KR102189659B1 - 표지 효소를 사용한 염색용 dab 함유 기질 키트 - Google Patents
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Abstract
퍼옥시다제 표지 항체를 사용한 발색 반응을, DAB 및 그 증감제로서의 이미다졸을 포함하는 발색 반응액을 사용하고, 특이 염색 강도를 증강시킴과 아울러, DAB의 응집에 의한 DAB 함유 기질 용액에의 침전 및 백그라운드 염색 등의 비특이적인 염색을 억제하는 것이 가능한 DAB 함유 기질 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 퍼옥시다제 발색단으로서의 DAB와 물을 포함하는 발색단 함유 용액(A) 및 EDTA·2Na, EDTA·2NH4, GEDTA 및 NTA 중 적어도 1종의 킬레이트제와, POE알킬에터계 비이온 계면활성제 및/또는 POP알킬에터계 비이온 계면활성제와, 이미다졸과, 과산화수소와, 물을 포함하는 발색 시약(B)을 포함하고, 적어도 발색단 함유 용액(A) 및 발색 시약(B)이 별도로 보관되는 2액 타입 이상이다.
Description
본 발명은 퍼옥시다제 표지 항체를 사용한, 면역조직 화학 염색(IHC)법, 면역세포 화학 염색(ICC)법 등의 면역염색법이나, 인시튜(in situ) 하이브리다이제이션(ISH)법에서의 발색 반응을, 다이아미노벤지딘(DAB) 및 그 증감제로서의 이미다졸을 포함하는 발색 반응액을 사용하여, DAB의 응집에 의한 DAB 함유 기질 용액에의 침전 및 비특이적인 염색에 의한, 예를 들면, 백그라운드 염색을 억제하여, 특이 염색 강도를 증강시키는 것이 가능한 DAB 함유 기질 키트에 관한 것이다.
현재, 병리나 분자생물학의 분야에서는 IHC법, ICC법 또는 ISH법에 사용하는 발색 반응액은 발색하기 위한 표지 효소의 종류에 따라 시약의 분별 사용이 행해지고 있다. 표지 효소로서 현재 가장 사용되고 있는 것은 퍼옥시다제이며, 대부분은 식물성의 서양 고추냉이 유래의 퍼옥시다제(HRP)(분자량 40∼45kDa)가 사용되는 것이 비특허문헌 1에 기재되어 있다. HRP의 효소 반응 수소 공여체로서는 갈색으로 발색하는 다이아미노벤지딘(DAB) 및 과산화수소를 포함하는 DAB 함유 기질 용액이 일상적으로 사용되고 있다.
DAB 함유 기질 용액은 2액 또는 3액으로 분리되며(DAB가 반응하지 않도록 DAB와 과산화수소가 분리되어 있는 경우가 일반적임), 사용시 조제를 행하는 고농도 스톡 용액, 또는 건조품인 태블릿정이 시판되고 있다. 예를 들면, Dako사제의 Liquid DAB+ Substrate Chromogen System(Code: K3468), Thermo SCIENTIFIC사제의 DAB Quanto(Code: TA-XXX-QHDX), Life Technologies사제의 Stable DAB(Code: 750118), 니치레이바이오사이언스사제의 DAB 기질 키트를 들 수 있다. 그러나, 그 조성에 대해서는 공개되지 않은 경우가 대부분이다.
비특허문헌 1에는 DAB 발색의 증감제로서 이미다졸을 첨가하는 것이 기재되어 있다. 지금까지의 경험상, 이미다졸은 DAB 반응을 빠르게 하는 효과는 있지만, 동시에 DAB의 응집을 일으켜, 일정시간 경과 후에 반응액 중에의 침전을 일으키는 것을 알고 있었다. 아울러, 증감효과가 높기 때문에, 조직상의 목적 물질 이외의 HRP 존재하에 주변에도 비특이적인 염색, 예를 들면, 백그라운드 염색을 일으키는 것을 알고 있었다.
그런데, 특허문헌 1에는, DAB 함유 기질 용액에 필요에 따라 비이온성 계면활성제를 함유시킬 수 있는 것, 특허문헌 2 및 3에는, DAB 함유 기질 용액에 EDTA를 배합할 수 있는 것이 기재되어 있다. 그러나, 이들 문헌에는, 상기 이미다졸을 배합한 경우의 과제에 대해서는 전혀 검토되어 있지 않다.
나구라 히로시, 오사무라 요시유키, 츠츠미 히로시: 개정 4판 와타나베·나카네 효소항체법 학제 기획 2002) 「효소항체법」(개정 4판 와타나베·나카네 학제 기획 2002)
본 발명의 과제는, 퍼옥시다제 표지 항체를 사용한, 면역조직 화학 염색법, 면역세포 화학 염색법 등의 면역염색법이나 인시튜 하이브리다이제이션법 등에 있어서의 발색 반응을, DAB 및 그 증감제로서의 이미다졸을 포함하는 DAB 함유 기질 용액을 사용하여, 특이 염색 강도를 증강시킴과 아울러, 비특이적인 염색을 억제하는 것이 가능한 DAB 함유 기질 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 과제는, 퍼옥시다제 표지 항체를 사용한, 면역염색법이나 인시튜 하이브리다이제이션법에서의 발색 반응을, DAB 및 그 증감제로서의 이미다졸을 포함하는 발색 반응액을 사용하여, 특이 염색 강도를 증강시킴과 아울러, DAB 함유 기질 용액 중에서의 DAB의 응집에 의한 침전을 억제하고, 비특이적인 염색도 억제하는 것이 가능한 DAB 함유 기질 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 과제는, 퍼옥시다제 표지 항체를 사용한, 면역염색법이나 인시튜 하이브리다이제이션법에서의 발색 반응을, DAB 및 그 증감제로서의 이미다졸을 포함하는 DAB 함유 기질 용액을 사용하여, 특이 염색 강도를 증강시킴과 아울러, 백그라운드 염색 등의 비특이적인 염색을 억제하고, 또한 DAB 함유 기질 용액 중에서의 DAB의 응집에 의한 침전을 장기간 억제하여 사용감 및 보존안정성도 개선한 DAB 함유 기질 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 종래, 면역염색법의 효소항체법이나, 인시튜 하이브리다이제이션법에 일반적으로 사용되고 있는 발색을 위한 DAB 함유 기질 용액 조성에 증감제로서 알려지는 이미다졸을 함유시켜, 특이 염색 강도를 증가시킨 경우에도, 특정 킬레이트제와, 특정 비이온 계면활성제를 함유시킴으로써, 비특이적인 염색을 경감하면서, 슬라이드 글라스를 사용한 경우에 발생하는, 예를 들면, 백그라운드 염색을 억제할 수 있는 것을 발견했다. 또한 DAB 함유 기질 용액을 조제 후의 DAB의 응집을 저해할 수 있고, 또한, 2액 타입 이상으로 하여, 그 조성을 조제함으로써, 그 보존안정성도 현격하게 좋아져, 4℃ 차광 보존하에서는 각 액의 혼합 후 2주까지 침전이 일어나지 않고, 또한 DAB 함유 기질 용액의 조제 직후와 동등한 염색성이 얻어지는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
여기에서, 본 발명에서 DAB 함유 기질 용액이란 본 발명의 키트를 혼합 또는 혼합 희석하여 얻어지는 기질 용액을 의미한다. 또한 본 명세서 중에서는, 염색을 염색 또는 발색의 의미로 사용하는 경우가 있다.
본 발명에 의하면, 퍼옥시다제 발색단으로서의 다이아미노벤지딘(DAB)과 물을 포함하는 발색단 함유 용액(A) 및 테트라에틸렌다이아민사아세트산이소듐·이수화물(EDTA·2Na), 에틸렌다이아민사아세트산·다이암모늄염(EDTA·2NH4), 글라이콜에터다이아민사아세트산(GEDTA) 및 나이트릴로삼아세트산(NTA)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 킬레이트제와, 폴리옥시에틸렌(이하 POE로 약칭함)알킬에터계 비이온 계면활성제 및 폴리옥시프로필렌(이하 POP로 약칭함)알킬에터계 비이온 계면활성제의 적어도 1종으로 이루어지는 비이온 계면활성제와, 이미다졸과, 과산화수소와, 물을 포함하는 발색 시약(B)을 함유하고, 적어도 발색단 함유 용액(A) 및 발색 시약(B)이 별도로 보관되는 2액 타입 이상의, 퍼옥시다제 표지 항체를 사용한, 예를 들면, IHC법, ICC법, 또는 ISH법의 염색에 사용하기 위한 DAB 함유 기질 키트(이하, 본 발명의 키트로 약칭하는 경우가 있음)가 제공된다.
또한 본 발명에 의하면, 상기 발색 시약(B)이 과산화수소 및 물을 포함하는 발색화 용액(B1) 및 상기 킬레이트제, POE알킬에터계 비이온 계면활성제 및 POP알킬에터계 비이온 계면활성제의 적어도 1종으로 이루어지는 비이온 계면활성제, 이미다졸 및 물을 포함하는 기질 안정화 용액(B2)이 별도로 보관되는 2액 타입이며, 키트를 3액 타입으로 한 상기 키트가 제공된다.
또한 본 발명에 의하면, DAB를 사용한 조직, 세포 또는 이들 일부의 염색에, 본 발명의 키트를 사용하는, IHC법, ICC법, 또는 ISH법이 제공된다.
더욱이 또한 본 발명에 의하면, DAB를 사용한 조직, 세포 또는 이것들의 일부의 염색에, 본 발명의 키트를 사용하는 것을 특징으로 하는 염색법이 제공된다.
본 발명의 키트는 퍼옥시다제 발색단으로서의 DAB와 물을 포함하는 발색단 함유 용액(A) 및 특정 킬레이트제와, 특정 계면활성제와, 이미다졸과, 과산화수소와, 물을 포함하는 발색 시약(B)을 함유하고, 적어도 발색단 함유 용액(A) 및 발색 시약(B)이 별도로 보관되는 2액 타입 이상의 키트이므로, 퍼옥시다제를 사용한, IHC법, ICC법이나, ISH법에서, 특이 염색 강도를 증강시킴과 아울러, 비특이적인 염색을 억제하고, 또한 DAB의 응집에 의한 DAB 함유 기질 용액 중에서의 침전을 억제할 수 있다. 게다가, 상기 침전을 장기간 억제하여 사용감 및 보존안정성도 개선할 수 있다. 이러한 효과를 갖는 본 발명의 키트는, 슬라이드 글라스에 첩부한 조직 검체를 IHC법에 의해 염색할 때, ICC법에 의해 세포 검체를 염색할 때, 게다가 ISH법에 의해 조직이나 세포 검체를 염색할 때 특히 유용하다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 키트는, 퍼옥시다제 표지 항체를 사용한, IHC법 및 ICC법에서의 염색이나, ISH법에서의 발색을 기반으로 하여, 생체의 정상 또는 종양 조직이나 세포 등에 존재하는, 예를 들면, 항원, mRNA, DNA 등의 특정 물질을, DAB 발색단을 사용하여 염색함으로써, 병리 진단이나 생물분자학 실험 등을 행하기 위한, 2액 타입 이상의 DAB 함유 기질 키트이다.
본 발명에 있어서, IHC법에 사용하는 조직 검체, ICC법에 사용하는 세포 검체나, ISH법에 사용하는 조직이나 세포 검체는 조직이나 세포가 변성되지 않도록 고정 후 박절하여 사용한다. 예를 들면, 장기 보존 등을 목적으로 하여, 통상 포말린이나 알코올 등에 의해 검체를 고정하고, 계속해서 파라핀 등을 포함하는 포매(embedding) 매체에 의해 포매한 후, 조직 검체를 박절하고, 슬라이드 글라스에 첩부한 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 염색에 앞서는 항원항체 반응이나, DIG(Digoxigenin) 표지를 한 프로브를 사용한 하이브리다이제이션 후의 항체 반응은, 퍼옥시다제 표지 항체를 사용한, 직접법 또는 간접법 등의 공지의 방법으로 행할 수 있다. 이때, 퍼옥시다제로서는 HRP를 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 키트는, 바람직하게는 상기 조직이나 세포 검체를 첩부한 슬라이드 글라스를 사용한 간접법의 효소 항체 반응에 사용할 수 있다. 예를 들면, 검체를 포말린으로 고정한 후에 파라핀 포매한 슬라이드 글라스를 탈파라핀 하고, 친수화한 후, 필요에 따라 항원성 부활화를 행하고, 내인성 퍼옥시다제 제거를 행한 후, 1차 항체를 반응시키거나, 혹은 DIG 표지를 한 프로브를 반응시키고, 이어서, 퍼옥시다제 및 2차 항체 또는 항 DIG 항체가 결합한 폴리머 등을 반응시킨 후, 본 발명의 키트의 각 용액을 혼합하여 조제한 DAB 함유 기질 용액을 반응시키고, 퍼옥시다제를 촉매로 하여 그 개소를 특이적으로 발색시키는 방법에 사용할 수 있다. 또한 발색 후, 또한 헤마톡실린 등에 의해 핵 염색을 함으로써 형태를 보기 쉽게 하는 것도 가능하다.
상기 DAB 함유 기질 용액의 조제는, 예를 들면, 본 발명의 키트에 포함되는 각 용액을 혼합하는 방법, 또는 본 발명의 키트에 포함되는 각 농축 용액을, 특정량의 증류수 등의 물에 혼합하는 방법에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 키트를 사용하여, IHC법에서의 염색이나, ISH법에 의한 발색에 사용할 수 있는 조직으로서는, 예를 들면, 대장(정상·암), 소장(정상), 십이지장(정상), 결장(정상), 위(정상·암), 식도(정상), 혀(정상), 간장(암), 췌장(정상), 신장(정상), 뇌(정상), 소뇌(정상), 심장(정상), 유선(정상·암), 태반, 전립선(정상·암), 폐(정상·암), 갑상선(정상), 편도(정상), 림프절(정상), 자궁경부(정상), 악성 흑색종, 호지킨 림프종, 흉선 과형성 증례, GIST(Gastrointestinal stromal tumor), 중피종을 들 수 있다. 이상의 조직 중, 대장(정상·암), 소장(정상), 십이지장(정상), 결장(정상), 위(정상·암) 등 근조직 또는 결합조직을 포함하는 부분에는 특히 백그라운드 염색이 보이는 경향이 있어, 본 발명의 키트는 이들 조직의 염색에 극히 유효하다.
본 발명의 키트를 사용하여, ICC법에서의 염색이나 ISH법에서의 발색에 사용할 수 있는 세포로서는, 예를 들면, 유방암 세포, 폐암 세포, 림파아구(정상)를 바람직하게 들 수 있다.
본 발명의 키트는 퍼옥시다제 발색단으로서의 DAB와 물을 포함하는 발색단 함유 용액(A)을 포함한다. 이 용액(A)에 포함되는 DAB는 후술하는 과산화수소가 퍼옥시다제와 반응하고, 그때의 효소 반응의 수소 공여체로서 작용한다. 그리고, 이 DAB가, 중합 반응함으로써, 퍼옥시다제 결합 부분을 특이적으로 갈색계 색으로 발색시킬 수 있다.
용액(A)에 있어서, DAB의 함유량은 최종적으로 IHC법이나 ICC법의 염색 또는 ISH법의 발색에 사용하는 DAB 함유 기질 용액으로서 발색 반응할 수 있는 양이면 되며, 바람직하게는 사용하는 DAB 함유 기질 용액 중의 농도로서 0.1∼10mg/mL이다. 0.1mg/mL 미만에서는, 발색 반응이 충분히 발생하지 않을 우려가 있고, 한편, 10mg/mL를 초과하면, DAB 함유 기질 용액으로 했을 때에 DAB가 응집 등 하여 침전이 발생할 우려가 있다.
용액(A)에 있어서, 물로서는, 예를 들면, 증류수 또는 초순수를 사용할 수 있다. 물의 양은 용액(A)에 있어서 DAB를 용해할 수 있는 양이며, 최종적으로 DAB 함유 기질 용액으로 했을 때에, 각 성분의 함유량이 적당한 범위가 되도록 적당히 선택하여 결정할 수 있다.
용액(A)에는, DAB 및 물 이외에 DAB의 용해성 또는 안정성을 향상시키기 위하여, 각종 유기 용매를 함유시킬 수도 있고, 그 함유량은 그 목적에 따라 적당히 선택할 수 있다.
본 발명의 키트는 특정 킬레이트제와, POE알킬에터계 비이온 계면활성제 및/또는 POP알킬에터계 비이온 계면활성제와, 이미다졸과, 과산화수소와, 물을 포함하는 발색 시약(B)을 포함한다.
발색 시약(B)은, 예를 들면, 과산화수소 및 물을 포함하는 발색화 용액(B1)과, 특정 킬레이트제, POE알킬에터계 비이온 계면활성제 및/또는 POP알킬에터계 비이온 계면활성제, 이미다졸 및 물을 포함하는 기질 안정화 용액(B2)으로 분할할 수 있다.
본 발명의 키트는 DAB와 과산화수소를 별도로 보관하는 2액 타입 이상의 키트이면 몇 액 타입이어도 되지만, 효율성을 고려한 경우, 상기 발색단 함유 용액(A) 및 상기 발색 시약(B)으로 이루어지는 2액 타입, 또는 상기 발색단 함유 용액(A), 상기 발색화 용액(B1) 및 상기 기질 안정화 용액(B2)으로 이루어지는 3액 타입으로 하는 것이 바람직하다.
발색 시약(B) 또는 기질 안정화 용액(B2)에 사용하는 특정 킬레이트제는 EDTA·2Na, EDTA·2NH4, GEDTA 및 NTA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이며, 특히 그 효과의 점에서 EDTA·2Na 또는 GEDTA의 사용이 바람직하다. 이들 특정 킬레이트제는, 특히, DAB의 비특이적인 결합을 억제하고, 특히, 슬라이드 글라스에 첩부한 조직 검체를 사용하는 경우에, 백그라운드 염색을 억제할 수 있다. 또한 후술하는 특정 비이온 계면활성제와의 조합에 의해, 검체 조직이 근조직이나 결합조직 등이어도, DAB의 비특이적 결합을 유효하게 억제할 수 있다.
상기 발색 시약(B) 또는 상기 기질 안정화 용액(B2) 중의 상기 킬레이트제의 함유량은 용량 의존적으로 상기 작용효과가 개선되는 경향이 있고, 그 작용효과를 고려하여 적당히 선택할 수 있다. 구체적으로는, 사용하는 DAB 함유 기질 용액 중의 농도로서 바람직하게는 0.1∼10mM이 되는 양, 특히 바람직하게는 0.3∼3mM이 되는 양으로 함유시킬 수 있다.
발색 시약(B) 또는 기질 안정화 용액(B2)에 사용하는 특정 계면활성제는 POE(23) 라우릴에터(Brij 35), POE(20) 세틸에터(Brij 58), POE 스테아릴에터, POE 올레일에터, POE 미리스틸에터, POE 옥틸도데실에터 등의 POE알킬에터나, POP 라우릴에터, POP 세틸에터, POP 스테아릴에터, POP 올레일에터, POP 미리스틸에터, POP 옥틸도데실에터 등의 POP알킬에터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 들 수 있고, 특히 Brij 35의 사용이 바람직하다. 이들 특정 비이온 계면활성제는, 특히, DAB와 과산화수소를 포함하는 DAB 함유 기질 용액으로 했을 때에, DAB의 수용액 중에서의 중합이나 침전을 억제하는 효과가 우수하며, 또한 DAB의 발색 강도를 증강할 수도 있다. 다른 계면활성제, 예를 들면, Triton X-100(4-(1, 1, 3, 3-Tetramethylbutyl) phenyl-polyethylene glycol), NP-40(4-Nonylphenyl-polyethylene glycol) 혹은 Tween 20(Polyoxyethylenesorbitan monolaurate)을 사용한 경우, 또는 비프로톤성 극성 용매, 예를 들면, DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 사용한 경우에는, 원하는 효과가 얻어지지 않는다.
발색 시약(B) 또는 기질 안정화 용액(B2) 중의 상기 POE알킬에터계 비이온 계면활성제 및/또는 POP알킬에터계 비이온 계면활성제의 함유량은 용량 의존적으로 상기 작용효과가 개선되는 경향이 있어, 그 작용효과를 고려하여 적당히 선택할 수 있다. 구체적으로는, IHC법, ICC법이나 ISH법에 사용하는 DAB 함유 기질 용액 중의 함유 비율로서 바람직하게는 0.05∼30질량%가 되는 양, 특히 바람직하게는 0.1∼5질량%가 되는 양으로 함유시킬 수 있다.
발색 시약(B) 또는 기질 안정화 용액(B2)에 사용하는 이미다졸은 DAB의 발색에서 발색 강도를 증강시키는 증강제로서 작용하는 성분이다. 이러한 작용효과를 나타내는 이미다졸은 발색 강도를 증강시키는 한편, 과산화수소의 존재하에, DAB의 응집을 일으켜, 일정 시간 경과 후에 DAB 함유 기질 용액 중에의 침전을 일으키고, 아울러 검체 조직이나 검체 세포 상의 목적 물질 이외의 비특이적인 염색, 예를 들면, 백그라운드 염색을 일으키는 원인도 되고 있다. 그래서, 본 발명의 키트에서는, 상기 특정 킬레이트제 및 상기 특정 비이온 계면활성제를 조합시킨, 발색 시약(B) 또는 기질 안정화 용액(B2)에 이미다졸을 배합한다.
발색 시약(B) 또는 기질 안정화 용액(B2) 중의 이미다졸 함유량은 용량 의존적으로 상기 DAB의 발색 증강 작용이 얻어지지만, 많으면 상기 문제점이 발생할 가능성도 높아지므로, IHC법, ICC법이나, ISH법에 사용하는 DAB 함유 기질 용액 중의 농도로서 통상 3∼300mM이 되는 양, 특히 5∼100mM이 되는 양으로 함유시키는 것이 바람직하다. 또한 이미다졸의 농도를 높게 하는 경우에는, 상기 특정 킬레이트제의 농도도 상기 범위 내에서 높게 설정하는 것이 바람직하다.
발색 시약(B) 또는 발색화 용액(B1)에 사용하는 과산화수소는 퍼옥시다제에 작용하여 DAB의 발색 반응에 관계되는 성분이다. 과산화수소의 함유량은 과잉량이어도 되지만, 지나치게 많으면 특이 염색 강도가 저하될 우려가 있다. 또한 지나치게 적으면 발색 반응이 충분히 진행되지 않고, 또한 DAB 함유 기질 용액으로 한 후의 보존성이 저하될 우려가 있다.
그래서, 과산화수소의 함유량은 IHC법, ICC법이나, ISH법에 사용하는 DAB 함유 기질 용액 중의 함유 비율로서 바람직하게는 0.001∼0.3질량%가 되는 양, 특히 바람직하게는 0.01∼0.05질량%가 되는 양으로 함유시킬 수 있다.
발색 시약(B), 발색화 용액(B1) 및 기질 안정화 용액(B2)에 사용하는 물은, 예를 들면, 증류수 또는 초순수를 사용할 수 있다. 물의 양은 각 성분의 함유량이 적당한 범위가 되도록 적당히 선택하여 결정할 수 있다.
본 발명의 키트에서, 발색 시약(B) 또는 기질 안정화 용액(B2)의 pH는 얻어지는 DAB 함유 기질 용액의 pH가 통상 5∼9, 특히 6∼8이 되도록 조정하는 것이 본 발명의 원하는 효과를 효율적으로 얻기 위해 바람직하다.
pH의 조정은 염산 등의 pH 조정제에 의해 행할 수 있는 이외에, 인산, Tris, MOPS, HEPES, ADA, CHES, MES 등의 완충제를 사용하여 행할 수도 있다. 과산화수소를 포함하는 발색 시약(B) 또는 얻어지는 DAB 함유 기질 용액의 보존안정성을 보다 향상시키는 점에서는 염산 등의 pH 조정제의 사용이 특히 바람직하다.
본 발명의 키트에 사용하는 상기 각 용액에는, 본 발명의 효과가 손상되지 않는 범위에서, 또한 다른 효과를 얻기 위해 다른 성분을 배합할 수 있다. 그 밖의 성분으로서는, 예를 들면, 방부제, 살균제를 들 수 있다.
본 발명의 키트는 용수법이더라도 자동기기를 사용하는 방법의 어느 것도 사용할 수 있다. 특히, 온도 제어 가능한 자동 기기 및 자동 면역조직 화학 염색 기기나, 자동 인시튜 하이브리다이제이션 장치를 사용한 방법에의 사용이 간편하여 바람직하다.
본 발명의 키트를 사용한, IHC법, ICC법 및 ISH법에서의 염색 또는 발색은, 키트의 각 용액을 혼합하고, 혹은 특정량의 물에 키트의 각 용액을 혼합 용해하여, DAB 함유 기질 용액을 조제하고, 예를 들면, 슬라이드 글라스의 검체 조직이나 검체 세포를 사용한 효소항체법의 경우, DAB 함유 기질 용액을 표지한 영역에, 통상, 실온(15∼30)℃에서 적하하고, 1∼20분간 반응시킴으로써 행할 수 있다.
실시예
이하, 실시예, 대조예 및 비교예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만 본 발명은 이것들에 한정되지 않는다.
또한, 이하에 나타내는 예에서 평가는 하기와 같이 행했다.
평가항목 (1)
특이 염색 강도: 얻어진 시료의 특이 염색 강도를 광학현미경에 의해 관찰했다.
평가는 대조예 1 또는 2의 특이 염색 강도를 「+」로 하고, 이것을 기준으로 그 강도가 대조예 1 또는 2의 몇 배인지로 평가했다.
평가항목 (2)
백그라운드 염색: 얻어진 시료의 백그라운드 염색을 광학현미경에 의해 관찰했다.
평가는 백그라운드 염색이 확인된 비교예 1 또는 8을 「±」로 하고, 백그라운드 염색이 확인되지 않은 대조예 1 또는 8을 「-」로 하고, 비교예 1 또는 8을 기준으로, 그 양보다 많은 것을 「+」, 약 2배 많은 것을 「2+」로 하여 평가했다.
평가항목 (3)
DAB 함유 기질 용액의 색: 후술하는 실시예 및 비교예에서 조제한 키트의 각 용액을 혼합한 후의 혼합 용액의 색을 육안으로 관찰했다.
평가항목 (4)
DAB 함유 기질 용액 중의 침전물: 후술하는 실시예 및 비교예에서 조제한 키트의 각 용액을 혼합한 후의 혼합 용액 중의 침전물의 상태를 육안으로 관찰했다.
평가항목 (5)
보존안정성: 후술하는 실시예 및 비교예에서 조제한 키트를 37℃에서 보존했을 때에, 조제 직후의 키트를 혼합하여 얻어진 DAB 함유 기질 용액을 사용하여 평가한 특이 염색 강도 및 백그라운드 염색과 동일한 정도의 평가결과가 얻어지는 보존기간을 측정했다.
퍼옥시다제 표지 항체를 사용한 면역조직 화학 염색 시료의 제작
(A) 탈파라핀 공정 및 친수화 공정
포말린으로 고정한 후에 파라핀 포매한 인간 소장조직 절편을 마이크로톰으로 3㎛로 박절하고, 미리 실레인 코팅된 코팅 슬라이드 글라스에 붙이고, 37℃에서 16시간 건조시켰다. 이것을, 자일렌층에 3분×3회 정치하고, 탈파라핀을 행했다. 그 후, 에탄올층에 3분×4회 정치하여, 친수화를 행했다.
(B) 세정 공정
최후의 에탄올층 정치 후, pH 7.6의 인산 완충액에서 3분×3회의 세정을 행했다.
(C) 면역조직 화학 염색 공정
용수법에서의 면역조직 화학 염색
(B) 세정 공정을 행한 슬라이드 글라스의 물기를 없애고, 3% 과산화수소/메탄올 용액에 10분간 반응시켜, 내인성 퍼옥시다제 제거를 행하고, 반응 종료 후, pH 7.6의 인산 완충액으로, 3분×3회의 세정을 행했다.
얻어진 슬라이드 글라스의 물기를 없애고, 조직 검체의 주변을 PAP 펜(오미치산교사제)을 사용하여 둘러싸고, 시약의 방파제를 제작했다.
이어서 슬라이드 글라스의 물기를 없애고, 마우스 유래의 1차 항체로서 상품명 「항엑틴(평활근) 단일 클론 항체(클론1A4)」(니치레이 바이오사이언스사제)를 슬라이드 글라스에 100μL 적하하고, 25℃에서 60분간 반응시켰다. 반응 종료 후, pH 7.6의 인산 완충액으로 3분×3회의 세정을 행했다.
다음에 세정한 슬라이드 글라스의 물기를 없애고, 아미노산 폴리머에 퍼옥시다제와, Fab'로 한 항마우스 Ig 및 항토끼 Ig를 2차 항체로서 결합시킨 표지 폴리머(상품명 「심플스테인 MAX-PO(MULTI)」, 니치레이 바이오사이언스사제)를 100μL 적하하고, 25℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후, pH 7.6의 인산 완충액으로 3분×3회의 세정을 행했다.
이 세정 후, 물기를 없앤 슬라이드 글라스에 발색 기질로서 각 실시예 및 비교예에서 조제한 키트에 의해 얻어지는 DAB 함유 기질 용액을 적하하고, 실온에서 5분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 5분간 유수 세정을 행했다. 계속해서, 대비 염색을 위해 슬라이드 글라스의 물기를 없애고, 마이어 헤마톡실린에 30초간 반응시켜 핵염색시킨 후, 5분간 유수 세정을 행했다.
이어서, 슬라이드 글라스의 물기를 없애고, 에탄올층 통과×3회, 에탄올층 정치 3분×1회, 자일렌층 통과 1회, 자일렌층 정치 5분×2회를 행하여, 탈수·침투를 행했다. 그 후에 비수용성 봉입제(니치레이 바이오사이언스사제)를 사용하여, 봉입을 행하고 각 시료를 제작했다.
대조예
1:
이미다졸
, 특정
킬레이트제
및 특정 계면활성제를 포함하지 않는
3
액 타입의 DAB 함유 기질
키트
최종에 얻어지는 DAB 함유 기질 용액 중의 농도가 15mg/mL가 되는 양의 DAB를 증류수에 용해하고, 발색단 함유 용액(A)을 조제했다. 또한 증류수에 과산화수소를 0.6질량%가 되도록 용해한 발색화 용액(B1)과, pH 7.6의 Tris-HCl의 기질 안정화 용액(B2')을 조제했다. 얻어진 발색단 함유 용액(A), 발색화 용액(B1) 및 기질 안정화 용액(B2')으로 이루어지는 키트를 사용하여, 증류수 1mL에 각 용액 1방울(약 40μL)을 혼합 교반하고, DAB 함유 기질 용액을 조제했다.
얻어진 DAB 함유 기질 용액을 사용하여, 상기 방법에 따라서 면역조직 화학 염색 시료를 제작했다. 얻어진 시료에 대하여, 평가항목 (1) 및 (2)를 행했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
비교예
1: 특정 계면활성제를 포함하지 않는
3액
타입의 DAB 함유 기질
키트
최종에 얻어지는 DAB 함유 기질 용액 중의 농도가 15mg/mL가 되는 양의 DAB를 증류수에 용해하고, 발색단 함유 용액(A)을 조제했다. 또한 증류수에 과산화수소량이 0.6질량%가 되도록 용해한 발색화 용액(B1)과, 이미다졸 농도 0.5M 및 EDTA·2Na 농도 20mM이 되도록 증류수에 용해하고, 염산으로 pH를 7.5로 조정한 기질 안정화 용액(B2')을 조제했다. 얻어진 발색단 함유 용액(A), 발색화 용액(B1) 및 기질 안정화 용액(B2')으로 이루어지는 키트를 사용하여, 증류수 1mL에 각 용액 1방울(약 40μL)을 혼합 교반하고, DAB 함유 기질 용액을 조제했다. 얻어진 용액 중의 과산화수소의 함유 비율은 0.024질량%, 이미다졸 농도는 20mM, EDTA·2Na 농도는 0.8mM이며, pH는 7.5이었다.
얻어진 DAB 함유 기질 용액을 사용하여, 상기 방법에 따라 면역조직 화학 염색 시료를 제작했다. 얻어진 시료에 대하여, 평가항목 (1)∼(4)를 행했다. 한편, 평가항목 (3) 및 (4)에 대해서는 DAB 함유 기질 용액의 조제후 1시간 경과 후에 평가를 행했다. 결과를 표 1 및 표 2에 나타낸다.
실시예
1:
킬레이트제로서
EDTA
·2Na를 사용한
3액
타입의 DAB 함유 기질
키트
기질 안정화 용액(B2') 대신에, 이미다졸 농도 0.5M, EDTA·2Na 농도 20mM 및 POE(23)라우릴에터(Brij 35, SIGMA-ALDRICH사제)의 함유 비율이 1질량%가 되도록 증류수에 용해하고, 염산으로 pH를 7.5로 조정한 기질 안정화 용액(B2)을 조제했다. 이 (B2) 용액의 조제 이외는, 비교예 1과 동일하게, 키트를 사용하여 DAB 함유 기질 용액을 조제했다. 얻어진 용액 중의 과산화수소 농도는 0.024질량%, 이미다졸 농도는 20mM, EDTA·2Na 농도는 0.8mM, Brij 35의 함유 비율은 0.04질량%이며, pH는 7.5이었다. 또한 각 평가를 비교예 1과 동일하게 행했다. 또한, 평가항목 (3) 및 (4)에 대해서는, DAB 함유 기질 용액의 조제 후 3일 경과 후의 평가도 행했다. 결과를 표 1 및 표 2에 나타낸다.
비교예
2∼4: 상이한 계면활성제를 포함하는
3액
타입의 DAB 함유 기질
키트
Brij 35 대신에, 표 1에 나타내는 폴리옥시소비탄계 비이온 계면활성제인 Tween 20, 폴리옥시알킬페닐에터계 비이온 계면활성제인 Triton X-100 또는 수크로스 지방산 에스터인 상품명 「DK에스터 SS」(다이이치고교세야쿠사제)를 사용한 이외는, 실시예 1과 동일하게 기질 안정화 용액(B2')을 조제했다. 발색단 함유 용액(A) 및 발색화 용액(B1)에 대해서는, 비교예 1과 동일하게 조제하고, 3액 타입의 키트로 했다. 얻어진 키트를 사용하여 비교예 1과 동일하게 DAB 함유 기질 용액을 조제하고, 각 평가를 실시예 1과 동일하게 행했다. 결과를 표 1 및 표 2에 나타낸다. 또한, 얻어진 DAB 함유 기질 용액 중의 각 농도는 실시예 1과 동일하다.
실시예
2∼5:
실시예
1에서 사용한
킬레이트제의
종류 또는 농도를 변경한
3액
타입의 DAB 함유 기질
키트
EDTA·2Na 20mM 대신에, 표 1에 나타내는 농도의 EDTA·2NH4, NTA, GEDTA 또는 EDTA·2Na를 사용한 이외는, 실시예 1과 동일하게 기질 안정화 용액(B2)을 조제했다. 발색단 함유 용액(A) 및 발색화 용액(B1)에 대해서는, 비교예 1과 동일하게 조제하고, 3액 타입의 키트로 했다. 얻어진 키트를 사용하여 비교예 1과 동일하게 DAB 함유 기질 용액을 조제하고, 각 평가를 실시예 1과 동일하게 행했다. 결과를 표 1 및 표 2에 나타낸다. 또한, 실시예 5에서 얻어진 DAB 함유 기질 용액 중의 과산화수소 농도는 0.024질량%, 이미다졸 농도는 20mM, EDTA·2Na 농도는 0.8mM, Brij 35의 함유 비율은 0.04질량%이며, pH는 7.5이었다.
비교예
5∼7: 상이한
킬레이트제를
포함하는
3액
타입의 DAB 함유 기질
키트
EDTA·2Na 대신에, 표 1에 나타내는 농도의 시트르산, 타르타르산 또는 갈릭산을 사용한 이외는, 비교예 2와 동일하게 기질 안정화 용액(B2')을 조제했다. 발색단 함유 용액(A) 및 발색화 용액(B1)에 대해서는, 비교예 1과 동일하게 조제하고, 3액 타입의 키트로 했다. 얻어진 키트를 사용하여 비교예 1과 동일하게 DAB 함유 기질 용액을 조제하고, 각 평가를 실시예 1과 동일하게 행했다. 단, 혼합 1시간 후의 용액의 색 및 침전물 상태의 평가에 대해서는 행하지 않았다. 결과를 표 1 및 표 2에 나타낸다. 또한, 비교예 5∼7에서 얻어진 DAB 함유 기질 용액 중의 과산화수소 농도는 0.024질량%, 이미다졸 농도는 20mM, 시트르산 또는 타르타르산 농도는 0.8mM, 갈릭산 농도는 0.08mM, Tween 20의 함유 비율은 0.04질량%이었다.
| (B2)액 또는 (B2')액의 계면활성제의 종류 | (B2)액 또는 (B2')액의 킬레이트제의 종류와 농도 | 특이 염색 강도 | 백그라운드 염색 | |
| 대조예 1 | - | - | + | - |
| 비교예 1 | - | 20mM EDTA-2Na | 2.5+ | ± |
| 실시예 1 | Brij 35 | 20mM EDTA-2Na | 3+ | - |
| 비교예 2 | Tween 20 | 20mM EDTA-2Na | 3+ | + |
| 비교예 3 | Triton X-100 | 20mM EDTA-2Na | 3+ | + |
| 비교예 4 | DK 에스터 SS | 20mM EDTA-2Na | 3+ | + |
| 실시예 2 | Brij 35 | 20mM EDTA-2NH4 | 3+ | - |
| 실시예 3 | Brij 35 | 20mM NTA | 3+ | - |
| 실시예 4 | Brij 35 | 20mM GEDTA | 3+ | - |
| 실시예 5 | Brij 35 | 50mM EDTA·2Na | 3+ | - |
| 비교예 5 | Tween 20 | 20mM 시트르산 | 2+ | + |
| 비교예 6 | Tween 20 | 20mM 타르타르산 | 2+ | + |
| 비교예 7 | Tween 20 | 2mM 갈릭산 | + | 2+ |
| 혼합 1시간 후의 용액 | 혼합 3일 후의 용액 | |||
| 색 | 침전물의 상태 | 색 | 침전물의 상태 | |
| 비교예 1 | 투명용액 | 침전있음 | - | - |
| 실시예 1 | 무색투명 | 침전없음 | 갈색투명 | 침전없음 |
| 비교예 2 | 투명용액 | 침전없음 | 갈색백탁 | 침전있음 |
| 비교예 3 | 투명용액 | 침전없음 | 갈색백탁 | 침전있음 |
| 비교예 4 | 투명용액 | 침전없음 | 갈색백탁 | 침전이 많음 |
| 실시예 2 | 무색투명 | 침전없음 | 갈색투명 | 침전없음 |
| 실시예 3 | 무색투명 | 침전없음 | 갈색투명 | 침전없음 |
| 실시예 4 | 무색투명 | 침전없음 | 갈색투명 | 침전없음 |
| 실시예 5 | 무색투명 | 침전없음 | 갈색투명 | 침전없음 |
| 비교예 5 | - | - | 갈색백탁 | 침전있음 |
| 비교예 6 | - | - | 갈색백탁 | 침전있음 |
| 비교예 7 | - | - | 갈색백탁 | 침전있음 |
표 1 및 표 2로부터, 발색 증강 작용을 갖는 이미다졸을 함유하지 않는 대조예 1에서는, 특이 염색 강도가 낮지만, 백그라운드 염색은 발생하지 않았다. 이에 반해 이미다졸을 함유하는 비교예 1에서는, 특정 킬레이트제인 EDTA·2Na를 함유해도, 백그라운드 염색이 생기고, 혼합 1시간 후라고 하는 단시간에 용액에 침전이 확인되었다. 비교예 3∼4는 POE알킬에터계 비이온 계면활성제 및/또는 POP알킬에터계 비이온 계면활성제 이외의 비이온 계면활성제를 배합함으로써, 비교예 1보다도 더욱 우수한 특이 염색 강도를 나타냈지만, 백그라운드 염색도 증강되고, 또한 혼합 3일 후의 용액에도 침전이 확인되었다. 비교예 5∼6은 킬레이트제를 EDTA·2Na보다도 킬레이트 효과가 낮은 것으로 변경한 예인데, 이 경우, 특이 염색 강도가 EDTA·2Na를 사용한 비교예 2보다 저하되고, 백그라운드 염색 및 용액의 상태는 비교예 2와 거의 같은 결과였다. 이에 반해 실시예 1에서는, 특이 염색 강도가 증강되어, 백그라운드 염색도 확인되지 않으며, 혼합 3일 후의 용액에 침전도 확인되지 않았다. 또한 실시예 2∼4로부터, EDTA·2Na를 특정의 다른 킬레이트제로 변경한 경우이어도 실시예 1과 동일한 효과가 얻어지는 것을 알 수 있었다.
실시예
6:
이미다졸의
농도를 변경한
3액
타입의 DAB 함유 기질
키트
이미다졸의 농도 0.5M을 0.1M(DAB 함유 기질 용액 중의 이미다졸 농도는 4mM), 0.2M(DAB 함유 기질 용액 중의 이미다졸 농도는 8mM), 0.3M(DAB 함유 기질 용액 중의 이미다졸 농도는 12mM) 및 0.4M(DAB 함유 기질 용액 중의 이미다졸 농도는 16mM)로 변경한 이외는, 실시예 1과 동일하게 기질 안정화 용액(B2)을 조제하고, 실시예 1과 동일하게 3액 타입의 키트로 하여, 동일한 평가를 행했다. 그 결과, 특이 염색 강도가, +1.5∼+2.5의 범위에서, 이미다졸 농도의 용량 의존적으로 증가하는 것을 알았다. 백그라운드 염색 및 혼합 용액의 색 및 침전 상태는 모두 실시예 1과 동일했다.
실시예
7∼13: 계면활성제의 농도를 변경한
3액
타입의 DAB 함유 기질
키트
Brij 35의 농도를 표 3에 나타내는 농도로 변경한 이외는, 실시예 1과 동일하게 기질 안정화 용액(B2)을 조제했다. 발색단 함유 용액(A) 및 발색화 용액(B1)에 대해서는, 비교예 1과 동일하게 조제하여, 3액 타입의 키트로 했다. 얻어진 키트를 사용하여 DAB 함유 기질 용액을 조제하고, 얻어진 혼합 직후의 용액을 사용하여 면역조직 화학 염색 시료의 제작을 행했다. 얻어진 시료에 대하여, 평가항목 (1) 및 (2)의 평가를 행했다. 결과를 표 3에 나타낸다. 또한 DAB 함유 기질 용액 조제 후, 4℃ 차광하에서 2주일 보존한 후의 혼합 용액을 사용하여 면역조직 화학 염색 시료의 제작을 행했다. 얻어진 시료에 대하여, 평가항목 (1) 및 (2)의 평가 및 4℃ 차광하에서 2주일 보존한 후의 혼합 용액에 대해 평가항목 (3) 및 (4)의 평가를 행했다. 결과를 표 4에 나타낸다. 또한, 조제한 DAB 함유 기질 용액 중의 Brij 35의 농도는 실시예 7에서 0.02질량%, 실시예 8에서 0.06질량%, 실시예 9에서 0.08질량%, 실시예 10에서 0.1질량%, 실시예 11에서 0.12질량%, 실시예 12에서 0.2질량%, 실시예 13에서 0.4질량%이었다.
| Brij 35의 농도 (질량%) |
특이 염색 강도 | 백그라운드 염색 | |
| 실시예 7 | 0.5 | 3+ | - |
| 실시예 8 | 1.5 | 3+ | - |
| 실시예 9 | 2.0 | 3+ | - |
| 실시예 10 | 2.5 | 3+ | - |
| 실시예 11 | 3.0 | 3.5+ | - |
| 실시예 12 | 5.0 | 3.5+ | - |
| 실시예 13 | 10.0 | 3.5+ | - |
| Brij 35의 농도 (질량%) |
혼합 후 2주간 4℃차광 하 보존 | |||
| 특이 염색 강도 | 백그라운드 염색 | 용액 보존 후의 침전 상태 | ||
| 실시예 7 | 0.5 | 3+ | - | 침전있음 |
| 실시예 8 | 1.5 | 3+ | - | 침전있음 |
| 실시예 9 | 2.0 | 3+ | - | 침전있음 |
| 실시예 10 | 2.5 | 3+ | - | 약간 침전 있음 |
| 실시예 11 | 3.0 | 3.5+ | - | 침전없음 |
| 실시예 12 | 5.0 | 3.5+ | - | 침전없음 |
| 실시예 13 | 10.0 | 3.5+ | - | 침전없음 |
표 4의 결과로부터, 특정 계면활성제의 농도를 높게 함으로써 DAB 함유 기질 용액을 장기 보존해도, 이 용액에 침전이 생기지 않고, 보존안정성이 우수한 것을 알 수 있었다.
또한 실시예 13에 대해서는, 키트를 가속 시험 37℃·3개월 및 동결 융해 시험 마이너스 20℃ 보존·3일간을 행한 후에 각 용액의 혼합을 한 후의 평가도 행했다. 그 결과 염색성 및 침전에 문제는 없었다. 또한 가속 시험 및 동결 융해 시험 후에, 혼합 용액의 4℃ 차광하에 5일간 보존한 평가도 행했지만, 특이 염색 강도의 저하는 거의 확인되지 않았고, 백그라운드 염색 변화도 확인되지 않았다. 그러나, 7일 경과 후의 혼합 용액을 사용한 경우에는, 염색은 되지만, 당일 조제한 것과 비교하면 약간 특이 염색 강도의 저하가 보였다.
실시예
14:
2액
타입의 DAB 함유 기질
키트
최종에 얻어지는 DAB 함유 기질 용액 중의 농도가 20mg/mL가 되는 양의 DAB를 증류수에 용해하고, 발색단 함유 용액(A)을 조제했다. 또한 과산화수소의 함유 비율이 0.025질량%, 이미다졸 농도가 20mM, EDTA·2Na 농도가 2mM 및 Brij 35의 함유 비율이 0.4질량%가 되도록 증류수에 용해하고, 염산만으로 pH를 7.5로 조정한 발색 시약(B)을 조제했다. 얻어진 발색단 함유 용액(A) 및 발색 시약(B)으로 이루어지는 2액 타입의 키트를 사용하여, (B)액 500μL에 대하여, (A)액 1방울(약 20μL)을 혼합 교반하여, DAB 함유 기질 용액을 조제했다. 얻어진 용액 중의 과산화수소의 함유 비율은 0.025질량%, 이미다졸 농도는 20mM, EDTA·2Na 농도는 2mM, Brij 35의 함유 비율은 0.4질량%이며, pH는 7.5이었다.
얻어진 DAB 함유 기질 용액을 사용하여, 상기 방법에 따라 면역조직 화학 염색 시료를 제작했다. 얻어진 시료에 대하여, 평가항목 (1) 및 (2)를 행하고, 얻어진 키트에 대하여, 평가항목 (5)의 보존안정성 시험을 행했다. 결과를 표 5에 나타낸다.
실시예
15∼18
염산만으로 pH를 7.5로 조정하지 않고, 표 5에 나타내는 완충액을 HCl 또는 NaOH로 적정하여 표 5에 나타내는 pH로 조정한 이외는, 실시예 14와 동일하게 발색 시약(B)을 조제했다. 그 외에, 발색단 함유 용액(A)의 조제 및 각 평가는 실시예 14와 동일하게 행했다. 결과를 표 5에 나타낸다.
| 완충액 (pH) | 특이 염색 강도 | 백그라운드 염색 | 37℃에서의 보존 가능 시기 평가 항목(5) |
|
| 실시예 14 | - (7.5) | 3.5+ | - | 3개월 보존 가능 |
| 실시예 15 | MOPS (7.5) | 3.5+ | - | 2개월 정도 보존 가능 |
| 실시예 16 | HEPES (7.5) | 3.5+ | - | 1개월 정도 보존 가능 |
| 실시예 17 | ADA (7.5) | 3.5+ | - | 1개월 정도 보존 가능 |
| 실시예 18 | CHES (9.0) | 3.5+ | - | 2개월 정도 보존 가능 |
MOPS: 3-모폴리노프로페인설폰산,
HEPES: 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에테인설폰산,
ADA: N-(2-아세트아마이드)이미드다이아세트산,
CHES: N-사이클로헥실-2-아미노에테인설폰산.
표 5의 결과로부터, 발색 시약(B)은 보존 시험에 있어서, 모두 보존안정성이 우수하고, 완충액을 포함하지 않는 실시예 14가 특히 우수한 것을 알 수 있었다.
실시예
19
EDTA·2Na의 농도를 2mM로부터 1mM, 1.5mM로 변경한 이외는, 실시예 14와 동일하게 발색 시약(B)을 조제했다. 그 외에, 발색단 함유 용액(A)을 조제하고, 특이 염색 강도, 백그라운드 염색의 평가를 행한 바, 모두 실시예 14와 동일했다. 또한 염색의 색조를 관찰한 바, EDTA·2Na 농도가 1mM까지는 황토색이었지만, 1.5mM 이상의 경우에는 암갈색으로, 보다 바람직한 색조를 나타내는 것을 알 수 있었다.
용수법에서의 CISH(Chromogenic in situ Hybridization)
(A) 조직 절편 제작, 탈파라핀, 친수화 공정
파라핀 포매한, 미리 HER2 양성인 것이 확인된 인간 유방암 조직 포말린 고정 조직 절편을 마이크로톰으로 5㎛로 박절하고, 미리 실레인 코팅된 슬라이드 글라스에 붙이고, 37℃, 16시간 건조시켰다. 이것을 자일렌 3분×3회 정치하고, 탈파라핀을 행했다. 그 후에 에탄올 3분×4회 정치하고, 친수화를 행했다.
(B) 전처리 공정
최후의 에탄올 정치 후, 슬라이드의 물기를 없애고, 3% 과산화수소/물에 넣고, 내인성 퍼옥시다제 제거를 행하고, 25℃, 5분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 인산 완충액(pH 7.6)으로 1분×2회의 세정을 행했다.
슬라이드의 물기를 없애고, 사전에 온욕에서 98℃로 데워 놓은 10mM 시트르산 완충액(pH 6.0) 속에 슬라이드를 넣고, 30분간 반응시켰다.
반응 종료 후, 인산 완충액(pH 7.6)으로 2분×2회의 세정을 행했다.
슬라이드의 물기를 없애고, 프로테아제(니치레이 바이오사이언스사제)를 1/5로 희석한 용액을 100μL 적하하고, 25℃에서 3분간 반응시키고, 반응 종료 후, 인산 완충액(pH 7.6)으로 5분×3회의 세정을 행했다.
탈수 조작을 위해, 70%, 90% 및 100% 에탄올(나머지 성분은 탈이온수)과 25℃에서 각 1분간 반응 후, 드라이어로 냉풍을 직접 슬라이드 글라스에 쐬어, 조직을 건조시켰다.
변성 및 하이브리다이제이션
인간 17번 염색체 상(17q 21.1)에 존재하는, 약 220kb의 상보쇄가 되는 것과 같은 배열로 링커를 통하여 DIG 표지를 한 HER2 프로브를 건조한 조직 주변에 10μL 적하했다.
거품을 피하면서, 22mm×22mm의 커버 유리(마츠나미가라스고교사제)를 조직 위에 올려놓고, 커버 유리의 주위를 페이퍼 본드로 실링했다. 실링 후, 슬라이드 글라스를 75℃로 설정된 핫플레이트에 두고, 5분간 열 변성을 행했다. 반응 후, 슬라이드 글라스를 습윤 상자로 이동하고, 37℃에서 하룻밤 반응시켰다.
포스트 하이브리다이제이션 및 검출
다음에 주의하여 페이퍼 본드를 벗기고, 2×SSC(시트르산 완충액) 버퍼로 25℃, 5분간 반응시켰다. 그 후에 미리 72℃로 데운 2×SSC 버퍼로 5분간, 그 후 인산 완충액(pH 7.6)으로 1분×2회의 세정을 행했다.
아미노산 폴리머에 퍼옥시다제와 Fab'로 한 항DIG 항체를 결합시킨 표지 폴리머를 100μL 적하하고, 25℃에서 30분간 반응시키고, 반응 종료 후, 인산 완충액(pH 7.6)에서 1분×3회의 세정을 행했다.
반응 전에 실시예 및 비교예에서 조제한 각 용액으로 이루어지는 키트를 사용하여 DAB 함유 기질 용액을 조제했다. 슬라이드 글라스의 물기를 없애고, 각 100μL의 DAB 함유 기질 용액을 적하하고, 실온에서 10분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 5분간 유수 세정을 행했다.
계속해서, 대비 염색을 위해 슬라이드 글라스의 물기를 없애고, 마이어 헤마톡실린에 15초간 반응시켜 핵 염색시킨 후, 5분간 유수 세정을 행했다.
이어서, 유수 세정 후, 물기를 없애고, 에탄올 통과×3회, 에탄올 정치 3분×1회, 자일렌 통과 1회, 자일렌 정치 5분×2회를 행하고, 탈수·침투를 행했다. 그 후에 비수용성 봉입제(니치레이 바이오사이언스사제)를 사용하여, 봉입을 행하고, 각 시료를 제작했다.
대조예
2:
이미다졸
, 특정
킬레이트제
및 특정 계면활성제를 포함하지 않는
3액
타입의 DAB 함유 기질
키트
최종에 얻어지는 DAB 함유 기질 용액 중의 농도가 15mg/mL가 되는 양의 DAB를 증류수에 용해하고, 발색단 함유 용액(A)을 조제했다. 또한 증류수에 과산화수소를 0.6질량%가 되도록 용해한 발색화 용액(B1)과, pH 7.6의 Tris-HCl의 기질 안정화 용액(B2')을 조제했다. 얻어진 발색단 함유 용액(A), 발색화 용액(B1) 및 기질 안정화 용액(B2')으로 이루어지는 키트를 사용하여, 증류수 1mL에 각 용액 1방울(약 40μL)을 혼합 교반하고, DAB 함유 기질 용액을 조제했다.
얻어진 DAB 함유 기질 용액을 사용하여, 상기 방법에 따라 CISH 시료를 제작했다. 얻어진 시료에 대하여, 평가항목 (1) 및 (2)를 행했다. 결과를 표 6에 나타낸다.
비교예
8: 특정 계면활성제를 포함하지 않는
3액
타입의 DAB 함유 기질
키트
최종에 얻어지는 DAB 함유 기질 용액 중의 농도가 15mg/mL가 되는 양의 DAB를 증류수에 용해하고, 발색단 함유 용액(A)을 조제했다. 또한 증류수에 과산화수소량이 0.6질량%가 되도록 용해한 발색화 용액(B1)과, 이미다졸 농도 0.5M 및 EDTA·2Na 농도 20mM이 되도록 증류수에 용해하고, 염산으로 pH를 7.5로 조정한 기질 안정화 용액(B2')을 조제했다. 얻어진 발색단 함유 용액(A), 발색화 용액(B1) 및 기질 안정화 용액(B2')으로 이루어지는 키트를 사용하여, 증류수 1mL에 각 용액 1방울(약 40μL)을 혼합 교반하고, DAB 함유 기질 용액을 조제했다. 얻어진 용액 중의 과산화수소의 함유 비율은 0.024질량%, 이미다졸 농도는 20mM, EDTA·2Na 농도는 0.8mM이며, pH는 7.5이었다.
얻어진 DAB 함유 기질 용액을 사용하여, 상기 방법에 따라 CISH 시료를 제작했다. 얻어진 시료에 대하여 평가항목 (1)∼(4)를 행했다. 또한, 평가항목 (3) 및 (4)에 대해서는 DAB 함유 기질 용액의 조제 후 1시간 경과 후에 평가를 행했다. 결과를 표 6에 나타낸다.
실시예
20:
킬레이트제로서
EDTA
·2Na를 사용한
3액
타입의 DAB 함유 기질
키트
기질 안정화 용액(B2') 대신에, 이미다졸 농도 0.5M, EDTA·2Na 농도 20mM 및 Brij 35(SIGMA-ALDRICH사제)의 함유 비율이 10질량%가 되도록 증류수에 용해하고, 염산으로 pH를 7.5로 조정한 기질 안정화 용액(B2)을 조제했다. 이 (B2) 용액의 조제 이외는, 비교예 8과 마찬가지로 키트를 사용하여 DAB 함유 기질 용액을 조제했다. 얻어진 용액 중의 과산화수소 농도는 0.024질량%, 이미다졸 농도는 20mM, EDTA·2Na 농도는 0.8mM, Brij 35의 함유 비율은 0.4질량%이며, pH는 7.5이었다. 또한 각 평가를 비교예 8과 동일하게 행했다. 또한, 평가항목 (3) 및 (4)에 대해서는, DAB 함유 기질 용액의 조제 후 3일 경과 후의 평가도 행했다. 결과를 표 6 및 표 7에 나타낸다.
| (B2)액 또는 (B2')액의 계면활성제의 종류 | (B2)액 또는 (B2')액의 킬레이트제의 종류와 농도 | 특이 염색 강도 | 백그라운드 염색 | |
| 대조예 2 | - | - | + | - |
| 비교예 8 | - | 20mM EDTA-2Na | 2.5+ | |
| 실시예 20 | Brij 35 | 20mM EDTA-2Na | 3+ | - |
| 혼합 1시간 후의 용액 | 혼합 3일 후의 용액 | |||
| 색 | 침전물의 상태 | 색 | 침전물의 상태 | |
| 비교예 8 | 투명용액 | 침전있음 | - | - |
| 실시예 20 | 무색투명 | 침전없음 | 갈색투명 | 침전없음 |
이상의 결과로부터 본 발명의 키트는 CISH에 사용했을 때에도, 특이 염색 강도의 증강, 백그라운드 염색의 저감 및 DAB 함유 기질 용액 중의 침전 억제 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
Claims (12)
- 퍼옥시다제 발색단으로서의 다이아미노벤지딘(DAB)과 물을 포함하는 발색단 함유 용액(A) 및 테트라에틸렌다이아민사아세트산이소듐·이수화물, 에틸렌다이아민사아세트산·다이암모늄염, 글라이콜에터다이아민사아세트산 및 나이트릴로삼아세트산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 킬레이트제와, 폴리옥시에틸렌(POE)알킬에터계 비이온 계면활성제와, 이미다졸과, 과산화수소와, 물을 포함하는 발색 시약(B)을 함유하고, 적어도 발색단 함유 용액(A) 및 발색 시약(B)이 별도로 보관되는 2액 타입 이상의 염색용 DAB 함유 기질 키트로서,
상기 발색 시약(B) 중의 상기 킬레이트제의 함유량은 사용하는 상기 염색용 DAB 함유 기질 키트의 각 용액을 혼합 또는 혼합 희석한 DAB 함유 기질 용액 중의 농도로서 0.1∼10mM이 되는 양이며,
상기 발색 시약(B) 중의 상기 POE 알킬에터계 비이온 계면활성제의 함유량은 사용하는 상기 염색용 DAB 함유 기질 키트의 각 용액을 혼합 또는 혼합 희석한 DAB 기질 용액 중의 함유 비율로서 0.05∼30질량%가 되는 양인 퍼옥시다제 표지 항체를 사용한 염색용 DAB 함유 기질 키트. - 제 1 항에 있어서, 상기 발색 시약(B)이 과산화수소 및 물을 포함하는 발색화 용액(B1) 및 상기 킬레이트제, 상기 POE알킬에터계 비이온 계면활성제, 이미다졸 및 물을 포함하는 기질 안정화 용액(B2)이 별도로 보관되는 2액 타입이며, 키트를 3액 타입으로 한 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 면역염색법 또는 인시튜 하이브리다이제이션법의 염색에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 POE알킬에터계 비이온 계면활성제가 POE(23)라우릴 에터(Brij 35), POE(20)세틸 에터(Brij 58), POE스테아릴 에터, POE올레일에터, POE미리스틸에터 및 POE옥틸도데실에터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 킬레이트제가 EDTA·2Na이며, 또한 상기 POE알킬에터계 비이온 계면활성제가 POE(23)라우릴에터인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 발색단 함유 용액(A) 중의 DAB의 함유량은 사용하는 상기 염색용 DAB 함유 기질 키트의 각 용액을 혼합 또는 혼합 희석한 DAB 함유 기질 용액 중의 농도로서 0.1∼10mg/mL가 되는 양인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 발색 시약(B) 중의 이미다졸의 함유량은 사용하는 상기 염색용 DAB 함유 기질 키트의 각 용액을 혼합 또는 혼합 희석한 DAB 함유 기질 용액 중의 농도로서 3∼300mM이 되는 양인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 발색 시약(B) 중의 과산화수소의 함유량은 사용하는 상기 염색용 DAB 함유 기질 키트의 각 용액을 혼합 또는 혼합 희석한 DAB 함유 기질 용액 중의 함유 비율로서 0.001∼0.3질량%가 되는 양인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 1 항에 있어서, 상기 발색 시약(B)의 pH를, 사용하는 상기 염색용 DAB 함유 기질 키트의 각 용액을 혼합 또는 혼합 희석한 DAB 함유 기질 용액의 pH가 5∼9가 되도록 조정한 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 2 항에 있어서, 상기 기질 안정화 용액(B2)의 pH를, 사용하는 상기 염색용 DAB 함유 기질 키트의 각 용액을 혼합 또는 혼합 희석한 DAB 함유 기질 용액의 pH가 5∼9가 되도록 조정한 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 퍼옥시다제가 서양 고추냉이 유래의 퍼옥시다제인 것을 특징으로 하는 키트.
- 삭제
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