to be selected from the bacterial group represented by G1 below based on the obtained data group. It is a method for predicting the onset of chorioamnionitis, which comprises detecting the presence of bacteria and associating a sample with the possibility of developing chorioamnionitis based on the number of bacterial species detected.
  • the second aspect is to obtain a data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in the sample derived from the target vagina, and to be selected from the bacterial group represented by G1 based on the obtained data group.
  • a method for detecting chorioamnionitis which comprises detecting the presence of a bacterium and associating a sample with the presence of chorioamnionitis based on the number of bacterial species detected.
  • the third aspect is to select chorioamnionitis-related bacteria in the target group to prepare the chorioamnionitis-related bacteria group, and to prepare the base sequence of the 16S ribosome RNA gene contained in the sample derived from the target vagina.
  • Obtaining a data group detecting the presence of bacteria selected from the chorioamnionitis-related bacterial group based on the obtained data group, and detecting the sample and chorioamnionitis based on the number of detected bacterial species
  • the present invention it is possible to provide a method for predicting the onset of chorioamnionitis, which can predict the onset of chorioamnionitis with high sensitivity.
  • the term "process” is included in this term not only as an independent process but also as long as the intended purpose of the process is achieved even if it cannot be clearly distinguished from other processes. ..
  • embodiments of the present invention will be described in detail.
  • the embodiments shown below exemplify a method for predicting the onset of chorioamnionitis for embodying the technical idea of the present invention, and the present invention describes the onset of chorioamnionitis shown below. It is not limited to the prediction method.
  • the method for predicting the onset of chorioamnionitis is the first step of obtaining a data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in a sample derived from the target vagina, and the obtained data group. Based on the second step of detecting the presence of bacteria selected from the bacterial group indicated by G1 below, and the second step of associating the sample with the possibility of developing chorioamnionitis based on the number of detected bacterial species. Includes 3 steps.
  • the bacterial flora contained in the sample derived from the target vagina is analyzed, and the possibility of developing chorioamnionitis is predicted based on the presence or absence of specific bacteria. can do.
  • the bacterial species to be detected is selected by associating a sample derived from the vagina with a definitive diagnosis by postpartum placental pathological examination, so that the possibility of developing chorioamnionitis is predicted with high sensitivity. be able to.
  • a data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in the sample derived from the target vagina is obtained.
  • the target in the method for predicting the onset of chorioamnionitis may be a pregnant human woman, for example, a pregnant woman in the perinatal period, or a pregnant woman in the perinatal period in which imminent preterm birth is a concern.
  • the sample derived from the vagina may be, for example, a vaginal swab.
  • Vaginal swabs can be harvested using commercially available kits, such as the Optiswab Transport System (Puritan), the Catch-All Sample Collection Swab (Epicenter), and other commonly used methods.
  • the collected sample can be stored, for example, at ⁇ 80 ° C.
  • the data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in the sample can be obtained by, for example, the following analysis method. Extracting DNA from a sample and amplifying the extracted DNA by PCR using a universal primer set for 16S ribosomal RNA gene to obtain an amplicon (PCR amplification product) of 16S ribosomal RNA gene, A data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene can be obtained by a method including randomly determining the base sequence of the included 16S ribosomal RNA gene.
  • Extraction of DNA from a sample can be carried out by a DNA extraction method commonly used in the art. For example, cells can be physically crushed and lysed by bead treatment using glass beads or the like, and DNA contained in a sample can be extracted using a commercially available DNA extraction kit or the like.
  • the amplification target region of the universal primer set for the 16S ribosomal RNA gene may be any of all variable regions V1 to V9 of the 16S ribosomal RNA gene.
  • the storage region sandwiching the V1 region and the V2 region is the amplification target region. Can be. This makes it easy to obtain effective phylogenetic information from the 16S ribosomal RNA gene.
  • the universal primer may include a so-called bar code sequence or the like, and the bar code sequence may be arranged at either the 5'end or the 3'end.
  • the nucleotide sequence data group can be obtained by randomly determining the nucleotide sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in the obtained amplicon.
  • the nucleotide sequence data group is composed of a combination of the nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene specific to a certain bacterial species and the abundance of oligonucleotides having the nucleotide sequence (for example, the number of reads).
  • randomly determined means as random as possible without selecting only a specific sequence or excluding a certain sequence from a mixture of DNA or the like whose base sequence should be determined. In addition, it means to determine an arbitrary base sequence contained in the mixture.
  • the base sequence When the base sequence is randomly determined in this way, DNA having a high concentration in the mixture such as the extracted DNA becomes more frequently subject to base sequence determination, and conversely, the concentration becomes higher. For DNA having a low base sequence, the frequency of base sequence determination is low.
  • the vaginal flora contained in the sample derived from the vagina contains a plurality of types of bacteria and has a base sequence peculiar to each type on the 16S ribosomal RNA gene. Therefore, in the base sequence data group obtained by randomly determining the base sequence of a mixture such as DNA prepared from a sample derived from the vagina, there is a base sequence (for example, there is) that matches the base sequence that can be arbitrarily selected.
  • the number of reads (which match the nucleotide sequence peculiar to a specific bacterial species) reflects the amount of bacteria that make up the vaginal flora. That is, the data group of the base sequence reflects the bacterial flora structure of the vaginal flora.
  • next-generation sequencer is a term that is contrasted with capillary sequencers that use the Sanger method.
  • Next-generation sequencers use sequencing principles such as synthetic sequencing, pyrosequencing, and ligase reaction sequencing.
  • Specific examples of the next-generation sequencer include a MiSeq (registered trademark) system (illmina), a HiSeq (registered trademark) system (illmina), and an IonPGM (registered trademark) system (Life Technology).
  • Amplicon sequencing by the next-generation sequencer can be performed according to the protocol recommended by the manufacturer. Further, in the sequencing analysis, low quality reads and the like can be deleted by quality control, and then randomly selected reads can be used as a base sequence data group.
  • the first step instead of comprehensive analysis using a next-generation sequencer, quantitative PCR is performed using a primer set specific to each bacterial species constituting the above bacterial group to obtain a sample derived from the vagina.
  • the primer set specific to each bacterial species is based on, for example, the standard sequence of the 16S ribosomal RNA gene for each bacterial species obtained from RDP (Ribosomal Database Project, http://rdp.cme.msu.edu). Can be created.
  • Quantitative PCR may be any method as long as it can quantitatively obtain a PCR amplification product, and known methods such as real-time PCR and digital PCR can be used.
  • the base sequence data group is a combination of the base sequence of the amplification target region of a specific primer set and the abundance (for example, the number of copies) of the oligonucleotide having the base sequence, and is used in the next-generation sequencer. It is considered that the data group of the obtained base sequence is substantially the same.
  • Second step the presence of a specific bacterium selected from the bacterium group is detected based on the obtained base sequence data group.
  • the presence of a specific bacterium in a sample can be determined based on the abundance of an oligonucleotide having the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene specific to that bacterial species.
  • the correction value obtained by correcting the number of reads of the oligonucleotide having a specific base sequence or the number of reads of the oligonucleotide having a specific base sequence with the number of reads of all bacterial species.
  • a bacterial species corresponding to a specific base sequence exists.
  • the base sequence data group is obtained by quantitative PCR, if the correction value obtained by correcting the copy number of the oligonucleotide having a specific base sequence by the copy number of all bacterial species is equal to or more than the predetermined cutoff value. It can be determined that a bacterial species corresponding to a specific base sequence exists.
  • the bacterial group may be composed of, for example, a bacterial species selected by a method for selecting chorioamnionitis-related bacteria, which will be described later. By detecting a specific bacterium selected from the above bacterial group, the onset of chorioamnionitis can be predicted with high sensitivity.
  • the bacterium group composed of the specific bacterium may be any of the following G2, G3 or G4, or may be another bacterium group selected by the method for selecting chorioamnionitis-related bacteria described later. Higher Youden Indexes and odds ratios can be achieved by using the bacterial population represented by G2. In addition, higher specificity and odds ratio can be achieved by using the bacterial group represented by G3.
  • the bacterial group represented by G4 and the bacterial group represented by G1 or G2 may be used in combination.
  • Another bacterial group selected by the selection method of chorioamnionitis-related bacteria described later it is possible to more appropriately respond to a target group having different races, lifestyles, diseases, complications, etc. ..
  • the sample is associated with the possibility that the subject from which the sample is derived develops chorioamnionitis, based on the number of specific bacterial species detected in the sample.
  • the number of bacterial species used for association is, for example, two or more, and may be two or three. For example, if two or more specific bacteria are detected in a sample, it is predicted that the risk of developing chorioamnionitis is high in the subject from which the sample was collected.
  • the method for predicting the onset of chorioamnionitis can adjust the sensitivity, accuracy, etc. by combining the bacterial group in which specific bacteria are selected and the number of specific bacterial species detected in the sample.
  • the onset of chorioamnionitis can be predicted with high sensitivity by associating the case where two or more specific bacteria selected from the bacterial group represented by G1 are detected with the possibility of onset.
  • the onset of chorioamnionitis may be predicted by using a bacterial group other than the bacterial group indicated by G1 as described below.
  • a high YoudenIndex and an excellent odds ratio can be used for chorioamnionitis.
  • the onset can be predicted.
  • the case where two or more specific bacteria selected from the bacterial group represented by G3 are detected may be associated with the possibility of developing chorioamnionitis.
  • the case where two or more specific bacteria selected from the bacterial group represented by G4 are detected may be associated with the possibility of developing chorioamnionitis.
  • the method for detecting chorioamnionitis is based on the first step of obtaining a data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in a sample derived from the target vagina and the obtained data group. Includes a second step of detecting the presence of bacteria selected from the bacterial group represented by G1 above, and a fourth step of associating the sample with the presence of chorioamnionitis based on the number of detected bacterial species. ..
  • the presence of chorioamnionitis in the subject can be detected based on the number of specific bacterial species contained in the sample derived from the vagina.
  • the presence of chorioamnionitis in the subject can be detected without waiting for a definitive diagnosis by placental pathological examination after delivery, and treatment intervention based on the diagnosis of developing chorioamnionitis can be performed.
  • the method for detecting chorioamnionitis may be a method for diagnosing chorioamnionitis in a subject.
  • the first step and the second step in the method for detecting chorioamnionitis are the same as those in the method for predicting the onset of chorioamnionitis.
  • the sample is associated with the presence of chorioamnionitis in the subject from which the sample is derived, based on the number of specific bacterial species detected in the sample.
  • the number of bacterial species used for association is, for example, two or more, and may be two or three. For example, when two or more specific bacteria are detected in a sample, the presence of chorioamnionitis in the subject from which the sample was collected can be detected with high sensitivity.
  • the sensitivity, accuracy, etc. can be adjusted by combining the bacterial group in which the specific bacterium is selected and the number of the specific bacterium species detected in the sample.
  • the presence of chorioamnionitis can be detected with high sensitivity by associating the case where two or more specific bacteria selected from the bacterial group represented by G1 are detected with the presence of chorioamnionitis. ..
  • the presence of chorioamnionitis in the subject may be detected by using a bacterial group other than the bacterial group indicated by G1 as described below.
  • the presence of chorioamnionitis with high YoudenIndex and excellent odds ratio can be determined. Can be detected.
  • the case where two or more specific bacteria selected from the bacterial group represented by G3 are detected may be associated with the presence of chorioamnionitis.
  • the case where two or more specific bacteria selected from the bacterial group represented by G4 are detected may be associated with the presence of chorioamnionitis.
  • the chorion when at least one specific bacterium selected from the bacterial group represented by G4 is detected, and at least one specific bacterium selected from the bacterial group represented by G1 or G2 is detected, and the chorion. It may be associated with the presence of chorioamnionitis.
  • Treatment method for chorioamnionitis is based on the first step of obtaining a data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in a sample derived from the target vagina and the obtained data group. , The second step of detecting the presence of bacteria selected from the bacterial group indicated by G1 below, and the third step of associating the sample with the possibility of developing chorioamnionitis based on the number of detected bacterial species. And a fifth step of treating a subject at high risk of developing chorioamnionitis.
  • preterm birth can be suppressed, pregnancy can be extended, maternal infection can be suppressed, neonatal infection can be suppressed, and fetal inflammatory reaction syndrome / neonatal meningitis / It has the effects of suppressing neonatal diseases such as neonatal chronic lung disease, periventricular white softness, cerebral palsy, and developmental delay, suppressing the occurrence of persons with disabilities, suppressing medical and social security costs, and promoting the social advancement of the child-rearing generation. be able to.
  • neonatal diseases such as neonatal chronic lung disease, periventricular white softness, cerebral palsy, and developmental delay
  • the treatment according to the subject may be any treatment performed for chorioamnionitis, for example, treatment, improvement, suppression of progression (prevention of deterioration), prevention, chorioamnionitis of chorioamnionitis.
  • Relief of symptoms caused by inflammation can be mentioned.
  • administration of antibacterial agent, administration of uterine contraction inhibitor, administration of steroid agent, administration of labor-promoting agent, induction of delivery, cesarean section, hysterotomy, dilation and curettage, hysterectomy, etc. Can be mentioned.
  • the method for selecting chorioamnionitis-related bacteria is a data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in a sample derived from the vagina of a target included in a target group consisting of a plurality of subjects.
  • Chorioamnionitis-related bacteria present in can be selected.
  • Chorioamnionitis-related bacteria By detecting selected chorioamnionitis-related bacteria from a sample derived from the vagina of any subject, the risk of developing chorioamnionitis in the subject can be evaluated. This makes it possible to suppress preterm birth associated with chorioamnionitis, prolong the gestation period, and suppress neonatal infection.
  • the target in the selection method is the same as the target in the prediction method described above.
  • the target group consisting of a plurality of subjects may be a group consisting of randomly selected subjects, and may be a group consisting of subjects having a tendency to have similar bacterial flora in the vagina.
  • the group consisting of subjects showing a tendency to have similar bacterial flora in the vagina may be a target group having a common race, a target group having a similar lifestyle, a target group having similar diseases, complications, etc. Good.
  • the method for obtaining the data group of the base sequence of the 16S ribosomal RNA gene contained in the sample is the same as that in the first step described above.
  • the 7th step pathological examination is performed on the placenta obtained after delivery for each subject, a definitive diagnosis of chorioamnionitis is made, and the Blanc classification is determined.
  • the Blanc classification is an index indicating the degree of pathological inflammation of chorioamnionitis.
  • the bacterial species related to chorioamnionitis are identified and the association with the Blanc classification is ranked by machine learning the relationship between the data group of the target base sequence and the Blanc classification. A method appropriately selected from known methods such as random forest can be applied to machine learning.
  • chorioamnionitis-related bacteria are selected based on the ranking. Bacterial species may be selected in descending order of association with chorioamnionitis. The number of bacterial species selected may be, for example, 30, 20, 15, 15 or 3 or the like.
  • PCR amplification products 16S amplicon analysis was performed on the PCR amplification products (amplicon) of 66 samples obtained above using a next-generation sequencer (NGS: MiSeq® sequencer) according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • NGS next-generation sequencer
  • Sequence data of PCR amplification products were obtained in Fastq file format. Low quality reads were removed from the obtained reads by quality control, adapter sequences and the like were deleted, and about 1,300 reads were randomly selected to obtain a base sequence data group.
  • the obtained data group was divided into a chorioamnionitis group and a non-chorioamnionitis group, and subjected to machine learning (random forest) to identify the top 20 bacterial species highly related to chorioamnionitis. ..
  • the identified bacterial species are shown below.
  • Example 3 The risk of developing chorioamnionitis was evaluated in the same manner except that the following bacterial group G3 was used instead of the above bacterial group G2.
  • the sensitivity was 53%
  • the specificity was 85%
  • the Youden Index was 37%
  • the sensitivity was 35%
  • the specificity was 100%
  • the Youden Index was 35%.

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Abstract

絨毛膜羊膜炎の発症を高感度に予測することができる絨毛膜羊膜炎の発症予測方法が提供される。絨毛膜羊膜炎の発症予測方法は、対象の膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得ることと、得られるデータ群に基づいて、下記細菌群Ｇ１から選択される細菌の存在を検出することと、検出される細菌種数に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付けることと、を含む。 細菌群Ｇ１：Finegoldia magna；Streptococcus anginosus；Aerococcus christensenii；Lactobacillus jensenii；Ureaplasma parvum；Prevotella disiens；Lactobacillus vaginalis）；Prevotella buccalis；Dialister micraerophilus；Atopobium vaginae；Prevotella bivia；Prevotella amnii；Anaerococcus lactolytcus；Streptococcus agalactiae；Anaerococcus.tetradius；Bacteroides fragilis；Gardnerella vaginalis； Mycoplasma hominis；Sneathia sanguinegens

Description

絨毛膜羊膜炎の発症予測方法
　本発明は、絨毛膜羊膜炎の発症予測方法に関する。
　絨毛膜羊膜炎は、胎児付属物である卵膜に細菌が感染して生じる炎症性疾患である。絨毛膜羊膜炎は、早産を引き起こす病態であり、また出生後の児の予後、例えば、中枢神経系障害、慢性呼吸障害等の後遺症と密接に関わっているとされる。絨毛膜羊膜炎の診断は、分娩後の胎盤病理検査で確定されるが、妊娠経過中においては臨床的診断と、顆粒球エラスターゼ等の早産マーカーを用いて診断がおこなわれている。しかし、これらの方法では絨毛膜羊膜炎の検出に対する感度が低く、早期発見が困難である。
　上記に関連して、羊水から特定の微生物を検出することで絨毛膜羊膜炎の存在を検出する方法が提案されている（例えば、特開２０１７－２０９０６３号公報参照）。
　絨毛膜羊膜炎の発症後は短期間で早産に至る症例が多いため、対象における絨毛膜羊膜炎の発症を感度よく予測する方法が求められている。従って本発明は、絨毛膜羊膜炎の発症を高感度に予測することができる絨毛膜羊膜炎の発症予測方法を提供することを目的とする。
　第１の態様は、対象の膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得ることと、得られるデータ群に基づいて、下記Ｇ１で示される細菌群から選択される細菌の存在を検出することと、検出される細菌種数に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付けることと、を含む絨毛膜羊膜炎の発症予測方法である。
細菌群Ｇ１
　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
　ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）；
　ウレアプラズマ・パルブム（Ureaplasma parvum）；
　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）；
　ディアリスタ・ミクラエロフィルス（Dialister micraerophilus）；
　アトポビウム・バギナエ（Atopobium vaginae）；
　プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；
　プレボテラ・アムニイ（Prevotella amnii）；
　アネロコッカス・ラクトリチクス（Anaerococcus lactolytcus）；
　ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）；
　アネロコッカス・テトラディウス（Anaerococcus tetradius）；
　バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）；
　ガルドネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）；
　マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）；
　スネシア・サンギネジェンス（Sneathia sanguinegens）。
　第２の態様は、対象の膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得ることと、得られるデータ群に基づいて、上記Ｇ１で示される細菌群から選択される細菌の存在を検出することと、検出される細菌種数に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けることと、を含む絨毛膜羊膜炎の検出方法である。
　第３の態様は、対象群における絨毛膜羊膜炎関連細菌を選択して絨毛膜羊膜炎関連細菌群を準備することと、対象の膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得ることと、得られるデータ群に基づいて、絨毛膜羊膜炎関連細菌群から選択される細菌の存在を検出することと、検出される細菌種数に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性、または試料と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けることと、を含む絨毛膜羊膜炎の発症予測方法または検出方法である。
　本発明によれば、絨毛膜羊膜炎の発症を高感度に予測することができる絨毛膜羊膜炎の発症予測方法を提供することができる。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、絨毛膜羊膜炎の発症予測方法を例示するものであって、本発明は、以下に示す絨毛膜羊膜炎の発症予測方法に限定されない。
絨毛膜羊膜炎の発症予測方法
　絨毛膜羊膜炎の発症予測方法は、対象の膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得る第１工程と、得られるデータ群に基づいて、下記Ｇ１で示される細菌群から選択される細菌の存在を検出する第２工程と、検出される細菌種数に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付ける第３工程とを含む。
細菌群Ｇ１
　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
　ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）；
　ウレアプラズマ・パルブム（Ureaplasma parvum）；
　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）；
　ディアリスタ・ミクラエロフィルス（Dialister micraerophilus）；
　アトポビウム・バギナエ（Atopobium vaginae）；
　プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；
　プレボテラ・アムニイ（Prevotella amnii）；
　アネロコッカス・ラクトリチクス（Anaerococcus lactolytcus）；
　ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）；
　アネロコッカス・テトラディウス（Anaerococcus tetradius）；
　バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）；
　ガルドネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）；
　マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）；
　スネシア・サンギネジェンス（Sneathia sanguinegens）。
　羊水を試料として、羊水に含まれる細菌叢を分析する方法では、絨毛膜羊膜炎から羊水感染まで病態が進行していないと細菌を検出することができない。したがって、絨毛膜羊膜炎を発症している対象については絨毛膜羊膜炎の存在を出生前に検出することができるものの、絨毛膜羊膜炎を発症していない対象についての絨毛膜羊膜炎発症の可能性を予測することは困難であると考えられる。また、羊水採取は対象に対する侵襲を伴い、容易に実施することが困難であるし、複数回の羊水採取は更にリスクが高く、その実施は更に困難である。一方、絨毛膜羊膜炎の発症予測方法では、対象の膣に由来する試料に含まれる細菌叢を分析して、特定の細菌の存在の有無に基づいて絨毛膜羊膜炎の発症の可能性を予測することができる。検出対象となる細菌種は後述するように、膣に由来する試料と分娩後の胎盤病理検査による確定診断とを関連付けて選択されるため、高い感度で絨毛膜羊膜炎発症の可能性を予測することができる。
第１工程
　第１工程では、対象の膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得る。絨毛膜羊膜炎の発症予測方法における対象としては、ヒトの妊婦であればよく、例えば、周産期の妊婦であってよく、切迫早産が懸念される周産期の妊婦であってよい。膣に由来する試料は例えば、膣スワブであってよい。膣スワブは市販のキット、例えば、オプティスワブ　トランスポート・システム（Ｐｕｒｉｔａｎ社）、Ｃａｔｃｈ－Ａｌｌ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｓｗａｂ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）等の通常用いられる方法を採用して採取することができる。採取した試料は例えば、－８０℃で保存しておくことができる。
　試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群は、例えば以下のような分析方法で得ることができる。試料からＤＮＡを抽出することと、抽出されたＤＮＡを１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅して１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のアンプリコン（ＰＣＲ増幅産物）を得ることと、アンプリコンに含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を無作為に決定することとを含む方法で、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得ることができる。
　試料からのＤＮＡの抽出は、当該技術分野で慣用されているＤＮＡ抽出方法によって実施することができる。例えば、ガラスビーズ等を用いるビーズ処理によって物理的に細胞を破砕して溶菌し、市販のＤＮＡ抽出キット等を用いて試料に含まれるＤＮＡを抽出することができる。
　抽出したＤＮＡを鋳型として、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅することで、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のアンプリコンを得ることができる。１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマーセットの増幅対象領域は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ１からＶ９のすべての可変領域のいずれであってもよく、例えば、Ｖ１領域とＶ２領域を挟む保存領域を増幅対象領域とすることができる。これにより、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子から有効な系統分類情報が容易に得られる。ここで、ユニバーサルプライマーは、いわゆるバーコード配列等を含んでいてよく、バーコード配列は５’末端および３’末端のいずれに配置されていてもよい。
　得られたアンプリコンに含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を無作為に決定することで塩基配列のデータ群が得られる。塩基配列のデータ群は、ある細菌種に特異的な１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列と、その塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの存在量（例えば、リード数等）との組み合わせで構成される。ここで「無作為に決定する」とは、塩基配列を決定すべきＤＮＡ等の混合物中から、ある特定の配列のものだけ選択したり、ある配列のものを排除したりすることなく、できるだけランダムに、その混合物中に含まれる任意の塩基配列を決定するという意味である。そのようにして塩基配列を無作為に決定すると、抽出されたＤＮＡ等の混合物中での濃度が高い塩基配列を有するＤＮＡについては、塩基配列決定の対象となる頻度が高くなり、逆に濃度が低い塩基配列を有するＤＮＡについては、塩基配列決定の対象となる頻度が低くなる。一方、膣に由来する試料に含まれる膣内細菌叢は複数種類の細菌を含み、それぞれの菌種に特有の塩基配列を１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子上に有している。したがって、膣に由来する試料から調製したＤＮＡ等の混合物の塩基配列を無作為に決定することによって得られる塩基配列のデータ群中では、任意に選択され得る塩基配列に合致する塩基配列（例えばある特定の菌種に特有の塩基配列に合致するもの）のリード数が、膣内細菌叢を構成する細菌の存在量の多寡を反映することになる。すなわち、その塩基配列のデータ群が、膣内細菌叢の菌叢構造を反映することになる。
　アンプリコンに含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、いわゆる次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を用いて決定される。次世代シーケンサーとは、サンガー法を用いるキャピラリーシーケンサーと対比される用語である。次世代シーケンサーでは、合成シーケンシング法、パイロシーケンシング法、リガーゼ反応シーケンシング法等のシーケンシング原理が用いられる。次世代シーケンサーとして具体的には、ＭｉＳｅｑ（登録商標）システム（ｉｌｌｍｉｎａ社）、ＨｉＳｅｑ（登録商標）システム（ｉｌｌｍｉｎａ社）、ＩｏｎＰＧＭ（登録商標）システム（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）等が挙げられる。次世代シーケンサーによるアンプリコンシーケンシングは、メーカー推奨プロトコールに従って実施することができる。またシーケンシング解析では、クオリティコントロールにより、低クオリティリードなどを削除した上で、ランダムに選択されるリードを塩基配列のデータ群とすることができる。
　第１工程では、次世代シーケンサーを用いる網羅的な解析に代えて、上記細菌群を構成するそれぞれの菌種に特異的なプライマーセットを用いて定量ＰＣＲを実施して、膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得てもよい。それぞれの菌種に特異的なプライマーセットは、例えば、ＲＤＰ(Ribosomal Database Project, http://rdp.cme.msu.edu)から得られるそれぞれの細菌種についての１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の標準配列に基づいて作成することができる。具体的には、ＭＥＧＡ(Molecular Evolutionary Genetics Analysis, http://www.megasoftware.net)を用いてマルチプルアライメントし、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中における菌種内で共通かつ菌種間で異なる塩基配列を同定する。次いでその塩基配列に対するプライマーセットを設計することで、それぞれの菌種に特異的なプライマーセットを得ることができる。なお、設計したプライマーセットの特異性は、ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ　ＰＣＲ等で確認してもよい。具体的なプライマーセットの例としては、例えば、以下のプライマーセットが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　定量ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅産物を定量的に得られる手法であればよく、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ等の公知の手法を用いることができる。この場合、塩基配列のデータ群は、特定のプライマーセットの増幅対象領域の塩基配列と、その塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの存在量（例えば、コピー数等）との組み合わせであり、次世代シーケンサーで得られる塩基配列のデータ群と実質的に同一であると考えられる。
第２工程
　第２工程では、得られる塩基配列のデータ群に基づいて、前記細菌群から選択される特定細菌の存在を検出する。これにより試料に含まれる特定細菌の菌種数が特定される。試料における特定細菌の存在は、その菌種に特異的な１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの存在量に基づいて判断することができる。塩基配列のデータ群が次世代シーケンサーで得られる場合、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのリード数、または特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのリード数を全菌種のリード数で補正した補正値が、所定のカットオフ値以上である場合に、特定の塩基配列に対応する菌種が存在すると判断してよい。また、塩基配列のデータ群が定量ＰＣＲで得られる場合、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのコピー数を全菌種のコピー数で補正した補正値が、所定のカットオフ値以上であれば、特定の塩基配列に対応する菌種が存在すると判断することができる。
　前記細菌群は、例えば、後述する絨毛膜羊膜炎関連細菌の選択方法によって選択される細菌種から構成されてよい。上記細菌群から選択される特定細菌を検出することで、絨毛膜羊膜炎の発症を高い感度で予測することができる。特定細菌が構成する細菌群は、下記Ｇ２、Ｇ３またはＧ４のいずれかであってもよいし、後述する絨毛膜羊膜炎関連細菌の選択方法によって選択される別の細菌群であってもよい。Ｇ２で示される細菌群を用いることでより高いＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘとオッズ比を達成することができる。また、Ｇ３で示される細菌群を用いることでより高い特異度とオッズ比を達成することができる。さらにＧ４で示される細菌群と、Ｇ１又はＧ２で示される細菌群とを組み合わせて用いてもよい。後述する絨毛膜羊膜炎関連細菌の選択方法によって選択される別の細菌群を採用することで、人種、生活習慣、疾患、合併症等が異なる対象群に、より適切に対応することができる。
細菌群Ｇ２
　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
　ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）；
　ウレアプラズマ・パルブム（Ureaplasma parvum）；
　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）；
　ディアリスタ・ミクラエロフィルス（Dialister micraerophilus）；
　アトポビウム・バギナエ（Atopobium vaginae）；
　プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；
　プレボテラ・アムニイ（Prevotella amnii）；
　アネロコッカス・ラクトリチクス（Anaerococcus lactolytcus）；
　ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）；
　アネロコッカス・テトラディウス（Anaerococcus tetradius）。
細菌群Ｇ３
　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
　ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）；
　ウレアプラズマ・パルブム（Ureaplasma parvum）；
　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）。
細菌群Ｇ４
　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）；
　ディアリスタ・ミクラエロフィルス（Dialister micraerophilus）；
　アトポビウム・バギナエ（Atopobium vaginae）；
　プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；
　プレボテラ・アムニイ（Prevotella amnii）；
　アネロコッカス・ラクトリチクス（Anaerococcus lactolytcus）；
　アネロコッカス・テトラディウス（Anaerococcus tetradius）。
第３工程
　第３工程では、試料から検出される特定細菌の菌種数に基づいて、試料と、その試料が由来する対象が絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付ける。関連付けに用いられる菌種数は、例えば２種以上であり、２種又は３種であってよい。例えば、試料から特定細菌が２種以上検出されると、試料が採取された対象において絨毛膜羊膜炎の発症リスクが高いと予測される。
　絨毛膜羊膜炎の発症予測方法は、特定細菌が選択される細菌群と、試料から検出される特定細菌の菌種数との組み合わせによって感度、精度等を調整することができる。例えば、上記Ｇ１で示される細菌群から選択される特定細菌が２種以上検出される場合と発症可能性とを関連付けることで高感度に絨毛膜羊膜炎の発症を予測することができる。また、以下のようにＧ１で示される細菌群以外の細菌群を用いて絨毛膜羊膜炎の発症を予測してもよい。例えば、上記Ｇ２で示される細菌群から選択される特定細菌が３種以上検出される場合と絨毛膜羊膜炎の発症可能性とを関連付けることで高いＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘ、優れたオッズ比で絨毛膜羊膜炎の発症を予測することができる。上記Ｇ３で示される細菌群から選択される特定細菌が２種以上検出される場合と絨毛膜羊膜炎の発症可能性とを関連付けてもよい。さらに、上記Ｇ４で示される細菌群から選択される特定細菌が２種以上検出される場合と絨毛膜羊膜炎の発症可能性とを関連付けてもよい。上記Ｇ４で示される細菌群から選択される特定細菌の少なくとも１種が検出され、上記Ｇ１またはＧ２で示される細菌群から選択される特定細菌の少なくとも１種が検出される場合と絨毛膜羊膜炎の発症可能性とを関連付けてもよい。
　絨毛膜羊膜炎の発症リスクが高いと予測される対象には、羊水検査等の追加検査を実施してもよく、必要に応じて経過観察、治療介入等の処置を実施してもよい。
絨毛膜羊膜炎の検出方法
　絨毛膜羊膜炎の検出方法は、対象の膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得る第１工程と、得られるデータ群に基づいて、上記Ｇ１で示される細菌群から選択される細菌の存在を検出する第２工程と、検出される細菌種数に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付ける第４工程とを含む。
　膣に由来する試料に含まれる特定細菌の菌種数に基づいて、対象における絨毛膜羊膜炎の存在を検出することができる。これにより、分娩後の胎盤病理検査による確定診断を待つことなく、対象における絨毛膜羊膜炎の存在を検出することができ、絨毛膜羊膜炎を発症しているとの診断に基づく治療介入等が可能になる。すなわち、絨毛膜羊膜炎の検出方法は、対象における絨毛膜羊膜炎の診断方法であってよい。
　絨毛膜羊膜炎の検出方法における第１工程及び第２工程は、絨毛膜羊膜炎の発症予測方法におけるそれらと同様である。第４工程では、試料から検出される特定細菌の菌種数に基づいて、試料と、その試料が由来する対象における絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付ける。関連付けに用いられる菌種数は、例えば２種以上であり、２種又は３種であってよい。例えば、試料から特定細菌が２種以上検出されると、試料が採取された対象における絨毛膜羊膜炎の存在を高い感度で検出することができる。
　絨毛膜羊膜炎の存在の検出方法は、特定細菌が選択される細菌群と、試料から検出される特定細菌の菌種数との組み合わせによって感度、精度等を調整することができる。例えば、上記Ｇ１で示される細菌群から選択される特定細菌が２種以上検出される場合と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けることで高感度に絨毛膜羊膜炎の存在を検出することができる。また、以下のようにＧ１で示される細菌群以外の細菌群を用いて、対象における絨毛膜羊膜炎の存在を検出してもよい。例えば、上記Ｇ２で示される細菌群から選択される特定細菌が３種以上検出される場合と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けることで高いＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘ、優れたオッズ比で絨毛膜羊膜炎の存在を検出することができる。例えば、上記Ｇ３で示される細菌群から選択される特定細菌が２種以上検出される場合と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けてもよい。例えば、上記Ｇ４で示される細菌群から選択される特定細菌が２種以上検出される場合と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けてもよい。例えば、上記Ｇ４で示される細菌群から選択される特定細菌の少なくとも１種が検出され、上記Ｇ１またはＧ２で示される細菌群から選択される特定細菌の少なくとも１種が検出される場合と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けてもよい。
絨毛膜羊膜炎の処置方法
　絨毛膜羊膜炎の処置方法は、対象の膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得る第１工程と、得られるデータ群に基づいて、下記Ｇ１で示される細菌群から選択される細菌の存在を検出する第２工程と、検出される細菌種数に基づいて、試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付ける第３工程と、絨毛膜羊膜炎の発症リスクが高い対象を処置する第５工程とを含んでよい。
　絨毛膜羊膜炎の発症リスクが高い対象に必要に応じた処置を施すことで、早産の抑制、妊娠期間の延長、母体感染の抑制、新生児感染の抑制、胎児炎症反応症候群・新生児髄膜炎・新生児慢性肺疾患・脳室周囲白質軟化症・脳性麻痺・発達遅滞などの新生児疾患の抑制、障がい者の発生抑制、医療費・社会保障費の抑制、子育て世代の社会進出促進等の効果を得ることができる。ここで対象に応じた処置とは、絨毛膜羊膜炎について施される何らかの処置であればよく、例えば、絨毛膜羊膜炎の治療、改善、進行の抑制（悪化の防止）、予防、絨毛膜羊膜炎に起因する症状の緩和等が挙げられる。具体的には、例えば、抗菌薬剤の投与、子宮収縮抑制薬剤の投与、ステロイド剤の投与、陣痛促進剤の投与、分娩誘発、帝王切開術、子宮切開術、子宮内容除去術、子宮摘出術などが挙げられる。
絨毛膜羊膜炎関連細菌の選択方法
　絨毛膜羊膜炎関連細菌の選択方法は、複数の対象からなる対象群に含まれる対象の膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得る第６工程と、対象の分娩後の胎盤病理検査によって絨毛膜羊膜炎におけるＢｌａｎｃ分類を決定する第７工程と、対象の塩基配列のデータ群とＢｌａｎｃ分類との関連付けを機械学習させて、絨毛膜羊膜炎と関連する細菌種をランク付けする第８工程と、ランク付けに基づいて絨毛膜羊膜炎関連細菌を選択する第９工程とを含む。
　対象群の膣に由来する試料に含まれる細菌の叢構造と胎盤病理検査による絨毛膜羊膜炎の診断結果との関係を機械学習させることで、対象群における絨毛膜羊膜炎と関連し、膣内に存在する絨毛膜羊膜炎関連細菌を選択することができる。選択される絨毛膜羊膜炎関連細菌を、任意の対象の膣に由来する試料から検出することで、対象における絨毛膜羊膜炎の発症リスクを評価することができる。これにより絨毛膜羊膜炎に関連する早産の抑制、妊娠期間の延長、新生児感染の抑制等が可能になる。
　選択方法における対象は、既述の予測方法における対象と同様である。また、複数の対象からなる対象群は、無作為に選択される対象からなる群であってよく、膣内の細菌叢が類似する傾向を示す対象からなる群であってよい。膣内の細菌叢が類似する傾向を示す対象からなる群は、人種が共通する対象群、生活習慣が類似する対象群、疾患、合併症等が類似する対象群等のいずれであってもよい。さらに、試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得る方法については、既述の第１工程と同様である。
　第７工程では、それぞれの対象について分娩後に得られる胎盤に病理検査を実施して、絨毛膜羊膜炎の確定診断を行い、Ｂｌａｎｃ分類を決定する。ここでＢｌａｎｃ分類とは絨毛膜羊膜炎の病理学的な炎症の程度を示す指標である。第８工程では、対象の塩基配列のデータ群とＢｌａｎｃ分類との関連を機械学習させることで、絨毛膜羊膜炎に関連する細菌種を特定し、Ｂｌａｎｃ分類との関連性をランク付けする。機械学習には、ランダムフォレスト等の公知の方法から適宜選択される方法が適用できる。第９工程では、ランク付けに基づいて絨毛膜羊膜炎関連細菌を選択する。細菌種の選択は、絨毛膜羊膜炎との関連性が高い順に行えばよい。選択される細菌種の数は、例えば３０種、２０種、１５種又は３種等のいずれであってもよい。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
　２０１４年５月からの２年間で、福岡大学病院に切迫早産の診断で入院し、解析に十分な量の検体を採取できた未破水妊婦６６例を対象とした。対象からは書面でのインフォームドコンセントに同意を受けた。分娩後に胎盤の病理検査を実施して、絨毛膜羊膜炎群（Ｂｌａｎｃ分類ステージＩＩ以上）４０例と非絨毛膜羊膜炎群（Ｂｌａｎｃ分類ステージＩ以下）２６例の２群に分けた。入院時に対象から採取した膣スワブを検体として－８０℃で保存した。
　各検体に含まれる細菌を、Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｌｙｓｉｓ　Ｔｕｂｅ　Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ社）によりガラスビーズを用いて溶菌し、ＱＩＡａｍｐ　ＵＣＰ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により各検体に含まれるＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型とし、以下に示す１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ１及びＶ２領域に対するユニバーサルプライマーセットを用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行ってＰＣＲ増幅産物を得た。得られたＰＣＲ増幅産物は４℃で保存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記で得られた６６検体のＰＣＲ増幅産物（アンプリコン）について同時に、次世代シークエンサー（ＮＧＳ：ＭｉＳｅｑ（登録商標）シークエンサー）を用い、メーカー推奨のプロトコールに準じて１６Ｓアンプリコン解析を実施した。ＰＣＲ増幅産物のシークエンスデータをＦａｓｔｑファイル形式として得た。得られたリードからクオリティコントロールにより低クオリティのリードを除き、アダプター配列などを削除し、ランダムに約１，３００リードを選出して塩基配列のデータ群を得た。得られたデータ群を絨毛膜羊膜炎群と非絨毛膜羊膜炎群とに分けて、機械学習（ランダムフォレスト）に供して、絨毛膜羊膜炎との関連性が高い上位２０菌種を同定した。同定した菌種を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　これらの細菌のうち、絨毛膜羊膜炎群で多く検出された細菌は、Lactobacillus gasseriおよびEnterococcus avium以外の１８種であり、菌種名まで特定できた細菌は以下の１５種であった。以下、これらを細菌群Ｇ２ともいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
絨毛膜羊膜炎の発症リスク評価
　上記細菌群Ｇ２から選択される細菌のうち、検体から検出された菌種数と絨毛膜羊膜炎の発症リスクとの関係を評価した。細菌群Ｇ２に属する細菌が２種以上検出された場合を陽性（絨毛膜羊膜炎の発症リスクが高い）と判断した場合、感度が６８％、特異度が６９％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが３７％であった。また、細菌群Ｇ２に属する細菌が３種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が６０％、特異度が８８％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが４８％であった。結果を下表にまとめて示す。
（比較例１）
　上記細菌群Ｇ２に代えて、特開２０１７－２０９０６３号公報に記載された羊水検査で検出された細菌のうち膣内で検出された下記細菌群Ｇ０を用いたこと以外は、同様にして絨毛膜羊膜炎の発症リスクを評価した。細菌群Ｇ０に属する細菌が２種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が５３％、特異度が７７％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが２９％であった。また、細菌群Ｇ０に属する細菌が３種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が１８％、特異度が１００％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが１８％であった。結果を下表にまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（実施例２）
　細菌群Ｇ０とＧ２の和集合を細菌群Ｇ１とした。上記細菌群Ｇ２に代えて、細菌群Ｇ１を用いたこと以外は、同様にして絨毛膜羊膜炎の発症リスクを評価した。細菌群Ｇ１に属する細菌が２種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が７８％、特異度が５８％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが３５％であった。また、細菌群Ｇ１に属する細菌が３種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が６３％、特異度が７７％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが３９％であった。結果を下表にまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（実施例３）
　上記細菌群Ｇ２に代えて、下記細菌群Ｇ３を用いたこと以外は、同様にして絨毛膜羊膜炎の発症リスクを評価した。細菌群Ｇ３に属する細菌が２種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が５３％、特異度が８５％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが３７％であった。また、細菌群Ｇ３に属する細菌が３種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が３５％、特異度が１００％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが３５％であった。結果を下表にまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（実施例４）
　上記細菌群Ｇ２に代えて、下記細菌群Ｇ４を用いたこと以外は、同様にして絨毛膜羊膜炎の発症リスクを評価した。細菌群Ｇ４に属する細菌が２種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が５３％、特異度が７７％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが２９％であった。また、細菌群Ｇ４に属する細菌が３種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が３５％、特異度が９６％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが３１％であった。結果を下表にまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（実施例５）
　上記細菌群Ｇ２に代えて、上記細菌群Ｇ４から選択される少なくとも１種と、上記細菌群Ｇ２から選択される少なくとも１種とを検出したこと以外は、同様にして絨毛膜羊膜炎の発症リスクを評価した。細菌群Ｇ４または細菌群Ｇ２に属する細菌が２種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が６５％、特異度が７３％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが３８％であった。また、細菌群Ｇ４または細菌群Ｇ２に属する細菌が３種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が６０％、特異度が８８％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが３７％であった。結果を下表にまとめて示す。
（実施例６）
　上記細菌群Ｇ２に代えて、上記細菌群Ｇ４から選択される少なくとも１種と、上記細菌群Ｇ１から選択される少なくとも１種とを検出したこと以外は、同様にして絨毛膜羊膜炎の発症リスクを評価した。細菌群Ｇ４または細菌群Ｇ１に属する細菌が２種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が６８％、特異度が７３％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが４１％であった。また、細菌群Ｇ４または細菌群Ｇ２に属する細菌が３種以上検出された場合を陽性と判断した場合、感度が６０％、特異度が７７％、ＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘが３７％であった。結果を下表にまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　羊水検査で検出された細菌群Ｇ０を用いるよりも、膣に由来する試料から検出された細菌群Ｇ１からＧ４を用いる方が、高感度に絨毛膜羊膜炎の発症を予測することができた。例えば、細菌群Ｇ１から選択される２種以上の細菌を検出することで７８％という高感度で絨毛膜羊膜炎の発症を予測できた。また、細菌群Ｇ２から選択される３種以上の細菌を検出することで４８％のＹｏｕｄｅｎＩｎｄｅｘを達成することができた。
絨毛膜羊膜炎の発症予測陽性群と陰性群の比較
　細菌群Ｇ１を用いて絨毛膜羊膜炎の発症予測をした場合の陽性群と陰性群の特徴について以下に示す。数値は中央値であり、有意差検定にはMann-Witney U testとFisher's exact testを使用した。なお、3歳児における発達障害については、染色体を含めた異常症例は除いた発症数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　日本国特許出願２０１９－２２１５３９号（出願日：２０１９年１２月６日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (7)

  1. 　対象の膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得ることと、
    　得られるデータ群に基づいて、下記Ｇ１で示される細菌群から選択される細菌の存在を検出することと、
    　検出される細菌種数に基づいて、前記試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付けることと、
    　を含む、絨毛膜羊膜炎の発症予測方法。
    細菌群Ｇ１
    　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
    　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
    　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
    　ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）；
    　ウレアプラズマ・パルブム（Ureaplasma parvum）；
    　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
    　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
    　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）；
    　ディアリスタ・ミクラエロフィルス（Dialister micraerophilus）；
    　アトポビウム・バギナエ（Atopobium vaginae）；
    　プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；
    　プレボテラ・アムニイ（Prevotella amnii）；
    　アネロコッカス・ラクトリチクス（Anaerococcus lactolytcus）；
    　ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）；
    　アネロコッカス・テトラディウス（Anaerococcus tetradius）；
    　バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）；
    　ガルドネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）；
    　マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）；
    　スネシア・サンギネジェンス（Sneathia sanguinegens）。
  2. 　前記検出される細菌種数が２以上の場合に、前記試料と絨毛膜羊膜炎を発症する可能性とを関連付けることを含む請求項１に記載の方法。
  3. 　対象の膣に由来する試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータ群を得ることと、
    　得られるデータ群に基づいて、下記Ｇ１で示される細菌群から選択される細菌の存在を検出することと、
    　検出される細菌種数に基づいて、前記試料と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けることと、
    　を含む、絨毛膜羊膜炎の検出方法。
    細菌群Ｇ１
    　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
    　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
    　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
    　ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）；
    　ウレアプラズマ・パルブム（Ureaplasma parvum）；
    　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
    　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
    　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）；
    　ディアリスタ・ミクラエロフィルス（Dialister micraerophilus）；
    　アトポビウム・バギナエ（Atopobium vaginae）；
    　プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；
    　プレボテラ・アムニイ（Prevotella amnii）；
    　アネロコッカス・ラクトリチクス（Anaerococcus lactolytcus）；
    　ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）；
    　アネロコッカス・テトラディウス（Anaerococcus tetradius）；
    　バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）；
    　ガルドネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）；
    　マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）；
    　スネシア・サンギネジェンス（Sneathia sanguinegens）。
  4. 　前記検出される細菌種数が２以上の場合に、前記試料と絨毛膜羊膜炎の存在とを関連付けることを含む請求項３に記載の方法。
  5. 　前記試料に含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のアンプリコンを得ることと、
    　前記アンプリコンに含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を無作為に決定して前記データ群を得ることを含む請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記検出される細菌種数が２または３である請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記細菌群が、下記Ｇ２で示される細菌群である請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
    細菌群Ｇ２
    　フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）；
    　ストレプトコッカス・アンジノサス（Streptococcus anginosus）；
    　アエロコッカス・クリステンセニイ（Aerococcus christensenii）；
    　ラクトバチルス・ジェンセニイ（Lactobacillus jensenii）；
    　ウレアプラズマ・パルブム（Ureaplasma parvum）；
    　プレボテラ・ディシエンス（Prevotella disiens）；
    　ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）；
    　プレボテラ・ブッカリス（Prevotella buccalis）；
    　ディアリスタ・ミクラエロフィルス（Dialister micraerophilus）；
    　アトポビウム・バギナエ（Atopobium vaginae）；
    　プレボテラ・ビビア（Prevotella bivia）；
    　プレボテラ・アムニイ（Prevotella amnii）；
    　アネロコッカス・ラクトリチクス（Anaerococcus lactolytcus）；
    　ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）；
    　アネロコッカス・テトラディウス（Anaerococcus tetradius）。
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