KR102207265B1

KR102207265B1 - OsHIRP1 gene from Oryza sativa for regulating high temperature stress resistance of plant and uses thereof

Info

Publication number: KR102207265B1
Application number: KR1020190147892A
Authority: KR
Inventors: 장철성; 김주희; 임성돈
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2021-01-25

Abstract

The present invention relates to an OsHIRP1 gene derived from Oryza sativa for controlling high temperature stress resistance of plants and uses thereof. It is confirmed that transgenic plants overexpressing the OsHIRP1 gene exhibit resistance to high temperature treatment, and by regulating the expression of a gene encoding an OsHIRP1 protein in transgenic plants, the present invention can be usefully used to develop genetically modified (GM) crops such as transgenic plants and biofuel crops that are resistant to environmental stress suitable for unfavorable conditions.

Description

OsHIRP1 gene from rice derived from Oryza sativa for regulating high temperature stress resistance of plant and uses thereof

본 발명은 식물의 고온 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsHIRP1 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to a rice-derived OsHIRP1 gene and its use for regulating high temperature stress tolerance of plants.

식물은 고착생활을 하기 때문에 일생동안 생물적 및 비생물적 스트레스에 지속적으로 노출되어 있으며, 환경 변화에 따라 이동을 할 수 없지만 외부의 환경변화를 인지할 수 있다. 이러한 환경변화에 따라 자신을 보호하기 위하여 다양한 환경변화에 따라 반응하여 스트레스 방어 및 감응을 위한 정교한 네트워크를 발달시켰으며, 이러한 반응으로 인한 유전자 발현의 변화 또는 세포의 대사작용의 변화를 통하여 생장율 또는 생산성의 변화를 가져온다. 식물의 생산성을 높이기 위해서는 이러한 다양한 환경 스트레스 내성과 관련된 유전자의 연구가 필수적으로서 식물 스스로 외부 환경 스트레스를 인식하고, 신호전달을 통해 방어 유전자들을 발현함으로써 스스로 보호하는 능력, 즉 환경 스트레스에 대한 자체방어시스템을 알아내 그 기능이 강화된 식물을 개발하게 된다면 그 활용도와 경제적 부가가치는 상당히 클 것으로 보여지고 있다.Because plants live a fixed life, they are constantly exposed to biotic and abiotic stress throughout their lifetime, and they cannot move according to environmental changes, but can perceive external environmental changes. In order to protect itself according to such environmental changes, it has developed a sophisticated network for stress defense and response by reacting to various environmental changes. Growth rate or productivity through changes in gene expression or metabolism of cells due to these reactions Bring about a change. In order to increase the productivity of plants, research on genes related to these various environmental stress tolerance is essential, and the ability to protect itself by recognizing external environmental stress by itself and expressing protective genes through signal transmission, that is, a self-defense system against environmental stress. If we find out and develop a plant with enhanced functions, its utilization and economic added value will be quite large.

다양한 환경 스트레스 중 온도는 모든 식물의 생존에 영향을 미칠 수 있는 가장 중요한 요소 중의 하나로서 작물의 생육과 발달에 주요한 원동력으로 작용한다. 지구온난화로 인해 온도 상승에 따른 고온 스트레스는 전세계 많은 지역에서 농업적으로 문제가 되고 있다. 식물체에 미치는 고온에 의한 직접적인 영향으로는 단백질의 변성, 집적, 세포 막 지질의 유동성 증가 등을 포함한다. 간접적인 손상으로는 엽록체와 미토콘드리아의 효소가 불활성화되고, 단백질 합성이 저해되며 합성된 단백질이 분해되고 세포막 손상을 일으킨다.Among various environmental stresses, temperature is one of the most important factors that can affect the survival of all plants and acts as a major driving force in the growth and development of crops. High temperature stress caused by temperature rise due to global warming is an agricultural problem in many parts of the world. Direct effects of high temperatures on plants include denaturation and accumulation of proteins, and increased fluidity of cell membrane lipids. As an indirect injury, enzymes in chloroplasts and mitochondria are inactivated, protein synthesis is inhibited, synthesized proteins are degraded, and cell membrane damage occurs.

한편, 한국등록특허 제1325960호는 '식물의 고온 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsHCI1 유전자 및 이의 용도'를 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1862755호는 '식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 애기장대 유래의 AtSIZ1 유전자 및 이의 용도'를 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '식물의 고온 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsHIRP1 유전자 및 이의 용도'에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.Meanwhile, Korea Patent Registration No. 1.32596 million discloses a discloses a "of rice origin for increasing the high-temperature stress tolerance of a plant OsHCI1 gene and use thereof", Korea Patent Registration No. 1862755 discloses a "Arabidopsis increasing the environmental stress resistance of plants The derived AtSIZ1 gene and its use' are disclosed . However, there has been no disclosure of the'OsHIRP1 gene derived from rice and its use for controlling the high temperature stress tolerance of plants' of the present invention.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼에서 고온 처리에 의해 발현이 현저하게 증가하는 OsHIRP1(Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) 유전자를 선발하였고, 고온 처리 조건에서 OsHIRP1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 식물체가 고온 스트레스 내성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived from the above requirements, and the present inventors selected OsHIRP1 ( Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) gene whose expression is remarkably increased by high temperature treatment in rice, and OsHIRP1 under high temperature treatment conditions The present invention was completed by confirming that the gene-overexpressed transgenic Arabidopsis thaliana plant exhibits high temperature stress tolerance.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 벼 유래의 OsHIRP1(Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsHIRP1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 고온 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention is a step of controlling the expression of OsHIRP1 gene by transforming plant cells with a recombinant vector containing a gene encoding a rice-derived OsHIRP1 ( Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) protein. It provides a method of controlling the high temperature stress tolerance of the plant comprising a.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 OsHIRP1(Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 고온 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of transforming plant cells with a recombinant vector containing a gene encoding a rice-derived OsHIRP1 ( Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; And re-differentiating the plant from the transformed plant cell. It provides a method for producing a transgenic plant with controlled high-temperature stress tolerance.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 고온 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.In addition, the present invention provides a transgenic plant with controlled high temperature stress tolerance and a transformed seed thereof prepared by the above method.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 OsHIRP1(Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 고온 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for controlling high temperature stress tolerance of plants containing as an active ingredient a gene encoding a rice-derived OsHIRP1 ( Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 .

본 발명을 통하여, OsHIRP1 유전자가 과발현된 형질전환 식물체가 고온 처리에 대해 저항성을 보이는 것을 확인하였으며, 형질전환 식물체에서 OsHIRP1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절을 통해, 조건 불리 지역에 적합한 환경 스트레스에 내성을 갖는 형질전환 식물체 및 바이오 연료 작물 등 GM(genetically modified) 작물을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다.Through the present invention, it was confirmed that the transgenic plants overexpressing the OsHIRP1 gene showed resistance to high-temperature treatment, and through the regulation of the expression of the gene encoding the OsHIRP1 protein in the transgenic plants, resistance to environmental stress suitable for unfavorable regions It may be usefully used to develop GM (genetically modified) crops such as transgenic plants and biofuel crops.

도 1은 다양한 비생물학적 스트레스(염, 고온, 건조 및 ABA)를 처리한 벼 뿌리에서 시간대별로 OsHIRP1 유전자 발현량을 나타낸 것이다. 별표는 대조군(0시간)과 비교하여, two-tailed Student t-test를 사용한 통계적 유의성을 나타내며, *는 P value < 0.05, **는 P value < 0.01, ***는 P value < 0.001인 것을 의미한다.
도 2는 벼 유래 OsHIRP1 단백질의 아미노산 서열과 이의 상동 유전자들(야생염소풀 유래 F775_02460, 애기장대 유래 AT3G05670, 야생잔디 유래 BRADI1G64740 및 밀 유래 4DL_6E50CBE1B)의 아미노산 서열의 다중 정렬 결과(A) 및 OsHIRP1 도메인 내에 잘 보존된 2개의 단립형 NLS 서열(monopartite NLS sequence)(B)을 나타낸 것이다. 정렬은 ClustalW2 소프트웨어(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)를 사용하여 수행하였으며, 별표는 RING-HC 도메인을 형성하는 시스테인(C) 또는 히스티딘(H)의 보존된 금속-리간드 위치의 C 및 H 잔기를 나타낸다.
도 3은 His-Nus-OsHIRP1 또는 His-Nus-OsHIRP1^C437A를 인간 유래 E1(ubiquitin-activating enzyme), 애기장대 유래 E2(ubiquitin-conjugating enzyme UBC10) 효소 및 소 유비퀴틴(bovine ubiquitin)이 포함된 유비퀴틴화 반응 버퍼에서 반응시킨 후, 다수의 유비퀴틴화된 밴드 유무를 확인하여 OsHIRP1 유전자의 유비퀴틴화 활성을 나타낸 것이다. 유비퀴틴화된 밴드는 항-Ub 항체를 사용한 면역 블롯 분석으로 검출하였다.
도 4는 벼 원형질체에서 35S:EYFP-OsHIRP1 융합 단백질의 세포 내 위치를 나타낸 것이다. (A): 일반 조건(22℃) 및 열 처리 조건(38℃ 및 45℃, 15분)에서 35S:EYFP-OsHIRP1 융합 단백질의 세포 내 위치, (B): 35S:EYFP-OsHIRP1 융합 단백질 및 핵 위치 마커인 35S:OsMeCP-DsRed2의 동시발현(co-expression)후 세포 내 위치, (C): 일반 조건(22℃) 및 열 처리 조건(38℃ 및 45℃, 15분)에서 세포질 및 핵 (cytosol + nuclear) 형광 비율과 핵(nuclear) 형광 비율.
도 5는 Y2H(Yeast Two-Hybrid) 분석을 통해 OsHIRP1과 상호작용하는 OsAKR4 및 OsHRK1의 기질 단백질의 결합 유무(A) 및 세포 내 위치(B)를 확인하고, OsAKR4 및 OsHRK1 유전자와 OsHIRP1 유전자와의 상호결합을 식물세포 내에서 재확인하기 위해 수행한 BiFC(biomolecular fluorescence complementation) 분석 결과(C)를 나타낸 것이다. 양성 대조군으로는 BD-53(encoding the Gal4-BD fused with murine p53)/AD-T(encoding the Gal4-AD fused with SV40 large T-antigen)를 동시 형질전환한 것을 사용하였고, 음성 대조군으로는 BD-Lam(encodes the Gal4-BD fused with lamin)/AD-T를 동시 형질전환한 것을 사용하였다.
도 6은 고온(45℃)을 처리한 벼 뿌리에서 시간대별로 OsAKR4 및 OsHRK1 유전자의 발현량을 나타낸 것이다. **는 P value < 0.01, ***는 P value < 0.001인 것을 의미하며, 양성 대조군으로 사용한 OsHSP90-1 유전자는 고온(45℃) 처리후 1~6시간대에서 발현이 현저하게 증가하고 12시간 후부터는 감소되는 양상을 나타낸다.
도 7은 OsHIRP1의 E3 리가아제 활성을 검정한 것으로, OsAKR4 및 OsHRK1 단백질의 유비퀴틴화 및 프로테아좀 매개 가수분해를 확인한 결과이다. MG132는 26S 프로테아좀의 억제제이다.
도 8은 qRT-PCR을 통해 선발된, 3개의 독립적인 T₃ 세대 형질전환 애기장대 식물체(35S:OsOsHIRP1-EYFP line #1, #7 및 #9)에서 OsHIRP1 유전자의 발현 양상(A)과 OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체 종자에 고온 처리하였을 때 촬영한 발아사진(B) 및 발아율을 측정한 결과(C)이다. *는 P value < 0.05, **는 P value < 0.01인 것을 의미한다.
도 9는 OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체에 38℃에서 90분 처리 후, 45℃에서 90분(acquired thermo-tolerance) 또는 45℃에서 60분(basal thermo-tolerance) 동안 열처리하여 OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체의 열 내성을 분석한 결과이다. A; 1주령의 OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체를 38℃에서 90분 열 처리; 45℃에서 60분 처리; 및 38℃에서 90분 열 처리 후, 45℃에서 90분 열 처리하였을 때, 생장 여부를 나타낸 사진, B: 45℃에서 60분 열 처리; 및 38℃에서 90분 열 처리 후, 45℃에서 90분 열 처리하였을 때, 생존율을 측정한 그래프.1 shows the expression level of OsHIRP1 gene by time in rice roots treated with various abiotic stresses (salt, high temperature, dry and ABA). The asterisk indicates statistical significance using the two-tailed Student t-test compared to the control group (0 hour), * indicates that P value <0.05, ** indicates that P value <0.01, and *** indicates that P value <0.001. it means.
Figure 2 is the amino acid sequence of the rice-derived OsHIRP1 protein and its homologous genes (F775_02460 from wild goat grass, AT3G05670 from Arabidopsis thaliana, BRADI1G64740 from wild grass and 4DL_6E50CBE1B from wheat) multiple alignment results (A) and within the OsHIRP1 domain Two well-conserved monopartite NLS sequences (B) are shown. Alignment was performed using ClustalW2 software (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/), and the asterisk is a conserved metal-ligand of cysteine (C) or histidine (H) forming the RING-HC domain. It represents the C and H residues of the position.
Figure 3 is a ubiquitinization of His-Nus-OsHIRP1 or His-Nus-OsHIRP1 ^C437A containing human-derived E1 (ubiquitin-activating enzyme), Arabidopsis-derived E2 (ubiquitin-conjugating enzyme UBC10) enzyme and bovine ubiquitin After reacting in the reaction buffer, the presence or absence of a number of ubiquitinated bands was confirmed to indicate the ubiquitination activity of the OsHIRP1 gene. Ubiquitinated bands were detected by immunoblot analysis using anti-Ub antibodies.
Figure 4 shows the intracellular location of the 35S:EYFP-OsHIRP1 fusion protein in the rice protoplast. (A): Intracellular location of 35S:EYFP-OsHIRP1 fusion protein under normal conditions (22°C) and heat treatment conditions (38°C and 45°C, 15 minutes), (B): 35S:EYFP-OsHIRP1 fusion protein and nucleus Location in the cell after co-expression of 35S:OsMeCP-DsRed2, a localization marker, (C): cytoplasm and nucleus under normal conditions (22°C) and heat treatment conditions (38°C and 45°C, 15 minutes) cytosol + nuclear) fluorescence ratio and nuclear fluorescence ratio.
5 is Y2H (Yeast Two-Hybrid) analyzes of the through OsHIRP1 the interaction confirm the binding of matrix proteins of OsAKR4 and OsHRK1 or without (A) and the subcellular localization (B) and, OsAKR4 and OsHRK1 gene and OsHIRP1 gene The results of biomolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis (C) are shown to reconfirm the mutual binding in plant cells. BD-53 (encoding the Gal4-BD fused with murine p53)/AD-T (encoding the Gal4-AD fused with SV40 large T-antigen) was used as a positive control, and BD -Lam (encodes the Gal4-BD fused with lamin)/AD-T was used simultaneously.
6 shows the expression levels of OsAKR4 and OsHRK1 genes by time in rice roots treated with high temperature (45° C.). ** means P value <0.01, *** means P value <0.001, and the OsHSP90-1 gene used as a positive control significantly increased in expression at 1 to 6 hours after high temperature (45°C) treatment and 12 hours From later on, it shows a decreasing pattern.
7 is a result of assaying the E3 ligase activity of OsHIRP1, confirming the ubiquitination and proteasome-mediated hydrolysis of OsAKR4 and OsHRK1 proteins. MG132 is an inhibitor of the 26S proteasome.
Figure 8 shows the expression pattern (A) and OsHIRP1 of the OsHIRP1 gene in three independent T _third generation transgenic Arabidopsis plants (35S:OsOsHIRP1-EYFP lines #1, #7 and #9) selected through qRT-PCR. Germination photographs taken when overexpressing transgenic Arabidopsis plant seeds were subjected to high temperature treatment (B) and germination rates were measured (C). * Means P value <0.05, ** means P value <0.01.
9 is OsHIRP1 transgenic Arabidopsis plants at 38 ℃ after treatment 90 minutes, at 45 ℃ 90 minutes (acquired thermo-tolerance) or by heating at 45 ℃ for 60 minutes (basal thermo-tolerance) OsHIRP1 transgenic Arabidopsis This is the result of analyzing the heat tolerance of long plants. A; 1-week-old OsHIRP1 overexpressing transgenic Arabidopsis thaliana plants were heat treated at 38°C for 90 minutes; 60 minutes treatment at 45°C; And a photo showing growth when heat treatment at 38°C for 90 minutes and then heat treatment at 45°C for 90 minutes, B: heat treatment at 45°C for 60 minutes; And a graph measuring the survival rate when heat treatment at 38° C. for 90 minutes and then heat treatment at 45° C. for 90 minutes.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래의 OsHIRP1(Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsHIRP1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 고온 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention controls the expression of OsHIRP1 gene by transforming plant cells with a recombinant vector containing a gene encoding a rice-derived OsHIRP1 ( Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) protein. It provides a method of controlling the high temperature stress tolerance of a plant comprising the step of.

본 발명에 따른 벼 유래의 OsHIRP1 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 고온 스트레스 증가 활성을 의미한다.The scope of the OsHIRP1 protein derived from rice according to the present invention includes a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a functional equivalent of the protein. The term "functional equivalent" is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a result of addition, substitution or deletion of amino acids. Refers to a protein that has 95% or more sequence homology and exhibits substantially the same physiological activity as the protein represented by SEQ ID NO: 2. The term "substantially homogeneous physiological activity" refers to the activity of increasing high temperature stress of a plant.

또한, 본 발명은 OsHIRP1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 범위는 OsHIRP1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 OsHIRP1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.In addition, the present invention includes a gene encoding the OsHIRP1 protein, and the range of the gene includes all of genomic DNA, cDNA and synthetic DNA encoding the OsHIRP1 protein. Preferably, the gene encoding the OsHIRP1 protein of the present invention may include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. In addition, homologs of the nucleotide sequence are included within the scope of the present invention. Specifically, the gene includes a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more, respectively, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can do. The "% of sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally aligned sequences, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (not including additions or deletions) for the optimal alignment of the two sequences. Additions or deletions (i.e., gaps) can be included compared to).

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 식물체의 고온 스트레스 내성을 조절할 수 있는 방법으로, 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsHIRP1 유전자를 과발현시켜 식물체의 고온 스트레스 내성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to an embodiment of the present invention, in a method capable of controlling the high temperature stress tolerance of the plant, the plant cells are transformed with a recombinant vector containing the gene of SEQ ID NO: 1 to overexpress the OsHIRP1 gene, and the high temperature stress tolerance of the plant May increase, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 고온은 40~55℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to an embodiment of the present invention, the high temperature may be 40 to 55°C, but is not limited thereto.

상기 "유전자 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 상기 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 상기 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 상기 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다.The "gene overexpression" means that the gene is expressed above the level expressed in wild-type plants. As a method of introducing the gene into a plant, there is a method of transforming a plant using an expression vector containing the gene under the control of a promoter.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.The term “recombinant” refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a peptide, a heterologous peptide, or a protein encoded by a heterologous nucleic acid. Recombinant cells may express genes or gene segments that are not found in the natural form of the cell in either a sense or antisense form. In addition, recombinant cells can express genes found in cells in their natural state, but the genes are modified and reintroduced into cells by artificial means.

본 발명에서, 상기 OsHIRP1 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다.In the present invention, the OsHIRP1 gene sequence may be inserted into a recombinant expression vector. The term “recombinant expression vector” refers to a bacterial plasmid, phage, yeast plasmid, plant cell virus, mammalian cell virus, or other vector. In general, any plasmid and vector can be used as long as they can replicate and stabilize in the host.

본 발명의 OsHIRP1 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.An expression vector comprising the OsHIRP1 gene sequence of the present invention and an appropriate transcription/translation control signal can be constructed by methods well known to those skilled in the art. The method includes in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis technology, and in vivo recombinant technology. The DNA sequence can be effectively linked to an appropriate promoter in the expression vector to guide mRNA synthesis. In addition, the expression vector may include a ribosome binding site and a transcription terminator as a translation initiation site.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.A preferred example of the recombinant vector of the present invention is a Ti-plasmid vector capable of transferring a part of itself, a so-called T-region, to plant cells when present in a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens. Other types of Ti-plasmid vectors (see EP 0 116 718 B1) are currently used to transfer hybrid DNA sequences into plant cells, or protoplasts from which new plants can be produced that properly insert hybrid DNA into the plant's genome. have. A particularly preferred form of Ti-plasmid vector is a so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and in US Pat. No. 4,940,838. Other suitable vectors that can be used to introduce the DNA according to the invention into a plant host are viral vectors such as those that can be derived from double-stranded plant viruses (e.g., CaMV) and single-stranded viruses, gemini viruses, etc. For example, it can be selected from incomplete plant viral vectors. The use of such vectors can be advantageous especially when it is difficult to properly transform a plant host.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The expression vector will preferably contain one or more selectable markers. The marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by a chemical method, and all genes capable of distinguishing a transformed cell from a non-transgenic cell correspond to this. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotics such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol. Resistance gene, aadA gene, and the like, but are not limited thereto.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.In the recombinant vector of the present invention, the promoter may be CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS, histone promoter, or Clp promoter, but is not limited thereto. The term "promoter" refers to a region of DNA upstream from a structural gene and refers to a DNA molecule to which RNA polymerase binds to initiate transcription. A “plant promoter” is a promoter capable of initiating transcription in a plant cell. A “constitutive promoter” is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental states or cell differentiation. Since the selection of transformants can be made by various tissues at various stages, constitutive promoters may be preferred in the present invention. Thus, constitutive promoters do not limit the possibility of selection.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.In the recombinant vector of the present invention, a conventional terminator may be used, examples of which include nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agrobacterium tumefaciens. ), the terminator of the octopine gene, and the rrnB1/B2 terminator of E. coli, but are not limited thereto. Regarding the need for terminators, it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells. Therefore, the use of a terminator is highly desirable in the context of the present invention.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.The "plant cell" used for plant transformation may be any plant cell. Plant cells may be cultured cells, cultured tissues, cultured organs or whole plants, preferably cultured cells, cultured tissues or cultured organs, and more preferably cultured cells.

용어 "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.The term “plant tissue” refers to tissues of differentiated or undifferentiated plants, such as, but not limited to, roots, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues, and various types of cells used in culture, ie single cells, Includes protoplast, shoot and callus tissue. The plant tissue may be in planta, organ culture, tissue culture, or cell culture.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.The method of transporting the vector of the present invention into a host cell includes injection of the vector into the host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, and gene bombardment. can do.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 OsHIRP1(Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및In addition, the present invention comprises the steps of transforming plant cells with a recombinant vector containing a gene encoding a rice-derived OsHIRP1 ( Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; And

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 고온 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.It provides a method for producing a transgenic plant with controlled high temperature stress tolerance comprising; re-differentiating the plant from the transformed plant cell.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 벼 유래의 OsHIRP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 과발현시켜 식물의 고온 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.The method according to an embodiment of the present invention is characterized in that the plant cell is overexpressed with a recombinant vector containing the OsHIRP1 gene derived from rice to increase the resistance of the plant to high temperature stress, but is not limited thereto.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 상기 형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.The method of the present invention includes transforming a plant cell with a recombinant vector according to the present invention, the transformation may be mediated by, for example, Agrobacterium tumefiaciens . In addition, the method of the present invention includes the step of regenerating a transformed plant from the transformed plant cell. Any method known in the art may be used as a method of regenerating a transformed plant from a transformed plant cell. The transformed plant cells must be regenerated into whole plants. Techniques for the regeneration of mature plants from callus or protoplast cultures are well known in the art for a number of different species.

상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 애기장대 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The plants are monocotyledonous plants such as rice, barley, wheat, rye, corn, sugar cane, oats, onions, or Arabidopsis, potato, eggplant, tobacco, pepper, tomato, burdock, garland chrysanthemum, lettuce, bellflower, spinach, chard, It may be a dicotyledonous plant such as sweet potato, celery, carrot, parsley, parsley, cabbage, cabbage, radish, watermelon, melon, cucumber, pumpkin, gourd, strawberry, soybean, green bean, kidney bean, or pea, preferably dicotyledonous plant. It may, and more preferably may be an Arabidopsis plant, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 OsHIRP1(Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 고온 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for controlling high temperature stress tolerance of plants containing as an active ingredient a gene encoding a rice-derived OsHIRP1 ( Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 .

상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsHIRP1 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물체의 고온 스트레스 내성을 증가시킬 수 있는 것이다.The composition contains a gene encoding the OsHIRP1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient, and can increase the high temperature stress tolerance of the plant by transforming the plant with the gene or a recombinant vector containing the gene. will be.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail using examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it is apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예 1. 벼 뿌리에서 Example 1. In rice roots OsHIRP1OsHIRP1 유전자의 발현 양상 확인 Confirmation of gene expression patterns

다양한 스트레스 조건에서 OsHIRP1 유전자의 발현 양상을 확인하기 위해, 1주령의 벼(품종 '동안벼') 식물체에 고온(45℃), 건조(drought; air-drying), 염(NaCl, 200mM) 및 식물 호르몬 엡시스산(ABA, 0.1mM)을 0, 6, 12 및 24시간 동안 처리한 뿌리 샘플을 확보하였으며, 확보된 뿌리 샘플로부터 RNA를 추출하여 반정량적 RT-PCR(semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석을 통해 OsHIRP1 유전자의 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, ABA를 제외한 다른 비생물학적 스트레스 조건에서 OsHIRP1 유전자가 상향 조절되었고, 고온 및 염 처리 조건에서 시간의존적으로 OsHIRP1 유전자의 발현양이 현저하게 증가되었으며, 특히 고온을 처리하였을 때 고온을 처리하지 않은 조건에 비해 OsHIRP1 유전자의 발현양이 약 20배 증가하는 것을 확인하였다(도 1).In order to confirm the expression pattern of OsHIRP1 gene under various stress conditions, high temperature (45℃), drought (air-drying), salt (NaCl, 200mM) and plants were used in 1 week old rice (cultivar'Dongan rice') plants. Root samples treated with the hormone epsisic acid (ABA, 0.1 mM) for 0, 6, 12, and 24 hours were obtained, and RNA was extracted from the obtained root samples to obtain a semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain (RT-PCR). reaction) analysis confirmed the expression pattern of the OsHIRP1 gene. As a result, the OsHIRP1 gene was upregulated under abiotic stress conditions other than ABA, and the amount of OsHIRP1 gene expression was remarkably increased in a time-dependent manner under high temperature and salt treatment conditions. In particular, when high temperature was treated, the high temperature was not treated. It was confirmed that the expression amount of the OsHIRP1 gene increased by about 20 times compared to the conditions (FIG. 1).

실시예 2. OsHIRP1 단백질의 E3 리가아제로서의 기능 분석 Example 2. Function analysis of OsHIRP1 protein as E3 ligase

OsHIRP1 단백질은 PHD-핑거 패밀리 도메인(잔기 505-549), RING-HC 유형 핑거 도메인(잔기 413-454 및 2개의 NLS(nuclear localization sequence, 잔기 145-151 및 452-458) 도메인을 가지고 있었으며(도 2A), OsHIRP1는 2개의 잘 보존된 단립형 NLS 서열(monopartite NLS sequence)을 가지고 있었다(도 2B). RING 도메인 구조를 비교하기 위해 벼 유래의 OsHIRP1 아미노산 서열과 야생염소풀(Aegilops tauschii, F775_02460), 애기장대(A. thaliana, AT3G05670), 야생잔디(Brachypodium distachyon, BRADI1G64740) 및 밀(Triticum aestivum, Traes_4DL_6E50CBE1B) 유래 상동 단백질들의 아미노산 서열을 ClustalW2 소프트웨어(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)를 사용하여 정렬(alignment)한 결과, N 말단 영역의 RING 도메인(RING-HC 타입) 내에서 잘 보존된 Cys- 및 His- 잔기들이 확인되었다(도 2A). OsHIRP1 protein had a PHD-finger family domain (residues 505-549), a RING-HC type finger domain (residues 413-454 and two NLS (nuclear localization sequences, residues 145-151 and 452-458) domains (Fig. 2A), OsHIRP1 had two well-conserved monopartite NLS sequences (Fig. 2B).To compare the RING domain structure, OsHIRP1 amino acid sequence derived from rice and wild goat grass ( Aegilops tauschii , F775_02460), Arabidopsis ( A. thaliana , AT3G05670), wild grass ( Brachypodium distachyon , BRADI1G64740) and wheat ( Triticum aestivum, Traes_4DL_6E50CBE1B) derived from the amino acid sequence of homologous proteins from ClustalW2 software (http://www.ebi.ac.uk. As a result of alignment using /clustalw/), well-conserved Cys- and His- residues in the RING domain (RING-HC type) of the N-terminal region were identified (FIG. 2A).

RING-HC 도메인을 가지는 OsHIRP1 단백질의 E3 리가아제 활성을 확인하기 위해, His-Nus가 태깅된 재조합 단백질을 이용한 유비퀴티네이션 분석을 수행하였다. 전장 OsHIRP1(Os03g19020) 유전자에 His-Nus를 결합시킨 융합 단백질을 대장균 BL21(DE3) pLysS(Promega, Madison, WI, USA)에서 발현시켰으며, 아밀로스 레진을 사용한 친화성 크로마토그래피로 정제하였다(New England Biolabs, Beverly, MA, USA). 또한 RING 도메인 중 437번째 시스테인을 알라닌으로 치환 돌연변이시킨 변이체의 활성을 검정하였다. 재조합 His-Nus-OsHIRP1, His-Nus-OsHIRP1^C437A 및 empty-His-Nus를 각각 대장균 시스템에서 발현시켰으며, 정제된 각각의 단백질들은 인간 유래 E1(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), 6×His가 붙여진 애기장대 유래 E2(UBC10) 및 소 유비퀴틴(bovine ubiquitin; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)과 함께 유비퀴틴화 반응 버퍼(1M Tris-HCl, pH 7.5; 40mM ATP; 100mM MgCl₂; 및 40mM DTT)에서 30℃의 조건으로 3시간 동안 반응시킨 후 반응 혼합물에 5×SDS(sodium dodecyl sulfate)를 첨가하고 100℃에서 5분 동안 가열하였고, 각각의 샘플은 7.5% SDS-PAGE로 분리한 후 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 유비퀴틴화 활성은 항-유비퀴틴 항체를 이용하여 측정하였다. 그 결과, E1, E2 및 His-Nus-OsHIRP1(E3)가 모두 포함된 그룹에서 다수의 유비퀴틴화된 밴드를 나타낸 반면, E1, E2, His-Nus-OsHIRP1(E3), His-Nus-OsHIRP1^C437A 또는 empty-His-Nus를 단독으로 포함하는 그룹에서는 유비퀴틴화된 밴드가 나타나지 않는 것을 통해 RING-HC 도메인을 포함하는 OsHIRP1 단백질이 E3 유비퀴틴 리가아제로서 작용한다는 것을 확인할 수 있었다(도 3). In order to confirm the E3 ligase activity of OsHIRP1 protein having a RING-HC domain, ubiquitination analysis was performed using a recombinant protein tagged with His-Nus. A fusion protein in which His-Nus was bound to the full-length OsHIRP1 (Os03g19020) gene was expressed in E. coli BL21 (DE3) pLysS (Promega, Madison, WI, USA), and purified by affinity chromatography using amylose resin (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). In addition, the activity of the mutant in which the 437 th cysteine of the RING domain was substituted with alanine was tested. Recombinant His-Nus-OsHIRP1, His-Nus-OsHIRP1 ^C437A and empty-His-Nus were each expressed in the E. coli system, and each of the purified proteins was human-derived E1 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), Ubiquitination reaction buffer (1M Tris-HCl, pH 7.5; 40mM ATP; 100mM MgCl) with 6×His-attached E2 (UBC10) from Arabidopsis and bovine ubiquitin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ₂ ; and 40mM DTT) at 30°C for 3 hours, 5×SDS (sodium dodecyl sulfate) was added to the reaction mixture and heated at 100°C for 5 minutes, and each sample was 7.5% SDS-PAGE And then transferred to a nitrocellulose membrane. Ubiquitination activity was measured using an anti-ubiquitin antibody. As a result, E1, E2 and His-Nus-OsHIRP1 (E3) showed a number of ubiquitinated bands in the group containing all of them, whereas E1, E2, His-Nus-OsHIRP1 (E3), His-Nus-OsHIRP1 ^C437A Alternatively, in the group containing empty-His-Nus alone, it was confirmed that the OsHIRP1 protein containing the RING-HC domain acts as an E3 ubiquitin ligase through the fact that the ubiquitinated band did not appear (FIG. 3 ).

실시예 3.Example 3. OsHIRP1 OsHIRP1 유전자의 세포 내 위치 확인Finding the location of the gene in the cell

상기 실시예 2의 도 2A 및 2B에서 확인한 바와 같이 OsHIRP1 단백질은 2개의 NLS(nuclear localization sequence) 도메인을 포함하고 있다. OsHIRP1 단백질의 세포 내 위치를 확인하기 위하여, 상기 OsHIRP14 유전자의 전장 코딩 서열을 EYFP 벡터(한국등록특허 제1282406호)의 다중 클로닝 부위로 클로닝하였다. 벼는 1/2 MS 배지에서 16/8 시간의 명/암 주기, 25/23℃의 명/암 온도 및 70%의 습도에서 2주 동안 재배하였다. 2주령 묘목의 잎 샘플을 모아서 효소 용액(1% cellulase R-10[Yakult Honsa Co. Ltd, Tokyo, Japan], 0.25% macerozyme R-10[Yakult Honsa], 0.1% BSA, 10mM MES, 500mM Mannitol, 1mM CaCl₂, pH 5.6)에서 천천히 교반하면서 6시간 동안 배양하였다. 효소 용액을 포함하는 잎을 세포 스트레이너(strainer)를 통하여 여과하고 원심분리로 모아진 원형질체 펠렛을 W5 용액(154mM NaCl, 125mM CaCl_2, 5mM KCl, 5mM glucose, 1.5mM MES)에 재부유하고 3시간 동안 냉장 배양하였다. 이 용액을 원심분리한 후 MaMg 용액(0.4M mannitol, 15mM MgCl_2, 4.7mM MES)에 재부유하였다. 상기 원형질체에 35S:EYFP-융합된 OsHIRP1(35S:EYFP-OsHIRP1) 및 35S:EYFP(음성 대조군) 벡터를 상온에서 30분 동안 40% PEG(polyethylene glycol) 용액(40% PEG, 400mM mannitol, 100mM Ca(NO₃₎₂)을 이용하여 형질주입시켰다. 형질주입된 원형질체를 W5 용액에 재부유하고 일반(22℃) 및 열 처리(38℃ 및 45℃) 조건하에서 그 타겟 유전자의 세포 내 위치를 춘천소재 한국기초과학연구소에서 공초점레이져 스캐닝 현미경(model LSM 510 META NLO, Carl Zeiss)을 사용하여 확인하였다. 그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 22℃ 조건하에서 35S:EYFP-융합된 OsHIRP1 단백질의 형광이 세포질 및 핵에 위치하였고, 22℃ 및 38℃ 조건에 비해 45℃ 조건하에서 세포질 및 핵 위치(cytosol+nuclear) 비율은 감소되고 핵(nuclear) 위치 비율이 현저하게 증가하는 것을 통해 온도가 증가할수록 OsHIRP1 단백질이 핵으로 이동하여 발현되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과로 인해 OsHIRP1 유전자가 고온 스트레스와 관련된 기능을 수행할 것이라는 것을 유추할 수 있다.As confirmed in Figs. 2A and 2B of Example 2, the OsHIRP1 protein contains two NLS (nuclear localization sequence) domains. In order to confirm the intracellular location of the OsHIRP1 protein, the full-length coding sequence of the OsHIRP14 gene was cloned into a multiple cloning site of an EYFP vector (Korean Patent No. 1282406). Rice was cultivated in 1/2 MS medium for 2 weeks at a light/dark cycle of 16/8 hours, a light/dark temperature of 25/23°C, and a humidity of 70%. Collect leaf samples of 2-week-old seedlings and enzymatic solution (1% cellulase R-10 [Yakult Honsa Co. Ltd, Tokyo, Japan], 0.25% macerozyme R-10 [Yakult Honsa], 0.1% BSA, 10 mM MES, 500 mM Mannitol, 1mM CaCl ₂ , pH 5.6) Incubated for 6 hours while slowly stirring. The leaves containing the enzyme solution were filtered through a cell strainer, and the protoplast pellet collected by centrifugation was resuspended in W5 solution (154mM NaCl, 125mM CaCl _2, 5mM KCl, 5mM glucose, 1.5mM MES) and then resuspended for 3 hours. Refrigerated culture. After centrifuging this solution, it was resuspended in MaMg solution (0.4M mannitol _, 15mM MgCl _2, 4.7mM MES). 35S:EYFP-fused OsHIRP1 (35S:EYFP-OsHIRP1) and 35S:EYFP (negative control) vectors to the protoplasts were added to a 40% polyethylene glycol (PEG) solution (40% PEG, 400mM mannitol, 100mM Ca) at room temperature for 30 minutes. (NO ₃₎₂ ) was used for transfection. The transfected protoplasts were resuspended in W5 solution, and the target gene's intracellular location under normal (22°C) and heat treatment (38°C and 45°C) conditions was measured under a confocal laser scanning microscope (model of the Korean Basic Science Research Institute in Chuncheon). LSM 510 META NLO, Carl Zeiss). As a result, the fluorescence of the 35S:EYFP-fused OsHIRP1 protein was located in the cytoplasm and nucleus under the condition of 22° C. as disclosed in FIG. 4, and the cytosol and nuclear position (cytosol) under the condition of 45° C. compared to the conditions of 22° C. and 38° C. The +nuclear) ratio decreased and the nuclear location ratio increased significantly, indicating that the OsHIRP1 protein migrated to the nucleus and expressed as the temperature increased. Due to these results, it can be inferred that the OsHIRP1 gene will perform a function related to high temperature stress.

실시예 4. OsHIRP1과 상호결합하는 기질 단백질 분석Example 4. Analysis of substrate protein that interacts with OsHIRP1

OsHIRP1과 상호결합하는 기질 단백질을 찾기 위해 Y2H(Yeast Two-Hybrid) 스크린을 실시하였다. OsHIRP1 전장 코딩 서열을 증폭한 후 증폭된 산물을 DNA-결합 도메인이 탑재되어 있는 pGBKT7-BD(binding domain) 벡터에 삽입하여 베이트(bait) 단백질로 사용하였다. 스크리닝을 위해 BD-OsHIRP1 형질전환된 효모 균주를 염 처리된 벼 라이브러리 효모 균주와 접합시켰다. 효모 메이팅 방법을 이용하여 30℃에서 24시간 배양하여 DDO/X/A(-Leu-Trp, 40㎎/ml의 X-α-Gal, 42ng/ml Aureobasidin A) 배지에 도말하였다. 1차 스크린을 통해 선발한 후, QDO/X/A(-Leu-Trp-Ade-His, 40㎎/ml의 X-α-Gal, 42ng/ml Aureobasidin A) 배지로 옮겨서 2차 스크린을 실시하였다. 최종적으로 5개의 양성 클론을 선발하였으며, 그 중에 강한 β-갈락토시다아제(β-galactosidase) 활성을 가지는 OsAKR4(Os04g26910) 및 OsHRK1(Os07g44330) 유전자를 선발하였다. OsAKR4 및 OsHRK1의 전장 코딩 영역을 프라이머를 이용하여 pGADT7-AD(activating domain) 벡터에 클로닝하고, pGBKT7-BD-OsHIRP1과 pGADT7-AD 벡터에 삽입된 OsAKR4 및 OsHRK1들을 Y2H Gold 효모 균주에 동시 형질전환하여 얻은 클론들을 DDO 배지와 QDO/X/A 배지에 drop하여 단백질-단백질 상호결합을 확인하였다(도 5A). Y2H (Yeast Two-Hybrid) screen was performed to find a matrix protein that interacts with OsHIRP1. After amplifying the OsHIRP1 full-length coding sequence, the amplified product was inserted into a pGBKT7-BD (binding domain) vector loaded with a DNA-binding domain, and used as a bait protein. For screening, a BD-OsHIRP1 transformed yeast strain was conjugated with a salt-treated rice library yeast strain. It was cultured at 30° C. for 24 hours using a yeast mating method and plated on DDO/X/A (-Leu-Trp, 40 mg/ml X-α-Gal, 42 ng/ml Aureobasidin A) medium. After selection through the first screen, QDO/X/A (-Leu-Trp-Ade-His, 40 mg/ml X-α-Gal, 42 ng/ml Aureobasidin A) was transferred to the medium to perform a second screen. . Finally, five positive clones were selected, and among them, OsAKR4 (Os04g26910) and OsHRK1 (Os07g44330) genes having strong β-galactosidase activity were selected. The full-length coding regions of OsAKR4 and OsHRK1 were cloned into a pGADT7-AD (activating domain) vector using a primer, and OsAKR4 and OsHRK1 inserted into pGBKT7-BD-OsHIRP1 and pGADT7-AD vector were simultaneously transformed into Y2H Gold yeast strain. The obtained clones were dropped into DDO medium and QDO/X/A medium to confirm protein-protein interaction (Fig. 5A).

또한, OsHIRP1 유전자와 상호작용하는 OsAKR4 및 OsHRK1 유전자는 모두 세포질에서 형광 시그널을 보였으며(도 5B), Y2H를 통해 발굴된 2개의 유전자와 OsHIRP1 유전자와의 상호결합을 식물세포 내에서 재확인하기 위해 BiFC(biomolecular fluorescence complementation) 분석을 실시하였다. OsHIRP1 유전자는 35S:HA-SPYCE(M) 벡터에 삽입하고, 2개 유전자들은 35S:c-myc-SPYNE(R) 벡터에 삽입하여 벼 원형질체에 동시에 형질주입시킨 결과, OsHIRP1-YFPc/OsAKR4-YFPn 및 OsHIRP1-YFPc/OsHRK1-YFPn의 BiFC 시그널이 핵 및 세포질에서 각각 확인되었으며, 일반(22℃) 및 열 처리(38℃ 및 45℃) 조건에서 OsHIRP1-YFPc/OsAKR4-YFPn 및 OsHIRP1-YFPc/OsHRK1-YFPn간에 BiFC 형광 정도의 차이는 없었다(도 5C). 추가적으로, OsHIRP1과 상호결합하는 2개의 유전자들이 고온(45℃)에서의 어떠한 발현 패턴을 보이는지 확인하기 위해 RT-PCR을 실시한 결과, 고온(45℃) 처리조건에서 OsAKR4 및 OsHRK1 유전자 모두 하향 조절되는 것을 확인하였다(도 6).Also, OsHIRP1 genes interact with OsAKR4 and OsHRK1 gene BiFC both to recheck the mutual coupling between the two genes and OsHIRP1 gene discovery through showed a fluorescent signal in the cytoplasm (Fig. 5B), Y2H in a plant cell to (biomolecular fluorescence complementation) analysis was performed. OsHIRP1 gene was inserted into the 35S:HA-SPYCE(M) vector, and two genes were inserted into the 35S:c-myc-SPYNE(R) vector and transfected simultaneously into rice protoplasts, resulting in OsHIRP1-YFPc/OsAKR4-YFPn. And BiFC signals of OsHIRP1-YFPc/OsHRK1-YFPn were confirmed in the nucleus and cytoplasm, respectively, and OsHIRP1-YFPc/OsAKR4-YFPn and OsHIRP1-YFPc/OsHRK1 under normal (22°C) and heat treatment (38°C and 45°C) conditions. There was no difference in the degree of BiFC fluorescence between -YFPn (Fig. 5C). In addition, RT-PCR was performed to determine what expression patterns of the two genes that interact with OsHIRP1 at high temperature (45° C.) were performed. As a result, both OsAKR4 and OsHRK1 genes were down-regulated under high temperature (45° C.) treatment conditions. Confirmed (Fig. 6).

실시예 5. 유비퀴틴 26S 프로테아좀 시스템에 의한Example 5. By ubiquitin 26S proteasome system OsHIRP1의 OsAKR4 및 OsHRK1의 유비퀴틴화 및 가수분해 Ubiquitination and hydrolysis of OsAKR4 and OsHRK1 of OsHIRP1

OsHIRP1 단백질과 상호결합 단백질(OsAKR4 및 OsHRK1)을 사용하여 유비퀴틴화 분석을 실시하였다. His-Nus가 인위적으로 태깅된 OsHIRP1 단백질을 His-Trx가 태깅된 OsAKR4 또는 OsHRK1 단백질과 함께 E1, E2 및 소 유비퀴틴과 반응 버퍼에서 반응시킨 결과, 기질 단백질인 OsAKR4 및 OsHRK1을 E1, E2 및 His-Nus-OsHIRP1(E3)과 함께 반응시켰을 때, 다수의 유비퀴틴화된 기질 밴드가 나타난 반면, E1, E2, His-Nus-OsHIRP1(E3) 또는 His-Nus-OsHIRP1^C437A와 단독 반응시켰을 때 다수의 유비퀴틴화된 기질 밴드가 나타나지 않는 것을 통해 OsAKR4 및 OsHRK1 단백질이 OsHIRP1 단백질에 의하여 유비퀴틴화되는 것이 확인되었다(도 7A).Ubiquitination analysis was performed using OsHIRP1 protein and mutual binding proteins (OsAKR4 and OsHRK1). As a result of reacting OsHIRP1 protein artificially tagged with His-Nus with OsAKR4 or OsHRK1 protein tagged with His-Trx in a reaction buffer with E1, E2 and bovine ubiquitin, substrate proteins OsAKR4 and OsHRK1 were E1, E2 and His- When reacted with Nus-OsHIRP1 (E3), a number of ubiquitinated substrate bands appeared, whereas when reacted alone with E1, E2, His-Nus-OsHIRP1 (E3) or His-Nus-OsHIRP1 ^C437A , a number of ubiquitins It was confirmed that the OsAKR4 and OsHRK1 proteins were ubiquitinated by the OsHIRP1 protein through the absence of the fused substrate band (Fig. 7A).

또한, Nus-His-OsHIRP1 단백질과 His-Trx-OsARK4 및 His-Trx-OsHRK1 단백질을 26S 프로테아좀의 억제제인 MG132(50μM)와 함께 포함되거나 포함되지 않은 상태에서 다양한 온도(4℃, 30℃, 45℃)조건으로 3시간 동안 반응시킨 결과, MG132이 포함되지 않은 상태에서 4℃ 및 30℃ 조건으로 반응시켰을 때 OsHIRP1, OsARK4 및 OsHRK1 단백질의 발현량 변화가 없었으나, 45℃ 조건일때에는 OsHIRP1, OsARK4 및 OsHRK1 단백질의 발현량이 감소되는 것을 확인하였다. 반면에, MG132이 포함된 상태에서 45℃ 조건으로 반응시켰을 때에는 OsHIRP1, OsARK4 및 OsHRK1 단백질의 발현 감소가 나타나지 않았다(도 7B 및 7C). 이러한 결과는 OsHIRP1 유비퀴틴 E3 리가아제가 26S 프로테아좀 분해 경로를 통해 OsARK4 및 OsHRK1 단백질 분해를 매개하며, 고온(45℃)일 때 반응성이 증가한다는 것을 나타낸다.In addition, Nus-His-OsHIRP1 protein, His-Trx-OsARK4 and His-Trx-OsHRK1 proteins were included with or without MG132 (50 μM), an inhibitor of 26S proteasome, at various temperatures (4° C., 30° C.) , 45°C) for 3 hours), when reacted at 4°C and 30°C without MG132, there was no change in the expression levels of OsHIRP1, OsARK4, and OsHRK1 proteins, but OsHIRP1 at 45°C. , It was confirmed that the expression levels of OsARK4 and OsHRK1 proteins were reduced. On the other hand, when the reaction was performed at 45° C. in the state containing MG132, the expression of OsHIRP1, OsARK4 and OsHRK1 proteins did not decrease (FIGS. 7B and 7C ). These results indicate that OsHIRP1 ubiquitin E3 ligase mediates OsARK4 and OsHRK1 protein degradation through the 26S proteasome degradation pathway, and reactivity increases at high temperatures (45° C.).

실시예 6. Example 6. OsHIRP1OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체의 표현형 분석 Phenotypic analysis of overexpressing transgenic Arabidopsis thaliana plants

상기 실시예를 통해 OsHIRP1 유전자가 고온과 관련이 있음을 확인하였고, OsHIRP1 유전자의 생물학적 기능을 확인하기 위해 11개의 OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체를 구축하였고, qRT-PCR을 통해 OsHIRP1 유전자가 과발현되는 것이 확인된 3개의 독립적인 T₃ 세대 형질전환 애기장대 식물체(35S:OsHIRP1-EYFP line #1, #7 및 #9)를 선발하였다(도 8A). 선발한 OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체의 종자는 고온(47.5-52.8℃) 처리 후 배지에서 7일 동안 배양하여 발아율을 확인한 결과, 47.5℃ 처리 조건에서 OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체와 대조구 식물체(35S:EYFP)간에 종자 발아율 차이가 크게 없었으나, 48.4~51.5℃의 조건에서는 OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체의 경우 48.4℃에서 83.56%, 49.8℃에서 31.56% 및 51.5℃에서 10.67%의 종자 발아율을 나타내었다. 반면에, 대조구 식물체의 경우 48.4℃에서 40%, 49.8℃에서 12% 및 51.5℃에서 2.67%의 종자 발아율을 나타내어, OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체가 고온 내성을 나타내는 것을 알 수 있었다(도 8B 및 8C).Through the above example, it was confirmed that the OsHIRP1 gene is related to high temperatures, and 11 OsHIRP1 overexpressing transgenic Arabidopsis plant bodies were constructed to confirm the biological function of the OsHIRP1 gene, and that the OsHIRP1 gene is overexpressed through qRT-PCR. The identified three independent T _third generation transgenic Arabidopsis plants (35S:OsHIRP1-EYFP lines #1, #7 and #9) were selected (Fig. 8A). The seeds of the selected OsHIRP1 overexpressing transgenic Arabidopsis plant were cultured for 7 days in a medium after high temperature (47.5-52.8℃) treatment to confirm the germination rate. As a result, OsHIRP1 overexpressing transgenic Arabidopsis plant and control plants (35S :EYFP) showed no significant difference in seed germination rates, but under the conditions of 48.4-51.5 ℃, the transgenic Arabidopsis plants overexpressing OsHIRP1 showed 83.56 % at 48.4℃, 31.56% at 49.8℃, and 10.67% at 51.5℃. Done. On the other hand, in the case of the control plant, the seed germination rate of 40% at 48.4°C, 12% at 49.8°C, and 2.67% at 51.5°C was shown, indicating that OsHIRP1 overexpressing transgenic Arabidopsis thaliana plants exhibited high temperature tolerance (Fig. 8B and 8C).

또한, OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체의 열 내성을 확인하기 위해, 1주령의 식물체를 2가지 방법으로 38℃에서 90분 처리 후, 45℃에서 90분(acquired thermo-tolerance) 또는 45℃에서 60분(basal thermo-tolerance) 동안 열처리하였다. 그 결과, 38℃에서 90분 처리 조건에서 OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체 및 대조구 식물체 모두 생존하였으나, 45℃에서 60분(basal thermo-tolerance) 처리 조건에서는 0% 회수율을 나타내었다(도 9A). 반면에, 38℃에서 90분 처리 후, 45℃에서 90분(acquired thermo-tolerance) 처리 조건에서는 OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체의 생존율은 약 62~68%인 반면, 대조구 식물체의 생존율은 34%로, OsHIRP1 과발현 형질전환 애기장대 식물체가 고온 처리 조건에서 열 내성을 나타내는 것을 알 수 있었다(도 9B). 이의 결과를 통해, 본 발명의 OsHIRP1 유전자가 고온 스트레스 조건에서 식물체에 내성을 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.In addition, in order to confirm the heat tolerance of OsHIRP1 overexpressing transgenic Arabidopsis thaliana plants, 1 week old plants were treated for 90 minutes at 38°C in two ways, and then 90 minutes at 45°C (acquired thermo-tolerance) or 60 at 45°C. Heat treated for a minute (basal thermo-tolerance). As a result, both OsHIRP1 overexpressing transgenic Arabidopsis plants and control plants survived under treatment conditions at 38°C for 90 minutes, but showed 0% recovery at 45°C for 60 minutes (basal thermo-tolerance) treatment conditions (FIG. 9A). On the other hand, under the condition of 90 minutes treatment at 38°C and 90 minutes (acquired thermo-tolerance) at 45°C, the survival rate of transgenic Arabidopsis plants overexpressing OsHIRP1 is about 62-68 %, whereas the survival rate of control plants is 34%. As a result, it was found that the transgenic Arabidopsis thaliana plant overexpressing OsHIRP1 exhibited heat tolerance under high temperature treatment conditions (Fig. 9B). Through the results, it was confirmed that the OsHIRP1 gene of the present invention can increase resistance to plants under high temperature stress conditions.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> OsHIRP1 gene from Oryza sativa for regulating high temperature stress resistance of plant and uses thereof <130> PN19419 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2400 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggggaagg gaggggaagg ggcggttccc gtgggggaga gcggcgggcg gcggcggagg 60 aggccgggcg aggacggagg cgacgacgac gacgaggagt atgtggtgga ggaggatgag 120 gaggaagagt gcgacgagga tctgtctgcc tcgagcgccg gcgagggagg agagggcaca 180 gacgaggaat acgaagaggg tgatgaggac gaagaggagg atgagacccc gcggccgagg 240 cagcctgtca agagccgcga gaatgggcgg aaggggaagg cagacccacc cgttgcgcga 300 tctcgtcgac gtaagtacga ggatgacgat gactactcgg aagaagaaga cgatcgggtc 360 gacgagtacg gcgaggatct tgaggaggag gaagaggatc ttgaggagga ggaagaggag 420 gacgatgagg cgccacgatc caagcgcatg aagaaacgtg gtggccgcaa cgtggagggg 480 aagcttcctc tggagcgatc aaatcgccgg aggtatgagg aggacatgga ctttgaccct 540 gacatggatg aggaggaaga ggaggaggat gttgatttcg atcctgaagt ggaggacgag 600 gaggaagaag attttgagga tgaggaagat gatgaattgg 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Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Val Asp 180 185 190 Phe Asp Pro Glu Val Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Phe Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Asp Asp Glu Leu Glu Ala Thr Lys Val Arg Val Lys Asn Met Gly 210 215 220 Arg Arg Lys Ser Thr Leu Asn Gln Arg Arg Gly Lys Met Lys Ser Ser 225 230 235 240 Ser Lys Val Ala Ser Arg Lys Val Gly Ser Val Lys Ala Arg Asn Ala 245 250 255 Ala Ser Ile Arg Arg Arg Gln Lys Lys Arg Ser Met Leu Asp Arg Tyr 260 265 270 Glu Asp Asp Asp Phe Ile Val Glu Asp Glu Val Met Ala Asp Trp Gln 275 280 285 Pro Arg Lys Lys Ala Arg Ile Arg Lys Gln Met Glu Val Asp Pro Pro 290 295 300 Thr Pro Val Phe Glu Ala Glu Ile Trp Pro Thr Ile Asp Ser Asp Thr 305 310 315 320 Thr Asp Phe Glu Phe Val Thr Ser Asp Glu Glu Ala Ala Ile Ala Glu 325 330 335 Pro Thr Arg Val Ile Lys Lys Gly Arg Lys Lys Arg Val Phe Val Ser 340 345 350 Asp Ser Ser Ser Asp Ser Glu Phe Val Val Ser Asp Lys Glu Leu Gly 355 360 365 Asn Leu Lys Glu Ser Glu Pro Pro Glu Ser Leu Lys Val Leu Pro Ser 370 375 380 Ser Pro Arg Lys Ile Ser Val Thr Gly Asn Gly Glu His Lys Gly Lys 385 390 395 400 Glu Lys Lys Glu Pro Gln Glu Ala Gly Arg Ala Thr Cys Gly Ile Cys 405 410 415 Leu Ser Glu Glu Gln Arg Val Thr Val Gln Gly Val Leu Asp Cys Cys 420 425 430 Ser His Tyr Phe Cys Phe Ala Cys Ile Met Gln Trp Ser Lys Val Glu 435 440 445 Ser Arg Cys Pro Leu Cys Lys Arg Arg Phe Thr Thr Ile Thr Lys Ser 450 455 460 Ser Lys Glu Asp Thr Gly Leu Glu Leu Thr Asn Ser Val Ile Arg Val 465 470 475 480 Glu Glu Arg Asp Gln Val Tyr Gln Pro Thr Glu Glu Glu Ile Arg Arg 485 490 495 Trp Leu Asp Pro Tyr Glu Asn Val Val Cys Ile Glu Cys Asn Gln Gly 500 505 510 Gly Asp Asp Ser Leu Met Leu Leu Cys Asp Ile Cys Asp Ser Ser Ala 515 520 525 His Thr Tyr Cys Val Gly Leu Gly Arg Glu Val Pro Glu Gly Asn Trp 530 535 540 Tyr Cys Gly Gly Cys Arg Leu Asp Gly Glu Ala His Ser Tyr His Asn 545 550 555 560 His Val Asn Gly Asn Ser Gly Met Phe Gly Ala Ile Ser Pro Ile Gly 565 570 575 Thr Phe Glu Arg Gln Gly Ile Asp Leu Asn Val Ser Pro Arg Glu Ile 580 585 590 Pro Arg Gly Asn His Ser Val Glu Ser Gln Ala Ser Thr Ala Gly Ala 595 600 605 Ser Thr Pro Ser Gly Arg Gln Thr Asn Ala Thr Asn Phe Arg Arg Arg 610 615 620 Gln Met His Asp Trp Ile Arg Ser Leu Leu Ser Arg Pro Arg Thr Thr 625 630 635 640 Leu Gly Pro Val Met His His Asn Gly Val His Gln Ser Gly Phe Val 645 650 655 Pro Ser Thr Glu Pro Asp His Met Asn Phe Cys Ala Pro Leu Glu Ser 660 665 670 Asp Thr Leu His Asn Thr Gly Ser Val Pro Gln Ser Glu Pro Ser Gln 675 680 685 Asn Phe His Val Met Ser Glu Ala Asn Thr Ser Glu Thr Ser Phe Gly 690 695 700 Arg His Ala Ala Leu Ser Glu Arg Arg Gln Ile Tyr Glu Arg Phe Phe 705 710 715 720 Met Leu Leu Ser Arg Pro Ser Pro Thr Ile Arg Pro Asp Leu Cys His 725 730 735 Asn Ala Ser Glu His Gly Ser Ser Val Pro Arg Val Glu Pro Asn His 740 745 750 Met Asn Phe His Ala Pro Pro Val Ala Asn Ser Pro Gln Thr Leu Leu 755 760 765 Asp Gly Ile Pro Asn Arg Ser Asn Gly Phe Ser Phe Thr Gln Ala His 770 775 780 Ser Asn Phe Val Asp Gly Asn Asn Phe Gln Gly Thr Glu Gly Val 785 790 795 <110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> OsHIRP1 gene from Oryza sativa for regulating high temperature stress resistance of plant and uses thereof <130> PN19419 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2400 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggggaagg gaggggaagg ggcggttccc gtgggggaga gcggcgggcg gcggcggagg 60 aggccgggcg aggacggagg cgacgacgac gacgaggagt atgtggtgga ggaggatgag 120 gaggaagagt gcgacgagga tctgtctgcc tcgagcgccg gcgagggagg agagggcaca 180 gacgaggaat acgaagaggg tgatgaggac gaagaggagg atgagacccc gcggccgagg 240 cagcctgtca agagccgcga gaatgggcgg aaggggaagg cagacccacc cgttgcgcga 300 tctcgtcgac gtaagtacga ggatgacgat gactactcgg aagaagaaga cgatcgggtc 360 gacgagtacg gcgaggatct tgaggaggag gaagaggatc ttgaggagga ggaagaggag 420 gacgatgagg cgccacgatc caagcgcatg aagaaacgtg gtggccgcaa cgtggagggg 480 aagcttcctc tggagcgatc aaatcgccgg aggtatgagg aggacatgga ctttgaccct 540 gacatggatg aggaggaaga ggaggaggat gttgatttcg atcctgaagt ggaggacgag 600 gaggaagaag attttgagga tgaggaagat gatgaattgg aagcgactaa ggtgagggtt 660 aagaatatgg ggcggcgaaa gtctactttg aatcagcgac gagggaagat gaagagcagc 720 tctaaggtgg ccagtcggaa ggtgggttca gtcaaggcaa ggaacgctgc gtctataaga 780 cggaggcaga aaaaacgttc aatgcttgat cgttatgagg atgacgactt cattgtggag 840 gacgaggtta tggctgattg gcaaccaagg aaaaaggcta gaattaggaa gcagatggag 900 gttgatcctc cgacaccagt ttttgaggct gagatatggc ctactattga ttcagacacg 960 acagacttcg aatttgtaac atccgatgag gaagcagcca ttgctgagcc tactagggtt 1020 attaagaagg ggaggaagaa aagggtattt gtgtcagatt catcctcaga ttctgaattc 1080 gttgtatcag ataaggaatt ggggaatttg aaggagtctg agcctccaga gtctctgaaa 1140 gtgctgcctt catcacccag gaagatttct gttacaggta atggggagca caaggggaag 1200 gagaaaaagg aaccacagga ggctggaagg gcaacgtgcg ggatttgcct ttctgaagaa 1260 cagagagtga ctgtgcaggg tgtgctggat tgctgttcac actatttttg ctttgcatgc 1320 atcatgcaat ggtctaaggt tgagtcaagg tgtccgttgt gtaaacggcg gttcacaaca 1380 atcacaaagt cgtcaaagga ggatactggt ttggaactga caaattctgt aattagggtt 1440 gaagaacgtg atcaggttta tcagcctacg gaagaggaaa taagacgttg gctagatcca 1500 tacgagaatg ttgtgtgcat agagtgcaat caaggtggtg atgacagtct catgttacta 1560 tgcgatattt gtgactcctc agcacatact tactgtgttg gtttgggaag agaagtacct 1620 gaaggaaatt ggtactgtgg aggttgtaga ctcgatggcg aagcacattc ataccataat 1680 catgtgaatg gcaattctgg gatgtttggt gcaatttcac caattggcac ttttgaaagg 1740 caggggattg atctaaatgt atctccaaga gagattccta ggggaaatca ttctgttgag 1800 tctcaagctt ctactgcagg agcatcaact ccatctggaa ggcagacaaa cgcaacgaat 1860 tttagaagac gtcaaatgca tgactggata cgcagtttgc tttctagacc aaggacaaca 1920 cttgggccag ttatgcatca taatggtgtg catcagagtg gttttgtacc aagcactgaa 1980 ccagaccaca tgaacttttg cgcaccatta gaatctgaca ctttacacaa cactgggtct 2040 gtaccacaaa gtgaaccaag ccagaacttc catgttatgt cagaagccaa cacttcagag 2100 acttcctttg gaaggcatgc agctctttct gaaagacgtc aaatttatga acgttttttc 2160 atgttgctat ctagaccaag cccgactatt agaccggact tgtgccataa tgcctcagag 2220 catggtagtt ctgtaccaag agttgaacca aaccacatga actttcatgc tccgccagta 2280 gccaacagtc cacaaactct gcttgatggc attccaaacc gcagcaatgg tttttctttt 2340 actcaggctc acagtaattt tgtagatgga aacaacttcc aaggaactga aggtgtctag 2400 2400 <210> 2 <211> 799 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Gly Lys Gly Gly Glu Gly Ala Val Pro Val Gly Glu Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Pro Gly Glu Asp Gly Gly Asp Asp Asp Asp Glu 20 25 30 Glu Tyr Val Val Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Cys Asp Glu Asp Leu 35 40 45 Ser Ala Ser Ser Ala Gly Glu Gly Gly Glu Gly Thr Asp Glu Glu Tyr 50 55 60 Glu Glu Gly Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp Glu Thr Pro Arg Pro Arg 65 70 75 80 Gln Pro Val Lys Ser Arg Glu Asn Gly Arg Lys Gly Lys Ala Asp Pro 85 90 95 Pro Val Ala Arg Ser Arg Arg Arg Lys Tyr Glu Asp Asp Asp Asp Tyr 100 105 110 Ser Glu Glu Glu Asp Asp Arg Val Asp Glu Tyr Gly Glu Asp Leu Glu 115 120 125 Glu Glu Glu Glu Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Ala 130 135 140 Pro Arg Ser Lys Arg Met Lys Lys Arg Gly Gly Arg Asn Val Glu Gly 145 150 155 160 Lys Leu Pro Leu Glu Arg Ser Asn Arg Arg Arg Tyr Glu Glu Asp Met 165 170 175 Asp Phe Asp Pro Asp Met Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Val Asp 180 185 190 Phe Asp Pro Glu Val Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Phe Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Asp Asp Glu Leu Glu Ala Thr Lys Val Arg Val Lys Asn Met Gly 210 215 220 Arg Arg Lys Ser Thr Leu Asn Gln Arg Arg Gly Lys Met Lys Ser Ser 225 230 235 240 Ser Lys Val Ala Ser Arg Lys Val Gly Ser Val Lys Ala Arg Asn Ala 245 250 255 Ala Ser Ile Arg Arg Arg Gln Lys Lys Arg Ser Met Leu Asp Arg Tyr 260 265 270 Glu Asp Asp Asp Phe Ile Val Glu Asp Glu Val Met Ala Asp Trp Gln 275 280 285 Pro Arg Lys Lys Ala Arg Ile Arg Lys Gln Met Glu Val Asp Pro Pro 290 295 300 Thr Pro Val Phe Glu Ala Glu Ile Trp Pro Thr Ile Asp Ser Asp Thr 305 310 315 320 Thr Asp Phe Glu Phe Val Thr Ser Asp Glu Glu Ala Ala Ile Ala Glu 325 330 335 Pro Thr Arg Val Ile Lys Lys Gly Arg Lys Lys Arg Val Phe Val Ser 340 345 350 Asp Ser Ser Ser Asp Ser Glu Phe Val Val Ser Asp Lys Glu Leu Gly 355 360 365 Asn Leu Lys Glu Ser Glu Pro Glu Ser Leu Lys Val Leu Pro Ser 370 375 380 Ser Pro Arg Lys Ile Ser Val Thr Gly Asn Gly Glu His Lys Gly Lys 385 390 395 400 Glu Lys Lys Glu Pro Gln Glu Ala Gly Arg Ala Thr Cys Gly Ile Cys 405 410 415 Leu Ser Glu Glu Gln Arg Val Thr Val Gln Gly Val Leu Asp Cys Cys 420 425 430 Ser His Tyr Phe Cys Phe Ala Cys Ile Met Gln Trp Ser Lys Val Glu 435 440 445 Ser Arg Cys Pro Leu Cys Lys Arg Arg Phe Thr Thr Ile Thr Lys Ser 450 455 460 Ser Lys Glu Asp Thr Gly Leu Glu Leu Thr Asn Ser Val Ile Arg Val 465 470 475 480 Glu Glu Arg Asp Gln Val Tyr Gln Pro Thr Glu Glu Glu Ile Arg Arg 485 490 495 Trp Leu Asp Pro Tyr Glu Asn Val Val Cys Ile Glu Cys Asn Gln Gly 500 505 510 Gly Asp Asp Ser Leu Met Leu Leu Cys Asp Ile Cys Asp Ser Ser Ala 515 520 525 His Thr Tyr Cys Val Gly Leu Gly Arg Glu Val Pro Glu Gly Asn Trp 530 535 540 Tyr Cys Gly Gly Cys Arg Leu Asp Gly Glu Ala His Ser Tyr His Asn 545 550 555 560 His Val Asn Gly Asn Ser Gly Met Phe Gly Ala Ile Ser Pro Ile Gly 565 570 575 Thr Phe Glu Arg Gln Gly Ile Asp Leu Asn Val Ser Pro Arg Glu Ile 580 585 590 Pro Arg Gly Asn His Ser Val Glu Ser Gln Ala Ser Thr Ala Gly Ala 595 600 605 Ser Thr Pro Ser Gly Arg Gln Thr Asn Ala Thr Asn Phe Arg Arg Arg 610 615 620 Gln Met His Asp Trp Ile Arg Ser Leu Leu Ser Arg Pro Arg Thr Thr 625 630 635 640 Leu Gly Pro Val Met His His Asn Gly Val His Gln Ser Gly Phe Val 645 650 655 Pro Ser Thr Glu Pro Asp His Met Asn Phe Cys Ala Pro Leu Glu Ser 660 665 670 Asp Thr Leu His Asn Thr Gly Ser Val Pro Gln Ser Glu Pro Ser Gln 675 680 685 Asn Phe His Val Met Ser Glu Ala Asn Thr Ser Glu Thr Ser Phe Gly 690 695 700 Arg His Ala Ala Leu Ser Glu Arg Arg Gln Ile Tyr Glu Arg Phe Phe 705 710 715 720 Met Leu Leu Ser Arg Pro Ser Pro Thr Ile Arg Pro Asp Leu Cys His 725 730 735 Asn Ala Ser Glu His Gly Ser Ser Val Pro Arg Val Glu Pro Asn His 740 745 750 Met Asn Phe His Ala Pro Pro Val Ala Asn Ser Pro Gln Thr Leu Leu 755 760 765 Asp Gly Ile Pro Asn Arg Ser Asn Gly Phe Ser Phe Thr Gln Ala His 770 775 780 Ser Asn Phe Val Asp Gly Asn Asn Phe Gln Gly Thr Glu Gly Val 785 790 795

Claims

A plant comprising the step of overexpressing the OsHIRP1 gene by transforming plant cells with a recombinant vector containing a gene encoding the rice-derived OsHIRP1 ( Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) protein consisting of the amino acid of SEQ ID NO: 2 How to increase high temperature stress tolerance.

delete

Overexpressing the OsHIRP1 gene by transforming plant cells with a recombinant vector containing a gene encoding a rice-derived OsHIRP1 ( Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; And
Re-differentiating the plant from the transformed plant cell; method for producing a transgenic plant having increased resistance to high temperature stress.

delete

Transgenic plants with increased resistance to high temperature stress prepared by the method of claim 4.

The transformed seed of the plant of claim 6.

Consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a composition for increasing high temperature stress tolerance of plants containing a gene encoding a rice-derived OsHIRP1 ( Oryza sativa heat-induced RING finger protein 1) protein as an active ingredient.