KR101862755B1 - AtSIZ1 gene from Arabidopsis thaliana for increasing environmental stress resistance of plant and uses thereof - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to an Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase (AtSIZ1) gene derived from Arabidopsis thaliana for increasing environmental stress resistance of plants and uses thereof. Arabidopsis thaliana plants in which AtSIZ1 gene is knocked out are resistant to stress by altering the balance of post-transitional modification mechanism under high temperature or dry conditions, and can provide an effective method capable of increasing stress resistance through the control of the expression of the AtSIZ1 gene in plants, and is thus expected to be useful in developing a technology capable of increasing productivity of related plants.

Description

식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 애기장대 유래의 AtSIZ1 유전자 및 이의 용도{AtSIZ1 gene from Arabidopsis thaliana for increasing environmental stress resistance of plant and uses thereof}The AtSIZ1 gene from Arabidopsis which increases the environmental stress tolerance of a plant and its use (AtSIZ1 gene from Arabidopsis thaliana for increasing environmental stress resistance of plant and uses thereof)

본 발명은 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 애기장대 유래의 AtSIZ1 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the AtSIZ1 gene derived from Arabidopsis thaliana and its use for increasing environmental stress tolerance of plants.

착생 유기체인 식물은 주변환경의 불리한 변화들에 고도로 적응하여 혹독한 생물적 및 비생물적 스트레스에 적응하도록 그들의 발달 프로그램을 조절한다. 식물은 주변환경의 변화에 적응할 수많은 메커니즘을 이용한다. 그 중 한가지 반응 메커니즘은 번역 후 변형인데, 여기서 메틸 및 포스페이트기, 유비퀴틴 및 SUMO(small ubiquitin-related modifier)와 같은 분자들이 표적 단백질에 부가되어 그들의 안정성 및 기능에 영향을 미친다.Plants that are co-host organisms adjust their developmental programs to adapt to adverse changes in the environment and adapt to harsh biological and abiotic stresses. Plants use a number of mechanisms to adapt to changes in the surrounding environment. One reaction mechanism is post-translational modification, where molecules such as methyl and phosphate groups, ubiquitin and small ubiquitin-related modifiers (SUMO) are added to the target protein to affect their stability and function.

유비퀴틴은 진핵성 유기체 내 거의 모든 조직에서 발견되는 소형 폴리펩티드이다. 유비퀴틴화는 유비퀴틴의 기질 단백질에 대한 공유 결합으로 유비퀴틴-활성화 효소(E1), 유비퀴틴-컨쥬게이션 효소(E2) 및 유비퀴틴 리가아제(E3)의 순차적 활성을 통해 일어난다. 유비퀴틴화는 표적 단백질에 대해 광범위한 영향을 미치며, 표적 단백질의 세포 내 위치 및 활성의 조절, 단백질-단백질 상호작용, 세포내섭취 수송(endocytotic trafficking), 염증, 번역, 분열 및 성장, 신호 전달, 아폽토시스 및 DNA 수복에 연관된다. 유비퀴틴화 효과는 단일유비퀴틴화 및 다중유비퀴틴화의 2개의 상이한 유비퀴틴 경로에 의해 이루어진다. 단일유비퀴틴화는 단일 유비퀴틴 분자의 표적 단백질의 단일 잔기에 대한 부가인데, 막 운행, 세포내섭취, 바이러스의 버딩 및 히스톤 프로세스와 같은 중요한 세포 기능을 조절한다. 다중유비퀴틴화는 표적 단백질 상의 단일 라이신 잔기 상의 유비퀴틴 사슬의 형성이다. 유비퀴틴은 7개의 라이신(K) 잔기(K6, K11, K27, K29, K33, K48 및 K63)를 갖고 있는데, 이들 전부는 표적 단백질과 이소펩티드 연결을 형성할 수 있다. K48-연결 사슬들은 밝혀진 최초의 것들로, 가장 특성규명이 잘 되어 있는 유형의 유비퀴틴 사슬이다. K63 사슬들 또한 널리 공지되어 있지만, 여타 라이신 사슬, 혼합 사슬, 분지화된 사슬 및 이종 사슬들(유비퀴틴 및 여타 유비퀴틴-유사 단백질들의 혼합물)의 기능들은 아직 명확하지 않다. 대부분의 경우, 다중유비퀴틴화된 단백질들은 26S 프로테아좀 복합체에 의한 분해에 대해 표적화되어 있다. 그러나, 단일유비퀴틴화 및 K63-다중유비퀴틴화는 단백질 활성화 및 신호전달과 연관되어 있다. 유비퀴틴화는 표적 단백질로부터 제거를 통한 유비퀴틴의 세포 유출을 제어하는 탈유비퀴틴화 효소의 큰 패밀리의 작용을 통해 바뀌게 된다.Ubiquitin is a small polypeptide found in almost all tissues in eukaryotic organisms. Ubiquitination occurs through the sequential activation of ubiquitin-activating enzyme (E1), ubiquitin-conjugating enzyme (E2) and ubiquitin ligase (E3) as a covalent bond to the substrate protein of ubiquitin. Ubiquitination has a wide range of effects on target proteins and can be controlled by controlling the intracellular location and activity of the target protein, protein-protein interactions, endocytotic trafficking, inflammation, translation, cleavage and growth, And DNA repair. The effect of ubiquitination is achieved by two different ubiquitin pathways: single ubiquitination and multiple ubiquitination. Single ubiquitination is the addition of a single ubiquitin molecule to a single residue of the target protein, which regulates important cell functions such as membrane motility, intracellular uptake, virus burding, and histone processes. Multiple ubiquitination is the formation of the ubiquitin chain on a single lysine residue on the target protein. Ubiquitin has seven lysine (K) residues (K6, K11, K27, K29, K33, K48 and K63), all of which can form isopeptide linkages with the target protein. The K48-linkage chains are the first to be discovered, the most well-characterized type of ubiquitin chain. Although K63 chains are also well known, the function of other lysine chains, mixed chains, branched chains and heterologous chains (a mixture of ubiquitin and other ubiquitin-like proteins) is not yet clear. In most cases, multiple ubiquitinated proteins are targeted for degradation by the 26S proteasome complex. However, single ubiquitination and K63-multiple ubiquitination are associated with protein activation and signal transduction. Ubiquitination is altered by the action of a large family of deubiquitinating enzymes that control the cellular uptake of ubiquitin through removal from the target protein.

SUMO는 표적 단백질들의 기능을 변경하기 위해 표적 단백질에 공유결합으로 결합되어 있는 또다른 소형 폴리펩티드이다. SUMO에는 약 100개의 아미노산이 있고, 유비퀴틴과는 8 내지 15%만 동일성을 공유함에도 불구하고 유비퀴틴과 유사한 구형 구조로 폴딩한다. 수모화는 유비퀴틴화에 연관되어 있는 것과 유사한 효소 캐스캐이드를 통해 발생한다.SUMO is another small polypeptide that is covalently bound to a target protein to alter the function of the target proteins. SUMO has about 100 amino acids and folds with a ubiquitin-like globular structure, even though 8 to 15% share the same identity with ubiquitin. Enzymes occur via enzyme cascades similar to those associated with ubiquitination.

유비퀴틴과 마찬가지로 SUMO는 SUMO 이소펩티다아제의 작용을 통한 기질 단백질로부터의 제거에 의해 재순환된다. 애기장대 게놈은 SUMO 이소펩티다아제를 코딩하는 7개의 유전자를 포함하는데, 이들은 전부 상이한 SUMO 이소형에 대한 특이적 SUMO 이소펩티다아제 활성을 갖고 있다. SUMO 이소펩티다아제인 EARLY IN SHORT DAYS 4(ESD4)의 소실은 SUMO-컨쥬게이트의 과축적, 조기 개화 및 심한 왜성을 유도한다. SUMO 이소펩티다아제는 개화, 성장 및 염 스트레스에 대한 반응에 연관되어 있다. Like ubiquitin, SUMO is recycled by removal from the substrate protein through the action of the SUMO isopeptidase. The Arabidopsis genome contains seven genes encoding SUMO isopeptidase, all of which have a specific SUMO isopeptidase activity on different SUMO isoforms. The disappearance of the SUMO isopeptidase, EARLY IN SHORT DAYS 4 (ESD4), leads to over-accumulation, premature flowering and severe dwarfing of the SUMO-conjugate. SUMO isopeptidase is associated with response to flowering, growth and salt stress.

유비퀴틴과는 대조적으로 SUMO는 분해를 위한 태그 단백질에 일반적으로 이용되지 않는다. 대신, 수모화는 단백질의 세포내 소기관 위치 지정, 단백질 기능 및 안정화, 핵-세포질 수송, 전사 조절, 아폽토시스, 스트레스 반응, 세포-주기 진행, 미토콘드리아 동역학 및 DNA 손상에 대한 반응에 영향을 준다. 최근 연구는 다중수모화된 단백질이 SUMO-표적화 유비퀴틴 리가아제(STUbLs)에 의해 유비퀴틴화되는 것을 보여주는데, 이는 수모화 및 유비퀴틴화 시스템 사이의 연관성을 나타낸다.In contrast to ubiquitin, SUMO is not commonly used for tagged proteins for degradation. Instead, humoral influences the response of proteins to cellular localization, protein function and stabilization, nuclear-cytoplasmic transport, transcriptional regulation, apoptosis, stress response, cell-cycle progression, mitochondrial kinetics and DNA damage. Recent studies show that multi-hydrated proteins are ubiquitinated by SUMO-targeted ubiquitin ligases (STUbLs), indicating a link between humoral and ubiquitination systems.

SIZ1는 RING-형 도메인, Siz-PIAS RING(SP-RING) 및 염색질 조직화 도메인, SAF-A/B-Acinus-PIAS(SAP)을 가진 E3 SUMO 리가아제이다. 애기장대 E3 SUMO 리가아제는 발아, 영양소 동화, 호르몬 신호전달 및 개화를 포함한 여러 발달 프로세스와 연관되어 있다.SIZ1 is an E3 SUMO ligase with a RING-type domain, Siz-PIAS RING (SP-RING) and a chromatin organization domain, SAF-A / B-Acinus-PIAS (SAP). Arabidopsis E3 SUMO ligase is associated with several developmental processes, including germination, nutrient assimilation, hormone signaling and flowering.

CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1(COP1)은 RING-핑거 모티프, 코일드-코일 도메인 및 WD40 반복체로 이루어진 E3 유비퀴틴 리가아제이며, 이량체로서 기능한다. COP1는 전사 인자 및 광수용체를 포함한 다양한 표적 단백질들을 다중유비퀴틴화하는데, 26S 프로테오좀 복합체에 의한 그들의 분해를 유도함으로써 적외선, 적색, 청색 및 자외선-B 광에 대한 광형태학적 반응, 장기 발생, 스트레스에 대한 반응, 개화 및 광 및 호르몬 신호전달 사이의 혼선과 같은 광범위한 식물 성장 및 발생 프로세스를 조절하게 된다.CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1) is an E3 ubiquitin ligase consisting of a RING-finger motif, a coiled-coil domain and a WD40 repeat, and functions as a dimer. COP1 is multi-ubiquitinated with a variety of target proteins, including transcription factors and photoreceptors, by inducing their degradation by the 26S proteasome complex to produce an optical morphological response to infrared, red, blue and ultraviolet-B light, Response to stress, blossoming and crosstalk between light and hormone signal transduction.

최근 연구들은 AtSIZ1이 COP1에 의해 다중유비퀴틴화된 후, 26S 프로테오좀 복합체에 의해 분해됨을 보고했다. 그러나, AtSIZ1를 포함하는 E3 SUMO 리가아제 근원의 조절 메커니즘은 아직 명백히 이해할 수 있는 것은 아니다. E3 SUMO 리가아제 조절을 더욱 이해하기 위해 본 발명에서는 상이한 주변환경 조건 하에서 AtSIZ1 변화를 조사하였다. Recent studies have reported that AtSIZ1 is multi-ubiquitinated by COP1 and then degraded by the 26S proteasome complex. However, the regulatory mechanism of the E3 SUMO ligase source, including AtSIZ1, is not yet clearly understood. In order to better understand the E3 SUMO ligase regulation, AtSIZ1 changes were investigated under different ambient conditions in the present invention.

한편, 한국등록특허 제1302375호에서는 'ＡｔＳＩＺ1 유전자를 이용한 식물의 질소 동화 및 질병 내성을 조절하는 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1507365호에서는 'AtSIZ1 유전자를 이용한 식물체의 FLC 단백질의 수모화를 억제하는 방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 애기장대 유래의 AtSIZ1 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.Korean Patent No. 1302375 discloses a method for controlling nitrogen assimilation and disease tolerance of a plant using the AtSIZ1 gene and Korean Patent No. 1507365 discloses a method for treating plants using the AtSIZ1 gene, And a plant according to the present invention. However, as described in the present invention, the AtSIZ1 gene derived from Arabidopsis thaliana and its use for increasing the environmental stress tolerance of plants has never been disclosed.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 식물에서 E3 SUMO 리가아제 조절을 더욱 이해하기 위해 상이한 주변환경 조건 하에서 AtSIZ1 변화를 조사한 결과, AtSIZ1는 고온 스트레스에 대한 반응에서 유비퀴틴화되고, 건조에 대한 반응에서 수모화되었으며, AtSIZ1 변화는 COP1 및 ESD4의 활성에 좌우되는 점을 확인하였다. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been achieved in view of the above needs, and the inventors of the present invention have found that AtSIZ1 undergoes changes in AtSIZ1 under different ambient conditions to further understand the regulation of E3 SUMO ligase in plants. As a result, AtSIZ1 is ubiquitinated in response to high temperature stress , And the AtSIZ1 change was dependent on the activity of COP1 and ESD4.

특히, 고온 및 건조 스트레스 환경에서 AtSIZ1 유전자가 발현 저해된 애기장대 식물체의 경우 내성을 가지는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.Especially, in high temperature and dry stress environment, AtSIZ1 The present inventors completed the present invention by confirming that the Arabidopsis plant having a gene-inhibited expression has resistance.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 애기장대 유래 AtSIZ1(Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention relates to a method for producing a plant resistant to environmental stress including a step of transforming a plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding a Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase protein derived from Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase To provide a method of controlling.

또한, 본 발명은 애기장대 유래 AtSIZ1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및The present invention also relates to a method for producing a plant cell, which comprises transforming a plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding a Arabidopsis thaliana InSIZ1 protein; And

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.And regenerating the plant from the transformed plant cell. The present invention also provides a method of producing a transgenic plant having resistance to environmental stress.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.In addition, the present invention provides transgenic plants and seeds thereof, which are prepared by the above method and whose tolerance to environmental stress is regulated.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래 AtSIZ1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for controlling environmental stress tolerance of a plant, which comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and which contains a gene coding for the Arabidopsis thaliana AtSIZ1 protein as an active ingredient.

본 발명의 AtSIZ1 유전자가 넉아웃된 애기장대 식물체는 고온이나 건조 조건 하에서 번역 후 변형(post-translational modification) 조절 기작의 균형이 변하여 스트레스에 대한 저항성을 갖게 하므로, 본 발명은 식물체에서 AtSIZ1 유전자의 발현 조절을 통해 스트레스 저항성을 증대시킬 수 있는 효과적인 방법을 제공할 수 있어, 관련 식물체의 생산성을 증대할 수 있는 기술 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.Since the AtSIZ1 knockout Arabidopsis plants according to the present invention have a balance of post-translational modification control mechanism under high temperature and dry conditions and are resistant to stress, the present invention relates to the expression of the AtSIZ1 gene in plants It is possible to provide an effective method for increasing stress resistance through regulation, and thus it is expected to be usefully used in the development of technology for increasing the productivity of related plants.

도 1은 AtSIZ1가 고온 스트레스 하에 COP1 활성을 통해 탈유비퀴틴화되는 것을 확인한 결과를 나타낸다. (A) 형질전환 XVE - DN - COP1 - Myc 6 식물을 β-에스트라디올이 있는 액체 배지에서 배양하여 DN-COP1 발현을 유도했다. 15시간의 배양 후, 식물을 37℃로 예열한 액체 MS 배지로 처리했다. 시료를 0, 10, 20 및 30분 동안의 처리 후 수집하고, AtSIZ1 및 DN-COP1-Myc6을 항-AtSIZ1 또는 항-Myc 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 검출했다. 튜불린을 로딩 대조군으로 이용했다. (B) 형질전환 XVE - COP1 - Myc 6 식물을 β-에스트라디올이 있는 액체 배지에서 배양하여 COP1 발현을 유도했다. 15시간 동안의 배양 후, 식물을 37℃로 예열한 액체 MS 배지로 처리했다. 시료를 5분 동안의 처리 후 수집하고, AtSIZ1 및 COP1-Myc6을 항-AtSIZ1 또는 항-Myc 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 검출했다. 튜불린을 로딩 대조군으로 이용했다.
도 2는 AtSIZ1 유비퀴틴화가 ESD4의 과발현에 의해 증가되는 것을 확인한 결과를 나타낸다. (A) 총 단백질을 MS 배지에서 성장시킨 10-일령 야생형 및 esd4 식물로부터 추출하고, AtSIZ1 경향을 항-AtSIZ1 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 평가했다. 튜불린을 로딩 대조군으로 이용했다. (B) MS 배지에서 성장시킨 10일령 야생형 및 ESD4-과발현 형질전환 식물을 37℃로 예열한 액체 MS 배지로 처리했다. 3분 동안 처리 후, 총 단백질을 추출하고, AtSIZ1를 항-AtSIZ1 또는 항-Myc 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 검출했다. 튜불린을 로딩 대조군으로 이용했다.
도 3은 siz1 돌연변이체가 고온 스트레스에 내성을 나타내는 것을 확인한 결과를 나타낸다. MS 배지 상에서 발아 및 성장시킨 5일령(A-C) 또는 2주령(D-F)의 야생형, siz1 -2 및 siz1 -3 모종을 열 충격 처리에 적용했다. 야생형, siz1 -2 및 siz1 -3 모종의 표현형을 각 섹션의 좌측에 도식적으로 제시한 상이한 열 충격 처리 후 시험했다. 열처리 후 5일 또는 1주째에 식물을 촬영했다. 화살표는 백화된 좌엽을 표시한다. d, 일; m, 분; w, 주.
도 4는 AtSIZ1 수모화가 건조 스트레스에 의해 유도되는 것을 확인한 결과를 나타낸다. (A) MS 배지에서 성장시킨 10일령 야생형 식물을 37℃에서 예열한 액체 MS 배지로 처리했다. 3분 동안 처리 후, 총 단백질을 식물로부터 추출하고, AtSIZ1를 항-AtSIZ1 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 검출했다. 별표는 유비퀴틴화된 AtSIZ1 밴드를 표시한다. 튜불린을 로딩 대조군으로 이용했다. (B) MS 배지에서 성장시킨 10일령 야생형 식물을 4시간 동안 건조시켰다. 식물을 수집하고, 총 단백질을 추출했다. AtSIZ1를 항-AtSIZ1 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 검출했다. 튜불린을 로딩 대조군으로 이용했다.
도 5는 AtSIZ1 수모화가 건조 스트레스 동안 자극되는 것을 확인한 결과를 나타낸다. (A) MS 배지에서 성장시킨 10일령 야생형 및 esd4 식물을 4시간 동안 건조시켰다. 식물을 수집하고, 총 단백질을 추출했다. AtSIZ1를 항-AtSIZ1 항체를 이용하는 웨스턴 블랏 분석으로 검출했다. 튜불린을 로딩 대조군으로 이용했다.
도 6은 AtSIZ1가 esd4 및 cop1 -4 돌연변이체에서 수모화된 형태로 축적되는 것을 확인한 결과를 나타낸다. (A) 10일령 야생형 및 cop1 -4 식물을 MG132의 존재 또는 부재 하에 처리했다. 총 단백질을 시료로부터 추출하고, AtSIZ1를 항-AtSIZ1 항체를 사용한 웨스턴 블랏 분석으로 검출했다. 튜불린을 로딩 대조군으로 이용했다. (B) XVE-COP1-Myc6을 보유하고 있는 10일령 형질전환 모종을 β-에스트라디올로 처리하여 COP1 발현을 유도했다. 15시간 동안의 배양 후, 식물을 37℃로 예열한 액체 MS 배지로 처리했다. 5분 동안의 처리 후 시료를 수집했다. 총 단백질을 야생형, esd4 및 cop1 -4 식물로부터 그리고 열-처리된 형질전환 식물로부터 추출했다. AtSIZ1 및 COP1-Myc6를 항-AtSIZ1 또는 항-Myc 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 검출했다. 튜불린을 로딩 대조군으로 이용했다.
도 7은 AtSIZ1가 생체내에서 단일수모화 또는 이중수모화되는 것을 확인한 결과를 나타낸다. (A) SUMO-컨쥬게이트를 XVE - His 6 - HA 4 - SUMO1를 보유하는 10일령 식물로부터 정제하고, 항-HA 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 검출했다. (B) 동일한 용출된 분획을 항-AtSIZ1 항체를 이용하는 웨스턴 블랏 분석으로 검사했다.
도 8은 siz1 돌연변이체가 건조 스트레스에 내성을 나타내는 것을 확인한 결과를 나타낸다. (A) 야생형, siz1 -2, 및 siz1 -3 종자를 토양에 파종하고, 30일 동안 물을 주지 않았다. (B) 식물에 5일 동안 물을 주고, 촬영했다.FIG. 1 shows the results of confirming that AtSIZ1 is deubiquitinated through COP1 activity under high temperature stress. (A) Transgenic XVE - DN - COP1 - the Myc 6 plants were incubated in a liquid medium with a β- estradiol DN-COP1 Lt; / RTI > After 15 hours of incubation, the plants were treated with liquid MS medium pre-warmed to 37 占 폚. Sample 0, 10, was detected by the post-processing and collecting, AtSIZ1 and DN-6 COP1-Myc Western blot analysis using an anti--AtSIZ1 -Myc or wherein the antibody in the 20 and 30 minutes. Tubulin was used as a loading control. (B) Transgenic XVE - COP1 - by culturing the plants in a liquid medium with a Myc 6 β- estradiol COP1 Lt; / RTI > After 15 hours of incubation, the plants were treated with liquid MS medium pre-warmed to 37 占 폚. Collecting the sample after the treatment for 5 minutes, it was detected by Western blot analysis using AtSIZ1 COP1 and 6-Myc or anti-anti--AtSIZ1 -Myc antibody. Tubulin was used as a loading control.
FIG. 2 shows the results of confirming that AtSIZ1 ubiquitination is increased by overexpression of ESD4. (A) Total protein was extracted from 10-day old wild-type and esd4 plants grown in MS medium and AtSIZ1 trend was evaluated by western blot analysis using anti-ATSIZ1 antibody. Tubulin was used as a loading control. (B) 10 day old wild-type and ESD4-overexpressed transgenic plants grown on MS medium were treated with liquid MS medium pre-warmed to 37 占 폚. After treatment for 3 minutes, the total protein was extracted and AtSIZ1 was detected by western blot analysis with anti-AtSIZl or anti-Myc antibody. Tubulin was used as a loading control.
Figure 3 shows the results of confirming that the sizl mutant exhibits resistance to high temperature stress. The germination and growth wild type, siz1 -2 and -3 siz1 seedlings of which five days of age (AC) or two weeks (DF) on the MS medium was applied to a heat shock treatment. The phenotype of the wild-type, siz1 -2 and sizl- 3 seedlings was tested after different heat shock treatments schematically presented on the left side of each section. Plants were photographed 5 days or 1 week after the heat treatment. The arrow indicates the white left leaf. d, day; m, min; w, note.
Fig. 4 shows the result of confirming that AtSIZ1 humification is induced by drying stress. (A) 10 days old wild-type plants grown in MS medium were treated with liquid MS medium pre-warmed at 37 占 폚. After treatment for 3 minutes, total protein was extracted from the plants and AtSIZ1 was detected by western blot analysis with anti-ATSIZ1 antibody. The asterisk denotes the ubiquitinated AtSIZ1 band. Tubulin was used as a loading control. (B) 10 days old wild-type plants grown in MS medium were dried for 4 hours. Plants were harvested and total protein extracted. AtSIZ1 was detected by western blot analysis using anti-ATSIZ1 antibody. Tubulin was used as a loading control.
Figure 5 shows the results of confirming that AtSIZ1 humification is stimulated during dry stress. (A) 10 days old wild-type and esd4 plants grown in MS medium were dried for 4 hours. Plants were harvested and total protein extracted. AtSIZ1 was detected by western blot analysis using anti-ATSIZl antibody. Tubulin was used as a loading control.
6 shows a result confirming that AtSIZ1 is accumulated in the animal hair type that in the esd4 mutant and cop1 -4. (A) it was treated with 10-day-old wild-type and cop1 -4 plants in the presence or absence of MG132. Total protein was extracted from the sample and AtSIZl was detected by western blot analysis using anti-ATSIZ1 antibody. Tubulin was used as a loading control. (B) 10-day-old transgenic seedlings carrying XVE-COP1-Myc 6 were treated with? -Estradiol to induce COP1 expression. After 15 hours of incubation, the plants were treated with liquid MS medium pre-warmed to 37 占 폚. Samples were collected after 5 minutes of treatment. The total protein from the wild, esd4 and cop1 -4 plants and heat-treated were extracted from transgenic plants. Wherein the AtSIZ1 COP1 and 6-Myc were detected by western blot analysis using anti -Myc -AtSIZ1 or antibody. Tubulin was used as a loading control.
FIG. 7 shows the result of confirming that AtSIZ1 is monohydrated or double-hydrated in vivo. (A) a conjugated SUMO- XVE - His 6 - HA 4 - purified from 10 day-old plants holding SUMO1, and was detected by Western blot analysis using an anti--HA antibody. (B) The same eluted fractions were examined by Western blot analysis using anti-ATSIZl antibody.
Figure 8 shows the results of confirming that the sizl mutant is resistant to drying stress. (A) The wild type, siz1 -2 , and siz1 -3 seeds were sown in the soil and did not water for 30 days. (B) The plants were watered for 5 days and photographed.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 애기장대 유래 AtSIZ1(Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 조절하는 방법을 제공한다. In order to accomplish the object of the present invention, the present invention relates to a method for transforming a plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding a Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase protein derived from Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase Lt; RTI ID = 0.0 > resistance. ≪ / RTI >

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 애기장대 유래 AtSIZ1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 비형질전환체에 비해 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다. The method according to one embodiment of the present invention is characterized in that plant cells inhibit the expression of the gene coding for the Arabidopsis thaliana AtSIZ1 protein, thereby increasing tolerance of the plant to environmental stress as compared with the non-transformant. It does not.

본 발명에서 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스(biotic stress)와 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로 대별된다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 가뭄(건조), 저온, 고온 및 산화 스트레스 등이 포함된다. "환경 스트레스 내성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.In the present invention, " environmental stress " refers to an external factor that lowers the growth or productivity of a plant, and is roughly divided into biotic stress and abiotic stress. Biological stresses are typically pathogens. Abiotic stresses include high salt, drought (dry), low temperature, high temperature and oxidative stress. The term " environmental stress tolerance " refers to a trait that suppresses or delays plant growth or productivity deterioration due to environmental stress.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 고온 또는 건조 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to an embodiment of the present invention, the environmental stress may be high temperature or dry stress, but is not limited thereto.

본 발명에 따른 AtSIZ1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, AtSIZ1 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The AtSIZ1 protein according to the present invention may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the AtSIZ1 gene may comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.

본 발명의 AtSIZ1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 활성을 의미한다.The AtSIZ1 protein of the present invention comprises a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a functional equivalent of the protein. Is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 90% or more, more preferably 90% or more, Quot; refers to a protein having a homology of at least 95% with a physiological activity substantially equivalent to that of the protein represented by SEQ ID NO: 2. &Quot; Substantially homogenous bioactivity " means an activity that regulates environmental stress tolerance of a plant.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포내 재도입된 것이다.The term " recombinant " refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, heterologous peptide or heterologous nucleic acid. The recombinant cell can express a gene or a gene fragment that is not found in the natural form of the cell in one of the sense or antisense form. In addition, the recombinant cell can express a gene found in a cell in its natural state, but the gene has been modified and reintroduced intracellularly by an artificial means.

본 발명에서, 상기 AtSIZ1 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다.In the present invention, the AtSIZ1 The gene sequence may be inserted into a recombinant expression vector. The term " recombinant expression vector " means a bacterial plasmid, a phage, a yeast plasmid, a plant cell virus, a mammalian cell virus, or other vector. In principle, any plasmid and vector can be used if it can replicate and stabilize within the host.

본 발명의 AtSIZ1 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.Expression vectors comprising the AtSIZl gene sequences of the invention and appropriate transcription / translation control signals can be constructed by methods known to those skilled in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis techniques, and in vivo recombination techniques. The DNA sequence can be effectively linked to appropriate promoters in the expression vector to drive mRNA synthesis. The expression vector may also include a ribosome binding site and a transcription terminator as a translation initiation site.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.A preferred example of the recombinant vector of the present invention is a Ti-plasmid vector capable of transferring a so-called T-region to a plant cell when present in a suitable host, such as Agrobacterium tumefaciens. Other types of Ti-plasmid vectors (see EP 0 116 718 B1) are currently used to transfer hybrid DNA sequences to plant cells or protoplasts in which new plants capable of properly inserting hybrid DNA into the plant's genome can be produced have. A particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is a so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and U.S. Patent No. 4,940,838. Other suitable vectors that can be used to introduce the DNA according to the invention into the plant host include viral vectors such as those that can be derived from double-stranded plant viruses (e. G., CaMV) and single- For example, from non -complete plant virus vectors. The use of such vectors may be particularly advantageous when it is difficult to transform the plant host properly.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The expression vector will preferably comprise one or more selectable markers. The marker is typically a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method, and includes all genes capable of distinguishing a transformed cell from a non-transformed cell. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotics such as kanamycin, G418, Bleomycin, hygromycin, chloramphenicol, Resistant gene, aadA gene, and the like, but are not limited thereto.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.In the recombinant vector of the present invention, the promoter may be CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS, histone promoter, Clp promoter, but is not limited thereto. The term " promoter " refers to the region of DNA upstream from the structural gene and refers to a DNA molecule to which an RNA polymerase binds to initiate transcription. A " plant promoter " is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A " constitutive promoter " is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation. Constructive promoters may be preferred in the present invention because the choice of transformants can be made by various tissues at various stages. Thus, constitutive promoters do not limit selectivity.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.In the recombinant vector of the present invention, conventional terminators can be used. Examples thereof include nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium tumefaciens ) Terminator of the Octopine gene, and the rrnB1 / B2 terminator of E. coli, but the present invention is not limited thereto. Regarding the need for terminators, it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells. Therefore, the use of a terminator is highly desirable in the context of the present invention.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 동물세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.When the vector of the present invention is transformed into eukaryotic cells, yeast ( Saccharomyce cerevisiae), and the like insect cells, animal cells (e.g., CHO cells (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cell may be used. The host cell is preferably a plant cell.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.The method of delivering the vector of the present invention into a host cell can be carried out by injecting a vector into a host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, can do.

또한, 본 발명은 애기장대 유래 AtSIZ1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다. The present invention also relates to a method for producing a plant cell, which comprises transforming a plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding a Arabidopsis thaliana InSIZ1 protein; And regenerating the plant from the transformed plant cell. The present invention also provides a method for producing a transgenic plant having a tolerance to environmental stress.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 애기장대 유래 AtSIZ1 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 비형질전환체에 비해 식물의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.The method according to one embodiment of the present invention is characterized by inhibiting the expression of the Arabidopsis thaliana AtSIZ1 gene in plant cells, thereby increasing tolerance of the plant to environmental stress as compared to the non-transformant.

바람직하게는, 상기 AtSIZ1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. Preferably, the AtSIZl protein may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 환경 스트레스는 고온 또는 건조 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to an embodiment of the present invention, the environmental stress may be high temperature or dry stress, but is not limited thereto.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개 될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.The method of the invention comprises the step of transforming a plant cell with a recombinant vector according to the present invention, the transformant is, for example, Agrobacterium tyumeo Pacific Enschede may be mediated by (Agrobacterium tumefiaciens). In addition, the method of the present invention comprises regenerating a transgenic plant from the transformed plant cell. Any of the methods known in the art can be used for regeneration of transgenic plants from transgenic plant cells.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.Transformed plant cells must be regenerated into whole plants. Techniques for the regeneration of mature plants from callus or protoplast cultures are well known in the art for a number of different species.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 환경 스트레스에 대한 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. In addition, the present invention provides transgenic plants and seeds thereof, which are prepared by the above method and whose tolerance to environmental stress is regulated.

바람직하게는, 상기 형질전환 식물체 및 이의 종자는 비형질전환체에 비해 환경 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자이다. Preferably, the transgenic plants and their seeds are transgenic plants and their seeds that have increased resistance to environmental stress compared to non-transformants.

상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 애기장대 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The plant may be selected from the group consisting of Arabidopsis, potato, eggplant, tobacco, red pepper, tomato, burdock, cilantro, lettuce, bellflower, spinach, modern sweet potato, celery, carrot, parsley, parsley, cabbage, cabbage, It may be a dicotyledonous plant such as squash, poultry, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean or pea or a monocotyledon such as rice, barley, wheat, rye, corn, sorghum, oats and onion, But is not limited thereto.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래 AtSIZ1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 환경 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 AtSIZ1 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물체의 환경 스트레스 내성, 바람직하게는 고온 또는 건조 스트레스 내성을 조절할 수 있는 것이다.In addition, the present invention provides a composition for controlling environmental stress tolerance of a plant, which comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and which contains a gene coding for the Arabidopsis thaliana AtSIZ1 protein as an active ingredient. The composition contains a gene encoding an AtSIZ1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient. By transforming a plant with the gene or a recombinant vector containing the gene, the plant is protected against environmental stress tolerance, Or dry stress tolerance.

또한, 본 발명은 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하기 위한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 AtSIZ1 단백질을 코딩하는 유전자의 용도를 제공한다. 상기 AtSIZ1 단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게는 식물체의 고온 또는 건조 스트레스 내성을 조절하는데 이용될 수 있다.In addition, the present invention provides the use of a gene coding for the Arabidopsis derived AtSIZ1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 for controlling the environmental stress tolerance of a plant. The gene coding for the AtSIZ1 protein can be preferably used to control the high temperature or dry stress tolerance of the plant.

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

재료 및 방법Materials and methods

식물 성장 조건 및 스트레스 처리 Plant Growth Conditions and Stress Treatment

애기장대(Arabidopsis thaliana) 에코타입 Col-0, cop1 -4, COP1 형질전환 식물 및 우성-음성 (DN)-COP1 형질전환 식물을 10일 동안 고체 MS 배지에서 22℃에서 16시간 명/8시간 암 광주기로 성장시켰다. 열 처리를 위해 식물을 상기와 같이 성장시킨 후, 2일 동안 액체 배지로 옮겨 적응하도록 했다. 고온 스트레스 처리를 위해, 식물을 표시된 시간 동안 37℃로 예열한 액체 배양 배지에 옮겼다. 건조 스트레스에 대해서는 MS 상에서 성장시킨 식물을 연속적 광 하에 22℃에서 공기에 직접 노출시켰다. Arabidopsis thaliana eco-type Col-0, cop1 -4 , COP1 transgenic plants and dominant-negative (DN) -COP1 transgenic plants were grown in solid MS medium for 10 days at 22 ° C for 16 hours / 8 hours in the dark . Plants were grown as described above for heat treatment and then transferred to a liquid medium for 2 days to adapt. For high temperature stress treatment, the plants were transferred to a liquid culture medium preheated to < RTI ID = 0.0 > 37 C < / RTI > For dry stress, plants grown on MS were directly exposed to air at 22 ° C under continuous light.

생체 내 In vivo AtSIZ1AtSIZ1 의 발현 수준 및 ≪ / RTI > 유비퀴틴화에On ubiquitinization 대한 고온 스트레스의 영향 분석 Analysis of influence of high temperature stress on Korea

XVE - COP1 - Myc 6 (Seo et al., 2003 Nature 423, 995-999) 또는 XVE - DN - COP1 -Myc 6 (Seo et al., 2004 Genes & development 18, 617-622)을 내재한 10일령 식물을 15시간의 광 중에 10μM β-에스트라디올(Sigma)의 존재 또는 부재 하에 MS 배지에서 성장시킨 후 표기된 시간 동안 37℃로 예열한 액체 배지로 옮겼다. 시료를 수집하고, 액체 질소에서 분쇄했다. AtSIZ1 및 COP1-Myc6 수준을 항-AtSIZ1 항체(Kim et al., 2016 Frontiers in Plant Science 7, 1182) 또는 항-Myc 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 이용한 웨스턴 블랏으로 분석했다. 10 days old with the XVE - COP1 - Myc 6 (Seo et al., 2003 Nature 423, 995-999) or XVE - DN - COP1 -Myc 6 (Seo et al., 2004 Genes & development 18, 617-622) The plants were grown in MS medium in the presence or absence of 10 μM β-estradiol (Sigma) in 15 hours of light and then transferred to a liquid medium preheated to 37 ° C. for the indicated time. Samples were collected and ground in liquid nitrogen. AtSIZ1 COP1 and Myc-6 level wherein the -AtSIZ1 antibodies (Kim et al., 2016 Frontiers in Plant Science 7, 1182) or were analyzed by Western blot using an anti--Myc antibody (Santa Cruz Biotechnology).

생체 내 In vivo AtSIZ1AtSIZ1 의 발현 수준 및 ≪ / RTI > 유비퀴틴화에On ubiquitinization 대한  About ESD4ESD4 의 영향 분석Impact Analysis

SUMO 이소펩티다아제의 영향을 MS 배지 상에서 성장시킨 10일령 야생형 및 esd4 돌연변이 유래의 총 단백질 추출물을 이용해 시험했다. AtSIZ1를 항-AtSIZ1 항체를 이용하는 웨스턴 블랏 분석으로 검출했다. AtSIZ1 상에서 고온 스트레스의 영향을 추가로 조사하기 위해, SUMO 이소펩티다아제 ESD4를 과발현하는 형질전환 식물을 제조했다. 전장 ESD4 cDNA를 식물 발현 벡터 pBA002-Myc6로 클로닝하여, 결과적으로 제조된 재조합 플라스미드 35S- ESD4 - Myc 6 를 플로럴 딥 방법(floral dip method)(Clough and Bent, 1998 Plant Journal　16, 735-743)을 이용해 애기장대에 도입했다. 10일령 야생형 및 ESD4-과발현 형질전환 식물을 MS 배지 상에서 성장시킨 후, 37℃에서 예열한 액체 배지로 옮겼다. 3분 동안 처리 후, 시료를 수집하고, 액체 질소에서 분쇄했다. AtSIZ1 및 ESD4 수준을 항-AtSIZ1 항체(Kim et al., 2016 Frontiers in Plant Science 7, 1182) 또는 항-Myc 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 검사했다.Effects of SUMO isopeptidase were tested using total protein extracts from 10 day old wild-type and esd4 mutants grown on MS medium. AtSIZ1 was detected by western blot analysis using anti-ATSIZl antibody. To further investigate the effect of high temperature stress on AtSIZl, transgenic plants overexpressing SUMO isopeptidase ESD4 were prepared. Battleground ESD4 The cDNA was cloned into plant expression vector pBA002-Myc 6, as a result of a recombinant plasmid prepared by the 35S- ESD4-Myc to 6 using the floral dip method (floral dip method) (Clough and Bent, 1998 Plant Journal 16, 735-743) It was introduced into the Arabian pole. Ten-day old wild-type and ESD4-overexpressed transgenic plants were grown on MS medium and then transferred to liquid medium pre-warmed at 37 占 폚. After treatment for 3 minutes, samples were collected and ground in liquid nitrogen. Levels of AtSIZl and ESD4 were examined by Western blot analysis using anti-AtsZ1 antibody (Kim et al., 2016 Frontiers in Plant Science 7, 1182) or anti-Myc antibodies (Santa Cruz Biotechnology).

생체 내 In vivo AtSIZ1AtSIZ1 의 발현 수준 및 ≪ / RTI > 수모화에On the water 대한 건조 스트레스의 영향 분석 Analysis of the effect of dry stress on Korea

10일령 야생형 식물을 MS 배지에서 성장시킨 후, 4시간 동안 22℃의 공기에 노출시켰다. 식물을 수집하고, 시료로부터 총 단백질을 추출했다. AtSIZ1 수준을 항-AtSIZ1 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 검사했다. 건조 스트레스 동안 AtSIZ1의 수준에 대한 SUMO 이소펩티다아제의 영향 분석을 위해, 총 단백질을 MS 배지 상에서 성장시킨 야생형 및 esd4 돌연변이체로부터 추출하고, AtSIZ1 수준을 항-AtSIZ1 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 검사했다(Kim et al., 2016 Frontiers in Plant Science 7, 1182).Ten-day-old wild-type plants were grown in MS medium and then exposed to 22 ° C air for 4 hours. Plants were harvested and total protein extracted from the samples. The AtSIZ1 level was examined by western blot analysis using anti-ATSIZ1 antibody. For the analysis of the effect of SUMO isopeptidase on the level of AtSIZ1 during dry stress, total protein was extracted from wild-type and esd4 mutants grown on MS medium and AtSIZ1 levels were examined by western blot analysis with anti-ATSIZ1 antibody Kim et al., 2016 Frontiers in Plant Science 7, 1182).

cop1cop1 -4-4 돌연변이체에서의  Mutant AtSIZ1AtSIZ1 의 발현 수준 및 ≪ / RTI > 수모화의Warm 결정 decision

MS 배지에서 성장시킨 10일령 야생형 및 cop1 -4 식물을 액체 질소에서 분쇄하고, 동량을 항-AtSIZ1 항체를 이용하는 웨스턴 블랏 분석으로 분석했다. AtSIZ1 의 발현 수준 및 수모화에 대한 프로테아좀 저해의 영향을 검사하기 위해, MS 배지 상에서 성장시킨 10일령 야생형 및 cop1 -4 돌연변이체를 50μM MG132(Calbiochem)으로 15시간 동안 처리했다. 총 단백질을 시료 및 AtSIZ1로부터 추출하고, 항-AtSIZ1 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 검출했다(Kim et al., 2016 Frontiers in Plant Science 7, 1182).10-day old wild-type and cop- 4 plants grown in MS medium were pulverized in liquid nitrogen and the same amount was analyzed by Western blot analysis using anti-ATSIZ1 antibody. To examine the level of AtSIZ1 expression and the effect of proteasome inhibition on hydration, 10-day old wild-type and cop- 4 mutants grown on MS medium were treated with 50 μM MG132 (Calbiochem) for 15 hours. Total protein was extracted from samples and AtSIZl and detected by western blot analysis using anti-ATSIZl antibody (Kim et al., 2016 Frontiers in Plant Science 7, 1182).

SUMO1SUMO1 컨쥬게이트의Conjugate 정제 및 검출 Purification and Detection

6×히스티딘 및 4A(헤마글루티닌)을 코딩하는 DNA 서열을 애기장대 SUMO1 cDNA의 상류에 삽입하고, 결과로서 수득한 재조합체, His 6 HA 4 - SUMO1 DNA를 β-에스트라디올-유도성 벡터 pER8(Zuo et al., 2000, Plant Journal 24, 265-273)에 도입했다. 구축물을 플로럴 딥 방법으로 애기장대에 형질전환시켜(Clough and Bent, 1998 Plant Journal　16, 735-743), SUMO1-과발현 애기장대 계열을 생성했다. SUMO1 컨쥬게이트를 XVE - His 6 - HA 4 - SUMO1 트랜스유전자를 보유하는 식물에서 평가했다. 식물을 MS 배지 상에서 2주 동안 성장시킨 후, 10μM β-에스트라디올로 광 조건 하에 15시간 동안 처리한 후, 공기에 4시간 동안 직접 노출시켰다. 시료를 수합하고, 액체 질소에서 분쇄하고, EDTA이 없는 1×프로테아제 저해 칵테일(Roche) 및 20mM 이미다졸(Sigma)을 함유하는 추출 완충액(20mM Tris HCl pH 8.0, 8M 우레아, 100mM NaH2PO4, 1% Triton X-100, 10mM β-머캅토에탄올)에 재현탁시켰다. 원심분리 후, 상층액을 제조사(Qiagen)의 지시사항에 따라 20 내지 500mM 이미다졸 농도 구배를 이용하는 Ni2 +-NTA 컬럼 상에서 정제했다. 용출된 단백질을 항-HA 항체(Santa Cruz Biotechnology) 또는 항-AtSIZ1 항체(Kim et al., 2016 Frontiers in Plant Science 7, 1182)를 이용하는 웨스턴 블랏 분석으로 검출했다.A DNA sequence encoding 6 × histidine and 4A (hemagglutinin) was inserted upstream of the Arabidopsis SUMO1 cDNA and the resulting recombinant, His 6 HA 4 - SUMO1 DNA was introduced into the? -Estradiol-inducible vector pER8 (Zuo et al., 2000, Plant Journal 24, 265-273). The construct was transformed into Arabidopsis using the floral dip method (Clough and Bent, 1998 Plant Journal 16, 735-743) to generate the SUMO1-overexpressed Arabidopsis family. SUMOl conjugates were evaluated in plants carrying the XVE - His 6 - HA 4 - SUMOl transgene. The plants were grown on MS medium for 2 weeks, treated with 10 μM β-estradiol under light conditions for 15 hours, then directly exposed to air for 4 hours. Samples were pooled, pulverized in liquid nitrogen and extracted with extraction buffer (20 mM Tris HCl pH 8.0, 8 M urea, 100 mM NaH 2 PO 4 , pH 7.5) containing 1 × protease inhibition cocktail (Roche) and 20 mM imidazole 1% Triton X-100, 10 mM [beta] -mercaptoethanol). After centrifugation, the supernatant is centrifuged using a gradient of 20 to 500 mM imidazole concentration according to the manufacturer ' s (Qiagen) Ni < 2 + & gt ; -NTA column. Eluted proteins were detected by western blot analysis using an anti-HA antibody (Santa Cruz Biotechnology) or an anti-ATSIG1 antibody (Kim et al., 2016 Frontiers in Plant Science 7, 1182).

siz1you1 돌연변이체의 성장에 대한 고온 스트레스의 영향력 분석 Analysis of influence of high temperature stress on mutant growth

고온 스트레스 내성을 평가하기 위해, MS 배지 상에서 발아 및 성장시킨 5일령 또는 2주령 야생형, siz1 -2 및 siz1 -3 모종을 이용했다. 5일령 식물을 시험하기 위해, 야생형, siz1 -2 및 siz1 -3 돌연변이체의 종자들을 MS 배지에 파종하여 5일 동안 22℃에서 성장시킨 후, 식물을 3가지 상이한 방식으로 수조에서 처리했다. 첫번째는 식물을 45℃에서 1시간 동안 가열했다. 처리 후, 식물을 5일 동안 22℃에서 더 배양한 후 촬영했다. 두번째는, 식물을 45℃에서 90분 동안 가열했다. 처리 후, 식물을 22℃에서 5일 동안 더 배양한 후 촬영했다. 세번째는, 식물을 37℃에서 1시간 동안 가열한 후, 22℃에서 1시간 동안 배양했다. 45℃에서 180분 동안 추가 처리 후, 식물을 22℃에서 5일 동안 배양한 후 촬영했다. 2주령 식물을 시험하기 위해, 야생형, siz1 -2 및 siz1 -3 돌연변이체의 종자를 MS 배지에 파종하고, 2주 동안 22℃에서 성장시킨 후, 식물을 세가지 상이한 방식으로 수조에서 처리했다. 첫번째는, 식물을 45℃에서 40분 동안 가열했다. 처리 후, 식물을 22℃에서 1주 동안 더 배양한 후 촬영했다. 두번째는, 식물을 37℃에서 1시간 동안 가열한 후 22℃에서 1시간 동안 배양했다. 45℃에서 40분 동안 더 처리 후, 식물을 22℃에서 1주 동안 배양 후 촬영했다. 세번째는, 식물을 37℃에서 1시간 동안 가열한 후, 22℃에서 1시간 동안 배양했다. 45℃에서 160분 동안 추가 처리 후, 식물을 22℃에서 1주 동안 배양한 후 촬영했다. 트레이마다 일정한 수의 식물을 성장시켜, 시험 오차를 최소화했다.To evaluate the high temperature stress tolerance, germinated and grown on MS medium 5 days of age or two weeks old wild-type, was used siz1 -2 and -3 siz1 seedlings. 5 days of age in order to test the plants, wild-type, by inoculating the siz1 -2 and -3 siz1 seeds of the mutant in MS medium were treated, after growing at 22 ℃ for 5 days, the plants in the water tank in three different ways. First, the plants were heated at 45 ° C for 1 hour. After treatment, plants were further incubated at 22 [deg.] C for 5 days and then photographed. Second, the plants were heated at 45 캜 for 90 minutes. After treatment, the plants were further cultured at 22 DEG C for 5 days and then photographed. Third, the plants were heated at 37 ° C for 1 hour and then at 22 ° C for 1 hour. After further treatment at 45 캜 for 180 minutes, the plants were incubated at 22 캜 for 5 days and then photographed. 2 weeks to test plants was treated in the wild type, siz1 -2 and -3 siz1 after planting the seeds of the mutant in MS medium and grown at 22 ℃ for two weeks, the water tank plants in three different ways. First, the plants were heated at 45 ° C for 40 minutes. After the treatment, the plants were further cultured at 22 DEG C for one week and then photographed. Second, the plants were heated at 37 ° C for 1 hour and then at 22 ° C for 1 hour. After further treatment at 45 캜 for 40 minutes, the plants were cultured at 22 캜 for 1 week and then photographed. Third, the plants were heated at 37 ° C for 1 hour and then at 22 ° C for 1 hour. After further treatment at 45 占 폚 for 160 minutes, the plants were cultured at 22 占 폚 for 1 week and then photographed. A certain number of plants were grown per tray, minimizing test errors.

siz1you1 돌연변이체의 성장에 대한 건조 스트레스의 영향 분석 Analysis of the effect of dry stress on the growth of mutants

토양-성장 식물에서 건조 스트레스 내성을 평가하기 위해, 야생형, siz1 -2 및 siz1 -3 돌연변이체의 종자들을 토양에 직접 파종하고, 식물에 30일 동안 물을 주지 않고 점차적 건조에 적용시켰다. 이어서, 식물에 5일 동안 물을 주고 관찰했다. 트레이마다 일정한 수의 식물을 성장시켜 시험 오차를 최소화했다. To assess dry stress tolerance in soil-grown plants, seeds of the wild-type, siz1 -2 and siz1 -3 mutants were directly sown in the soil and applied to gradual drying without watering the plants for 30 days. The plants were then watered for 5 days and observed. Minimal test error by growing a certain number of plants per tray.

실시예Example 1.  One. AtSIZ1AtSIZ1 는 고온 스트레스 하에 Under high temperature stress COP1COP1 에 의해 By 다중유비퀴틴화된다Multiply ubiquitinated ..

선행연구에서는 고온 스트레스의 조건 하에서 SUMO에 의해 수많은 단백질이 변형되는 것을 보여줬다(Kurepa et al., 2003 Journal of Biological Chemistry 278, 6862-6872). 그러나, 고온-유도성 수모화에 연관되는 특정 E3 SUMO 리가아제는 미지로 남아있고, 고온과 같은 스트레스에 대한 반응에서 E3 SUMO 리가아제 자체가 수모화에 의한 조절 대상인 것인지 아니면 열과 같은 스트레스에 반응하여 다른 단백질의 변형이 대상인 것인지 불명확하다.Previous studies have shown that a number of proteins are modified by SUMO under conditions of high temperature stress (Kurepa et al., 2003 Journal of Biological Chemistry 278, 6862-6872). However, the particular E3 SUMO ligase associated with the high temperature-induced hydration remains unknown and, in response to stresses such as high temperature, whether the E3 SUMO ligase itself is the subject of conditioning by hydration or in response to stress such as heat It is unclear whether the modification of other proteins is the target.

COP1(Constitutive photomorphogenic 1)은 AtSIZ1에 대해 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 나타내는데(Kim et al., 2006 Frontiers in Plant Science 7, 1182), 상기 시스템을 스트레스에 대한 반응에서 E3 SUMO 리가아제의 변형 분석에 이용했다. 고온 스트레스-유도성 AtSIZ1 변형은 COP1 및 DN(우성-음성)-COP1 형질전환 식물에서 조사했다. 첫번째로, 고온-유도성 AtSIZ1 유비퀴틴화에 대한 DN-COP1의 영향은 DN-COP1 발현이 β-에스트라디올을 이용해 유도가능한 XVE-DN - COP1 - Myc 6 형질전환 식물을 이용해 조사했다. AtSIZ1은 비-유도성 식물에서 다중유비퀴틴화되나(도 1A), 유비퀴틴화는 DN-COP1의 유도시 차단되어, COP1가 AtSIZ1 유비퀴틴화에 필요함을 시사한다. 이는 β-에스트라디올 유도시 COP1을 과발현한 XVE-COP1 - Myc 6 형질전환 식물에서 고온-유도성 AtSIZ1 유비퀴틴화의 분석에 의해 확인되었다. 유비퀴틴화는 β-에스트라디올을 이용한 COP1 발현의 유도 후 고온에 노출된 XVE-COP1-Myc 6 형질전환 식물체에서 실질적으로 상승되었다(도 1B).COP1 (Constitutive photomorphogenic 1) exhibits E3 ubiquitin ligase activity against AtSIZ1 (Kim et al., 2006 Frontiers in Plant Science 7, 1182), and the system is used for the deformation analysis of E3 SUMO ligase in response to stress did. High temperature stress-inducible AtSIZ1 strains were investigated in COP1 and DN (dominant-negative) -COP1 transgenic plants. First, the high-temperature-inducible of DN-COP1 effect on AtSIZ1 ubiquitination is DN-COP1 expression is inducible XVE using β- estradiol-6 was examined using the Myc transformed plant-DN-COP1. AtSIZ1 is multi-ubiquitinated in non-inductive plants (Fig. IA), suggesting that ubiquitination is blocked upon the induction of DN-COP1, suggesting that COP1 is required for AtSIZ1 ubiquitination. This XVE a overexpressing COP1 when β- estradiol induction was confirmed by analysis of the inductive AtSIZ1 ubiquitination-Myc 6 in a high temperature transformed plant-COP1. Ubiquitination is the XVE exposed to a high temperature after the induction of expression with COP1 β- estradiol - it was substantially elevated in COP1 Myc-6 transgenic plant (Fig. 1B).

실시예Example 2.  2. AtSIZ1AtSIZ1 유비퀴틴화가Ubiquitinizing ESD4ESD4 에 의해 강화된다.Lt; / RTI >

선행기술에서 SUMO-컨쥬게이트의 실질적 축적이 esd4 돌연변이체에서 관찰되었다(Murtas et al., 2003 Plant Cell 15, 2308-2319). ESD4는 SUMO 이소펩티다아제를 코딩하는데, 이는 SUMO를 SUMO-컨쥬게이트로부터 제거한다. 여기서, AtSIZ1 다량성 및 유비퀴틴화에 대한 ESD4의 영향을 esd4 식물에서 분석했다. AtSIZ1 수준은 야생형에 비해 esd4 돌연변이체에서 상승되었다(도 2A). AtSIZ1 유비퀴틴화에 대한 ESD4의 영향은 35S- ESD4 - Myc 6 를 보유하고 있는 ESD4-과발현 형질전환 식물체를 이용해 시험했다. 3분 동안의 고온 스트레스 처리 후, AtSIZ1 유비퀴틴화는 웨스턴 블랏 분석으로 평가했다. ESD4의 과발현은 AtSIZ1 유비퀴틴화의 증가를 초래했다(도 2B). 이는 ESD4가 AtSIZ1에 대한 SUMO 이소펩티다아제로서 작용할 수 있고, ESD4에 의한 AtSIZ1의 탈수모화가 AtSIZ1 유비퀴틴화를 유도함을 시사한다.In the prior art, substantial accumulation of the SUMO-conjugate was observed in the esd4 mutant (Murtas et al., 2003 Plant Cell 15, 2308-2319). ESD4 encodes SUMO isopeptidase, which removes SUMO from the SUMO-conjugate. Here, the effect of ESD4 on AtSIZ1 mass and ubiquitination was analyzed in esd4 plants. The AtSIZ1 level compared to the wild type esd4 mutants (Fig. 2A). AtSIZ1 of ESD4 impact on ubiquitination is 35S- ESD4 - tested using a switch ESD4- overexpressing transgenic plants that hold the Myc 6. After 3 minutes of high temperature stress treatment, AtSIZ1 ubiquitination was evaluated by Western blot analysis. Overexpression of ESD4 resulted in an increase in AtSIZ1 ubiquitination (Fig. 2B). This suggests that ESD4 may act as a SUMO isopeptidase for AtSIZ1 and dehydration of AtSIZ1 by ESD4 induces AtSIZ1 ubiquitination.

실시예Example 3.  3. siz1you1 돌연변이체는 고온 스트레스에 내성이다. Mutants are resistant to high temperature stress.

AtSIZ1의 소실이 고온-스트레스를 받은 식물에서 긍정적인 또는 부정적인 영향을 미치는지 분석했다. 5일령 또는 2주령의 야생형, siz1 -2, 및 siz1 -3 돌연변이체를 세가지 상이한 방식으로 열 충격 처리에 적용했다. 5일령 모종의 경우, 대부분의 야생형 식물에서 심한 백화 현상이 발생했고, 결국 사멸한 반면, siz1 -2 및 siz1 -3 돌연변이체는 45℃에서 1시간 동안 열 처리 후에도 여전히 건강했다(도 3A). 그러나, 다수의 siz1 -2 및 siz1 -3 돌연변이체도, 45℃에서 90분 동안 열처리 후에는, siz1 -2 및 siz1 -3 돌연변이체의 생존율이 야생형보다는 더 높긴 했지만, 백화 현상이 발생했다(도 3B). 추가로, 37℃에서 1 시간 동안의 예비처리 후 45℃에서 180분 동안의 열 처리는 야생형 및 siz1 돌연변이체 모두에서 사멸을 초래했다(도 3C). 2주령 모종의 경우, 45℃에서 40분 동안의 열 처리는 야생형, siz1 -2 및 siz1 -3 돌연변이체의 성장에 영향을 주지 않았다(도 3D). 37℃에서 1시간 동안의 예비처리 후 45℃에서 40분 동안의 열 처리는 야생형에서는 부분적인 좌엽 백화를 초래했지만, siz1 -2 및 siz1 -3 돌연변이체에서는 그렇지 않았다(도 3E). 더욱 혹독한 조건인, 37℃에서 1시간 동안 예비처리 후 45℃에서 160분 동안의 열 처리는 야생형의 사멸을 유발한 반면, siz1 -2 및 siz1 -3 돌연변이체는 여전히 생존했다(도 3F). 흥미롭게도, siz1 -2 돌연변이체는 siz1 -3 돌연변이체에 비해 더욱 내성이었다(도 3F). 고온에 대한 siz1 돌연변이체의 내성은 AtSIZ1가 식물에서 고온 스트레스에 대해 부정적 영향을 미치는 것을 시사한다.We analyzed whether the loss of AtSIZ1 had a positive or negative effect on hot-stressed plants. Five-day or two-week-old wild-type, sizl- 2 , and sizl- 3 mutants were subjected to heat shock treatment in three different ways. In the 5-day-old seedlings, severe whitening occurred in most wild-type plants and eventually died, while the sizl- 2 and sizl- 3 mutants were still healthy after 1 hour of heat treatment at 45 ° C (Fig. 3A). However, after multiple heat-treatment of sizl- 2 and sizl- 3 mutants at 45 ° C for 90 minutes, whitening occurred, although the survival rate of sizl- 2 and sizl- 3 mutants was higher than that of wild type ). In addition, heat treatment at 45 < 0 > C for 180 minutes after pretreatment for 1 hour at 37 [deg.] C resulted in death in both wild type and sizl mutants (Fig. 3C). In the case of 2-week-old seedlings, heat treatment at 45 캜 for 40 minutes did not affect the growth of the wild type, siz1 -2 and siz1 -3 mutants (FIG. 3D). Heat treatment at 45 < 0 > C for 40 min after pretreatment at 37 < 0 > C for 1 h resulted in partial left lobe bleaching in the wild type but not in the siz1 -2 and sizl- 3 mutants (Fig. 3E). Heat treatment at 45 캜 for 160 min after pretreatment for 1 h at 37 캜, which was a more severe condition, caused wild-type death, while sizl- 2 and sizl- 3 mutants still survived (Fig. 3F). Interestingly, siz1 -2 mutant was more resistant than the siz1 -3 mutants (Fig. 3F). The resistance of siz1 mutants to high temperatures suggests that AtSIZ1 has a negative impact on high temperature stress in plants.

실시예Example 4.  4. AtSIZ1AtSIZ1 는 건조 스트레스 하에 Under dry stress 수모화된다Become thickened ..

선행기술의 연구는 건조 스트레스 조건 하에 여러 단백질이 SUMO에 의해 변형됨을 보여줬다(Catala et al., 2007 Plant Cell 19, 2952-2966). AtSIZ1에 대한 건조 스트레스의 영향을 평가하기 위해, 야생형 식물을 4시간 동안 공기 중에 건조시켜 조직 시료 중 AtSIZ1 다량인 점을 웨스턴 블랏 분석으로 평가했다. AtSIZ1 수준은 대조군 및 건조 스트레스 식물에서 유사했다(도 4A). 탈유비퀴틴화된 AtSIZ1와 크기 면에서 유사한 추가적 단백질(상단 밴드)은 건조 스트레스 식물에서만 검출되었다(도 4A 및 4B). 선행기술의 연구는 수모화된 단백질 이동이 SDS-PAGE 분석 동안 약 20kDa 만큼 지연됨을 밝혔다(Johnson, 2004 Annual Review of Biochemistry　73,　355-382). 도 4A에서의 단백질 밴드 1(RB1)의 이동은 상기 지연에 해당하는 것으로, RB1이 모노수모화된 AtSIZ1임을 시사한다. Prior art studies have shown that several proteins are modified by SUMO under dry stress conditions (Catala et al., 2007 Plant Cell 19, 2952-2966). To assess the effect of drying stress on AtSIZ1, wild-type plants were dried in air for 4 hours to assess the AtSIZ1 mass in tissue samples by western blot analysis. The AtSIZ1 level was similar in control and dry stress plants (Fig. 4A). Additional proteins (top band) similar in size to deubiquitinated AtSIZ1 were detected only in dry stress plants (FIGS. 4A and 4B). Prior art studies have shown that humoral protein migration is delayed by about 20 kDa during SDS-PAGE analysis (Johnson, 2004 Annual Review of Biochemistry 73, 355-382). The movement of protein band 1 (RB1) in FIG. 4A corresponds to the delay, suggesting that RB1 is monosmulated AtSIZ1.

AtSIZ1이 풍부한 점에 대한 건조 스트레스의 영향을 또한 esd4 돌연변이체에서 분석했다. 상기 기재된 바와 같이, 야생형에서보다 더 많은 양의 AtSIZ1가 esd4 돌연변이체에서 축적되었다(도 2A). 오직 단일 단백질 단일 밴드가 본래 분석에서 관측되었으나 웨스턴 블랏의 더 긴 노출은 이중유비퀴틴화된 AtSIZ1와 유사한 분자량을 갖고, RB1에 대응하는(도 4A) 추가적인 AtSIZ1 밴드(도 5, 좌측 패널)을 밝혀내어 추가적인 밴드 또한 모노수모화된 AtSIZ1을 나타냄을 시사한다. The effect of dry stress on AtSIZ1-rich points is also evd4 And analyzed in mutants. As described above, a greater amount of AtSIZl than in the wild type was accumulated in the esd4 mutant (Fig. 2A). Only a single protein single band was observed in the original assay, but a longer exposure of the Western blot revealed an additional AtSIZ1 band (Figure 5, left panel) with a molecular weight similar to that of double ubiquitinated AtSIZl and corresponding to RBl (Figure 4A) The additional band also suggests monosmallized AtSIZ1.

건조 스트레스에서 esd4 돌연변이체에서의 AtSIZ1의 웨스턴 분석은 RB1보다 더 큰 제2의 추가적 단백질을 밝혀냈다. 상기 밴드는 지연된 밴드 2(RB2)로 명명했는데(도 5, 우측 패널), 이중수모화된 AtSIZ1를 나타내는 듯하여, AtSIZ1 수모화가 건조 스트레스에 의해 유발될 수도 있음을 시사한다. Esd4 in dry stress Western analysis of AtSIZ1 in the mutants revealed a second additional protein that is larger than RB1. The band was named Delayed Band 2 (RB2) (Fig. 5, right panel), suggesting a double atomized AtSIZ1, suggesting that AtSIZ1 humification may be caused by dry stress.

실시예Example 5.  5. AtSIZ1AtSIZ1 는 The esd4esd4 및  And cop1cop1 -4-4 돌연변이체에서 각각 단일- 및 이중- In the mutants, single- and double- 수모화Humiliation 형태로서 축적되었다. It was accumulated as a form.

본 발명자의 선행 연구에서 AtSIZ1가 명 조건 및 암 조건 모두에서 야생형보다 cop1-4 돌연변이체에서 더욱 다량으로 존재함을 보여줬다(Kim et al., 2016b Frontiers in Plant Science 7, 1182). 상기와 같이, 본래의 웨스턴 블랏을 X-선 필름에 비교적 단시간에 노출시켜, 오직 AtSIZ1 밴드만 나타났다. cop1 -4 돌연변이체에서의 AtSIZ1의 웨스턴 블랏 분석을 반복하고, 사중유비퀴틴화 AtSIZ1와 크기가 유사한 추가적인 상단 단백질 밴드가 관찰되었다(도 6A 및 B). 밴드 강도는 프로테아좀 저해제 MG132 처리에 의해 영향받지 않아(도 6A), 밴드가 유비퀴틴화된 AtSIZ1보다는 수모화되었음을 나타낸다는 점을 강력히 시사한다. 이는 단편이 RB2에서와 같이 이중수모화된 AtSIZ1임을 시사한다(도 5, 우측 패널). 이를 확인하기 위해, 웨스턴 블랏 분석을 esd4 및 cop1 -4 돌연변이체 및 β-에스트라디올 처리 후 열-처리된 XVE-DN - COP1 - Myc 6 형질전환 식물을 이용해 수행했다. RB1 및 RB2이 각각 esd4 및 cop1 -4 돌연변이체에서 검출되었고(도 6B), COP1-Myc6 과발현 식물에서 검출되는 유비퀴틴화된 AtSIZ1 밴드와 비교시 RB1 및 RB2 크기는 각각 이중유비퀴틴화 및 사중유비퀴틴화된 AtSIZ1와 유사하였다.In a previous study of the present inventor, AtSIZ1 was found to be more abundant in the cop1-4 mutant than wild type in both light and dark conditions (Kim et al., 2016b Frontiers in Plant Science 7, 1182). As described above, the original western blot was exposed to the X-ray film in a relatively short time, and only the AtSIZ1 band appeared. repeating the Western blot analysis of AtSIZ1 in cop1 -4 mutant, and the quadruple ubiquitination AtSIZ1 and additional top protein band similar in size was observed (Figure 6A and B). Band intensity is not affected by the proteasome inhibitor MG132 treatment (Fig. 6A), suggesting that the band is more abundant than ubiquitinated AtSIZl. This suggests that the fragment is double-stranded AtSIZ1 as in RB2 (Figure 5, right panel). To confirm this, Western blot analysis after the esd4 and cop1 -4 mutants and β- estradiol treatment heat-Myc were carried out using 6 transformed plant-treated XVE-DN-COP1. RB1 and RB2, respectively, and cop1 -4 esd4 were detected in the mutant (Fig. 6B), COP1-Myc 6 overexpression ubiquitination AtSIZ1 the band and comparison RB1 and RB2 size detected by the plant are each dual-ubiquitination and quadruple ubiquitination Similar to AtSIZ1.

최종적으로, RB1 및 RB2가 수모화된 AtSIZ1인지 여부를 확인하기 위해, SUMO-컨쥬게이트를 정제하여 AtSIZ1의 존재 여부에 대해 분석했다. 각각 니켈 친화성 컬럼 및 웨스턴 블랏 분석으로 SUMO1-컨쥬게이트의 정제 및 검출을 위해 N-말단 His6(6'-히스티딘) 및 HA4(4'-헤마글루티닌)으로 태그된 β-에스트라디올-유도성 SUMO1을 발현하는 형질전환 식물 계열(XVE - His 6 - HA 4 - SUMO1 )을 생성했다. His6-HA4-SUMO1를 발현하는 형질전환 식물을 건조에 노출시켰다. 항-HA 항체를 이용한 웨스턴 블랏에 의한 정제된 SUMO1-컨쥬게이트의 분석은 SUMO1-컨쥬게이트의 정제가 성공적임을 보여줬다(도 7A). 정제된, 항-AtSIZ1 항체와의 SUMO1-컨쥬게이트의 분석은 esd4 및 cop1 -4 돌연변이체에서 검출되는 것(도 6B)과 크기에 있어 상응하는 2개의 명확한 밴드(도 7B)를 밝혀냈다. 그러한 결과들은 단백질 밴드 RB1 및 RB1가 각각 단일수모화 및 이중수모화 AtSIZ1로 이루어져 있으며, AtSIZ1의 단일수모화 및 이중수모화 형태가 각각 esd4 및 cop1 -4 돌연변이체에 축적되어 있음을 나타냈다.Finally, to ascertain whether RB1 and RB2 were AtSizZ1 hydrated, the SUMO-conjugate was purified and analyzed for the presence of AtSZ1. Each nickel affinity column and analyzed by Western blot for the purification and detection of the conjugate SUMO1- N- terminal His 6 (6'- histidine) and HA 4 (4'- hemagglutinin) to tag the β- estradiol ( XVE - His 6 - HA 4 - SUMO 1 ) expressing the inducible SUMO1. Transgenic plants expressing the His 6 -HA 4 -SUMO1 and exposed to drying. Analysis of the purified SUMOl-conjugate by Western blot using an anti-HA antibody showed that purification of the SUMOl-conjugate was successful (Fig. 7A). Revealed two specific bands (Fig. 7B) corresponding to in the SUMO1- analysis of the conjugate of the purified, wherein -AtSIZ1 antibody is detected by the esd4 and cop1 -4 mutant (Fig. 6B) and the size. Such results showed that the protein band RB1 and RB1, respectively, and consists of a single-screen and dual animal hair animal hair AtSIZ1 screen, the single screen animal hair and animal hair dual type that is accumulated in each of AtSIZ1 esd4 and cop1 -4 mutants.

실시예Example 6.  6. siz1you1 돌연변이체는 건조 스트레스에 내성이다. Mutants are resistant to dry stress.

SUMO 컨쥬게이션은 단백질을 안정화 또는 활성화하는 것으로 공지되어 있다. siz1 -2 및 siz1 -3 돌연변이체를 이용해 siz1 돌연변이체가 건조 스트레스에 민감성인지 또는 내성인지 여부를 결정했다. 야생형, siz1 -2 및 siz1 -3 종자들을 직접 토양에 파종하고, 30일 동안 물을 주지 않아 건조 처리했다(도 8A). 이어서, 식물에 다시 물을 주고 5일 후 촬영했다(도 8B). 야생형 식물은 사멸했으나, siz1 -2 및 siz1-3 돌연변이체에서는 성장이 회복되었다(도 8A 및 8B). 이는 AtSIZ1의 소실이 건조 스트레스 내성을 부여함을 시사한다.SUMO conjugation is known to stabilize or activate proteins. Siz1 - 2 and siz1 - 3 mutants were used to determine whether siz1 mutants were susceptible or resistant to dry stress. Wild-type, siz1 do not give the water during the 30 days of sowing directly on soil-2 and -3 siz1 seeds and dried process (Fig. 8A). The plants were then watered again and photographed 5 days later (Fig. 8B). Wild-type plants died, but growth was restored in sizl- 2 and sizl3 mutants (Figures 8A and 8B). This suggests that loss of AtSIZ1 confers dry stress tolerance.

<110> Seoul National University R＆DB Foundation <120> AtSIZ1 gene from Arabidopsis thaliana for increasing environmental stress resistance of plant and uses thereof <130> PN17127 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2622 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggatttgg aagctaattg taaggaaaaa ctttcatatt ttcggataaa agagctcaag 60 gatgtgctca ctcagctggg actttcgaaa cagggaaaga agcaggaact tgtcgaccgg 120 atcttgaccc ttctttctga tgaacaagct gccaggttgt tgtctaaaaa gaatacagtg 180 gcaaaggaag cagttgccaa attagtggac gatacatata ggaaaatgca agtatctggg 240 gcaagtgatt tagcatcaaa aggacaagtg agttcagata ccagtaatct gaaagttaag 300 ggagagcctg aagacccctt ccaaccagaa attaaagttc gatgtgtttg tggaaactcg 360 ctagaaacag actcaatgat acagtgtgag gatccaagat gccatgtttg gcagcatgtt 420 ggctgtgtta ttctcccaga taagcctatg gatgggaatc caccacttcc ggaatcattt 480 tattgtgaaa tctgccgact tactcgagct gacccatttt gggttacagt ggcacatcca 540 ctctctccag tgaggctgac tgcaacgact atcccaaatg atggtgcaag cacaatgcag 600 agtgtggaga gaacatttca 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Asp Ser Met Ile Gln 115 120 125 Cys Glu Asp Pro Arg Cys His Val Trp Gln His Val Gly Cys Val Ile 130 135 140 Leu Pro Asp Lys Pro Met Asp Gly Asn Pro Pro Leu Pro Glu Ser Phe 145 150 155 160 Tyr Cys Glu Ile Cys Arg Leu Thr Arg Ala Asp Pro Phe Trp Val Thr 165 170 175 Val Ala His Pro Leu Ser Pro Val Arg Leu Thr Ala Thr Thr Ile Pro 180 185 190 Asn Asp Gly Ala Ser Thr Met Gln Ser Val Glu Arg Thr Phe Gln Ile 195 200 205 Thr Arg Ala Asp Lys Asp Leu Leu Ala Lys Pro Glu Tyr Asp Val Gln 210 215 220 Ala Trp Cys Met Leu Leu Asn Asp Lys Val Leu Phe Arg Met Gln Trp 225 230 235 240 Pro Gln Tyr Ala Asp Leu Gln Val Asn Gly Val Pro Val Arg Ala Ile 245 250 255 Asn Arg Pro Gly Gly Gln Leu Leu Gly Val Asn Gly Arg Asp Asp Gly 260 265 270 Pro Ile Ile Thr Ser Cys Ile Arg Asp Gly Val Asn Arg Ile Ser Leu 275 280 285 Ser Gly Gly Asp Val Arg Ile Phe Cys Phe Gly Val Arg Leu Val Lys 290 295 300 Arg Arg Thr Leu Gln Gln Val Leu Asn Leu Ile Pro Glu Glu Gly Lys 305 310 315 320 Gly Glu Thr Phe Glu Asp Ala Leu Ala Arg Val Arg Arg Cys Ile Gly 325 330 335 Gly Gly Gly Gly Asp Asp Asn Ala Asp Ser Asp Ser Asp Ile Glu Val 340 345 350 Val Ala Asp Phe Phe Gly Val Asn Leu Arg Cys Pro Met Ser Gly Ser 355 360 365 Arg Ile Lys Val Ala Gly Arg Phe Leu Pro Cys Val His Met Gly Cys 370 375 380 Phe Asp Leu Asp Val Phe Val Glu Leu Asn Gln Arg Ser Arg Lys Trp 385 390 395 400 Gln Cys Pro Ile Cys Leu Lys Asn Tyr Ser Val Glu His Val Ile Val 405 410 415 Asp Pro Tyr Phe Asn Arg Ile Thr Ser Lys Met Lys His Cys Asp Glu 420 425 430 Glu Val Thr Glu Ile Glu Val Lys Pro Asp Gly Ser Trp Arg Val Lys 435 440 445 Phe Lys Arg Glu Ser Glu Arg Arg Glu Leu Gly Glu Leu Ser Gln Trp 450 455 460 His Ala Pro Asp Gly Ser Leu Cys Pro Ser Ala Val Asp Ile Lys Arg 465 470 475 480 Lys Met Glu Met Leu Pro Val Lys Gln Glu Gly Tyr Ser Asp Gly Pro 485 490 495 Ala Pro Leu Lys Leu Gly Ile Arg Lys Asn Arg Asn Gly Ile Trp Glu 500 505 510 Val Ser Lys Pro Asn Thr Asn Gly Leu Ser Ser Ser Asn Arg Gln Glu 515 520 525 Lys Val Gly Tyr Gln Glu Lys Asn Ile Ile Pro Met Ser Ser Ser Ala 530 535 540 Thr Gly Ser Gly Arg Asp Gly Asp Asp Ala Ser Val Asn Gln Asp Ala 545 550 555 560 Ile Gly Thr Phe Asp Phe Val Ala Asn Gly Met Glu Leu Asp Ser Ile 565 570 575 Ser Met Asn Val Asp Ser Gly Tyr Asn Phe Pro Asp Arg Asn Gln Ser 580 585 590 Gly Glu Gly Gly Asn Asn Glu Val Ile Val Leu Ser Asp Ser Asp Asp 595 600 605 Glu Asn Asp Leu Val Ile Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser Gly Cys Gln 610 615 620 Thr Asp Gly Gly Leu Thr Phe Pro Leu Asn Pro Pro Gly Ile Ile Asn 625 630 635 640 Ser Tyr Asn Glu Asp Pro His Ser Ile Ala Gly Gly Ser Ser Gly Leu 645 650 655 Gly Leu Phe Asn Asp Asp Asp Glu Phe Asp Thr Pro Leu Trp Ser Phe 660 665 670 Pro Ser Glu Thr Pro Glu Ala Pro Gly Phe Gln Leu Phe Arg Ser Asp 675 680 685 Ala Asp Val Ser Gly Gly Leu Val Gly Leu His His His Ser Pro Leu 690 695 700 Asn Cys Ser Pro Glu Ile Asn Gly Gly Tyr Thr Met Ala Pro Glu Thr 705 710 715 720 Ser Met Ala Ser Val Pro Val Val Pro Gly Ser Thr Gly Arg Ser Glu 725 730 735 Ala Asn Asp Gly Leu Val Asp Asn Pro Leu Ala Phe Gly Arg Asp Asp 740 745 750 Pro Ser Leu Gln Ile Phe Leu Pro Thr Lys Pro Asp Ala Ser Ala Gln 755 760 765 Ser Gly Phe Lys Asn Gln Ala Asp Met Ser Asn Gly Leu Arg Ser Glu 770 775 780 Asp Trp Ile Ser Leu Arg Leu Gly Asp Ser Ala Ser Gly Asn His Gly 785 790 795 800 Asp Pro Ala Thr Thr Asn Gly Ile Asn Ser Ser His Gln Met Ser Thr 805 810 815 Arg Glu Gly Ser Met Asp Thr Thr Thr Glu Thr Ala Ser Leu Leu Leu 820 825 830 Gly Met Asn Asp Ser Arg Gln Asp Lys Ala Lys Lys Gln Arg Ser Asp 835 840 845 Asn Pro Phe Ser Phe Pro Arg Gln Lys Arg Ser Val Arg Pro Arg Met 850 855 860 Tyr Leu Ser Ile Asp Ser Asp Ser Glu *** 865 870 <110> Seoul National University R & DB Foundation <120> AtSIZ1 gene from Arabidopsis thaliana for increasing          environmental stress resistance of plant and uses thereof <130> PN17127 <160> 2 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 2622 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggatttgg aagctaattg taaggaaaaa ctttcatatt ttcggataaa agagctcaag 60 gatgtgctca ctcagctggg actttcgaaa 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agggtggaaa taatgaagtc 1800 atcgttctga gtgattctga tgacgagaat gatttagtga tcactccagg gcctgcatac 1860 agtggttgtc aaacagatgg tggacttact tttccactga accctcctgg aataattaac 1920 tcatataatg aggacccaca cagcatagct gggggaagtt caggcttagg tcttttcaat 1980 gatgatgatg aatttgatac gcccctttgg tcatttcctt ctgaaactcc agaagcccct 2040 gggttccaac tatttagatc tgatgctgac gtttcaggag gtttagttgg tttgcatcat 2100 catagtccac taaactgttc tcctgaaata aatggaggtt ataccatggc tcctgagaca 2160 tcaatggcat ctgttcctgt ggttcctggc tctactggcc gatctgaagc aaacgatggc 2220 ctagttgaca atcctcttgc atttggtaga gacgatccct cacttcaaat atttttgcca 2280 acaaaaccag atgcttcagc tcagtcgggt tttaaaaacc aagctgatat gtcaaatggt 2340 ctccgtagtg aagactggat ctcgcttagg ctaggcgata gcgcctctgg gaatcatgga 2400 gatcctgcaa ctacaaacgg gattaactca agccatcaga tgtctacgag ggaaggttct 2460 atggatacta caacagagac tgcgtcgttg cttctgggta tgaatgacag tagacaagac 2520 aaggcaaaga agcaaagatc agataatcca ttttcatttc ctcgccagaa gcgttctgta 2580 agacctcgga tgtacctctc cattgactcg gattctgagt aa 2622 <210> 2 <211> 874 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Asp Leu Glu Ala Asn Cys Lys Glu Lys Leu Ser Tyr Phe Arg Ile   1 5 10 15 Lys Glu Leu Lys Asp Val Leu Thr Gln Leu Gly Leu Ser Lys Gln Gly              20 25 30 Lys Lys Gln Glu Leu Val Asp Arg Ile Leu Thr Leu Leu Ser Asp Glu          35 40 45 Gln Ala Ala Arg Leu Leu Ser Lys Lys Asn Thr Val Ala Lys Glu Ala      50 55 60 Val Ala Lys Leu Val Asp Asp Thr Tyr Arg Lys Met Gln Val Ser Gly  65 70 75 80 Ala Ser Asp Leu Ala Ser Lys Gly Gln Val Ser Ser Asp Thr Ser Asn                  85 90 95 Leu Lys Val Lys Gly Glu Pro Glu Asp Pro Phe Gln Pro Glu Ile Lys             100 105 110 Val Arg Cys Val Cys Gly Asn Ser Leu Glu Thr Asp Ser Met Ile Gln         115 120 125 Cys Glu Asp Pro Arg Cys His Val Trp Gln His Val Gly Cys Val Ile     130 135 140 Leu Pro Asp Lys Pro Met Asp Gly Asn Pro Pro Leu Pro Glu Ser Phe 145 150 155 160 Tyr Cys Glu Ile Cys Arg Leu Thr Arg Ala Asp Pro Phe Trp Val Thr                 165 170 175 Val Ala His Pro Leu Ser Pro Val Val Leu Thr Ala Thr Thr Ile Pro             180 185 190 Asn Asp Gly Ala Ser Thr Met Gln Ser Val Glu Arg Thr Phe Gln Ile         195 200 205 Thr Arg Ala Asp Lys Asp Leu Leu Ala Lys Pro Glu Tyr Asp Val Gln     210 215 220 Ala Trp Cys Met Leu Leu Asn Asp Lys Val Leu Phe Arg Met Gln Trp 225 230 235 240 Pro Gln Tyr Ala Asp Leu Gln Val Asn Gly Val Pro Val Arg Ala Ile                 245 250 255 Asn Arg Pro Gly Gly Gln Leu Leu Gly Val Asn Gly Arg Asp Asp Gly             260 265 270 Pro Ile Ile Thr Ser Cys Ile Arg Asp Gly Val Asn Arg Ile Ser Leu         275 280 285 Ser Gly Gly Asp Val Arg Ile Phe Cys Phe Gly Val Arg Leu Val Lys     290 295 300 Arg Arg Thr Leu Gln Gln Val Leu Asn Leu Ile Pro Glu Glu Gly Lys 305 310 315 320 Gly Glu Thr Phe Glu Asp Ala Leu Ala Arg Val Arg Arg Cys Ile Gly                 325 330 335 Gly Gly Gly Gly Asp Asp Asn Ala Asp Ser Asp Ser Asp Ile Glu Val             340 345 350 Val Ala Asp Phe Phe Gly Val Asn Leu Arg Cys Pro Met Ser Gly Ser         355 360 365 Arg Ile Lys Val Ala Gly Arg Phe Leu Pro Cys Val His Met Gly Cys     370 375 380 Phe Asp Leu Asp Val Phe Val Glu Leu Asn Gln Arg Ser Ser Arg Lys Trp 385 390 395 400 Gln Cys Pro Ile Cys Leu Lys Asn Tyr Ser Val Glu His Val Ile Val                 405 410 415 Asp Pro Tyr Phe Asn Arg Ile Thr Ser Lys Met Lys His Cys Asp Glu             420 425 430 Glu Val Thr Glu Ile Glu Val Lys Pro Asp Gly Ser Trp Arg Val Lys         435 440 445 Phe Lys Arg Glu Ser Glu Arg Glu Leu Gly Glu Leu Ser Gln Trp     450 455 460 His Ala Pro Asp Gly Ser Leu Cys Pro Ser Ala Val Asp Ile Lys Arg 465 470 475 480 Lys Met Glu Met Leu Pro Val Lys Gln Glu Gly Tyr Ser Asp Gly Pro                 485 490 495 Ala Pro Leu Lys Leu Gly Ile Arg Lys Asn Arg Asn Gly Ile Trp Glu             500 505 510 Val Ser Lys Pro Asn Thr Asn Gly Leu Ser Ser Ser Asn Arg Gln Glu         515 520 525 Lys Val Gly Tyr Gln Glu Lys Asn Ile Ile Pro Met Ser Ser Ser Ala     530 535 540 Thr Gly Ser Gly Arg Asp Gly Asp Asp Ala Ser Val Asn Gln Asp Ala 545 550 555 560 Ile Gly Thr Phe Asp Phe Val Ala Asn Gly Met Glu Leu Asp Ser Ile                 565 570 575 Ser Met Asn Val Asp Ser Gly Tyr Asn Phe Pro Asp Arg Asn Gln Ser             580 585 590 Gly Glu Gly Gly Asn Asn Glu Val Ile Val Leu Ser Asp Ser Asp Asp         595 600 605 Glu Asn Leu Val Ile Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser Gly Cys Gln     610 615 620 Thr Asp Gly Gly Leu Thr Phe Pro Leu Asn Pro Pro Gly Ile Ile Asn 625 630 635 640 Ser Tyr Asn Glu Asp Pro His Ser Ale Gly Gly Ser Ser Gly Leu                 645 650 655 Gly Leu Phe Asn Asp Asp Asp Glu Phe Asp Thr Pro Leu Trp Ser Phe             660 665 670 Pro Ser Glu Thr Pro Glu Ala Pro Gly Phe Gln Leu Phe Arg Ser Asp         675 680 685 Ala Asp Val Ser Gly Gly Leu Val Gly Leu His His Ser Ser Leu     690 695 700 Asn Cys Ser Pro Glu Ile Asn Gly Gly Tyr Thr Met Ala Pro Glu Thr 705 710 715 720 Ser Met Ala Ser Val Val Val Pro Gly Ser Thr Gly Arg Ser Glu                 725 730 735 Ala Asn Asp Gly Leu Val Asp Asn Pro Leu Ala Phe Gly Arg Asp Asp             740 745 750 Pro Ser Leu Gln Ile Phe Leu Pro Thr Lys Pro Asp Ala Ser Ala Gln         755 760 765 Ser Gly Phe Lys Asn Gln Ala Asp Met Ser Asn Gly Leu Arg Ser Glu     770 775 780 Asp Trp Ile Ser Leu Arg Leu Gly Asp Ser Ala Ser Gly Asn His Gly 785 790 795 800 Asp Pro Ala Thr Thr Asn Gly Ile Asn Ser Ser His Gln Met Ser Thr                 805 810 815 Arg Glu Gly Ser Met Asp Thr Thr Thr Glu Thr Ala Ser Leu Leu Leu             820 825 830 Gly Met Asn Asp Ser Arg Gln Asp Lys Ala Lys Lys Gln Arg Ser Asp         835 840 845 Asn Pro Phe Ser Phe Pro Arg Gln Lys Arg Ser Val Arg Pro Arg Met     850 855 860 Tyr Leu Ser Ile Asp Ser Asp Ser Glu *** 865 870

Claims (10)

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래 AtSIZ1(Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 AtSIZ1 유전자의 발현을 저해시키는 단계를 포함하는 식물의 고온 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 방법.Comprising the step of transforming a plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding the Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase protein of Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and inhibiting the expression of the AtSIZ1 gene A method for increasing tolerance to high temperature stress. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래 AtSIZ1(Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 고온 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.Transforming the plant cell with a recombinant vector comprising a gene encoding the Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase protein from Arabidopsis thaliana comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; And
Wherein the resistance to high temperature stress is increased as compared to the non-transformant comprising regenerating the plant from the transformed plant cell. 삭제delete 제5항의 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 고온 스트레스에 대한 내성이 증가된 형질전환 식물체.A transgenic plant having increased tolerance to high temperature stress compared to the non-transformant produced by the method of claim 5. 삭제delete 제7항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.A transformed seed of a plant according to claim 7. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 애기장대 유래 AtSIZ1(Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 고온 스트레스 내성 증가용 조성물.A composition for increasing the high-temperature stress tolerance of a plant, which comprises the gene encoding the Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase protein of Arabidopsis thaliana SUMO E3 ligase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Frontiers in Plant Science. Vol. 6, No. 57, 페이지 1-14 (2015.02.11.)*

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