JP2019068853A - 有害な妊娠転帰を予測するための細菌分類群の検出 - Google Patents

有害な妊娠転帰を予測するための細菌分類群の検出 Download PDF

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Siu-Chung Chim Stephen
スティーブン シュウ−チャン チム、
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Chee-Yin Cheung
チー−イン チュン、
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Wan-Chee Cheung
ワン−チー チュン、
メン メン、
Meng Meng
メン メン、
タク−イェン リャン、
Tak-Yeung Leung
タク−イェン リャン、
クアン−ヤン リー、
Keun-Young Lee
クアン−ヤン リー、
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Abstract

【課題】異常な子宮頸管内の細菌分類群を体系的にプロファイリングするための手段の提供。【解決手段】１つ以上の選択された細菌分類群（例えば、属または種）の細菌のレベル上昇を検出することによって、妊娠対象についての有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰のリスクを検出する方法。そのような方法に有用なキット。加えて、進行した子宮頸管拡張および／または早期子宮頸管短縮を有するリスクを、差次的に大量に存在する細菌分類群に基づいて決定する方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出現の相互参照
本出願は、全ての目的のためにその開示全体が参照によりここに援用される２０１４年６月３０日に提出された米国特許仮出願番号第６２／０１８９２０号の優先権を主張する。
合併症を伴わない正常な妊娠では、胎児が充分に発生し、生まれる準備が整う時期辺りで子宮頸管が最終的に短くなり拡張する妊娠第三期後期までは、子宮頸管は長く、閉じている。対照的に、子宮頸管の短縮または高度な子宮頸管拡張を併発した妊娠では、上記の正常なスケジュールのかなり前に子宮頸管が短縮または拡張する。その結果、これらの症状を有するいくらかの女性は、妊娠３７週よりも早い胎児発生が不完全な時期に出産することになる。したがって、このことが新生児の死亡と罹病を招く場合があり得る。妊娠期間を長くするため、子宮頸管を支持するためのセルクラージュまたは子宮頸管ペッサリーが臨床医によって留置されることがある。主に共通見解と専門家の意見に基づいて、羊水内感染症が除外される場合はセルクラージュ留置が有益であろうと推奨されている。ペッサリー留置についても同様のガイドラインが示唆されている。感染症を効果的に除外するため、非常に高感度な検出方法が必要である。
現在、試料中の細菌の検出は培養、顕微鏡観察、および細菌種特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイに依存しており、それらは低程度から中程度の感度を提供するにすぎない。我々が「正常な」子宮頸管内に存在する「正常」細菌叢の一部でしかない細菌分類群を標的とするのではなく、異常な（すなわち、短い／拡張した）子宮頸管内において差次的に多く存在する細菌分類群を特異的に標的とすることができれば、その感度が改善される可能性がある。しかしながら、異常な子宮頸管内の細菌分類群は体系的にプロファイリングされておらず、且つ、適切にマッチングされた女性の「正常な」子宮頸管内の細菌分類群と比較されていないので、今日までそれらの分類群について存在するデータは限られている。早産の有病率と影響を考えると、早産または新生児合併症の可能性を低下または排除するために、時宜を得て予防手段を取ることができるように、女性における有害な妊娠転帰のリスク増加をより正確に検出する新規方法のニーズがある。本発明はこのニーズ及び他の関連するニーズを充足する。
本開示は、女性の子宮頸管内の細菌分類群の特定のグループ（例えば、細菌の種または属）に属する細菌のレベルが、３４週または３７週の妊娠期間未満での早産などの有害な妊娠転帰、または１分もしくは５分の時点での７未満のアプガースコア、絨毛羊膜炎、呼吸窮迫症候群、気管支肺異形成症、脳室内出血、新生児敗血症、および出生後７日以内の新生児死亡などの有害な新生児状態の可能性と相関して上昇するという発見に部分的に基づく。したがって、第１の態様では本発明は対象、例えば妊婦または非妊婦の有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰のリスクを決定するための方法を提供する。その方法は、（ａ）メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、ウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８中の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定されている細菌分類群、ならびに表４Ｅ、表４Ｇ、および表９中のＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定される細菌分類群からなる群より選択される少なくとも１種類の細菌分類群の細菌のレベルを、対象から採取された生体試料において検出する工程、および（ｂ）少なくとも１種類の細菌属に由来する細菌のレベルが標準対照の細菌レベルよりも高い場合に、対象が有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰の増加したリスクを有すると決定する工程、を含む。幾つかの実施形態では、その方法は、対象から採取された生体試料においてスネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカムまたはウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、ペプトニフィラス・ラクリマリス、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）のレベルを検出すること、および前記細菌の総レベルが標準対照レベルと比較して上昇している場合に、対象が有害な妊娠転帰の増加したリスクを有すると決定すること、を含む。
幾つかの実施形態では、有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰には、３４週未満での早産、３７週未満での早産、前記生体試料の採取後約１〜１９６日以内の分娩、臨床介入の実施後約１〜１９６日以内の分娩、１分の時点での７未満のアプガースコア、５分の時点での７未満のアプガースコア、絨毛羊膜炎、呼吸窮迫症候群、気管支肺異形成症、脳室内出血、出生後７日以内の新生児死亡、または新生児敗血症が含まれる。幾つかの事例では、方法は、少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌のレベルが標準対照レベルよりも高い場合に、対象が高度な子宮頸管拡張または早期子宮頸管短縮のリスクを有すると決定すること、を含む。
他の実施形態では、方法は、対象から採取された生体試料においてパルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカムまたはウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、ペプトニフィラス・ラクリマリス、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）のレベルを検出すること、および前記細菌の総レベルが標準対照レベルと比較して上昇している場合に、対象が子宮頸管への介入（すなわちセルクラージュ／ペッサリー介入）から７日以内の分娩などの有害な妊娠転帰の増加したリスクを有すると決定すること、を含む。幾つかの事例では、前記方法は、対象が羊膜腔、子宮腔、子宮頸管または膣に感染症を有するリスクを有すると決定することも含む。
一分類のメガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１３３０７．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１３３０７．１の配列に対して少なくとも９３％または９４％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。幾つかの実施形態ではメガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）分類群の細菌は、配列番号５に示される１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０４２５８３．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０４２５８３．１のヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を持つものとして検出される。
ウレアプラズマ・ウレアリティカム細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１０２８３６．１の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、ウレアプラズマ・ウレアリティカム分類群の細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１０２８３６．１のヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有するものとして検出される。ウレアプラズマ・パルバム細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０７４１７６．１の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、ウレアプラズマ・パルバム分類群の細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０７４１７６．１のヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有するものとして検出される。幾つかの実施形態では、ウレアプラズマ・パルバム分類群の細菌は、配列番号７に示される１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
アトポビウム・バギナエ細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１７７５７．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、アトポビウム・バギナエ分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１７７５７．１のヌクレオチド配列に対して９７％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。幾つかの実施形態では、アトポビウム・バギナエ分類群の細菌は、配列番号８に示される１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１７３７４．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）分類群の細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１７３７４．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有するものとして検出される。幾つかの実施形態では、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）分類群の細菌は、配列番号９に示される１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
ラクトバチルス・カゼイ細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０７５０３２．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、ラクトバチルス・カゼイ分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０７５０３２．１のヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
ベイロネラ・モンペリエレンシス細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２８８３９．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、ベイロネラ・モンペリエレンシス分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２８８３９．１のヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
アナエロコッカス・セネガレンシス細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１８２２０．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、アナエロコッカス・セネガレンシス分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１８２２０．１のヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
ブレイディア・エクストルクタ細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２８７７３．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、ブレイディア・エクストルクタ分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０２８７７３．１のヌクレオチド配列に対して９７％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
マイコプラズマ・ホミニス細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１３６７９．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、マイコプラズマ・ホミニス分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１３６７９．１のヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を持つものとして検出される。
プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１４３３７．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１４３３７．１のヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
本開示に適切な一分類の未培養細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、この分類群の細菌はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して９２％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ。
コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１６５６９．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１６５６９．１のヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
別の分類のメガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１３３０７．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１３３０７．１の配列に対して少なくとも９３％または９４％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。幾つかの実施形態では、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）分類群の細菌は配列番号２９に示される１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１３１７９．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１３１７９．１のヌクレオチド配列に対して９７％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１６３３１．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１６３３１．１のヌクレオチド配列に対して９９％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
本開示に関連する別の分類の未培養細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、この分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して９０％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０４４０２２．２の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０４４０２２．２のヌクレオチド配列に対して９３％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１６８６９．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１６８６９．１のヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１６３４６．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１６３４６．１のヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
ファスティディオシピラ・サングイニス細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０４２１８６．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、ファスティディオシピラ・サングイニス分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿０４２１８６．１のヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
スネアチア・サングイネゲンスは、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ３４４０９３．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、スネアチア・サングイネゲンス分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ３４４０９３．１の配列に対して少なくとも９３％または９４％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）は、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１４３３８．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿１１４３３８．１の配列に対して少なくとも９３％の配列同一性、例えば、９３％、９４％、９５％、９６％、９７５、またはそれより高い配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。幾つかの実施形態では、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）分類群の細菌は配列番号４３に示される１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。
ペプトニフィラス・ラクリマリスは、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列が、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ９７１８１２．１およびＮＲ＿０４１９３８．１の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するものとして同定することができる。幾つかの実施形態では、ペプトニフィラス・ラクリマリス分類群の細菌は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ９７１８１２．１およびＮＲ＿０４１９３８．１の配列に対して１００％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。幾つかの実施形態では、ペプトニフィラス・ラクリマリス分類群の細菌は配列番号４４に示される１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つものとして検出される。幾つかの実施形態では、前記方法は、少なくとも２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、１３種類、１４種類、１５種類、１６種類、１７種類、１８種類、１９種類、または２０種類の異なる細菌分類群を検出することを含む。
幾つかの実施形態では、対象は妊娠約１３週から約３７週の時点の妊婦である。他の実施形態では、妊婦は妊娠約１３週から約２５週の間である。幾つかの事例では、妊婦は早期に開いた子宮頸管を有する。その女性は羊膜腔、子宮腔、子宮頸管または膣に感染症を有するリスクを有するかもしれない。他の実施形態では、対象は非妊婦である。幾つかの実施形態では、非妊婦は将来の妊娠を計画している。幾つかの例では、対象は早産、死産、または流産の病歴を有する。幾つかの例では、対象は妊娠前または妊娠後にセルクラージュ介入またはプロゲステロン補充などの臨床介入を受けることを計画している。
幾つかの実施形態では、前記方法は工程（ａ）を実施する前に対象から採取された生体試料から核酸を抽出することも含む。幾つかの実施形態では、試料は子宮頸管スワブ（外子宮口のスワブ試料を含む）、膣スワブ（円蓋のスワブ試料を含む）、尿試料、羊水試料、母体血試料（母体全血試料）、母体血清試料、母体血漿試料、または子宮頸管粘液試料である。幾つかの実施形態では、試料は胎盤スワブ、臍帯スワブ、または生殖系から直接的もしくは間接的に採取された任意の試料である。これには擦過、切断、水洗、洗浄、ガス流の適用、液体の適用、真空の適用、吸引力の適用、ある形態のエネルギー（例えば、静電界、ＬＡＳＥＲ）の適用、または化学物質（例えば、化学遊走を誘発するための化学誘引物質）の濃度勾配の適用による女性生殖管表面からのあらゆる試料採取が含まれる。幾つかの実施形態では、頬粘膜スワブ、咽頭スワブ、肛囲スワブ、直腸スワブまたは大便試料などの試料が、妊娠した対象の胃腸管系から直接的または間接的に採取される。
幾つかの実施形態では、検出工程にポリヌクレオチド増幅アッセイが含まれる。幾つかの例では、増幅アッセイはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイである。所望により、そのＰＣＲアッセイは定量的ＰＣＲアッセイであってもよい。幾つかの例では、検出工程には配列特異的プローブ／プライマーハイブリダイゼーションが含まれ、それはポリヌクレオチド増幅をしない場合にも存在し得る。他の実施形態では、前記検出工程には、限定されないが、大量並列シーケンシングなどのポリヌクレオチド配列決定が含まれる。
例えば、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカムまたはウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８中の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列によって規定される細菌分類群、表４Ｅ、表４Ｇ、および表９中のＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定されている細菌分類群、またはそれらの任意の組合せ、である細菌分類群に属する細菌のレベルが、標準対照と比較して上昇している場合に、妊娠した対象が有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有するリスクを有する。標準対照と比較した、それら選択された細菌分類群のうちの１つ以上の分類群の細菌のレベル上昇が判定される場合、その女性が早産の増加したリスク、または新生児合併症を有する子供を分娩する増加したリスクを有することを示している。例えば、妊婦の子宮頸管スワブ試料または膣スワブ試料におけるメガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカムまたはウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８中の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列によって規定されている細菌分類群、ならびに表４Ｅ、表４Ｇ、および表９中のＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定されている細菌分類群などの１つ以上の分類群の細菌のレベルが、標準対照と比較して高いと検出されるとき、その女性は有害な妊娠転帰および／または有害な新生児転帰を有する増大した可能性を有している。可能性がある有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰には、３４週未満での早産、３７週未満での早産、１分の時点での７未満のアプガースコア、５分の時点での７未満のアプガースコア、絨毛羊膜炎、呼吸窮迫症候群、気管支肺異形成症、脳室内出血、出生後７日以内の新生児死亡、および／または新生児敗血症が含まれるがこれらに限定されない。さらに、対象が妊婦である場合、可能性がある有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰には、生体試料の採取後約１〜１９６日の期間内（例えば、１日、７日、１４日、２１日、２８日、５６日、８４日、１１２日、１４０日、１６８日、または１９６日）の分娩、臨床介入の実施後約１〜１９６日の期間内（例えば、１日、７日、１４日、２１日、２８日、５６日、８４日、１１２日、１４０日、１６８日、または１９６日）の分娩がさらに含まれる。
本明細書において提供される方法は、妊婦が進行した子宮頸管拡張または進行した子宮頸管短縮を有するリスクを有することを決定するために用いることができる。例えば、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカムまたはウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するものとしての未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８中の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定されている細菌分類群、ならびに表４Ｅ、表４Ｇ、および表９中のＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定されている細菌分類群、などの少なくとも１種類の細菌分類群の細菌のレベルが標準対照レベルのそれよりも高い場合に、その女性は進行した子宮頸管拡張または早期子宮頸管短縮を有する増大した可能性を有する。そのような対象は妊娠１３週から３７週までの間に分娩活動期を有さずに、例えば２ｃｍ以上の子宮頸管拡張を示すか、または正期産前の子宮頸管短縮を示すと予測される。
幾つかの例では、前記方法に、ジョンケテラ・アントロピ（Ｊｏｎｑｕｅｔｅｌｌａ ａｎｔｈｒｏｐｉ）、アエロコッカス・ウリナエ、表４Ｂおよび表４Ｄ中の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定される細菌分類群、ならびに表４Ｆおよび表４Ｈ中のＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定される細菌分類群、からなる群より選択される少なくとも１種類の細菌分類群の細菌のレベルを前記生体試料において検出すること、および前記少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌のレベルが標準対照レベルのそれよりも低い場合に有害な妊娠転帰の増加したリスクが前記対象にあると決定すること、がさらに含まれ得る。
有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有することが前記妊婦に予測される場合、前記方法はその対象のある試料タイプの生体試料を使用して後の時点で工程（ａ）と（ｂ）を繰り返すことを含むことができ、その場合に後の時点での前記少なくとも１種類の細菌分類群の細菌の、最初の工程（ａ）において決定されたレベルと比較したレベル上昇によって、有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有する増加したリスクが示される。さらに、一旦、妊婦が有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を経験する増加したリスクがあることが示されると、医師はそのような異常転帰のリスクを最小にするようにその女性に治療を行ってもよい。例えば、その女性は妊娠期を通して綿密にモニタリングされても、新生児集中治療付きの三次ユニットに時宜を得て移送されてもよい。
別の態様では、本発明は対象における有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有するリスクを決定するためのキットを提供する。そのキットは、（ａ）妊婦から採取され、且つ、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカムまたはウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８中の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定される細菌分類群；ならびに表４Ｅ、表４Ｇ、および表９中のＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定される細菌分類群からなる群より選択される少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌を含み、妊婦から採取された生体試料を提供する標準対照、および（ｂ）メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカムまたはウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、ならびに表４Ａ、表４Ｃ、および表８中の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定される細菌分類群、ならびに表４Ｅ、表４Ｇ、および表９中のＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定される細菌分類群からなる群より選択される少なくとも１種類の細菌分類群を特異的および定量的に同定する１種類以上の薬剤を含み得る。幾つかの実施形態では、１種類以上の薬剤には増幅アッセイにおいて前記少なくとも１種類の細菌属のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、そのポリヌクレオチドを増幅する一対以上のオリゴヌクレオチドプライマーが含まれ得る。幾つかの実施形態では、１種類以上の薬剤には前記少なくとも１種類の細菌分類群のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブがさらに含まれ得る。幾つかの例では、キットは取扱い説明書を含む。
別の態様では、本発明は、進行した子宮頸管拡張または早期子宮頸管短縮を有する増加したリスクが妊娠対象にあるか決定するための方法を提供する。その方法は、（ａ）対象から採取された生体試料から核酸を抽出する工程、（ｂ）メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカムまたはウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８中の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定される細菌分類群、ならびに表４Ｅ、表４Ｇ、および表９中のＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定される細菌分類群か、らなる群より選択される少なくとも１種類の細菌分類群のレベルを、核酸において検出する工程、および（ｃ）前記少なくとも１種類の細菌分類群のレベルが標準対照レベルのそれよりも高い場合に対象が進行した子宮頸管拡張または早期子宮頸管短縮を有する増加したリスクを有すると決定する工程を含む。例えば、妊婦が子宮頸管または膣内に選択された細菌分類群のうちの１つ以上の分類群に由来する細菌の上昇したレベルを有すると判定される場合、早期拡張子宮頸管および／または早期短縮子宮頸管を有するリスクがあると予測される。妊婦が、例えば妊娠約１３〜約２５週の時点で子宮頸管または膣内にメガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカムまたはウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８中の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定される細菌分類群、表４Ｅ、表４Ｇ、および表９中のＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定される細菌分類群、またはそれらのいずれかの組合せなどの群のより多くの細菌を有する場合、例えば、妊婦は妊娠約３４〜約３７週より前の妊娠約１３〜約２５週に拡張子宮頸管または短縮子宮頸管を有する可能性がある。少なくとも２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、１３種類、１４種類、１５種類、１６種類、１７種類、１８種類、１９種類、または２０種類の異なる細菌分類群がその試料の中に検出され得る。
幾つかの実施形態では、生体試料は子宮頸管スワブ、膣スワブ、尿試料、羊水試料、母体血試料、母体血清試料、母体血漿試料、子宮頸管粘液試料、胎盤スワブ、臍帯スワブ、または生殖系もしくは胃腸管系から直接的もしくは間接的に採取されたあらゆる試料である。前記検出工程はポリヌクレオチド増幅アッセイ、ポリヌクレオチド配列決定を伴うアッセイ、または配列特異的プローブ／プライマーハイブリダイゼーションを伴うアッセイであり得る。幾つかの事例では前記増幅アッセイはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイである。所望により、前記ＰＣＲアッセイは定量的ＰＣＲアッセイまたは逆転写酵素ＰＣＲアッセイでもよい。
１A〜１Eは、介入後の自然早産（ｓＰＴＢ）および介入後の正期産（ＴＢ）などの臨床転帰と細菌分類群との関連を示す図である。１Ａは、２５人の頸管不全症（ＣＩ）患者の介入後の臨床転帰を示す。各列は分娩時の妊娠期間（ＧＡ）の昇順で患者（Ｐ１〜Ｐ２５）を表している。黒い長方形は「介入後の３４週未満での自然早産（ｓＰＴＢ）」を起こしたＰ１〜Ｐ１０を表す。白い長方形は「介入後の３７週以降での正期産（ＴＢ）」を起こしたＰ１１〜Ｐ２５を表す。待機時間は処置と分娩の間の間隔である。ＲＤＳは呼吸窮迫症候群である。ＢＰＤは気管支肺異形成症である。ＩＶＨは脳室内出血である。ＲＯＰは未熟児網膜症である。新生児死亡は分娩後２８日以内の死亡である。ＹはＹｅｓであり、ｎはｎｏであり、−は不明である。 図１Ｂおよび図１Ｃは、それぞれ「介入後のｓＰＴＢ」のＣＩ頸管および「介入後のＴＢ」のＣＩ頸管において最も多く存在する１０種類の細菌分類群を示す。示されている値は各患者（列）の子宮頸管スワブ試料中の各細菌分類群（行）の存在量値（正規化されたシーケンシングリードカウント、累積和スケーリング（ＣＳＳ）方法）のｌｏｇ１０である。正規化されたリードカウントは図１Ｅに記されているようにｌｏｇ（存在量）に変換される。各行は９７％以上の同一性を有する配列をクラスター化することにより形成されたＯＴＵを表す。各ＯＴＵは、リボソームデータベースプロジェクト（ＲＤＰ）ナイーブベイズｒＲＮＡ分類（バージョン２．９、２０１４年９月、ＲＤＰ １６Ｓ ｒＲＮＡトレーニングセット１０）を使用して属レベルで分類学的に分類されている。ラクトバチルスは、種についての情報を得るために、ＢＬＡＳＴ（最高スコア）およびＭＯＬＥ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴマッチの最適多重アラインメント）を使用して１６Ｓ ｒＲＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に対してさらにマッチさせる。 １Ｄは、「介入後のｓＰＴＢ」群（ｎ＝１０）と「介入後のＴＢ」群（ｎ＝１５）の間で量が差次的に存在する（マン・ホイットニーの順位和検定）細菌分類群を示す。偽発見率（ＦＤＲ）法によって多重検定（星印においてｐ＜０．０５およびｑ値＜０．０５、すなわちＦＤＲ＜５％）のために調整した後に、７種類の分類群が存在量が差次的なものとして残る。ｐ＜０．０１である後方の６種類の分類群が、各子宮頸管スワブ試料について要約スコア、すなわちｌｏｇ６種選択分類群総存在量の値（底は１０）（ＬＡ６）を計算するためにさらに選択される。総存在量は選択された分類群の存在量の一般的（線形）スケールでの算術和である。
２Ａ〜２Ｃは、二群、例えば介入後に自然早産（ｓＰＴＢ）を起こした患者と介入後に正期産（ＴＢ）を起こした患者の統計分析とＬＡ６値を提供する図である。２Ａは、どちらも臨床介入を受けたが異なる転帰を生じた二群の頸管不全症（ＣＩ）患者におけるＬＡ６値（ｌｏｇスケール（底は１０）の選択された６種細菌分類群の総存在量）を提供する。セルクラージュ／ペッサリー介入の前にＣＩ患者からＬＡ６を測定するための子宮頸管スワブ試料を収集した。その処置後に、１０人の患者が３４週未満で自然早産を起こし（「介入後のｓＰＴＢ」群、丸）、１５人の患者が３７週以上で正期産を起こした（「処置後のＴＢ」群、三角）。６分類群は、大量並列シーケンシングデータ（図１Ｄ）における二群間での有意な存在量の差（ｐ＜０．０１）に基づいて選択された。長いエラーバーの線と短いエラーバーの線はそれぞれ中央値と四分位数範囲について引かれている。 図２Ｂは、１．１５を超えるＬＡ６を有する（ＬＡ６陽性）ＣＩ患者と１．１５以下のＬＡ６を有する（ＬＡ６陰性）ＣＩ患者の様々な妊娠期間における未分娩の妊娠の割合を示す。ＬＡ６陽性患者はＬＡ６陽性患者よりも臨床介入後の早い時期に分娩した（２３．７週に対して３８．４週の分娩時の妊娠期間中央値；９５％信頼区間、２０．６週〜２５．４週に対して３８．０週〜３８．７週；カイ二乗、３２．３５２；ｄｆ、１；ログランク検定、ｐ＜０．０００１；ハザード比、６．２４；９５％信頼区間、１．５０〜２５．９）。ＬＡ６陽性患者とＬＡ６陰性患者の未分娩の妊娠のパーセンテージについての９５％信頼区間がそれぞれ太い直線と太い点線の周りの細い線として示されている。 図２Ｃは、ＬＡ６陽性ＣＩ患者とＬＡ６陰性ＣＩ患者の処置後の異なる日数における未分娩の妊娠の割合を示す。ＬＡ６陽性患者は介入後にＬＡ６陰性の対応者よりも短い期間の間に分娩した（介入と分娩の間の日数の中央値、１０日に対して１２６日；９５％信頼区間、８日〜３２日に対して１１２日〜１３４日；カイ二乗、３２．５２０；ｄｆ、１；ログランク検定、ｐ＜０．００００１；ハザード比、６．３４；９５％信頼区間、１．５１〜２６．６）。
定義
本開示では「または」という用語は、内容から別途明確に指示されない限り、「および／または」を含む意味で一般的に使用される。
「有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰」という用語は健康な乳児を分娩／出産する機会を減少させる状態を指す。有害な妊娠転帰の非限定的な例には習慣性妊娠第一期流産、妊娠第二期妊娠損失、早産（例えば、自然早産または適応あり早産）、早期子癇前症、早期子癇発作、胎児発育遅延、胎盤早期剥離、胎児死亡／死産、出生異常、１分の時点での７未満のアプガースコア、５分の時点での７未満のアプガースコア、臨床的絨毛羊膜炎、病理的絨毛羊膜炎、新生児呼吸窮迫症候群、新生児気管支肺異形成症、新生児敗血症、新生児脳室内出血等が挙げられる。
「頸管不全症」という用語は、妊娠第二期での妊娠損失または出産を引き起こすことになり得る子宮頸管の無力化または子宮頸管の進行した拡張などの子宮頸管の状態を指す。子宮頸管無力症、早期子宮頸管短縮、早期子宮頸管拡張または進行した子宮頸管拡張、子宮頸管外傷、子宮頸管構造異常、またはそれらのあらゆる組合せが頸管不全に寄与し得る。頸管不全症を管理するための臨床介入にはプロゲステロン補充、子宮頸管セルクラージュ、および子宮頸管ペッサリーが含まれるがこれらに限定されない。
「細菌分類群」という用語は細菌の分類学、すなわち、細菌の階級ベースの分類を指す。階層的生物分類には生物、ドメイン、界、門、綱、目、科、属および種が含まれる。
「生体試料」または「試料」という用語には生検試料および剖検試料などの組織の切片、および組織学目的のために採取された凍結切片、またはそのような試料のいずれかを加工したものが含まれる。生体試料には子宮頸管スワブ、膣スワブ、子宮スワブ、血液および血液画分または血液産物（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球等）、喀痰または唾液、リンパ系組織および舌組織、培養細胞、例えば初代培養細胞、外植片および形質転換細胞、大便、尿、生検組織等が含まれる。生体試料は典型的には真核生物から獲得され、その真核生物は哺乳類動物であり得、霊長類であり得、ヒト対象であり得る。
「生検」という用語は診断評価または予後評価のために組織試料を切除する過程、およびその組織標本自体を指す。当技術分野において知られているあらゆる生検技法が本発明の診断方法および予後予測方法に適用可能である。適用される生検技法は何よりも、評価される組織の種類（例えば、子宮頸管、膣、舌、結腸、前立腺、腎臓、膀胱、リンパ節、肝臓、骨髄、血液細胞、胃組織等）に依存する。代表的な生検技法にはスワブ生検、摘出生検、切開生検、針生検、外科的生検、および骨髄生検が含まれるがこれらに限定されず、結腸内視鏡検査が含まれてもよい。多種多様な生検技法の中から選択を行い、最小限の実験でそれらの生検技法を実行することになる当業者にそれらの生検技法がよく知られている。
本開示では「単離」核酸分子という用語は、通常はその単離核酸分子と会合している他の核酸分子から分離されている核酸分子を意味する。したがって、「単離」核酸分子には、限定されないが、天然状態ではその単離核酸が由来する生物のゲノム内でその核酸の一端または両端に隣接するヌクレオチド配列が存在しない核酸分子が含まれる（例えば、ＰＣＲまたは制限酵素消化によって作製されるｃＤＮＡ断片またはゲノムＤＮＡ断片）。そのような単離核酸分子は操作を簡便にするためか、または融合核酸分子を生成するためのベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）に導入され得る。加えて、単離核酸分子には組換え核酸分子または合成核酸分子などの操作核酸分子が含まれ得る。例えば、制限消化ゲノムＤＮＡを含む核酸ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）またはゲル（例えば、アガロースまたはポリアクリルアミン）内の数百から数百万もの核酸分子の中に存在する一核酸分子は「単離」核酸ではない。
「核酸」、「ヌクレオチド」、または「ポリヌクレオチド」という用語はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）および一本鎖型または二本鎖型のそれらの重合体を指す。具体的に限定されない限り、その用語は基準核酸と同等の結合特性を有し、且つ、天然ヌクレオチドと同様に代謝される公知の天然ヌクレオチド類似体を含有する核酸を包含する。別途指示されない限り、特定の核酸配列は明示的に示された配列と同様に、保存的に改変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換体）、アレル、オルソログ、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、および相補配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換は１つ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基残基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．誌、第１９巻：５０８１頁（１９９１年）、Ｏｈｔｓｕｋａら著、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．誌、第２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）、およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら著、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ誌、第８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。核酸という用語は遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語はアミノ酸残基の重合体を指すために本明細書において互換的に使用される。それらの用語は天然アミノ酸重合体および非天然アミノ酸重合体と同様に、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸重合体にも当てはまる。本明細書において使用される場合、それらの用語は、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、完全長タンパク質（すなわち、抗原）をはじめとしたあらゆる長さのアミノ酸鎖を包含する。
「アミノ酸」という用語は天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然アミノ酸は遺伝コードによってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。本出願の目的のため、アミノ酸類似体は天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合している炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルフオキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。本出願の目的のため、アミノ酸模倣物はアミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
アミノ酸には国際公開第０１／１２６５４号パンフレットに記載されるような非天然Ｄ−キラリティーを有するアミノ酸が含まれてよく、それらのアミノ酸はそのようなＤ−アミノ酸のうちの１つ以上を含むポリペプチドの安定性（例えば、半減期）、生物学的利用率、および他の特徴を改善し得る。幾つかの事例では治療用ポリペプチドのアミノ酸のうちの１つ以上、場合によってはそれらのアミノ酸のうちの全てがＤ−キラリティーを有する。
アミノ酸は一般的に知られている３文字のシンボルか、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される１文字のシンボルのどちらかによって指示され得る。同様に、ヌクレオチドはそれらの一般的に受け入れられている１文字のコードによって指示され得る。
２つ以上のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を説明する文脈の中の「同一である」またはパーセント「同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、または手作業による整列と目視検査によって測定される場合に比較ウィンドウ上または指定領域上で最大の一致度を得るように比較され、整列させられると同一である２つ以上の配列または部分配列、または同一である特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列に関連する（例えば、本発明の方法において使用される細菌性のタンパク質または関心の物の変異体（例えば有害な妊娠転帰を予測するためのもの）は基準配列、例えば対応する野生型細菌性目的タンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは８５％、９０％、９１％、９２％、９３、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する）。そこで、そのような配列は「実質的に同一である」と言われる。ポリヌクレオチド配列に関して、この定義は検査配列の相補体にも関連する。少なくとも約５０アミノ酸長またはヌクレオチド長である領域に同一性が存在することが好ましく、または７５〜１００アミノ酸長またはヌクレオチド長である領域に同一性が存在することがより好ましい。
配列比較のためには１つの配列が基準配列として働き、その配列に対して検査配列が比較されることが典型的である。配列比較アルゴリズムを使用するときは検査配列と基準配列をコンピューターに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。初期プログラムパラメーターを使用することができ、または代替的パラメーターを指定することができる。その後、配列比較アルゴリズムがそれらのプログラムパラメーターに基づいて基準配列と比較した検査配列のパーセント配列同一性を計算する。核酸およびタンパク質の配列比較のため、下で考察するＢＬＡＳＴアルゴリズムとＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム、および初期パラメーターが使用される。
本明細書において使用される場合の「比較ウィンドウ」は、２０から６００までの連続位置数、一般的には約５０から約２００までの連続位置数、より一般的には約１００から約１５０までの連続位置数からなる群より選択される連続位置数のうちのいずれか１つの連続位置数の区域に対する参照であって、ある配列と基準配列の２つの配列を最適になるように整列させた後に同じ数の連続位置からなるその基準配列に対してその配列が比較され得るその参照に関連する。比較のための配列整列方法は当技術分野においてよく知られている。比較のための最適な配列整列は、例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ著、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．誌、第２巻：４８２頁（１９８１年）の局所的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ著、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．誌、第４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ著、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ誌、第８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索方法、これらのアルゴリズム（ウィスコンシン州、マジソン、５７５ サイエンス・ドライブのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＧｒｏｕｐのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター実装、または手作業による整列と目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５年、補遺）を参照されたい）によって実施され得る。
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適切であるアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムとＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら著、（１９９０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．誌、第２１５巻：４０３〜４１０頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら著、（１９７７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．誌、第２５巻：３３８９〜３４０２頁に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは米国国立生物工学情報センターのウェッブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて公開されている。そのアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させるとある正の閾値スコアＴと合致するか、またはそれを満たすクエリー配列中に長さＷのショートワードを特定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に特定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上掲）。これらの最初の隣接ワードヒットはそれらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして機能する。次に累積アラインメントスコアが増加可能である限りそれらのワードヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列について、累積スコアはパラメーターＭ（一致残基対に対する報酬スコア；常に０より上）およびパラメーターＮ（不一致残基に対するペナルティースコア；常に０より下）を用いて計算される。アミノ酸配列について、累積スコアを計算するためにスコア行列が使用される。各方向でのワードヒットの延長は累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下したとき、負のスコアを獲得する１つ以上の残基アラインメントの集積のために累積スコアがゼロ以下になるとき、またはどちらかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターであるＷ、Ｔ、およびＸはそのアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は２８のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝１、Ｎ＝−２、および両鎖の比較を初期設定として使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは３のワードサイズ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を初期設定として使用する（例えば、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ著、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ誌、第８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列の間の類似性の統計分析も行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ著、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ誌、第９０巻：５８７３〜５７８７頁（１９９３年）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こることになる確率の目安を提供する。例えば、基準核酸に対する検査核酸の比較において最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合にその核酸はその基準配列と類似していると見なされる。
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの意味は、第１核酸によってコードされるポリペプチドが下で説明されるように第２核酸によってコードされるポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応するということである。したがって、ポリペプチドは典型的には第２ポリペプチドと、例えばそれら２つのペプチドが保存的置換によって異なるだけである場合に実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の意味は、それら２つの分子またはそれらの相補体が下で説明されるようにストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズすることを意味する。２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらに別の意味は、同じプライマーを使用してその配列を増幅することができることである。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「高ストリンジェンシー」という用語は、プローブが典型的には複雑な核酸混合物の中でその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況においては異なってくる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての詳細な指針がＴｉｊｓｓｅｎ著、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ −Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９９３年）に見られ、当業者によって容易に理解される。一般的に、ストリンジェントな条件は規定のイオン強度ｐＨにおいて特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。そのＴｍは、標的に対して相補的であるプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、および核濃度での）温度である（Ｔｍで標的配列が過剰に存在するとき、プローブの５０％が平衡状態で占められる）。ストリンジェントな条件はホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によって達成されてもよい。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。例となるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は次の通りであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃で保温、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃で保温、６５℃の０．２×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳの中で洗浄。
ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸は、それでもそれらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば実質的に同一である。これは、例えば、遺伝コードによって許される最大のコドン縮重を用いて核酸が作製される場合に起こる。そのような事例ではそれらの核酸はややストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることが典型的である。例となる「ややストリンジェントハイブリダイゼーション条件」には３７℃の４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および４５℃の１×ＳＳＣでの洗浄が含まれる。陽性のハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、類似のストリンジェンシー条件を提供するために代替的なハイブリダイゼーション条件と洗浄条件が利用可能であることを容易に理解する。ハイブリダイゼーションパラメーターを決定するための追加のガイドラインは多数の参照文献、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編において提示されている。
ポリヌクレオチド配列が別のポリヌクレオチド配列と二本鎖複合体を形成することを言及する文脈で使用されるときに「特異的に結合する」という語句は、「ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法」という用語の定義において提示されるワトソン・クリック塩基対合に基づいた「ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション」を説明する。
本出願において使用される場合、「増加」または「減少」は、比較対照、例えば確立された標準対照（妊娠している対照被検者の正常な子宮頸管組織または膣組織に見られる細菌のｍＲＮＡまたはタンパク質の平均発現レベル等）からの検出可能な量の正または負の変化を指す。増加は典型的には少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または５０％、または１００％の正の変化であり、対照値の少なくとも２倍、または少なくとも５倍、または１０倍も高い場合があり得る。同様に、減少は典型的には対照値の少なくとも１０％、または少なくとも２０％、３０％、または５０％の負の変化、または対照値の少なくとも８０％または９０％もの大きさの負の変化である。「より多くの」、「より少ない」、「より高い」、および「より低い」などの比較基準からの量的な変化または差異を表す他の用語は上で説明されたのと同じように本出願において使用される。対照的に、「実質的に同じ」または「実質的に変化が無い」という用語は標準対照値からの量の変化がほとんど無いか、全く無いことを表し、典型的には標準対照の±１０％以内、または標準対照から±５％以内、標準対照から２％以内、または標準対照からずっと変化が少ないことを表す。
本明細書において使用される「ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法」は、適切なハイブリダイゼーション条件下で公知の配列のポリヌクレオチドプローブとワトソン・クリック塩基対合を形成する能力に基づいて所定のポリヌクレオチド配列の存在および／または量を検出するための方法を指す。そのようなハイブリダイゼーション法の例にはサザンブロット、ノーザンブロット、およびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。
本明細書において使用される「プライマー」は、目的の遺伝子に対応するポリヌクレオチド配列、例えば特定の細菌遺伝子またはその一部のｃＤＮＡ配列またはゲノム配列に基づいてヌクレオチド配列を増幅するための増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用することができるオリゴヌクレオチドを指す。典型的にはポリヌクレオチド配列の増幅用のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも１つはそのポリヌクレオチド配列に対して配列特異的である。そのプライマーの正確な長さは、温度、そのプライマーの起源、および使用される方法をはじめとする多数の因子に依存する。例えば、診断用途および予後予測用途については、標的配列の複雑さに応じてオリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも１０ヌクレオチド、または１５ヌクレオチド、または２０ヌクレオチド、または２５ヌクレオチド、またはそれより多くのヌクレオチドを含むことが典型的であるが、オリゴヌクレオチドプライマーはそれより少ないヌクレオチドを含んでも、それより多いヌクレオチドを含んでもよい。当業者はプライマーの適切な長さの決定に関わる因子を容易に理解する。本開示では「プライマーペア」という用語は、標的ＤＮＡ分子の両鎖に、または標的ＤＮＡの領域であって増幅されるヌクレオチド配列に隣接するそれらの領域にハイブリダイズする一対のプライマーを意味する。本開示では「プライマーサイト」という用語はプライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡまたは他の核酸の領域を意味する。
「標識」、「検出可能標識」、または「検出可能部分」は分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理学的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および例えばあるペプチドに放射性成分を組み込むことによって検出可能になり得るそのタンパク質、またはあるペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用されるそのタンパク質が含まれる。プローブ（およびそれ故にその結合標的）の存在が容易に検出可能となるように規定の結合特性を有するプローブまたは分子（例えば、公知の結合特異性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチド）に検出可能標識を結合することが典型的である。
本明細書において使用される「標準対照」は確立された正常な組織試料、例えば正常な子宮頸管組織試料に存在する所定の量または濃度の特定の細菌属に属する細菌、細菌性ポリヌクレオチド、または細菌性ポリペプチドを指す。検査試料に存在する特定の細菌の属、ｍＲＮＡ、またはタンパク質の量を比較するための基盤として機能するような標準対照値が本発明の方法の活用にとって適切である。標準対照として機能する確立された試料は、従来規定されているように例えば閉じた子宮頸管または正常な長さの子宮頸管を有する平均的な健康で妊娠しているヒトの子宮頸管組織試料に典型的である細菌の属、ｍＲＮＡまたはタンパク質の平均量を提供する。標準対照値は前記試料の性質、試料収集方法、ならびに性別、年齢、そのような対照値を確立する基になった対象の民族的帰属（および妊婦の場合は妊娠期間）などの他の因子に応じて変化し得る。
従来規定されているように、妊娠しており、且つ、有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有するリスクが無いヒトを説明する文脈の中で使用される場合、「平均」という用語は、有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有するどのようなリスクも無い妊娠しているヒトからなる無作為選択群を表すその人物の子宮頸管のある特定の特徴、特に１種類以上の特定の細菌分類群の細菌量を指す。これらの個人の間での子宮頸管内の特定の分類群の細菌の平均量が健康で正常な妊娠しているヒトからなる母集団における前記分類群の細菌の対応量を妥当な精度で反映するようにこの選択群は充分な数のヒトを含むべきである。加えて、妊娠しているヒトからなる選択群は、有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有するリスクの徴候に関して子宮頸管組織試料が検査される対象の妊娠期間と類似の妊娠期間を有することが一般的である。また、年齢、同じ種類または類似の種類の介入（例えば、ペッサリー／セルクラージュ介入）の受け入れ状態、民族的帰属、医療歴などの他の因子も考慮され、検査対象のプロファイルと「平均」値を構築する個人からなる選択群のプロファイルとの間で厳密に一致することが好ましい。
本出願において使用される「量」または「レベル」という用語は試料中に存在する目的の細菌分類群、目的の細菌性ポリヌクレオチド、または目的の細菌性ポリペプチドの量を指す。そのような量は絶対項、すなわち試料中の細菌分類群、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドの総量で表現されても、相対項、すなわち試料中の細菌分類群、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドの濃度で表現されてもよい。
「対象」という用語には有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有する潜在的リスクのために医学的配慮を求めている個人、例えば、あらゆる妊娠している個人が含まれる。対象には以前の妊娠時に有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有したことがある個人も含まれる。
本発明の詳細な説明
Ｉ． 序論
本発明は、適切にマッチングされた対応症状を有しない女性に由来する適切な対照試料における細菌分類群と比較して、進行した子宮頸管拡張／子宮頸管短縮を有する女性の子宮頸管スワブ試料中において、差次的に大量に存在する細菌分類群の発見に部分的に基づく。特定の細菌分類群（例えば、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカムまたはウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８中の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定される細菌分類群、ならびに表４Ｅ、表４Ｇ、および表９中のＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定される細菌分類群）に由来する細菌のレベル上昇は、３４週未満での早産（例えば、自然早産）、３７週未満での早産（例えば、自然早産）、生体試料が採取された後の期間内（例えば、１日後、７日後、１４日後、２１日後、２８日後、５６日後、８４日後、１１２日後、１４０日後、１６８日後、１９６日後）での分娩、臨床介入が実施された後の期間内（例えば、１日後、７日後、１４日後、２１日後、２８日後、５６日後、８４日後、１１２日後、１４０日後、１６８日後、１９６日後）での分娩、１分の時点で７未満のアプガースコア、５分の時点で７未満のアプガースコア、絨毛羊膜炎（例えば、臨床的絨毛羊膜炎または病理的絨毛羊膜炎）、呼吸窮迫症候群、気管支肺異形成症、脳室内出血、出生後７日以内の新生児死亡および新生児敗血症などの有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有するリスクも予測する。
ＩＩ． 一般的方法
本発明の実施は分子生物学分野におけるルーチン的技法を利用する。本発明において活用される一般的方法を開示する基本的な教科書にはＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ著、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９９０年）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年））が含まれる。
核酸について、サイズはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のどちらかで示される。これらはアガロースゲル電気泳動またはアクリルアミドゲル電気泳動から得られる推定値、シーケンシングした核酸から得られる推定値、または公開されたＤＮＡ配列から得られる推定値である。タンパク質について、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で示される。タンパク質サイズはゲル電気泳動からの推定値、シーケンシングしたタンパク質からの推定値、得られたアミノ酸配列からの推定値、または公開されたタンパク質配列からの推定値である。
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．誌、第１２巻：６１５９〜６１６８頁（１９８４年）に記載されているように自動合成機を使用してＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．誌、第２２巻：１８５９〜１８６２頁（１９８１年）によって最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って化学合成され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、当技術分野において理解されているあらゆる戦略、例えばネイティブアクリルアミドゲル電気泳動またはＰｅａｒｓｏｎおよびＲｅａｎｉｅｒ著、Ｊ． Ｃｈｒｏｍ．誌、第２５５巻：１３７〜１４９頁（１９８３年）に記載される陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて実施される。
ＩＩＩ． 組織試料の獲得および細菌分類群の分析
本発明は、早期陣痛および早期分娩などの有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有するリスクの評価手段として、妊婦の子宮頸管または膣に、特に子宮頸管スワブまたは膣スワブ試料にの特定の細菌分類群の細菌量を測定することに関する。したがって、本発明を実施する第１工程は検査対象に由来する子宮頸管組織試料または膣組織試料を、試料中に含まれる核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡを分析することができるように得ることである。幾つかの実施形態では妊婦の子宮頸管または膣にの特定の細菌分類群の細菌量は、子宮頸管または膣に由来しない生体試料中の特定の細菌の量によって表され得る。
Ａ． 生体試料の獲得および調製
子宮頸管組織または膣組織、子宮頸管粘液、羊水、または母体血などの生体試料は、本発明の方法を用いて検査またはモニターされる人物から入手される。個人からの子宮頸管上皮細胞または膣上皮細胞、子宮頸管粘液、羊水、または母体血（例えば、母体全血、母体血清および／または母体血漿）の収集は、子宮頸管スクリーニング時のプロトコルなど、病院または診療所が一般的に従う標準的プロトコルに準じて実施される。適切な量の子宮頸管上皮または膣上皮、こそぎ落とされた細胞、粘膜、および／または体液が収集され、それはその後の調製の前に標準的手順に従って貯蔵されてもよい。
妊娠している患者の試料にの細菌の本発明に従う分析は、例えば、その試料中に見出される細胞、組織、粘膜、または体液を使用して実施され得る。核酸抽出用の細胞試料、組織試料、または体液試料を調製するための方法は当業者によく知られている。例えば、対象の子宮頸管粘膜試料または膣粘膜試料は、その試料中の細菌性のＤＮＡまたはＲＮＡを分析することができるように処理され得る。
Ｂ． ＤＮＡの抽出および定量
生体試料から細菌のＤＮＡを抽出するための多数の方法が存在する。生体試料からＤＮＡを抽出するための方法は分子生物学の分野においてよく知られており、且つ、日常的に実施される。例えば、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌの著作を参照されたい。ＲＮＡ混入はＤＮＡ分析への干渉を回避するために排除されるべきである。溶解緩衝液ならびにムタノリシンおよびプロテイナーゼＫをはじめとする酵素を使用する前記生体試料の前処理を抽出の前に行ってもよい。標的ＤＮＡを検出するための方法にはＰＣＲ分析、蛍光標識を用いる定量的分析、またはサザンブロット分析のいずれも含まれる。標的ＤＮＡは特定の細菌分類群が有する１６ＳリボソーマルＲＮＡコード遺伝子（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）または他の目的遺伝子または他の目的ゲノム配列であり得る。
様々なポリヌクレオチド増幅方法がよく確立されており、研究において頻繁に用いられている。例えば、ポリヌクレオチド配列増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の一般的方法が当技術分野において周知であり、したがって本明細書では詳細には説明されない。ＰＣＲ法、プロトコル、およびプライマーデザインの原理の概説については、例えば、Ｉｎｎｉｓら著、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク、１９９０年を参照されたい。ＰＣＲ試薬およびプロトコルはＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓのような商業的供給業者からも入手可能である。
ＰＣＲ増幅が本発明の実施において使用されることが典型的であるが、当業者は各々が充分な増幅を行う、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅法、および自家持続配列複製法または核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）などのあらゆる公知の方法によって関係のあるゲノム配列の増幅が達成され得ることを理解する。つい最近開発された分岐ＤＮＡテクノロジーを特定の細菌性ｍＲＮＡマーカーの量の定量的決定に用いてもよい。臨床試料中の核酸配列の直接的定量のための分岐ＤＮＡシグナル増幅の詳細な説明については、例えば、Ｎｏｌｔｅ著、Ａｄｖ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．誌、第３３巻：２０１〜２３５頁、１９９８年を参照されたい。
ポリヌクレオチド配列決定のための技法もよく確立されており、関係する研究分野において広く実施されている。例えば、ポリヌクレオチドシーケンシングの基本原理および一般的技法が、上掲のＷａｌｌａｃｅらの著作、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌの著作、および上掲のＡｕｓｕｂｅｌらの著作などの分子生物学と組換え遺伝学についての様々な研究報告書と学術論文に記載されている。研究室においてルーチン的に実施される手作業のＤＮＡシーケンシング方法または自動化ＤＮＡシーケンシング方法が本発明の実施に用いられ得る。本発明の方法を実施するためのポリヌクレオチド配列検出に適切なその他の手段には、マススペクトロメトリー、プライマー伸長法、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、融解曲線分析、高解像度融解分析、ヘテロ二重鎖分析、大量並列シーケンシング（例えば、次世代シーケンシング）、および電気泳動が含まれるがこれらに限定されない。
Ｃ． ＲＮＡの抽出および定量
当業者は、生体試料から細菌性ＲＮＡを抽出するための多数の方法が存在することを理解している。ＲＮＡ調製の（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１年によって説明される）一般的方法に従うことができ、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ Ｄｉｒｅｃｔ ｍＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州）、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）、およびＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ（登録商標）シリーズ９６００（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウィスコンシン州）などの様々な市販の試薬またはキットを使用して検査対象由来の生体試料からｍＲＮＡを得てもよい。これらの方法のうちの複数の方法の組合せを用いてもよい。
全ての混入ＤＮＡがＲＮＡ調製物から排除されることは大変重要である。したがって、ＤＮａｓｅを用いる処理による注意深い試料の取扱い、および増幅工程と定量工程における適切な陰性対照が用いられるべきである。
Ｄ． ＲＮＡレベルのＰＣＲベースの定量的測定
一旦、ＲＮＡが試料から抽出されると、特定の細菌分類群の細菌が発現するあらゆる目的ＲＮＡ転写産物の量を定量することができる。例えば、限定されないが、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカムまたはウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８中の１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定される細菌分類群、ならびに表４Ｅ、表４Ｇ、および表９中のＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定される細菌分類群などの特定の細菌分類群、の１６ＳリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の量を検出および測定することができる。ＲＮＡ転写産物レベルを決定するための好ましい方法は増幅ベースの方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による方法である。
増幅工程の前に、目的の細菌のＲＮＡ転写産物のＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）が合成されることが求められる。これは別の工程として実施され得る逆転写によって達成されるか、またはＲＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応の変法である同次逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）において達成される。リボ核酸のＰＣＲ増幅に適切な方法は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ内のＲｏｍｅｒｏおよびＲｏｔｂａｒｔの著作、４０１〜４０６頁、Ｐｅｒｓｉｎｇら編、Ｍａｙｏ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ロチェスター、ミネソタ州、１９９３年、Ｅｇｇｅｒら著、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．誌、第３３巻：１４４２〜１４４７頁、１９９５年、および米国特許第５０７５２１２号明細書によって説明される。
ＰＣＲの一般的方法は当技術分野において周知であり、したがって本明細書では詳細には説明されない。ＰＣＲ法、プロトコル、およびプライマーデザインの原理の概説については、例えば、Ｉｎｎｉｓら著、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク、１９９０年を参照されたい。ＰＣＲ試薬およびプロトコルはＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓのような商業的供給業者からも入手可能である。
ＰＣＲは熱安定性酵素を使用する自動化処理として最も一般的に実施される。この処理では反応混合物の温度が自動的に変性領域、プライマーアニーリング領域、および伸長反応領域を周期的に繰り返す。この目的のために特別にに適合した機械が市販されている。
標的ＲＮＡのＰＣＲ増幅が、本発明の実施において使用されることが典型的である。しかしながら、当業者は、各々が充分な増幅を行う、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅法、および自家持続配列複製法または核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）などのあらゆる公知の方法によって試料中の細菌のＲＮＡ種の増幅が達成され得ることを理解する。つい最近開発された分岐ＤＮＡテクノロジーを特異的な細菌のＲＮＡマーカーの量の定量的決定に用いてもよい。臨床試料中の核酸配列の直接的定量のための分岐ＤＮＡシグナル増幅の概説についてはＮｏｌｔｅ著、Ａｄｖ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．誌、第３３巻：２０１〜２３５頁、１９９８年を参照されたい。
Ｅ． ＤＮＡおよびＲＮＡ用の他の定量的方法
目的の細菌のＤＮＡまたはＲＮＡ転写産物は、当業者に周知な他の標準的技法を用いても検出することができる。検出工程は増幅工程の後に来ることが典型的であるが、本発明の方法では増幅は必要とされない。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡは、増幅工程が先行するにしても先行しないにしてもサイズ分画（例えば、ゲル電気泳動）によって同定され得る。周知の技法（例えば、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌの著作を参照されたい）に従って、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル中で試料を泳動し、臭化エチジウムを用いて標識した後、標準的比較物と同じサイズのバンドの存在が標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡの存在を意味し、次にそのバンドの強度に基づいて標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡの量がその対照に対して比較され得る。あるいは、目的のＤＮＡまたはＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブをＤＮＡ種またはＲＮＡ種の存在の検出に使用することができ、そのプローブによって与えられたシグナルの強度に基づいてその標準的比較物に対して比較してＤＮＡまたはＲＮＡの量を示すことができる。
配列特異的プローブハイブリダイゼーションは、他の種の核酸を含む特定の核酸を検出する周知の方法である。充分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、プローブは実質的に相補的な配列だけに特異的にハイブリダイズする。様々な量の配列ミスマッチを許容するために、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを緩めることができる。
溶液相ハイブリダイゼーションアッセイ、固相ハイブリダイゼーションアッセイ、または混合相ハイブリダイゼーションアッセイを含むがこれらに限定されない当技術分野においてよく知られている多数のハイブリダイゼーション形式。次の論文は様々なハイブリダイゼーションアッセイ形式を概説している：Ｓｉｎｇｅｒら著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ誌、第４巻：２３０頁、１９８６年、Ｈａａｓｅら著、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８９〜２２６頁、１９８４年、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ著、Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード大学出版局、オックスフォード、ならびにＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年。
周知の技法に従ってハイブリダイゼーション複合体が検出される。標的核酸、すなわちＲＮＡまたは増幅されたＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブは、典型的にはハイブリダイズした核酸の存在を検出するために用いられる幾つかの方法のうちのいずれか１つによって標識することができる。１つの一般的な検出方法は、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐなどで標識されたプローブを使用するオートラジオグラフィーの利用である。放射性同位体の選択は、合成の容易さ、安定性、および選択した同位体の半減期に起因する研究上の好ましさによる。他の標識には、フルオロフォア、化学発光薬剤、および酵素で標識された抗リガンドまたは抗体に結合する化合物（例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニン）が含まれる。あるいは、プローブは、フルオロフォア、化学発光薬剤、または酵素などの標識と直接的に結合することができる。標識の選択は必要とされる感度、プローブとの結合の容易さ、安定性条件、および利用可能な機器による。
本発明の実施にとって必要なプローブおよびプライマーは、周知の技法を用いて合成および標識することができる。プローブおよびプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．誌、第１２巻：６１５９〜６１６８頁、１９８４年に記載されているように自動合成機を使用してＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．誌、第２２巻：１８５９〜１８６２頁、１９８１年によって最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製はネイティブアクリルアミドゲル電気泳動またはＰｅａｒｓｏｎおよびＲｅｇｎｉｅｒ著、Ｊ． Ｃｈｒｏｍ．誌、第２５５巻：１３７〜１４９頁（１９８３年）に記載される陰イオン交換ＨＰＬＣのどちらかによる。
Ｆ． 増幅および配列分析
配列分析の前に増幅反応を実施してもよい。様々なポリヌクレオチド増幅方法がよく確立されており、研究に頻繁に用いられている。例えば、ポリヌクレオチド配列増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の一般的方法が当技術分野においてよく知られており、したがって本明細書では詳細には説明されない。ＰＣＲ法、プロトコル、およびプライマーデザインの原理の概説については、例えば、Ｉｎｎｉｓら著、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク、１９９０年を参照されたい。ＰＣＲ試薬およびプロトコルはＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓのような商業的供給業者からも入手可能である。
ポリヌクレオチド配列決定のための技法もよく確立されており、関係する研究分野において広く実施されている。例えば、ポリヌクレオチドシーケンシングの基本原理および一般的技法が、上掲のＷａｌｌａｃｅらの著作、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌの著作、および上掲のＡｕｓｕｂｅｌらの著作などの分子生物学と組換え遺伝学についての様々な研究報告書と学術論文に記載されている。研究室において日常的に実施される手作業のＤＮＡシーケンシング方法または自動化ＤＮＡシーケンシング方法を本発明の実施に用いることができる。本発明の方法を実施するためのポリヌクレオチド配列検出に適切なその他の手段には、マススペクトロメトリー、プライマー伸長法、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、融解曲線分析、高解像度融解分析、ヘテロ二重鎖分析、大量並列シーケンシング、および電気泳動が含まれるがこれらに限定されない。
ＩＶ． 標準対照の確立
本発明の方法を実施するための特定の種類の試料（例えば、子宮頸管スワブまたは膣スワブ）の標準対照を確立するため、健康な妊婦からなる群、有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有するリスクが無い妊婦からなる群、または妊娠の正常なタイムフレーム内で分娩することが後に確認された妊婦からなる群を従来規定されている通りにまず選択する。例えば、その群には正期の陣痛および分娩があった妊婦からなる群が含まれてもよい。幾つかの実施形態ではその群の妊婦はセルクラージュまたはペッサリーなどの臨床介入の後に正期の陣痛および分娩があったとしてもよい。これらの個人は、該当する場合は、本発明の方法を用いた有害な妊娠転帰のリスクのスクリーニングおよび／またはモニタリングの目的にとって適切なパラメーター内にある。例えば、それらの個人は類似の妊娠期間と同等の健康状態を有する個人であってよい。所望により、それらの個人は類似の年齢または類似の民族的バックグラウンドを有する個人であってもよい。
選択された個人の正常な分娩時期が後で確認される。「標準対照」としてのデータを提供するために、選択された個人の中で正常な分娩時期の領域よりも早く、または遅く出産を行ったことが分かった人は全てその群から除外されることになる。
選択された個人の健康状態は、個人の一般的健康診断および医療歴の総点検をはじめとするよく確立された日常的に用いられる方法によって確認されるが、限定はされない。
さらに、選択された健康な個人の群は、その群から得られた子宮頸管組織試料における１種類以上の細菌分類群の細菌の平均量／平均濃度が、健康な妊婦の一般的な集団における正常レベルまたは平均レベルを表すものとして合理的に見なされ得るように、合理的なサイズの群でなくてはならない。好ましくは、その選択群は少なくとも１０人の妊娠しているヒト対象を含む。
一旦、複数の分類群の細菌の平均値が選択された健常対照群の各対象の個々の値に基づいて確定されると、平均値、または中央値、または代表的値またはプロファイルが標準対照と見なされる。同じ過程の間に標準偏差も決定される。幾つかの例では、年齢、妊娠期間、または民族的バックグラウンドなどの異なる特徴を有する別々に規定された群について別々の標準対照を確立してもよい。
Ｖ． 子宮頸管微生物スコアに基づく有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰のリスクの予測
本明細書に記載される方法を用いると、現在の妊娠において有害な妊娠転帰、例えば自然早産または３４週より前の出産を有する可能性が妊娠対象にあるか予測することができる。同様に、将来の妊娠において有害な妊娠転帰を有する可能性が非妊娠対象にあるか予測することができる。幾つかの実施形態では、各対象について少なくとも１種類の細菌分類群、例えば１種類、２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、１３種類、１４種類、１５種類、１６種類、１７種類、１８種類、１９種類、２０種類、またはそれより多くの種類の細菌分類群に属する細菌の存在量レベルを使用して子宮頸管微生物スコアを計算することができる。その対象のスコアを標準対照群のスコアによって確定されたカットオフ値と比較し、有害な妊娠転帰を有する可能性が妊娠対象にあるか決定するために使用することができる。幾つかの実施形態ではそれらの細菌は少なくとも３種類の細菌分類群、例えば、１種類、２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、１３種類、１４種類、１５種類、１６種類、１７種類、１８種類、１９種類、２０種類、またはそれより多くの種類の細菌分類群に属する。幾つかの例では、細菌にはスネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（またはウレアプラズマ・パルバム）、アトポビウム・バギナエ、ペプトニフィラス・ラクリマリス、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびパラビバクター・カエシコラ（Ｐａｒａｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）が含まれる。他の例では、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（またはウレアプラズマ・パルバム）、アトポビウム・バギナエ、ペプトニフィラス・ラクリマリス、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびパラビバクター・カエシコラ（Ｐａｒａｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）の存在量レベルが、対象の子宮頸管微生物スコアを計算するために使用される。幾つかの実施形態では、選択された細菌分類群の各ｌｏｇ１０（存在量）値を線形スケールに変換した後で合算することができ、その後でその総合値を対数変換し、ｌｏｇ１０スケールの子宮頸管微生物スコアとして表す。幾つかの例では、１．１５を超える子宮頸管微生物スコアは自然早産を有するリスクがその妊娠対象にあることを示すことができる。幾つかの例では、縫縮術またはペッサリーなどの介入後に自然早産を有するリスクが妊娠している対象にある。幾つかの実施形態では、１．１５を超える子宮頸管スコアは、約３７．０週未満で、例えば、約３６．５週、約３６．０週、約３５．０週、約３４．０週、約３３．０週、約３２．０週、約３１．０週、約３０．０週、約２９．０週、約２８．０週、約２７．０週、約２６．０週、約２５．０週、約２４．０週、約２３．０週、約２２．０週、約２１．０週、またはそれより少ない週で分娩を行う増大した可能性がそ の妊した娠対象にあることを示すことができる。
幾つかの実施形態では、各生体試料の細菌分類群の存在量レベルは、その該当する分類群に特異的なポリヌクレオチド配列を標的とする定量的ＰＣＲアッセイまたは配列特異的ハイブリダイゼーションアッセイによって決定される。他の実施形態では、各生体試料の細菌分類群の存在量レベルは、それぞれの分類群の代用物として機能するマーカー遺伝子配列の大量並列シーケンシングによって決定される。幾つかの例では、試料中の細菌分類群の存在量レベルは、該当する分類群を示す１６ＳリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子配列の正規化されたリードカウントである。幾つかの例では、正規化リードカウントは、試料当たりの異なるシーケンシング深度または試料当たりの異なるライブラリーサイズのような試料間の技術的変動を最小限にするための確立された正規化方法を用いて生リードカウントから計算される。幾つかの例では、細菌分類群の存在量レベルはｌｏｇ１０スケールで示される。
幾つかの実施形態では、実施例２におけるＬＡ６値に示されているように、選択された群の細菌分類群（例えば、閉じた子宮頸管よりも拡張した子宮頸管において有意に大量に存在する分類群）の存在量が、加算または乗算によってまとめられて子宮頸管微生物スコアを提供する。他の実施形態では、スコアは、３工程で計算され、すなわち、（ａ）１つのサブ選択群の細菌分類群（例えば、閉じた子宮頸管よりも拡張した子宮頸管において有意に多く存在する分類群）の存在量レベルが加算または乗算によってまとめられ、（ｂ）別のサブ選択群の分類群（例えば、拡張した子宮頸管よりも閉じた子宮頸管において有意に多く存在する分類群）の存在量レベルも加算または乗算によってまとめられ、（ｃ）１番目の選択された群の分類群の和または積と２番目のサブ選択群の分類群の和または積との間の減算または除算によって、子宮頸管微生物スコアが計算される。他の実施形態では、子宮頸管微生物スコアは、実施例１中のＤＩＢＴ１検査、ＤＩＢＴ２検査、およびＤＩＢＴ３検査に示されているように、試料中に存在する選択された細菌分類群の種類の数に基づいて計算される。そのＤＩＢＴ１検査、ＤＩＢＴ２検査、およびＤＩＢＴ３検査では、子宮頸管微生物スコアは選択された細菌分類群の数であり、１以上のスコアを有する対象は有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰のリスク増加を意味する。他の実施形態では、子宮頸管微生物叢スコアは、試料中に検出される全ての分類群の中の選択された細菌分類群のランク付けに基づいて計算される。
ＶＩ． キット
本発明は、本明細書に記載される、妊娠した対象において１種類以上の特定の分類群の細菌のレベルを評価する方法を実施するための組成物およびキットを提供し、それらは有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有するリスクの判定などの様々な目的のために使用され得る。
目的の細菌分類群の細菌のＲＮＡレベルを決定するアッセイを実施するためのキットには、目的のコード配列の少なくとも１つのセグメントまたはその相補配列との特異的ハイブリダイゼーションに有用な、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドが含まれることが典型的である。所望により、オリゴヌクレオチドは検出可能部分で標識されてもよい。幾つかの例では、キットにはＰＣＲ、特にＲＴ−ＰＣＲによって目的の細菌性のＤＮＡまたはＲＮＡ転写産物の少なくとも１つのセグメントの増幅に使用され得る、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプライマーが含まれてもよい。
目的の細菌分類群の細菌のタンパク質レベルを決定するアッセイを実施するためのキットには、標的タンパク質アミノ酸配列への特異的結合に有用な少なくとも１種類の抗体が含まれることが典型的である。所望により、抗体は検出可能部分で標識されてもよい。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のどちらかであり得る。幾つかの例では、キットには少なくとも２種類の異なる抗体、一方は標的タンパク質への特異結合のための抗体（すなわち、一次抗体）、他方は一次抗体の検出用の抗体（すなわち、二次抗体）が含まれてもよく、二次抗体には検出可能部分が結合していることが多い。
キットには適切な標準対照も含まれることが典型的である。標準対照は、有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有するリスクが無い健康な妊娠した対象の子宮頸管上皮中の特定の細菌分類群の細菌が発現する標的タンパク質または標的ｍＲＮＡの平均値を示す。幾つかの例では、そのような標準対照は設定値の形態で提供され得る。加えて、本発明のキットは、使用者に検査試料の分析および検査対象における早期分娩などの有害な妊娠転帰事象を有するリスクの評価を手引きするための取扱い説明書を提供してもよい。
以下の実施例は例示だけを目的として提供されており、限定を目的として提供されてはいない。当業者は、同じ結果または類似の結果を基本的に生じるように変更または改変することができる重要ではない様々なパラメーターを容易に認識する。
実施例１．妊娠関連合併症を有する女性の子宮頸管内において差次的に多く存在する細菌分類群
背景
進行した子宮頸管拡張または早期子宮頸管短縮を有する女性の妊娠を延長する試みにおいて、子宮頸管を支持するために臨床医はセルクラージュ（Ｏｗｅｎ， Ｈａｎｋｉｎｓら著、２００９年）または子宮頸管ペッサリーを留置するかもしれない。しかしながら、羊水内感染などの感染を有する女性にはセルクラージュの留置にもかかわらず妊娠損失、早産、破水をはじめとする有害な妊娠転帰が伴うことが示された（Ｒｏｍｅｒｏ， Ｇｏｎｚａｌｅｚら著、１９９２年）。具体的には、２ｃｍ以上の子宮頸管拡張を有し、無傷の卵膜を有し、且つ、妊娠１４週と２４週の間に分娩活動期を有しない３３人の女性のうち、１７人（５１．５％）が羊膜腔の微生物侵襲を有することが分かった。羊膜腔の微生物侵襲を有する全ての患者が合併症を有した。羊水培養の陽性が存在する状態で子宮頸管セルクラージュを受けた患者に破水、臨床的絨毛羊膜炎、または妊娠損失があった（Ｒｏｍｅｒｏ， Ｇｏｎｚａｌｅｚら著、１９９２年）。したがって、進行した子宮頸管拡張を有するサブ集団の患者にはが有益ではない場合があり得る。主に共通見解と専門家の意見に基づいて、羊水内感染が除外される場合にのみセルクラージュ留置が有益であり得ると勧告されている（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ． ２０１４． Ｃｅｒｃｌａｇｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 第１４２号、 Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、２０１４年；第１２３巻：３７２〜９頁）。同様に、高度に感染または炎症性の環境の中に胎児を閉じ込めることが胎児の脳性麻痺または脳損傷をはじめとした有害新生児転帰を引き起こす場合があり得るので、ペッサリー留置の前に感染症を除外するように示唆されてもいる。
現在、試料中の細菌の検出は培養、顕微鏡観察、および細菌種特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイに依存しており、それらは低程度から中程度の感度を提供するだけであり、したがって感染症の除外には好適ではない。例えば、生殖器マイコプラズマ、好気性細菌および嫌気性細菌の羊水培養、およびウレアプラズマ・ウレアリティカムとウレアプラズマ・パルバムのＰＣＲターゲティングを用いて、進行した子宮頸管拡張を有する全部で５８人の患者のうちの４４人の患者（７６％）が培養とＰＣＲの両方の検査で細菌陰性になった（Ｏｈ， Ｌｅｅら著、２０１０年）。しかしながら、最終的には、検査で細菌陰性になった女性のうち６３％（１５／２４人）が検査で絨毛膜脱落膜炎陽性になり、３０％（７／２３人）が羊膜炎陽性になり、２５％（６／２４人）が臍帯炎陽性になり、６２％（２４／３９人）が１分の時点で４未満のアプガースコアを有する新生児を分娩し、４１％（１８／４４人）が出生から１日以内に死亡した新生児を分娩した（Ｏｈ， Ｌｅｅら著、２０１０年）。培養とＰＣＲの陰性結果を有するこれら４４人の患者における、炎症と新生児転帰不良の有病率から、細菌についてのこれらの陰性の検査結果の多くが偽陰性である可能性があることが示唆された。
さらに、合併症を伴わない正常な転帰を有する妊娠においてもウレアプラズマが検出された（Ｇｒａｙ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎら著、１９９２年、Ｇｅｒｂｅｒ， Ｖｉａｌら著、２００３年、Ｐｅｒｎｉ， Ｖａｒｄｈａｎａら著、２００４年）。ウレアプラズマは単に、満期妊娠になり、正常な新生児を産むことになった女性の生殖管にも存在する片共生性細菌または正常細菌叢の一部である可能性がある。このことは、以前の研究の多くにおいて候補アプローチによって選択された非常に少数の細菌種を検出することの限界を強調している。
対照的に、我々は１６ＳリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ベースの大量並列ゲノムシーケンシングを用いて、進行した子宮頸管拡張／短縮を有する女性とそれらの条件を有しない女性から得られた子宮頸管スワブ試料の各々において、基本的に全て（公知のゲノム配列を有する９，５００種類／分類群を超える細菌）の存在と相対存在量を体系的にプロファイリングした。我々のアプローチは、以前の研究の幾つかの限界を克服している。第一に、我々のアプローチは選択リスト内の候補を検出するだけではなく、基本的に全ての細菌分類群を例外なく検出することができる。第二に、我々のアプローチは培養に依存せず、したがって偏好性細菌も検出され得る。第三に、我々のアプローチは死んだ細菌からも生きた細菌からもゲノムＤＮＡ断片を増幅することができるＰＣＲに基づいているので生きた細菌を必要としない。第四に、我々のアプローチは、合併症を有している、または有していないあらゆる妊婦から容易に入手可能な非侵襲性型の試料である子宮頸管スワブを調査する。このことにより、胎児損失のリスクがあり、徴候が無い限り正常な妊娠のために推奨されない侵襲性の手順を必要とする羊水とは異なり、正常対照群との適切なマッチングおよび疾患群と対照群との間のデータ比較が容易になる。第五に、我々のアプローチはあらゆる妊娠期間のあらゆる妊婦から容易に入手可能である子宮頸管スワブを調査する。このことにより、通常はそれぞれ妊娠１４週または３７週の後に獲得される羊水または胎盤と異なり、対照群とのマッチングにみならず、できれば早期の試料採取、およびそれにより早期の検出と治療も容易になる。
合併症を有しない「正常で健康な」ヒトの多数の解剖学的部位における細菌群をプロファイリングするために１６ＳリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ベースの大量並列ゲノムシーケンシングを活用した多数の刊行物が存在する。これらには非妊婦または「正常で健康な」妊婦の膣スワブ試料中の細菌群についての刊行物が含まれる（Ｒａｖｅｌ， Ｇａｊｅｒら著、２０１１年、Ａａｇａａｒｄ， Ｒｉｅｈｌｅら著、２０１２年、Ｇａｊｅｒ， Ｂｒｏｔｍａｎら著、２０１２年）。しかしながら、妊娠合併症を有する女性の試料を分析したものはほとんどない（Ｈｕｍｍｅｌｅｎ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら著、２０１０年）。
具体的には、一つの刊行物はＨＩＶ陽性女性の膣における細菌群についての研究であり、その研究はＨＩＶを有しない大部分の産婦集団に適用可能なデータセットを提供することがなかった（Ｈｕｍｍｅｌｅｎ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら著、２０１０年）。別の刊行物は３７週よりも早く分娩された胎盤試料または３７週の後に分娩された胎盤試料における細菌群についての研究であり、その研究は妊娠期間を適合させた比較を容易にすることはなく、したがって妊娠期間の差によって混乱したデータセットを含んだ（Ａａｇａａｒｄ， Ｍａら著、２０１４年）。したがって、そのような有害な転帰を有する女性の子宮頸管内の細菌分類群の体系的なプロファイリングと、そのような合併症を有さず、妊娠期間がマッチした女性の子宮頸管内の細菌分類群との比較についての刊行物は今日まで無い。
我々の今回の研究は、合併症（進行した子宮頸管拡張または短縮）を有する妊婦の子宮頸管スワブ試料中の細菌群についての初めて体系的で比較的に包括的なプロファイルを提供する。また、我々が初めて、合併症を有する女性における細菌群のプロファイルを、そのような合併症を有さず、妊娠期間がマッチした女性と体系的に比較する。さらに、我々が初めて、合併症を有する女性の子宮頸管内において、そのような合併症を有しない女性の子宮頸管と比較して差次的に多く存在する細菌分類群のリストを提供する。このリストの提供は、妊娠期の子宮頸管内の「異常細菌叢」を特異的に標的とするが、「正常細菌叢」を標的とすることがないＰＣＲアッセイの設計にとって、重要な基礎的作業である。したがって、我々は我々の研究は、進行した子宮頸管拡張に関連する細菌の検出を改善するためのデータを提供すると結論付けられる。
特に、妊娠１３週から２５週の間の細菌分類群のリストのうちの選択されたメンバーの存在が、３４週未満での出生および脳室内出血などの異常転帰と関連し、またはそのような異常転帰を予測する。したがって、我々は、早期の綿密なモニタリング、または適切な新生児治療がある三次病院への移送を容易にするように、我々の細菌分類群リストがこれらの異常転帰の早期予後予測も提供すると結論付ける。
本明細書に記載される研究の目的は、全ての細菌を体系的にプロファイリングし、進行した子宮頸管拡張または子宮頸管短縮を有する女性の子宮頸管内において差次的に多く存在する細菌分類群のリストおよびそれらの部分的ゲノム配列を特定することである。具体的には、本研究は、（ｉ）進行した子宮頸管拡張を有する女性の子宮頸管（「拡張子宮頸管」）内の細菌分類群を体系的にプロファイリングし、そして適切にマッチングされた前記条件を有しない女性の子宮頸管（「閉鎖子宮頸管」）内の細菌分類群と比較し、（ｉｉ）子宮頸管短縮を有する女性の子宮頸管（「短縮子宮頸管」）内の細菌分類群を体系的にプロファイリングし、そして適切にマッチングされた前記条件を有しない女性の子宮頸管（「正常長子宮頸管」）内の細菌分類群と比較し、（ｉｉｉ）（ｉ）のデータを使用して閉鎖子宮頸管内の細菌分類群と比較して拡張子宮頸管内において差次的に多く存在する細菌分類群のリストを体系的に特定し、そして（ｉｖ）（ｉｉ）のデータを使用して正常長子宮頸管内の細菌分類群と比較して短縮子宮頸管内において差次的に大多く存在する細菌分類群のリストを体系的に特定するように設計された。
我々は拡張した子宮頸管に定着する細菌群は正常に閉じた子宮頸管に定着する細菌群と異なるという仮説を立てた。この仮説を試験するため、我々は１６ＳリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ベースの大量並列ゲノムシーケンシングを用いて進行した拡張子宮頸管（「拡張子宮頸管」、ｎ＝１９）における細菌分類群と、正常に閉じた子宮頸管（「閉鎖子宮頸管」、ｎ＝１３）における細菌分類群を体系的にプロファイリングした。二群の間で差次的に多く存在する分類群を体系的に検査するため、我々は適切な統計学的手法を用いて拡張子宮頸管群においてプロファイリングされた全ての分類群と閉鎖子宮頸管群においてプロファイリングされた全ての分類群の相対存在量を比較した。この細菌分類群リストのメンバーによってどんな有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰でも予測することができるか試験するため、我々はこの研究のためのリクルートから出産後２８日まで妊娠を追跡調査し、転帰が入手可能であれば転帰の予測についての感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率を算出した。
同様に、我々は短縮した子宮頸管（ｎ＝１１）における細菌分類群も体系的にプロファイリングし、そして正常な長さの子宮頸管を有する妊娠期間をマッチさせた対照（ｎ＝１１）の細菌分類群と比較した。我々は統計学的手法を用い、臨床転帰を追跡調査して短縮子宮頸管群と正常長群との間で差次的に多く存在する分類群のリストも特定した。我々は、転帰が入手可能であればそのリストのうちの選択されたメンバーによる予測についても評価した。
方法と結果
参加者のリクルート。本研究は各治験審査委員会から倫理審査による承認を得て実施され、試料はインフォームドコンセントを行って妊婦から収集された。試験群（拡張子宮頸管群、ｎ＝１９）では０．８ｃｍを超える無痛の進行した子宮頸管拡張を有する妊婦だけをリクルートした。
一方、参照群（閉鎖子宮頸管群、ｎ＝１３）では、０．８ｃｍを超える無痛の進行した子宮頸管拡張を有しない妊婦だけをリクルートした。さらに、試験群と参照群の両方における結果と臨床転帰の公正な比較を可能にするため、（ｉ）妊娠３４週より前に定期的で頻発するのではなく、（ｉｉ）子宮頸管セルクラージュ留置を受けるための徴候を有する女性だけがリクルートされた。これら３２人の参加者（拡張子宮頸管群内の１９人と閉鎖子宮頸管群内の１３人）の重要な特徴が表１に挙げられている。
表現型（すなわち、進行した子宮頸管拡張）を複雑にしないようにするため、試験群と参照群の両方において、試料収集時に子癇前症、多胎妊娠、胎児ジストレス、成長遅延、染色体異常、または構造異常を伴う妊娠を除外した。子宮頸管内の細菌群に影響を与える幾つかの重要な交絡因子を最小限にするため、試料収集の４８時間前に性行為があったか、またはあらゆる使用される他のあらゆる膣用外用薬（例えば、膣用の医薬または坐剤、膣洗浄液）を用いた参加者、または試料収集の３０日前に抗生剤または抗真菌剤を投与された参加者、または卵巣腫瘍を有する参加者も除外した。以前に１４週から３６週の間に流産または出産があった参加者（ｎ＝３、全員が拡張子宮頸管群、フィッシャーの正確検定、ｐ＝０．２５３）、以前に流産または妊娠中絶のために外科的除去を受けた参加者（ｎ＝１６、拡張子宮頸管群の９人と閉鎖子宮頸管群の７人、ｐ＝１．００）、子宮頸管外科手術を受けた参加者（ｎ＝６、拡張子宮頸管群の２人と閉鎖子宮頸管群の４人、ｐ＝０．１９４）、子宮異常を有する参加者（ｎ＝６、拡張子宮頸管群の３人と閉鎖子宮頸管群の３人、ｐ＝０．６６６）、異常な膣排泄物が最近あった参加者（ｎ＝５、拡張子宮頸管群の４人と閉鎖子宮頸管群の１人、ｐ＝０．６２５）を我々のデータベース中に明確に記録した。これらの因子は前記二群の間で統計学的に差がないが、データを説明するために含まれることになった。
子宮頸管スワブ試料の収集およびＤＮＡ抽出：環境、病院職員、または女性生殖管の他の部分による汚染混入の機会を最小限にするため、膣鏡によって女性生殖管を開口して直ぐに他のあらゆる手順よりも前にＣａｌｇｉｓｗａｂタイプＩＩＩ（Ｐｕｒｉｔａｎ、ギルフォード、メイン州、米国）を使用して子宮頸管スワブ試料を収集した。確実に同じ解剖学的部位から試料採取し、比較するため、外子宮口の周縁側にある固定した位置（臨床医に対面して１２時の位置）から各子宮頸管スワブ試料を収集した。全ての試料を通した公正な比較の一貫性を維持するため、一人の臨床医が拡張子宮頸管群と閉鎖子宮頸管群から全ての試料を収集した。収集の変動を最小限にするため、３６０°一周させることによって各スワブを収集した。参加者または子宮内の胎児への感染リスクのあらゆる増加を最小限にするため、それらのスワブは子宮頸管粘液栓に接触することなく回収され、滅菌であった。また、スワブ試料の収集時に陰唇、または外子宮口以外の女性生殖管のどの部分にも接触しないように充分に気をつけた。処置室、試薬、および収集手順における細菌の汚染混入をモニタリングするため、各子宮頸管スワブと並行して、しかし患者に接触させずに別の陰性対照のスワブを収集した。
子宮頸管スワブおよび陰性対照のスワブを無菌ヌクレアーゼフリー水に浸漬し、抽出まで−８０℃で貯蔵した。確立された方法（Ｙｕａｎ， Ｃｏｈｅｎら著、２０１２年内の方法１）を用いてゲノムＤＮＡの抽出作業をスワブに行い、それによって女性生殖管に一般的に見られる細菌群を偏りなく表すことを確実にすることになった。この方法はムタノリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）による試料の前処理とカラムベースのＤＮＡ抽出方法（ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡミニキット、Ｑｉａｇｅｎ）を含んでいた。あらゆるバッチごとの変動を最小限にするため、同日に全ての試料を抽出した。
ＰＣＲ増幅と大量並列シーケンシング：前記子宮頸管スワブ試料は、不可避的に細菌のゲノムＤＮＡの中にヒトゲノムＤＮＡを含むことになるので、我々は全ての細菌が共通して所有するが、ヒトは所有しない１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を特異的に増幅した。ほぼ全ての細菌のゲノムＤＮＡ配列の増幅を容易にするため、我々は一対のＰＣＲプライマー、すなわち、よく保存された領域１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対して相補的であるＶ４とＶ５（Ｃｌａｅｓｓｏｎ， Ｗａｎｇら著、２０１０年）を使用することを選択した。我々は１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を含む最大の公開データベースであるリボソーマルデータベースプロジェクト（ＲＤＰ）（Ｗａｎｇ， Ｇａｒｒｉｔｙら著、２００７年）を使用して、公知の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列の９，２００種類を超える分類された（確定された）細菌分類群のうちの９７％超が我々の選択したＰＣＲプライマーペアによって理論的に増幅され得ることを確認した。したがって、このＰＣＲプライマーペアは本研究における体系的で偏りのない細菌群のプロファイリングに適用可能である。
我々は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の超可変領域Ｖ４およびＶ５に隣接するＶ４−Ｖ５ ＰＣＲプライマーペア（Ｃｌａｅｓｓｏｎ， Ｗａｎｇら著、２０１０年）を使用して各スワブ試料から抽出されたゲノムＤＮＡを増幅した。フォワードプライマーとリバースプライマーの配列はそれぞれ５’−［プライマーＡキー配列］［ＭＩＤ配列］ＡＹＴＧＧＧＹＤＴＡＡＡＧＮＧ−３’（配列番号１）と５’−［プライマーＢキー］ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＹＹＴＴＴＲＡＧＴＴＴ−３’（配列番号２）であり、プライマーＡキー配列、プライマーＢキー配列およびＭＩＤ配列は大量並列シーケンシングプラットフォームＧＸ−ＦＬＸ ４５４ Ｔｉｔａｎｉｕｍ（Ｒｏｃｈｅ）用の「アンプリコン実験デザインのための４５４シーケンシングシステムガイドライン、２０１１年７月」に記載されている。２．５ユニットのＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＨｉＦｉ ＰＣＲシステムｄＮＴＰａｃｋ、Ｒｏｃｈｅ）、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｎＭの各プライマーおよび２００mＭのｄＮＴＰを含む５０μＬの反応として各ＰＣＲを実施した。次のサーマルサイクリング条件、すなわち９５℃で２分間、続いて９５℃で３０秒間と４０℃で３０秒間と７２℃で１分間を３３サイクルと７２℃で５分間と２５℃で５分間の最後の伸長を使用してＰＴＣ−１００サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で全てのＰＣＲを行った。その後、我々はＰＣＲ産物を電気泳動にかけた。我々は３２の子宮頸管スワブ試料全てについて期待されるサイズの単一のＰＣＲアンプリコンを確認し、対応する３２陰性試薬対照全てについてＰＣＲアンプリコンが無いことを確認した。したがって、環境、試薬、および手順の中に、望まれない細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列のどのような汚染混入も無かった。
その後、我々は、前記３２子宮頸管スワブ試料から由来し、多重識別子（ＭＩＤ）配列とアダプター配列がＲｏｃｈｅの推奨する指示に従ってＰＣＲプライマーの５’末端を介して付加された３２例のＰＣＲ産物の全てを精製した。精製産物は、製造業者の指示に従ってＧＸ−ＦＬＸ ４５４ Ｔｉｔａｎｉｕｍ（Ｒｏｃｈｅ）を使用する、試料当たり平均で約１０，０００生シーケンシングリードを目標とした大量並列ゲノムシーケンシングを行った。
各試料について、Ｐｙｒｏｎｏｉｓｅ（Ｑｕｉｎｃｅ， Ｌａｎｚｅｎら著、２０１１年）をｍｏｔｈｕｒ（Ｓｃｈｌｏｓｓ， Ｗｅｓｔｃｏｔｔら著、２００９年）に実装してフローグラムレベルで生シーケンシングデータに対してノイズ除去を行った。リボソーマルデータベースプロジェクト（ＲＤＰ）トレーニングセット（バージョン９、２０１２年）に基づいて生リードに対してフローグラムノイズ除去を行い、品質と長さに関してフィルタリングを行い、キメラ除去を行い、アラインメントを行い、操作的分類単位への予備クラスター化とクラスター化を行い、その後でそれらの操作的分類単位を分類学的に分類した。
拡張子宮頸管群（ｎ＝１９）と閉鎖子宮頸管群（ｎ＝１３）との間の差次的に多く存在する細菌分類群の体系的特定：上記分析工程の全ての工程の後に我々は３２の子宮頸管スワブ試料中に３４２の細菌分類群を認めた。異なる試料間のリードカウントの変動を正規化するため、我々はｍｏｔｈｕｒ（Ｓｃｈｌｏｓｓ， Ｗｅｓｔｃｏｔｔら著、２００９年）を使用して無作為サブサンプリングを実施した結果、３２試料の各々が後続の分析用に７，５９４種類の処理済みリードを含んだ。あるいは、我々は試料中の各分類群のリードカウントをその試料に由来する総リードカウントの比率として表すことによっても正規化を行った。
拡張子宮頸管群と閉鎖子宮頸管群の間で差次的に多く存在する分類群を同定するため、我々はこの種のシーケンシングデータのために特別にデザインされている統計学的検定、すなわちＭｅｔａｓｔａｔｓ（Ｗｈｉｔｅ， Ｎａｇａｒａｊａｎら著、２００９年）を実施した。基本的にＭｅｔａｓｔａｔｓはノンパラメトリックｔ検定と、ある特定の分類群が平均して試料当たり１リード未満の割合で現れる（この種のデータの中の重大な変化の検出に難題をつきつけるいわゆる低カウント数問題）場合に、フィッシャーの正確検定を使用するためのヒューリスティックを特徴とする。
分類群の一回だけ現れる配列（シングルトン配列）の除去と偽発見率（ＦＤＲ）法を５％未満のＦＤＲで使用する多重検定のための調整（ＳｔｏｒｅｙおよびＴｉｂｓｈｉｒａｎｉ著、２００３年）の後に、１６分類が統計学的に有意に異なるまま残った（ｑ＜０．０５）。それらのうち、閉鎖子宮頸管群と比べて拡張子宮頸管群において９分類群（表２Ａ）が有意に増加し、７分類群（表２Ｂ）が有意に減少した。界レベルから属レベルでのこれらの１６ゲノム配列の最近縁分類学的分類が表３Ａおよび表３Ｂに記載されている。１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列が表４Ａおよび表４Ｂに記載されている。１６ＳリボソーマルＲＮＡデータベースに対するＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメント（２０１４年６月にＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴウェッブサイトを使用して実施された）に基づくこれらの１６ゲノム配列の最近縁種分類が表４Ｅおよび表４Ｆに記載されている。
試料収集時の最も近い在胎週数によって１：１でマッチングした拡張子宮頸管群（ｎ＝１０）と閉鎖子宮頸管群（ｎ＝１０）の間で差次的に多く存在する細菌分類群の体系的特定：二群の間の試料収集時の妊娠期間は統計学的に有意に異なってはいない。しかしながら、我々の分析に対する妊娠期間のどのような影響も最小限に抑えるため、我々は拡張子宮頸管群中の各女性を閉鎖子宮頸管群中の別の女性と試料収集時の最も近い在胎週数（２週間以内）によってマッチングした。また、二群の異なる試料サイズのどのような影響も最小限に抑えるため、我々は上記のマッチングを１：１の比率で実施した。最終的に我々は拡張子宮頸管群中の１０人の女性を閉鎖子宮頸管群中の１０人の女性と試料収集時の在胎週数に関してマッチさせることができた。
偽発見率（ＦＤＲ）法を５％未満のＦＤＲで使用する多重検定のための調整（ＳｔｏｒｅｙおよびＴｉｂｓｈｉｒａｎｉ著、２００３年）の後に２０分類が統計学的に有意に異なるまま残った（ｑ＜０．０５）。それらのうち、閉鎖子宮頸管群と比べて拡張子宮頸管群において１５分類群（表２Ｃ）が有意に増加し、５分類群（表２Ｄ）が有意に減少した。界レベルから属レベルでのこれらの２０ゲノム配列の最近縁分類学的分類が表３Ｄおよび表３Ｃに記載されている。１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列が表４Ｃおよび表４Ｄに記載されている。１６ＳリボソーマルＲＮＡデータベースに対するＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメント（２０１４年６月にＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴウェブサイトを使用して実施された）に基づく１６ゲノム配列の最近縁種分類が表４Ｇおよび表４Ｈに記載されている。
差次的に多く存在する細菌分類群のリストのうちの選択されたメンバーによる様々な転帰についての予測成績。我々は２種類の検査、すなわち差次的増加細菌検査（ＤＩＢＴ）１とＤＩＢＴ２を構築するために、それぞれ表２Ａの９分類群の全てと表２Ｃの１５分類群の全てを選択した。
ＤＩＢＴ１およびＤＩＢＴ２は大量並列ゲノムシーケンシングデータまたは、より好ましくは、所与の細菌分類群の存在を検出するための種特異的ＰＣＲのデータを使用してもよい。これら９種類または１５種類の差次的に増加した分類群のうちのいずれかがその試料に存在する場合、我々はそれをそれぞれＤＩＢＴ１陽性またはＤＩＢＴ２陽性と定義した。他方、これらの９分類群または１５分類群の全てが試料に存在しない場合、我々はそれをそれぞれＤＩＢＴ１陰性またはＤＩＢＴ２陰性と定義した。
ＤＩＢＴ１またはＤＩＢＴ２と有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰との間の関連性を調査するため、我々はフィッシャーの正確検定を行った。重要な妊娠および新生児転帰の予測におけるＤＩＢＴ１またはＤＩＢＴ２の能力を調査するため、我々はこれらの転帰の予測におけるＤＩＢＴ１またはＤＩＢＴ２の真陽性、偽陽性、偽陰性および真陰性を算出した（それぞれ表５Ａおよび表５Ｂ）。また、我々はこれらの転帰の予測におけるＤＩＢＴ１およびＤＩＢＴ２の感度、特異度、陽性的中率および陰性的中率を算出した（それぞれ表５Ａおよび表５Ｂ）。
ＤＩＢＴ１と進行した子宮頸管拡張（フィッシャーの正確検定、ｐ＝０．０２８）、２８週未満での自然早産（ｐ＝０．００２３）、３４週未満での自然早産（ｐ＝０．０００６５）、２８週未満での早産（ｐ＝０．００５７）、３４週未満での早産（ｐ＝３．２×１０−６）および脳室内出血（ｐ＝０．０１）との間に有意な関連性が存在する。特筆すべきことに、自然早産の７事例の全てがＤＩＢＴ１陽性として検出された（偽陰性無し）。これも特筆すべきことに、ＤＩＢＴ１陽性と分類された１３事例の全てのうち、全ての事例が３４週未満での早産を経験した（偽陰性無し）。これらの早産の全てが子癇前症、子宮内成長遅延、胎児染色体異常）によるものではなかった。したがって、我々は、我々によって本研究において特定され、ＤＩＢＴ１に含まれるように選択されたこれらの「異常細菌叢」のうちの１種類以上の感染によってこれら１３例の早産が引き起こされたのではないかと考える。
ＤＩＢＴ２に関しては、ＤＩＢＴ２と２８週未満での自然早産（ｐ＝０．００２３）、自然３４週未満での早産（ｐ＝０．０００６５）、２８週未満での早産（ｐ＝０．００５７）、３４週未満での早産（ｐ＝０．００３２）との間で有意な関連性が認められる。特筆すべきことに、３４週未満での自然早産の７事例の全てがＤＩＢＴ２によって陽性として検出された（偽陰性無し）。
別の研究（研究Ｂ）において、我々は、短い子宮頸管を有するか、または正常な長さの子宮頸管を有する女性からではあるが、マッチする妊娠期間で収集された子宮頸管スワブ試料について同様の分析を実施した（表６）。各試料について、ＤＮＡを抽出し、Ｖ４Ｖ５プライマーによってＰＣＲ増幅し、そしてＧＳ−ＦＬＸ ４５４分析にかけた。偽発見率（ＦＤＲ）法を５％未満のＦＤＲで使用する多重検定のための調整（ＳｔｏｒｅｙおよびＴｉｂｓｈｉｒａｎｉ著、２００３年）の後に、２４分類が統計学的に有意に異なるまま残った（ｑ＜０．０５）。それらのうち、正常長子宮頸管群と比べて短縮子宮頸管群において１７分類群（表７）が有意に増加し、７分類群（示されず）が有意に減少した。１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列が表８に記載されている。１６ＳリボソーマルＲＮＡデータベースに対するＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメント（２０１４年６月にＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴウェブサイトを使用して実施された）に基づくこれらの１７ゲノム配列の最近縁種分類が表９に記載されている。
差次的に多く存在する細菌分類群のリストのうちの選択されたメンバーによる様々な転帰についての予測成績。我々は別の検査、すなわち差次的増加細菌検査（ＤＩＢＴ）３を構築するために表７の１７分類群の全てを選択した。
ＤＩＢＴ３は大量並列ゲノムシーケンシングデータまたは、より好ましくは、所与の細菌分類群の存在を検出するための種特異的ＰＣＲのデータを使用してもよい。これら１７種類の差次的に増加した分類群のうちのいずれかがその試料に存在する場合、我々はそれをＤＩＢＴ３陽性と定義した。他方、これらの１７分類群の全てが試料に存在しない場合、我々はそれをそれぞれＤＩＢＴ３陰性と定義した。ＤＩＢＴ３陽性の結果と有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰の関連性が表１０に示されている。
ＤＩＢＴ３と早期子宮頸管拡張（フィッシャーの正確検定、ｐ＝０．０００２２）、３４週未満での自然早産（ｐ＝０．０４９）、３４週未満での早産（ｐ＝０．０４９）との間に有意な関連性が存在する。特筆すべきことに、自然早産の３事例の全てがＤＩＢＴ３陽性として検出された（偽陰性無し）。
本明細書において提供される細菌マーカーは、妊娠１３週に早期に実施される分子検査に基づいて有害な妊娠転帰および有害な新生児転帰を正確に予測するために使用された（表５Ａ、表５Ｂおよび表１０）。本明細書に記載される方法により、綿密なモニタリングまたは新生児集中治療付きの三次治療ユニットへの時宜を得た移送などの早期介入が容易になる。
実施例２：臨床介入後に自然早産を起こす頸管不全症患者の特定用の子宮頸管微生物叢の識別特性
臨床介入（セルクラージュ／ペッサリー）に対して異なる反応を示す頸管不全症（ＣＩ）患者の子宮頸管に定着している細菌分類群は体系的に調査されていない。我々は、大量並列シーケンシングを用い、順次リクルートされた単胎妊娠ＣＩ患者とマッチングされたＣＩではない女性から介入前に得られた子宮頸管スワブ試料につき９，６００種類を超える分類群の存在量を調査した。我々は、それらの子宮頸管微生物叢が非ＣＩ対照の子宮頸管微生物叢と比較してＣＩ患者において変化していることを観察した。特筆すべきことに、我々は「介入後の正期産（３７週以上）」を起こした患者と比較して「介入後の自然早産（３４週未満、ｓＰＴＢ）」を起こした患者において差次的に多く存在する６種類の分類群を特定した。我々は、１．１５を超えるｌｏｇ１０（これらの６分類群の総存在量）を陽性の結果と規定し、ＬＡ６を使用して「介入後のｓＰＴＢ」を起こした１人の患者を除く全員（９／１０＝９０％）を正確に分類した。偽陽性は無かった（０／１５＝０％）。ＬＡ６陽性患者ではＬＡ６陰性患者と比較して介入後の無分娩の維持期間が短かった［介入と分娩の間の日数の中央値、１０日に対して１２６日；ログランク検定、ｐ＜０．００００１；ハザード比、６．３４；９５％信頼区間、１．５１〜２６．６］。また、ＬＡ６陽性患者はＬＡ６陰性の対応者よりも早く分娩した［２３．７週に対して３８．４週の分娩時の妊娠期間の中央値；ログランク検定、ｐ＜０．０００１；ハザード比、６．２４；９５％信頼区間、１．５０〜２５．９］。我々の研究は、セルクラージュ／ペッサリー介入後の妊娠の予後予測情報を提供するために介入前子宮頸管微生物叢を使用する可能性を強調する。
序論
頸管不全症（ＣＩ）は、新生児の罹病および周産期死亡と関連する早産（ＰＴＢ）のリスク因子である。頸管不全症は妊娠第三期に代わり、妊娠第二期に早期拡張子宮頸管（子宮頸管拡張、１ｃｍ〜５ｃｍ）または早期短縮子宮頸管（２５ｍｍ未満の子宮頸管長）として罹患女性に現れる。ＣＩ患者の無力化子宮頸管への外科的セルクラージュまたは子宮頸管ペッサリーの留置による臨床介入（Ｓｈｉｒｏｄｋａｒ著、Ａｎｔｉｓｅｐｔｉｃ誌、第５２巻、２９９〜３００頁（１９５５年）、Ｃｒｏｓｓ著、Ｌａｎｃｅｔ誌、第２７４巻、１２７頁（１９５９年））は、２８週未満のＰＴＢの比率（Ｐｅｒｅｉｒａら著、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、第１９７巻、４８３ ｅ４８１〜４８８頁（２００７年））または３４週未満のＰＴＢの比率（Ａｌｔｈｕｉｓｉｕｓら著、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、第１８９巻、９０７〜９１０頁（２００３年）、Ｇｏｙａら著、Ｌａｎｃｅｔ誌、第３７９巻、１８００〜１８０６ （２０１２年））を低下させ、新生児生存率を上昇させ（３）、入院と分娩の間の間隔を増加させる（Ｐｅｒｅｉｒａら著、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、第１９７巻、４８３ ｅ４８１〜４８８頁（２００７年））ことが示されている。
それでもなお、子宮頸管介入は全てのＣＩ患者に有益であるわけではない。特に、羊水内感染（ＩＡＩ）を有するＣＩ患者ではセルクラージュ介入の後に３４週未満のＰＴＢの比率が、同じ介入を受けたがＩＡＩを有していない患者と比較して４倍高くなった（Ｒｏｍｅｒｏら著、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、第１６７巻、１０８６〜１０９１頁（１９９２年））。ＩＡＩが除外される場合にのみセルクラージュ介入を受けた患者では、３４週未満のＰＴＢの比率がＩＡＩについて検査することなくその介入を受けた患者と比較して低くなった（Ｍａｙｓら著、Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、第９５巻、６５２〜６５５頁（２０００年））。ＩＡＩはＣＩ患者で（３８％〜５１％）罹患率が高いので（Ｒｏｍｅｒｏら著、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、第１６７巻、１０８６〜１０９１頁（１９９２年）、Ｍａｙｓら著、Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、第９５巻、６５２〜６５５頁（２０００年））、専門家は微生物を検出するためのセルクラージュ前の羊水穿刺によってＩＡＩを除外することを考慮するように臨床医に提言している（Ｂｅｒｇｈｅｌｌａら著、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、第２０９巻、１８１〜１９２頁（２０１３年）、Ａｉｒｏｌｄｉら著、Ａｍ Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ誌、第２６巻、６３〜６８頁（２００９年））。しかしながら、羊水穿刺は侵襲性であり、小さいながら有限の胎児損失の機会に関連する。したがって、我々はＣＩ患者における子宮頸管細菌叢を調査し、微生物叢の発現を子宮頸管介入の転帰と相互に関連づけた。それらの結果は子宮頸管スワブ試料採取が、ＣＩ患者にとって相対的に非侵襲性な羊水穿刺の代替法であり得ることを示す。
大量並行シーケンシング（ＭＰＳ）は、培養に依存しないことを容易にし、よって、異なる体の部位の微生物叢の感度が高く包括的な観察を提供してきた。従来、羊膜腔の内側に位置する胎盤は無菌であると考えられてきた。これとは反対に、この雑誌において公表されたＭＰＳベースの微生物叢およびメタゲノム研究から、胎盤は、母体の出産前感染と早産の遠い経歴と関連して変化する少量の微生物叢を有することが明らかにされた（Ａａｇａａｒｄら著、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ誌、第６巻、２３７ｒａ２６５頁（２０１４年））。出産前子宮頸管微生物叢とＣＩ患者の早産転帰との間の関連性を調査するために本研究を実施した。
ＭＰＳによって生成される高解像度データとそれらのデータから推論され得る量的情報も女性の健康における微生物についての我々の知識を拡大した。５つの主要なクラスの細菌群（コミュニティーグループ）が出産年齢の非妊婦の膣管において認められた。コミュニティーグループＩＶにおいて共通して見られるように、非ラクトバチルス種の膣内割合が増加した女性では彼女らのヌージェントスコア（Ｎｕｇｅｎｔ ｓｃｏｒｅ）、すなわち、細菌性膣症を有する女性を特定するために一般的に用いられる診断用係数も増加した（Ｒａｖｅｌら著、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ誌、第１０８巻、４６８０〜４６８７頁（２０１１年））。特筆すべきことに、細菌性膣症を有する女性は拡張した子宮頸管（調整オッズ比、４．９；９５％信頼区間２．２〜１０．９）を有する可能性が高かった（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋら著、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、第１９４巻、１１６８〜１１７６頁（２００６年））。非妊婦における膣微生物叢の長期にわたる研究から、幾つかの細菌群が短期間で著しく変化する一方で他の細菌群は比較的に安定であることが明らかにされた（Ｇａｊｅｒら著、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ誌、第４巻、１３２ｒａ１５２頁（２０１２年））。そのことは、安定性が低いコミュニティーほど病原性生物による侵入を受けやすいという生態学の理論から合理的に説明される（Ｄｕｎｓｔａｎら著、Ｅｃｏｌｏｇｙ誌、第８７巻、２８４２〜２８５０頁（２００６年））。本研究ではＣＩ患者における子宮頸管微生物叢が目的に適合したＣＩではない女性の子宮頸管微生物叢と比較された。
結果
我々は３４人の頸管不全症（ＣＩ）患者をリクルートし、セルクラージュ／ペッサリー処置の前に各人から子宮頸管スワブ試料を得た。本研究に参加した妊娠第二期の単胎妊婦の全員が、子宮頸管スワブ試料採取の間に（ｉ）無痛の進行した子宮頸管拡張（１．５ｃｍ〜５．０ｃｍ）および／または子宮頸管短縮（２５ｍｍ未満の子宮頸管長）を有し、（ｉｉ）無傷の卵膜を有し、且つ、（ｉｉｉ）分娩収縮を有しなかった。
これらのＣＩ患者の全員が早期拡張子宮頸管／早期短縮子宮頸管のためにそれぞれセルクラージュ介入／ペッサリー介入を受けた。これらの患者を分娩から１か月後まで追跡調査した。子癇前症、胎児ジストレス、成長遅延、胎児染色体異常、または構造異常に起因する医原性ＰＴＢを合併した９例の妊娠を除外した。残りの２５人のＣＩ患者のうち、１５人の女性が介入後に正期産（ＴＢ、妊娠３７週またはその後に分娩した）を起こし、１０人が介入後に自然早産（ｓＰＴＢ、３４週未満の時点で分娩した）を起こした（図１Ａ）。これらのうち、７人が呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、脳室内出血（ＩＶＨ）および未熟児網膜症（ＲＯＰ）または周産期死亡などの新生児の罹病を伴った（図１Ａ）。
大量並列による細菌分類群のプロファイリング
臨床介入前に収集された各子宮頸管スワブ試料について細菌のＤＮＡの抽出、１６ＳリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子のＰＣＲ増幅、およびアンプリコンの大量並列シーケンシング（Ｔｉｔａｎｉｕｍ、ＧＳ−ＦＬＸ ４５４、Ｒｏｃｈｅ）を行った。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域とＶ５領域を標的とするＰＣＲプライマーにより、分析される１６Ｓ ｒＲＮＡ配列が知られている９，６００種類を超えるよく確定された細菌を増幅することができた（Ｃｌａｅｓｓｏｎら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ誌、第３８巻、ｅ２００頁（２０１０年））。この範囲は女性生殖管について公表された微生物叢研究の大半よりも広範囲であった。
シーケンシングエラーから生じる「新規」分類群の偽検出を最小限にするため、よく確立された方法（Ｓｃｈｌｏｓｓら著、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ誌、第７５巻、７５３７〜７５４１頁（２００９年）、Ｑｕｉｎｃｅら著、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第６巻、６３９〜６４１頁（２００９年））を用いて生シーケンシングリード（６８万リード）に対してノイズ除去を行い、品質に関してフィルタリングを行って処理済みリード（５４万リード）にした。概して２５試料の各々を２２，０００の処理済み高品質リードの深度でシーケンシングした。そのようなシーケンシング深度は女性生殖管について公表された微生物叢研究の大半よりも大きかった。
さらに、少なくとも９７％の配列同一性を有する全ての試料の処理済みリードを１つの操作的分類単位（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔ）（Ｏｔｕ、すなわち細菌分類群）としてクラスター化した。全体として、１５２細菌分類群が２５例の子宮頸管の全てで検出された。異なるリードカウントでシーケンシングされた試料間のより公正な比較を可能にするため、我々は累積和スケーリング（ＣＳＳ）正規化（Ｐａｕｌｓｏｎら著、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第１０巻、１２００〜１２０２頁（２０１３年））を行い、各分類群についての存在量値（単位：リードカウント）をｌｏｇ１０スケールのそのＣＳＳ正規化リードカウント（すなわち、ｌｏｇ（存在量）値）として表した。
頸管不全症患者において非常に大量に存在する細菌分類群
図１Ｂは１０例の「介入後のｓＰＴＢ」子宮頸管において観察された１０種類の最も大量に存在する細菌分類群を示している。主に乳酸桿菌が占める健康な女性生殖管とは対照的に、ガードネレラ属のメンバー（Ｏｔｕ４）が「処置後のｓＰＴＢ」子宮頸管において最も大量に存在する細菌分類群として特定された［図１Ｂ、１行目、すなわち、１０例の「介入後のｓＰＴＢ」子宮頸管において最大の総ｌｏｇ（存在量）値を有する分類群］。実際にはこの群の中の１０種類の最も多く存在する細菌分類群のうちの７つの分類群が非ラクトバチルス属、すなわちガードネラ、２種類のスネアチア、アエロコッカス、メガスファエラ、シュードモナス、およびアナエロコッカス（図１Ｂ、１行目から１０行目および「ｓＰＴＢ」の下の列）として分類された。
比較すると、「処置後のＴＢ」子宮頸管におけるそれら１０種類の最も多く存在する細菌分類群のうちの５つの分類群だけが非ラクトバチルス属として分類されていた（図１Ｃ、１行目から１０行目および「ＴＢ」の下の列）。特筆すべきことに、３種類の最も多く存在する細菌がラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・イナース、およびラクトバチルス・ジェンセニイイとして特定され、それらは健康な女性生殖管において主に占められてることが知られている（Ｒａｖｅｌら著、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ誌、第１０８巻、４６８０〜４６８７頁（２０１１年））。
介入に対して異なる反応を有する患者において差次的に多く存在する分類群
重要なことに、我々は「処置後のｓＰＴＢ」群と「処置後のＴＢ」群との間で差次的に多く存在する７種類の細菌分類群を特定した（図１Ｄ）。それら７種類の分類群、すなわちスネアチア（Ｏｔｕ１１）、パルビモナス（Ｏｔｕ１６）、ウレアプラズマ（Ｏｔｕ５６）、アトポビウム（Ｏｔｕ４２）、ペプトニフィラス（Ｏｔｕ２８）、メガスファエラ（Ｏｔｕ４７）およびパラエゲルセエラ（Ｐａｒａｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）（Ｏｔｕ４０）のｌｏｇ（存在量）値は前述の群におけるものよりも高かった（マン・ホイットニーの順位和検定、ｐ＜０．０５；偽発見率（ＦＤＲ）法を５％未満のＦＤＲで使用して多重検定補正を行った）（図１Ｄ、１行目から７行目、最後の列）。顕著なことに、これらのうち、後の６種類の分類群は「処置後のＴＢ」群ではなく「処置後のｓＰＴＢ」群においてのみ独占的に認められた［図１Ｄ、２行目から７行目、「ｓＰＴＢ」列の下の多数のｌｏｇ（存在量）値は０以上であるが、「ＴＢ」列の下の全てのｌｏｇ（存在量）値は０である］。
介入後の差次的に大量に存在する分類群と転帰
後方の６種類の差次的に多く存在する分類群（マン・ホイットニー、ｐ＜０．０１；表１１）の存在量を簡潔化するため、我々はｌｏｇ１０（それら６種類の差次的に多く存在する分類群の総存在量）を表すＬＡ６値を各子宮頸管スワブ試料について算出した。簡単に説明すると、各試料について我々はパルビモナス（Ｏｔｕ１６）、ウレアプラズマ（Ｏｔｕ５６）、アトポビウム（Ｏｔｕ４２）、ペプトニフィラス（Ｏｔｕ２８）、メガスファエラ（Ｏｔｕ４７）およびパラエゲルセエラ（Ｐａｒａｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ）（Ｏｔｕ４０）についてのその試料のｌｏｇ（存在量）値の各々を一般的な線形スケールに変換し直した。一般的スケールの６つの存在量値を合算した後で我々はその総存在量を対数変換し、ｌｏｇ１０スケールのＬＡ６値を表した。
ＬＡ６の中央値は「処置後のｓＰＴＢ」群と「処置後のＴＢ」群でそれぞれ２．６１と０．７８であった（図２Ａ）。ＬＡ６中央値は前述の群では３．３６倍上昇することが示されている（マン・ホイットニー、ｐ＜０．０００１）。処置を受けたＣＩ患者の中からの「処置後のｓＰＴＢ」群の特定における最適な閾値を見つけ出すため、我々は受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線をプロットした［ＲＯＣ曲線下面積（９５％信頼区間）、０．９５（０．８４〜１．０６）；ｐ＝０．０００２］。我々は陽性の結果を規定する閾値として１．１５を超えるＬＡ６を使用し、１人の「介入後のｓＰＴＢ」ＣＩ患者を除く全員（９／１０＝９０％の感度）を同定することができた。偽陽性は無かった（１−０／１５＝１００％の特異度）。
重要なことに、ＬＡ６陽性患者はＬＡ６陽性患者よりも臨床介入後に早く分娩した（図２Ｂ、２３．７週に対して３８．４週の分娩時の妊娠期間の中央値；９５％信頼区間、２０．６週〜２５．４週に対して３８．０週〜３８．７週；カイ二乗、３２．３５２；ｄｆ、１；ログランク検定、ｐ＜０．０００１；ハザード比、６．２４；９５％信頼区間、１．５０〜２５．９；ＭｅｄＣａｌｃ、バージョン１４．１２）。これも重要なことに、ＬＡ６陽性患者は彼女らのＬＡ６陰性の対応者よりも介入後から短い期間の間に分娩した（図２Ｃ、介入と分娩の間の日数の中央値、１０日に対して１２６日；９５％信頼区間、８日〜３２日に対して１１２日〜１３４日；カイ二乗、３２．５２０；ｄｆ、１；ログランク検定、ｐ＜０．００００１；ハザード比、６．３４；９５％信頼区間、１．５１〜２６．６）。
考察
本研究において同定された子宮頸管微生物叢
我々はＣＩ患者における７種類の細菌分類群の存在量が「臨床介入後のＴＢ」を起こした女性と比較して「臨床介入後のｓＰＴＢ」を起こした女性において有意に増加することを示した。さらに、我々はそれら６種類の最も有意に増加した分類群の総存在量値を表すＬＡ６値を各ＣＩ患者について算出した。セルクラージュ／ペッサリー介入の前に得られた２５子宮頸管スワブ試料のＬＡ６値に基づき、我々は１５人の「介入後のＴＢ」患者において、全く偽陽性を含むことなく（１−０／１５＝１００％の特異度）、１１人の「介入後のｓＰＴＢ」ＣＩ患者の中から１０人を正確に特定した（９／１０＝９０％の感度）。
本研究は、アジア人妊婦の試料サイズによって限りがあり、且つ、遡及的研究デザインを伴った。それでもなお、本研究は早産の重大なリスクであるＣＩと関連する、自明ではない焦点を合わせた細菌分類群パネルを提供した。本研究において特定された子宮頸管微生物叢の識別特性、すなわちＬＡ６がセルクラージュ／ペッサリー介入の後に予後予測情報を提供することが示された。一見して、検査でＬＡ６について陽性になったＣＩ患者には検査で陰性になった患者よりも臨床介入後の有意に早い妊娠期間で分娩する増加したリスクがある（２３．７週に対して３８．４週；ハザード比、６．２４；９５％信頼区間、１．５０〜２５．９）。それだけではなく、ＬＡ６陽性患者には対応するＬＡ６陰性者よりも、介入後に非常に早く分娩する増加したリスクもある（１０日に対して１２６日；ハザード比、６．３４；９５％信頼区間、１．５１〜２６．６）。
材料と方法
参加者の動員
本研究の実施についての倫理承認を、それぞれの治験審査委員会から得た。香港中文大学プリンス・オブ・ウェールズ病院産婦人科または韓国ソウルの翰林大学産婦人科に通院し、且つ、次の試験対象患者基準、すなわち（ｉ）妊娠第二期における無痛子宮頸管拡張（１．０ｃｍ〜５．０ｃｍ）、および（ｉｉ）無傷の卵膜、および（ｉｉｉ）分娩収縮無し（１０分毎に一回）、を満たすアジア人妊婦からインフォームドコンセントを得た。女性が（ａ）多胎妊娠（２人以上の胎児）を有する場合、または（ｂ）子宮頸管スワブ試料収集の４８時間前に性交があったか、または膣用外用薬を塗布した場合、または（ｃ）子宮頸管スワブ試料収集の３０日前に抗生剤／抗真菌剤を使用した場合、それらの女性は本研究から除外された。
子宮頸管スワブ収集
セルクラージュ処置の前に、外子宮口でＤａｃｒｏｎスワブを一回３６０°回転させることでＣＩ患者から子宮頸管スワブ試料を収集した。拡張した子宮頸管について、臨床医に対面して１２時の位置で外子宮口からスワブを得た。膣鏡によって生殖管を開口し、直ぐに他のあらゆる手順よりも前にそのスワブ試料を収集した。消毒技術を適用した。スワブが子宮頸管の指定部位以外の生殖管のどの部分（例えば、膣、陰唇）とも接触しないように充分に気をつけた。
細菌のＤＮＡの抽出
我々は、試料中の細菌分類群の好適な提示を維持するために最適化された、公表されているプロトコルに従って各試料の細菌のゲノムＤＮＡを抽出した（Ｙｕａｎら著、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ誌、第７巻、ｅ３３８６５頁（２０１２年））。
分類学的分類
各Ｏｔｕはリボソーマルデータベースプロジェクト（ＲＤＰ）ナイーブベイズｒＲＮＡ分類（バージョン２．９、２０１４年９月、ＲＤＰ １６Ｓ ｒＲＮＡトレーニングセット１０）を使用して属レベルで分類学的に分類されている。ラクトバチルスは、種についての情報を得るためにＢＬＡＳＴ（最高スコア）およびＭＯＬＥ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴマッチの最適多重アラインメント）を使用して１６Ｓ ｒＲＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に対してさらにマッチさせる。
参照文献
Ａａｇａａｒｄ， Ｋ．， Ｊ． Ｍａ， Ｋ． Ｍ． Ａｎｔｏｎｙ， Ｒ． Ｇａｎｕ， Ｊ． Ｐｅｔｒｏｓｉｎｏ ａｎｄ Ｊ． Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ （２０１４）． “Ｔｈｅ ｐｌａｃｅｎｔａ ｈａｒｂｏｒｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．” Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ， ６（２３７）： ２３７−２６５．
Ａａｇａａｒｄ， Ｋ．， Ｋ． Ｒｉｅｈｌｅ， Ｊ． Ｍａ， Ｎ． Ｓｅｇａｔａ， Ｔ． Ａ． Ｍｉｓｔｒｅｔｔａ， Ｃ． Ｃｏａｒｆａ， Ｓ． Ｒａｚａ， Ｓ． Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ， Ｉ． Ｖａｎ ｄｅｎ Ｖｅｙｖｅｒ， Ａ． Ｍｉｌｏｓａｖｌｊｅｖｉｃ， Ｄ． Ｇｅｖｅｒｓ， Ｃ． Ｈｕｔｔｅｎｈｏｗｅｒ， Ｊ． Ｐｅｔｒｏｓｉｎｏ ａｎｄ Ｊ． Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ （２０１２）． “Ａ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆｔｈｅ ｖａｇｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．” ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（６）： ｅ３６４６６．
Ｃｌａｅｓｓｏｎ， Ｍ． Ｊ．， Ｑ． Ｗａｎｇ， Ｏ． Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｒ． Ｇｒｅｅｎｅ−Ｄｉｎｉｚ， Ｊ． Ｒ． Ｃｏｌｅ， Ｒ． Ｐ． Ｒｏｓｓ ａｎｄ Ｐ． Ｗ． Ｏ’Ｔｏｏｌｅ （２０１０）． “Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔａｎｄｅｍ ｖａｒｉａｂｌｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｒｅｇｉｏｎｓ．” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８（２２）： ｅ２００．
Ｇａｊｅｒ， Ｐ．， Ｒ． Ｍ． Ｂｒｏｔｍａｎ， Ｇ． Ｂａｉ， Ｊ． Ｓａｋａｍｏｔｏ， Ｕ． Ｍ． Ｓｃｈｕｔｔｅ， Ｘ． Ｚｈｏｎｇ， Ｓ． Ｓ． Ｋｏｅｎｉｇ， Ｌ． Ｆｕ， Ｚ． Ｓ． Ｍａ， Ｘ． Ｚｈｏｕ， Ｚ． Ａｂｄｏ， Ｌ． Ｊ． Ｆｏｒｎｅｙ ａｎｄ Ｊ． Ｒａｖｅｌ （２０１２）． “Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｖａｇｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．” Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４（１３２）： １３２−ｌ５２．
Ｇｅｒｂｅｒ， Ｓ．， Ｙ． Ｖｉａｌ， Ｐ． Ｈｏｈｌｆｅｌｄ ａｎｄ Ｓ． Ｓ． Ｗｉｔｋｉｎ （２００３）． “Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ ｉｎ ｓｅｃｏｎｄ−ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．” Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １８７（３）： ５１８−５２１．
Ｇｒａｙ， Ｄ． Ｊ．， Ｈ． Ｂ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｊ． Ｍａｌｏｎｅ ａｎｄ Ｒ． Ｂ． Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊｒ． （１９９２）． “Ａｄｖｅｒｓｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ．” Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ １２（２）： １１１−１１７．
Ｈｕｍｍｅｌｅｎ， Ｒ．， Ａ． Ｄ． Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ， Ｊ． Ｍ． Ｍａｃｋｌａｉｍ， Ｒ． Ｊ． Ｄｉｃｋｓｏｎ， Ｊ． Ｃｈａｎｇａｌｕｃｈａ， Ｇ． Ｂ． Ｇｌｏｏｒ ａｎｄ Ｇ． Ｒｅｉｄ （２０１０）． “Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｇｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｏｆ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ＨＩＶ．” ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（８）： ｅ１２０７８．
Ｏｈ， Ｋ． Ｊ．， Ｓ． Ｅ． Ｌｅｅ， Ｈ． Ｊｕｎｇ， Ｇ． Ｋｉｍ， Ｒ． Ｒｏｍｅｒｏ ａｎｄ Ｂ． Ｈ． Ｙｏｏｎ （２０１０）． “Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｅａｐｌａｓｍａｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．” Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔ Ｍｅｄ ３８（３）： ２６１−２６８．
Ｏｗｅｎ， Ｊ．， Ｇ． Ｈａｎｋｉｎｓ， Ｊ．Ｄ． ｌａｍｓ， Ｖ． Ｂｅｒｇｈｅｌｌａ， Ｊ． Ｓ． Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ， Ａ． Ｐｅｒｅｚ−Ｄｅｌｂｏｙ， Ｒ． Ｓ． Ｅｇｅｎｎａｎ， Ｄ． Ａ． Ｗｉｎｇ， Ｍ． Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， Ｒ． Ｓｉｌｖｅｒ， Ｓ．Ｍ． Ｒａｍｉｎ， Ｅ． Ｒ． Ｇｕｚｍａｎ， Ｍ． Ｇｏｒｄｏｎ， Ｈ． Ｙ． Ｈｏｗ， Ｅ． Ｊ． Ｋｎｕｄｔｓｏｎ， Ｊ． Ｍ． Ｓｚｙｃｈｏｗｓｋｉ， Ｓ． Ｃｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｊ． Ｃ． Ｈａｕｔｈ （２００９）． “Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｃｅｒｃｌａｇｅ ｆｏｒ ｐｒｅｔｅｒｍ ｂｉｒｔｈ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ ｍｉｄｔｒｉｍｅｓｔｅｒ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｎｇｔｈ．” Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、２０１（４）： ３７５ ｅ３７１−３７８．
Ｐｅｒｎｉ， Ｓ．Ｃ．， Ｓ． Ｖａｒｄｈａｎａ， Ｉ． Ｋｏｒｎｅｅｖａ， Ｓ． Ｌ． Ｔｕｔｔｌｅ， Ｌ． Ｒ． Ｐａｒａｓｋｅｖａｓ， Ｓ． Ｔ． Ｃｈａｓｅｎ， Ｒ． Ｂ． Ｋａｌｉｓｈ ａｎｄ Ｓ． Ｓ． Ｗｉｔｋｉｎ （２００４）． “Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ ａｎｄ Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ ｉｎ ｍｉｄｔｒｉｍｅｓｔｅｒ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ： ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｏｕｔｃｏｍｅ．” Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、１９１（４）： １３８２−１３８６．
Ｑｕｉｎｃｅ， Ｃ．， Ａ． Ｌａｎｚｅｎ， Ｒ． Ｊ． Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ａｎｄ Ｐ． Ｊ． Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ （２０１１）． “Ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｎｏｉｓｅ ｆｒｏｍ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｃｏｎｓ．” ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １２： ３８．
Ｒａｖｅｌ， Ｊ．， Ｐ． Ｇａｊｅｒ， Ｚ． Ａｂｄｏ， Ｇ． Ｍ． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｓ． Ｓ． Ｋｏｅｎｉｇ， Ｓ． Ｌ． ＭｃＣｕｌｌｅ， Ｓ． Ｋａｒｌｅｂａｃｈ， Ｒ． Ｇｏｒｌｅ， Ｊ． Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｃ． Ｏ． Ｔａｃｋｅｔ， Ｒ． Ｍ． Ｂｒｏｔｍａｎ， Ｃ． Ｃ． Ｄａｖｉｓ， Ｋ． Ａｕｌｔ， Ｌ． Ｐｅｒａｌｔａ ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｆｏｒｎｅｙ （２０１１）． “Ｖａｇｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｏｆ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ−ａｇｅ ｗｏｍｅｎ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８ Ｓｕｐｐｌ １： ４６８０−４６８７．
Ｒｏｍｅｒｏ， Ｒ．， Ｒ． Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｗ． Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ， Ｆ． Ｂｒａｎｄｔ， Ｍ． Ｒａｍｉｒｅｚ， Ｙ． Ｓｏｒｏｋｉｎ， Ｍ． Ｍａｚｏｒ， Ｍ． Ｃ． Ｔｒｅａｄｗｅｌｌ ａｎｄ Ｄ． Ｂ． Ｃｏｔｔｏｎ （１９９２）． “Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｂｏｒ． ＶＩＩＩ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｃａｖｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ： ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．” Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ誌、１６７（４ Ｐｔ １）： １０８６−１０９１．
Ｓｃｈｌｏｓｓ， Ｐ． Ｄ．， Ｓ． Ｌ． Ｗｅｓｔｃｏｔｔ， Ｔ． Ｒｙａｂｉｎ， Ｊ． Ｒ． Ｈａｌｌ， Ｍ． Ｈａｒｔｍａｎｎ， Ｅ． Ｂ． Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ， Ｒ． Ａ． Ｌｅｓｎｉｅｗｓｋｉ， Ｂ． Ｂ． Ｏａｋｌｅｙ， Ｄ． Ｈ． Ｐａｒｋｓ， Ｃ． Ｊ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｊ． Ｗ． Ｓａｈｌ， Ｂ． Ｓｔｒｅｓ， Ｇ． Ｇ．， Ｔｈａｌｌｉｎｇｅｒ， Ｄ． Ｊ． Ｖａｎ Ｈｏｒｎ ａｎｄ Ｃ． Ｆ． Ｗｅｂｅｒ （２００９）． “Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｏｔｈｕｒ： ｏｐｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ， ｐｌａｔｆｏｒｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ， ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ．” Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７５（２３）： ７５３ ７−７５４１．
Ｓｔｏｒｅｙ， Ｊ．Ｄ． ａｎｄ Ｒ． Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ （２００３）． “Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ ｓｔｕｄｉｅｓ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００（１６）： ９４４０−９４４５．
Ｗａｎｇ， Ｑ．， Ｇ． Ｍ． Ｇａｒｒｉｔｙ， Ｊ． Ｍ． Ｔｉｅｄｊｅ ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｃｏｌｅ （２００７）． “Ｎａｉｖｅ Ｂａｙｅｓｉａｎ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｎｅｗ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔａｘｏｎｏｍｙ．” Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７３（１６）： ５２６１−５２６７．
Ｗｈｉｔｅ， Ｊ．Ｒ， Ｎ． Ｎａｇａｒａｊａｎ ａｎｄ Ｍ． Ｐｏｐ． （２００９年） “Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｂｕｎｄａｎｔ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｓａｍｐｌｅｓ．” ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ５（４）：ｅ１０００３５２．
Ｙｕａｎ， Ｓ．， Ｄ． Ｂ． Ｃｏｈｅｎ， Ｊ． Ｒａｖｅｌ， Ｚ． Ａｂｄｏ ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｆｏｒｎｅｙ （２０１２）． “Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．” ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（３）： ｅ３３８６５．
本出願において引用されている全ての特許、特許出願、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって言及される配列などの他の刊行物は全ての目的のために全体が参照により援用される。
前述の発明は明瞭な理解を目的として例示と実例によって幾らか詳細に説明されているが、当業者は添付されている特許請求の範囲の範囲内である特定の変更と改変を行ってよいことを理解する。加えて、本明細書において提示された各参照文献は、各参照文献が参照により個別に援用されたのと同じ程度に全体が参照により援用される。

















































略式の配列表
配列番号１
Ｖ４−Ｖ５ ＰＣＲフォワードプライマー（プライマー５’末端のプライマーＡキー配列とＭＩＤ配列を含まない）
AYT GGG YDT AAA GNG
配列番号２
Ｖ４−Ｖ５ ＰＣＲリバースプライマー（プライマーの５’末端のプライマーＢキー配列を含まない）
CCG TCA ATT YYT TTR AGT TT
配列番号３
表４Ａのｄ−ｃ−０１９分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCT
配列番号４
表４Ａのｄ−ｃ−０３０分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
CGCGCGCAGGCGGACTAGCCAGTCAGTCTTAAAAGTTCGGGGCTTAACCCCGTGATGGGATTGAAACTACTAGTCTAGAGTATCGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACGAACACTGACGCT
配列番号５
表４Ａのd-c-037分類群 (OTU 47分類群) − １６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGCGCGCAGGCGGTTCGGTAAGTCTGTCTTAAAGTGCGGGCTTAACCCCGTGAGGGACGGAAACTGTCGAACTTGAGTGTCGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGACGCT
配列番号６
表４Ａのｄ−ｃ−０４０分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
AGATGAGATGGCGGTTTGTCGCGTCTGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATTGGCGCTGGGTACGGGCAGGCTAGAGTGTAGTAGGGGAGACTGGAATTCTCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTATTACTGACGCT
配列番号７
表４Ａのｄ−ｃ−０４３分類群（ＯＴＵ５６分類群）−１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
CGAGCGCAGGCGGGTTTGTAAGTTTGGTATTAAATCTAGATGCTTAACGTCTAGCTGTATCAAAAACTGTAAACCTAGAGTGTAGTAGGGAGTTGGGGAACTCCATGTGGAGCGGTAAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGCCAACTTGGACTATCACTGACGCT
配列番号８
表４Ａのｄ−ｃ−０４５分類群（ＯＴＵ４２分類群）−１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
CGCGCGTAGGCGGTCTGTTAGGTCAGGAGTCAAATCTGGGGGCTCAACCCCTATCCGCTCCTGATACCGGCAGGCTTGAGTCTGGTATGGGAAGGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATTTGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCTTCTGGGCCATGACTGACGCT
配列番号９
表４Ａのｄ−ｃ−０３８分類群（ＯＴＵ４０分類群）−１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
CGCGCGCAGGCGGTTGCTCAAGCGGAACCTCTAATCTCGGGGCTTAACCTCGAGCCGGGTTCCGAACTGGACGACTCGAGTGCGGTAGAGGCAGATGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCGGGAAGAACACCAACGGCGAAGGCAGTCTGCTGGGCCGTCACTGACGCT
配列番号１０
表４Ａのｄ−ｃ−０４７分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
AGTACGTAGGCGGCCTAGTAAGTTAGAAGTGAAAGAATATAGCTCAACTATATAAAGCTTTTAAAACTGTTAGGCTTGAGAGATGAAAGGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATTAGGAAGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCATCATCTGACGCT
配列番号１１
表４Ａのｄ−ｃ−０５４分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGTGCGTAGGCGGTCTGTTAAGTTCATGGTTAAATTTTGGGGCTCAACCCCATTGAGCCATGGATACTGGCAGACTAGAGTATTGGAGAGGCAAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTAAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTAGCCAAAGACTGACGCT
配列番号１２
表４Ｂのｄ−ｃ−０６７分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGTGCGCAGGCGGCTTTACAAGTTGGATGTGAAATATTGTGGCTCAACCACAAACGTGCATCCAAAACTGCAAAGCTTGAGTTAAGGAGAGGTAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATCAGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTACTGGACTTAAACTGACGC
配列番号１３
表４Ｂのｄ−ｃ−０３９分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGCGCGTAGGCGGAATGGCAAGTCAGCAAGTGAAAGCGTGGGGCTCAACCCCATGATGCGGCTGAAACTGTTATTCTAGAGGCATGGAGAGGCAAACGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGTTTGCTGGCCATGAACTGACGCT
配列番号１４
表４Ｂのｄ−ｃ−０５２分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
TGGGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTTAACCGTGGAAGTGCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTACAGAAGAGGAAAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTCACTGACGCT
配列番号１５
表４Ｂのｄ−ｃ−０７４分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
CGTTCGCAGGCGGCAATGCAAGTCTCGTGTGAAAGGCAAGGGCTCAACCCTTGTAAGCACAAGAAACTGCATAGCTTGAGTAGTGGAGAGGCAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGACACAAACTGACGCT
配列番号１６
表４Ｂのｄ−ｃ−０８２分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAATTCCGGGGCTTAACTCCGGGCGTGCAGGCGATACGGGCATAACTTGAGTACTGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCT
配列番号１７
表４Ｂのｄ−ｃ−０９２分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
CGCGTGTAGGCGGATTCTCAAGTTGGATGTGAAACCCCTTGGCTAAACTGAGGGCTTGCATTCAAAACTGAGGACCTTGAGTATCAGAGGGGAAAGTGGAATTCCTGGTGGAGCGGTAAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGCTGACAACTGACGCT
配列番号１８
表４Ｂのｄ−ｃ−０９８分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
TGTGTGTAGGTGGCGTGATTAGTCGTTTGTGAAAGATCCGAGCTTAACTTGGAAAACGCGAACGAAACGGTCATGCTTGAGTATGTGAGAGGTAAGCAGAACTCATGGTGTAGGGGTGAAATCCGTTGATATCATGGGGAATACCAAAAGCGAAGGCAGCTTACTGGCACATTACTGACACT
配列番号１９
表４Ｃのｄ−ｃ−０１２分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGTTCGTAGGCTGTTTGTTAAGTCTGGAGTTAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGCTCGCTTTGGATACTAGCAAACTAGAGTTAGATAGAGGTAAGCGGAATTCCATGTGAAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAAAGGCGAAGGCAGCTTACTGGGTCTATACTGACGCT
配列番号２０
表４Ｃのｄ−ｃ−０３０分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
CGCGCGCAGGCGGACTAGCCAGTCAGTCTTAAAAGTTCGGGGCTTAACCCCGTGATGGGATTGAAACTACTAGTCTAGAGTATCGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACGAACACTGACGCT
配列番号２１
表４Ｃのｄ−ｃ−０４０分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
AGATGAGATGGCGGTTTGTCGCGTCTGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATTGGCGCTGGGTACGGGCAGGCTAGAGTGTAGTAGGGGAGACTGGAATTCTCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTATTACTGACGCT
配列番号２２
表４Ｃのｄ−ｃ−０４７分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
AGTACGTAGGCGGCCTAGTAAGTTAGAAGTGAAAGAATATAGCTCAACTATATAAAGCTTTTAAAACTGTTAGGCTTGAGAGATGAAAGGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATTAGGAAGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCATCATCTGACGCT
配列番号２３
表４Ｃのｄ−ｃ−０５０分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGCTTGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGAAAGTGTAAACTCAGTGCTTAACGCTGAGCCTGCTTTCGATACGGGCTGACTAGAGGAAGGTAGGGGAGAATGGAATTCCCGGTGGAGCGGTGGAATGCGCAGATATCGGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGACCTTTCCTGACGC
配列番号２４
表４Ｃのｄ−ｃ−０５３分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
CGCTCGTAGGTGGTGTGTTGCGTCGTCTGTGTAATCCAGGGGCTTAACTTTTGGTTGGCAGGCGATACGGGCATTGCTTGAGTGCTGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCAGTTACTGACG
配列番号２５
表４Ｃのｄ−ｃ−０６８分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
TGAGCGTAGGCGGCAGTACAAGTCGGGAGTGAAAACTCGGGGCTCAACCCCGAGACTGCTCTCGAAACTGTACAGCTAGAGTGCAGGATGGGCAGGCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCCTGCTGGACTGTAACTGACGCT
配列番号２６
表４Ｃのｄ−ｃ−０７１分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGCTTGTAGGCGGCTTGTTGCGCCTGCTGTGAAAACGCGGGGCTTAACTTCGCGCGTGCAGTGGGTACGGGCAGGCTTGAGTGTGGTAGGGGTGACTGGAATTCCAGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCTGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCACTGGGCCATTACTGACGCT
配列番号２７
表４Ｃのｄ−ｃ−０７２分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGTACGTAGGCGGTTTGTTAAGTTTGGCGTTAAATCACGGGGCTCAACCCCGTTCAGCGTTGAAAACTGGCAAACTTGAGTAGTAGAGGGGACAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTGTCTGGATACATACTGACGCT
配列番号２８
表４Ｃのｄ−ｃ−０８１分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGTGTGTAGGCGGTTATATTAGTCATTTGTTAAATCCTCGGGCTTAACCCGAGAATCGCGAGCGAAACGGTATAACTAGAAAGTGTGAGGGGTGTACAGAACTCATGGTGTAGGGGTGAAATCCGTTGATATCATGGGGAATACCAAAAGCGAAGGCAGTACACTGGCACATATTTGACGCT
配列番号２９
表４Ｃのｄ−ｃ−０１５分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
TGCGCGCAGGCGGTTCGGTAAGTCTGTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGACGGAAACTGTCGAACTTGAGTGTCGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGACGCT
配列番号３０
表４Ｃのｄ−ｃ−０８３分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGTTCGCAGGCGGAATAACAAGTCAGATGTGAAAGGCATGGGCTCAACCCATGTAAGCATTTGAAACTGTAATTCTTGAGAAGTGGAGAGGTAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAATACCTGTGGCGAAGGCGACTTACTGGACACAAATCTGACGCT
配列番号３１
表４Ｃのd-c-087分類群 − １６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
CGCGTGTAGGCGGCACTGTAAGTCAGATGTGAAATCTCCCGGCTCAACCGGGAGCGTGCATCTGATACTGCAATGCTTGAGTGATAGAGGGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTAAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGCTATTAACTGACGCT
配列番号３２
表４Ｃのｄ−ｃ−０８８分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGTGCGTAGGCGGTTCGGTAAGTCTTGTGTGAAATCTTCAGGCTCAACTTGAAGTCTGCACGAGAAACTGCCGGGCTTGAGTGTGGGAGAGGTGAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCGGAAGGAACACCTGTGGCGAAAGCGGCTCACTGGACCACAACTGACGCT
配列番号３３
表４Ｃのｄ−ｃ−１０５分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGTGTGTAGGTGGTTATGTTAGTCTCCTTTCAAAGCTCCCGGCCTAACCGGGAAAAGGGAGGGGAAACGGCACAACTAGAGGATGCGAGGGGTCTGTGGAACTCATGGAGTAGGGGTGAAATCCGTTGATATCATGGGGAACACCAAAAAGCGAAGGCAGCAGACTGGCGCATTCCTGACACT
配列番号３４
表４Ｄのｄ−ｃ−０１８分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
CGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCT
配列番号３５
表４Ｄのｄ−ｃ−０５２分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
TGGGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTTAACCGTGGAAGTGCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTACAGAAGAGGAAAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTCACTGACGCT
配列番号３６
表４Ｄのｄ−ｃ−０７４分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
CGTTCGCAGGCGGCAATGCAAGTCTCGTGTGAAAGGCAAGGGCTCAACCCTTGTAAGCACAAGAAACTGCATAGCTTGAGTAGTGGAGAGGCAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGACACAAACTGACGCT
配列番号３７
表４Ｄのｄ−ｃ−０７６分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
TGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTAGTCTGTAACTGACGCT
配列番号３８
表４Ｄのｄ−ｃ−０８２分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列。
GGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAATTCCGGGGCTTAACTCCGGGCGTGCAGGCGATACGGGCATAACTTGAGTACTGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCT
配列番号３９
表８のｓ−ｎ−００６分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
AGGGCGCAGGCTGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTTAACCGTGGAAGTGCATTGGAAACTGGGAAGCTTGAGTACAGAAGAGGAAAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTTTCTGGTCTGTCACTGACGCTGA
配列番号４０
表８のｓ−ｎ−００７分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
CGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGA
配列番号４１
表８のｓ−ｎ−００８分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
CGCGTGTAGGCGGCTAGATAAGTGTGATGTTTAAATCCAAGGCTTAACCTTGGGGTTCATTACAAACTGTTTAGCTTGAGTGCTGGAGAGGATAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTAAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTATCTGGACAGTAACTGACGCTGA
配列番号４２
表８のｓｎ−０１２分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
CGAGCGTAGGCTGTTTGTTAAGCGTGTTGTGAAATGTAGGAGCTCAACTTTTAGATTGCAGCGCGAACTGGCAGACTTGAGTGCGCACAACGTAGGCGGAATTCATGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCATGACGAACTCCGATTGCGAAGGCAGCTTACGGGAGCGCAACTGACGCTAA
配列番号４３
表８のｓ−ｎ−０１４分類群（ＯＴＵ１６分類群）−１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
GGTACGTAGGCGGTTTTTAAGTCAGGTGTCAAAGCGTGGAGCTTAACTCCATTAAGCACTTGAAACTGAAAGACTTGAGTGAAGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACTTTTACTGACGCTCA
配列番号４４
表８のｓ−ｎ−０２２分類群（ＯＴＵ２８分類群）−１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
TGTTCGCAGGCGGCAATGCAAGTCAGATGTAAAAGGCAAAGGCTCAACCTTTGTAAGCATCTGAAACTGTATAGCTTGAGAAGTGTAGAGGCAAGTGGAATTTTTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAAAAAGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTGCTGGGCACAATCTGACGCTGA
配列番号４５
表８のｓ−ｎ−０２４分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
AGTACGTAGGCGGATAAGCAAGTTAGAAGTGAAATCCTATAGCTCAACTATAGTAAGCTTTTAAAACTGCTCATCTTGAGGTATGGAAGGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATTAGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGCCATAAACTGACGCTGA
配列番号４６
表８のｓ−ｎ−０２５分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
GGCGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCGGTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGACCGAAACTGGAAGACTTGAGTGTCGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGACGCTGA
配列番号４７
表８のｓ−ｎ−０２７分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
GGCGCGCAGGCGGTCACTTAAGTCCATCTTAGAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGATGGGATGGAAACTGGGAGACTGGAGTATCGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACGAAAACTGACGCTGA
配列番号４８
表８のｓ−ｎ−０２８分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
GGTGCGTAGGTGGTCTTTCAAGTCGGTGGTTAAAGGCTACGGCTCAACCGTAGTTAGCCTCCGAAACTGGAAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAAAGTGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGGGAGGAACACCAGTAGCGAAGGCGGCTTTCTGGACTGCAACTGACACTGA
配列番号４９
表８のｓ−ｎ−０２９分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
GGCGTGTAGGCGGCTAGATAAGTGTGATGTTTAAATCCAAGGCTTAAACCTTGGGGTTCATTACAAACTGTTTAGCTTGAGTGCTGGAGAGGATAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTAAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTATCTGGACAGTAACTGACGCTGA
配列番号５０
表８のｓ−ｎ−０３０分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
GGCGCGTAGGCGGTCTGTTAGGTCAGGAGTCAAATCTGGGGGCTCAACCCCTATCCGCTCCTGATACCGGCAGGCTTGAGTCTGGTATGGGAAGGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATTTGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCCTTCTGGGCCATGACTGACGCTGA
配列番号５１
表８のｓ−ｎ−０４６分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
GATGAGATGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGA
配列番号５２
表８のｓ−ｎ−０５４分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
GGCAGGTAGGTGGTCTGATTAGTCAATAGGTGAAATCCTCGGGCTTAACCCGAGAAGTGCCTTTGAAACGGTCAGACTGGAGTACTCTAGAGGGTCGTGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAACACCAGAGGCGAAGGCGGCGACCTGGGGAGTGACTGACACTCA
配列番号５３
表８のｓ−ｎ−０６３分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
CGTGCGTAGGCGGTTCTTTAAGTCAGAGGTGAAAGACGGCAGCTTAACTGTCGCAGTGCCTTTGATACTGAAGAACTTGAATTGGGTTGAGGAATGCGGAATGAGACAAGTAGCGGTGAAATGCATAGATATGTCTCAGAACCCCGATTGCGAAGGCAGCATTCCAAGCCTATATTGACGCTGA
配列番号５４
表８のｓ−ｎ−０６８分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
GGCAGGTAGGCTGTTTTGTAAGTCCGGCGTGAAATCCCAGAGCTCAACTCTGGAACTGCGTTGGAAACTACATGACTTGAGTATCGGAGAGGTTAGGGGAATTCTCGGTGTAAGGGTGAAATCTGTAGATATCGAGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGCCTAACTGGCCGATTACTGACGCTGA
配列番号５５
表８のｓ−ｎ−０７１分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
AGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTCAACCGAGGAAGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAATGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAATTGACGCTGA
配列番号５６
ＯＴＵ＃１１分類群、すなわちスネアチア・サングイネゲンスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列。
CGCATCTAGGCGGTAAGACAAGTTGAAGGTGAAAACCTGTGGCTCAACCATAGGCTTGCCTACAAAACTGTTGAACTAGAGTACTGGAAAGGTGGGTGGAACTACACGAGTAGAGGTGAAATTCGTA

Claims (24)

  1. （ａ）メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、ウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８における１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定されている細菌分類群、ならびに表４Ｅ、表４Ｇ、および表９におけるＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定されている細菌分類群、からなる群より選択される少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌のレベルを、対象から採取された生体試料において検出すること、および
    （ｂ）前記少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌のレベルが標準対照レベルよりも高い場合に、前記対象は有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰の増加したリスクを有すると決定すること、
    を含む、対象について異常妊娠転帰または有害な新生児転帰のリスクを決定する方法。
  2. 少なくとも２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、１３種類、１４種類、１５種類、１６種類、１７種類、１８種類、１９種類、または２０種類の異なる細菌分類群が検出される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記対象が妊婦または非妊婦である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記生体試料が、子宮頸管スワブ、膣スワブ、尿試料、羊水試料、母体血試料、母体血清試料、母体血漿試料、子宮頸管粘液試料、胎盤スワブ、臍帯スワブ、または生殖系もしくは胃腸管系から直接的もしくは間接的に採取された任意の試料である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記検出の工程が、ポリヌクレオチド増幅アッセイ、ポリヌクレオチド配列決定を伴うアッセイ、または配列特異的プローブ／プライマーハイブリダイゼーションを伴うアッセイを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ポリヌクレオチド増幅アッセイがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＰＣＲアッセイが定量的ＰＣＲアッセイまたは逆転写酵素ＰＣＲアッセイである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰が、３４週未満での早産、３７週未満での早産、前記生体試料の採取後約１〜１９６日以内の分娩、臨床介入の実施後約１〜１９６日以内の分娩、１分の時点での７未満のアプガースコア、５分の時点での７未満のアプガースコア、絨毛羊膜炎、呼吸窮迫症候群、気管支肺異形成症、脳室内出血、出生後７日以内の新生児死亡、または新生児敗血症を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌のレベルが標準対照レベルよりも高い場合に、対象が進行した子宮頸管拡張または早期子宮頸管短縮を有するリスクを有すると決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  10. 対象が、羊膜腔、子宮腔、子宮頸管または膣に感染症を有するリスクを有すると決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  11. 工程（ａ）の前に、生体試料から核酸を抽出することをさらに含む請求項１に記載の方法。
  12. 対象が有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有すると予測されたときに、前記生体試料の種類である前記対象の別の生体試料を使用して、後の時点で工程（ａ）と（ｂ）を繰り返すことを含み、最初の工程（ａ）において決定されたレベルと比較した場合の、後の時点での前記少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌のレベルの上昇が、有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有するリスクの増加を示す、請求項１に記載の方法。
  13. ジョンケテラ・アントロピ（Ｊｏｎｑｕｅｔｅｌｌａ ａｎｔｈｒｏｐｉ）、アエロコッカスリナエ（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓｕｒｉｎａｅ）、表４Ｂおよび表４Ｄにおける１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定されている細菌分類群、および表４Ｆおよび表４Ｈ中のＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定されている細菌分類群からなる群より選択される少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌のレベルを前記生体試料において検出すること、および、
    前記少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌のレベルが標準対照レベルよりも低い場合に、対象が有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰の増加したリスクを有すると決定すること、
    をさらに含む請求項１に記載の方法。
  14. （ａ）メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８における１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定されている細菌分類群、ならびに表４Ｅ、表４Ｇ、および表９におけるＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類による細菌分類群、からなる群より選択される少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌を含む、妊娠している対象から採取される生体試料を提供する標準対照、および
    （ｂ）メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８における１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定されている細菌分類群、ならびに表４Ｅ、表４Ｇ、および表９におけるＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類によって規定されている細菌分類群、からなる群より選択される少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌を特異的および定量的に特定する１種類以上の薬剤、
    を含む、対象が有害な妊娠転帰または有害な新生児転帰を有するリスクを決定するためのキット。
  15. 前記薬剤が、増幅アッセイにおいて前記少なくとも１種類の細菌分類群のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、そのポリヌクレオチドを増幅する１種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項１４に記載のキット。
  16. 前記薬剤が、前記少なくとも１種類の細菌分類群のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブである、請求項１４に記載のキット。
  17. 取扱い説明書をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
  18. （ａ）メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アロスカルドビア・オムニコレンス（Ａｌｌｏｓｃａｒｄｏｖｉａ ｏｍｎｉｃｏｌｅｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、ウレアプラズマ・パルバム、アトポビウム・バギナエ、パルビバクター・カエシコラ（Ｐａｒｖｉｂａｃｔｅｒ ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、ラクトバチルス・カゼイ、ベイロネラ・モンペリエレンシス、アナエロコッカス・セネガレンシス、ブレイディア・エクストルクタ、マイコプラズマ・ホミニス、プロピオニミクロビウム・リンフォフィラム、１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ７８１４４３．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％の配列同一性を有する未培養細菌、コリネバクテリウム・ピルビシプロデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｒｕｖｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メガスファエラ・セレビシエ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アシディピラ・ロセア（Ａｃｉｄｉｐｉｌａ ｒｏｓｅａ）、ムルドシエラ・アサカロリティカ（Ｍｕｒｄｏｃｈｉｅｌｌａ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＦ２９５５２０．１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ未培養細菌、ホワルデラ・ウレイリティカ（Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ ｕｒｅｉｌｙｔｉｃａ）、アクチノバクラム・シャアリイ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｃｈａａｌｉｉ）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、ファスティディオシピラ・サングイニス、スネアチア・サングイネゲンス、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、ペプトニフィラス・ラクリマリス、表４Ａ、表４Ｃ、および表８における１６Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチド配列によって規定されている細菌分類群、ならびに表４Ｅ、表４Ｇ、および表９におけるＢＬＡＳＴヌクレオチドアラインメントに基づく最近縁種分類による細菌分類群、からなる群より選択される少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌のレベルを、対象から採取された生体試料において検出すること、および
    （ｂ）前記少なくとも１種類の細菌分類群に属する細菌のレベルが標準対照レベルのそれよりも高い場合に、前記対象が進行した子宮頸管拡張または早期子宮頸管短縮を有する増加したリスクを有すると決定すること、
    を含む、妊娠した対象が、進行した子宮頸管拡張または早期子宮頸管短縮を有する増加したリスクを有するか決定する方法。
  19. （ａ）の工程を実施する前に、生体試料から核酸を抽出することをさらに含む請求項１８に記載の方法。
  20. 少なくとも２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、１３種類、１４種類、１５種類、１６種類、１７種類、１８種類、１９種類、または２０種類の異なる細菌分類群が検出される、請求項１８に記載の方法。
  21. 生体試料が子宮頸管スワブ、膣スワブ、尿試料、羊水試料、母体血試料、母体血清試料、母体血漿試料、子宮頸管粘液試料、胎盤スワブ、臍帯スワブ、または生殖系もしくは胃腸管系から直接的もしくは間接的に採取された任意の試料である、請求項１８に記載の方法。
  22. 前記検出の工程が、ポリヌクレオチド増幅アッセイ、ポリヌクレオチド配列決定を伴うアッセイ、または配列特異的プローブ／プライマーハイブリダイゼーションを伴うアッセイを含む、請求項１８に記載の方法。
  23. 前記ポリヌクレオチド増幅アッセイがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＰＣＲアッセイが定量的ＰＣＲアッセイまたは逆転写酵素ＰＣＲアッセイである、請求項２３に記載の方法。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017220785B2 (en) * 2016-02-16 2019-02-21 Tata Consultancy Services Limited Method and system for early risk assessment of preterm delivery outcome
WO2018045359A1 (en) * 2016-09-02 2018-03-08 Karius, Inc. Detection and treatment of infection during pregnancy
US20200308627A1 (en) * 2016-09-15 2020-10-01 Sun Genomics, Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
US11959125B2 (en) 2016-09-15 2024-04-16 Sun Genomics, Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
WO2018129043A1 (en) * 2017-01-03 2018-07-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for predicting risk of preterm birth
KR101831416B1 (ko) 2017-09-04 2018-02-22 이화여자대학교 산학협력단 시료 내 미생물 군집의 변화를 이용한 조산 위험성 예측
CN111655863A (zh) * 2017-11-24 2020-09-11 西澳大利亚大学 感染相关的早产诊断方法
KR101872457B1 (ko) * 2018-04-20 2018-06-28 이화여자대학교 산학협력단 혈액 내 미생물 군집의 변화를 이용한 조산 위험성의 예측
WO2020088596A1 (en) * 2018-10-31 2020-05-07 Coyote Diagnostics Lab (Beijing) Co., Ltd. Methods, systems and kits for predicting premature birth condition
WO2020178297A1 (en) * 2019-03-04 2020-09-10 Fundación Para La Investigación Biomédica Del Hospital Ramón Y Cajal Anal bacterial biomarkers for the diagnosis of anal precancerous lesions
CN110423804B (zh) * 2019-08-12 2022-09-20 中国福利会国际和平妇幼保健院 一种筛查稽留流产风险的生物标志物集合及筛查方法
WO2021112237A1 (ja) * 2019-12-06 2021-06-10 学校法人福岡大学 絨毛膜羊膜炎の発症予測方法
JPWO2021112236A1 (ja) * 2019-12-06 2021-06-10
CN113186311B (zh) * 2021-04-27 2022-05-10 中国医学科学院北京协和医院 阴道微生物在慢性盆腔痛综合征鉴别诊断中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7625697B2 (en) * 1994-06-17 2009-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for constructing subarrays and subarrays made thereby
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